KR20210043432A

KR20210043432A - T 보조세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 세포독성 t 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210043432A
Application number: KR1020200118557A
Authority: KR
Inventors: 백문창; 예경무; 정도경; 류수연; 신상희; 정인성
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2021-04-21
Also published as: KR102548439B1

Abstract

본 발명은 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 사이토카인으로 활성화된 CD4+ T 세포에서 세포외 소포체의 분비가 증가하고, 상기 세포외 소포체가 CD8+ T 세포의 증식 및 활성을 증가시켜 암세포 사멸을 유도하여 항암 효과를 증진시키는 것을 확인한 바, 상기 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 암 질환에 대한 약학적 제제 또는 면역 항암제로 제공하고, 상기와 같이 우수한 항암 활성을 나타내는 CD8+ T 세포를 제조하기 위해 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체를 이용한 CD8+ T 세포의 활성화 방법을 제공한다.

Description

T 보조세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 세포독성 T 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer disease comprising cytotoxic T cells activated by extracellular vesicles derived from T helper cells as an active ingredient}

본 발명은 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

작은 세포외 소포체(Small extracellular vesicles; sEV)는 대부분의 세포에서 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 세포외 소포체의 직경은 대략 30-100 ㎚로, 세포외 소포체 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, RNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있다. 세포외 소포체는 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies; MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출 및 분비된다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데 이것을 세포외 소포체라고 부른다. 세포외 소포체가 어떤 기작에 의해 만들어지는지 정확하게 밝혀진 바가 없으나 정상 상태 및 병적 상태 모두에서 다수의 세포 유형으로부터 분리되어 방출되는 것으로 알려져 있다.

한편, 암은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고 무질서한 세포 증식의 산물로서, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 질환이라고 할 수 있다. 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만해도 수십 종에 이르며 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 양성종양과 악성종양으로 구분되는데, 양성종양은 비교적 성장 속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되는 전이가 발생하지 않는 반면, 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특성을 가져 생명을 위협한다. 대부분의 암은 초기에 증상이 없으며, 증상이 있다고 하더라도 경미하여 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉽고, 이는 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.

암의 치료를 위해서 수술 요법, 화학 요법, 방사선 요법 등이 사용되고 있으나 많은 연구에도 불구하고 암 환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망하는 것으로 보고된다. 그 이유는 외과적으로 절제를 하였다 하더라도 미세하게 전이된 암세포를 제거하지 못하여 암이 재발하거나, 항암제에 대한 암세포의 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료도중이나 치료가 끝난 후 항암제에 대한 내성이 생긴 암세포들이 급격히 증가하기 때문이다. 오늘날에는 약 60여 종의 다양한 항암제가 사용되고 있으며, 암 발생 및 암세포의 특성에 관한 지식이 많이 알려짐에 따라 새로운 항암제 개발에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나 대부분의 항암제는 오심과 구토, 탈모, 피부 및 손톱의 변색, 신경계 부작용 등의 심각한 부작용을 일으키며, 반복적으로 장기간 투여되거나 암이 재발된 경우에는 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득함으로써 치료 효과를 상실하는 단점이 있다. 또한, 방사선 요법은 고에너지의 방사선을 암 조직에 조사하여 암세포의 사멸을 유도하나, 암 조직 주변에 있는 정상 조직에게도 손상을 주어 부작용을 발생시키는 단점이 있다.

이에, 사이토카인으로 활성화된 보조 T 세포 유래 세포외 소포체는 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있는 바, 상기 기술의 개발은 암 예방 및 치료 효능을 극대화시킬 수 있다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0063841호 (2018.06.12. 공개)

본 발명은 T 보조세포 (CD4+ T 세포) 유래의 세포외 소포체로 활성화된 세포독성 T세포 (CD8+ T 세포)를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 사이토카인으로 활성화된 CD4+ T 세포에서 세포외 소포체의 분비가 증가하고, 상기 세포외 소포체가 CD8+ T 세포의 증식 및 활성을 증가시켜 암세포 사멸을 유도하여 항암 효과를 증진시키는 것을 확인한 바, 상기 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물, 면역 항암제용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있으므로, 상기 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 암 질환에 대한 약학적 제제 또는 면역 항암제로 제공하고, 상기와 같이 우수한 항암 활성을 나타내는 CD8+ T 세포를 제조하기 위해 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체를 이용한 CD8+ T 세포의 활성화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역 항암제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 사이토카인을 처리하여 CD4+ T 세포를 활성화시키는 제1단계; 및 상기 활성화된 CD4+ T 세포에서 유래된 세포외 소포체를 CD8+ T 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 CD8+ T 세포의 활성화 방법을 제공한다.

본 발명에서는 사이토카인으로 활성화된 CD4+ T 세포에서 세포외 소포체의 분비가 증가하고, 상기 세포외 소포체가 CD8+ T 세포의 증식 및 활성을 증가시켜 암세포 사멸을 유도하여 항암 효과를 증진시키는 것을 확인한 바, 상기 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물, 면역 항암제용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체 분비 증가 및 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포의 항암 효과를 도시하여 나타낸 것이다.
도 2는 웨스턴 블랏, 실시간 중합효소 연쇄반응 및 유세포 분석을 수행하여 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포에서 IL-2에 의한 Rab5, 7, 27a의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 3은 나노입자 추적 분석을 통해 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포에서 세포외 소포체 크기 검증 및 IL-2에 의한 분비 증가를 확인한 결과이다.
도 4 및 도 5는 IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체를 이용하여 CD8+ T 세포와 Primary CD8+ T 세포의 증식 및 활성의 증가를 확인한 결과이다.
도 6는 IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체를 이용하여 CD8+ T 세포와 Primary CD8+ T 세포의 항암 활성 증가를 확인한 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 도 1과 같이, CD4+ T 세포에 사이토카인을 처리 시, 세포외 소포체의 분비가 증가되고, CD8+ T 세포에 상기 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체를 처리 시, CD8+ T 세포가 정상 상태에서 가지고 있던 항암 효과에 비하여 더욱 증가된 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 상기 세포외 소포체가 CD8+ T 세포의 증식 능력 및 세포독성 능력을 증가시켜 암세포의 사멸을 유도함으로써 항암 효과를 증진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 CD4+ T 세포는 사이토카인에 의해 활성화된 것으로, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 IL-2일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 세포외 소포체는 CD8+ T 세포의 증식을 증가시키고, 세포독성을 나타내는 표지자인 IFN-γ, 퍼포린 및 그랜자임 B의 발현을 증가시켜 항암 효과를 증대시킬 수 있다.

상기 세포외 소포체는 직경이 50 내지 100nm인 작은 세포외 소포체(Small extracellular vesilce; sEV)로, 엑소좀(exosome), 미세소포(microvesicle) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 암 질환은 흑색종, 피부암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 골암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병, 식도암, 소장암, 대장암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

상기 제1단계의 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 세포 배양

B16F10 세포(마우스 흑색종)는 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Hyclone)이 첨가된 DMEM 배지(Hyclone)에서 배양하고, CD4+ T 세포(인간 T 림프구)는 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. CD8+ T 세포(마우스 세포독성 T 림프구)는 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 20 IU/mL의 재조합 IL-2(R&D system)가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. Primary CD4+ T 세포 및 Primary CD8+ T 세포는 (PBMC에서 분리) 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

실시예 2: 인간 말초혈액 단핵세포에서 Primary CD4+ T 세포 및 Primary CD8+ T 세포 분리

50 ml syringe를 이용하여 50 ml씩 혈액을 채취한 후 헤파린(heparin)이 내포된 진공기(BD Vacutainer)에 옮긴 후 550 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이후 PBS와 1:1로 섞어주었다. 이후, PBS를 섞은 blood를 8 ml당 ficoll (GE Healthcare) 5 ml을 넣어주고 550 x g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 이후, 상층액을 제거하고 Buffy coat층을 새로운 50 ml conical tube에 옮겼다. 30 ml까지 PBS를 넣어준 후 550 x g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 이후 pellet을 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지로 섞어주고 10 cm 플레이트(Cat, 430167; Corning)에 16 시간 동안 배양하였다.

인간 말초혈액 단핵세포를 16시간 동안 배양한 후, Human CD4+ T cell isolation ki(Cat, 130-096-533; MACS)t 및 Human CD8+ T cell isolation kit(Cat, 130-096-495; MACS)를 이용하여 Primary CD4+ T 세포 및 Primary CD8+ T 세포를 분리하였다.

10 cm 플레이트(Cat, 430167; Corning)에서 배양중인 인간 말초혈액 단핵세포의 세포 수를 tryphan blue 염색을 통해 counting 후, 550 x g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 이후, 10⁷ 당 40 ul의 Macs buffer를 넣어주었다. 이후 Biotin-Ab cocktail을 10⁷ 당 10 ul 넣고 섞은 후 4℃에서 5 분 동안 incubation 하였다. 이후 microbead cocktail을 10⁷ 당 20 ul 넣고 섞은 후 4℃에서 10 분 동안 incubation 하였다. 이후 LS column을 MACS serator의 자기장에 위치시켰다. 이후 Macs buffer로 1 ml씩 3 번 column을 wash 하였다. 이후 10 분 동안 incubation 시켰던 세포 상층액을 column에 넣고 flow-through를 5 ml tube에 받는다. 상기 과정을 3 번 반복하여 총 3 ml의 세포 상층액을 받고 550 x g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 이후 pellet을 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지로 섞어주고 10 cm 플레이트(Cat, 430167; Corning)에 배양하였다.

실시예 3: IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(sEV) 분석

3-1. 나노입자 추적 분석

CD4+ T 세포를 10 cm 플레이트(Cat. 430167; Corning) 당 2 X 10⁶ 밀도로 첨가하고, 다양한 농도의 IL-2(0 IU/ml, 1 IU/ml, 10 IU/ml, 100 IU/ml, 500 IU/ml)를 처리한 다음 48 시간 동안 배양하였다. 이후, 세포외 소포체를 수집하기 위해, 배지를 FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 24 시간 동안 추가 배양하였다. 세포 배양 상층액을 회수한 후 원심분리하여 세포 및 잔해물을 제거하였다. 이후 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(CE) 또는 IL-2에 의해 활성화된 T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)를 분리하기 위해, 각 세포에서 얻은 각 상등액을 300 x g, 2,500 x g, 10,000 x g로 연속 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 0.2 μm 주사기 필터로 여과하고, 120,000 x g에서 원심분리하였다. 세포외 소포체 펠릿을 PBS에 재현탁하고 다시 120,000 x g에서 원심분리하였다. 정제된 펠릿은 다음 실험을 위해 PBS 또는 1X 세포 용해 완충액에 재현탁하였다. 이 후 세포외 소포체의 크기 및 농도를 fast video capture 및 입자 추적 소프트웨어가 장착된 Nanosight LM10(Malvern Instruments)을 사용하여 측정하였다. 이와 같은 과정은 primary CD4+ T 세포에서도 동일한 과정으로 진행되었다.

그 결과, 도 2와 같이, CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포에 IL-2를 처리 시, 농도 의존적으로 세포외 소포체의 분비가 증가하는 것을 확인하였다.

3-2. 유세포 분석

상기 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포를 PBS로 세척한 뒤 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 15 분 동안 고정시켰다. 이어서, 0.1% Triton-X(CAS #. 9002-93-1; Biosesang)을 포함하는 PBS(Cat. SH30028.02; Hyclone)를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 반응시켜 세포를 투과시켰다. 투과 후, 시료를 1차 항체와 4℃에서 1 시간 반응시킨 후 PBS로 세척하고, 2차 항체(1:2000 희석)와 4℃에서 1 시간 반응시킨 후 PBS로 세척하여 유세포 분석(FACSAria III; Becton Dickinson)을 수행하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어(Flowjo, Ashland, OR, USA)로 분석하였다.

본 실험에 사용된 1차 항체는 다음과 같다: Rab5(ab18211, 1:100; Abcam), Rab7(ab50533, 1:100; Abcam), Rab27a(ab55667, 1:100; Abacm).

그 결과, 도 3과 같이, CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포에 IL-2를 500 IU/ml 처리하였을 때, 세포외 소포체의 생성과 분비에 관여하는 Rab 효소들(Rab5, Rab7, Rab27a)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 4: IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(sEV) 정제

상기 CD4+ T 세포 또는 IL-2(500 IU/ml)로 활성화된 CD4+ T 세포를 인산완충식염수(PBS)로 세척하고 FBS가 첨가되지 않은 RPMI 1640 배지에서 24 시간 동안 추가 배양하였다.

세포외 소포체 정제를 위해, 실온에서 1,200 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 세포 배양 상층액을 회수한 후, 상층액을 2,000 x g에서 30 분 동안 원심분리하여 세포 및 잔해물을 제거하였다. 이후 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(CE) 또는 IL-2에 의해 활성화된 T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)를 분리하기 위해, 각 세포에서 얻은 각 상등액을 300 x g, 2,500 x g, 10,000 x g로 연속 원심분리하였다. 이어서, 상등액을 0.2 μm 주사기 필터로 여과하고, 120,000 x g에서 원심분리하였다. 세포외 소포체 펠릿을 PBS에 재현탁하고 다시 120,000 x g에서 원심분리하였다. 정제된 펠릿은 다음 실험을 위해 PBS 또는 1X 세포 용해 완충액에 재현탁하였다.

실시예 5: CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포와 Primary CD8+ T 세포에서의 항암 효능 분석

5-1. 유세포 분석

다음은 IL-2에 의해 활성화된 CD4+ T 세포로부터 정제된 세포외 소포체를 CD8+ T 세포에 처리하여 세포외 소포체의 효능을 평가하였다. 간략하게 CD8+ T 세포를 6 웰 플레이트에 1 X 10⁵ 세포/웰 밀도로 접종한 후, CE(CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체) 또는 IL-2E(IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체) (25 μg/ml)로 24시간 배양하였다. 이후, Ki-67, IFN-γ, 퍼포린(Perforin), 그랜자임 B(Granzyme B)에 대하여 유세포 분석을 수행하였다. 또한 Primary CD4+ T 세포로부터 정제된 세포외 소포체를 Primary CD8+ T 세포에 처리하여 위와 동일한 방법으로 유세포 분석을 수행하였다.

본 실험에 사용된 1차 항체는 다음과 같다: anti-Ki-67(ab16667, 1:500; Abcam), Perforin(ab16074, 1:500; Abcam), IFN-g(ab9657, 1:500; Abcam), Granzyme B(ab4059, 1:500 Abcam).

그 결과, 도 4와 같이, CD8+ T 세포에 IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)을 처리 시, 세포증식 표지자인 Ki-67 단백질의 발현이 대조군에 비해 약 7% 증가하는 것을 확인하였다. 또한 Primary CD8+ T 세포에 IL-2로 활성화된 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)을 처리 시, 세포증식 표지자인 Ki-67 단백질의 발현이 대조군에 비해 약 40% 증가하는 것을 확인하였다.

또한, 도 5와 같이, CD8+ T 세포에 IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)을 처리 시와, Primary CD8+ T 세포에 IL-2로 활성화된 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)을 처리 시, 둘 다에서 세포독성을 나타내는 표지자인 IFN-γ, 퍼포린, 그랜자임 B 단백질의 발현 역시 대조군 또는 CE 처리군에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 퍼포린과 그랜자임 B의 경우 대조군 또는 CE 처리군 대비 상당한 증가를 보여주었다.

따라서, IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체(IL-2E)이 CD8+ T 세포의 세포독성 능력을 향상시켜 항암 효과를 증진시키는 것을 확인할 수 있었다.

5-2. 실시간 중합효소 연쇄반응

CD8+ T 세포로부터 mRNA(MiniBEST Universal RNA Extracntion Kit, # 9767; TaKaRa)를 추출한 뒤, nanodrop(DS-11 Series Spectrophotometer; DeNovix)을 이용하여 mRNA의 농도를 측정하였다. 이후 100 ng의 mRNA로 cDNA(PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit, # 6110A; TaKaRa)를 합성한 후, TB GreenTM Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) kit(# RR420A; TaKaRa)를 사용하여 유전자 발현을 검출하였다.

본 실험에 사용된 프라이머는 다음과 표 1과 같다.

유전자		염기서열	서열번호
PD-1	F	5'-AGA ATC CTG GAG ACC TCA AC-3'	1
	R	5'-ATA CCC ACT AGG GCA CTC AT-3'	2
Ki-67	F	5’-CAT CAA GGA ACA GCC TCA ACC-3’	3
	R	5’-GAC CTA CGG CGT TGA TCA CT-3’	4
IFN-γ	F	5’-GAC AAT GAA CGC TAC ACA CT-3’	5
	R	5’-TAG GCT TTC AAT GAC TGT GC-3’	6
Granzyme B	F	5’-CTA CTG CTG ACC TTG TCT CT-3’	7
	R	5’-AAA GTA AGG CCA TGT AGG GT-3’	8
Perforin	F	5’-TTT CGC CTG GTA CAA AAA CC-3’	9
	R	5’-AGG GCT GTA AGG ACC GAG AT-3’	10

실시간 중합효소 연쇄반응은 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 시료의 상대적인 mRNA 수준은 동일한 시료의 GAPDH의 양에 대한 정규화 후 Ct(comparative threshold cycle) 분석으로 계산하였고, 초기 Ct 값으로 부터 변형된 2^-△△Ct 값으로 표시하였다.

그 결과, 도 4에서와같이, CD8+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포의 세포외 소포체를 처리 시, T 세포의 증식(proliferation) 표지자인 Ki-67의 mRNA 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 5에서와 같이 CD8+ T 세포와 Primary CD4+ T 세포의 세포외 소포체를 처리 시, T 세포의 활성(activation) 표지자인 IFN-γ, Granzyme B, Perforin의 mRNA 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 세CD8+ T 세포가 암세포를 공격할 수 있는 능력이 촉진되어 항암 효과 증진시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 6: 세포외 소포체로 전처리된 CD8+ T 세포와 흑색종 세포의 공동 배양 분석

CD8+ T 세포를 6 웰 플레이트에 1 X 10⁵ 세포/웰 밀도로 접종한 후, CE(CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체) 또는 IL-2E(IL-2로 활성화된 CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체) (25 μg/ml)로 전처리하였다. 24시간 배양 후, 96 웰 플레이트에 세포를 상이한 비율의 흑색종 세포(1:1 내지 1:10)와 함께 72시간 동안 배양하였다. 배양 종료 시, MTS(# G3582; Promega) 시약을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이후, 각 웰의 상층액을 포함하는 MTS 시약을 제거한 후, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 인간 PBMC에서 분리한 CD8+ T 세포에서도 이와 같은 방법으로 CE(Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체) 또는 IL-2E(IL-2로 활성화된 Primary CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체) (25 μg/ml)로 전처리 후 동일한 과정을 진행하였다.

그 결과, 도 8과 같이, 세포외 소포체를 처리한 CD8+ T 세포와 흑색종 세포의 공동 배양군에서 흑색종 세포의 생존율이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kyungpook National University Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology <120> Composition for preventing or treating cancer disease comprising cytotoxic T cells activated by extracellular vesicles derived from T helper cells as an active ingredient <130> ADP-2020-0366 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1-f <400> 1 agaatcctgg agacctcaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1-r <400> 2 atacccacta gggcactcat 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ki-67-f <400> 3 catcaaggaa cagcctcaac c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ki-67-r <400> 4 gacctacggc gttgatcact 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-r-f <400> 5 gacaatgaac gctacacact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-r-r <400> 6 taggctttca atgactgtgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Granzyme B-f <400> 7 ctactgctga ccttgtctct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Granzyme B-r <400> 8 aaagtaaggc catgtagggt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perforin-f <400> 9 tttcgcctgg tacaaaaacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Perforin-r <400> 10 agggctgtaa ggaccgagat 20

Claims

CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포는 사이토카인에 의해 활성화된 것을 특징으로 하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 CD8+ T 세포의 증식 및 세포독성을 증가시켜 항암 효과를 증대시키는 것을 특징으로 하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암 질환은 흑색종, 피부암, 폐암, 간암, 위암, 췌장암, 골암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호킨스씨병, 식도암, 소장암, 대장암, 결장암, 직장암, 항문부근암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
CD4+ T 세포 유래의 세포외 소포체로 활성화된 CD8+ T 세포를 유효성분으로 포함하는 면역 항암제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포는 사이토카인에 의해 활성화된 것을 특징으로 하는 면역 항암제용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역 항암제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 세포외 소포체는 CD8+ T 세포의 증식 및 세포독성을 증가시켜 항암 효과를 증대시키는 것을 특징으로 하는 면역 항암제용 조성물.
사이토카인을 처리하여 CD4+ T 세포를 활성화시키는 제1단계; 및상기 활성화된 CD4+ T 세포에서 유래된 세포외 소포체를 CD8+ T 세포에 처리하는 단계;를 포함하는 CD8+ T 세포의 활성화 방법.
제10항에 있어서, 상기 제1단계의 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 CD8+ T 세포의 활성화 방법.