KR20210041593A - 암의 예방 또는 치료의 방법에 사용하기 위한 암/고환 항원을 암호화하는 바이러스 벡터 - Google Patents

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캐롤 에스. 렁
안드리안 에스. 힐
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Abstract

암 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 침팬지 아데노바이러스(ChAd) 및 MVA 바이러스 벡터들은, 프라임 부스트 효과를 달성하기 위해 적절한 보조제 하에 피험자에게 순차적으로 투여된다. 폴리뉴클레오티드는, MAGEA3/링커/NY-ESO-1 융합 단백질 및 이의 변이체, 또한, hli/MAGEA3/링커/NY-ESO-1 융합 단백질 및 이의 변이체를 제공하기 위해 투여 후에 인시튜 발현된다. 개선된 T 세포 반응은 확인된다. 특정 시너지 치료 접근법에서, ChAdOx 및 MVA 벡터와 함께 화학요법제 및 관문 억제제의 삼중 조합은, 암의 마우스 모델에서 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 고갈시키고, 생존 시간을 극적으로 개선시킨다.

Description

암의 예방 또는 치료의 방법에 사용하기 위한 암/고환 항원을 암호화하는 바이러스 벡터
본 발명은, 암의 예방 또는 치료를 위한 바이러스 벡터-기반 백신(viral vector-based vaccines), 특히, 포유류에 투여하기 위한, 관심의 암 백신 항원을 포함하는 복제-결함 아데노바이러스(replication-defective adenovirus: Ad) 및 변형된 우두 바이러스 앙카라(Modified Vaccinia Virus Ankara: MVA) 벡터들에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 바이러스 입자(viral particles), 상기 바이러스 입자를 포함하는 면역원성 조성물(immunogenic compositions), 및 바이러스 벡터를 함유하는 숙주 세포와 관련된다. 바이러스 벡터 백신은, 암으로부터 고통받는 피험자를 치료하거나 또는 피험자가 암에 걸리는 것을 예방하는데 사용된다. 바람직한 요법(regime)에서, 본 발명은 Ad 벡터를 사용한 프라임 투여(prime administration), 이후에 MVA 벡터를 사용한 부스트 투여(boost administration)를 포함한다. 본 발명은, 본 발명의 새로운 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 포함하는 백신 조성물을 더욱 제공한다.
매년 160만명 이상의 미국인이 암으로 진단되고 있으며, 2018년 미국에서만 대략 60만명이 이 질병으로 사망할 것으로 예상된다. 지난 수십 년 동안, 암의 발견, 진단, 및 치료에서 상당한 진전이 있었다. 그러나, 여전히 67%의 인간들 만이 치료의 시작 후 5년 동안 생존한다(Siegel, R. L. et al. (2017) Cancer J. Clin. 67 (1): 7-30, 참조).
현재 치료적 옵션은, 수술 절차, 방사선, 고주파, 화학요법, 단일클론 항체, 등을 포함한다. 대부분의 이들 접근법은, 심각한 위험, 독성 부작용, 고비용, 및 의심스러운 효능과 관련된다.
그러나, 암 면역요법은, 최근 몇 년 동안 상당한 진전을 보이고 있으며, 발전하는 관심 분야로서 지속되고 있다. 건강한 정상적인 인간 면역계(immune system)는, 종양-관련 항원(TA)을 인식하는 세포 용해성 T 림프구(cytolytic T lymphocytes: CTLs)의 능력에 기초하여 종양 세포를 식별하고 거부하는 타고난 역량(innate capacity)을 가지고 있다. 암 세포는 보통, 세포 및 체액 모두에서, 통합된 면역 반응(integrated immune response)을 활성화시켜야 한다. 세포 반응은 면역 반응에 참여하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함한다. 그러나, 암 및 악성 암의 발생에서, 종양 세포에 대한 정상적인 CTL 활성(activity)은, 손상되거나 또는 상실된다. 따라서, 암 면역요법은, 종양 세포에 대한 인간 면역계의 CTL 활성을 회복하거나 또는 재생시키기 위한 다양한 접근법을 채택한다. 인간 암 환자의 면역계는, 종양-관련 항원(TA)을 발현하는 악성 세포를 박멸시키는 목표로 활용될 수 있다.
세포독성 T 세포는, CD8을 발현시키고 암 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 T 헬퍼 세포(helper cells)는, 세포독성 반응의 발달을 지원하고, 사이토카인을 생성하며, 또한 B 세포의 성숙(maturation) 및 증식을 돕는다. 체액 반응 동안, B 세포는 활성화되고, 복제되며, 분화되고, TA-특이적 항체를 생성한다. 더 많은 정보는, Murphy, K. & Weaver, C. "Janeway's Immunobiology" 9th Edition (2016): Garland Science/Taylor & Francis: New York, NY을 참조.
입양(Adoptive) T 세포 치료법 및 면역 관문 조절제(immune checkpoint modulators)는, 종양을 거부하는 인간 면역계의 능력을 높이기 위한 임상 접근법이다. 그러나, 상기 접근법 모두는 제한을 갖는다. 입양 T 세포 치료법은, 요구된 특이성의 효과기 T 세포(effector T cells)의 확장 및 형질도입을 필요로 한다(Baruch E. N. et al. (2017) Cancer 123 (S11): 2154-62, 참조). 이러한 복잡성은 현재 이러한 접근법의 적용가능성을 제한한다. 면역 관문 조절제의 한 부분인, 관문 억제제 치료는, 효과기 기능을 개선하기 위해 T 세포에 대한 제동기(brakes)를 해제하는 단일클론 항체에 기초한다. 관문 억제제가 진행된 암 환자의 일부에서 장기적인 임상 반응을 유도할 수 있지만, 모든 T 세포의 이러한 자극에 의해 유발된 자가면역 독성의 부작용은 여전히 문제이다. 또한, 기존의 관문 억제제 치료는, T 세포에 의해 침투되지 않는 "불응성" 종양("cold" tumours)과 관련하여 효능이 부족하다.
이에 대한 유망한 대안을 대표하는 또 다른 접근법은, 종양 세포에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용되는 암 백신 또는 좀 더 구체적으로 암 치료용 백신이다. 이것은 종양 세포가 본질적으로 면역원성이 낮고, 백신이 이러한 결핍을 극복하는데 도움이 되어야 한다는 개념에 기초한다. 많은 다른 타입의 암 백신은 연구되었으며, 몇몇은 유망한 결과를 나타냈다. Sahin U. et al. (2017) Nature 547 (7662): 222-226은, 암에 대하여 다중특이적 치료 면역을 동원하는 맞춤형 RNA 돌연변이 백신을 시도했다. 또한, Ott P. A. et al. (2017) Nature 547 (7662): 217-221은, 흑색종 환자에 대해 맞춤형 면역원성 신생항원 백신을 시도했다.
그러나, 암 백신의 잠재력은, GlaxoSmithKline(GSK)에 의한 2개의 대규모 Ⅲ 상(phase Ⅲ) 시험을 포함하여, 여러 대규모 임상 시험의 실패 후, 의심스러워졌다. 이들 시험들은, 보조제와 조합된 재조합 종양-관련 단백질에 기초한 백신접종 접근법을 사용한다. 이러한 백신 플랫폼(vaccine platform)은, 다른 많은 플랫폼과 마찬가지로, 우수한 항체 및 CD4+ T-헬퍼 반응을 유도할 수 있는 것으로 입증되었지만, 일관된 CTL 반응을 증가시킬 수 없었다. CTLs이 항-종양 면역 반응의 주요 효과기인 점을 감안할 때, 이는 이들 백신의 임상 실패를 적절히 설명한다. 따라서, 기술적 과제는, 인간에게 양호한 CD8 반응을 유도하는 새로운 암 백신 플랫폼을 제공하는 것이다.
일부 효능을 달성하기 위해, 암 백신은: ⅰ) 암 세포에 대해 잠재적으로 발현되거나 또는 단독으로 발현되고, 통합된 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 표적화하는 능력; 및 ⅱ) 항원-특이적 T 세포의 강력한 클론 확장 및 효과기 및 기억 분화를 유도하는 능력을 가져야 하는 것으로 믿어진다(Coulie, P.G. (2014) Nat. Rev. Cancer, 14 (2): 135-146, 참조).
전통적으로, 치료용 암 백신은 종양 항원(TA) 단백질 및 보조제를 포함한다. 예를 들어, (이전에 BLP25 리포솜 백신(L-BLP25)으로 알려진) Stimuvax로 불리든 백신은, 뮤신(mucin) 1(MUC1) 항원 및 보조제인 MPL4로부터 파생된 합성 펩티드를 캡슐화시킨 리포솜으로, US 6,600,012(B1) BIOMIRA INC.와 관련된다. 또한, 절개된 MAGE-A3-양성 비-소-세포 폐암 환자에서 3상 시험에서 평가된 MAGRIT 백신(Vansteenkiste, JF et al Lancet Oncol. 17 (6): 822-835, 참조)은, 재조합 흑색종-관련 항원 MAGE-A3 단백질과 조합된 AS15 보조제를 함유한다. 그러나, 위에서 일반적으로 나타낸 바와 같이, 이들 Stimuvax 및 MAGRIT 백신은, 대규모 Ⅲ 상 시험에서 효능을 나타내지 못했다.
미국과 유럽에서 승인된 최초의 "암 백신"은, 환자의 항원 제시 세포(APC)가 전립선 산성 인산효소(prostate acid phosphatase: PAP) 항원과 함께 배양되는 자가(autologous) 세포 백신인, PROVENGE이다. 적절한 T 세포 반응을 활성화시키는 능력 및 효능에도 불구하고, 이러한 백신은, 각 환자에 대해 개별적으로 만드는 것이 요구되며, 이에 의해 복잡하고 값비싼 제작 공정을 포함한다. 결과적으로, 백신은 제한된 실용성을 갖는다(US2004/141991 (A1) LAUS et al., 참조).
벡터-기반 암 백신은, 임상에서 시험된 여러 벡터 기술들, 보조제들 및 조합들로 큰 가능성을 보였고 강력한 치료적 관심을 불러 일으켰다. 이러한 전략의 토대는, 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 종양 항원을 전달하는 것이다. 바이러스 벡터 자체는, 복제-결함이 있도록 변경되어, 더 이상 환자에게 해롭지 않다. 벡터는 보조제로서 작용하고 면역 반응의 유도를 가능하게 하는 다른 바이러스 항원뿐만 아니라 TA를 모두 발현한다. 이상적인 바이러스 벡터는: ⅰ) 안전하고; ⅱ) 효율적인 항원 제시를 가능하게 하며; ⅲ) 통합된 면역 반응을 유도하고; ⅳ) 대규모로 생산이 가능한, 몇 가지 특성을 가져야 한다(Melief, C. J. M. et al. (2015) J. Clin. Invest. 125 (9): 3401-3412, 참조).
임상 사용을 위해 여러 바이러스 벡터는 제안되었다. 예를 들어, 복제-결함 아데노바이러스(Ad)는, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1에 대한 EP 2,130,921 B1 GLAXOSMITHKLINE BIOLOGALS SA 또는 말라리아에 대한 US2012/082694(A1) CRUCELL에 개시된 것과 같은 감염성 질병에 대한 백신 벡터로서 연구되었다.
백신접종의 분야에서, 백신 투여는 통상적으로 1차 주사와 동일한 방식으로, 그러나 나중에, 또는 후에 투여되는 하나 이상의 부스팅 주사(boosting injections)가 수반된다. 1차(프라이밍)와 후속(부스팅) 투여 사이에 간격 동안에, 면역계는 세포 및 체액 반응 모두를 유도하여 반응한다(Woodland, D.L. (2004) Trends Immunol. 25 (2): 98-104, 참조).
그러나, 동일한 벡터를 사용한 반복 투여(상동 부스팅(homologous boosting))는, 바이러스 항원에 대해 경쟁 면역원성(competing immunogenicity)이 발생되어, 바이러스 캡시드(capsid)의 표면 항원을 인식하고, 재조합 벡터에 의한 항원-제시 세포의 추가 감염을 방지하는 항체를 생성을 결과하기 때문에, 종양 항원-특이적 T 세포 반응을 높이는데 실패했다. 특히, 상동 부스팅은 삽입된 종양 항원에 대하여 CD8 T 세포를 유도하지 않는다. 이러한 문제를 피해가는 잠재적인 접근법은, 2개의 다른 바이러스 벡터와 같은 다른 항원-전달 시스템(이종 부스팅)을 사용하는 백신의 순차적 투여를 포함한다. EP 2,631,290 (A1) NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION은, 우두 바이러스 벡터 및 센다이 바이러스 벡터를 포함하는 프라임/부스트 백신용 바이러스 벡터를 개시한다. Chen, J.-L. et al. (2015) Int. J. Cancer 136 (6): E590-601은, ISCOMATRIX에 NY-ESO-1 단백질로 프라이밍되고, 재조합 NY-ESO-1 계두 바이러스(fowlpox virus)로 부스팅된 흑색종 환자에서 NY-ESO-1 특이적 항체 및 세포 반응을 기재한다.
DNA 백신 및 다양한 바이러스 벡터로 구성된 많은 프라임/부스트 백신은, 시도되고 있다. 예를 들어, WO2006/057454 (A1) JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY는, 프라이밍용 Bacillus Calmette-Guerin(BCG) 벡터 및 부스팅용, 약독화된 우두 바이러스 균주 DIs를 사용하여 HIV-1 gag E 항원에 대해 개발된 이종 프라임/부스트 HIV 백신을 개시한다. Odunsi, K. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109 (15): 5797-5802는, 2개의 다른 오르토폭스(orthopox) 벡터(우두 및 계두) 및 항원 NY-ESO-1을 이용한 프라임-부스트 접근법을 사용한 제한된 크기의 Ⅰ상 연구를 기재하고, 흑색종 및 난소 암 환자들 중에서 가능한 임상적 이점을 나타낸다.
인간 아데노바이러스는, 이의 특성들(예를 들어, 복제-결핍, 안정성, 높은 면역원성, 수많은 세포 타입을 형질도입하는 능력, 등) 때문에, 암 백신의 개발을 위해 과학자들에 의해 널리 사용된다. 자연적인 아데노바이러스 감염은, 인간 집단에서 만연하며, 대부분의 인간은 생후 5년 이내에 혈청전환된다. 따라서, 인간 아데노바이러스에서 파생된 암 백신은, 이의 효능을 제한할 선재성(pre-existing) 체액 및 세포 면역과 충돌할 것이다(Coughlan, L. (2015) et al. J. Pharm. Pharmacol. 67(3): 382-399 및 US 6,140,087 ADVEC INC entitled "Adenovirus Vectors for Gene Therapy", 참조).
명칭이 "Simian Adenovirus and hybrid Adenoviral vector"인, US 9,714,435 (B2) ISIS INNOVATION 및 명칭이 "Chimpanzee Adenovirus Vaccine Carriers"인, EP 2,163,260 (A2) ISTITUTO RICHERCHE DI BIOLOGICA MOLECULARE는, 과학자들이 어떻게 인간에서 임의의 선재성 면역을 피하는, 비-인간 영장류로부터 유래된 복제-결함 아데노바이러스를 개발했는지를 설명한다. 침팬지 아데노바이러스(ChAd)는 몇 가지 특질들: ⅰ) 강력한 면역원성; ⅱ) 인간에서 낮은 혈청유병률; ⅲ) 표준화된 제조 생산을 나타낸다.
또한, 약독화된 비-복제 우두 바이러스 앙카라 균주(MVA)는 알려져 있다. 이러한 바이러스 벡터는 우수한 안전성 프로파일(safety profile)로 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. MVA는, 닭 배아 섬유아세포에서 570 초과의 계대(passages)에 의해 이의 게놈의 대략 15%의 결과 손실(consequent loss)로 약화되었다. 따라서, MVA는, 많은 포유류 세포에서 비리온(virions)을 성숙시키는 능력이 부족하고, 강력한 면역원성 및 감소된 증폭의 위험과 관련이 있다. Isis Innovation Limited의 WO2011/128704호는, 이식유전자가 폭스바이러스 게놈(poxvirus genome)에 삽입되고, 따라서, 폭스바이러스 벡터를 제공하는, MVA를 포함하는, 폭스바이러스 발현 시스템 및 감염, 암 치료 및 유전자 치료에 대한 백신의 목적을 위해 관심 유전자를 표적 세포로 전달하기 위한 이의 용도를 개시한다. 또한, Isis Innovation Limited의 EP 2044947 A1은, 면역 반응, 특히, 인플루엔자 바이러스에 대한 T 세포 면역 반응을 유도하는데 사용되는 MVA 바이러스 벡터를 기재한다.
감염성 질병에 대한 치유법을 목표로 하여, 이종 프라임-부스트 요법에서 바이러스 벡터-기반 백신은 개발되고 최적화되어, 강력한 CTL 반응을 유도한다. 이러한 백신 전략은, 프라임용 침팬지 아데노바이러스(ChAd) 및 부스트로 동일한 면역원을 전달하는 변형된 바이러스 앙카라(MVA)를 사용한다. Coughlan L. et al. (2015) J. Pharm. Pharmacol. 67 (3): 382-99 및 Hui E. P. et al. (2013) Cancer Res. 73 (6): 1676-88은, 감염성 질병 설정에서 전임상 및 임상 연구에서 2개의 바이러스 벡터들의 개별 시험 및 이들이 매우 높은 안전성 프로파일을 어떻게 갖는지에 대해 보고한다.
EP 2,044,947 (A1) ISIS INNOVATION은, 인플루엔자의 예방에서 프라이밍을 위한 아데노바이러스 벡터 및 그 다음 부스팅을 위한 MVA을 이용한 백신을 개시한다.
Ewer K. J. et al. (2013) Nat. Commun. 4: 2836 및 Ogwang, C. et al. (2015) Sci. Transl. Med. 7(286): 286re5는, 말라리아에 대해 프라이밍으로 ChAd 및 부스팅으로 MVA를 이용하는 백신을 개시한다.
동일한 프라임-부스트 접근법은, 암 마우스 모델에서 5T4 항원을 발현시키는 Cappuccini, F. et al. (2017) Oncotarget 8 (29): 47474-47489, 및 암 마우스 모델이 전립선 암 항원인 STEAP1을 발현시키는 Cappuccini, F. et al. (2016) Cancer Immunol. Immunother. CII 65 (6): 701-713에 기재되어 있다. 이들 모든 연구에서, 이종 프라임-부스트 백신은, TA에 대한 강력한 면역 반응 및 항원-특이적 CD8+ T 세포의 활성화를 유도한다.
또한, 임상적으로 관련된 암 모델에서 복제성 종양용해 랍도바이러스(oncolytic rhabdovirus) 및 면역 관문 억제제의 공동-투여를 기재하는 WO2017/120670 A1 (Lichty, B. & Bell, J.)은, 상당한 생존 및 항원-특이적 T 림프구의 자극을 결과한다. 종양용해 랍도바이러스는, 악성 세포를 특이적으로 감염시키고, 복제하며, 사멸하여 영향받지 않은 정상 조직을 남긴다. 종양용해 랍도바이러스(예를 들어, VSVdelta5 Ⅰ 또는 Mamba MG 1)는, 시험 동물이 MAGEA3, 인간 유두종 바이러스 E6/E7 융합 단백질, 전립선 단백질의 인간 6-막관통 상피 항원, 또는 암 고환 항원으로부터 선택된 선재성 면역을 갖는 종양 항원을 발현시킨다.
성공적인 암 치료용 백신은, 정상 조직이 아닌 종양에서 발현되는 종양 항원을 표적으로 삼을 필요가 있을 것이다. 암-생식계 항원은, 여러 타입의 암에서 생리학적으로 발현되지만, MHC I 분자의 결핍에 기인하여 면역계에 항원을 제시할 수 없는 생식계 세포를 제외하고는, 분화된, 정상 조직에서는 발현되지 않는 단백질의 이종 그룹이다. 이들 항원은 암-생식계 유전자에 의해 암호화된다. NY-ESO-1 및 MAGE-A3는, Gnjatic, S. et al. (2006) Cancer Res. 95: 1-30에 기재된 바와 같은 가장 대표하는 그룹 중 2개의 원형 MAGE-타입 항원들이다. 또한, 상기 Coulie P. G. et al. (2014)는, 다수의 환자에서 발생하는 것으로 나타난 반응을 기재한다.
본 개시는, 암의 예방 또는 치료를 위한 방법들 및 바이러스 벡터들을 제공한다.
본 발명에 따르면, 핵산 분자를 캡슐화하는 침팬지 아데노바이러스(ChAd) 벡터가 제공되며, 상기 핵산 분자는, 동물 세포에서 암 항원 또는 이의 단편의 번역, 전사 및/또는 발현을 지시하는 발현 조절 서열, 및 아데노바이러스 패키징 신호 서열(packaging signal sequence)에 작동 가능하게 연결된, (ⅰ) MAGE 암 항원 및/또는 NY-ESO-1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) MAGE 암 항원 및/또는 LAGE1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유리하게는, 이러한 ChAd 바이러스 벡터는 안정하고, 잘-연구되어 있으며, 인간 아데노바이러스에 대한 항체에 의해 중화되지 않고, 복제 결핍인 것으로 유전자조작된다. 이들은 관심의 삽입된 항원에 대한 높은 용량(high capacity)을 가지고 있으며, 아데노바이러스 E1 유전자를 함유하는 HEK293 세포에서 생성될 수 있다.
MAGE-타입 항원은, 암 환자에서 CD8 T 세포를 유도하는 것으로 알려진 종양-특이적 공유 인간 종양 항원이다. 이들은, 많은 암 타입에서 발현되며, MHC-1 분자가 없는 수컷 생식계 세포를 제외하고는, 정상 조직에서는 발현되지 않는다.
NY-ESO-1(유전자명 CTAG1)은, 많은 암 환자에서 강력한 CD8 반응을 유도하고, 다수의 CD8 에피토프(epitopes)는, 다수의 HLA 클래스 I 특이성에 의해 제시된 바와 같이, 식별될 수 있다.
특정 형태에서, ChAd 벡터는, (a) WO2012/172277호에 개시된 바와 같은 ChAdOx1; 바람직하게는 WO2012/172277호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO: 38의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 80% 동일성의 서열에 의해 암호화된 ChAdOx1; 또는 (b) WO2017/221031호에 개시된 바와 같은 ChAdOx2; 바람직하게는 WO2017/221031호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO: 10의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 80% 동일성의 서열에 의해 암호화된 ChAdOx2일 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 캡슐화하는 변형된 우두 바이러스 앙카라(MVA) 벡터를 제공하며, 상기 핵산 분자는, 동물 세포에서 암 항원 또는 이의 단편의 번역, 전사 및/또는 발현을 지시하는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, (ⅰ) MAGE 암 항원 및/또는 NY-ESO-1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) MAGE 암 항원 및/또는 LAGE1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유리하게는, 이러한 MVA 벡터는 인간에서 복제할 수 없으며, 천연두 백신과 같은 긴 안전성 추적 기록(safety track record)을 갖는다. MVA는 ChAd로 프라이밍 후 우수한 부스팅을 제공한다. MVA는 독성 및 면역계 회피 인자가 없고, 면역원성이 높으며, 닭 배아 섬유아세포 또는 불멸화된 오리 배아 세포주에서 쉽게 생성된다.
좀 더 특별한 형태의 MVA 벡터는, WO2011/128704호 또는 EP 2044947 A1에 개시된 바와 같은 것일 수 있다.
여기에서 기재된 바와 같은 본 발명의 ChAd 및/또는 MVA 벡터의 경우, MAGE 항원은 바람직하게는 MAGE3A이고, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 46%; 바람직하게는 적어도 69%; 좀 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성의 서열; 또는 이의 임의의 면역원성 단편을 갖는다.
여기에서 기재된 바와 같은 본 발명의 ChAd 및/또는 MVA 벡터의 경우, NY-ESO-1 암 항원은, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75%; 바람직하게는 적어도 76.7% 동일성의 서열; 또는 이의 임의의 면역원성 단편을 갖는다.
여기에서 기재된 바와 같은 본 발명의 ChAd 및/또는 MVA 벡터의 경우, LAGE1 항원은, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 78%; 바람직하게는 적어도 97% 동일성의 서열; 또는 이의 임의의 면역원성 단편을 갖는다.
본 발명의 바람직한 ChAd 및/또는 MVA 벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은, 인간 HLA 클래스 Ⅱ 조직적합성 항원 감마 사슬(hli 또는 li)을 더욱 암호화할 수 있으며, li은 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 79% 동일성의 서열, 또는 이의 단편을 가질 수 있어서, 암 항원이 li 또는 이의 단편과의 융합으로서 동물 세포에서 발현되며; 더욱 바람직하게는, 여기서 상기 단편은 막관통 도메인(transmembrane domain)이고; 더욱 더 바람직하게는, 여기서 상기 막관통 도메인은 아미노산 잔기 30 내지 55 또는 30 내지 61을 포함한다. 특히 바람직한 구현 예에서, 상기 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 선택적으로 바람직한 ChAd 및/또는 MVA 벡터에서, 폴리뉴클레오티드 서열은, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 81% 동일성의 서열, 또는 이의 단편을 갖는 tPA를 더욱 암호화할 수 있어, 암 항원이 tPA 또는 이의 단편과 융합으로 동물 세포에서 발현되며; 좀 더 바람직하게는, 여기서, 상기 단편은 21개 아미노산 리더 서열(leader sequence)을 포함하고; 더욱 더 바람직하게는, 상기 21개 아미노산 리더 서열은 SEQ ID NO: 9이다.
유리하게는, li 또는 tPA의 포함은, 바이러스 벡터 생성 항원의 면역원성을 증가시킨다. 이는 항원-특이적 T 세포 반응의 크기, 폭 및 기간을 증가시킨다.
본 발명의 ChAd 벡터는, 융합 단백질로서 동물 세포에서 발현되는, (ⅰ) 여기에서 각각 정의된 바와 같은, MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및 NY-ESO-1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) 여기에서 각각 정의된 바와 같은, MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및 LAGE1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레어타이드 서열을 갖도록 구축될 수 있다.
본 발명의 MVA 벡터는, 융합 단백질로서 동물 세포에서 발현되는, (ⅰ) 여기에서 각각 정의된 바와 같은, MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및/또는 NY-ESO-1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) 여기에서 각각 정의된 바와 같은, MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및/또는 LAGE1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖도록 구축될 수 있고, 여기서, MAGE 암 항원, NY-ESO-1 암 항원 또는 LAGE1 암 항원 중 적어도 하나는 단편이다.
본 발명자들은, NYESO-1이 인간에서 MAGEA3보다 좀 더 면역원성일 수 있는 것으로 믿는다. 또한, 암 환자에서, 이들의 특정 그룹에서, 종양은 NY-ESO-1이 아닌 MAGEA3를 더 자주 발현시키는 것으로 확인된다. 따라서, 가능한 문제는, MAGEA3에 대해 효과 없는 면역화 및 NY-ESO-1에 대한 면역우성(immunodominant) 면역 반응으로 이어지는 MAGEA3 및 NY-ESO-1 항원들 모두를 포함하는, 본 발명의 프라임-부스트 요법에서 MVA 부스트 벡터를 갖는 것일 수 있다. 따라서, 적어도 이러한 특정 환자 그룹, 또는 NY-ESO-1에 비해 MAGEA3의 더 높은 발현을 갖는 그룹의 경우, 단지 MAGEA3 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 MVA 벡터는, 프라임-부스트 요법에 바람직하다. 즉, 특정 구현 예에서, 본 발명은, 임의의 NY-ESO-1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 MVA 벡터를 포함하지 않는다. 유사한 방식으로, 특정 구현 예에서, 본 발명은, 임의의 LAGE1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 MVA 벡터를 포함하지 않는다.
바람직한 구현 예에서, 각각의 MVA 벡터, 각각의 MAGE 암 항원 및 NY-ESO-1, 또는 MAGE 암 항원 및 LAGE1은 면역원성 단편이다.
본 발명의 ChAd 및/또는 MVA 벡터가 발현시 항원의 융합을 산출하도록 구축되는 경우, 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 또한, 발현시, 융합 단백질로서, 임의의 순서로, MAGE 및 NY-ESO-1 또는 LAGE1 암 항원들 또는 이의 단편들을 연결하는, 5 내지 9개의 아미노산의 적합한 폴리펩티드 링커; 좀 더 바람직하게는, 아미노산 서열 GGGPGGG를 갖는 링커를 암호화한다.
따라서, 본 발명은 또한 위에서 및 여기에서 기재된 바와 같은 ChAd 또는 MVA 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 적합한 보조제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 여기에서 기재된 바와 같은 ChAd 벡터 또는 MVA 벡터에 함유된 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 더욱 제공한다.
바람직한 폴리뉴클레오티드는, MAGEA3/링커/NY-ESO-1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 또한, SEQ ID NO: 10과 적어도 70% 동일성의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 가능하다. 501개 아미노산의 번역된 단백질 서열은, SEQ ID NO: 11에 제시된 바와 같거나 또는 이와 적어도 70% 동일성의 서열이다.
또 다른 바람직한 폴리뉴클레오티드는, hli/MAGEA3/링커/NY-ESO-1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 SEQ ID NO: 12를 갖는다. 또한, SEQ ID NO: 12와 적어도 70% 동일성의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 가능하다. 번역된 단백질 서열은, SEQ ID NO: 13에 제시된 서열 또는 이와 적어도 70% 동일성의 서열이다.
또 다른 바람직한 폴리뉴클레오티드는, tPA/MAGEA3/링커/NY-ESO-1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 SEQ ID NO: 14를 갖는다. 또한, SEQ ID NO: 14와 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는 가능하다. 번역된 단백질 서열은, SEQ ID NO: 15에 제시된 서열 또는 이와 적어도 70% 동일성의 서열이다.
특정 구현 예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는, 전술된 서열 중 어느 하나 또는 이의 변이체로 이루어진다.
본 발명의 모든 관점에서, 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 인간에서 발현을 위해 최적화된 코돈(codon)이다. 당업자는, 예를 들어, Puigbo, P. et al. (2007) OPTIMIZER: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences: Nucleic Acids Research, 35:W126-W131, 또는 미국 특허 제8,326,547호에 기재된 것들을 포함하는, 다수의 이용가능한 소프트웨어 패키지에 익숙할 것이다. 또한, 이와 같은 상업적으로 이용가능한 서비스 및 소프트웨어는, Integrated DNA Technologies 또는 GenScript에 의해 제공된다.
본 발명은 또한 여기에서 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론을 포함한다. 바이러스 게놈의 BAC 클론을 바이러스로 전환("구제(rescue)")은, 여기에서 참조로서 병합된, Isis Innovation Limited의 WO2012/172277호에 기재된 바와 같은, 잘 알려진 공정에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 여기에서 기재된 바와 같은 ChAd 및/또는 MVA 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 더욱 포함한다.
또한, 본 발명은, 유효량의 여기에서 기재된 바와 같은 ChAd 벡터를 투여하는 단계, 및 유효량의 여기에서 기재된 바와 같은 MVA 벡터를 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 개체의 후천성 면역계가 자극되어 항-암 면역 반응을 제공하는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 유리하게는, 본 발명의 방법은, 강한 T 세포 면역 반응, 특히, 오래 지속되는 보호 면역으로 이어지는 강한 CD8+ 면역 반응을 발생시킨다.
본 발명에 따른 바람직한 암 예방 또는 치료 방법에서, ChAd 및 MVA 벡터의 투여는, 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 수행된다.
본 발명에 따른 암을 예방 또는 치료하는 특정 방법에서, 유효량의 하나 이상의 면역 관문 조절제는 추가 투여된다. 이러한 관문 조절제는, ChAd 및 MVA 벡터와 동시에, 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 암을 예방 또는 치료하는 방법에서, 치료 중인 개체는, 화학요법 및/또는 방사선요법 치료를 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정인 개체일 수 있다.
본 발명에 따른 암 예방 또는 치료 방법에서, ChAd 벡터는 바람직하게는 맨 먼저 투여된다.
본 발명의 암 예방 또는 치료 방법에서, ChAd 및 MVA 벡터는 각각 1회 이상 투여될 수 있다. 바람직한 관점에서, ChAd가 프라이밍 면역화로 사용되는 경우, 이들 중 오직 1회 면역화가 있고, 뒤이어, 2회의 MVA 부스터 면역화가 수반된다. 또한, ChAd 및 MVA 벡터가 교대로 투여되는, 암 치료 또는 예방의 방법은 가능하다.
본 발명의 벡터의 각 투여 사이에 기간은, 5일 내지 8주 범위일 수 있고; 바람직하게는, 프라임과 후속 부스트 또는 부스트들 사이에 약 1주의 기간일 수 있다.
관문 조절제가 투여되고 또한 치료 요법의 일부를 형성하는 본 발명의 암 예방 또는 치료 방법에서, 관문 조절제는 PD-1, CTLA-4 또는 PD-L1을 차단하는 억제제일 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 벡터 및 면역원성 조성물과 함께 하나 이상의 관문 조절제의 사용은, 등가 효과에 필요한 관문 조절제의 복용량을 감소시키는데 도움이 될 수 있다 (즉, 단독으로 사용되는 경우). 효과는 단순히 부가된 것이 아니라 본 발명의 바이러스 벡터 치료 요법과 관문 조절제 사이에서 상승 효과이다.
특히 바람직한 관문 조절제는, 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 이필리무맙(Yervoy®), 트레멜리무맙 또는 아테졸리주맙(Tecentriq®), 두르발루맙(Imfinzi®) 또는 아벨루맙(Bavencio®)으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 암을 예방 또는 치료하는 방법은, 암-생식계 유전자, 바람직하게는 MAGE-타입, NYESO, 및 LAGE 항원을 암호화하는 유전자를 발현하는 암과 관련되고: 바람직하게는 특정 암 타입들과 관련되며, 예를 들어, 여기서 상기 암은 비-소세포 폐암(NSCLC), 흑색종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 요로암(요로상피암), 식도암, 방광암, 소세포 폐암, 신장암, 두경부암, 육종, 또는 유방암이다.
따라서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 ChAd 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 MVA 벡터를 포함한다. 이러한 사용과 관련하여, 본 발명의 방법의 각각의 다양한 관점은, 동일하게 적용된다.
더욱이, 본 발명은, 암의 예방 또는 치료를 위해 환자에게 개별적, 순차적 또는 동시 투여를 위한, 여기에 정의된 바와 같은 본 발명의 ChAd 벡터, 및 여기에 정의된 바와 같은 본 발명의 MVA 벡터를 포함한다.
여기에 정의된 바와 같은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터는, Chen, DS 및 Mellman, I. (2013) Immunity 39(1):1-10, 및 Chen, D.S. and Mellman, I. (2017) Nature 541(7637):321-330에 기재된 바와 같은 암-면역 주기 또는 암-면역 설정-지점(cancer-immunity set-points)의 하나 이상의 조절제; 바람직하게는, 암의 치료를 위해 ChAd 및 MVA 벡터와 함께 투여하기 위한 관문 억제제를 더욱 포함할 수 있다.
현재 진행성 암 환자의 상당수는 관문 조절제에 기초한 면역치료에 반응하지 않는다. 예를 들어, 항-PD1 억제제가 흑색종, 신세포(renal cell) 암종, 두경부 암종 및 폐 암종에서 사용되는 경우이다. 하나의 관점에서, 본 발명은 항-PD1 및 화학요법과 조합하여 MAGE-A3 및 NY-ESO-1에 대하여 CD8 T 세포를 유도하기 위해 ChAd/MVA 백신을 사용한다. 어떤 특정 이론에 의해 구속되는 것을 원하지는 않지만, 본 발명자들은, 그렇게 하지 않으면, "불응성" 종양이 항-PD1에 의해 부스팅될 종양-특이적 CD8 T 세포에 의해 침투될 것으로 예상한다.
본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 백신, 화학요법제에 더하여 관문 억제제의 삼중 조합이 백신 단독 또는 백신에 더하여 화학요법제 또는 백신에 더하여 관문 억제제와 비교할 때, 마우스 모델에서 현저하게 개선된 항-종양 효과, 및 마우스의 상당한 생존 시간을 제공한다. 실제로, 삼중 조합의 효과는 상승 효과가 있다. 골수 유래 억제 세포(MDSC)의 상당한 고갈은, 삼중 조합으로 달성된다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 삼중 조합 치료의 방법 및 상응하는 의학적 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은, 암의 예방 또는 치료를 위해 환자에게 개별적, 순차적 또는 동시 투여를 위한, 위에서 정의된 바와 같은 ChAd 벡터, 위에서 정의된 바와 같은 MVA 벡터, 화학요법제, 및 관문 억제제를 제공한다.
화학요법제는, (a) 카보플라틴 또는 시스플라틴과 (b) 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 젬시타빈, 에토포시드 또는 페메트렉시드 중 하나의 조합으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 관문 억제제의 경우, PD-1일 수 있다. 이러한 특정 삼중 조합은, 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 소세포 폐암(SCLC), 흑색종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 요로암(요로상피암), 방광암, 신장암, 두경부암, 육종 또는 유방암에 대한 유용한 치료를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일부로서, 암의 예방 또는 치료를 위해 여기에서 기재된 바와 같은 ChAd 및/또는 MVA 벡터를 포함하는 키트는 제공된다. 이러한 키트는, 본 발명의 ChAd 및/또는 MVA 벡터 중 하나를 보유하는 적어도 하나의 용기를 포함한다. 키트는 본 발명의 다른 바이러스 벡터를 각각 갖는 둘 이상의, 즉, 다수의 용기를 포함할 수 있다. 키트는, 사용될 백신 요법에 대한 필수적 정보, 예를 들어, 프라임-부스트, 및 투여들 사이에 기간을 포함하는, 백신으로 벡터의 사용에서 일련의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 더 복잡한 구현 예에서, 키트는, 여기서 기재된 발명에 따라, 추가 치료 요소 중 어느 하나, 예를 들어, 관문 조절제를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 구현 예는 수반되는 도면을 참조하여 더욱 설명된다.
도 1a는, 마우스 P1A 항원(mouse P1A antigen)을 암호화하여 제조된 ChAdOx1 벡터를 개략적으로 나타낸다.
도 1b는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 취하고 면역 반응을 위해 시험된 마우스의 ChAdOx1-P1A/MVA-P1A 프라임-부스트 면역화의 개략적인 개요를 나타낸다.
도 2는, 도 1에 나타낸 바와 같이, P1A를 암호화하는 ChAdOx1/MVA 바이러스 벡터로 면역화된 마우스에서 CD8+ T 세포 반응의 결과를 나타낸다.
도 3은, 동계(syngeneic) P1A-발현 암 세포주, P815 및 15V4T3에 의한 공격에 대한 DBA/2 마우스의 ChAdOx1-P1A/MVA-P1A 프라임-부스트 예방 백신접종의 개략적인 개요를 나타낸다.
도 4는, 3개의 P1A 항원 대 인산 완충 식염수(PBS) 대조군에 대해 도 3에 나타낸 바와 같이 마우스의 프라임-부스트 백신접종 후 시간에 따른 평균 P815 종양 성장을 나타낸다.
도 5는, 도 4에 나타낸 백신접종된 마우스에 대한 카플란-마이어(K aplan-Meier) 생존 곡선을 나타낸다.
도 6a는, ChAdOx1-liP1A/MVA-P1A의 프라임-부스트 백신접종 후 시간에 따른 평균 15V4T3 종양 성장, 또는 인산 완충 식염수(PBS) 대조군에 대해 도 3에 나타낸 바와 같은 마우스의 세포주 L1210.P1A.B7.1을 이용한 면역화를 나타낸다.
도 6b는, 도 6a에 나타낸 백신접종된 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 7은, 확립된 종양(established tumours)의 거부를 포함하는, 치료 환경에서 마우스에 프라임-부스트 PIA 백신을 시험하기 위한 백신접종 계획을 개략적으로 나타낸다.
도 8a는, P1A-발현 동계 암주 15V4T3에 의한 공격에 대한 치료 환경에서 DBA/2 마우스에 다른 ChAdOx1-P1A/MVA-P1A 프라임-부스트 백신접종 요법으로 백신접종-후 시간에 따른 종양 부피 성장을 나타낸다.
도 8b는, 프라임 부스트 백신접종 계획(단일 프라임-부스트, 고용량(108 ChadOx/107MVA)) 후 25일까지 평균 종양 성장을 나타낸다.
도 8c는, 도 8에 나타낸 백신접종된 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 9는, 마우스의 치료 환경에서 ChAdOx1-liP1A/MVA-P1A의 프라임-부스트 백신접종과 항-PD1 관문 억제제 치료를 조합한 효과를 보여주기 위해 실험에 사용된 백신접종 계획을 나타낸다.
도 10은, P1A-발현 동계 암주(cancer line) 15V4T3에 의한 공격에 대한 DBA/2 마우스에서, 면역 관문 억제제와 조합한 ChAdOx1-liP1A/MVA-P1A 프라임-부스트 백신접종 요법에 대한 시간에 따른 종양 부피 성장을 나타낸다.
도 11은, 도 10에서 백신접종된 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다.
도 12는, 비근교계 CD1 마우스(outbred CD1 mice)가 MAGE-A3 (M) 및 NY-ESO-1 (NY) 단백질을 암호화하는 바이러스 벡터로 백신접종된 다음, CD8+ T 세포 반응이 결정되는 실험에 대한 개략적인 개요를 나타낸다.
도 13은, 불변 사슬 li 또는 tPA를 갖거나 갖지 않는, ChAdOx-MAGEA3/NY-ESO-1 융합을 이용한 비근교계 CD1 마우스의 면역화의 결과로서 (IFNγ 생산에 의해 측정된 것으로) CD8 T 세포의 유도를 나타낸다. 면역화 후 단리된 PBMCs는 중첩 MAGEA3 또는 중첩 NY-ESO-1 펩티드로 생체 외 자극된다.
도 14는, 도 13에서와 동일하고 tPA를 갖거나 갖지 않는 MVA-MAGEA3의 부스트를 이용한 면역화의 결과를 나타낸다.
도 15는, 도 13에서와 동일하고 tPA를 갖거나 갖지 않는 MVA-NY-ESO-1의 부스트를 이용한 면역화의 결과를 나타낸다.
도 16에서 A)는, ChAdOx-M-NY, ChAdOx-tPA-M-NY 또는 ChAdOx-li-M-NY를 이용한 프라임, 및 MVA-M, MVA-NY MVA-tPA-M, 또는 MVA-tPA-NY 벡터를 이용한 부스트 후 PBMCs에서 MAGE-A3 및 NYESO 특이적 반응을 나타낸다.
도 16에서 B)는, MVA-M, MVA-NY MVA-tPA-M, 또는 MVA-tPA-NY 벡터를 이용한 2차 부스트 후 PBMCs에서 MAGE-A3 및 NYESO 특이적 반응을 나타낸다.
도 17a는, ChAdOx-li-MAGEA3/NY-ESO-1 융합으로 면역화, 및 MVA-M, MVA-NY, MVA-tPA-M, 또는 MVA-tPA-NY 벡터로 부스트한 후 비근교계 CD1 마우스에서 MAGE-A3 및 NYESO에 대한 CD8 T 세포 반응의 유도를 나타낸다.
도 17b는, MVA-M, MVA-NY, MVA-tPA-M, 또는 MVA-tPA-NY 벡터를 이용한 2차 부스트 후 MAGE-A3 및 NYESO-특이적 반응을 나타낸다.
도 18은, 마우스 내로 15V4T3 세포 주사의 시각표(time lines) 및 마우스의 8개의 실험 그룹 각각에서 후속 처리 지점을 나타낸다.
도 19는, 도 18에 나타낸 실험의 평균 종양 성장 결과의 그래프를 나타낸다. 결과는 2-원(way) ANOVA에 의해 분석된다. * = p < 0.05. ** = p < 0.01. *** = p < 0.001. **** = p < 0.0001.
도 20a 및 도 20b는, 마우스의 8개의 실험 그룹 각각에 대해, 이식-후 종양의 시간에 따른 종양 부피의 그래프를 나타낸다.
도 21은, 마우스의 8개의 실험 그룹 각각에 대한 카플란-마이어 생존 플롯을 나타낸다. 데이터는 로그-순위(Mantel-Cox)법으로 분석된다. * = p < 0.05. ** = p < 0.01.
도 22는, 마우스의 8개의 실험 그룹 중 27일째 출혈에 대한 CD8 세포의 IFNγ 반응을 보여주는 차트이다.
도 23은, 마우스 내로 15V4T3 세포 주사의 반복된 실험의 시각표 및 마우스의 8개 실험 그룹 각각에서 후속 처리 지점를 나타낸다.
도 24는, 특정 실험 처리 및 대조군에 대한, (a) CD11b, (b) CD11b+ 및 GR1hi+; 또는 (c) CD11b 및 GR1int+인 CD45+ 세포의 비율의 그래프를 나타낸다.
도 25는, 특정 실험 처리 및 대조군에 대한, (a) CD11c, 및 (b) CD11b+ 및 CD11c+인 CD45+ 세포의 비율의 그래프를 나타낸다.
도 26은, PBS 대조군, αPD1 단독, 및 마우스의 2개의 시험 그룹 (1) 저 복용량 1주 간격의 프라임 부스트(ChAdOx1-li-P1A + MVA-tPA-P1A) 및 (2) 저 복용량 1주 간격의 프라임 부스트(ChAdOx1-li-P1A + MVA-tPA-P1A) + αPD1에 대한 백신접종의 시각표을 나타낸다.
도 27은, 도 26에 나타낸 각각의 실험 마우스 및 대조군에 대한 시간에 따른 평균 종양 부피를 나타낸다.
도 28은, 도 26에 나타낸 각각의 실험 마우스 및 대조군에 대한 종양 질량을 나타내는 차트이다.
도 29는, 도 25 내지 28에 나타낸 바와 같은 대조군 및 실험 그룹 각각에 대한 각 개별 동물에 대한 종양 성장 속도 데이터의 그래프이다.
도 30은, 마우스의 각 실험 그룹 및 대조군에서 종양에 총 세포의 비율로서 종양 침윤 림프구(TILs)의 비율을 나타내는 차트이다.
도 31은, 마우스의 실험 그룹 및 대조군 각각에서 CD4:CD8 T 세포의 비를 나타내는 차트이다.
도 32는, 마우스의 실험 그룹 및 대조군 각각에서 종양에 CD4+:CD8+ TILs의 비(좌측 차트) 및 CD8+ 세포인 T 세포의 퍼센트(우측 차트)의 비의 차트를 나타낸다.
도 33은, 대조군 및 실험 마우스 그룹 각각에서 CD3+ CD8+ TIL 카운트(counts)의 절대 수를 나타내는 차트이다.
도 34는, 대조군 및 실험 마우스 그룹 각각에서 절대 P1A35-43 테트라머+ H-2Ld CD8+ TIL 카운트를 나타내는 차트이다.
도 35는, 수확시 종양 질량과 P1A-특이적 CD8+ TIL 침윤 사이에 상관관계를 나타내는 다이어그램이다.
도 36-37은, 마우스의 혈액에서 CD8 반응을 나타내는 차트이다.
도 38-40은, 마우스의 비장에서 CD8 반응을 나타내는 데이터의 차트이다.
도 41-43은, T 세포 서브세트 분석을 나타내는 데이터의 막대 차트이다. 도 43의 범례는 도 41 및 42에 적용된다.
도 44 및 45는, 추가 T 세포 서브세트 분석을 나타내는 데이터의 막대 차트이다. 도 45의 범례는 도 44에 적용된다.
도 46은, T 세포-서브세트 분석의 추가 데이터를 나타낸다.
도 47은, T 세포 상에 PD1 발현에 대한 데이터의 차트를 나타낸다.
도 48은, T 세포 상에 PD1 발현에 대한 추가 데이터를 나타낸다.
도 49는, T 세포 상에 PD1 발현에 대한 추가 데이터를 나타낸다.
도 50은, P1A-특이적 T 세포 상에 PD1 발현에 대한 데이터의 차트를 나타낸다.
도 51-53은, P1A-특이적 T 세포 상에 PD1 발현에 대한 추가 데이터의 차트를 나타낸다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 침팬지 아데노바이러스 벡터는, WO2012/17277호 Isis Innovations Limited, 또는 WO2005/071093호 Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti SpA, 또는 Oxford University Innovation Limited의 WO2017/221031호에 상세히 기재되어 있고, 이들 모두는 참조로서 여기에 병합된다.
특히 바람직한 아데노바이러스 벡터는, 옥스포드에 있는, Vaccitech Ltd의 침팬지 아데노바이러스 Oxford 1 및 2(ChAdOx1 및 ChAdOx2)이다. ChAdOx1은, 야생-형 분리물 Y25(인간 아데노바이러스 E 종) 유래의 복제 결함 E1/E3 침팬지 아데노바이러스 벡터이며, Dicks M.D. et al. (2012) PLoS ONE 7: e40385이다. ChAdOx2는, HEK293 세포에서 바이러스 수율을 높이기 위해 변형된 E4 영역을 갖는 ChAd68에서 파생된 E1/E3-결손 백신 벡터이다.
본 발명의 ChAd 벡터는, (a) WO2012/172277호에 개시된 ChAdOx1; 바람직하게는 WO2012/172277호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO:38의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 80% 동일성의 서열에 의해 암호화된 ChAdOx1; 또는 (b) WO2017/221031호에 개시된 바와 같은 ChAdOx2; 바람직하게는 WO2017/221031호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO: 10의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 80% 동일성의 서열에 의해 암호화된 ChAdOx2일 수 있다. 당업자는, 본 발명에 사용된 ChAd 벡터가, 여기에서 더욱 기재된 바와 같은, 모든 핵산 서열의 상동체, 등가물 및 유도체를 포함할 수 있는 것으로 이해할 것이다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 변형된 우두 앙카라(MVA) 벡터는, WO2011/128704호 또는 EP 2044947 A1에 상세하게 기재되어 있으며, 이들 각각은 여기에 참조로서 병합된다.
본 발명의 바이러스 벡터 중 어느 하나에 의해 암호화되고 발현되는 바와 같은, 개별적으로 또는 서로 및 선택적으로 다른 폴리펩티드와 융합 형태로, 암 항원들은, 바람직하게는 여기에 정의된 바와 같은 면역원성이고, 이는 암 항원의 단편 및 서로 및 다른 폴리펩티드와 이들의 융합을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같은, "항원"은 일반적으로 이의 융합 및 단편 및 변이체를 포함하는, 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프와 동일하다. 이러한 단편 및 변이체는 본질적으로 모 항원(parent antigen)과 동일한 생물학적 활성 또는 기능을 보유할 수 있다. "항원"은 보통 단백질 또는 폴리펩티드 또는 단편이 항체 또는 T 세포를 증대시키는데 사용될 수 있고, 따라서 피험자에게서 항체 또는 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 의미한다. "면역원성"은, 단백질 또는 폴리펩티드 또는 단편이 피험자에게서 강력한, 바람직하게는 보호 면역 반응을 유도할 수 있음을 의미한다. 따라서, 후자의 경우에서, 단백질 또는 폴리펩티드 또는 단편은 항체 반응 및 비-항체 기반 면역 반응을 발생시킬 수 있다.
여기 사용된 바와 같은, 참조 서열(reference sequence)과 동일성을 갖는 핵산 서열에 대한 언급이 있을 때마다, 동일성의 정도는 다음 중 어느 하나로부터 선택될 수 있으며, 여기서, "적어도"는 여기에 나열된 각 퍼센트 수치에 적용된다: 적어도 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%. 상동성 또는 동일성의 정도를 결정할 목적을 위해 핵산 서열을 비교하는 경우, 사람들은 BESTFIT 및 GAP(모두 Wisconsin Genetics Computer Group(GCG) 소프트웨어 패키지에서 제공)와 같은 프로그램을 사용할 수 있다. 예를 들어, BESTFIT는, 두 서열을 비교하고, 가장 유사한 세그먼트(segments)의 최적 정렬을 생성한다. GAP은, 서열이 이들의 전체 길이에 따라 정렬되는 것을 가능하게 하고, 적절하게 서열에 간격을 삽입하여 최적 정렬을 찾는다. 적합하게, 본 발명의 맥락에서, 핵산 서열의 동일성을 논의할 때, 비교는 서열의 전체 길이를 따라 서열의 정렬에 의해 이루어진다. 상기 내용은 본 출원에 개시된 모든 핵산 서열에 대해 준용하여 적용된다.
부가적으로, 당업자는 또한 여기에서 대표화된 특정 핵산 분자 유래의 변이가 유전 암호(genetic code)의 퇴화(degeneracy)의 측면에서 가능한 것으로 인식할 것이다. 바람직하게는, 이러한 변이체는 여기에 기재된 핵산 서열과 이의 전체 길이에 걸쳐 실질적인 동일성을 갖는다.
본 발명과 관련하여 기재된 임의의 아미노산 서열과 관련하여, 이는 이들 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 여기에 개시된 주어진 출발 또는 참조 서열의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기는 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 첨가될 수 있다. 변화로서 바람직한 것은 본 발명의 단백질의 특성 및 활성을 변경시키지 않는 침묵 치환(silent substitutions), 첨가 및 결실이다. 다양한 아미노산은, 유사한 특성을 가지며, 하나 이상의 이러한 아미노산은, 그 물질의 원하는 면역원성 또는 다른 활성을 제거하지 않고 하나 이상의 다른 이러한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로 치환될 수 있다 - 이들은 지방족 측쇄를 갖는다. 이들 중 글리신 및 알라닌은 바람직하게는 서로 치환을 위해 사용된다. 또한, 발린, 류신 및 이소류신은, 서로를 치환하는데 사용될 수 있고 - 이들은 소수성인 더 큰 지방족 측쇄를 갖는다. 방향족 측쇄를 가진 아미노산인 - 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판은, 서로를 치환할 수 있다. 염기성 측쇄를 갖는 아미노산인 - 리신, 아르기닌 및 히스티딘은, 서로를 치환할 수 있다. 산성 측쇄를 갖는, 아스파르테이트 및 글루타메이트는 서로를 치환할 수 있다. 아미드 측쇄를 갖는 - 아스파라긴 및 글루타민은 서로를 치환할 수 있다. 황-함유 측쇄를 갖는 - 시스테인 및 메티오닌은 서로를 치환할 수 있다.
여기에서 기재된 바와 같은 "변이체"는, 자연 발생 또는 인공 변이체를 포함한다. 인공 변이체는, 핵산 분자, 세포 또는 유기체에 적용되는 것을 포함하여, 돌연변이 유발 또는 유전자 공학 또는 유전자 편집 기술을 사용하여 발생될 수 있다. 여기에 사용된 바와 같은, 참조 서열과 동일성을 갖는 아미노산 서열에 대한 언급이 있을 때마다, 동일성의 정도는 다음 중 어느 하나로부터 선택될 수 있으며: 여기서 "적어도"는, 여기에 나열된 각 퍼센트 수치에 적용된다: 적어도 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%. 당업자는, 아미노산 서열을 비교하기 위해 CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용할 수 있다. 이러한 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고 적절하게 서열에 간격을 삽입하여 최적의 정렬을 찾는다. 최적의 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성(아미노산 타입의 동일성 + 보존)을 계산하는 것은 가능하다. BLASTx와 같은 프로그램은, 유사한 서열의 가장 긴 스트레치(stretch)를 정렬하고 값을 적합도(fit)로 할당한다. 따라서, 다른 스코어를 각각 갖는, 유사성의 여러 영역이 발견되는 비교를 얻는 것은 가능하다. 상기 내용은 본 출원에 개시된 모든 아미노산 서열에 대해 준용하여 적용된다.
특히 바람직한 MVA 벡터는, 당업계에서 가장 일반적으로 사용되는 대로 CEF에서 570 계대 후에 안톤 마이어(Anton Mayr)에 의해 생성된 표준 MVA이다. 이것은 천연두 박멸과 관련하여 개발된 우두 바이러스의 고도로 약독화된 균주이다. MVA는 우두 게놈의 약 10%를 잃었고, 영장류 세포에서 효율적으로 복제하는 능력을 갖추고 있다.
MAGE 인간 암 항원과 관련하여, MAGE 패밀리(family)는 대략 40개의 구성원으로 이루어진다. MAGE-A 단백질은, 적어도 46%의 서열 동일성, 정의된 생화학적 구조 및 특성을 공유한다. MAGE-A3는, 주요 형태의 암에서 현저하게 발현되며 이의 발현은 부정적인 결과와 관련이 있다. MAGE-A3 아미노산 서열과 다른 MAGE-A 페밀리 구성원의 정렬은 다음의 % 동일성 값을 제공한다:
MAGEA3와 동일성
MAGEA1 66.9%
MAGEA2 84.4%
MAGEA4 69.3%
MAGEA5 71.8%
MAGEA6 95.9%
MAGEA8 63.7%
MAGEA9 59.6%
MAGEA10 47.8%
MAGEA11 59.6%
MAGEA12 85.4%
위에서 언급된 각각의 MAGE 항원은, SEQ ID NO: 1의 MAGEA3 참조 서열과의 임의의 퍼센트 동일성의 측면에서 정의될 수 있는 바와 같이, 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다.
NY-ESO-1과 관련하여, 이것은 알려진 180개 아미노산의 암 항원이다. 상기 서열은 LAGE-1과 76.6% 동일성을 갖는다. 서열의 면역원성을 정의하기 위해 여러 연구는 시도되었다. 주요 영역은 NY-ESO-1의 aa 79로부터 173까지이다. Gnjatic S, et al. (2006) Adv. Cancer Res. vol 95: 1-30; Sabbatini P, et al. (2012) Clin. Cancer Res. Vol 18 (23): 6497-508; 및 Baumgaertner P, et al. (2016) Oncoimmunology vol 9:5(10)는, 흑색종 또는 난소암이 관심의 특이적 단편을 어떻게 강조했는지 보고한다. 이들은 본 발명의 임의의 관점에 사용하기 위한 각각의 옵션이다:
· NY-ESO-1 79-173
· NY-ESO-1 79-108
· NY-ESO-1 100-129
· NY-ESO-1 121-150
· NY-ESO-1 42-173
LAGE1은 또한 공지된 암 항원이고, 이것 또는 이의 단편도 본 발명의 바이러스 벡터 및 방법 및 용도에서 MAGEA3와 함께 사용될 수 있다.
보조제는, 여기에 기재된 본 발명의 AdCh 및/또는 MVA 벡터의 전달을 위한 조성물에 사용될 수 있다. 유리하게는, 이들 바이러스 벡터는, 이들이 암 항원 또는 단편과 CD74인, MHC 클래스 Ⅱ 불변 사슬(li) 사이에 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하도록 유전자 조작될 수 있다. 이것은 강화된 CD8+ T 세포 면역원성으로 이어질 것으로 예상된다. 이러한 단백질 융합 및 바람직한 li 서열을 만드는 방법에 대한 더 자세한 정보는, 여기에 참조로서 병합된, Isis Innovation Limited의 WO2015/082922호에서 제공된다.
본 발명의 바이러스 벡터는, 에피토프 스트링(epitope string)으로서 하나 이상의 항원 유전자를 발현하도록 설계될 수 있다. 바람직하게는, 다중 에피토프의 스트링에서 에피토프는, 불필요한 핵산 및/또는 아미노산 물질이 회피되도록 개재 서열(intervening sequences)없이 함께 연결된다. 에피토프 스트링의 생성은 바람직하게는 동일한 리딩 프레임(reading frame)에서 하나 이상의 에피토프를 암호화하는 DNA와 함께, 에피토프 스트링의 아미노산 서열을 암호화하는 재조합 DNA 구축물을 사용하여 달성된다. 선택적으로, 항원은 개별의 폴리펩티드로 발현될 수 있다.
기재된 바와 같은 에피토프 스트링에서 또는 개별적으로, 항원의 임의의 단편은, 바람직하게는 모 항원의 서열로부터 적어도 n개의 연속적인 아미노산을 포함하며, 여기서, n은 바람직하게는 적어도, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산이다. 단편은 바람직하게는 모 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 단편은 몇몇 상황에서 모 항원의 단일 에피토프를 포함하거나 또는 단일 에피토프 만으로 이루어질 수 있다. 보통, 단편은 항원성/면역원성 특성이 유지되도록 모 영역 또는 에피토프(들)와 충분히 유사할 것이다.
본 발명에 사용되는 하나 이상의 항원 또는 항원 유전자는, C-말단 및/또는 N-말단에서 절단될 수 있다. 이는 벡터화된 백신의 클로닝 및 구축을 촉진하고 및/또는 항원의 면역원성 또는 항원성을 향상시킬 수 있다. 절단 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 다양한 잘 알려진 유전 공학의 기술은, 항원 유전자의 한쪽 말단에서 암호화 핵산 서열을 선택적으로 삭제한 다음, 원하는 암호화 서열을 바이러스 벡터 내로 삽입하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 후보 단백질의 절단은, 각각, 암호화 핵산의 3' 및/또는 5' 말단을 침식(erode)시키기 위해 선택적으로 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 전략(exonuclease strategies)을 사용하여 생성된다. 야생형 유전자 서열은, 발현된 항원이 모 항원에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 아미노산 만큼 절단될 수 있다. 몇몇 사례에서, 항원 유전자는, 야생형 항원에 비해 C-말단에서 (발현시) 10-20개의 아미노산 만큼 절단된다. 다른 사례에서, 항원 유전자는 야생형 항원에 비해 C-말단에서 (발현시) 13-18개의 아미노산, 바람직하게는 (발현시) 15개의 아미노산 만큼 절단된다.
몇몇 상황에서, 항원 유전자는 리더 서열(leader sequence)을 포함할 수 있으며, 이는 mRNA로 1차 전사의 처리, 번역 효율, mRNA 안정성에 영향을 미칠 수 있으며, 항원의 발현 및/또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 본 발명과 관련하여, 보조 능력(adjuvanting capacity)으로도 역할을 할 수 있는 몇몇 바람직한 리더 서열은, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA) 또는 MHC Ⅱ 샤페론(chaperone) 단백질 불변 사슬(li)이다. 바람직하게는, 리더 서열은 하나 이상의 항원에 대해 N-말단에 위치된다.
본 발명은, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 벡터들을 포함하는; 선택적으로 하나 이상의 부가적인 활성 성분, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제와 조합한 약제학적 또는 면역원성 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 면역원성 및/또는 항원성 조성물이다.
적합한 보조제는, 당업계에 잘 알려져 있으며, 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freund's adjuvant), 완전 프로인트 보조제, MDP를 갖는 프로인트 보조제(무라밀디펩티드), 명반(수산화 알루미늄), 명반과 보르데텔라 백일해 및 면역 자극 복합체(ISCOMs, 통상적으로 바이러스성 단백질을 포함하는 Quil A의 매트릭스(matrix))를 포함한다.
본 발명의 면역원성 및/또는 항원성 조성물은, 예방적(이에 의해 이들은 암 형성을 방지하는 면역 반응을 유도함) 또는 치료적(이에 의해 이들은 항-암 활성을 갖는 면역 반응을 유도함)일 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 조성물은, 단일 면역화 또는 다중 면역화로서 개별 피험자에게 투여된다. 바람직하게는, 바이러스 벡터 또는 이의 면역원성 조성물은, 단일, 이중 또는 삼중 면역화 요법의 일부로 투여된다. 이들은 또한 상동 또는 이종 프라임-부스트 면역화 요법의 일부로 투여될 수 있다.
면역화 요법은, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 면역원성 조성물의 2차 또는 후속 투여를 포함할 수 있다. 2차 투여는 단기간 또는 장기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 1회 복용량은, 1차 투여 후 수 시간, 수 일, 수 주일, 수 개월 또는 수 년에 걸쳐, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 이상 또는 0.25, 0.5, 0.75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40년 이상까지 투여될 수 있다. 바람직하게는, 2차 투여는 1차 투여 후 적어도 2개월에서 발생한다. 바람직하게는, 2차 투여는 1차 투여 후 10년까지 발생한다. 이러한 시간 간격은 바람직하게는 임의의 후속 복용량들 사이에 기간에 준용하여 적용된다.
투여의 측면에서, 본 발명의 바이러스 벡터는, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 이상의 바이러스 입자(vp)의 하나 이상 복용량의 양으로 투여될 수 있다.
투여는, 복강 내, 정맥내, 동맥-내, 근육내, 피내, 피하, 또는 비강내 투여에 의해 이루어질 수 있다. 바람직한 구현 예에서, 바이러스 벡터는, 특히 주사, 관류 및 이와 유사한 것을 포함하는, 혈관내 투여에 의해 전신 투여된다.
면역 관문 조절제(작용제(agonists) 또는 억제제)는, 암의 치료에 사용된 면역요법이다. 이들은 암 세포를 공격하는 T 세포를 조정하는 것으로 알려진 단백질인, 관문 단백질을 조절한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한, 관문 조절제의 한 부분인, 관문 억제제는, CTLA-4(세포독성 T 림프구 관련 단백질 4), PD-1(프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1) 또는 PD-L1(프로그래밍된 사멸 리간드 1)을 포함하는, 다른 관문 단백질을 차단한다. CTLA-4 및 PD-1은 T 세포에서 발견되는 반면, PD-L1은 암 세포에서 발견된다. PD-1을 차단하는데 적합한 관문 억제제는, 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®)을 포함하며, 흑색종, 호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 요로암(요로상피암), 방광암과 같은, 암을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 본 발명의 백신접종 접근법과 함께 사용될 수 있다. CTLA-4를 차단하는데 적합한 관문 억제제는, 이필리무맙(Yervoy®)을 포함하며, 흑색종의 치료를 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있다. PD-L1을 차단하는데 적합한 관문 억제제는, 아테졸리주맙(Tecentriq®)을 포함하며, 폐암, 유방암 및 요로상피암을 포함하는 암의 치료를 위해 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도의 작동에 유용한 면역 관문 조절제에 대한 기타 적합한 표적은, 예를 들어, AMHRIl, B7-H3, B7-H4, BTLA, BTNL2, 부티로필린 페밀리, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD47, CD48, CD70, CD80, CD86, CD155, CD160, CD226, CD244, CEACAM6, CLDN6, CCR2, CTLA4, CXCR4, GD2, GGG(구아닐일 사이클라아제 G), GIRT, GIRT 리간드, HHLA2, HVEM, ICOS, ICOS 리간드, IFN, IL1, IL1R, IL1RAP, IL6, IL6R, IL7, IL7R, IL12, IL12R, IL15, IL15R, LAG3, LIGHT, LIF, MUC16, NKG2A 페밀리, OX40, OX40 리간드, PD1, PDL1, PDL2, 레소킨, SEMA4D, Siglec 페밀리, SIRP알파, STING, TGF베타 페밀리, TIGIT, TIM3, TL1A, TMIGD2, TNFRSF, VISTA, 4-1BB 및 4-1BB 리간드로부터 선택된 임의의 것을 포함한다.
관문 조절제에 대한 더 충분한 검토는, Mahoney, A. M. et al., (2015) Nature Reviews Drug Discovery vol 14: 561-584 (특히 도 1 참조)에 의해 제공된다.
관문 조절제의 투여는, 본 발명의 프라임 또는 하나 이상의 부스트 면역화와 동시에 함께 수행될 수 있다. 따라서, 이것은 예방 또는 치료 목적을 위해, 병용 치료(combination treatment)를 제공한다. 동시 투여의 변형으로서, 관문 조절제는 프라임 및/또는 부스트 투여 후에 사실상 동시에 실질적으로 투여될 수 있다. 또는, 프라임 및/또는 부스트 투여로부터 시간이 지연된 순차적 투여가 있을 수 있다. 지연은, 프라임 및 부스트 투여에 대하여 다를 수 있으며, 관문 조절제가 백신 투여들 사이에 시간에 개별적으로 투여되도록 충분히 길 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물로부터 관문 조절제의 개별 투여는, 각 투여 사이에 동일 기간을 결과할 수 있다. 몇몇 사례에서, 관문 조절제는, 본 발명의 ChAd-기반 면역원성 조성물을 사용하여 프라임 백신접종 전에 투여될 수 있다.
하나 이상의 관문 조절제의 맥락에서 "병용 치료"는 병용의 성분의 동시, 순차적 또는 개별 투여를 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 바이러스 벡터 및 관문 억제제는 동시 투여된다. 또한, 예를 들어, 본 발명의 바이러스 벡터 및 하나 이상의 관문 억제제의 순차적 투여는 가능하다. 더욱이, 본 발명의 바이러스 벡터 및 하나 이상의 관문 억제제를 개별 투여하는 예가 있다. 바이러스 벡터 및 관문 억제제의 투여가 순차적이거나 개별적인 경우, 바이러스 및 관문 억제제는 치료제가 협력적, 예를 들어, 상승 효과를 나타낼 수 있도록하는 시간 간격 내에 투여될 수 있다. 바람직한 구현 예에서, 본 발명의 바이러스 벡터 및 하나 이상의 관문 억제제는, 서로 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72시간 이내, 또는 4, 5, 6 또는 7일 이내 또는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일 이내에서 투여된다. 몇몇 구현 예에서, 본 발명의 바이러스 벡터의 제1 복용량은, 관문 억제제의 1차 복용량 전에 또는 그 반대의 경우로 투여되고, 바이러스 벡터와 관문 억제제를 이용한 치료가 중첩되는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구현 예에서, 본 발명의 바이러스 벡터의 1차 복용량은 관문 억제제의 1차 복용량과 거의 동시간에 투여될 수 있다. 다른 구현 예에서, 본 발명의 바이러스 벡터의 1차 복용량은, 관문 억제제의 1차 복용량(또는 제2, 제3 또는 후속 복용량) 후에 투여되고, 바이러스 벡터 및 관문 억제제를 이용한 치료가 중첩되는 단계를 포함할 수 있다.
실시 예
물질 및 방법
바이러스 벡터 구축
바이러스 벡터에 삽입하기 위한 유전자 서열, 번역 효율을 위해 최적화된 코돈은, GeneArt(ThermoFisher Scientific)에 의해 DNA 스트링 또는 플라스미드로 합성된다. 침팬지 아데노바이러스 벡터(ChAdOx)의 구축을 위해, DNA 스트링 삽입물 및 p1990 백본(Gateway® 엔트리 벡터(entry vector))은, 제한 효소 KpnI/NotI로 분해된 다음, 밤새 배양을 통해 연결된다. 관심의 유전자 서열을 암호화하는 플라스미드 p1990은, DH5α™ 수용성(competent) E. coli로 형질전환된 다음, PCR 방법을 통해 양성 클론에 대해 스크리닝된다. 양성 클로닝된 DNA는, 미디프렙(midiprep)을 통해 증폭된 다음, Gateway® 클로닝(ThermoFisher Scientific)은, LR 클로나제(LR clonase)를 사용하여, ChAdOx 목표 벡터(destination vector)인, p2563 [SEQ ID NO:24]과 유전자 삽입물을 함유하는 p1990 사이에서 수행된다. p2563 목표 벡터 DNA는, 박테리아 형질전환, 미디프렙 및 중력 컬럼 정제(gravity column purification)를 통해 증폭된다. p2563 목표 벡터는, 바이러스 생산을 위해 보내기 전에 DNA를 선형화하기 위해 Pme1로 분해된다.
ChAdOx1 벡터를 발생시키기 위한 기탁된 생물학적 물질의 공급원 및 핵산 서열을 포함하는, 보다 포괄적인 기술 정보는, 여기에 참조로서 병합된, Isis Innovation Limited의 WO2012/172277호에 개시되어 있다. ChAdOx2 벡터를 발생시키기 위한 생물학적 물질의 공급원 및 핵산 서열을 포함하는, 보다 포괄적인 기술 정보는, 여기에 참조로서 병합된, Oxford University Innovation Limited의 WO2017/221031호에 개시되어 있다.
여기에 참조로 병합되고 본 발명의 ChAdOx 바이러스 벡터의 생산을 위한 더 많은 물질 및 방법 정보를 제공하는 다른 관련 개시는, Dicks, M.D.J., et al. (2012) "A Novel Chimpanzee Adenovirus Vector with Low Human Seroprevalence: Improved Systems for Vector Derivation and Comparative Immunogenicity" PlosOne e40385이다.
변형된 우두 앙카라(MVA) 벡터를 발생시키기 위해, GeneArt DNA 스트링 또는 플라스미드는, 주입 반응(InFusion reaction)에 대한 정확한 오버행(overhangs)을 보장하기 위해 Phusion® 중합효소(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 PCR을 통해 증폭된다. 유전자 삽입물 및 p4719 [SEQ ID NO: 25]인, MVA 목표 벡터는, 그 다음 제한 효소 Ale I로 분해된다. 증폭된 삽입물 및 p4719는 그 다음 주입 방법을 사용하여 연결된다. 결찰된 플라스미드는 DH5α™ 수용성 E. coli.로 형질전환된다. 양성 클론은 스크리닝되고, 미디프렙을 통해 DNA를 증폭했다. DNA를 선형화하기 위한 Xho1 + Acc651을 이용한 최종 분해는, 바이러스 생산 전에 수행된다.
본 발명에 필요한 MVA 벡터를 발생 및 재생하기 위한 기탁된 생물학적 물질의 공급원 및 핵산 서열을 포함하는, 보다 포괄적인 기술 정보는, Isis Innovation Limited의 WO2011/128704호 및 EP 2044947 A1에 개시되어 있으며, 이들 각각의 전체적인 내용은 여기에 참조로서 병합된다. 여기에 참조로서 병합되고, 본 발명의 MVA 바이러스 벡터의 생산을 위한 더 많은 물질 및 방법 정보를 제공하는 기타 관련 개시는, Pavot V., Sebastian S., Turner A. V., Matthews J., Gilbert S.C. (2017) "Generation and Production of Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) as a Vaccine Vector" Ferran M., Skuse G. (eds) Recombinant Virus Vaccines, Methods in Molecular Biology, vol 1581 Humana Press, New York, NY이다.
펩티드 생산
P1A, MAGE-A3 및 NY-ESO-1 단백질의 전체를 커버하는 15개 아미노산 길이의 짧은 펩티드의 중첩 풀(Overlapping pools)은, Mimotopes of Mulgrave, Victoria, Australia에 의해 주문 생산된다.
마우스
6-8 주-령의 C57BL/6, DBA/2 및 CD1 마우스는, 영국 Envigo에서 구입하여, 영국 옥스퍼드 대학의 Functional Genomics Facility에 보관했다. 마우스 관리 및 실험 절차는, UK Animals Scientific Procedures Act Project License 30/2947의 조건에 따라 수행되었다.
생체 내 연구
백신 면역원성을 평가하기 위해, 마우스는, 생성된 ChAdOx1 및 MVA 바이러스 벡터를 전신마취 하에 총 부피 50㎕의 근육 내(i.m.) 주사를 통해 도면에 표시된 복용량으로 투여된다. 백신접종은 각 실험에 대해 자세히 설명된 계획에 따른 시점에서 투여된다. 살아있는 L1210.P1A.B7-1 세포를 이용한 면역화는 복강-내 주사를 통해 이루어졌다. 생체 외 분석을 위한 PBMCs를 얻기 위해, 혈액은 꼬리 정맥 출혈을 통해 샘플링되고, ACK 용해 완충액으로 적혈구를 제거하기 위해 처리된다.
10개의 다른 재조합 바이러스 백신(하기 표 2 참조)은 발생되고, 감염된 세포에서 항원 발현은 확인되었다.
바이러스 벡터 폴리뉴클레오티드 서열 삽입 항원 아미노산 서열
ChAdOx_MAGEA3_NYESO SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11
ChAdOx_li_MAGEA3_NYESO SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13
ChAdOx_tPA_MAGEA3_NYESO SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
ChAdOx_P1A SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27
ChAdOx_li_P1A SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29
MVA_MAGEA3 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17
MVA_NYESO SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19
MVA_tPA_MAGEA3 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21
MVA_tPA_NYESO SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23
MVA_P1A SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31
P1A 항원을 발현하는 이들 바이러스 벡터 백신의 면역원성은, DBA/2, C57BL/6 및 CD1 비근교계 마우스를 포함하는 마우스의 3개의 다른 균주에서 시험된다.
생체 외 펩티드 자극
단리된 마우스 PBMCs 또는 비장세포는, 10% FCS로 보충된 RPMI 1640 배지에서 현탁되고, V-버텀 96-웰 플레이트에 첨가된다. 세포들은, P1A, MAGE-A3 또는 NY-ESO-1 펩티드 또는 DMSO 대조군을 항-CD28 항체(2㎍/㎖) 및 DNase(20㎍/㎖)와 함께 4㎎/㎖의 작용 농도(working concentration)로 배양 배지에 첨가하여 자극된다. 펩티드 자극 세포는, 세포내 사이토카인 축적을 촉진하기 위해 1시간 후 Brefaldin A의 첨가와 함께, 5% CO2로 37℃에서 5시간 동안 배양된다.
유세포 분석(flow cytometry) - 세포내 사이토카인 염색
펩티드 자극 후, PBMCs는 PBS로 세척되고, 4℃에서 20분 동안 PBS에서 Aqua 생/사 고정 염료(Aqua live/dead fixable dye)(Invitrogen) 및 항-CD8/항-CD4 항체와 함께 배양하여 표면 마커/생존율에 대해 염색된다. 사이토카인을 생성하는 활성화된 세포의 퍼센트를 평가하기 위해, 세포는 그 다음 고정되고, CytoFix/CytoPerm(BD Biosciences)으로 투과되며, 4℃에서 20분 동안 1x perm 완충액에서 항-IFN-γ, 항-TNF-α 및 항-IL-2 항체와 함께 배양된다. 샘플은, BD Fortessa에서 획득되고, FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc.)를 사용하여 분석을 수행했다.
통계 분석
모든 통계 시험 및 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 다중 그룹들 사이에 차이는, Kruskal-Wallis 비-모수(non-parametric) ANOVA 및 Mann-Whitney 비-모수 t-검정으로 개별 그룹 사이에서 결정된다.
실시 예 1: ChAdOx/MVA로 면역화에 의한 P1A에 대한 CD8 T 세포의 유도
P1A는, 동계 숙주에서 돌연변이되지 않은 MAGE-타입 항원에 대한 CD8 반응의 유도를 확인하고, P1A-발현 종양 P815에 대한 보호를 유도하는데 사용될 수 있는 쥣과(murine) MAGE-타입 항원이다. 이것은 MAGE-A3 및 NY-ESO-1에 대한 대용물(surrogate)이다.
도 1b는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 취하고 백신접종 반응에 대해 시험된 마우스의 프라임-부스트 면역화의 개략적인 개요를 나타낸다. 도 2는, P1A를 암호화하는 ChAdOx1/MVA 바이러스 벡터로 백신접종된 마우스에서 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다. 백신접종 계획 시각표(도 1)에 따르면 - BL/6, DBA/2 및 CD1 마우스는, ChAdOx1.P1A 또는 ChAdOx1.P1A-li(프라임)에 이어 4주 후 MVA.P1A(부스트)로 백신접종된다. P1A-특이적 T-세포 반응을 시험하기 위해, PMBCs는 유세포 분석에 의해 분석된 타입 I 사이토카인을 생산하는 퍼센트 세포 및 P1A 펩티드 풀로 생체 외에서 자극된다. 사이토카인 IFN-γ(A) 및 TNF-α(B)를 생성하는 CD8+ 세포의 퍼센트(그룹당 n = 6)는 측정된다. 이종 프라임-부스트 백신접종은, IFN-γ 및 TNF-α의 세포내 염색에 의해 예시된 바와 같이 마우스의 3개의 균주 모두에서 P1A에 대한 강한 CD8 반응을 유도했다(도 2). 반응은, P1A가 MHC Ⅱ 샤페론 단백질 불변 사슬(li)에 융합된 경우 더욱 향상되었다. 이들 결과는 DBA/2 마우스에서 IFN-γ ELISPOT 검정(assay) 및 P1A-특이적 사량체 염색에 의해 확인된다(결과는 나타내지 않음).
종합하면, 관찰된 반응은 DBA/2, B6 및 비근교계된 CD1 마우스에서 매우 강한 CD8 반응이다. CD8 반응은 ChAdOx 벡터에 li를 첨가하여 증가된다. CD8 T 세포가 중첩 펩티드에 의해 유도된 경우 확인된 것은 이들이 IFNγ, IL2, 및 TNFα를 분비하는 것이다. P1A에 대한 CD4 반응의 방식은 거의 없다(알려진 CD4 에피토프는 없음).
실시 예 2: 종양 발달에 대한 P1A를 운반하는 ChAdOx1 및 MVA 바이러스 벡터의 보호 효능의 평가
종양 공격에 대한 백신 보호 효능의 평가의 일부로서, 마우스는, 옆구리에 무-혈청 세포 배양 배지에서 종양 세포로 피하(s.c.) 주사된다. 촉지성 종양(palpable tumour)의 발달에 따라, 성장은 기록되고, 종양 크기가 어느 방향으로든 10㎜에 도달하면, 마우스는 안락사된다. 종양 부피는 식 길이(㎜) x 너비2(㎜) x 0.5를 사용하여 측정된다. 생존 곡선은 카플란-마이어 방법에 따라 만들어지고, 생존에서 차이는, 로그-순위 시험을 사용하여 시험된다. 0.05 미만의 P 값은 중요한 것으로 간주된다.
좀 더 상세하게는, DBA/2 마우스는, PBS, 살아있는 L1210.P1A.B7-1 세포 또는 4주 간격으로 제공된 ChAdOx1-P1A(±li)/MVA-P1A 프라임-부스트로 면역화된 다음, 옆구리에 피하 주사를 통한 1.5x106 P815 세포 또는 1x106 15V4T3 세포로 공격받는다. P815 및 15V4T3은 동계 P1A-양성 비만세포종 세포주이다. 15V4T3 세포는, Boon T, Van den Eynde B, Hirsch H, Moroni C, De Plaen E, van der Bruggen P, De Smet C, Lurquin C, Szikora JP, De Backer O (1994) "Genes coding for tumor-specific rejection antigens" Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 59: 617-22에 기재되어 있다.
P815(도 4) 및 15V4T3(도 8a) 공격 후 각 처리 그룹에 대한 평균 종양 성장. 카플란-마이어 생존 곡선은, 그룹 당 P815(도 5), 15V4T3(도 8b) n = 10에 대해 나타낸다.
도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, P1A를 이용한 아데노바이러스 프라임 및 MVA 부스트 백신접종은, PBS 대조군에 비해 백신접종된 마우스에서 종양 성장을 상당히 감소시키고 생존을 개선시켰다. 흥미롭게도, li_P1A로 백신접종된 그룹은 L1210.P1A B7.1 세포로 면역화된 양성 대조군에 비해 종양 부피가 더 작고 생존율이 더 좋았다. 이러한 세포주는, 이전에 매우 강력한 P1A-특이적 세포독성 활성 및 P1A 양성 종양 공격에 대한 보호를 유도하는 것으로 나타났다(Brandle D. et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28 (12): 4010-4019 및 Naslund TI et al. (2007) J. Immunol. 178 (11): 6761-6769 참조). 이것은 백신접종으로 인한 자극된 면역 반응이 P815 종양으로부터 마우스를 보호하는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 도 6a 및 6b는, 다른 P1A 양성 종양 세포주 15V4T3를 사용하여 관찰된 동일한 결과를 나타낸다.
종합하면, 관찰된 반응은 다른 P1A-발현 종양 모델 P815 및 15V4T3 (또한 V4D6 - 데이터는 나타내지 않음)에서 증가된 생존 및 종양 공격에 대한 보호와 관련된 CD8 반응이다. 프라임-부스트 요법은, 양성 대조군 세포 백신보다 우수한 보호를 제공한다. 또한, 어떻게 불변 사슬(li)-P1A 융합이 벡터에서 P1A 단독보다 더 우수하게 나타나는지는 관찰된다. 임의의 종양이 장기간 치료로 성장 감소 효과에서 벗어나면, 이들은 P1A 발현을 상실했다 (데이터는 나타내지 않음).
실시 예 3: P1A를 운반하는 ChAdOx1 및 MVA 바이러스 벡터의 백신 치료 효능의 평가
실험은 백신 치료 효능을 평가하기 위해 수행된다. 15V4T3 종양의 확립시, 마우스는, 5일 후 ChAdOx 벡터로 프라이밍된 다음, 26일에 MVA 벡터로 부스팅된다. 백신접종 계획은 도 7에 나타낸다. 3개의 다른 백신접종 계획은 시험된다. DBA/2 마우스는, 옆구리에 피하 주사를 통해 1x106 15V4T3 세포로 공격받은 다음, 공격 5일 후 3주 간격으로 단일 표준 복용량 ChAdOx-P1A (108 IU)/MVA-P1A (107 PFU) 프라임-부스트 백신접종, 3주 간격으로 단일 저 복용량 프라임-부스트 백신접종(ChAdOx-107 IU, MVA-106 PFU), 매주 교대로 저 복용량 ChAdOx-P1A/MVA-P1A 백신접종 또는 매주 대조 항원인, DPY를 암호화하는 ChAdOx/MVA 백신접종을 받는다. 그 다음, 각 치료 그룹에서 15V4T3 종양 성장 및 생존은 모니터링된다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 종양 성장은, 관계없는 단백질 DPY를 발현하는 바이러스 벡터로 백신접종된 대조군에 비해 백신접종된 마우스에서 현저하게 지연된다. 게다가, 단일 표준 복용량의 프라임-부스트는, 종양 공격에 대한 최상의 보호와 생존을 입증했다. 그러나, 백신접종된 마우스는, 후기 단계(6 주)에서 종양 성장을 제어하는 능력을 잃기 시작했다.
따라서, 치료 효능은 15V4T3 모델에서 관찰된다.
실시 예 4: 면역 관문 억제제와 조합하여 ChAdOx1-P1A/MVA-P1A 프라임-부스트 백신접종 요법의 치료 효능을 평가
더 우수한 종양 보호를 달성하고, 백신 효능을 증가시키기 위해, 백신은, 동일한 15V4T3 종양 모델을 사용하여, 관문 억제제 차단과 조합되고, DBA/2 마우스는, P1A-발현 동계 15V4T3 종양 세포로 접종된다. DBA/2 마우스는, 옆구리에 피하 주사를 통해 1x106 15V4T3 세포로 공격받은 다음, 종양 크기에 기초하여 공격 후 8일에 다른 처리 그룹으로 무작위화된다. 마우스는, PBS(sham) 백신접종, 매주 ChAdOx/MVA 백신접종 - 단독으로 또는 항-PD1 또는 항-CTLA-4 항체과 조합하여 (3일 간격으로 3회분), 또는 항-PD1 또는 항-CTLA-4 항체 단독을 받는다. 각 치료 그룹에서 15V4T3 종양 성장(도 10) 및 생존(도 11)은, 기간 내내 모니터링되고 기록된다. 촉지성 종양의 확립한 후, 종양 크기는 측정되고 마우스는 다른 그룹으로 무작위화된다. 도 10(좌측 그래프)에 나타난 바와 같이, 병용 치료를 받은 마우스의 종양 성장은, 대조군 및 단일 치료 그룹에 마우스에 비해 훨씬 지연되었다. 또한, 항-PD1 및 백신의 병용 치료를 받은 마우스의 100%는, 종양 공격 후 36 일까지 생존했으며, 50%의 마우스는, 항-CTLA4 및 백신 처치의 그룹에서 생존한 반면, 다른 마우스는 모두 생존이 어려웠다.
백신 + 항-PD1의 상승 효과는, 15V4T3 모델의 치료 환경에서 관찰된다.
실시 예 5: CD1 비근교계 마우스에서 MAGE-A3 및 NY-ESO-1의 면역원성을 평가
마우스 P1A 유전자를 암호화하는 벡터로부터 반응을 확립한 후, 인간 MAGE-타입 항원을 암호화하는 벡터 구축물은 생성하고 시험된다. 인간 MAGE-타입 항원, MAGE-A3 및 NY-ESO-1의 다른 형태의 면역원성은 CD1 비근교계 마우스에서 조사된다. MAGE-A3 및 NY-ESO-1은, 침팬지 아데노바이러스 벡터에서 융합 단백질로 클로닝되고, 이들은 MVA에서 개별적으로 클로닝된다. 이는 2가지 주된 이유 때문이다. 먼저, 아데노바이러스 벡터 백신의 생성은 MVA보다 훨씬 고가이다. 임상 환경을 준비하기 위해, 목표는, MAGE-A3 및 NY-ESO-1의 융합을 발현하는 단일 아데노바이러스 벡터 백신을 포함하는 비용을 최소화하는 것이다. 둘째, 몇몇 인간 종양은, MAGE-A3 또는 NY-ESO-1을 발현시킨다. 종양에 대해 좀 더 특이적 반응을 유도하기 위해, 종양에 의해 발현되는 특정 항원은 부스팅용으로 표적화된다. 좀 더 상세하게는, 마우스는 시각표(도 12)에 따라 백신접종을 받는다 - MAGE-A3-NY-ESO-1을 암호화하는 ChAdOx1 ± li 또는 tPA로 프라임, 그 다음, MAGE-A3 또는 NY-ESO-1을 암호화하는 MVA ± tPA로 2번의 부스트(1차 MVA 부스트에 대해 대체 항원(alternate antigen)을 함유하는 2차 MVA 부스트)가 수반된다. 항원 특이적 T-세포 반응은, 지정된 시점에 각 백신접종 후 평가된다 - PBMCs는 수확되고, 유세포 분석에 의해 분석된 세포에 반응하는 IFN-γ+ 의 퍼센트 및 MAGE-A3(청색 원) 또는 NY-ESO-1(적색 사각형) 펩티드로 생체 외에서 자극받는다.
도 13은, ChAdOx1-MAGE-A3/NY-ESO-1 융합(M-NY), tPA와 ChAdOx1-MAGE-A3/NY-ESO-1 융합(tPA-M-NY) 및 불변 사슬과 ChAdOx1-MAGE-A3/NY-ESO-1 융합(li-M-NY)으로 비근교계 CD1 마우스의 프라이밍 주사 후 MAGE-A3/NY-ESO-1에 대한 CD8 T 세포의 유도를 나타낸다. 2주 후, PBMCs는 단리되고, MAGE-A3 중첩 펩티드(적색 원) 및 NY-ESO-1 중첩 펩티드(청색 사각형)에 대한 반응은 생체 외 세포내 사이토카인 염색에 의해 시험된다. 프라임 후 CD8 IFNγ 반응은, 융합 단백질을 함유하는 ChAdOx 프라임이 항원 모두에 대해 특이적 CD8 T 세포를 유도할 수 있음을 나타낸다.
그 다음, ChAdOx 프라이밍된 마우스는, (ⅰ) tPA에 융합되거나 융합되지 않은 MAGEA3를 함유하는 MVA; 및 (ⅱ) tPA에 융합되거나 융합되지 않은 NY-ESO-1을 함유하는 MVA로 부스터 주사를 맞는다. PBMCs는 그 다음 이들 마우스로부터 다시 단리되고, 중첩 펩티드로 자극 후 생체 외 세포내 사이토카인 염색을 사용하여 MAGEA3 및 NY-ESO-1 반응에 대해 시험된다. 도 14는, MVA-MAGEA3 + tPA 부스트의 효과를 나타내고, 도 15는, MVA-NY-ESO-1 + tPA 부스트의 효과를 나타낸다. 도 14 및 15 각각에서, 도 13은 부스트 결과와 프라임 결과 만의 편리한 비교를 위해 좌측 부분으로 포함된다. 알 수 있듯이, 초기 프라임 반응은, MVA를 사용하여 선택한 항원에 대해 훨씬 더 높은 크기로 부스팅된다.
프라임으로서 ChAdOx-불변 사슬(li) 및 MVA-tPA는, 샘플 크기 및 어느 정도의 가변성을 갖는 비근교계 마우스의 사용을 조건으로, 가장 면역원성 요법인 것으로 보인다.
이중 부스트에서, 초기 프라임 반응은, 동시에 더 높은 크기로 증가된다(데이터는 나타내지 않음). 관찰된 반응은, 다른 타입 I 사이토카인에 의해 광범위하게 일치된다(데이터는 나타내지 않음).
어떻게 항원-특이적 T-세포의 빈도가 훨씬 더 높은 수준으로 부스트되는 것처럼 보이고, 반응이 선택된 항원에 대해 향하는지 고려하면, 본 발명은 문제의 개별 종양의 특정 발현 패턴 후에 예방 또는 치료에 대한 좀 더 개인화된 접근법을 가능하게 할 수 있다.
도 16에서 A)는 MVA-M, MVA-NY, MVA-tPA-M, 또는 MVA-tPA-NY 벡터로 부스팅 후 CD8+ 세포에서 IFN-γ+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 16에서 B)는, MVA-M, MVA-NY, MVA-tPA-M, 또는 MVA-tPA-NY 벡터로 2차 부스팅 후 CD8+ 세포에서 IFN-γ+ 세포의 퍼센트를 나타낸다.
마우스가 융합 MAGE-A3 및 NY-ESO-1을 발현하는 아데노바이러스로 프라이밍되고, MAGE-A3 또는 NY-ESO-1을 발현하는 MVA로 부스팅된 경우, 증가된 CD8 반응은, MVA에 의해 발현된 항원을 향하게 된다(도 14 및 15). 또한, 두 MVAs(MVA_MAGEA3 및 MVA_NYESO)로 마우스의 부스팅은, 이들 두 항원에 대해 비슷한 수준의 CD8 반응을 유도했다.
항원의 면역원성은, Bolhassani A. et al. (2011) Mol. Cancer. 10:3에 기재된 바와 같이 유전자를 몇몇 분자 보조제에 융합시켜 향상될 수 있다. 이들 중에서, 인간 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA) 신호 펩티드(Delogu G. et al. (2002) Infect. Immun.70(1): 292-302, 참조)는, 감염된 세포 내에서 단백질 발현을 증가시킬 수 있고, 따라서, T 세포 반응을 향상시킬 수 있다(예를 들어, Biswas S. et al. (2011) PLoS One 6(6): e20977). 또한, 항원을 MHC Ⅱ 관련 li에 융합은, CD8 반응을 강화시킬 수 있다(Mikkelsen M. et al. (2011) Journal of Immunology 186(4): 2355-2364; 및 Sorensen M. R. et al. (2009) European Journal of Immunology 39(10): 2725-2736).
상기 다양한 실시 예로부터 요약하면, P1A에 대한 CD8 반응은, 항원을 li에 융합시킬 때 향상된다(도 2). 또한, 더 잘 자극된 CD8 반응이 마우스에서 더 나은 종양 보호로 어떻게 번역되는지 나타낸다(도 4 및 5). tPA 융합의 효과는, 지금까지 바이러스 벡터 백신에서 연구되지 않았다. 실시 예는, li와 달리, MAGE 항원에 tPA 융합이 아데노바이러스를 이용한 단일 백신접종에서 CD8+ T 세포 반응을 향상시킬 수 없음을 나타낸다. 또한, CD8 반응의 증가는, 단일 프라임 부스트 백신접종에서, li에 융합된 항원을 발현하는 아데노바이러스로 프라이밍되고, tPA에 융합된 항원을 암호화하는 MVA로 부스팅된 경우 관찰된다(도 16의 A) 및 도 16의 B) 참조). 그러나, 추가 분석은, MVA 부스트에서 MAGE 항원에 대한 tPA 융합이 CD8 반응을 향상시킬 수 없음을 나타낸다.
실시 예 6: DBA/2 마우스에서 15V4T3 종양에 유효한 백신, 관문 억제제 및 화학요법의 삼중 조합
도 18은, 화학요법 및 관문 억제제 치료뿐만 아니라, 관련 대조군 치료와 함께 시험 마우스의 백신접종에 대한 실험 연대표(chronologies)를 나타낸다. 간단히 말해, 1 백만 개의 15V4T3 세포는 각각의 DBA/2 마우스 내로 피하 주사된다. 마우스는, 6일째에 종양 크기에 기초하여 무작위로 그룹으로 나누어진다. 마우스의 임의의 백신접종을 포함하는 치료는, 종양 이식 후 8일에 시작된다. 투여된 경우, 20㎎/㎏의 파클리탁셀 및 40㎎/㎏의 카보플라틴은, 8일째에 I.P로 마우스에 제공되고, 20㎎/㎏의 파클리탁셀은 I.P로 9일째 제공된다. 투여된 경우, 3회 복용량의 aPD1 100㎍은 I.P로 18일, 21일, 및 24일에 제공된다. 그룹당 마우스 수는 6 또는 7 또는 8 마리이다.
도 19는, 각각의 실험 및 대조군 처리에 대한 마우스에서 평균 종양 부피의 시간 경과를 나타낸다.
도 20a 및 20b는, 각 실험 그룹 또는 대조군에서 개별 마우스의 종양 부피에 대한 시간 경과를 나타낸다. 백신접종 및/또는 화학요법 및/또는 관문 억제제와 관계없이, 치료 시간은 나타낸다. 또한, 종양이 없는 것으로 밝혀진 각 그룹에서 마우스의 48일 종점 수(end-point numbers)는 표시된다. 백신접종, 화학요법 및 관문 억제제의 삼중 조합은, 다양한 치료 중 가장 효과적으로 종양의 형성을 명확히 억제한다.
도 21은, 각각의 실험 및 대조군에서 시간에 따른 마우스의 생존을 나타낸다. 백신접종, 화학요법 및 관문 억제제의 삼중 조합은, 명확히 다른 치료 및 대조군에 비해 마우스의 최상의 생존을 제공한다.
백신과 aPD1 및 화학요법의 삼중 조합은, 다른 그룹에 비해 종양 성장을 유의하게 억제했다. 종양 주사 후 23일째에 종양이 없는 마우스는 8 마리 중 6 마리가 있었고, 이들 마우스는 48일까지 종양이 없는 상태를 유지했다. 또한, 도 22에 나타낸 바와 같이, 삼중 조합 그룹은 또한 종양 주사 후 27일에 가장 높은 말초 P1A-특이적 CD8 반응을 갖는다.
실시 예 7: DBA/2 마우스에서 15V4T3 종양에 유효한 백신, 관문 억제제 및 화학요법의 삼중 조합
도 23은, 마우스 및 대조군의 각 실험 그룹에 대한 시각표를 나타낸다. 1 백만 개의 15V4T3 세포(초기 계대)는, DBA/2 마우스 내로 동시에 주사된다. 마우스는, 종양 이식 후 11일에 시작된 마우스의 백신접종 및 11일에 종양 크기에 기초한 그룹으로 무작위로 나누어진다. 투여된 경우, 20㎎/㎏의 파클리탁셀 및 40㎎/㎏의 카보플라틴은, 11일째에 I.P로 마우스에 제공되고, 20㎎/㎏의 파클리탁셀은 I.P로 12일째 제공된다. 투여된 경우, 3회 복용량의 aPD1 100㎍은 I.P로 21일, 24일, 및 27일에 제공된다. 그룹당 마우스 수는 6 또는 7 마리이다. 종양 공격이 없는 미경험 그룹(naive group)은 또한 본 실험에 포함된다. 출혈은 14일에 수행되었으며, 샘플은 골수 유래 억제 세포(MDSC) 고갈을 확인하기 위해 사용된다.
도 24 및 25는, 화학요법 단독 또는 화학요법과 백신으로 처치된 마우스가 더 낮은 MDSC 빈도(MDSC frequency)를 갖는 방법을 나타낸다.
실시 예 8: DBA/2 마우스에서 15V4T3 종양 - CPI를 이용한 백신접종은 종양 T 세포 침윤을 증가시킨다
1 백만 개의 15V4T3 세포는, DBA/2 마우스에 피하 주사된다. 백신접종 일정은, PBS 대조군, aPD1 단독, 및 마우스의 두 시험 그룹 (1) 1주 간격으로 저 복용량 프라임 부스트(ChAdOx1-li-P1A + MVA-tPA-P1A) 및 (2) 1주 간격의 저 복용량 프라임 부스트(ChAdOx1-li-P1A + MVA-tPA-P1A) + aPD1에 대해 도 26에 나타낸다. 마우스의 백신접종은, 종양 이식 후 10일째 시작된다. CPI(αPD1)는 프라임 후 3일, 종양 주입 후 13일, 16일, 19일에 100㎍을 3회 복용량으로, 제공된다. 모든 마우스는 20일에 채혈하고 21일에 희생된다. 종양 미세환경의 면역 프로파일은, FACS에 의해 연구되었다. 결과는 도 27-53에 제시되어 있다.
보다 상세하게는, 도 27은, 희생시 모든 마우스 그룹에서 종양 크기의 균일한 확산을 나타낸다. 도 28은, 이들 마우스에서 종양 제거의 시작을 나타내는, 백신 + 항-PD-1 병용 그룹의 마우스 서브세트에서 종양 질량의 감소를 나타낸다.
도 29는, 각 그룹에서 각각의 마우스에 대한 개별 종양 성장 곡선을 나타낸다.
도 30은, 마우스의 대조군 및 백신의 종양에서 CD8+ 종양 침윤 림프구(TILs)의 퍼센트를 나타낸다. 백신접종은 종양에서 총 세포의 비율로서 CD3+CD8+ TILs을 증가시킨다.
도 33 및 34는, 세포 수 및 종양 중량에 대해 계산되고 정규화된 절대 TIL 수를 나타낸다.
도 36 및 37은, αPD-1 처리의 부가가 ChAdOx 프라임 후 11일의 초기 시-점에서 평가될 때 ChAdOx/MVA 백신접종에 의해 프라이밍된 P1A-특이적 반응을 어떻게 부스팅시키는지를 나타낸다.
도 46은, 종양에서 P1A-특이적 TEM CD8+s의 침윤이 어떻게 P1A-특이적 CD8s와 동일한 패턴을 따르는지를 나타낸다.
종합적으로, 도 27-53의 결과는, 백신이 대조군과 비교한 마우스의 백신 그룹에서 CD3+CD8+ TIL의 증가 및 P1A-특이적 TIL의 증가와 함께, 종양의 T 세포 침윤을 어떻게 증가시키는지를 나타낸다.
또한, CD3+CD8+ TIL은, 주로 효과기 메모리 세포들 TEM(CD62L-CD44+) 및 TCM(CD62L+CD44+)이다.
더욱이, P1A-특이적 TILs은 백신 그룹에서 PD-1을 발현하지만, αPD1 차단에 따라 발현은 감소한다.
여기에서 언급된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
특정 단백질 또는 폴리펩티드는 여기에서 언급되고, 이들에 대한 참조 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열은, 본 상세한 설명의 일부로서 제출된 수반되는 서열 목록에 제공된다. 몇몇의 서열은, 다음과 같은 추가 정보를 제공하기 위해 주석이 달린다:
인간 HLA 클래스 Ⅱ 조직적합성 항원 감마 사슬(li) UniProtKB/Swiss-Prot: P04233.3. 밑줄친 서열 부분은 벡터에 사용되는 막관통 도메인을 나타낸다:
MHRRRSRSCR EDQKPVMDDQ RDLISNNEQL PMLGRRPGAP ESKCSRGALY TGFSILVTLL LAGQATTAYF LYQQQGRLDK LTVTSQNLQL ENLRMKLPKP PKPVSKMRMA TPLLMQALPM GALPQGPMQN ATKYGNMTED HVMHLLQNAD PLKVYPPLKG SFPENLRHLK NTMETIDWKV FESWMHHWLL FEMSRHSLEQ KPTDAPPKVL TKCQEEVSHI PAVHPGSFRP KCDENGNYLP LQCYGSIGYC WCVFPNGTEV PNTRSRGHHN CSESLELEDP SSGLGVTKQD LGPVPM [SEQ ID NO: 6]
인간 조직-형 플라스미노겐 활성인자(tPA). 나타낸 밑줄친 서열 부분은 벡터에 사용되는 리더 서열이다.
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLRSNRVEYCWCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAGKCCEIDTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGNHNYCRNPDRDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP [SEQ ID NO: 8]
벡터 ChAdOx1_MAGE_NYESO에 대한 폴리뉴클레오티드 구축물. 밑줄친 MAGEA3. 링커는 굵게 표시된다. NY-ESO-1은 이탤릭체(italics)이다.
ATGCCCCTGGAACAGCGGAGCCAGCACTGCAAGCCTGAGGAAGGCCTGGAAGCCAGAGGCGAAGCTCTGGGACTCGTGGGAGCACAGGCTCCAGCCACCGAAGAACAGGAAGCCGCCAGCAGCAGCTCCACCCTGGTGGAAGTGACACTGGGCGAAGTGCCTGCCGCCGAGTCTCCTGATCCTCCTCAGTCTCCTCAGGGCGCCAGCTCTCTGCCCACCACCATGAACTACCCCCTGTGGTCCCAGTCCTACGAGGACAGCAGCAACCAGGAAGAAGAGGGCCCCAGCACCTTCCCCGACCTGGAATCTGAATTCCAGGCCGCCCTGAGCCGGAAGGTGGCCGAACTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTACCGGGCCAGAGAACCCGTGACCAAGGCCGAGATGCTGGGCAGCGTCGTGGGCAACTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCTCCAAGGCCAGCTCCAGCCTGCAGCTGGTGTTCGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGACACCTGTACATCTTCGCCACCTGTCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCCAAAGCCGGCCTGCTGATCATCGTGCTGGCCATCATTGCCCGCGAGGGCGATTGTGCCCCCGAGGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTGCTGGAAGTGTTCGAGGGAAGAGAGGACTCCATCCTGGGCGACCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTATAGACAGGTGCCCGGCAGCGACCCTGCCTGCTACGAATTTCTGTGGGGCCCTAGAGCACTGGTGGAAACCAGCTACGTGAAAGTGCTGCACCACATGGTCAAGATCAGCGGCGGACCCCACATCAGCTACCCCCCTCTGCATGAATGGGTGCTGAGAGAGGGCGAGGAA GGCGGAGGACCTGGCGGAGGA ATGCAGGCTGAAGGCAGAGGCACAGGCGGCTCTACAGGCGACGCTGATGGACCAGGCGGACCCGGAATTCCAGATGGCCCTGGCGGAAATGCTGGCGGGCCTGGCGAAGCTGGCGCTACAGGCGGAAGAGGACCTAGAGGCGCTGGCGCCGCTAGAGCTTCTGGACCAGGGGGAGGCGCTCCTAGAGGACCTCATGGCGGAGCTGCCTCTGGCCTGAACGGCTGCTGTAGATGTGGCGCCAGAGGCCCCGAAAGCAGACTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCTTTCGCCACCCCCATGGAAGCTGAGCTGGCCAGAAGAAGCCTGGCCCAGGACGCTCCTCCACTGCCTGTGCCAGGCGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCCGGCTGACAGCCGCCGACCACAGACAGCTGCAGCTGAGCATCAGCAGCTGCCTGCAGCAGCTGTCCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTTCTGGCCCAGCCTCCTAGCGGACAGCGGAGATGA [SEQ ID NO: 10]
ChAdOx1_MAGE_NYESO의 번역된 단백질. 밑줄친 MAGEA3. 링커는 굵게 표시된다. NY-ESO-1은 이탤릭체이다:
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEEGGGPGGG MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID NO: 11]
벡터 ChAdOx1_hli_MAGE_NY-ESO-1에 대한 폴리뉴클레오티드 구축물. 굵은 이탤릭체의 li 서열. MAGEA3은 밑줄쳐 있다. 서열 링커는 굵게 표시된다. NY-ESO-1은 이탤릭체이다:
ATG GGCGCCCTGTACACCGGCTTTAGCATCCTCGTGACCCTGCTGCTGGCCGGACAGGCTACCACCGCCTACTTTCTGTAC CCCCTGGAACAGCGGAGCCAGCACTGCAAGCCTGAGGAAGGCCTGGAAGCCAGAGGCGAAGCTCTGGGACTCGTGGGAGCACAGGCTCCAGCCACCGAAGAACAGGAAGCCGCCAGCAGCTCTAGCACCCTGGTGGAAGTGACACTGGGCGAAGTGCCTGCCGCCGAGTCTCCTGATCCTCCTCAGTCTCCTCAGGGCGCCAGCTCTCTGCCCACCACCATGAACTACCCCCTGTGGTCCCAGTCCTACGAGGACAGCAGCAACCAGGAAGAAGAGGGCCCCAGCACCTTCCCCGACCTGGAATCTGAATTCCAGGCCGCCCTGAGCCGGAAGGTGGCCGAACTGGTGCACTTTCTGCTGCTGAAGTACCGGGCCAGAGAACCCGTGACCAAGGCCGAGATGCTGGGCAGCGTCGTGGGCAACTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCTCCAAGGCCAGCTCCAGCCTGCAGCTGGTGTTCGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGACACCTGTACATCTTCGCCACCTGTCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCCAAAGCCGGCCTGCTGATCATCGTGCTGGCCATCATTGCCCGCGAGGGCGATTGTGCCCCCGAGGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTGCTGGAAGTGTTCGAGGGAAGAGAGGACTCCATCCTGGGCGACCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTATAGACAGGTGCCCGGCAGCGACCCTGCCTGCTACGAATTTCTGTGGGGCCCTAGAGCACTGGTGGAAACCAGCTACGTGAAAGTGCTGCACCACATGGTCAAGATCAGCGGCGGACCCCACATCAGCTACCCCCCTCTGCATGAATGGGTGCTGAGAGAGGGCGAGGAA GGCGGAGGACCTGGCGGAGGA ATGCAGGCTGAAGGCAGAGGCACAGGCGGCTCTACAGGCGACGCTGATGGACCAGGCGGACCCGGAATTCCAGATGGCCCTGGCGGAAATGCTGGCGGGCCTGGCGAAGCTGGCGCTACAGGCGGAAGAGGACCTAGAGGCGCTGGCGCCGCTAGAGCATCTGGACCAGGGGGAGGCGCTCCTAGAGGACCTCATGGCGGAGCTGCCTCTGGCCTGAACGGCTGCTGTAGATGTGGCGCCAGAGGCCCCGAAAGCAGACTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCTTTCGCCACCCCCATGGAAGCTGAGCTGGCCAGAAGAAGCCTGGCCCAGGACGCTCCTCCACTGCCTGTGCCAGGCGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCCGGCTGACAGCCGCCGACCACAGACAGCTGCAGCTGAGCATCAGCAGCTGCCTGCAGCAGCTGTCCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTTCTGGCCCAGCCTCCTAGCGGACAGCGGAGATGA [SEQ ID NO: 12]
ChAdOx1_hli_MAGE_NY-ESO-1의 번역된 단백질 서열. 굵은 이탤릭체의 li 서열. MAGEA3은 밑줄쳐 있다. 링커는 굵게 표시된다. NY-ESO-1은 이탤릭체이다:
M GALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLY PLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE GGGPGGG MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR* [SEQ ID NO: 13]
벡터 ChAdOx1_tPA_MAGE_NY-ESO-1에 대한 폴리뉴클레오티드 구축물. 굵은 이탤릭체로된 tPA 서열. MAGEA3은 밑줄쳐 있다. 링커는 굵게 표시된다. NY-ESO-1은 이탤릭체이다:
ATG GACGCCATGAAGCGGGGCCTGTGTTGCGTGCTGCTGCTGTGTGGCGCTGTGTTCGTGTCCCCC CCACTGGAACAGAGAAGCCAGCACTGCAAGCCCGAGGAAGGCCTGGAAGCCAGAGGCGAAGCTCTGGGACTCGTGGGAGCACAGGCTCCAGCCACCGAAGAACAGGAAGCCGCCAGCAGCTCTAGCACCCTGGTGGAAGTGACACTGGGCGAAGTGCCTGCCGCCGAGTCTCCTGATCCTCCTCAGTCTCCTCAGGGCGCCAGCTCTCTGCCCACCACCATGAACTACCCCCTGTGGTCCCAGTCCTACGAGGACAGCAGCAACCAGGAAGAAGAGGGCCCCAGCACCTTCCCCGACCTGGAATCTGAATTCCAGGCCGCCCTGAGCCGGAAGGTGGCCGAACTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTACCGGGCCAGAGAACCCGTGACCAAGGCCGAGATGCTGGGCAGCGTCGTGGGCAACTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCTCCAAGGCCAGCTCCAGCCTGCAGCTGGTGTTCGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGACACCTGTACATCTTCGCCACCTGTCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCCAAAGCCGGCCTGCTGATCATCGTGCTGGCCATCATTGCCCGCGAGGGCGATTGTGCCCCCGAGGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTGCTGGAAGTGTTCGAGGGAAGAGAGGACTCCATCCTGGGCGACCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTATAGACAGGTGCCCGGCAGCGACCCTGCCTGCTACGAATTTCTGTGGGGCCCTAGAGCACTGGTGGAAACCAGCTACGTGAAAGTGCTGCACCACATGGTCAAGATCAGCGGCGGACCCCACATCAGCTACCCACCTCTGCACGAATGGGTGCTGAGAGAGGGCGAAGAA GGCGGAGGACCTGGCGGAGGA ATGCAGGCTGAAGGCAGAGGCACAGGCGGCTCTACAGGCGACGCTGATGGACCAGGCGGACCCGGAATTCCAGATGGCCCTGGCGGAAATGCTGGCGGGCCTGGCGAAGCTGGCGCTACAGGCGGAAGAGGACCTAGAGGCGCTGGCGCCGCTAGAGCATCTGGACCAGGGGGAGGCGCTCCTAGAGGACCTCATGGCGGAGCTGCCTCTGGCCTGAATGGCTGCTGTAGATGTGGCGCCAGAGGCCCCGAAAGCAGACTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCTTTCGCCACCCCCATGGAAGCTGAGCTGGCCAGAAGAAGCCTGGCCCAGGACGCTCCTCCACTGCCTGTGCCAGGGGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCCGGCTGACAGCCGCCGACCACAGACAGCTGCAGCTGAGCATCAGCAGCTGCCTGCAGCAGCTGTCCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTTCTGGCCCAGCCTCCTAGCGGACAGCGGAGATGA [SEQ ID NO: 14]
ChAdOx1_tPA_MAGE_NY-ESO-1의 번역된 단백질. 굵은 이탤릭체로된 tPA 서열. MAGEA3은 밑줄쳐 있다. 링커는 굵게 표시된다. NY-ESO-1은 이탤릭체이다:
M DAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP PLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIlVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE GGGPGGG MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID NO: 15]
벡터 MVA_tPA_MAGEA3에 대한 폴리뉴클레오티드 구축물. tPA는 밑줄쳐 있다:
ATGGACGCCATGAAGCGGGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGCTGTGTGGCGCTGTGTTCGTGTCCCCCCCACTGGAACAGAGAAGCCAGCACTGCAAGCCCGAGGAAGGCCTGGAAGCCAGAGGCGAAGCTCTGGGACTCGTGGGAGCACAGGCTCCAGCCACCGAAGAACAGGAAGCCGCCAGCAGCTCTAGCACCCTGGTGGAAGTGACACTGGGCGAAGTGCCTGCCGCCGAGTCTCCTGATCCTCCTCAGTCTCCTCAGGGCGCCAGCTCTCTGCCCACCACCATGAACTACCCCCTGTGGTCCCAGTCCTACGAGGACAGCAGCAACCAGGAAGAAGAGGGCCCCAGCACCTTCCCCGACCTGGAATCTGAATTCCAGGCCGCCCTGAGCCGGAAGGTGGCCGAACTGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTACCGGGCCAGAGAACCCGTGACCAAGGCCGAGATGCTGGGCAGCGTCGTGGGCAACTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCTCCAAGGCCAGCTCCAGCCTGCAGCTGGTGTTCGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGACACCTGTACATCTTCGCCACCTGTCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAACCAGATCATGCCCAAAGCCGGCCTGCTGATCATCGTGCTGGCCATCATTGCCCGCGAGGGCGATTGTGCCCCCGAGGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTGCTGGAAGTGTTCGAGGGAAGAGAGGACTCCATCCTGGGCGACCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTATAGACAGGTGCCCGGCAGCGACCCTGCCTGCTACGAATTTCTGTGGGGCCCTAGAGCACTGGTGGAAACCAGCTACGTGAAAGTGCTGCACCACATGGTCAAGATCAGCGGCGGACCCCACATCAGCTACCCACCTCTGCACGAATGGGTGCTGCGGGAAGGCGAAGAGTGA [SEQ ID NO: 20]
MVA_tPA_MAGEA3의 번역된 단백질. tPA는 밑줄쳐 있다:
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIlVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE [SEQ ID NO: 21]
벡터 MVA_tPA_NYESO에 대한 폴리뉴클레오티드 구축물. tPA는 밑줄쳐 있다:
ATGGACGCCATGAAGCGGGGCCTGTGCTGCGTGCTGCTGCTGTGTGGCGCTGTGTTCGTGAGCCCTCAGGCCGAGGGAAGAGGCACAGGCGGATCTACAGGCGACGCTGATGGACCTGGCGGCCCTGGAATTCCTGATGGCCCAGGCGGAAATGCTGGCGGACCAGGCGAAGCTGGCGCTACAGGCGGAAGAGGACCTAGAGGCGCTGGCGCCGCTAGAGCTTCTGGACCTGGGGGAGGCGCTCCTAGAGGACCTCATGGCGGAGCTGCCTCTGGCCTGAATGGCTGCTGTAGATGTGGCGCCAGAGGCCCCGAAAGCCGGCTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCCTTCGCCACCCCCATGGAAGCTGAGCTGGCCAGAAGAAGCCTGGCCCAGGACGCTCCTCCACTGCCTGTGCCAGGGGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCCGGCTGACAGCCGCCGACCACAGACAGCTGCAGCTGAGCATCAGCAGCTGCCTGCAGCAGCTGTCCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTTCTGGCCCAGCCTCCTAGCGGCCAGCGGCGCTAA [SEQ ID NO: 22]
MVA_tPA_NYESO의 번역된 단백질. tPA는 밑줄쳐 있다:
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID NO: 23]
벡터 ChAdOx1_mli_P1A에 대한 폴리뉴클레오티드 구축물. li 서열은 밑줄쳐 있다:
ATGGGCGCTCTGTATACTGGCGTGTCCGTGCTGGTGGCCCTGCTGCTGGCTGGACAGGCTACAACCGCCTACTTCCTGTACAGCGACAACAAGAAGCCCGACAAGGCCCACTCTGGCAGCGGCGGAGATGGCGACGGCAACAGATGTAACCTGCTGCACAGATACAGCCTGGAAGAGATCCTGCCCTACCTGGGCTGGCTGGTGTTCGCCGTCGTGACAACAAGCTTCCTGGCCCTGCAGATGTTCATCGACGCCCTGTACGAGGAACAGTACGAGAGGGACGTGGCCTGGATCGCCAGACAGAGCAAGAGAATGAGCAGCGTGGACGAGGACGAGGATGATGAGGACGACGAAGATGACTACTACGACGATGAGGATGACGACGACGACGCCTTCTACGATGACGAGGACGATGAAGAGGAAGAACTGGAAAACCTGATGGACGACGAGTCCGAGGATGAGGCCGAGGAAGAGATGAGCGTGGAAATGGGCGCTGGCGCCGAAGAGATGGGAGCCGGCGCTAACTGTGCTTGCGTGCCAGGACACCACCTGAGAAAGAACGAAGTGAAGTGCCGGATGATCTACTTCTTCCACGACCCCAACTTTCTGGTGTCCATCCCCGTGAACCCCAAAGAACAGATGGAATGCAGATGCGAGAACGCCGACGAAGAGGTGGCCATGGAAGAAGAAGAGGAAGAGGAAGAAGAAGAAGAAGAGGAAGAAATGGGCAACCCCGACGGCTTCAGCCCCTGA [SEQ ID NO: 28]
번역된 단백질 ChAdOx1_mli_P1A. li 서열은 밑줄쳐 있다:
MGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYSDNKKPDKAHSGSGGDGDGNRCNLLHRYSLEEILPYLGWLVFAVVTTSFLALQMFIDALYEEQYERDVAWIARQSKRMSSVDEDEDDEDDEDDYYDDEDDDDDAFYDDEDDEEEELENLMDDESEDEAEEEMSVEMGAGAEEMGAGANCACVPGHHLRKNEVKCRMIYFFHDPNFLVSIPVNPKEQMECRCENADEEVAMEEEEEEEEEEEEEEMGNPDGFSP [SEQ ID NO: 29]
본 명세서의 상세한 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함한다" 및 "함유한다" 및 이들의 변형은, "포함하지만 이에 제한되지 않음"을 의미하고, 기타 모이어티(moieties), 첨가제, 구성요소, 정수 또는 단계들을 배제하는 것으로 의도되지 않는다(즉, 배제하지 않는다). 본 명세서의 상세한 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어의 단수 형태는, 문맥상 별도로 명시되지 않는 한, 복수 형태를 포괄한다. 예를 들어, 용어 "항원"은, 문맥상 별도로 명시되지 않는 한, "항원들"을 포괄한다.
본 발명의 특정 관점, 구현 예 또는 실시 예와 관련하여 기재된 특색, 정수, 특징, 화합물, 화학적 모이어티 또는 그룹은, 이와 양립할 수 없는 경우를 제외하고 여기에 기재된 임의의 다른 관점, 구현 예 또는 실시 예에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다. (수반되는 청구범위, 요약서 및 도면을 포함하는) 본 명세서에 개시된 모든 특색, 및/또는 그렇게 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는, 이러한 특색 및/또는 단계들 중 적어도 몇몇이 상호 배타적인 경우의 조합을 제외하고, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 발명은 임의의 전술한 구현 예의 세부사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은, (수반되는 청구범위, 요약서 및 도면을 포함하는) 본 명세서에 개시된 특색의, 임의의 신규의 하나, 또는 임의의 신규 조합, 또는 그렇게 개시된 임의의 방법 또는 공정의 단계들의, 임의의 신규의 하나, 또는 임의의 신규 조합으로 확장된다.
독자의 주의는, 본 출원과 관련하여 본 명세서와 동시에 또는 이전에 제출되고, 본 명세서와 함께 공람을 위해 오픈된 모든 논문 및 문서와 관련되며, 이러한 모든 논문 및 문서의 내용은 여기에 참조로서 병합된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. <120> Viral vectors and methods for the prevention or treatment of cancer <130> P257619WO <150> 1812647.4 <151> 2018-08-03 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 35 40 45 Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp 65 70 75 80 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys 100 105 110 Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln 130 135 140 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 145 150 155 160 Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 165 170 175 Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 180 185 190 Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile 195 200 205 Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly 225 230 235 240 Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 290 295 300 His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 2 <211> 1753 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys 20 25 30 Thr Gly Ala Cys Gly Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly 35 40 45 Ala Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys 50 55 60 Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr 65 70 75 80 Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr 85 90 95 Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala 115 120 125 Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr 130 135 140 Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr 145 150 155 160 Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys 165 170 175 Ala Cys Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly 180 185 190 Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Thr 195 200 205 Cys Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly 210 215 220 Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala 225 230 235 240 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Cys Thr 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 260 265 270 Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 275 280 285 Gly Thr Gly Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys 290 295 300 Thr Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly 305 310 315 320 Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr 325 330 335 Cys Thr Ala Cys Thr Cys Thr Ala Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Thr 340 345 350 Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly 355 360 365 Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys 370 375 380 Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly 385 390 395 400 Thr Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys 405 410 415 Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Cys Ala 420 425 430 Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly 435 440 445 Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Thr Cys Cys Thr Ala Thr Gly Ala Gly 450 455 460 Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly 465 470 475 480 Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly 485 490 495 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly 500 505 510 Gly Ala Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Cys Ala Ala Gly 515 520 525 Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Gly Ala Ala 530 535 540 Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Thr 545 550 555 560 Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala 565 570 575 Ala Gly Thr Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala 580 585 590 Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala 595 600 605 Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Gly 610 615 620 Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Cys Ala 625 630 635 640 Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Gly 645 650 655 Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr 660 665 670 Cys Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr 675 680 685 Gly Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly 690 695 700 Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys 705 710 715 720 Cys Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr Gly Thr Ala 725 730 735 Cys Ala Thr Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys 740 745 750 Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly 755 760 765 Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala 770 775 780 Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Cys 785 790 795 800 Ala Ala Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala 805 810 815 Thr Ala Ala Thr Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr 820 825 830 Ala Ala Thr Cys Gly Cys Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys 835 840 845 Gly Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly 850 855 860 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala 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tcattgcccg cgagggcgat 720 tgtgcccccg aggaaaagat ctgggaggaa ctgagcgtgc tggaagtgtt cgagggaaga 780 gaggactcca tcctgggcga ccccaagaag ctgctgaccc agcacttcgt gcaggaaaac 840 tacctggagt atagacaggt gcccggcagc gaccctgcct gctacgaatt tctgtggggc 900 cctagagcac tggtggaaac cagctacgtg aaagtgctgc accacatggt caagatcagc 960 ggcggacccc acatcagcta cccccctctg catgaatggg tgctgagaga gggcgaggaa 1020 ggcggaggac ctggcggagg aatgcaggct gaaggcagag gcacaggcgg ctctacaggc 1080 gacgctgatg gaccaggcgg acccggaatt ccagatggcc ctggcggaaa tgctggcggg 1140 cctggcgaag ctggcgctac aggcggaaga ggacctagag gcgctggcgc cgctagagca 1200 tctggaccag ggggaggcgc tcctagagga cctcatggcg gagctgcctc tggcctgaac 1260 ggctgctgta gatgtggcgc cagaggcccc gaaagcagac tgctggaatt ctacctggcc 1320 atgcctttcg ccacccccat ggaagctgag ctggccagaa gaagcctggc ccaggacgct 1380 cctccactgc ctgtgccagg cgtgctgctg aaagaattca ccgtgtccgg caacatcctg 1440 accatccggc tgacagccgc cgaccacaga cagctgcagc tgagcatcag cagctgcctg 1500 cagcagctgt ccctgctgat gtggatcacc cagtgctttc tgcccgtgtt 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agagagggcg aagaaggcgg aggacctggc 1020 ggaggaatgc aggctgaagg cagaggcaca ggcggctcta caggcgacgc tgatggacca 1080 ggcggacccg gaattccaga tggccctggc ggaaatgctg gcgggcctgg cgaagctggc 1140 gctacaggcg gaagaggacc tagaggcgct ggcgccgcta gagcatctgg accaggggga 1200 ggcgctccta gaggacctca tggcggagct gcctctggcc tgaatggctg ctgtagatgt 1260 ggcgccagag gccccgaaag cagactgctg gaattctacc tggccatgcc tttcgccacc 1320 cccatggaag ctgagctggc cagaagaagc ctggcccagg acgctcctcc actgcctgtg 1380 ccaggggtgc tgctgaaaga attcaccgtg tccggcaaca tcctgaccat ccggctgaca 1440 gccgccgacc acagacagct gcagctgagc atcagcagct gcctgcagca gctgtccctg 1500 ctgatgtgga tcacccagtg ctttctgccc gtgtttctgg cccagcctcc tagcggacag 1560 cggagatga 1569 <210> 15 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Translated protein of ChAdOx1_tPA_MAGE_NY-ESO-1 <400> 15 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys 20 25 30 Pro Glu Glu Gly Leu Glu Ala Arg Gly 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ttcatgccca 36240 atctaggtgc atatcctaaa acccaaagca aaacaccaaa aaatagtata gtaagtcagg 36300 tatatttaaa tggagaaact actatgccaa tgacactgac aataactttc aatggcactg 36360 atgaaaaaga cacaacacct gtgagcactt actccatgac ttttacatgg cagtggactg 36420 gagactataa ggacaagaat attacctttg ctaccaactc ctttactttc tcctacatgg 36480 cccaagaata aaccctgcat gccaacccca ttgttcccac cactatggaa aactctgaag 36540 cagaaaaaaa taaagttcaa gtgttttatt gattcaacag ttttctcaca gaaccctagt 36600 attcaacctg ccacctccct cccaacacac agagtacaca gtcctttctc cccggctggc 36660 cttaaaaagc atcatatcat gggtaacaga catattctta ggtgttatat tccacacggt 36720 ttcctgtcga gccaaacgct catcagtgat attaataaac tccccgggca gctcacttaa 36780 gttcatgtcg ctgtccagct gctgagccac aggctgctgt ccaacttgcg gttgcttaac 36840 gggcggcgaa ggagaagtcc acgcctacat gggggtagag tcataatcgt gcatcaggat 36900 agggcggtgg tgctgcagca gcgcgcgaat aaactgctgc cgccgccgct ccgtcctgca 36960 ggaatacaac atggcagtgg tctcctcagc gatgattcgc accgcccgca gcataaggcg 37020 ccttgtcctc cgggcacagc agcgcaccct gatctcactt aaatcagcac agtaactgca 37080 gcacagcacc acaatattgt tcaaaatccc acagtgcaag gcgctgtatc caaagctcat 37140 ggcggggacc acagaaccca cgtggccatc ataccacaag cgcaggtaga ttaagtggcg 37200 acccctcata aacacgctgg acataaacat tacctctttt ggcatgttgt aattcaccac 37260 ctcccggtac catataaacc tctgattaaa catggcgcca tccaccacca tcctaaacca 37320 gctggccaaa acctgcccgc cggctataca ctgcagggaa ccgggactgg aacaatgaca 37380 gtggagagcc caggactcgt aaccatggat catcatgctc gtcatgatat caatgttggc 37440 acaacacagg cacacgtgca tacacttcct caggattaca agctcctccc gcgttagaac 37500 catatcccag ggaacaaccc attcctgaat cagcgtaaat cccacactgc agggaagacc 37560 tcgcacgtaa ctcacgttgt gcattgtcaa agtgttacat tcgggcagca gcggatgatc 37620 ctccagtatg gtagcgcggg tttctgtctc aaaaggaggt agacgatccc tactgtacgg 37680 agtgcgccga gacaaccgag atcgtgttgg tcgtagtgtc atgccaaatg gaacgccgga 37740 cgtagtcata tttcctgaag caaaaccagg tgcgggcgtg acaaacagat ctgcgtctcc 37800 ggtctcgccg cttagatcgc tctgtgtagt agttgtagta tatccactct ctcaaagcat 37860 ccaggcgccc cctggcttcg ggttctatgt aaactccttc atgcgccgct gccctgataa 37920 catccaccac cgcagaataa gccacaccca gccaacctac acattcgttc tgcgagtcac 37980 acacgggagg agcgggaaga gctggaagaa ccatgattaa ctttattcca aacggtctcg 38040 gagcacttca aaatgcaggt cccggaggtg gcacctctcg cccccactgt gttggtggaa 38100 aataacagcc aggtcaaagg tgacacggtt ctcgagatgt tccacggtgg cttccagcaa 38160 agcctccacg cgcacatcca gaaacaagag gacagcgaaa gcgggagcgt tttctaattc 38220 ctcaatcatc atattacact cctgcaccat ccccagataa ttttcatttt tccagccttg 38280 aatgattcgt attagttcct gaggtaaatc caagccagcc atgataaaaa gctcgcgcag 38340 agcgccctcc accggcattc ttaagcacac cctcataatt ccaagagatt ctgctcctgg 38400 ttcacctgca gcagattaac aatgggaata tcaaaatctc tgccgcgatc cctaagctcc 38460 tccctcaaca ataactgtat gtaatctttc atatcatctc cgaaattttt agccataggg 38520 ccgccaggaa taagagcagg gcaagccaca ttacagataa agcgaagtcc tccccagtgw 38580 gcattgccaa atgtaagatt gaaataagca tgctggctag accctgtgat atcttccaga 38640 taactggaca gaaaatcagg caagcaattt ttaagaaaat caacaaaaga aaagtcgtcc 38700 aggtgcaggt ttagagcctc aggaacaacg atggaataag tgcaaggagt gcgttccagc 38760 atggttagtg tttttttggt gatctgtaga acaaaaaata aacatgcaat attaaaccat 38820 gctagcctgg cgaacaggtg ggtaaatcac tctttccagc accaggcagg ctacggggtc 38880 tccggcgcga ccctcgtaga agctgtcgcc atgattgaaa agcatcaccg agagaccttc 38940 ccggtggccg gcatggatga ttcgagaaga agcatacact ccgggaacat tggcatccgt 39000 gagtgaaaaa aagcgaccta taaagcctcg gggcactaca atgctcaatc tcaattccag 39060 caaagccacc ccatgcggat ggagcacaaa attggcaggt gcgtaaaaaa tgtaattact 39120 cccctcctgc acaggcagca aagcccccgc tccctccaga aacacataca aagcctcagc 39180 gtccatagct taccgagcac ggcaggcgca agagtcagag aaaaggctga gctctaacct 39240 gactgcccgc tcctgtgctc aatatatagc cctaacctac actgacgtaa aggccaaagt 39300 ctaaaaatac ccgccaaaat gacacacacg cccagcacac gcccagaaac cggtgacaca 39360 ctcaaaaaaa tacgtgcgct tcctcaaacg cccaaaccgg cgtcatttcc gggttcccac 39420 gctacgtcac cgctcagcga ctttcaaatt ccgtcgaccg ttaaaaacgt cactcgcccc 39480 gcccctaacg gtcgcccttc tctcggccaa tcaccttcct cccttcccaa attcaaacgc 39540 ctcatttgca tattaacgcg cacaaaaagt ttgaggtata tatttgaatg atg 39593 <210> 26 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide construct for vector ChAdOx1_P1A <400> 26 atgagcgaca acaagaagcc cgacaaggcc cactctggca gcggcggaga tggcgacggc 60 aacagatgta acctgctgca cagatacagc ctggaagaga tcctgcccta cctgggctgg 120 ctggtgttcg ccgtcgtgac aacaagcttc ctggccctgc agatgttcat cgacgccctg 180 tacgaggaac agtacgagag ggacgtggcc tggatcgcca gacagagcaa gagaatgagc 240 agcgtggacg aggacgagga tgatgaggac gacgaagatg actactacga cgatgaggat 300 gacgacgacg acgccttcta cgatgacgag gacgatgaag aggaagaact ggaaaacctg 360 atggacgacg agtccgagga tgaggccgag gaagagatga gcgtggaaat gggcgctggc 420 gccgaagaga tgggagccgg cgctaactgt gcttgcgtgc caggacacca cctgagaaag 480 aacgaagtga agtgccggat gatctacttc ttccacgacc ccaactttct ggtgtccatc 540 cccgtgaacc ccaaagaaca gatggaatgc agatgcgaga acgccgacga agaggtggcc 600 atggaagaag aagaggaaga ggaagaagaa gaagaagagg aagaaatggg caaccccgac 660 ggcttcagcc cctga 675 <210> 27 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Translated protein of ChAdOx1_P1A <400> 27 Met Ser Asp Asn Lys Lys Pro Asp Lys Ala His Ser Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asp Gly Asp Gly Asn Arg Cys Asn Leu Leu His Arg Tyr Ser Leu Glu 20 25 30 Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe Ala Val Val Thr Thr 35 40 45 Ser Phe Leu Ala Leu Gln Met Phe Ile Asp Ala Leu Tyr Glu Glu Gln 50 55 60 Tyr Glu Arg Asp Val Ala Trp Ile Ala Arg Gln Ser Lys Arg Met Ser 65 70 75 80 Ser Val Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Tyr Tyr 85 90 95 Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Ala Phe Tyr Asp Asp Glu Asp Asp 100 105 110 Glu Glu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Met Asp Asp Glu Ser Glu Asp Glu 115 120 125 Ala Glu Glu Glu Met Ser Val Glu Met Gly Ala Gly Ala Glu Glu Met 130 135 140 Gly Ala Gly Ala Asn Cys Ala Cys Val Pro Gly His His Leu Arg Lys 145 150 155 160 Asn Glu Val Lys Cys Arg Met Ile Tyr Phe Phe His Asp Pro Asn Phe 165 170 175 Leu Val Ser Ile Pro Val Asn Pro Lys Glu Gln Met Glu Cys Arg Cys 180 185 190 Glu Asn Ala Asp Glu Glu Val Ala Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 195 200 205 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Met Gly Asn Pro Asp Gly Phe Ser Pro 210 215 220 <210> 28 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide construct for vector ChAdOx1_mIi_P1A <400> 28 atgggcgctc tgtatactgg cgtgtccgtg ctggtggccc tgctgctggc tggacaggct 60 acaaccgcct acttcctgta cagcgacaac aagaagcccg acaaggccca ctctggcagc 120 ggcggagatg gcgacggcaa cagatgtaac ctgctgcaca gatacagcct ggaagagatc 180 ctgccctacc tgggctggct ggtgttcgcc gtcgtgacaa caagcttcct ggccctgcag 240 atgttcatcg acgccctgta cgaggaacag tacgagaggg acgtggcctg gatcgccaga 300 cagagcaaga gaatgagcag cgtggacgag gacgaggatg atgaggacga cgaagatgac 360 tactacgacg atgaggatga cgacgacgac gccttctacg atgacgagga cgatgaagag 420 gaagaactgg aaaacctgat ggacgacgag tccgaggatg aggccgagga agagatgagc 480 gtggaaatgg gcgctggcgc cgaagagatg ggagccggcg ctaactgtgc ttgcgtgcca 540 ggacaccacc tgagaaagaa cgaagtgaag tgccggatga tctacttctt ccacgacccc 600 aactttctgg tgtccatccc cgtgaacccc aaagaacaga tggaatgcag atgcgagaac 660 gccgacgaag aggtggccat ggaagaagaa gaggaagagg aagaagaaga agaagaggaa 720 gaaatgggca accccgacgg cttcagcccc tga 753 <210> 29 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Translated protein ChAdOx1_mIi_P1A <400> 29 Met Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Ser Asp Asn Lys Lys 20 25 30 Pro Asp Lys Ala His Ser Gly Ser Gly Gly Asp Gly Asp Gly Asn Arg 35 40 45 Cys Asn Leu Leu His Arg Tyr Ser Leu Glu Glu Ile Leu Pro Tyr Leu 50 55 60 Gly Trp Leu Val Phe Ala Val Val Thr Thr Ser Phe Leu Ala Leu Gln 65 70 75 80 Met Phe Ile Asp Ala Leu Tyr Glu Glu Gln Tyr Glu Arg Asp Val Ala 85 90 95 Trp Ile Ala Arg Gln Ser Lys Arg Met Ser Ser Val Asp Glu Asp Glu 100 105 110 Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Tyr Tyr Asp Asp Glu Asp Asp Asp 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Tyr Asp Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu 130 135 140 Asn Leu Met Asp Asp Glu Ser Glu Asp Glu Ala Glu Glu Glu Met Ser 145 150 155 160 Val Glu Met Gly Ala Gly Ala Glu Glu Met Gly Ala Gly Ala Asn Cys 165 170 175 Ala Cys Val Pro Gly His His Leu Arg Lys Asn Glu Val Lys Cys Arg 180 185 190 Met Ile Tyr Phe Phe His Asp Pro Asn Phe Leu Val Ser Ile Pro Val 195 200 205 Asn Pro Lys Glu Gln Met Glu Cys Arg Cys Glu Asn Ala Asp Glu Glu 210 215 220 Val Ala Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Met Gly Asn Pro Asp Gly Phe Ser Pro 245 250 <210> 30 <211> 675 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide construct for vector MVA_P1A <400> 30 atgagcgaca acaagaagcc cgacaaggcc cactctggca gcggcggaga tggcgacggc 60 aacagatgta acctgctgca cagatacagc ctggaagaga tcctgcccta cctgggctgg 120 ctggtgttcg ccgtcgtgac aacaagcttc ctggccctgc agatgttcat cgacgccctg 180 tacgaggaac agtacgagag ggacgtggcc tggatcgcca gacagagcaa gagaatgagc 240 agcgtggacg aggacgagga tgatgaggac gacgaagatg actactacga cgatgaggat 300 gacgacgacg acgccttcta cgatgacgag gacgatgaag aggaagaact ggaaaacctg 360 atggacgacg agtccgagga tgaggccgag gaagagatga gcgtggaaat gggcgctggc 420 gccgaagaga tgggagccgg cgctaactgt gcttgcgtgc caggacacca cctgagaaag 480 aacgaagtga agtgccggat gatctacttc ttccacgacc ccaactttct ggtgtccatc 540 cccgtgaacc ccaaagaaca gatggaatgc agatgcgaga acgccgacga agaggtggcc 600 atggaagaag aagaggaaga ggaagaagaa gaagaagagg aagaaatggg caaccccgac 660 ggcttcagcc cctga 675 <210> 31 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Translated protein of MVA_P1A <400> 31 Met Ser Asp Asn Lys Lys Pro Asp Lys Ala His Ser Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Asp Gly Asp Gly Asn Arg Cys Asn Leu Leu His Arg Tyr Ser Leu Glu 20 25 30 Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe Ala Val Val Thr Thr 35 40 45 Ser Phe Leu Ala Leu Gln Met Phe Ile Asp Ala Leu Tyr Glu Glu Gln 50 55 60 Tyr Glu Arg Asp Val Ala Trp Ile Ala Arg Gln Ser Lys Arg Met Ser 65 70 75 80 Ser Val Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Tyr Tyr 85 90 95 Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Ala Phe Tyr Asp Asp Glu Asp Asp 100 105 110 Glu Glu Glu Glu Leu Glu Asn Leu Met Asp Asp Glu Ser Glu Asp Glu 115 120 125 Ala Glu Glu Glu Met Ser Val Glu Met Gly Ala Gly Ala Glu Glu Met 130 135 140 Gly Ala Gly Ala Asn Cys Ala Cys Val Pro Gly His His Leu Arg Lys 145 150 155 160 Asn Glu Val Lys Cys Arg Met Ile Tyr Phe Phe His Asp Pro Asn Phe 165 170 175 Leu Val Ser Ile Pro Val Asn Pro Lys Glu Gln Met Glu Cys Arg Cys 180 185 190 Glu Asn Ala Asp Glu Glu Val Ala Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 195 200 205 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Met Gly Asn Pro Asp Gly Phe Ser Pro 210 215 220

Claims (48)

  1. 동물 세포에서 암 항원 또는 이의 단편의 번역, 전사 및/또는 발현을 지시하는 발현 조절 서열, 및 아데노바이러스 패키징 신호 서열에 작동 가능하게 연결된, (ⅰ) MAGE 암 항원 및/또는 NY-ESO-1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) MAGE 암 항원 및/또는 LAGE1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 캡슐화하는 침팬지 아데노바이러스(ChAd) 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 ChAd 벡터는, (a) WO2012/172277호에 개시된 바와 같은 ChAdOx1; 바람직하게는 WO2012/172277호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO: 38의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 80% 동일성의 서열에 의해 암호화된 ChAdOx1; 또는 (b) WO2017/221031호에 개시된 바와 같은 ChAdOx2; 바람직하게는 WO2017/221031호에 개시된 바와 같은 SEQ ID NO: 10의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 80% 동일성의 서열에 의해 암호화된 ChAdOx2인, ChAd 벡터.
  3. 동물 세포에서 암 항원 또는 이의 단편의 번역, 전사 및/또는 발현을 지시하는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, (ⅰ) MAGE 암 항원 및/또는 NY-ESO-1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) MAGE 암 항원 및/또는 LAGE1 암 항원, 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 캡슐화하는 변형된 우두 바이러스 앙카라(MVA) 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 MVA 벡터는 WO2011/128704호 또는 EP 2044947 A1에 개시된 바와 같은, MVA 벡터.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MAGE 항원은, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 46%; 바람직하게는 적어도 69%; 좀 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성의 서열을 갖는 MAGE 3A; 또는 이의 임의의 면역원성 단편인, ChAd 또는 MVA 벡터.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 NY-ESO-1 암 항원은, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 75%; 바람직하게는 적어도 76.7% 동일성의 서열; 또는 이의 임의의 면역원성 단편을 갖는, ChAd 또는 MVA 벡터.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 LAGE1 암 항원은, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 78%; 바람직하게는 적어도 97% 동일성의 서열; 또는 이의 임의의 면역원성 단편을 갖는, ChAd 또는 MVA 벡터.
  8. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 79% 동일성의 서열, 또는 이의 단편을 갖는 인간 HLA 클래스 Ⅱ 조직적합성 항원 감마 사슬(li)을 더욱 암호화하여, 암 항원이 li 또는 이의 단편과의 융합으로서 동물 세포에서 발현되며; 바람직하게는, 여기서, 상기 단편은 막관통 도메인이고; 좀 더 바람직하게는, 상기 막관통 도메인은 아미노산 잔기 30 내지 55 또는 30 내지 61을 포함하며, 더욱 더 바람직하게는, 상기 막관통 도메인은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는, ChAd 또는 MVA 벡터.
  9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 81% 동일성의 서열, 또는 이의 단편을 갖는 tPA를 더욱 암호화하여; 암 항원이 tPA 또는 이의 단편과 융합으로 동물 세포에서 발현되며; 바람직하게는, 여기서, 상기 단편은 21개 아미노산 리더 서열을 포함하고; 좀 더 바람직하게는, 상기 21개 아미노산 리더 서열은 SEQ ID NO: 9인, ChAd 또는 MVA 벡터.
  10. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은, 융합 단백질로서 동물 세포에서 발현되는, (ⅰ) MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및 NY-ESO-1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및 LAGE1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는, ChAd 벡터.
  11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은, 융합 단백질로서 동물 세포에서 발현되는, (ⅰ) MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및/또는 NY-ESO-1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편; 또는 (ⅱ) MAGE 암 항원 또는 이의 면역원성 단편 및/또는 LAGE1 암 항원 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하고, 여기서, 상기 MAGE 암 항원, NY-ESO-1 암 항원 또는 LAGE1 암 항원 중 적어도 하나는 단편인, MVA 벡터.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 MAGE 암 항원 및 NY-ESO-1 또는 MAGE 암 항원 및 LAGE1은, 면역원성 단편인, MVA 벡터.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열은, 발현시 융합 단백질로서, 임의의 순서로, MAGE 및 NY-ESO-1 또는 LAGE1 암 항원 또는 이의 단편을 연결하는, 5 내지 9개의 아미노산의 링커; 바람직하게는, 아미노산 서열 GGGPGGG를 갖는 링커를 암호화하는, ChAd 또는 MVA 벡터.
  14. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 청구된 ChAd 또는 MVA 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 청구항 14에있어서,
    보조제를 더욱 포함하는, 조성물.
  16. 청구항 1 내지 10 또는 13 중 어느 한 항의 ChAd 벡터, 또는 청구항 3 내지 9 또는 11 내지 13 중 어느 한 항의 MVA 벡터를 암호화하는 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  17. 청구항 16에 있어서,
    인간 코돈 사용을 위해 최적화된 코돈인, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 청구항 16 또는 17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론.
  19. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 ChAd 및/또는 MVA 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  20. 청구항 1 내지 10 또는 13 중 어느 한 항에 기재된 유효량의 ChAd 벡터를 투여하는 단계, 및 청구항 3 내지 9 또는 11 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 유효량의 MVA 벡터를 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 개체의 후천성 면역계가 자극되어 항-암 면역 반응을 제공하는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 ChAd 및 MVA 벡터의 투여는, 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 수행되는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  22. 청구항 20 또는 21에 있어서,
    유효량의 하나 이상의 관문 억제제의 투여를 더욱 포함하는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  23. 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관문 억제제는, ChAd 및 MVA 벡터와 동시에, 개별적으로 또는 함께 투여되는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  24. 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체는, 화학요법 및/또는 방사선요법 치료를 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정인, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  25. 청구항 20 내지 24 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ChAd 벡터는 맨 먼저 투여되는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  26. 청구항 20 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ChAd 및 MVA 벡터는, 각각 1회 이상 투여되는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  27. 청구항 20 내지 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ChAd 및 MVA 벡터는 교대로 투여되는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  28. 청구항 20 내지 27 중 어느 한 항에 있어서,
    벡터의 각 투여 사이에 기간은 5일 내지 8주의 범위; 바람직하게는 1주인, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  29. 청구항 22 내지 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관문 억제제는, PD-1, CTLA-4 또는 PD-L1을 차단하는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  30. 청구항 22 내지 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관문 억제제는, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙 또는 아테졸리주맙, 두르발루맙 또는 아벨루맙으로부터 선택되는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  31. 청구항 22 내지 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은, 비-소세포 폐암(NSCLC), 흑색종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 요로암(요로상피암), 방광암, 소세포 폐암, 신장암, 두경부암, 육종, 또는 유방암인, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  32. 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 청구항 1, 2, 5 내지 10 또는 13 중 어느 한 항에 따른 ChAd 벡터.
  33. 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 청구항 3 내지 9 또는 11 내지 13 중 어느 한 항에 따른 MVA 벡터.
  34. 암의 예방 또는 치료를 위해 환자에게 개별적, 순차적 또는 동시에 투여하기 위한, 청구항 1, 2, 5 내지 10 또는 13 중 어느 한 항에 기재된 ChAd 벡터 및 청구항 3 내지 9 또는 11 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 MVA 벡터.
  35. 청구항 34에 있어서,
    암의 치료를 위해 ChAd 및 MVA 벡터와 함께 투여하기 위한 하나 이상의 관문 억제제를 더욱 포함하는, 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 관문 억제제는, 벡터와 동시에, 개별적으로 또는 함께 투여되는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  37. 청구항 31 내지 33 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 환자는, 화학요법을 받았거나, 받고 있거나, 또는 받을 예정인, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  38. 청구항 34 내지 36 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ChAd 벡터는 맨 먼저 투여되는, 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  39. 청구항 34 내지 38 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ChAd 및 MVA 벡터는 각각 1회 이상 투여되는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  40. 청구항 34 내지 39 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ChAd 및 MVA 벡터는 교대로 투여되는, 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  41. 청구항 34 내지 40 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 벡터의 각 투여 사이에 기간은, 5일 내지 8주의 범위, 바람직하게는 1주인, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  42. 청구항 35 내지 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관문 억제제는, PD-1, CTLA-4 또는 PD-L1을 차단하는, 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  43. 청구항 35 내지 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관문 억제제는, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙 또는 아테졸리주맙, 두르발루맙 또는 아벨루맙으로부터 선택되는, 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  44. 청구항 35 내지 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은, 비-소세포 폐암(NSCLC), 흑색종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 요로암(요로상피암), 방광암, 소세포 폐암, 신장암, 두경부암, 육종, 또는 유방암인, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 ChAd 및 MVA 벡터.
  45. 암의 예방 또는 치료를 위해 환자에게 개별적, 순차적 또는 동시에 투여하기 위한, 청구항 1, 2, 5 내지 10 또는 13 중 어느 한 항에 기재된 ChAd 벡터, 청구항 3 내지 9 또는 11 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 MVA 벡터, 화학요법제, 및 관문 억제제.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 화학요법제는, (a) 카보플라틴 또는 시스플라틴과 (b) 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 젬시타빈, 에토포시드 또는 페메트렉시드 중 하나의 조합으로부터 선택되는, ChAd 벡터, MVA 벡터, 화학요법제 및 관문 억제제.
  47. 청구항 45 또는 46에 있어서,
    상기 관문 억제제는 PD-1인, ChAd 벡터, MVA 벡터, 화학요법제 및 관문 억제제.
  48. 청구항 45 내지 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은, 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 소세포 폐암(SCLC), 흑색종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 요로암(요로상피암), 방광암, 신장암, 두경부암, 육종 또는 유방암으로부터 선택되는, ChAd 벡터, MVA 벡터, 화학요법제 및 관문 억제제.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2022099543A1 (zh) * 2020-11-12 2022-05-19 深圳先进技术研究院 Ny-eso-1基因抑制剂作为抗肿瘤化疗药物增敏剂的应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6140087A (en) 1993-06-24 2000-10-31 Advec, Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
WO1998046769A1 (en) 1997-04-11 1998-10-22 Dendreon Corporation Composition and method for inducing an immune response against tumour-related antigens
DE69839443D1 (de) 1997-05-08 2008-06-19 Biomira Inc Verfahren zur gewinnung von aktivierten t-zellen und mit antigen inkubierten antigenpräsentierenden zellen
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
DE60124899T2 (de) * 2000-05-10 2007-08-16 Sanofi Pasteur Ltd., Toronto Durch mage minigene kodierte immunogene polypeptide und ihre verwendungen
WO2004055187A1 (en) 2002-12-17 2004-07-01 Crucell Holland B.V. Recombinant viral-based malaria vaccines
CN102719478A (zh) 2004-01-23 2012-10-10 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP2006149234A (ja) 2004-11-25 2006-06-15 Japan Science & Technology Agency プライム−ブーストワクチン接種法
WO2006120474A2 (en) * 2005-05-13 2006-11-16 Oxxon Therapeutics Ltd Compositions for inducing an immune response against tumor antigens
GB0719526D0 (en) 2007-10-05 2007-11-14 Isis Innovation Compositions and methods
US8326547B2 (en) 2009-10-07 2012-12-04 Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corp. Method of sequence optimization for improved recombinant protein expression using a particle swarm optimization algorithm
GB201006405D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Isis Innovation Poxvirus expression system
ES2528369T3 (es) 2010-08-06 2015-02-09 Re.Le.Vi. S.P.A. Agente sanitario
US20130302367A1 (en) 2010-10-22 2013-11-14 Hisatoshi Shida Virus vector for prime/boost vaccines, which comprises vaccinia virus vector and sendai virus vector
GB201108879D0 (en) 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
GB201321384D0 (en) 2013-12-04 2014-01-15 Isis Innovation Molecular adjuvant
WO2015092710A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
EP3402500A4 (en) 2016-01-11 2019-06-12 Turnstone Limited Partnership COMBINATION THERAPY OF ONCOLYTIC VIRUS AND CHECKPOINT INHIBITOR
GB2549809C (en) * 2016-06-23 2022-11-30 Univ Oxford Innovation Ltd Vector

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