KR20210041581A - 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 숙주 적합성이 개선되고 혈전증에 대한 감수성이 감소된, 이식에 유용한 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 이러한 방법에 의해 생산된 개인맞춤 혈관 및 수술에서의 이의 용도가 제공된다.

Description

개인맞춤 혈관을 제조하는 방법
본원은 2018년 8월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/714,200호를 우선권 주장한다.
본원은 개인맞춤 혈관 및 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다. 다양한 실시태양에서, 본원에서 고려하는 방법에 의해 생산된 개인맞춤 혈관은 개선된 숙주 적합성, 조직 통합성, 및 혈전증에 대한 감소된 감수성에 의해 이식에서 유용할 수 있다.
혈관 질환은 전세계적 규모로 심각하고 계속해서 일어나는 건강 문제인 것으로 여겨진다. 손상된 혈관을 대체하기 위한 선택지는 오늘날 제한된다. 자가유래 이식은 환자에서 적합한 혈관을 필요로 하고, 제공자 부위 이환율(donor site morbidity)을 유도한다. 합성 혈관으로 대체할 수 있지만, 이들은 숙주 조직에서의 생물학적 통합 및 장기간의 개방성(patency)이 부족하다. 완전히-생물학적인 환자-개별화된 이식편에 대한 요구가 있다.
국제 특허출원 공개공보 번호 제WO/2013/136184호는 "혈관의 재세포화를 위한 방법(methods for recellurization of blood vessels)"을 개시하고; 예를 들면 "동종이형 정맥을 생산하기 위한 것으로, 여기서 제공자 정맥은 탈세포화되고, 이어서 전혈 또는 골수 줄기 세포를 사용하여 재세포화된다".
국제 특허출원 공개공보 번호 제WO/2015/181245호는 "밸브-함유 정맥에서의 밸브의 재세포화를 위한 방법(methods for recellularization of valves in valve-bearing veins)"을 개시하고; 예를 들면 "동종이형 정맥 밸브를 생산하기 위한 것으로, 여기서 제공자 밸브-함유 정맥은 탈세포화되고 이어서 전혈 또는 골수 줄기 세포를 사용하여 재세포화된다".
본원의 하나의 양태는, 무세포 관형 지지체(acellular tubular scaffold)의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 개체로부터의 희석되지 않은 전혈 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 접촉을 2일 초과 동안 수행하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본원의 또 다른 양태는 무세포 관형 지지체의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 개체로부터의 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 전혈 샘플이 생리학적 용액에 희석되어 있는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 세포외 환경의 교질 삼투압을 유지하고, C02 독립적 물질에서 pH를 완충하고/하거나, 세포 보호 또는 항산화 효과를 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플에 존재하는 세포의 집단은 지지체를 점유한다.
몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플은 1종 이상의 비-세포 인자를 포함하고, 여기서 전혈의 1종 이상의 비-세포 인자는 지지체를 점유하고, 1종 이상의 비-세포 인자는 무세포 관형 지지체의 세포화 및 이식시 혈관의 숙주 적합성을 촉진시킨다.
몇몇 실시태양에서, 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액은 추가로 항혈전 인자를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항혈전 인자는 항응고제를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 항응고제는 헤파린 또는 덱스트란을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 헤파린은 무세포 관형 지지체의 표면과 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.5 IU/㎖ 내지 약 150 IU/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 헤파린은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 6.7 IU/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 덱스트란은 덱스트란-40이다.
몇몇 실시태양에서, 덱스트란은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 1 g/ℓ 내지 약 55 g/ℓ의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 항혈전제는 아스코르브산을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 아스코르브산은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 아스코르브산은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 5 ㎍/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 항혈전 인자는 아세틸살리실산을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 아세틸살리실산은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 아세틸살리실산은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 5 ㎍/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액은: 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-3, IL-4, 뉴트로핀(neutrophin)(NT)-6, 플레이오트로핀(pleiotrophin)(HB-GAM), 미드카인(midkine)(MK), 인터페론 유도 단백질-10(IP-10), 혈소판 인자(PF)-4, 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-1), RANTES[CCL-5, 케모카인(C-C 모티프(motif)) 리간드 5], IL-8, IGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, 형질전환 성장 인자(TGF)-β, VEGF, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, 간세포 성장 인자(HGF), 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-1, 및 이들의 임의의 조합(들)으로 구성된 군에서 선택된 성장 인자를 모집단의 평균 생리학적 수준과 동일하거나 그 이상으로 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF)-2이다.
몇몇 실시태양에서, FGF-2는 인간 FGF-2이다.
몇몇 실시태양에서, FGF-2는 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.5 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, FGF-2의 농도는 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 10 ng/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다.
몇몇 실시태양에서, VEGF는 인간 VEGF이다.
몇몇 실시태양에서, VEGF는 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 4 ng/㎖ 내지 약 800 ng/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, VEGF는 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 80 ng/㎖의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액은 인간 혈청 알부민을 추가로 포함하고, 여기서 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 인간 혈청 알부민의 농도는 약 55 g/ℓ 내지 약 105 g/ℓ이다.
몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 무기 염, 및 완충 시스템을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 완충 시스템은 C02-독립적 완충 시스템을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, C02-독립적 완충 시스템은 인산염 완충 시스템을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 전혈과 실질적으로 유사한 삼투압을 나타내고, 이는 바람직하게는 약 270 mOsm/kg H20 내지 약 310 mOsm/kg H20이다.
몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 삼투성 인자 및/또는 영양분을 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 삼투성 인자는 혈청 알부민을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 인간 혈청 알부민 VEGF는 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 55 g/ℓ 내지 약 105 g/ℓ의 농도로 존재한다.
몇몇 실시태양에서, 영양분은 당분, 아미노산, 또는 비타민중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 당분은 D-글루코스이다.
몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 성장 인자, 항혈전 인자, 영양분, 및 삼투성 인자를 포함하고; 여기서 성장 인자는 인간 FGF-2 및 인간 VEGF를 포함하고; 여기서 항혈전 인자는 아세틸살리실산, 헤파린 또는 덱스트란중 하나 이상을 포함하며; 영양분은 D-글루코스를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 방법은 개인맞춤 혈관을 제조하기 위해 무세포 관형 지지체를 전혈과 접촉시킨 후 세포 배양 배지와 접촉시킬 필요가 없다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체의 표면의 접촉은 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과 동안, 2 내지 21일 동안, 3 내지 21일 동안, 4 내지 21일 동안, 5 내지 21일 동안, 6 내지 21일 동안, 7 내지 21일 동안, 또는 7 내지 9일 동안이다.
무세포 관형 지지체를 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 접촉시키는 몇몇 실시태양에서, 방법은 개인맞춤 혈관의 제조 동안에 다수의 환경적 매개변수, 및/또는 영양분의 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 방법은 다수의 환경적 매개변수를 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 다수의 환경적 매개변수는 온도, pH, 산소, 및/또는 C02를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 접촉되고, 방법은 현탁액중의 영양분의 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 방법은 영양분의 농도를 연속적으로 또는 규칙적으로 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 영양분은 D-글루코스이고, 여기서 D-글루코스 농도는 D-글루코스 농도를 약 3 내지 약 11 밀리몰/ℓ에서 유지시키기 위해 연속적으로 또는 규칙적으로 조정된다.
몇몇 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 현택액으로부터 수집된 샘플중의 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 모니터링된다.
몇몇 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 1일 1회 측정된다.
몇몇 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 현탁액과 접촉된 센서를 사용하여 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 모니터링된다.
몇몇 실시태양에서, 센서는 접촉 동안에 현탁액과 연속적으로 접촉된다.
몇몇 실시태양에서, D-글루코스는 현탁액중의 D-글루코스의 측정된 농도가 4 밀리몰/ℓ 미만인 경우 첨가된다.
몇몇 실시태양에서, D-글루코스는 현탁액중의 D-글루코스의 최종 농도인 10 밀리몰/ℓ에 도달될 때까지 첨가된다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체의 표면은 무세포 관형 지지체의 내부 표면이다.
몇몇 실시태양에서, 전혈은 말초 혈액 또는 제대혈을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 방법은 인간 혈청 알부민의 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 인간 혈청 알부민의 농도는 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 약 55 g/ℓ 내지 약 105 g/ℓ이다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체의 접촉은 다수의 전구체(progenitor) 세포의 다수의 내피 세포로의 증식 및/또는 분화를 일으킨다.
몇몇 실시태양에서, 다수의 내피 세포는 VE-카드헤린(cadherin), AcLDL, vWF, 및/또는 CD31을 발현한다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 탈세포화된 혈관이다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 연속적으로 현탁액 또는 전혈에 의해 관류된다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 1분당 약 0.1 ㎖ 내지 약 50 ㎖의 속도로 관류된다.
몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 1분당 약 2 ㎖의 속도로 관류된다.
몇몇 실시태양에서, 지지체는 현탁액 또는 전혈의 폐쇄된 재순환에 의해 관류된다.
몇몇 실시태양에서, 연속 접촉은 생물반응기를 사용하여 수행되는 관류이다.
몇몇 실시태양에서, 접촉은 시험관내에서 수행된다.
몇몇 실시태양에서, 접촉은 약 8℃ 내지 약 40℃에서 수행된다.
몇몇 실시태양에서, 접촉은 약 20℃ 내지 약 25℃에서 수행된다.
몇몇 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 정맥이다.
몇몇 실시태양에서, 정맥은 대퇴부 정맥이다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 방법은 밸브 능력 시험을 사용하여 개인맞춤 혈관의 정맥 밸브 기능을 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
본원의 또 다른 양태는 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법들중 임의의 한 방법에 의해 제조된 개인맞춤 혈관에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 수술에 의해 피험체내로 이식되었다.
본원의 또 다른 양태는 개인맞춤 혈관을 이식할 필요가 있는 피험체내로 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 이식하는 단계를 포함하는 수술 방법에 관한 것이다.
본원의 또 다른 양태는 개인맞춤 혈관을 이식할 필요가 있는 피험체내로 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 이식하는 단계를 포함하는 수술 방법에 사용하기 위한 개인맞춤 혈관에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 피험체는 인간이다.
본원의 또 다른 양태는, 연동식 펌프, 샘플링 포트(sampling port)를 포함하는 용기, 제1 연결기, 및 제2 연결기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 용기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 여기서 각각의 연결기가 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 관형 지지체의 말단에 연결되며, 여기서 제1 및 제2 연결기가 관형 지지체의 2개의 말단에 연결되는 경우, 연동식 펌프가 폐쇄된 회로에서 현탁액 또는 용액의 순환을 중재하는, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 생물반응기에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 제1 및 제2 연결기는 루어(Luer) 연결기이다.
몇몇 실시태양에서, 샘플링 포트는 주입 포트이다.
몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 주입 포트를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 주입 포트는 D-글루코스의 저장소에 연결된다.
몇몇 실시태양에서, 제1 용기는 관에 의해 용기에 직접적으로 연결되고/되거나, 제2 용기는 관에 의해 용기에 직접적으로 연결된다.
몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 1개 이상의 샘플 포트를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 글루코스 수준을 측정하기 위해 1개 이상의 센서를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 pH 조정 모듈(module)을 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 C02 조정 모듈을 추가로 포함한다.
본원의 또 다른 양태는 표면 접촉에 사용하기 전에 강화되거나 선택된 전혈에 포함된 성분과 무세포 관형 지지체의 표면을 접촉시키는 단계를 포함하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 성분은 혈소판, 유핵 세포, 단백질, 성장 인자, 신호전달 인자, 면역글로불린, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 성분은 원심분리, 구배 원심분리에 의해 강화되거나; 또는 선택적 접착, 여과, 또는 분류에 의해 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 표면은 무세포 관형 지지체의 내부 표면이다.
도 1A 및 1B는 모의 수술된 대정맥(도 1A) 및 이식된 P-TEV(도 1B)의 혈관조영사진이다. 금속 클립은 문합(anastomose)의 위치를 알려 주기 위해 화살표에 의해 지시된다.
도 2A 및 2B는 수술 후 3일, 2주, 17일, 및 4 내지 5주째 인접한 구간으로부터의 선천성 대정맥("선천성", 도 2A) 및 P-TEV 이식물("P-TEV", 도 2B)의 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)(H&E) 염색 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색을 보여주는 일련의 영상이다.
도 3A 내지 3D는 수술 후 2주째 대정맥 세포화를 보여주는 영상을 도시한다. 도 3A 내지 3D는 수술 후 2주째 대정맥의 DAPI 염색 및 CD31 면역 염색을 보여주는 일련의 면역히스토그램이다. 도 3A는 문합 부근의 선천성 대정맥을 보여준다. 도 3B 내지 3D는 P-TEV의 근위(도 3B), 중심(도 3C), 및 원위(도 3D) 부분을 보여준다. 화살표는 CD31-양성 세포를 지시한다.
도 4A 내지 4D는 수술 후 4주째 대정맥 세포화를 보여주는 영상을 도시한다. 도 4A 내지 4D는 수술 후 4 내지 5주째 대정맥의 DAPI 염색 및 CD31 면역 염색을 보여주는 일련의 면역히스토그램이다. 도 4A는 문합 부근의 선천성 대정맥을 보여준다. 도 4B 내지 4D는 P-TEV의 근위(도 4B), 중심(도 4C), 및 원위(도 4D) 부분을 보여준다. 화살표는 CD31-양성 세포를 지시한다.
도 5A 및 5B는 수술 후 4주째 내강(luminal) 세포 형태를 보여주는 영상을 도시한다. 도 5A 및 5B는 수술 후 4 내지 5주째 선천성 대정맥(도 5A) 및 P-TEV 이식물(도 5B)의 H&E 염색을 보여주는 40배 배율의 일련의 영상이다. 화살표는 선천성 조직중의 내피 세포 및 P-TEV 이식물에 덧대어진 내피 세포-유사 형태를 갖는 세포를 지시한다.
본원은, 무엇 보다도, 혈액중의 세포 및 비-세포 인자가 무세포 관형 지지체[예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된(bioprinted) 관형 지지체]를 조절하여 개인맞춤 혈관을 생산할 수 있다는 발견에 기초한다. 본원은, 무엇 보다도, 무세포 관형 지지체를 희석되지 않은 전혈 샘플, 또는 생리학적 용액에 희석된 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 시험관내 공정으로 접촉시킴으로써 숙주 적합성이 개선되고 혈전증에 대한 감수성이 감소된 개인맞춤 혈관을 생산함을 추가로 제공한다.
따라서, 본원의 하나의 양태는 무세포 관형 지지체의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 피험체로부터의 희석되지 않은 전혈 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 접촉을 2일 초과 동안 수행하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본원의 또 다른 양태는 무세포 관형 지지체의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 피험체로부터의 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 전혈 샘플이 생리학적 용액에 희석되어 있는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체의 표면은 무세포 관형 지지체의 내부 표면이다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "개인맞춤 혈관"은 선천성 혈관이 아닌 조직 또는 기관을 통해 혈액을 전달할 수 있는 관형 구조물을 지칭한다. 관형 구조물은 제공자로부터의 선천성 혈관을 탈세포화함으로써 무세포 지지체를 수득하고, 또 다른 개별체로부터의 세포를 사용하여 지지체를 재조절(recondition)/재세포화함으로써 제조될 수 있다. 무세포 지지체는 또한 생체적합성 물질을 시험관내에서 조립(예를 들어, 생체인쇄 또는 중합체 자가-조립)함으로써 수득될 수 있다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "재조절하다", "재조절하는", 및 "재조절된"은 전혈이 함유된 재세포화/재조절(RC) 용액의 성분에 의한 무세포 지지체의 변형을 설명하기 위해 사용된다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "재세포화하다", "재세포화하는", 및 "재세포화"는 어떤 상황에서나 사용되고, 초기 출발 물질이 세포를 부착시킬 필요는 없다. 개인맞춤 혈관은 개인맞춤 정맥, 동맥, 또는 모세혈관일 수 있다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 선천성 혈관을 대체하기 위해 유용하다.
제공자로부터의 무세포 관형 지지체의 제조
본원에 개시된 바와 같은 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법은 무세포 관형 지지체를 이용한다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "무세포 관형 지지체"는 실질적으로 세포가 없는 관형 지지체를 지칭한다. 무세포 관형 지지체는 제공자로부터의 선천성 혈관을 탈세포화함으로써 제조될 수 있다. 제공자는 인간 또는 적합한 종으로부터의 동물일 수 있다. 무세포 지지체는 또한 생체적합성 물질을 시험관내에서 조립(예를 들어, 생체인쇄 또는 중합체 자가-조립)함으로써 수득될 수 있다.
무세포 관형 지지체는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 선천성 혈관의 탈세포화에 의해 제조될 수 있다. 선천성 혈관은 인간 기원일 수 있거나, 또는 적합한 동물 종으로부터 수득될 수 있다. 관형 구조물은 생체적합성 지지체 및 세포로부터 시험관내에서 조직-배양 방법에 의해 제조될 수 있고, 무세포 지지체의 제조를 위한 출발 물질로서 작용할 수 있다. 특정 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 본원에 개시된 탈세포화 방법에 의해 수득된다. 특정 실시태양에서, 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법은 선천성 혈관을 탈세포화함으로써 무세포 관형 지지체를 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "탈세포화하다", "탈세포화된", "탈세포화하는", 또는 탈세포화"는 혈관(혈관중의 임의의 정맥 밸브 포함)으로부터 세포를 제거하는 과정을 지칭한다. 효과적 탈세포화는 조직 밀도 및 구조화, 최종 생성물을 위해 요구되는 기하학적 및 생물학적 특성, 및 목표하는 임상적 적용분야와 같은 인자에 의해 좌우된다. ECM의 완전한 보존 및 생물활성을 갖는 혈관의 탈세포화는 당분야의 숙련가에 의해, 예를 들어, 가공 동안에 특정한 제제 및 기법을 선택함으로써 최적화될 수 있다.
성공적인 탈세포화는 표준 조직학적 염색 절차를 사용하여 조직학적 구간에서 세포, 예컨대 내피 세포, 평활근 세포, 및 핵이 존재하지 않는 것으로 정의된다. 대부분의 세포 제거 제제 및 방법은 ECM 조성을 변경시키고 어느 정도의 초미세구조의 파쇄를 야기하지만, 이들의 원치않는 영향의 최소화가 요망된다. 탈세포화의 방법은 당분야, 예를 들어, 미국 특허 공개공보 번호 제 2017/0071738호에 공지되어 있다.
따라서, 특정 실시태양에서, 탈세포화 공정은, 당분야에 공지된 방법(예를 들어, DAPI 염색, DNA 정량화)에 의해 검출되는 바와 같이, 모든 핵을 제거한다. 특정 실시태양에서, 탈세포화 공정은, 당분야에 공지된 방법(예를 들어, HLA 부류-I 및 부류-II 항원에 대한 면역조직화학적 검정)에 의해 검출되는 바와 같이, HLA 부류-I 항원 및 HLA 부류-II 항원을 감소시키거나 제거한다.
특정 실시태양에서, ECM 성분은 탈세포화 공정에서 실질적으로 보유된다. 탈세포화 공정 동안 및 이후, ECM의 형태 및 구조는 시각적으로 및/또는 조직학적으로 검사되어, 탈세포화 공정이 ECM 지지체의 3차원 구조 및 생물활성을 손상시키지 않음을 입증할 수 있다. 염색[예를 들어, H&E 염색, 매슨(Masson)의 삼색 염색, 또는 베르회프-반 기에슨(Verhoeff-Van Gieson) 염색]에 의한 조직학적 분석은 탈세포화된 혈관 구조 및 ECM 성분, 예컨대 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴의 보존을 시각화하기 위해 유용할 수 있다. 당분야에 공지된 기타 방법은 글리코스아미노글리칸 및 콜라겐과 같은 ECM 성분의 보존을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
혈관을 탈세포화하기 위해 1종 이상의 세포 파쇄 용액이 사용될 수 있다. 세포 파쇄 용액은 일반적으로 적어도 1종의 세정제, 예컨대 SDS, PEG, 또는 트리톤(Triton) X를 포함한다. 특별히 바람직한 세정제는 트리톤 X(예를 들어, 트리톤 X-100)이다. 세포 파쇄 용액은 유기 용매, 예를 들어, 트리-n-부틸 인산염(TNBP)을 포함할 수 있다. 세포 파쇄 용액은 또한 혈액보다 실질적으로 더 낮은 삼투 압력을 가짐으로써, 세포 용해를 촉진시킬 수 있다. 다르게는, 세포 파쇄 용액은 등장성일 수 있다. 세포 파쇄 용액은 또한, 제한없이, 1종 이상의 뉴클레아제(예를 들어, DNA 분해효소 또는 RNA 분해효소) 및 단백질분해효소[예를 들어, 콜라겐분해효소, 디스파제(dispase), 또는 트립신]와 같은 효소를 포함할 수 있다. DNA 분해효소 I을 포함하는 세포 파쇄 용액은 효소를 활성화시키기 위해 염화 칼슘 및 염화 마그네슘을 포함할 수 있다[A12858, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]. 특정 실시태양에서, 세포 파쇄 용액은 1종 이상의 단백질분해효소 저해제[예를 들어, 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF), 콜라겐분해효소 저해제]를 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 세포 파쇄 용액은 항생제[예를 들어, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 또는 암포테리신(amphotericin)] 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 관류 방법은 혈관의 탈세포화를 위한 세포 파쇄 용액으로 혈관(예를 들어, 밸브-함유 정맥)을 처리하기 위해 사용될 수 있다. 관류 방향의 교대(예를 들어, 제방향 및 역방향)는 밸브-함유 정맥을 효과적으로 탈세포화하는 것을 도울 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 탈세포화는 밸브-함유 정맥 내부에 덧대어진 세포를 내부로부터 바깥쪽으로 본질적으로 제거하여, ECM에 거의 손상을 주지 않는다. 혈관의 크기 및 중량, 및 특별한 세정제(들) 및 세포 파쇄 용액중의 세정제(들)의 농도에 따라서, 밸브-함유 정맥은 일반적으로 4 내지 48 시간; 또는 8 내지 24 시간 동안 세포 파쇄 매질에 의해 관류된다. 세척을 포함하여, 혈관은 트리톤 X의 경우 약 48 시간 또는 24 시간 이하 동안, TNBP의 경우 약 8 시간 동안, DNA 분해효소의 경우 약 16 시간 동안, 약 1 시간의 총 세척 및 약 48 시간의 최종 세척에 의해 관류될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 전술된 관류 절차는 1 내지 14 주기; 1 내지 5 주기; 2 내지 4 주기; 1 내지 3 주기; 또는 2 주기; 또는 3 주기; 또는 4 주기; 또는 5 주기; 또는 6 주기 반복된다. 특정 실시태양에서, 탈세포화는 전술된 시약에 의해 연속적으로 100 시간, 110 시간, 120 시간, 130 시간, 140 시간, 150 시간, 160 시간, 170 시간, 180 시간, 190 시간, 200 시간, 210 시간, 220 시간, 230 시간, 240 시간, 250 시간, 260 시간, 270 시간, 280 시간, 290 시간, 300 시간, 310 시간, 320 시간, 330 시간, 340 시간, 350 시간, 또는 그 이상 동안 관류함으로써 수행된다. 관류는 일반적으로 박동 혈류 속도 및 압력을 비롯한 생리학적 조건으로 조정된다. 본원에 기재된 바와 같은 관류 탈세포화는 몇몇 실시태양에서, 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,753,181호 및 제6,376,244호에 기재된 바와 같은 침지 탈세포화에 비교될 수 있다. 특정 실시태양에서, 탈세포화는 하기 실시예 1에 제공된 바와 같은 혈관을 탈세포화하는 방법에 따라 수행된다.
특정 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 합성되고/되거나 조립된 지지체, 예를 들어, 생체적합성 물질을 시험관내에서 조립함으로써 수득되는 지지체이다. 이러한 지지체를 제조하는 방법, 예를 들어, 생체인쇄 또는 중합체 자가-조립은 당분야에 공지되어 있고, 비제한적 예는 미국 특허출원 공개공보 번호 제2017/0304503호 및 제2016/0354194호에 제공된다.
따라서, 특정 실시태양에서, 본원에 개시된 방법은 생체인쇄된 중합체 지지체를 사용하여 생체인쇄된 관형 혈관 지지체를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 생체인쇄된 혈관 지지체는 중합체(천연 또는 합성) 상에서 제조되고, 이는 겔 형태, 스폰지 형태, 포움 형태, 패치 형태, 또는 반-액체/유체 형태로 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 생체인쇄된 지지체는 전혈, 또는 용액에 희석된 전혈, 예를 들어, 전혈을 포함하는 현탁액에 의해 관류된다.
특정 실시태양에서, ECM 성분은 분말 형태로 중합체에 첨가될 수 있다. 본원에서, 본원의 조성물을 제조하기 위한 분말은 조직을 화학약품으로 처리하고, 화학약품 처리된 조직을 동결-건조시키며, 동결-건조된 조직을 균질화함으로써 제조된다. 특정 실시태양에서, 분말은 섬유상(filamentous)이다.
특정 실시태양에서, 생체인쇄된 중합체 지지체는 젤라틴 및 피브린을 포함할 수 있다. 젤라틴 및 피브린은 천연 ECM을 모방하는 상호침입 중합체 망조직(interpenetrating polymer network)을 형성할 수 있고, 세포 부착, 생체인쇄, 투명도, 및 생체적합성에 대해 최적화될 수 있다.
특정 실시태양에서, ECM의 성분은 포유동물(예를 들어, 돼지, 소, 어린 양, 염소, 양, 침팬지, 원숭이, 인간, 또는 기타 영장류)의 조직으로부터 단리되고/되거나 정제되거나, 또는 개별적 ECM 성분(예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 글리코스아미노글리칸, 프로테오글리칸, 항균물질, 화학유인물질, 사이토카인, 및 성장 인자)을 인코딩하는 포유동물(예를 들어, 돼지, 소, 어린 양, 염소, 양, 침팬지, 원숭이, 인간, 또는 기타 영장류)의 유전자 또는 유전자 단편과 관련된 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산되고 적합한 발현 시스템[원핵 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포)]으로부터 발현되며, 후속적으로 당분야의 적합한 방법에 의해 단리되고/되거나 정제된다. 특정 실시태양에서, ECM 성분중 하나 이상은 생체인쇄된 중합체 지지체를 제조하기 위한 중합체 지지체에 첨가될 수 있고, 이어서 지지체는, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위해, 전혈, 또는 용액에 희석된 전혈, 예를 들어, 전혈을 포함하는 현탁액에 의해 관류된다.
몇몇 실시태양에서, 관형 지지체는 상이한 물질의 3D-인쇄, 자가-조립, 화학적 또는 생화학적 제작과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 관형 지지체는 생물학적 및 비-생물학적 출발 물질로부터 제작된다.
환자 전혈
몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플에 존재하는 세포의 집단은 지지체를 점유한다. 환자 전혈은 희석되지 않거나, 예컨대 실시예 4 및 5에 기재된 생리학적 관류 용액, 또는 기타 기관 보존 용액, 예를 들면 퍼파덱스(Perfadex)(상표명), 스틴(STEEN)(상표명), 유로 콜린스(Euro Collins) 용액, 위스콘신 대학교 냉각 저장 용액(University of Wisconsin cold storage solution) 또는 셀시어(Celsior)(등록상표) 용액에 의해 희석될 수 있다.
특정 실시태양에서, 전혈은 말초 혈액(예를 들어, 말초 정맥혈)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 전혈은 말초 혈액(예를 들어, 말초 정맥혈)이다. 특정 실시태양에서, 전혈은 제대혈을 포함한다. 특정 실시태양에서, 전혈은 제대혈이다.
용어 "환자" 및 "피험체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 인간 또는 인간 이외의 동물(예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 비제한적인 예로는 인간, 소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 원숭이, 염소, 양, 소 및 사슴이 포함된다. 몇몇 실시태양에서, 피험체는 인간이다.
희석되지 않은 환자 전혈
본원의 하나의 양태는 무세포 관형 지지체의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 피험체로부터의 희석되지 않은 전혈 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 접촉을 2일 초과 동안 수행하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다
특정 실시태양에서, 혈액에 존재하는 세포 및/또는 전구체 세포는 지지체를 점유한다. 몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플에 존재하는 세포의 집단은 지지체를 점유한다. 용어 "전혈"은 신체, 기관 또는 조직으로부터 채취된 혈액을 지칭하고, 이로부터 어떠한 성분도 제거되지 않는다.
숙련가라면 전혈의 수집 동안, 혈액 샘플이 피험체로부터 채취되는 동안 또는 직후에 소량의 항혈전제가 첨가될 수 있음을 이해할 것이다. 항혈전제의 부피가 항혈전제와 혼합되는 혈액 부피의 약 5% 또는 적어도 10%를 초과하지 않는 경우, 이렇게 제조된 전혈은 희석되지 않은 것으로 고려된다. 유사하게, 특정 실시태양에서, 전혈에 1종 이상의 다른 제제(예를 들어, 항혈전제, 영양분, 희석제, 보존제, 및 C02-독립적 완충 시스템)가 보충될 수 있고, 첨가된 물질(들)의 전체 부피(수집 시점에 초기에 도입된 임의의 항혈전제를 포함하지 않음)가 전혈 부피의 약 5% 또는 적어도 10%를 초과하지 않는 경우, 보충된 전혈은 희석되지 않은 것으로 고려된다.
특정 실시태양에서, 방법은 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 세포 배양 배지와 무세포 관형 지지체를 접촉시킬 필요가 없다. 특정 실시태양에서, 전혈은 본원에 개시된 방법에서 전혈 수집 후 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 12 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 2일, 약 3일, 또는 약 1주 이내에 사용된다. 특정 실시태양에서, 전혈은 방법에 사용하기 이전에 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장된다.
희석된 환자 전혈
또 다른 양태에서, 본 발명은 무세포 관형 지지체를 희석된 환자 전혈과 접촉시킴에 관한 것이다.
환자 전혈은, 환자로부터 채취된 전혈이 임의의 유형의 용액, 완충액, 또는 수성 액체에 의해 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200% 희석된다면, 희석된 것으로 고려된다. 몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플은 1:1로 희석되고, 즉 1 부피의 전혈은 1 부피 희석액과 혼합된다. 몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플은 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10으로 희석될 수 있다.
특정 실시태양에서, 전혈은 생리학적 용액에 희석된다. 특정 실시태양에서, 희석액은 추가적인 삼투성 인자 및 기타 인자를 함유한 생리학적 용액(실시예 x-y에 기재됨) 또는 기타 기관 보존 용액, 예를 들면 퍼파덱스(상표명)(하기 실시예 5 참조), 스틴(상표명)(인간 혈청 알부민 및 덱스트란 40을 포함한 무독성 생리식염수, 또는 미국 특허 번호 제8,980,541호에 기재된 바와 같은 용액), 유로 콜린스 용액(하기 실시예 5 참조), 위스콘신 대학교 냉각 저장 용액(하기 실시예 5 참조) 또는 셀시어(등록상표) 용액(하기 실시예 5 참조)이다. 특정 실시태양에서, 생리학적 용액은 스틴(상표명) 용액이다.
몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액의 삼투압을 조절하기 위해 사용하도록 고려되는 삼투성 인자는 혈청 알부민, 글로불린, 또는 피브리노겐을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 삼투성 인자는 혈청 알부민을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 젤라틴은 용액의 삼투압을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
생리학적 용액은 1종 이상의 영양분[예를 들어, 아미노산, 단당류(예를 들어, D-글루코스), 비타민, 무기 이온, 미량 원소, 및/또는 염], 및/또는 예를 들어, 세포의 생존, 증식, 및/또는 분화를 지지하기 위한 생리학적 농도에서의 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 영양분은 당분, 아미노산, 또는 비타민중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 당분은 D-글루코스이다.
몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 무기 염, 및 완충 시스템을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 완충 시스템은 C02-독립적 완충 시스템을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, C02-독립적 완충 시스템은 인산염 완충 시스템을 포함한다. 생리학적 용액은 전혈 또는 하기 기재된 바와 같은 희석된 전혈에 첨가되는 임의의 추가의 제제를 함유할 수 있다.
전혈 또는 희석된 전혈 샘플에 첨가되는 추가의 제제
몇몇 실시태양에서, 본원에 기재된 추가의 제제는 무세포 관형 지지체를 전혈과 접촉시키기 이전 또는 접촉시키는 동안에 전혈 샘플, 전혈의 현탁액 또는 희석된 전혈 샘플에 첨가된다. 상기 설명된 바와 같이, 본원에 기재된 인자의 첨가가 전혈을 5 또는 적어도 10% 이상 희석시키지 않는 한, 전혈 샘플은 여전히 희석되지 않은 것으로 고려된다. 만일 전혈 샘플이 본원에 기재된 인자에 의해 15% 이상 희석된다면, 전혈 샘플은 희석된 것이다.
특정 실시태양에서, 전혈을 갖는 현탁액 또는 희석된 전혈 또는 희석되지 않은 전혈은 항혈전제를 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 항혈전제는 무세포 관형 지지체를 접촉시키기 이전에 전혈에 도입되거나 도입되어져 있다. 특정 실시태양에서, 항혈전제는 항응고제를 포함한다. 특정 실시태양에서, 항응고제는 헤파린, 덱스트란을 포함한다. 특정 실시태양에서 항혈전제는 혈소판-저해제, 예컨대 아스코르브산을 포함한다.
특정 실시태양에서, 항응고제는 헤파린을 포함한다. 응고를 방지하기 위한 헤파린의 효과적인 농도는 당분야에 공지되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 헤파린은 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.5 IU/㎖ 내지 약 150 IU/㎖의 농도로 존재한다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 헤파린의 농도는 약 5 내지 약 50 IU/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 헤파린의 농도는 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 또는 약 20 IU/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 헤파린의 농도는 약 6.7 IU/㎖이다. 몇몇 실시태양에서, 배관 및 정맥을 갖는 생물반응기는 PBS 용액중 50 IU/㎖의 헤파린(예를 들면 1 시간 동안)에 의해 미리 씻겨지고, 이어서 비워지고, 혈액 용액으로 충전되고; 다양한 실시태양에서, 용액의 전환에 의해 1:10의 희석비를 수득하여, 혈액 용액중 대략 5 IU/㎖ 헤파린을 달성한다. 특정 실시태양에서, 17 IU 헤파린/㎖의 전혈이 함유된 진공채혈기를 사용하여 혈액 용액중 약 8.5 IU 헤파린을 달성한다.
특정 실시태양에서, 항응고제는 덱스트란을 포함한다. 평균 분자량의 덱스트란이 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 덱스트란은 약 40 kD의 평균 분자량을 갖고, 즉 덱스트란은 덱스트란-40이다. 특정 실시태양에서, 덱스트란은 약 60 kD의 평균 분자량을 갖고, 즉 덱스트란은 덱스트란-60이다. 특정 실시태양에서, 덱스트란은 약 70 kD의 평균 분자량을 갖고, 즉 덱스트란은 덱스트란-70이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 덱스트란의 농도는 약 1 내지 약 55 g/ℓ이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 덱스트란의 농도는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 10, 또는 약 20 g/ℓ이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 덱스트란의 농도는 약 5 g/ℓ이다.
특정 실시태양에서, 항혈전제는 아스코르브산을 포함한다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 아스코르브산의 농도는 약 0.2 내지 약 200 ㎍/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 아스코르브산의 농도는 약 1, 약 5, 약 10, 약 20, 약 50, 또는 약 100 ㎍/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 아스코르브산의 농도는 약 5 ㎍/㎖이다.
본 발명에서 2종 이상의 항혈전제(예를 들어, 항응고제)가 조합될 수 있다. 특정 실시태양에서, 현탁액은 헤파린, 덱스트란(예를 들어, 덱스트란-40), 및 아스코르브산으로 구성된 군에서 선택된 2종 이상의 제제를 포함한다. 특정 실시태양에서, 현탁액은 헤파린, 덱스트란(예를 들어, 덱스트란-40), 및 아스코르브산을 포함한다. 숙련가라면 2종 이상의 항혈전제가 조합될 경우, 이들중 적어도 1종은 이것이 단독으로 사용될 경우의 농도에 비해 더 낮은 농도로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 실시태양에서, 현탁액은 약 6.7 IU/㎖의 헤파린, 약 6.7 mg/㎖의 덱스트란-40, 및 약 4.5 ㎍/㎖의 아스코르브산을 포함한다. 특정 실시태양에서, 현탁액은 적어도 약 6.7 IU/㎖의 헤파린, 약 6.7 mg/㎖의 덱스트란-40, 및 약 4.5 ㎍/㎖의 아스코르브산을 포함한다.
특정 실시태양에서, 전혈을 갖는 현탁액, 희석된 전혈 또는 희석되지 않은 전혈은: 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-3, IL-4, 뉴트로핀(NT)-6, 플레이오트로핀(HB-GAM), 미드카인(MK), 인터페론 유도 단백질-10(IP-10), 혈소판 인자(PF)-4, 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-l), RANTES(CCL-5, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 5), IL-8, IGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, 형질전환 성장 인자(TGF)-β, VEGF, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, 간세포 성장 인자(HGF), 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-1, 및 이들의 임의의 조합(들)으로 구성된 군에서 선택된 성장 인자를 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 성장 인자는 인간 성장 인자이다. 특정 실시태양에서, 성장 인자의 농도는 성장 인자의 모집단의 평균 생리학적 수준과 동일하다. 특정 실시태양에서, 성장 인자의 농도는 성장 인자의 모집단의 평균 생리학적 수준보다 높다. 특정 실시태양에서, 성장 인자는 재조합 단백질로서 보충된다.
특정 실시태양에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF)-2이다. 특정 실시태양에서, FGF-2는 인간 FGF-2이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 FGF-2의 농도는 약 0.5 내지 약 200 ng/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 FGF-2의 농도는 약 10 ng/㎖이다. 특정 실시태양에서, FGF-2는 접촉 이전에 약 0.5 내지 약 200 ng/㎖(예를 들어, 약 10 ng/㎖)의 농도로 보충된다. 특정 실시태양에서, FGF-2는 재조합 인간 FGF-2(rhFGF-2)이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 rhFGF-2의 농도는 약 0.5 내지 약 200 ng/㎖(예를 들어, 약 10 ng/㎖)이다.
특정 실시태양에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다. 특정 실시태양에서, VEGF는 인간 VEGF이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 VEGF의 농도는 약 4 내지 약 800 ng/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 VEGF의 농도는 약 80 ng/㎖이다. 특정 실시태양에서, VEGF는 접촉 이전에 약 4 내지 약 800 ng/㎖(예를 들어, 약 80 ng/㎖)의 농도로 보충된다. 특정 실시태양에서, VEGF는 재조합 인간 VEGF(rhVEGF)이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 rhVEGF의 농도는 약 4 내지 약 800 ng/㎖(예를 들어, 약 80 ng/㎖)이다.
특정 실시태양에서, 전혈을 갖는 현탁액, 희석된 전혈 또는 희석되지 않은 전혈은 아세틸살리실산을 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 아세틸살리실산의 농도는 0.2 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖; 또는 0.5 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖; 또는 0.1 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖; 또는 1 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖; 또는 1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖; 또는 2 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖; 또는 3 ㎍/㎖ 내지 8 ㎍/㎖; 또는 4 ㎍/㎖ 내지 6 ㎍/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 아세틸살리실산의 농도는 약 0.5 ㎍/㎖; 또는 약 1 ㎍/㎖; 또는 약 2 ㎍/㎖; 또는 약 3 ㎍/㎖; 또는 약 4 ㎍/㎖; 또는 약 5 ㎍/㎖; 또는 약 6 ㎍/㎖; 또는 약 7 ㎍/㎖; 또는 약 8 ㎍/㎖; 또는 약 8 ㎍/㎖; 또는 약 8 ㎍/㎖; 또는 약 9 ㎍/㎖; 또는 약 10 ㎍/㎖; 또는 약 25 ㎍/㎖ 또는 약 50 ㎍/㎖; 또는 약 100 ㎍/㎖; 또는 약 200 ㎍/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 아세틸살리실산의 농도는 약 5 ㎍/㎖이다. 특정 실시태양에서, VEGF는 접촉 이전에 4 ng/㎖ 내지 800 ng/㎖; 또는 10 ng/㎖ 내지 400 ng/㎖; 또는 20 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖; 또는 40 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖; 또는 60 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖; 또는 70 ng/㎖ 내지 90 ng/㎖의 농도로 보충된다.
특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 인간 혈청 알부민(HSA)의 농도는 50mg/㎖ 내지 150 mg/㎖; 또는 50 mg/㎖ 내지 125 mg/㎖; 또는 50 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖; 또는 60 mg/㎖ 내지 90 mg/㎖; 또는 60 mg/㎖ 내지 80 mg/㎖; 또는 65 mg/㎖ 내지 75 mg/㎖이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 인간 혈청 알부민의 농도는 약 55 내지 약 105 mg/m이고, 이는 전혈이 용액중 2-배로 희석될 경우의 양이다. 특정 실시태양에서, 접촉이 시작될 때 인간 혈청 알부민의 농도는 약 45 내지 약 69 mg/㎖이다. 특정 실시태양에서, 용액중 HSA의 농도는 약 70 mg/㎖이고, 인간 혈액중 HSA의 농도는 약 45 mg/㎖이며, 전혈은 용액에 희석되고, 전혈이 포함된 현탁액중의 HSA는 55 내지 60 mg/㎖(즉, 용액중 전혈의 2-배 희석물)이다. 특정 실시태양에서, 전혈이 용액에 희석된 이후 인간 혈청 알부민의 농도는 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 1O-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 또는 20-배 희석된 HSA를 포함한다.
특정 실시태양에서, 전혈을 갖는 현탁액, 희석된 전혈 또는 희석되지 않은 전혈은, 세포의 생존, 증식, 및/또는 분화를 지지하기 위한 1종 이상의 영양분 및/또는 성장 인자를, 예를 들어, 생리학적 농도로 포함한다. 특정 실시태양에서, 영양분은 단당류(예를 들어, D-글루코스), 아미노산(천연 아미노산), 비타민, 무기 이온, 미량 원소, 염 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 영양분으로서 포함되는 아미노산은 다음중 하나 이상일 수 있다: L-아르기닌HCl, L-시스틴2HCl, L-시스틴HCl H20, L-히스티딘HCl H20, L-이소로이신, L-로이신, L-라이신HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신2H20, L-발린, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, 글리신, L-프롤린, L-세린, 및/또는 L-하이드록시프롤린. 특정 실시태양에서, 영양분으로서 포함된 비타민은 다음중 하나 이상일 수 있다: K-Ca-판토텐산염, 염화 콜린, 폴산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독살 HC1, 피리독신 HC1, 리보플라빈, 티아민 HC1, 비오틴, 비타민 B12, 파라-아미노벤조산, 니아신, 아스코르브산, α-토코페롤 포스페이트, 칼시페롤(calciferol), 메나디온(menadione), 비타민 A. 특정 실시태양에서, 무기 이온은 무기 염의 형태로 포함되고, 제한되지 않지만, CaCl2, KC1, MgS04, NaCl, NaHCO3, NaHP04, KNO3, NaSeO3, Ca(N03)2, CuS04, NaHP04, MgCl2, Fe(N03)3, CuS04, FeS04, 및/또는 KH2P04이다.
몇몇 실시태양에서, 전혈을 갖는 현탁액, 희석된 전혈 또는 희석되지 않은 전혈은 약 0.7% 내지 약 1.5%의 염을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생리학적 용액은 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 또는 약 1.0%의 염을 포함한다.
특정 실시태양에서, 현탁액은 C02-독립적 완충 시스템을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, C02-독립적 완충 시스템은 인산염 완충 시스템을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, C02-독립적 완충 시스템은 인산염 완충액 및 중탄산 나트륨을 포함한다. 특정 실시태양에서, 현탁액은 다음중 하나 이상을 추가로 포함한다: D-글루코스, 페놀 레드(Phenol red), HEPES, 피루브산 나트륨, 글루타티온(환원됨), 하이포잔틴.Na, 티미딘, 리포산, 푸트레신(putrescine) 2HCl, 박토-펩톤(bacto-peptone), 티민, 아데닌 설페이트, 아데노신-5-트리포스페이트, 콜레스테롤, 2-데옥시-D-리보스, 아데노신-5-포스페이트, 구아닌 HCl, 리보스, 아세트산 나트륨, 트윈(Tween) 80, 우라실, 및/또는 잔틴 Na.
특정 실시태양에서, 전혈 현탁액의 비-세포 인자는, 예를 들어, 세포 생존, 증식, 및/또는 분화를 촉진시킴으로써 무세포 관형 지지체의 세포화를 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 비-세포 인자는 전혈에 존재하는 비-세포 성분이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 접촉 동안에 전혈로부터(예를 들어, 전혈중의 세포로부터) 생성된 인자이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 이식시 숙주 적합성, 세포화 또는 혈관의 통합을 촉진시킨다. 본 발명의 비-세포 인자의 비제한적인 예는 하기 표에 제공된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 개시된 임의의 제제, 예를 들어, 항혈전제, 영양분, 희석제, 및 C02-독립적 완충 시스템은 희석액(예를 들어, 생리학적 용액)에 도입되고, 전혈의 희석시 현탁액으로 혼합될 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 이는 희석 이전에 직접적으로 전혈에 도입되고/되거나, 전혈의 희석 이후에 현탁액에 도입될 수 있다.
특정 실시태양에서, 현탁액중의 영양분의 농도는 연속적으로 또는 규칙적으로 모니터링되고 조정된다. 특정 실시태양에서, 영양분은 단당류(예를 들어, D-글루코스), 아미노산(예를 들어, 천연 아미노산), 비타민, 무기 이온, 미량 원소, 및 염으로 구성된 군에서 선택된다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 접촉 동안 모니터링되고, D-글루코스는 D-글루코스 농도를 약 3 내지 약 11 밀리몰/ℓ에서 유지시키도록 현탁액에 첨가된다.
특정 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 현탁액으로부터 수집된 샘플중의 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 모니터링된다. 특정 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 규칙적으로, 예컨대 1일 2회, 1일 1회, 2일 1회 측정된다. 특정 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 현탁액과 접촉된 센서를 사용하여 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 모니터링된다. 특정 실시태양에서, 센서는 접촉 동안 연속적으로 현탁액과 접촉된다. 특정 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 측정된 농도가 4 밀리몰/ℓ 미만인 경우 D-글루코스가 첨가된다. 특정 실시태양에서, D-글루코스는 현탁액중 약 7 밀리몰/ℓ; 약 8 밀리몰/ℓ; 약 9 밀리몰/ℓ; 또는 약 10 밀리몰/ℓ의 D-글루코스의 최종 농도에 도달되도록 첨가된다. 몇몇 실시태양에서, 글루코스 수준은 1.1 M D-글루코스 스톡(stock) 용액의 첨가에 의해 조정된다. 특정 실시태양에서, 혈액 용액 1 ㎖당 0.91 ㎕의 스톡 용액(1.1 M에서)의 첨가는 글루코스 수준을 1 밀리몰/ℓ 증가시킨다. 임의적으로 현탁액중의 D-글루코스의 자동 첨가와 조합된, 센서에 의한 연속적 모니터링은, D-글루코스 농도를 더욱 좁은 범위로 유지시킬 수 있도록 한다. 특정 실시태양에서, D-글루코스 농도는 약 5 내지 약 8 밀리몰/ℓ로 유지된다.
비-세포 혈액 인자
몇몇 실시태양에서, 전혈 샘플은 1종 이상의 비-세포 인자를 포함하고, 여기서 전혈의 1종 이상의 비-세포 인자는 지지체를 점유하고, 여기서 1종 이상의 비-세포 인자는 무세포 관형 지지체의 세포화 및 이식시 혈관의 숙주 적합성을 촉진시킨다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "비-세포 인자"는 완전한 진핵 세포를 포함하지 않는 전혈 현탁액중의 성분을 지칭한다. 비-세포 인자는, 제한되지 않지만, 단백질, 핵산, 당류, 지질, 소분자, 금속 이온, 또는 컨주게이트(conjugate) 또는 이의 조합을 비롯한 임의의 유형의 분자일 수 있다.
예를 들면, 비-세포 인자는 성장 인자일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 성장 인자는: 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-3, IL-4, 뉴트로핀(NT)-6, 플레이오트로핀(HB-GAM), 미드카인(MK), 인터페론 유도 단백질-10(IP-10), 혈소판 인자(PF)-4, 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-l), RANTES(CCL-5, 케모카인(C-C 모티프) 리간드 5), IL-8, IGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, 형질전환 성장 인자(TGF)-β, VEGF, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, 간세포 성장 인자(HGF), 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-1, 및 이들의 임의의 조합(들)으로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 세포 단편(예를 들어 혈소판, 세포 분별물)이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 단백질(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 항체, 항체 단편, 보체 시스템의 단백질, 또는 효소)이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 핵산(예를 들어, 순환 DNA, 순환 RNA, 또는 순환 miRNA)이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 당류(예를 들어, 단당류 또는 이당류)이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 지질(예를 들어, 지방산, 트리글리세라이드, 또는 콜레스테롤)이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 소분자이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 금속 이온이다.
특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 변형된 형태 또는 상기 분자중 임의의 하나의 대사물질이다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 단백질의 분절(예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 하나 이상의 변형[예를 들어, 메틸화, 5' 캐핑(capping)]을 갖는 핵산이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 당류의 알디톨(alditol) 또는 알돈산이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 스테롤이다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 본원에 개시된 분자중 임의의 하나의 컨주게이트이고, 여기서 분자는 공유적으로 또는 비공유적으로 컨주게이트된다.
특정 실시태양에서, 성장 인자의 농도는 성장 인자의 모집단의 평균 생리학적 수준과 동일하다. 특정 실시태양에서, 성장 인자의 농도는 성장 인자의 모집단의 평균 생리학적 수준에 비해 더 높다. 특정 실시태양에서, 성장 인자는 단리, 정제 및/또는 합성 분자로서 보충된다.
비-세포 혈액 인자는 시험관내에서 또는 이식 후 다양한 방식으로 무세포 관형 지지체의 재조절/재세포화에 기여할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 지지체에 세포를 부착시키거나 접착시키는 것을 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 전구체 세포의 증식을 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 전구체 세포가 지지체를 점유할 수 있는 세포로 분화하는 것을 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 세포 및/또는 전구체 세포의 세포자멸 및/또는 괴사를 저해한다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 지지체 위에 존재하는 동종이형 단백질(들)의 제거 또는 차폐를 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 자가유래 단백질(들)이 지지체 위에 침적되는 것을 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 비-세포 혈액 인자는 숙주 거부를 억제하기 위해 지지체의 조절을 촉진시킨다.
무세포 관형 지지체와 환자 전혈의 접촉
본원은 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)의 표면(예를 들어, 내부 표면)을 전혈이 포함된 현탁액과 48 시간 이상 동안 접촉시키는 단계를 포함함으로써, 혈액에 존재하는 세포가 지지체를 점유할 수 있도록 하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체의 표면은 무세포 관형 지지체의 내부 표면이다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "접촉", "접촉하는", 또는 "접촉된"은 정지 상태의 항온처리, 관류, 도입, 주입, 또는 배양을 의미한다. 관류는 규칙적(pulsed) 관류, 휴지 기간을 둔 관류, 방향 교대이고, 관류가 없을 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 현탁액 또는 전혈에 의해 연속적으로 관류된다.
특정 실시태양에서, 접촉은 2일 초과 동안이다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "2일 초과"는 48 시간 보다 더 긴, 및 약 48 시간 보다 더 긴 기간을 지칭한다. 용어 "일"은 24 시간 주기(들)를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 접촉은 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일 동안이다. 특정 실시태양에서, 접촉은 9일 이하, 10일 이하, 11일 이하, 12일 이하, 13일 이하, 14일 이하, 21일 이하, 또는 31일 이하 동안이다. 특정 실시태양에서, 접촉은 1 개월 이하 동안이다. 몇몇 실시태양에서, 접촉은 약 1 내지 31일, 2 내지 21일, 2 내지 14일, 2 내지 9일, 2 내지 7일, 2 내지 5일, 5 내지 7일, 또는 7 내지 9일 동안이다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 7 내지 약 9일 동안이다. 몇몇 실시태양에서, 무세포 관형 지지체의 표면의 접촉은 2 내지 21일, 3 내지 21일, 4 내지 21일, 5 내지 21일, 6 내지 21일, 또는 7 내지 21일 동안이다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 또는 약 21일 동안이다.
무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)는 희석되지 않은 전혈 샘플, 또는 희석된 전혈이 함유된 현탁액과 당분야에 공지된 임의의 방식으로 접촉될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 지지체는 느슨하고 현탁액에 현탁되며, 임의적으로, 여기서 현탁액은 성분을 규칙적으로 또는 연속적으로 재혼합하도록 진탕된다(예를 들어, 회전된다). 관류 동안 관형 지지체의 회전은 연속적/간헐적으로, 교호적으로, 또는 휴지 기간을 두고 이루어 진다.
특정 실시태양에서, 지지체의 내부 표면은 현탁액과 접촉된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 현탁액에 의해 관류된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 현탁액의 폐쇄된 재순환에 의해 관류된다. 특정 실시태양에서, 연속 접촉은 생물반응기를 사용하여 수행되는 관류이다. 특정 실시태양에서, 지지체의 외부 표면은 또한 현탁액과 접촉된다. 다른 실시태양에서, 지지체의 외부 표면은 현탁액과 접촉되지 않는다. 특정 실시태양에서, 접촉은 시험관내에서 수행된다.
관류는 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 지지체는 현탁액에 의해 연속적으로 관류된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 현탁액에 의해 간헐적으로 관류된다(예를 들어, 4 분의 휴지 기간을 두고 1 분 동안 관류). 특정 실시태양에서, 관류는 단일 방향으로 수행된다. 특정 실시태양에서, 단일 방향은 제방향 흐름의 방향, 예를 들어, 지지체에서 밸브 구조물(들)에 의해 허용되는 방향이다. 특정 실시태양에서, 관류는 교대 방향(예를 들어, 5분 마다 방향 전환)으로 수행된다. 관류의 속도는 다수의 인자, 예컨대 관형 지지체의 직경, 지지체의 기계적 강도, 세포가 침강되는데 걸리는 시간, 및 현탁액의 점성의 견지에서 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 지지체는 1분당 약 0.1 내지 약 50 ㎖의 속도로 관류된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 1분당 약 2 ㎖의 속도로 관류된다. 지지체의 배향에 의존하여, 관류 동안(휴지 기간 포함)의 회전은 지지체의 내부 표면이 균일하게 점유되도록 하는 것이 유리할 수 있다. 특정 실시태양에서, 지지체는 연속적으로 회전된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 간헐적으로 회전된다(예를 들어, 5분 마다 30°씩). 회전 방향은 일정하거나 교호적일 수 있다. 회전의 이점은, 지지체가 수직으로 고정되는 경우 실질적이지 않을 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 지지체는 회전되지 않는다.
구체적인 실시태양에서, 지지체(예를 들어, 지지체의 내강)는 현탁액에 의해 연속적으로 관류된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 1분당 약 0.1 내지 약 50 ㎖(예를 들어, 1분당 약 2 ㎖)의 속도로 관류된다. 특정 실시태양에서, 지지체는 현탁액의 폐쇄된 재순환에 의해 관류된다. 특정 실시태양에서, 연속 접촉은 생물반응기를 사용하여 수행되는 관류이다.
접촉 동안 환경 조건의 모니터링
또 다른 양태에서, 본원은 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)의 표면을 전혈이 포함된 현탁액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 다수의 환경적 매개변수(예를 들어, 온도, pH, 산소 함량, 및/또는 C02 함량)를 연속적으로 또는 규칙적으로 모니터링하고 조정하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시태양에서, 접촉은 약 8℃ 내지 약 40℃에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 20℃ 내지 약 25℃에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 37℃에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 또는 약 25℃에서 수행된다.
특정 실시태양에서, 접촉은 약 pH 7.2 내지 약 pH 7.5에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 pH 7.4에서 수행된다.
특정 실시태양에서, 접촉은 약 30 mmHg 내지 약 100 mmHg의 산소 분압에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 30 mmHg 내지 약 40 mmHg의 산소 분압에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 80 mmHg 내지 100 mmHg의 산소 분압에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 160 mmHg의 산소 분압에서 수행된다.
특정 실시태양에서, 접촉은 약 38 mmHg 내지 약 76 mmHg의 이산화탄소 분압에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 38 mmHg의 이산화탄소 분압에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 76 mmHg의 이산화탄소 분압에서 수행된다. 특정 실시태양에서, 접촉은 약 40 mmHg 내지 약 50 mmHg의 이산화탄소 분압에서 수행된다.
특정 실시태양에서, 환경적 매개변수(예를 들어, 온도, pH, 산소 함량, 및/또는 C02 함량)는 접촉 동안 연속적으로 또는 규칙적으로 모니터링되고 조정된다.
또 다른 양태에서, 본원은 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)의 표면을 전혈이 포함된 현탁액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 현탁액중의 영양분의 농도를 연속적으로 또는 규칙적으로 모니터링하고 조정하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)의 표면을 전혈이 포함된 현탁액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 현탁액중의 D-글루코스의 농도를 접촉 동안 모니터링하고, D-글루코스 농도를 약 3 내지 약 11 밀리몰/ℓ로 유지시키도록 D-글루코스를 현탁액에 첨가하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 현탁액으로부터 수집된 샘플중의 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 모니터링된다. 몇몇 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 1일 1회 측정된다. 몇몇 실시태양에서, 현탁액중의 D-글루코스의 농도는 현탁액과 접촉된 센서를 사용하여 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 모니터링된다. 몇몇 실시태양에서, 센서는 접촉 동안 연속적으로 현탁액과 접촉된다.
몇몇 실시태양에서, D-글루코스는 현탁액중의 D-글루코스의 측정된 농도가 4 밀리몰/ℓ 미만일 경우 첨가된다. 몇몇 실시태양에서, D-글루코스는 현탁액중 10 밀리몰/ℓ의 D-글루코스의 최종 농도에 도달될 때까지 첨가된다.
전혈의 강화되거나 선택된 성분을 갖는 무세포 관형 지지체의 제조
특정 실시태양에서, 본원은 전혈의 1종 이상의 성분을 강화하거나 선택하고, 이어서 무세포 관형 지지체의 내부 표면과 접촉하도록 지지체의 표면에 첨가하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 혈소판, 유핵 세포, 단백질, 성장 인자, 신호전달 인자, 면역글로불린, 및 이의 임의의 조합(들)으로부터 선택된 성분은 무세포 관형 지지체의 내부 표면에 첨가될 수 있다. 성분은, 예를 들면, 원심분리, 구배 원심분리, 선택적 접착에 의한 분리, 여과, 또는 분류(예를 들어, FACS, MACS)에 의해 강화되거나 선택될 수 있다.
용어 "강화되고 선택된"은, 초기에 생산될 때(자연적이거나 또는 실험 환경에서이거나 무관함) 혼합되어지는 성분들중 적어도 하나로부터 분리되어진 물질 및/또는 실체를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 단리된 물질 및/또는 실체는 초기에 생산될 때 혼합되어진 성분의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%로부터 분리된다. 특정 실시태양에서, 강화되고 선택된 물질 및/또는 실체는 정제된다. 특정 실시태양에서, 강화, 선택 및/또는 정제된 물질 및/또는 실체는 다른 성분들이 실질적으로 존재하지 않는다. 본원에 사용되는 경우, 분리 또는 정제 퍼센트의 계산에 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)는 포함되지 않는다.
개인맞춤 혈관
본원에 개시된 방법은 세포 및/또는 전구체 세포가 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)의 표면(예를 들어, 내부 표면)을 점유할 수 있도록 함으로써, 개인맞춤 혈관을 생성한다. 특정 실시태양에서, 세포는 내피 세포를 포함한다. 특정 실시태양에서, 세포는 평활근 세포를 포함한다. 특정 실시태양에서, 전구체 세포는 내피 전구체 세포를 포함한다. 특정 실시태양에서, 전구체 세포는 평활근 전구체 세포를 포함한다. 숙련가라면 세포 및/또는 전구체 세포가 지지체를 한가지 이상의 방식으로 점유할 수 있음을 이해할 것이다. 지지체의 점유는 이식 이전에 시험관내에서 또는 이식 이후에 생체내에서 일어날 수 있다. 특정 실시태양에서, 세포는 지지체에 부착된다. 특정 실시태양에서, 전구체 세포는 증식 및/또는 분화되어 자손(progeny) 세포를 생성하고, 이러한 자손 세포는 지지체에 부착된다.
특정 실시태양에서, 접촉은 전구체 세포의 내피 세포로의 증식 및/또는 분화를 초래한다. 특정 실시태양에서, 내피 세포는 VE-카드헤린, AcLDL, vWF, 및/또는 CD31을 발현한다. 재조절되고/재세포화된 지지체는 내피 및 평활근 세포의 존재를 특징으로 할 수 있다. 일반 숙련가에게 잘 공지된 면역조직화학 및 면역형광 기법이 내피 및 평활근 세포의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 이용된다. 내피 세포의 존재를 시각화하기 위해, CD31(1:200)[어빔(Abeam), 독일] 및 vWF(1:100)[산타 크루즈(Santa Cruz), 독일]에 대한 항체가 재조절된/재세포화된 지지체의 염색을 위해 사용될 수 있다. 평활근 세포를 시각화하기 위해, 평활근 액틴에 대한 항체(1:50)(어빔, 독일)가 재조절된/재세포화된 밸브를 염색하기 위해 사용될 수 있다. 재세포화된 지지체에서 이들 표지에 양성인 세포의 존재는 면역조직화학 또는 면역형광에 의해 검출된다. 평활근 세포는 또한 재조절된/재세포화된 지지체 안쪽에 덧대어진 방추형 근육 세포의 형태에 의해 식별될 수 있다.
본원에 개시된 방법에 의해 제조된 개인맞춤 혈관은 피험체(예를 들어, 인간)내로 이식하기에 유용하다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 정맥으로서 유용하다. 특정 실시태양에서, 방법은 개인맞춤 혈관의 정맥 밸브 기능을 평가(예를 들어, 시험관내 밸브 능력 시험을 사용함)하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 시험관내 밸브 능력 시험은 미국 특허 공개공보 번호 제 2017/0071738호에 제공된다. 특정 실시태양에서, 정맥 밸브 기능은 재조절/재세포화 이전에 시험된다. 특정 실시태양에서, 정맥 밸브 기능은 재조절/재세포화 이후에 시험된다. 특정 실시태양에서, 정맥 밸브 기능은 재조절/재세포화 이전 및 이후 둘 다에 시험된다.
기능성 개인맞춤 혈관은 누출이 없다. 따라서, 특정 실시태양에서, 방법은 누출을 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 누출을 시험하기 위한 다양한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 용액(예를 들어, 생리학적 완충 용액, 예컨대 인산염 완충된 염수(PBS))에 의해, 바람직하게는 일정한 속도에서 수세되고, 개인맞춤 혈관의 표면은 틈 또는 구멍으로부터 생성된 용액의 축적에 대해 관찰된다. 특정 실시태양에서, 누출은 재조절/재세포화 이전에 시험된다. 특정 실시태양에서, 누출은 재조절/재세포화 이후에 시험된다. 특정 실시태양에서, 누출은 재조절/재세포화 이전 및 이후 둘 다 시험된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 개시된 방법들중 임의의 하나에 의해 제조된 개인맞춤 혈관을 제공한다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 비-세포 인자, 예컨대 ECM 성분/포유동물 혈관 또는 이의 작용 부분의 조성을 포함하는 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관, 임의적으로 MMP-처리되거나, 또는 생체인쇄된 관형 지지체)를 포함하고, 인간 세포(예를 들어, 내피 세포 및/또는 평활근 세포)에 의해 세포화된다.
본원의 개인맞춤 혈관은 세포, 예컨대, 제한되지 않지만, 전혈 유래된 줄기 세포 또는 전구체 세포, 예컨대 내피 줄기 세포, 내피 전구체 세포, 평활근 전구체 세포, 전혈, 말초 혈액, 및 전혈로부터 단리될 수 있는 임의의 세포 집단을 추가로 포함한다. 전구체 세포는 세포의 한가지 유형으로 분화되도록 정해진 세포로서 정의된다. 예를 들면, 내피 전구체 세포는 내피 세포로 분화되도록 예정된 세포를 의미하고; 평활근 전구체 세포는 평활근 세포로 분화되도록 예정된 세포를 의미한다. 전혈 또는 말초 혈액에서 전구체 세포는 정해지지 않고/않거나 정해진 세포, 예컨대 다분화성(pluripotent) 세포 또는 분화전능성(totipotent) 세포의 집단을 포함한다.
특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관의 표면은 실질적으로 세포에 의해 덮혀진다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관의 내부 표면은 실질적으로 내피 세포에 의해 덮혀진다. 특정 실시태양에서, 내피 세포는 VE-카드헤린, AcLDL, vWF, 및/또는 CD31을 발현한다.
숙련가라면 재조절된/재세포화된 지지체가 선천성 혈관과 구별될 수 없는 정도로 혈액중의 세포 및/또는 전구체 세포가 지지체의 내부 표면을 점유할 필요가 없음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, 재세포화는 시험관내 뿐만 아니라 이식 후 생체내에서 발생할 수 있고, 시험관내에서 부분적으로 재세포화된 지지체는 선천성 혈관의 형태 및/또는 기능을 되찾기 위해 생체내에서 추가로 재세포화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 선천성 혈관에서에 비해 더 낮은 밀도의 내피 세포는 또한 보다 펼쳐진 형태를 채택함으로써 지지체의 내부 표면을 실질적으로 덮고, 이로써 세포당 더 넓은 표면적에 부착된다.
본원에 개시된 방법에 의해 제조된 개인맞춤 혈관은 피험체(예를 들어, 인간)내로 이식하기에 유용하다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 정맥으로서 유용하다.
특정 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 정맥으로부터 유래된다(예를 들어, 선천성 정맥을 탈세포화함으로써 제조됨). 특정 실시태양에서, 정맥은 하지에 존재한다. 하지의 정맥계는 근육 근막 아래에 놓여 하지 근육을 흘러 가는 심부 정맥; 심부 근막 위에 존재하여 피부 미소순환을 흘러 가는 표재 정맥; 및 근육 근막에 침투하여 표재 및 심부 정맥을 연결시키는 관통 정맥을 포함한다. 교통 정맥(communicating vein)은 동일한 구획내에서 정맥을 연결시킨다.
특정 실시태양에서, 정맥은 심부 정맥이다. 본 방법에 유용한 심부 정맥으로는 표재 대퇴부 정맥(이는 슬와 정맥을 총(common) 대퇴 정맥에 연결시킴), 및 종아리 심부 정맥(예를 들어, 전경골, 후경골, 및 비골 정맥)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 정맥은 표재 정맥이다. 본 방법에 유용한 심부 정맥으로는 대복재 정맥, 전방 및 후방 부(accessory) 대복재 정맥, 소복재 정맥(SSV), 및 복재간(intersaphenous) 정맥[지아코미니(Giacomini) 정맥으로도 알려짐]이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
대부분의 정맥은 단일 방향의 혈류를 확보하기 위해 정맥 밸브를 갖는다. 예를 들면, 하지에서 표재 정맥, 심부 정맥, 및 대부분의 관통 정맥은 2첨(bicuspid) 밸브를 함유한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 무세포 관형 지지체는 밸브 구조물을 포함하고, 밸브 구조물은 개인맞춤 혈관에 기능성 정맥 밸브를 제공하기 위해 재조절되고/재세포화된다. 밸브 구조물은 선천성 정맥 밸브로부터 또는 지지체 합성 및/또는 조립으로부터 유래될 수 있다. 정맥 밸브 기능을 평가하는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 시험관내 밸브 능력 시험을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 방법은 무세포 관형 지지체의 정맥 밸브 기능을 평가함(예를 들어, 시험관내 밸브 능력 시험을 사용)을 추가로 포함한다.
특정 실시태양에서, 무세포 관형 지지체에서 밸브 구조물은 지지체의 내부 표면의 나머지 부분의 재조절/재세포화 동안에 재조절되고/재세포화되는데, 즉 밸브 구조물을 특별히 재조절/재세포화하기 위해 추가의 단계가 사용되지 않는다. 특정 실시태양에서, 재조절된/재세포화된 밸브는 CD31-양성이다. 재조절된/재세포화된 밸브는 또한 평활근 액틴-양성, vWF-양성이고/이거나, 방추형 평활근 세포의 존재를 특징으로 할 수 있다.
특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 선천성 혈관의 특징들중 하나 이상을 갖는다. 특정 실시태양에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 개인맞춤 정맥은 제1 피이크에서 0.8 N 이상의 힘의 기계적 특성을 갖는 재조절된/재세포화된 밸브를 포함한다. 특정 실시태양에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 개인맞춤 정맥은 시험될 경우 누출을 나타내지 않는다.
치료 또는 사용 방법
또 다른 양태에서, 본원은 치료법에 사용하기 위한 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본원은 피험체에서 이식에 사용하기 위한 개인맞춤 혈관을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본원은 혈관 질환 또는 질병의 치료가 필요한 피험체에서 혈관 질환 또는 질병의 치료에 사용하기 위한 개인맞춤 혈관을 제공한다.
본원에 사용될 경우 용어 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료", 및 기타 문법적 동등어는 질환, 증상 또는 증후의 완화, 약화, 개선, 또는 방지, 추가적인 증후의 방지, 증후의 근본적인 대사적 원인의 개선 또는 방지, 질환 또는 증상의 저해, 예를 들어, 질환 또는 증상의 발달 저지, 질환 또는 증상의 경감, 질환 또는 증상의 회복, 질환 또는 증상에 의해 야기된 증상의 경감, 또는 질환 또는 증상의 증후의 중단을 포함하고, 예방을 포함하고자 한다. 이 용어는 치료학적 이점 및/또는 예방학적 이점의 달성을 포함한다. 치료학적 이점은 치료되는 근본적 질병의 근절 또는 개선을 의미한다. 또한 치료학적 이점은, 환자가 근본적 질병으로 여전히 고통받을 수 있을지라도 환자에서 향상이 관찰되도록, 근본적 질병과 연관된 하나 이상의 생리학적 증후의 근절 또는 개선에 의해 달성된다.
본원에 개시된 방법은 자가유래-유사 조작된 혈관을 생성하기에 특별히 적합하다. 이들은 다음과 같은 이점을 갖는다: (1) 비-면역원성이고, 따라서 이식 거부 또는 면역 부작용의 위험이 최소화되고; (2) 면역억제에 대한 필요성을 제거하고, 따라서 수술 후 및 일생 동안 환자에 대한 위험이 더 적으며; (3) 길이 제한이 없고; (4) 부합된 제공자 정맥 또는 자가유래 정맥과 비교하여 더욱 쉽게 이용가능하며; (5) 천연 성분(즉, ECM, 내피 세포 및 평활근 세포)으로 이루어지고, 따라서 일반적으로 합성 및 인공 정맥에 비해 탁월한 품질(생체역학적 완전성 및 잔여 혈관기원 성장 인자의 보존을 포함함)을 갖고; 6) 이식을 위해 자가유래 정맥을 수거하는 것과 비교하여 정맥의 침습적 생산을 필요로 하고; (7) 전혈의 사용에 의해 개체에게 신속하고 최소한으로 침습적인 절차를 허용하고; (8) 세포화되어 피험체의 신체 및 그의 기능(복원, 성장, 면역-방어)으로 생물학적으로 통합된다.
따라서, 하나의 양태에서, 본원은 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 개인맞춤 혈관 이식이 필요한 피험체(예를 들어, 인간)에게 이식하는 단계를 포함하는 수술 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본원은 개인맞춤 혈관 이식이 필요한 피험체(예를 들어, 인간)에게 이식하는데 사용하기 위한 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본원은 본원에 개시된 방법들중 임의의 하나에 의해 제조된, 피험체(예를 들어, 인간)내로 수술에 의해 이식되어진 개인맞춤 혈관을 제공한다.
특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 자가유래성이다. 본원에 사용되는 경우, 용어 "자가유래"는 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에서 사용되는 혈액이 이식 또는 수술받는 피험체로부터 유래됨을 의미한다. 개인맞춤 혈관이 선천성 혈관을 탈세포화함으로써 생산되는 특정 실시태양에서, 선천성 혈관의 제공자는 개인맞춤 혈관의 수여자와 동일한 개별체가 아니다. 개인맞춤 혈관이 선천성 혈관을 탈세포화함으로써 생산되는 특정 실시태양에서, 선천성 혈관은 적합한 동물 종(예를 들어, 돼지, 양, 소)으로부터 수득된다.
본원에 개시된 수술 방법은 다양한 혈관 질환 또는 질병을 치료하기에 유용하다. 따라서, 특정 실시태양에서, 피험체는 혈관 질환 또는 질병, 예를 들어, 정맥 질환 또는 질병을 갖는다. 특정 실시태양에서, 정맥 질환 또는 질병은 심부 정맥 혈전증(DVT), 만성 정맥 부전증(CVI)(정맥염후 증후군으로서도 알려짐), 정맥류 정맥, 정맥 궤양화(예를 들어, 다리 정맥 궤양화), 및 재발성 다리 암(예를 들어, 심부 정맥 역류 및/또는 정맥 고혈압에 의해 발생)으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 임의의 혈관 질환 또는 질병으로 고통받는 선천성 혈관의 분절을 대체하기 위해 주입되거나, 이식되거나, 그래프팅된다. 특정 실시태양에서, 개인맞춤 혈관은 정맥이고 적어도 하나의 정맥 밸브를 포함한다.
특정 실시태양에서, 수술 방법은 다리에서의 둔통, 무거움, 또는 경련, 가려움 및 얼얼함, 서있을 때 악화되는 통증, 다리를 올렸을 때 나아지는 통증, 다리의 종창, 다리 및 발목의 발적, 발목 주변의 피부색 변화, 표면(표재) 상의 정맥류 정맥, 다리 및 발목 상의 피부의 두꺼워짐 및 경화(경화성 지방층염), 다리 및 발목 상의 궤양, 및 다리 및 발목 상의 치유를 둔화시키는 상처를 포함하는 하나 이상의 증후를 치료, 개선, 및/또는 완화시킨다.
특정 실시태양에서, 본원에 개시된 수술 방법은 CVI를 치료 및/또는 개선시킨다. CVI는 운동에 의해 정맥 압력을 감소시킬 수 없는 것으로 정의되는, 보행가능한 정맥 고혈압으로부터 초래된 정맥 질환의 징후를 정의한다. 일상적인 환경에서, 하지의 정맥 밸브 및 근육 펌프는 하지 정맥에서 혈액의 축적을 제한한다. 유출로 폐쇄, 근육-근막 약화, 관절 운동의 손실, 또는 판막 기능 부전에 기인한 하지 근육 펌프의 기능 부전은 말초 정맥 기능 부전과 연관된다.
특정 실시태양에서, 본원에 개시된 수술 방법은 정맥 궤양을 치료 및/또는 개선시킨다. 정맥 궤양은, 대체적으로 다리의 정맥 밸브의 부적절한 작용에 기인한 상처(즉, 정맥 다리 궤양)이다. 정맥 궤양은 밸브의 기능이 감소하고 혈액의 역류로 인해 정맥에 혈액이 모여서 정맥 및 모세관에서 압력이 증가될 경우 발생한다. 이는 다른 관련된 합병증, 예컨대 부종, 염증, 조직의 경화, 피부의 영양부족, 및 정맥 습진을 유도한다. 정맥 궤양은 크고, 얕으며, 적혈구중의 철-함유 색소가 조직으로 누출됨에 따라 변색되고, 방출될 수도 있다. 궤양은 가장 빈번히 내측 또는 외측 복사뼈 주변에 위치된다.
특정 실시태양에서, 본원에 개시된 수술 방법은 정상적인 하지 정맥 압력을 회복시킨다. 예를 들면, 보행시, 하지 정맥 압력은 7 내지 12 걸음 이내에 대략 100 mm Hg(신장에 의존함)로부터 평균 18 mm Hg 내지 약 25 mm Hg로 감소된다. 유사한 압력 변화는 직립시 발목의 발바닥쪽 굽힘 또는 발뒤꿈치 들기, 발 앞부분으로의 체중 이동(발끝 걷기)에 의해 관찰된다. 보행시 정맥 압력(AVP)은, 발등 정맥에서 대체적으로 1초당 1의 속도로, 10회의 발끝 이동에 대한 반응을 측정하기 위하여 21-게이지의 바늘을 사용하여 결정될 수 있다. 직립 자세를 재개할 경우, 정역학적(hydrostatic) 압력은 평균 31초 후에 회복된다. 궤양의 발생은 30 mm Hg 이상의 AVP에서의 증가와 선형 관계이다. 증가된 AVP는 또한 20초 미만의 90% 정맥 재충전 시간과 연관된다. AVP와 대조적으로, 부피 변화는 혈량측정법(plethysmography)을 사용하여 비-침습적으로 측정될 수 있다. 빠른 역류(즉, 7 ㎖/초 이상의 정맥 충전) 및 종아리 근육 펌프 기능 저하는 궤양의 높은 발생과 연관된다. 정맥중의 재조절된/재세포화된 밸브는, 이식시, AVP, 빠른 역류 및/또는 종아리 근육 펌프 기능 저하를 정상으로 회복시킨다. 바람직하게는, 개인맞춤 혈관중의 정맥 밸브는, 이식시, 약 100 mm Hg의 역류 압력의 정상적인 용인성을 회복시키고, 7 내지 12 걸음 보행할 동안 평균 약 18 mm Hg 내지 약 25 mm Hg로 감소시킨다.
특정 실시태양에서, 본원에 개시된 수술 방법은 넓적다리에서 무력한 밸브의 증후를 치료하고/하거나 개선시킨다. 특정 실시태양에서, 이러한 증후의 치료 및/또는 개선은 근육 펌프 및 정맥 밸브 사이의 정상적인 작업 관계를 회복시킴으로써 달성된다. 하지의 근육 펌프는 발, 종아리, 및 넓적다리의 근육 펌프를 포함한다. 종아리 펌프는 가장 효율적이므로 가장 중요하고, 가장 큰 커패시턴스(capacitance)를 가지며, 가장 높은 압력(근육 수축 동안 200 mm의 수은주)을 생성한다. 정상적인 하지는 1500 내지 3000 cc 범위의 종아리 부피, 100 내지 150 cc의 정맥 부피를 갖고, 단일 수축에 의해 정맥 부피의 40% 내지 60% 이상이 나오게 된다.
수축 동안, 비복근 및 비장근 근육은 큰 용량의 슬와 및 대퇴부 정맥내로 혈액을 몰아 낸다. 본원의 재조절된/재세포화된 밸브는 후속적인 이완 동안 역행 흐름(역류)을 방지하여 음압을 생성하고, 혈액을 표재로부터 심부계로 유능한 관통 정맥을 통해 끌어 당긴다. 재조절된/재세포화된 밸브는 동맥 유입이 정맥 유출과 동일해질 때까지 정맥 압력을 점진적으로 저하시킨다. 본원은 피험체에서 운동을 중단할 경우, 재조절된/재세포화된 밸브를 갖는 정맥이 모세혈관계를 천천히 충전시켜, 나머지 정맥 압력으로 천천히 복원시킴을 보여준다.
근육이 넓적다리 정맥을 둘러싸고 있지만, 정맥 복원에 대해 넓적다리 근육 수축이 기여하는 바는 종아리 근육 펌프와 비교하여 아주 적다. 보행 동안 족저 정맥총의 압축에 기인한 펌핑 작용은 종아리 펌프를 준비시킨다. 다양한 다리 펌프는 유능한 밸브 기능과 함께 작업하여 정맥 혈액을 원위로부터 근위 극단까지 되돌려 보낸다. 본원의 개인맞춤 혈관은 정맥 혈액을 원위로부터 근위 극단까지 되돌려 보내기 위한 기능성 다리 펌프의 회복에 사용하기 위한 것이다.
생물반응기
또 다른 양태에서, 본원은 펌프(예를 들면 연동식 펌프, 중력식 펌프, 플런저(plunger) 펌프, 또는 기타 적합한 펌프), 용기, 제1 연결기, 및 제2 연결기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 직접적으로 또는 간접적으로 용기에 연결되고, 여기서 각각의 연결기가 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 제조하는 임의의 방법들중 하나에 의해 제조되는 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 관형 지지체의 말단에 연결되고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 관형 지지체의 2개의 말단에 연결될 경우, 펌프가 폐쇄된 회로에서 현탁액, 전혈, 또는 용액의 순환을 중재하는, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 생물반응기를 제공한다. 많은 실시태양에서, 본원에서 사용되는 펌프(예를 들면 연동식 펌프, 중력식 펌프, 플런저 펌프, 또는 기타 적합한 펌프)는 혈액 세포에 대한 손상을 최소화하기 위해 충분히 부드러운 것이 유리하다.
특정 실시태양에서, 생물반응기는 관형 지지체[예를 들어, 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)]를 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 생물반응기는 개인맞춤 혈관을 제조하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 현탁액 또는 전혈을 추가로 포함한다.
특정 실시태양에서, 생물반응기의 적어도 두 부분은, 미리 정해진 순서로 이들을 결합시키는 지시서와 함께, 별도로 제공된다. 따라서, 하나의 양태에서, 본원은 생물반응기가 연동식 펌프, 용기, 제1 연결기, 및 제2 연결기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 직접적으로 또는 간접적으로 용기에 연결될 수 있고, 여기서 각각의 연결기가 본원에 개시된 개인맞춤 혈관을 제조하는 임의의 방법들중 하나에 의해 제조되는 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 관형 지지체의 말단에 연결될 수 있고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 관형 지지체의 두 말단에 연결될 경우, 연동식 펌프가 폐쇄된 회로에서 현탁액, 전혈, 또는 용액의 순환을 중재하는, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 생물반응기를 조립하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 관형 지지체[예를 들어, 무세포 관형 지지체(예를 들어, 탈세포화된 혈관 또는 생체인쇄된 관형 지지체)]를 추가로 포함한다.
특정 실시태양에서, 제1 및 제2 연결기는 루어 연결기이다. 특정 실시태양에서, 제1 용기는 관에 의해 직접적으로 용기에 연결되고/되거나, 제2 용기는 관에 의해 직접적으로 용기에 연결된다.
특정 실시태양에서, 생물반응기는 샘플링 포트를 포함한다. 특정 실시태양에서, 샘플링 포트는 용기의 일부분이다. 특정 실시태양에서, 샘플링 포트는 폐쇄된 회로로부터 현탁액, 전혈, 또는 용액의 샘플의 채취를 허용한다. 특정 실시태양에서, 샘플링 포트는 현탁액, 전혈, 또는 용액중의 온도, pH, 및/또는 산소, C02, 또는 영양분(예를 들어, D-글루코스)의 농도를 측정하기 위한 센서를 포함한다.
특정 실시태양에서, 샘플링 포트는 또한 주입 포트로서 유용하다. 특정 실시태양에서, 생물반응기는 주입 포트를 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 주입 포트는 산소, C02, 또는 영양분(예를 들어, D-글루코스)의 저장소이거나 이에 연결될 수 있다.
특정 실시태양에서, 관형 지지체의 외부 표면은 용기중의 현탁액, 전혈, 또는 용액과 접촉된다. 이러한 생물반응기는 관형 지지체의 내부 표면 및 외부 표면을 동시에 재조절/재세포화 할 수 있다.
특정 실시태양에서, 생물반응기는 관형 지지체를 둘러싸는 챔버(chamber)를 추가로 포함하고, 이로써 관형 지지체의 외부 표면이 챔버중의 액체와 접촉하는 것을 허용한다. 챔버는 멸균되어, 관형 지지체를 무균 상태로 유지할 수 있다.
숙련가라면 동일한 생물반응기가 선천성 혈관을 탈세포화하거나 관형 지지체를 조절하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 적절한 현탁액, 전혈, 또는 용액은 용도에 상응하여 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
연장된 관류 기간 동안 조차도 혈액 용액중의 세포 및 무세포 성분을 파괴하지 않는 다양한 펌프가 사용될 수 있다. 이들은 연동식 펌프, 중력식 펌프, 피스톤 펌프 또는 유사 펌프일 수 있다. 생물반응기 장비에 샘플 포트가 포함되어, 관류 매질의 멸균 샘플링을 가능하게 할 뿐만 아니라, 폐쇄된 루우프를 개방하지 않고, 몇몇 경우 심지어 관류를 중단시키지 않고, 추가적인 성분의 멸균 주입을 가능하게 한다. 생물반응기 장비의 개선된 형태에서, 글루코스, pH, 산소 함량, C02 함량, 대사산물 등과 같은 다양한 매개변수 관련한 센서는 관류 배관에 직렬로 연결될 수 있다. 이는 RC 동안 또는 DC 동안 개인화 공정의 연속적인 모니터링을 허용하고, 세포 및 DNA 파괴 및 제거의 진행 및 성공을 모니터링한다.
본원의 또 다른 양태는 연동식 펌프, 샘플링 포트를 포함하는 용기, 제1 연결기, 및 제2 연결기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 직접적으로 또는 간접적으로 용기에 연결되고, 여기서 각각의 연결기가 본원에 개시된 임의의 방법들중 하나에 의해 제조된 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 관형 지지체의 말단에 연결되고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 관형 지지체의 2개의 말단에 연결될 경우, 연동식 펌프가 폐쇄된 회로에서 현탁액, 전혈, 또는 용액의 순환을 중재하는, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 생물반응기에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 제1 및 제2 연결기는 루어 연결기이다. 몇몇 실시태양에서, 샘플링 포트는 주입 포트이다. 몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 주입 포트를 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 주입 포트는 D-글루코스의 저장소에 연결된다. 몇몇 실시태양에서, 제1 용기는 관에 의해 직접적으로 용기에 연결되고/되거나, 제2 용기는 관에 의해 직접적으로 용기에 연결된다. 몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 1개 이상의 샘플 포트를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 글루코스 수준을 측정하기 위한 1개 이상의 센서를 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 pH-조정 모듈을 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 생물반응기는 C02 조정 모듈을 추가로 포함한다.
본원의 또 다른 양태는 표면에 접촉하여 사용되기 이전에 강화되거나 선택된 전혈에 함유된 성분과 무세포 관형 지지체의 표면을 접촉시키는 단계를 포함하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 성분은 혈소판, 유핵 세포, 단백질, 성장 인자, 신호전달 인자, 면역글로불린, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 성분은 원심분리, 구배 원심분리, 선택적 접착에 의한 분리, 여과, 또는 분류에 의해 강화된다. 성분을 강화하거나 분류하는 많은 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 분류를 위한 방법의 몇몇 예로는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 자기-활성화된 세포 분류(MACS)가 포함된다.
정의
방법은 기재된 특별한 실시태양에 제한되지 않고, 이로서 다양할 수 있음을 알아야 한다. 또한 본원에 사용된 전문 용어는 단지 특별한 실시태양을 설명하기 위한 것으로, 제한하려는 것이 아님을 알아야 한다. 본 기술의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.
본원에 사용되는 경우, 특정 용어는 하기 정의된 의미를 가질 것이다. 명세서 및 청구범위에 사용되는 경우, 단수 형태는, 전후관계가 명확히 다르게 지시되지 않는 한, 단수 및 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들면, 용어 "하나의 세포"는 단일 세포 뿐만 아니라, 이의 혼합물을 포함한 다수의 세포를 포함한다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은, 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하고자 한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 경우 "∼으로 본질적으로 구성되는"은, 조성물 또는 방법에 임의의 본질적인 의미를 갖는 다른 요소를 배제함을 의미할 것이다. "∼으로 구성되는"은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대한 다른 구성성분의 미량 이상의 요소를 배제함을 의미할 것이다. 이러한 각각의 변환 용어에 의해 정의된 실시태양은 본원의 범주내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물은 추가적인 단계 및 성분을 포함할 수 있거나(포함함), 또는 다르게는 의미 없는 단계 및 조성물을 포함하거나(본질적으로 구성됨), 또는 다르게는, 단지 언급된 방법 단계 또는 조성물만을 포함(구성됨)하고자 한다.
용어 "약"은 언급된 효능, 활성, 작용, 결과 등을 바꾸지 않는 언급된 절대적 값(예를 들어, 제제의 농도 또는 양)에서의 임의의 최소한의 변화를 지칭한다. 실시태양에서, 용어 "약"은 특정화된 수치 또는 데이터 포인트(data point)의 ±10%를 포함할 수 있다. 용어 "약"은 언급된 값을 포함한다(예를 들어 "약 1%"는 1% 뿐만 아니라 이의 최소한의 변화를 포함한다).
범위는 "약" 제1 특정 값으로부터 및/또는 "약" 제2 특정 값까지로서 본원에 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 경우, 제1 특정 값으로부터 및/또는 제2 특정 값까지를 포함하는 또 다른 양태가 또한 고려된다. 유사하게, 값이 "약"의 사용에 의해 추정값으로서 표현되는 경우, 특정 값이 또 다른 양태를 형성하는 것으로 이해한다. 추가로, 각 범위의 종점은 나머지 종점과 관련하여서 및 나머지 종점과 독립적으로 둘 다 유의미한 것으로 이해한다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 존재하고, 각각의 값이 또한 그 자체의 값에 더하여 "약" 그러한 특정 값으로서 개시되는 것으로 이해한다. 또한, 출원 전반에 걸쳐, 데이터는 다수의 상이한 형식으로 제공되고, 이러한 데이터는 종점 및 출발점 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 이해한다. 예를 들면, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 개시된다면, 10 및 15 초과, 10 및 15 이상, 10 및 15 미만, 10 및 15 이하, 및 10 및 15, 뿐만 아니라 10 내지 15가 개시된 것으로 고려됨을 이해한다. 또한 2개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 개시되는 것으로 이해한다. 예를 들면, 10 및 15가 개시된다면, 11, 12, 13, 및 14가 또한 개시된 것이다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은, 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하고자 한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 경우 "∼으로 본질적으로 구성되는"은, 조성물 또는 방법에 임의의 본질적인 의미를 갖는 다른 요소를 배제함을 의미할 것이다. "∼으로 구성되는"은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대한 다른 구성성분의 미량 이상의 요소를 배제함을 의미할 것이다. 이러한 각각의 변환 용어에 의해 정의된 실시태양은 본원의 범주내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물은 추가적인 단계 및 성분을 포함할 수 있거나(포함함), 또는 다르게는 의미 없는 단계 및 조성물을 포함하거나(본질적으로 구성됨), 또는 다르게는, 단지 언급된 방법 단계 또는 조성물만을 포함(구성됨)하고자 한다.
실시예
실시예 1: 개인맞춤 조직 조작된 정맥(P-TEV)
돼지 P-TEV 이식편을 제조하고 생체내에서 시험하여 이들의 안전성 및 실행가능성을 보여주었다. 구체적으로, 인간 대퇴부 정맥의 혈관 벽의 크기 및 두께를 모방하기 위한 대체 모델계로서 돼지 대정맥을 선택하였다.
P-TEV의 제조
돼지 사체로부터 대정맥을 회수하고 탈세포화하여 제공자 세포 및 DNA를 제거하였다. 간단히, 정맥 분절을 DC 용액 1, DC 용액 2, 및 DC 용액 3에 의해 순차적으로 관류시켰고, 이때 상이한 DC 용액 관류 사이에 멸균 수를 사용하여 세척 단계를 거쳤다. 본 실시예에서, 24 시간 동안 트리톤 X, 8 시간 동안 TNBP 및 16 시간 동안 DNA 분해효소를 사용하였다. 이어서 정맥 분절을 DC 기본 용액 및 PBS에 의해 1 시간 동안 철저히 세척하고 48-시간 최종 세척하였다. 그런 다음, 정맥 분절을 멸균 용액에서 멸균시키고, PBS에서 철저히 세척하였다(1-시간 멸균 세척 및 48 시간 최종 세척). 이어서 각각의 멸균된 DC 정맥 분절을 영구적으로 라벨이 부착된 용기에 옮기고 -80℃에서 PBS중에서 동결시켰다. 탈세포화 및 멸균화에 사용된 용액의 조성은 표 1에 제공된다.
[표 1]
탈세포화 및 멸균화를 위한 용액
Figure pct00005
탈세포화된 정맥 지지체의 무세포성을 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색에 의해 조직학적으로 입증하였다. 구체적으로, H&E 염색에서 핵을 나타내는 청색 점은 가공되지 않은 정맥에서 관찰되었지만, 탈세포화된 샘플에서는 관찰되지 않았다. 유사하게, DNA를 지시하는, DAPI로부터의 형광성은 가공되지 않은 정맥에서 검출될 수 있었지만, 탈세포화된 샘플에서는 검출되지 않았다. 쿼빗(Qubit)(상표명) 형광측정기를 사용하여 탈세포화된 정맥 분절의 DNA 함량을 또한 평가하였다. 탈세포화 이전의 샘플의 평균 이중-가닥 DNA(dsDNA) 함량은 조직 1 mg당 152 ng이었고, 이때 32 ng/mg의 평균 표준 오차(SEM)를 가졌다. 탈세포화 이후, 샘플은 0.04 ng/mg의 SEM를 가지면서 조직 1 mg당 0.5 ng의 dsDNA를 함유하였고, 이는 가공되지 않은 물질의 약 0.3 ± 0.03%였다. 따라서, 탈세포화에 의해 정맥 지지체는 실질적으로 DNA-부재가 되었다.
정맥 지지체를 재조절/재세포화하기 위해, 17 IU/㎖의 소디움 헤파린이 함유된 멸균 10 ㎖ 들이 BD 진공채혈기 유리 관에서 통상적인 정맥천자에 의해 수여자 돼지로부터 말초 전혈(PWB) 샘플을 채취하였다. PWB를 생체외 기관 관류 용액[스틴(상표명) 용액]과 1:1의 비로 혼합하고, 10 ng/㎖의 재조합 인간 FGF-2(rhFGF-2), 80 ng/㎖의 재조합 인간 VEGF(rhVEGF), 및 5 ㎍/㎖의 아세틸살리실산으로 보충함으로써, 자가유래 혈액 현탁액을 생성하였다. 재조절/재세포화를 폐쇄된 생물반응기에서 수행하였다. PBS에 의한 예비세척 및 헤파린에 의한 예비처리 이후, 정맥 지지체를 7일 동안 폐쇄된 재순환에 의해 혈액 현탁액에 의해 연속적으로 관류시켰다. 관류 동안에, 혈액 현탁액중의 글루코스 수준을 3 내지 11 밀리몰/ℓ 사이로 유지시켰다. 이들 조건하에, 자가유래 혈액 현탁액으로부터의 세포 및 기타 성분은 정맥 지지체를 재점유하였다.
수술
재조절된/재세포화된 P-TEV를 수술에 의해 수여자 돼지내로 이식하였다. 구체적으로, 백선을 통해 절개하였다. 대정맥을 배치하는 종래의 기법을 처음 2마리의 돼지에 대해 사용하였고: 염수에 적신 거즈 및 수술용 후크에 의해 장을 한쪽으로 유지시키고, 신정맥 및 대퇴정맥으로의 분기점 사이의 대정맥 부분을 주변 조직으로부터 해부하였다. 2마리의 동물중 1마리에서 장 유착이 형성되었으므로, 나머지 6마리의 돼지에서는 개선된 후복막 기법을 사용하여 대정맥을 배치하였고(4마리는 P-TEV에 의해 이식되고, 2마리는 모의 수술됨): 복막 및 복벽을 우측에서 대정맥 아래로 분리하였고, 이로써 장을 건드리지 않게 되었다. P-TEV 이식된 돼지의 경우, 대정맥을 절단하고, 대략 4 cm의 P-TEV를 한쪽 끝과 다른 한쪽 끝을 잇는 문합에 의해 부착시켰다. 모의 수술된 돼지에서는, 정맥의 장력으로 인해 P-TEV 이식에 의해서와 같이 두 장소에서의 절단 및 봉합이 허용되지 않았다. 그 대신, 대정맥을 절단하고 하나의 문합에 의해 봉합하였다.
수술 동안, 돼지를 틸레타민(tiletamine), 졸라제팜(zolazepam), 및 메데토미딘(medetomidine)으로 진정시키고, 이어서 이소플루란(isoflurane)에 의한 마취를 위해 기관내 삽관하였다. 수술 후 고통을 덜어주기 위해 수술 동안 부프레노르핀(buprenorfin)을 제공하였다. 응고 및 혈전증을 예방하기 위해, 모든 돼지를 수술전 1주 동안 1일 1회 160 mg의 아세틸살리실산에 의해, 및 수술전 1일부터 안락사시킬 때까지 1일 2회 2 mg/kg의 리바록사반(rivaroxaban)에 의해 경구적으로 치료하였다. 추가적으로, 10,000 IU의 헤파린을 수술 동안 정맥내로 투여하였다.
수술 후 돼지의 증상
2마리의 돼지는 수술 후 장 유착이 나타났고, 장폐색 증후로 인해 계획된 종점 이전에 안락사시켜야 했다. 1마리는 대정맥이 종래의 기법에 의해 배치된 P-TEV 돼지였다. 이는 수술 후 16일째 안락사시켜야 했고, 장은 해부시 대량의 유착을 나타내었다. 나머지는 모의 수술 돼지였고, 수술 후 7일째 안락사시켰다. 이러한 돼지의 복막은 수술 도중 파열되었고, 종래의 기법에 의해서와 같이 장을 젖은 거즈와 후크로 처리해야 했다.
나머지 6마리 돼지의 해부시 장 유착은 관찰되지 않았다. 이들 6마리 돼지중에서, 1마리의 모의 수술 돼지 및 3마리의 P-TEV 돼지를 수술 후 4 내지 5주째의 계획된 종점에 안락사시켰다. 2마리의 P-TEV 돼지는 대정맥 이식과 관련되지 않은 합병증으로 인해 더 일찍 안락사시켜야 했다. 1마리는 수술 후 3일째 안락사시켰는데, 복벽의 봉합이 파열되었기 때문이었다. 나머지는 수술 후 17일째 안락사시켰는데, 왼쪽 앞다리의 무릎 골절 때문이었다.
이식된 P-TEV의 특징결정
수술 후 4 내지 5주째 살아있는 1마리의 모의 수술 돼지 및 3마리의 P-TEV 돼지를 안락사시키기 이전에 마취하에 혈관조영술을 수행하였다. 조영제를 대퇴부 정맥에 주사하고, C-커브형 X-선을 사용하여 대정맥을 실시간으로 모니터링하였다. 도 1A 및 1B에 제시된 바와 같이, P-TEV(도 1B) 및 모의(도 1A) 수술된 정맥 둘다 자유 혈액 유동에 의해 개방되었다.
각각의 돼지를 안락사시킨 후, 대정맥을 검사하였다. 2개의 모의 수술된 정맥 및 6개의 P-TEV는 모두 응고 또는 혈전증의 징후 없이 자유 혈액 유동에 의해 개방되었다. 혈액 응고물 또는 혈전증은 육안 검사에서 관찰되지 않았다.
이어서 정맥을 박편화하고 H&E 염색 및 DAPI 염색을 위해 준비하였다. 도 2A 및 2B에 제시된 바와 같이, 수술 후 3일째 안락사된 돼지의 P-TEV(도 2B)의 경우, H&E 및 DAPI 염색에 의해 P-TEV 이식편에서 세포가 관찰되었다. 3-일째의 샘플을 기재된 바와 같이 분석하였다. RC 후의 샘플을 또한 관례대로 분석하였다(이들은 이식되지 않은 P-TEV 샘플의 마지막 단계를 나타내었다). 수술 후 17일째 안락사된 돼지에서 P-TEV 이식편은 잘 세포화되었다. 수술 후 4 내지 5주째, P-TEV(도 2B)에서의 세포의 수는 선천성 조직(도 2A)과 동일한 것으로 나타났다. 중요하게는, 본 연구에서 주된 잠재적 합병증인 내막 과다증식은 이식된 P-TEV에서 관찰되지 않았다.
정맥 샘플을 또한 면역조직화학에 의해 특징결정하였다. 수술 후 2주째 안락사된 돼지에서, P-TEV의 근위, 중심 및 원위 부분은 상당한 수의 세포를 가졌고, CD31-양성 세포를 식별할 수 있었다(도 3A 내지 3D). 도 3A는 문합 근처의 선천성 대정맥을 보여준다. 도 3B 내지 3D는 P-TEV의 근위(도 3B), 중심(도 3C), 및 원위(도 3D) 부분을 보여준다. 화살표는 CD31-양성 세포를 지시한다.
수술 후 4 내지 5주째 안락사된 돼지에서, P-TEV의 근위, 중심 및 원위 부분은 선천성 대정맥과 유사한 세포 밀도를 가졌고, P-TEV 내강은 CD31-양성 내피 층으로 덮혔다(도 4A 내지 4D). 도 4A 내지 4D는 수술 후 4주째 대정맥의 DAPI 염색 및 CD31 면역 염색을 보여주는 일련의 면역히스토그램(immunohistograms)이다. 도 4A는 문합 근처의 선천성 대정맥을 보여준다. 도 4B 내지 4D는 P-TEV의 근위(도 4B), 중심(도 4C), 및 원위(도 4D) 부분을 보여준다. 화살표는 CD31-양성 세포를 지시한다.
내강 표면의 안에 덧대어진 내피-유사 세포의 형태는 선천성 대정맥의 세포 형태와 사실상 구별 불가능하였다(도 5A 및 5B). 도 5A 및 5B는 수술 후 4주째의 선천성 대정맥(도 5A) 및 P-TEV 이식물(도 5B)의 H&E 염색을 보여주는 40배 배율의 일련의 영상이다. 화살표는 선천성 조직중의 내피 세포 및 P-TEV 이식물에 덧대어진 내피 세포-유사 형태를 갖는 세포를 지시한다.
요약하면, 이러한 생체내 연구는 P-TEV가 정맥 이식을 위해 안전하고 실현가능함을 시사하였다.
실시예 2: 생리학적 관류 용액의 제조
칼슘 및 마그네슘과 함께 900 ㎖의 둘베코 인산염-완충된 염수(DPBS: Dulbeccos Phosphate-Buffered Saline)를 연속적으로 60 rpm하에 RT에서 교반하였다. 액체 표면상에 분말을 층상화시킴으로써(덩어리짐을 방지하기 위해) 74 g의 인간 혈청 알부민을 천천히 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. rpm을 일시적으로 감소시킴으로써 거품형성을 방지하였다. 후속적으로 6.7 g의 덱스트란-40을 용액에 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 적정하고, 칼슘 및 마그네슘을 갖는 DPBS를 사용하여 최종 부피를 1000 ㎖로 조정하였다. 이어서 저 단백질-결합 멸균 필터를 사용하여 생리학적 관류 용액을 멸균 여과하고, 25 ㎖의 분취량으로 멸균 50 ㎖ 들이 관에 분취하고, 2 내지 8℃에서 12 개월 이하 동안 저장하였다.
실시예 3: 대안의 생리학적 관류 용액의 제조(고가의 HSA를 필요로 하지 않음)
환자로부터의 25 ㎖의 멸균 혈장을 멸균 50 ㎖ 들이 관에 넣었다. 이어서 1.5 ㎖의 1OO g/ℓ 멸균-여과된 덱스트란-40 스톡(stock) 용액을 혈장에 첨가하고 용액을 완전히 혼합될 때까지 주의깊에 저어 주었다. 멸균 생리학적 관류 용액을 2 내지 8℃에서 7일 이하 동안 저장하였다.
실시예 4: 제조된 생리학적 관류 용액의 추가적인 변형
70 g/ℓ의 HSA, 5 g/ℓ의 덱스트란-40 및 11 밀리몰/ℓ의 글루코스가 함유된, 칼슘 및 마그네슘을 갖는 DPBS
40 g/ℓ의 HSA 및 10 g/ℓ의 덱스트란-40이 함유된, 칼슘 및 마그네슘을 갖는 DPBS
추가적인 30 g/ℓ의 HSA 및 5 g/ℓ의 덱스트란-40이 함유된 인간 혈장
추가적인 5 g/ℓ 덱스트란-40 및 총 11 밀리몰/ℓ의 글루코스가 함유된 인간 혈장
70 g/ℓ의 HSA, 5 g/ℓ의 덱스트란-60 및 11 밀리몰/ℓ의 글루코스가 함유된, 칼슘 및 마그네슘을 갖는 DPBS
실시예 5: 상업적으로 입수가능한 생리학적 관류 용액의 조성
Figure pct00006
실시예 6: 생체인쇄에 의해 제조된 무세포 관형 지지체로부터의 개인맞춤 혈관의 제조
실시예 1은 탈세포화된 관형 지지체를 사용하여 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법을 기재한다. 다르게는, 개인맞춤 혈관은 생체인쇄된 관형 무세포 지지체로부터 제조된다. 간단히, 생체인쇄된 혈관 지지체를 겔 형태, 스폰지 형태, 포움 형태, 패치 형태, 또는 반-액체/유체 형태인 중합체(천연 또는 합성) 상에서 제조한다. 이러한 방법에서, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위해 중합체 지지체를 전혈 또는 용액에 희석된 전혈, 예를 들어, 전혈을 포함하는 현탁액에 의해 관류시킨다.
실시예 7: 개인맞춤 혈관의 이식
혈관 이식이 요구되는 피험체를 선택하고, 본원의 실시예 1 또는 2에 제공된 방법에 의해 제조된 개인맞춤 혈관을 피험체내로 주입/이식한다. 이식 후 피험체의 예후 및 회복을 모니터링한다.
본원에 개시된 개인맞춤 혈관은 다양한 혈관 질환 및 질병, 예컨대 심부 정맥 혈전증(DVT), 만성 정맥 부전증(CVI), 정맥류 정맥, 정맥 궤양화(예를 들어, 다리 정맥 궤양화), 및 재발성 다리 암(예를 들어, 심부 정맥 역류 및/또는 정맥 고혈압에 의해 발생됨)의 치료를 위해 사용된다.
구체적으로, 혈관 질환 또는 질병을 앓는 피험체를 선택한다. 개인맞춤 혈관을 수술에 의해 피험체에 도입하고: 질환 또는 질병을 앓는 선천성 혈관의 분절을 제거하고; 개인맞춤 혈관 또는 이의 기능성 분절을 선천성 혈관에 문합시킴으로써, 제거된 선천성 혈관의 분절을 대체한다. 수술로부터 생성된 혼성 혈관은 선천성 혈관과 기능적으로 유사하거나 동일하고, 다리에서의 둔통, 무거움, 또는 경련, 가려움 및 얼얼함, 서있을 때 악화되는 통증, 다리를 올렸을 때 나아지는 통증, 다리의 종창, 다리 및 발목의 발적, 발목 주변의 피부색 변화, 표면(표재) 상의 정맥류 정맥, 다리 및 발목 상의 피부의 두꺼워짐 및 경화(경화성 지방층염), 다리 및 발목 상의 궤양, 및 다리 또는 발목 상의 치유를 둔화시키는 상처를 비롯한 증후를 개선시킨다.
실시예 8
개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 무세포 관형 지지체의 재세포화/재조절 공정은 환자로부터의 전혈의 작은 샘플을 포함한다. 이러한 실시예에서, 재세포화/재조절 공정과 관련된 전혈의 세포 뿐만 아니라 비-세포 성분(예를 들어, 혈소판, 유핵 세포, 단백질, 성장 인자, 신호전달 인자, 면역글로불린)을 공정에 사용하기 위해 선택하거나 강화시킨다. 하나의 실시예, 전혈의 세포 뿐만 아니라 비-세포 성분을 전혈과 조합한다. 다르게는, 전혈의 세포 뿐만 아니라 비-세포 성분을 재세포화/재조절 공정에서 전혈 대신에 사용한다. 공정-관련된 이유로, 및/또는 혈관의 개인맞춤을 최적화하기 위해 후자의 공정을 수행한다. 예를 들어, 원심분리, 구배 원심분리, 선택적 접착, 크로마토그래피, 여과, 또는 분류(FACS, MACS)를 사용하여 강화 또는 선택을 수행한다.
기타 실시태양
본원은 이의 상세한 설명과 관련하여 기재되었지만, 전술된 기재사항은 본원의 범주를 예시하려는 것으로 제한하지 않고, 이는 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의됨을 알아야 한다. 다른 양태, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주내에 있다. 본원에 제공된 임의의 정의는 본 발명의 대상을 이해하기 위해, 및 첨부된 특허 청구범위를 작성하기 위해 포함된다. 본원에 사용된 약어는 화학 및 생물 분야에서 통상적인 의미를 갖는다.

Claims (89)

  1. 무세포 관형 지지체(acellular tubular scaffold)의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 개체로부터의 희석되지 않은 전혈 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 접촉을 2일 초과 동안 수행하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법.
  2. 무세포 관형 지지체의 표면을 개인맞춤 혈관이 필요한 개체로부터의 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 전혈 샘플이 생리학적 용액에 희석되어 있는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    전혈 샘플중의 세포의 집단이 무세포 관형 지지체를 점유하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    전혈 샘플이 1종 이상의 비-세포 인자를 포함하고, 여기서 전혈의 1종 이상의 비-세포 인자가 지지체를 점유하며, 여기서 비-세포 인자가 무세포 관형 지지체의 세포화 및 이식시 혈관의 숙주 적합성을 촉진시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액이 항혈전 인자를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    항혈전 인자가 항응고제를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    항응고제가 헤파린 또는 덱스트란을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    헤파린이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.5 IU/㎖ 내지 약 150 IU/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    헤파린이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 6.7 IU/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    덱스트란이 덱스트란-40인 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    덱스트란이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 1 g/ℓ 내지 약 55 g/ℓ의 농도로 존재하는 방법.
  12. 제5항에 있어서,
    항혈전제가 아스코르브산을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    아스코르브산이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    아스코르브산이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 5 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  15. 제5항에 있어서,
    항혈전 인자가 아세틸살리실산을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    아세틸살리실산이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.2 ㎍/㎖ 내지 약 200 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    아세틸살리실산이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 5 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
    전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액이, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-3, IL-4, 뉴트로핀(neutrophin)(NT)-6, 플레이오트로핀(pleiotrophin)(HB-GAM), 미드카인(midkine)(MK), 인터페론 유도 단백질-10(IP-10), 혈소판 인자(PF)-4, 단핵구 화학주성 단백질-1(MCP-l), RANTES[CCL-5, 케모카인(C-C 모티프(motif)) 리간드 5], IL-8, IGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, 형질전환 성장 인자(TGF)-β, VEGF, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, 간세포 성장 인자(HGF), 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-1, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 성장 인자를 모집단의 평균 생리학적 수준 이상으로 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    성장 인자가 섬유아세포 성장 인자(FGF)-2인 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    FGF-2가 인간 FGF-2인 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    FGF-2가 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 0.5 ng/㎖ 내지 약 200 ng/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  22. 제19항에 있어서,
    FGF-2가 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 10 ng/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  23. 제18항에 있어서,
    성장 인자가 혈관 내피 성장 인자(VEGF)인 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    VEGF가 인간 VEGF인 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    VEGF가 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 4 ng/㎖ 내지 약 800 ng/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  26. 제23항에 있어서,
    VEGF가 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 80 ng/㎖의 농도로 존재하는 방법.
  27. 제1항에 있어서,
    전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액이 인간 혈청 알부민을 추가로 포함하고, 여기서 인간 혈청 알부민의 농도가 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 약 55 g/ℓ 내지 약 105 g/ℓ인 방법.
  28. 제2항에 있어서,
    생리학적 용액이 무기 염, 및 완충 시스템을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    완충 시스템이 C02-독립적 완충 시스템을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    C02-독립적 완충 시스템이 인산염 완충 시스템을 포함하는 방법.
  31. 제28항에 있어서,
    생리학적 용액이 전혈과 실질적으로 유사한 삼투 압력을 나타내는 방법.
  32. 제28항에 있어서,
    생리학적 용액이 삼투성 인자 및/또는 영양분을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    삼투성 인자가 혈청 알부민을 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    혈청 알부민이 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 희석되지 않은 전혈 샘플 또는 전혈 샘플이 포함된 현탁액에 약 55 g/ℓ 내지 약 105 g/ℓ의 농도로 존재하는 방법.
  35. 제32항에 있어서,
    영양분이 당분, 아미노산, 또는 비타민중 하나 이상을 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    당분이 D-글루코스인 방법.
  37. 제2항에 있어서,
    생리학적 용액이 성장 인자, 항혈전 인자, 영양분, 및 삼투성 인자를 포함하고; 여기서 성장 인자가 인간 FGF-2 및 인간 VEGF를 포함하고; 항혈전 인자가 아세틸살리실산, 헤파린 또는 덱스트란중 하나 이상을 포함하며; 영양분이 D-글루코스를 포함하는 방법.
  38. 제1항에 있어서,
    개인맞춤 혈관을 제조하기 위해 무세포 관형 지지체를 전혈과 접촉시킨 후 세포 배양 배지와 접촉시킬 필요가 없는 방법.
  39. 제1항에 있어서,
    무세포 관형 지지체의 표면을 접촉시키는 단계가 3일 초과, 4일 초과, 5일 초과, 6일 초과, 7일 초과 동안, 2 내지 21일 동안, 3 내지 21일 동안, 4 내지 21일 동안, 5 내지 21일 동안, 6 내지 21일 동안, 7 내지 21일 동안, 또는 7 내지 9일 동안인 방법.
  40. 제2항에 있어서,
    무세포 관형 지지체를 전혈 샘플이 포함된 현탁액과 접촉시키고; 개인맞춤 혈관의 제조 동안에 다수의 환경적 매개변수 및/또는 영양분의 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    다수의 환경적 매개변수를 조정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    다수의 환경적 매개변수가 온도, pH, 산소, 및/또는 C02를 포함하는 방법.
  43. 제2항에 있어서,
    현탁액중의 영양분의 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    영양분의 농도를 연속적으로 또는 규칙적으로 조정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    영양분이 D-글루코스이고, 여기서 D-글루코스 농도를 약 3 내지 약 11 밀리몰/ℓ의 농도로 유지시키기 위해 연속적으로 또는 규칙적으로 D-글루코스 농도를 조정하는 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    현탁액으로부터 수집된 샘플중의 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 현탁액중의 D-글루코스의 농도를 모니터링하는 방법.
  47. 제45항에 있어서,
    현탁액중의 D-글루코스의 농도를 1일 1회 측정하는 방법.
  48. 제45항에 있어서,
    현탁액과 접촉된 센서를 사용하여 D-글루코스의 농도를 측정함으로써 현탁액중의 D-글루코스의 농도를 모니터링하는 방법.
  49. 제45항에 있어서,
    접촉 동안에 센서를 현탁액과 연속적으로 접촉시키는 방법.
  50. 제45항에 있어서,
    현탁액중의 D-글루코스의 측정된 농도가 4 밀리몰/ℓ 미만인 경우 D-글루코스를 첨가하는 방법.
  51. 제45항에 있어서,
    현탁액중 10 밀리몰/ℓ의 D-글루코스의 최종 농도에 도달하도록 D-글루코스를 첨가하는 방법.
  52. 제1항 내지 제51항중 어느 한 항에 있어서,
    무세포 관형 지지체의 표면이 무세포 관형 지지체의 내부 표면인 방법.
  53. 제1항 내지 제52항중 어느 한 항에 있어서,
    전혈이 말초 혈액 또는 제대혈을 포함하는 방법.
  54. 제1항 내지 제53항중 어느 한 항에 있어서,
    인간 혈청 알부민의 농도를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 인간 혈청 알부민의 농도가 무세포 관형 지지체의 표면에 접촉하기 시작할 때 약 55 g/ℓ 내지 약 105 g/ℓ인 방법.
  55. 제1항 내지 제54항중 어느 한 항에 있어서,
    접촉 단계가 전구체 세포의 내피 세포로의 증식 및/또는 분화를 일으키는 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    내피 세포가 VE-카드헤린(cadherin), AcLDL, vWF, 및/또는 CD31을 발현하는 방법.
  57. 제1항 내지 제56항중 어느 한 항에 있어서,
    무세포 관형 지지체가 탈세포화된 혈관인 방법.
  58. 제1항 내지 제57항중 어느 한 항에 있어서,
    무세포 관형 지지체를 현탁액 또는 전혈에 의해 연속적으로 관류시키는 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    무세포 관형 지지체를 1분당 약 0.1 ㎖ 내지 약 50 ㎖의 속도로 관류시키는 방법.
  60. 제58항에 있어서,
    무세포 관형 지지체를 1분당 약 2 ㎖의 속도로 관류시키는 방법.
  61. 제58항에 있어서,
    지지체를 현탁액 또는 전혈의 폐쇄된 재순환에 의해 관류시키는 방법.
  62. 제58항에 있어서,
    연속 접촉이 생물반응기를 사용하여 수행되는 관류인 방법.
  63. 제1항 내지 제62항중 어느 한 항에 있어서,
    접촉을 시험관내에서 수행하는 방법.
  64. 제1항 내지 제63항중 어느 한 항에 있어서,
    접촉을 약 8℃ 내지 약 40℃에서 수행하는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항중 어느 한 항에 있어서,
    접촉을 약 20℃ 내지 약 25℃에서 수행하는 방법.
  66. 제1항 내지 제65항중 어느 한 항에 있어서,
    개인맞춤 혈관이 정맥인 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    정맥이 대퇴부 정맥인 방법.
  68. 제66항에 있어서,
    밸브 능력 시험을 사용하여 개인맞춤 혈관의 정맥 밸브 기능을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  69. 제1항 내지 제68항중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 개인맞춤 혈관.
  70. 제69항에 있어서,
    수술에 의해 피험체내로 이식되어진 개인맞춤 혈관.
  71. 제70항에 있어서,
    피험체가 인간인 개인맞춤 혈관.
  72. 개인맞춤 혈관이 필요한 피험체내로 제69항의 개인맞춤 혈관을 이식하는 단계를 포함하는 수술 방법.
  73. 제72항에 있어서,
    피험체가 인간인 방법.
  74. 개인맞춤 혈관이 필요한 피험체내로 제69항의 개인맞춤 혈관을 이식하는 단계를 포함하는 수술 방법에 사용하기 위한 개인맞춤 혈관.
  75. 제74항에 있어서,
    피험체가 인간인 개인맞춤 혈관.
  76. 연동식 펌프, 샘플링 포트(sampling port)를 포함하는 용기, 제1 연결기, 및 제2 연결기를 포함하고, 여기서 제1 및 제2 연결기가 용기에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 여기서 각각의 연결기가 제1항 내지 제68항중 어느 한 항에 의해 제조된 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 관형 지지체의 말단에 연결되며, 여기서 제1 및 제2 연결기가 관형 지지체의 두 말단에 연결되는 경우, 연동식 펌프가 폐쇄된 회로에서 현탁액 또는 용액의 순환을 중재하는, 개인맞춤 혈관을 제조하기 위한 생물반응기.
  77. 제76항에 있어서,
    제1 및 제2 연결기가 루어(Luer) 연결기인 생물반응기.
  78. 제76항에 있어서,
    샘플링 포트가 주입 포트인 생물반응기.
  79. 제76항에 있어서,
    주입 포트를 추가로 포함하는 생물반응기.
  80. 제78항에 있어서,
    주입 포트가 D-글루코스의 저장소에 연결되는 생물반응기.
  81. 제76항에 있어서,
    제1 용기가 관에 의해 용기에 직접적으로 연결되고/되거나, 제2 용기가 관에 의해 용기에 직접적으로 연결되는 생물반응기.
  82. 제76항에 있어서,
    1개 이상의 샘플 포트를 추가로 포함하는 생물반응기.
  83. 제76항에 있어서,
    글루코스 수준을 측정하기 위한 1개 이상의 센서를 추가로 포함하는 생물반응기.
  84. 제76항에 있어서,
    pH 조정 모듈을 추가로 포함하는 생물반응기.
  85. 제76항에 있어서,
    C02 조정 모듈을 추가로 포함하는 생물반응기.
  86. 표면 접촉에 사용하기 이전에 강화되거나 선택된 전혈에 함유된 성분과 무세포 관형 지지체의 표면을 접촉시키는 단계를 포함하는, 개인맞춤 혈관을 제조하는 방법.
  87. 제86항에 있어서,
    성분을 혈소판, 유핵 세포, 단백질, 성장 인자, 신호전달 인자, 면역글로불린, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택하는 방법.
  88. 제86항에 있어서,
    성분을 원심분리, 구배 원심분리에 의해 강화시키거나; 선택적 접착, 여과, 또는 분류에 의해 선택하는 방법.
  89. 제86항에 있어서,
    표면이 무세포 관형 지지체의 내부 표면인 방법.
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