KR20210039421A

KR20210039421A - 알칼로이드 수준이 변경된 담배 식물 및 제품을 생산하기 위한 pmt 공학에 기초한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20210039421A
Application number: KR1020217005996A
Authority: KR
Inventors: 첸갈라얀 쿠디시푸디; 동 치; 얀신 쉔; 우와라 와렉; 제임스 스트릭랜드; 동메이 쉬
Original assignee: 알트리아 클라이언트 서비시즈 엘엘씨
Priority date: 2018-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2021-04-09
Also published as: US20200029522A1; JP2021531021A; JP7413348B2; US20220380788A1; BR112021001364A2; CN112639105A; US11384361B2; WO2020023864A1; JP2024045135A; EP3827086A1

Abstract

본 개시내용은 총 알칼로이드 및 니코틴 수준이 변경되고 상업적으로 허용 가능한 잎의 등급을 갖는 담배 식물과 관련된 조성물 및 방법, 육종 또는 형질전환 접근법을 통한 이들의 개발 및 이러한 담배 식물로부터의 담배 제품의 생산을 제공한다.

Description

알칼로이드 수준이 변경된 담배 식물 및 제품을 생산하기 위한 PMT 공학에 기초한 조성물 및 방법

서열 목록의 통합

본 출원은 2018년 7월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/703,775 및 2019년 5월 15일자로 출원된 미국 가출원 제62/848,159의 우선권을 주장하며, 이들 모두는 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 200,338 바이트(MS-Windows^®에서 측정됨)이며, 2019년 7월 25일자로 생성된 "P34620WO00_SL.txt"라는 파일명으로 포함되는 서열 목록은 함께 전자적으로 제출되며 그 전체가 참조에 의해 원용된다.

기술 분야

본 개시내용은 알칼로이드 및 니코틴 수준을 조절하기 위한 담배 유전공학을 제공한다.

니코틴은 우세한 알칼로이드이며, 일반적으로 상업용 담배 품종에서 전체 알칼로이드의 90% 내지 95% 초과를 차지한다. 나머지 알칼로이드 분획은 주로 세 가지의 추가적인 알칼로이드: 노르니코틴, 아나바신 및 아나타빈으로 구성된다. 니코틴 수준이 감소된 담배 식물에서 여러 가지 니코틴 생합성 유전자 및 전사 조절자를 조절하여 다양하고 일관성 없는 결과를 얻었다. 담배 잎에서 니코틴 수준을 감소시키기 위한 새로운 기술이 필요하다.

본 개시내용은 총 알칼로이드 및 니코틴 수준이 변경되고 상업적으로 허용 가능한 잎의 등급을 갖는 담배 식물, 육종 또는 형질전환 접근법을 통한 이들의 개발 및 담배 식물로부터의 담배 제품의 생산을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물 또는 이의 일부를 제공하되, 담배 식물은 유사한 조건에서 성장 및 가공될 때 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 갖지 않는 대조군 담배 식물로부터의 잎의 니코틴 수준보다 적은 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다.

다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다.

다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 4개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 표 8A 내지 표 8E에 열거된 바와 같은 단일 pmt 돌연변이체, 이중 pmt 돌연변이체, 삼중 돌연변이체, 사중 돌연변이체 및 오중 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 담배 식물을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 표 4A 내지 표 4E 또는 표 10에 열거된 바와 같은 담배 식물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 표 4A 내지 표 4E 또는 표 10에서 자가생식 또는 다른 식물과의 교배로부터 표 4A 내지 표 4E 또는 표 10의 담배 식물의 후대 식물을 제공한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 단일 pmt 돌연변이체, 이중 pmt 돌연변이체, 삼중 돌연변이체, 사중 돌연변이체 또는 오중 돌연변이체를 생성하기 위해 표 5A 내지 표 5E 또는 표 12A 내지 표 12E에 열거된 pmt 돌연변이체 대립유전자의 다양한 조합을 포함하는 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 21 내지 200, 410 내지 441, 474 내지 505, 538 내지 569, 602 내지 633 및 666 내지 697로 이루어진 군으로부터 선택되는 pmt 돌연변이체 대립유전자 서열을 포함하는 담배 식물을 제공한다.

본 개시내용은 개시된 담배 식물, 계통, 품종 또는 잡종으로부터의 식물 재료를 포함하는 건조 담배(cured tobacco), 담배 블렌드(tobacco blend), 담배 제품을 더 제공한다.

서열의 간단한 설명

서열번호 1 내지 5는 TN90 참조 게놈으로부터의 PMT1b, PMT1a, PMT2, PMT3 및 PMT4의 예시적인 게놈 서열을 각각 제시한다.

서열번호 6 내지 10은 TN90으로부터의 PMT1b, PMT1a, PMT2, PMT3 및 PMT4의 예시적인 cDNA 서열을 각각 제시한다.

서열번호 11 내지 15는 TN90으로부터의 PMT1b, PMT1a, PMT2, PMT3 및 PMT4의 예시적인 폴리펩타이드 서열을 각각 제시한다.

서열번호 16 내지 22는 예시적인 가이드 RNA 서열을 제시한다.

서열번호 23 내지 200, 410 내지 441, 474 내지 505, 538 내지 569, 602 내지 633 및 666 내지 697 예시적인 편집된 pmt 돌연변이체 서열을 제시한다.

도 1: TN90의 뿌리에서 5개의 PMT 유전자의 RNA 발현.
도 2: 각각의 정상-알칼로이드 대조군 계통 NLM(Ph Ph), VA359 및 KY171 배경과 비교하여, 다양한 저-알칼로이드 계통 CS15(NLM(Ph Ph) 배경에 있는 오중 pmt 넉-아웃 돌연변이체 계통 CS15), pmt RNAi 형질전환 계통(VA359 배경) 및 저-니코틴 KY171("LN KY171") 품종(nic1 및 nic2 이중 돌연변이를 포함하는 KY 171 배경)에서의 니코틴 수준.
도 3: 각각의 정상-알칼로이드 대조군 계통 NLM(Ph Ph), VA359 및 KY171 배경과 비교하여, 다양한 저-알칼로이드 계통 CS15, PMT RNAi 및 LN KY171에서의 총 알칼로이드 수준.
도 4: 각각의 정상-알칼로이드 대조군 계통 NLM(Ph Ph), VA359 및 KY171 배경과 비교하여, 다양한 저-알칼로이드 계통 CS15, PMT RNAi 및 LN KY171에서의 잎의 수율.
도 5: 각각의 정상-알칼로이드 대조군 계통 NLM(Ph Ph), VA359 및 KY171 배경과 비교하여, 다양한 저-알칼로이드 계통 CS15, PMT RNAi 및 LN KY171에서의 잎의 품질.
도 6: TN90 LC(도 6A), LA BU 21(도 6B), PR50을 하향조절하기 위한 RNAi 작제물을 포함하는 TN90(도 6C), PMT 유전자를 하향조절하기 위한 RNAi 작제물을 포함하는 TN90(도 6D) 및 5개의 PMT 유전자 모두에 대한 편집을 포함하는 TN90(도 6E)을 포함하는, 건조 담배에서의 곰팡이 성장을 보여주는 사진.
도 7: 도 6A 내지 도 6E에서 검사된 계통에서 관찰된 곰팡이 감염의 묘사.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당업자는 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있는 많은 방법을 인식할 것이다. 실제로, 본 개시내용은 기재된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다. 본 개시내용의 목적을 위해, 다음의 용어가 아래에 정의된다.

예를 들어, 모든 특허 및 간행물을 포함하여 본 명세서에 인용되는 임의의 참고문헌은 그 전문이 참조에 의해 원용된다.

본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하여 복수의 화합물을 포함할 수 있다.

용어 "약"이 숫자 범위와 함께 사용되는 경우, 설정된 숫자 값의 위아래로 경계를 10% 확장하여 해당 범위를 수정한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "미만", "초과", "적어도", "최대", "대략", "이하", "이상" 및 "약"과 같은 문구는 일련의 숫자 값과 함께 사용되는 경우, 시리즈 내의 각각의 모든 값을 수정한다. 예를 들어, "1%, 2% 또는 3% 미만"이라는 표현은 "1% 미만, 2% 미만 또는 3% 미만"과 동일하다.

본 명세서에서 사용되는 담배 식물은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 종의 식물을 지칭한다.

담배에서 니코틴 생합성은 보조인자로서 S-아데노실-메티오닌을 사용하여 효소인 푸트레신 N-메틸트랜스퍼레이스(putrescine N-methyltransferase: PMT)에 의해 폴리아민 푸트레신을 N-메틸푸트레신으로 메틸화하는 것으로 시작한다. 이것은 니코틴 생합성에 전구체 대사산물을 도입하는 단계이다. PMT 효소는 EC 2.1.1.53과 같은 효소 분류 시스템에 따라 분류된다. 니코티아나 타바쿰에서, 5개의 유전자가 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 명명된 푸트레신 N-메틸트랜스퍼레이스를 암호화한다. 표 1A는 TN90 식물에서의 이들 5개의 PMT 유전자의 유전체 DNA 서열, cDNA 서열 및 단백질 서열을 열거한다. 본 개시내용은 잎의 품질은 유지하면서 니코틴 수준이 감소된 pmt 돌연변이체 식물을 생산하기 위해 PMT 유전자를 편집하는데 사용되는 조성물 및 방법을 설명한다.

본 명세서에서 사용되는 "PMT1b" 또는 "PMT1b 유전자"는 서열번호 11에 제시된 바와 같은 TN90의 예시적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 담배의 유전자 좌위(genic locus)를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "PMT1a" 또는 "PMT1 유전자"는 서열번호 12에 제시된 바와 같이 TN90의 예시적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 담배의 유전자 좌위를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "PMT2" 또는 "PMT2 유전자"는 서열번호 13에 제시된 바와 같은 TN90의 예시적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 담배의 유전자 좌위를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "PMT3" 또는 "PMT3 유전자"는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 TN90의 예시적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 담배의 유전자 좌위를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "PMT4" 또는 "PMT4 유전자"는 서열번호 15에 제시된 바와 같은 TN90의 예시적인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 담배의 유전자 좌위를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 돌연변이는 유전자에 의해 암호화되는 생성물의 발현 또는 활성을 감소, 저해 또는 제거하기 위해 유전자에 도입된 유전되는 유전자 변형을 지칭한다. 이러한 변형은 유전자의 임의의 서열 영역, 예를 들어 프로모터, 5' UTR, 엑손, 인트론, 3' UTR 또는 종결 영역에 있을 수 있다. 일 양태에서, 돌연변이는 특정 담배 품종 또는 재배종(cultivar)에 존재하는 자연적인 다형성이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 "돌연변이체 대립유전자(mutant allele)"는 대립유전자가 돌연변이를 포함하는 유전자좌로부터의 대립유전자를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "pmt 돌연변이체"는 하나 이상의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 담배 식물을 지칭한다. pmt 돌연변이체는 단일 돌연변이체, 이중 돌연변이체, 삼중 돌연변이체, 사중 돌연변이체 또는 오중 돌연변이체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 단일, 이중, 삼중, 사중 또는 오중 pmt 돌연변이체는 각각 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 PMT 유전자에 변형을 갖는 돌연변이체를 지칭한다. pmt 돌연변이체는 또한 하나 이상의 PMT 유전자에서 동형접합성(homozygous) 돌연변이체, 이형접합성(heterozygous) 돌연변이체 또는 이형대립유전자(heteroallelic) 돌연변이체 조합일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 유전자 명칭 또는 유전자 좌위 명칭은 대문자로 쓰고, 이탤릭체, 예를 들어 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 나타낸다. 단백질 또는 폴리펩타이드 명칭은 이탤릭체가 아닌 대문자, 예를 들어 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 쓴다. 돌연변이체 명칭(유전자 또는 유전자의 군의 일반적인 돌연변이를 지칭하거나 또는 특정 돌연변이체 대립유전자를 지칭하는 경우)은 소문자와 이탤릭체, 예를 들어 pmt, pmt1a, pmt1b, pmt2, pmt3 및 pmt4로 나타낸다.

일 양태에서, 본 개시내용은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물 또는 이의 일부를 제공하되, 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 갖지 않는 대조군 담배 식물로부터의 잎의 니코틴 수준보다 적은 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다. 일 양태에서, 단일 pmt 돌연변이체 담배 식물이 제공된다. 다른 양태에서, 단일 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 단일 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하 또는 95% 이하 수준의 니코틴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 단일 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 단일 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95% 수준의 니코틴을 포함한다.

다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 일 양태에서, 이중 pmt 돌연변이체 담배 식물이 제공된다. 다른 양태에서, 이중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 이중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하 또는 95% 이하 수준의 니코틴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 이중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 이중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95% 수준의 니코틴을 포함한다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 일 양태에서, 삼중 pmt 돌연변이체 담배 식물이 제공된다. 다른 양태에서, 삼중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 삼중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하 또는 95% 이하 수준의 니코틴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 삼중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 삼중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95% 수준의 니코틴을 포함한다.

다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 4개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 일 양태에서, 사중 pmt 돌연변이체 담배 식물이 제공된다. 다른 양태에서, 사중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 사중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하 또는 95% 이하 수준의 니코틴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 사중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 사중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95% 수준의 니코틴을 포함한다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 일 양태에서, 오중 pmt 돌연변이체 담배 식물이 제공된다. 다른 양태에서, 오중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 오중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하 또는 95% 이하 수준의 니코틴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 오중 pmt 돌연변이체 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장한 경우 오중 pmt 돌연변이를 갖지 않는 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95% 수준의 니코틴을 포함한다.

일 양태에서, 담배 식물은 표 8A 내지 표 8E에 열거된 바와 같은 단일 pmt 돌연변이체, 이중 pmt 돌연변이체, 삼중 돌연변이체, 사중 돌연변이체 또는 오중 돌연변이체이다. 다른 양태에서, 담배 식물은 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E에 열거된 하나 이상의 pmt 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E에 열거된 pmt 돌연변이체 대립유전자 각각 및 이들의 모든 조합이 또한 단일 pmt 돌연변이체, 이중 pmt 돌연변이체, 삼중 돌연변이체, 사중 돌연변이체 또는 오중 돌연변이체를 생성시키기 위해 제공된다. 각각의 돌연변이된 유전자좌는 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있거나, 또는 이형대립유전자 조합을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 담배 식물은 표 4A 내지 표 4E 및 표 10에 열거된 각각의 개별 계통에 대해 나타낸 바와 같이 pmt 돌연변이체 유전자형 조합을 포함한다. 일 양태에서, 담배 식물은 서열번호 21 내지 200, 410 내지 441, 474 내지 505, 538 내지 569, 602 내지 633 및 666 내지 697로 이루어진 군으로부터 선택되는 pmt 돌연변이체 대립유전자 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 21 내지 200, 410 내지 441, 474 내지 505, 538 내지 569, 602 내지 633 및 666 내지 697로 이루어진 군으로부터 선택되는 pmt 돌연변이체 대립유전자 서열을 포함하는, 이중 pmt 돌연변이체, 삼중 돌연변이체, 사중 돌연변이체 또는 오중 돌연변이체를 제공한다.

일 양태에서, 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 대조군 담배 식물로부터의 잎의 니코틴 수준의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0.25% 미만의 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다. 다른 양태에서, 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 대조군 담배 식물의 니코틴 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95%의 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다.

다른 양태에서, 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 대조군 담배 식물로부터의 잎의 총 알칼로이드 수준의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0.25% 미만의 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다. 다른 양태에서, 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 대조군 담배 식물로부터의 잎의 총 알칼로이드 수준의 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 95%의 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 대조군 담배 식물로부터의 잎의 총 알칼로이드 수준의 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다.

일 양태에서, 돌연변이체 pmt 대립유전자는 프로모터, 5' UTR, 제1 엑손, 제1 인트론, 제2 엑손, 제2 인트론, 제3 엑손, 제3 인트론, 제4 엑손, 제4 인트론, 제5 엑손, 제5 인트론, 제6 엑손, 제6 인트론, 제7 엑손, 제7 인트론, 제8 엑손, 3' UTR, 종결인자 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 pmt 서열 영역에 돌연변이를 포함한다. 다른 양태에서, 돌연변이체 pmt 대립유전자는 표 1D 내지 표 1H에 열거된 pmt 게놈 서열 영역에 돌연변이를 포함한다.

다른 양태에서, 돌연변이체 pmt 대립유전자는 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이, 스플라이스-부위 돌연변이 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 유형을 포함한다. 일 양태에서, 돌연변이체 pmt 대립유전자는 널(null) 대립유전자 또는 넉-아웃 대립유전자이다.

일 양태에서, 돌연변이체 pmt 대립유전자는 다음 중 하나 이상을 초래한다: pmt 유전자에서 pmt 단백질 절단, 비-번역가능 PMT 유전자 전사체, 비-기능성 PMT 단백질, 조기 정지 코돈 및 이들의 임의의 조합.

다른 양태에서, 돌연변이체 pmt 대립유전자는 야생형 PMT 유전자에 대한 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 중복 및 역위로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체는 동형접합성, 이형접합성 및 이형대립유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 상태(zygosity status)를 포함한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 PMT 유전자에서 동형접합성 또는 이형대립유전자이다. 일 양태에서, pmt 돌연변이체는 적어도 4개의 PMT 유전자에서 동형접합성 또는 이형대립유전자이다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체는 5개의 PMT 유전자 모두에서 동형접합성 또는 이형대립유전자이다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체는 PMT1a 및 PMT3에 돌연변이를 포함한다.

일 양태에서, 담배 식물은 0.15% 미만, 0.125% 미만, 0.1% 미만, 0.08% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만 및 0.01% 미만의 건조 중량으로 이루어진 군으로부터 선택되는 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다.

다른 양태에서, 담배 식물은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만 및 0.2% 미만의 건조 중량으로 이루어진 군으로부터 선택되는 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은 2 내지 0.05ppm, 1.9 내지 0.05ppm, 1.8 내지 0.05ppm, 1.7 내지 0.05ppm, 1.6 내지 0.05ppm, 1.5 내지 0.05ppm, 1.4 내지 0.05ppm, 1.3 내지 0.05ppm, 1.2 내지 0.05ppm, 1.1 내지 0.05ppm, 1.0 내지 0.05ppm, 0.9 내지 0.05ppm, 0.8 내지 0.05ppm, 0.7 내지 0.05ppm, 0.6 내지 0.05ppm, 0.5 내지 0.05ppm, 0.4 내지 0.05ppm, 0.3 내지 0.05ppm, 0.2 내지 0.05ppm, 0.15 내지 0.05 또는 0.1 내지 0.05ppm의 총 TSNA 수준을 포함하는 건조된 잎을 생산할 수 있다.

일 양태에서, 담배 식물은 건조되는 경우, 50 이상, 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상 및 95 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있다. 다른 양태에서, 담배 식물은 건조되는 경우, 유사한 환경에서 성장하고 건조될 때 대조군 식물과 유사한 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있으며, 여기서 대조군 식물은 변형을 제외하고 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 배경을 공유한다. 또 다른 양태에서, 담배 식물은 건조되는 경우, 유사한 환경에서 성장할 때 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98%의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있으며, 여기서 대조군 식물은 변형을 제외하고 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 배경을 공유한다. 또 다른 양태에서, 담배 식물은 건조되는 경우, 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 65% 내지 130%, 70% 내지 130%, 75% 내지 130%, 80% 내지 130%, 85% 내지 130%, 90% 내지 130%, 95% 내지 130%, 100% 내지 130%, 105% 내지 130%, 110% 내지 130%, 115% 내지 130% 또는 120% 내지 130%의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있다. 또 다른 양태에서, 담배 식물은 건조되는 경우, 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값의 70% 내지 125%, 75% 내지 120%, 80% 내지 115%, 85% 내지 110% 또는 90% 내지 100%의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있다.

일 양태에서, 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장할 때, 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하 또는 80% 이하 수준의 니코틴을 포함하며, 여기서 대조군 식물은 변형을 제외하고 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 배경을 공유한다.

또 다른 양태에서, 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이체 대립유전자를 포함하며, MPO, QPT, BBL, A622, 아스파테이트 옥시데이스, 아그마틴 데이미네이스(agmatine deiminase: AIC), 아르기네이스, 다이아민 옥시데이스, 오르니틴 데카복실레이스, 아르기닌 데카복실레이스, 니코틴 흡수 퍼미에이스(nicotine uptake permease: NUP) 및 MATE 수송자로 이루어진 군으로부터 선택되는 산물을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 직접 억제하는 이식유전자 또는 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이체 대립유전자를 포함하며, Nic2 유전자좌의 ERF 유전자에 돌연변이를 더 포함한다. 일 양태에서, 담배 식물은 ERF189, ERF115, ERF221, ERF104, ERF179, ERF17 및 ERF168로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개의 유전자 모두에 하나 이상의 돌연변이를 더 포함한다. 문헌[Shoji et al.,, Plant Cell, (10):3390-409 (2010); 및 Kajikawa et al., Plant physiol. 2017, 174:999-1011] 참조. 일 양태에서, 담배 식물은 ERF189, ERF115 또는 둘 다에 하나 이상의 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, 담배 식물은 하나 이상의 qpt 돌연변이체 대립유전자를 포함하며, Nic1 유전자좌(또는 2019년 1월 11일자로 출원된 PCT/US2019/013345에서와 같은 Nic1b 유전자좌, WO/2019/140297로 공개됨)의 ERF 유전자에 돌연변이를 더 포함한다. WO/2018/237107을 또한 참조. 일 양태에서, 담배 식물은 ERF101, ERF110, ERFnew, ERF199, ERF19, ERF130, ERF16, ERF29, ERF210 및 ERF91L2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 더 포함한다. 문헌[Kajikawa et al.,, Plant physiol. 2017, 174:999-1011] 참조. 일 양태에서, 담배 식물은 ERFnew, ERF199, ERF19, ERF29, ERF210 및 ERF91L2로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개의 유전자 모두에 하나 이상의 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 3% 미만, 2.75% 미만, 2.5% 미만, 2.25% 미만, 2.0% 미만, 1.75% 미만, 1.5% 미만, 1.25% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 0.025% 미만, 0.01% 및 0.005% 미만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함하는 pmt 돌연변이체 담배 식물 또는 이의 일부를 더 제공하며, 여기서 담배 식물은 건조되는 경우, 50 이상, 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상 및 95 이상의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있다. 다른 양태에서, 이러한 pmt 돌연변이체 담배 식물은 0.02% 미만의 니코틴 수준을 포함하며, 건조되는 경우 70 이상의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있다. 또 다른 양태에서, 이러한 담배 식물은 0.01% 미만의 니코틴 수준을 포함하며, 건조되는 경우 70 이상의 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있다.

일 양태에서, 본 개시내용은 또한 비-형질전환 돌연변이를 포함하는 담배 식물 또는 이의 일부를 제공하며, 여기서 비-형질전환 돌연변이는 유사한 성장 조건에서 성장할 때 대조군 식물의 니코틴 수준의 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 8% 이하, 10% 이하, 12% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하 또는 80% 이하로 담배 식물의 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 감소시키고, 담배 식물은 건조되는 경우, 대조군 식물의 USDA 등급 지수 값과 비슷한 USDA 등급 지수 값을 갖는 잎을 생산할 수 있으며, 대조군 식물은 비-형질전환 돌연변이를 제외하고 담배 식물과 본질적으로 동일한 유전적 배경을 공유한다.

일 양태에서, 담배 식물은 무작위 돌연변이 유발 및 표적 돌연변이 유발로 이루어진 군으로부터 선택되는 접근법에 의해 도입된 pmt 돌연변이를 포함한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이는 메가뉴클레이스, 아연 핑거 뉴클레이스, TALEN 및 CRISPR로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 돌연변이 유발 접근법에 의해 도입된다.

달리 명시하지 않는 한, 담배 식물, 품종, 재배종 또는 계통에 대해 본 명세서에서 언급된 알칼로이드 또는 니코틴 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성의 특성화)의 측정값 또는 잎의 등급 지수 값은 예를 들어, 단일 식물의 여러 잎의 평균, 또는 단일 품종, 재배종 또는 계통의 담배 식물의 개체군으로부터의 평균 측정값을 포함하는 평균 측정값을 지칭한다

달리 명시하지 않는 한, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성의 특성화)은 토핑 후 잎 번호 3, 4 및 5로부터 수집된 혼주된(pooled) 잎 샘플에서 토핑 후 측정된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 두 식물(예를 들어, 돌연변이체 식물 대 대조군 식물)의 잎 간의 비교가 언급될 때마다, 동일하거나 유사한 줄기 위치(들) 및 발달 단계(들)로부터의 잎은, 비교가 다른 인자가 아닌 유전자형의 차이로 인한 효과를 입증할 수 있도록 의도된다. 예시로서, 야생형 대조군 식물의 잎 3은 pmt 돌연변이체 식물의 잎 3과 비교하기 위한 기준점(reference point)으로서 의도된다. 일 양태에서, 적어도 하나의 pmt 돌연변이를 포함하는 담배 식물은 동일한 담배 품종의 대조군 담배 식물과 비교된다.

담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 또한 대안적인 방식으로 측정될 수 있다. 일 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 가장 높은 수준의 니코틴 또는 알칼로이드(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)를 갖는 잎에서의 토핑 후 측정된다. 일 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준은 잎 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30에서 토핑 후 측정된다. 다른 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 잎 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 연속적인 잎 번호를 갖는 2개 이상의 잎의 혼주(pool)에서 토핑 후에 측정된다. 다른 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 1 내지 5, 6 내지 10, 11 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25 내지 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잎 번호를 갖는 잎에서 토핑 후 측정된다. 다른 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 1 내지 5, 6 내지 10, 11 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25 내지 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잎 번호를 갖는 2개 이상의 잎의 혼주에서 토핑 후 측정된다. 다른 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 1 내지 5, 6 내지 10, 11 내지 15, 16 내지 20, 21 내지 25 내지 26 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 잎 번호를 갖는 3개 이상의 잎의 혼주에서 토핑 후 측정된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 잎 번호 매기기는 담배 줄기의 잎의 위치를 기준으로 하며, 잎 번호 1은 토핑 후 가장 어린 잎(위쪽)이고, 가장 높은 잎 번호는 가장 오래된 잎(아래쪽)에 할당된다.

평균 측정값(예를 들어, 알칼로이드 또는 니코틴 수준 또는 잎의 등급)을 결정하기 위한 담배 식물의 개체군 또는 담배 잎의 집합은 임의의 크기, 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 50일 수 있다. 업계에서 인정하는 표준 프로토콜을 따라 평균 측정값 또는 등급 지수 값을 결정한다.

본 명세서에서 사용되는 "토핑(topping)"은 담배 식물이 식물 성숙기에 가까워지고 대략 번식 성장이 시작될 때, SAM, 꽃 및 최대 여러 개의 인접한 잎을 포함하여 줄기 꼭대기를 제거하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 담배 식물은 버튼 단계(button stage)(꽃이 나타나기 시작한 직후)에서 토핑된다. 예를 들어, 온실 또는 밭에서 자란 담배 식물은 식물의 50%가 적어도 하나의 개화된 꽃을 가지고 있을 때 토핑될 수 있다. 담배 식물을 토핑하면 꼭대기의 우세성을 잃고 알칼로이드 생성이 증가한다.

달리 명시되지 않는 한, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 토핑 후 2주에 측정된다. 대안적으로, 다른 시점도 또한 사용될 수 있다. 일 양태에서, 담배 식물의 니코틴 또는 알칼로이드 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 토핑 후 약 1주, 2주, 3주, 4주 또는 5주에 측정된다. 다른 양태에서, 담배 식물의 니코틴, 알칼로이드, 또는 폴리아민 수준(또는 다른 잎의 화학적 성질 또는 특성 특성화)은 토핑 후 약 3일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일, 17일, 19일 또는 21일에 측정된다.

본 명세서에서 사용되는 "유사한 성장 조건(similar growth condition)" 또는 "비슷한 성장 조건(comparable growth condition)"은 환경 조건이나 농업 관행이 2개 이상의 식물 유전자형 간에 관찰된 임의의 차이에 기여하거나 이를 해명하지 않도록 하는 2개 이상의 식물 유전자형 간에 성장 및 의미있는 비교를 하기 위한 유사한 환경 조건 및/또는 농업 관행을 지칭한다. 환경 조건은 예를 들어, 빛, 온도, 물(습도) 및 영양분(예를 들어, 질소 및 인)을 포함한다. 농업 관행은 예를 들어, 씨 뿌리기(seeding), 클리핑(clipping), 언더컷팅(undercutting), 옮겨 심기, 토핑 및 곁순따기(suckering)를 포함한다. 문헌[Chapters 4B and 4C of Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford (1999), pp 70-103]을 참조.

"알칼로이드"는 인간 및 동물에서 약학적 효과를 나타내는 복잡한 질소-함유 화합물이다. "니코틴"은 상용화된 궐련 담배의 주요 천연 알칼로이드이며, 니코티아나 타바쿰의 알칼로이드 함량의 약 90%를 차지한다. 담배의 다른 주요 알칼로이드는 코티닌, 노르니코틴, 마이오스민, 니코티린, 아나바신 및 아나타빈을 포함한다. 소량의 담배 알칼로이드는 니코틴-n-옥사이드, N-메틸 아나타빈, N-메틸 아나바신, 슈도옥시니코틴, 2,3 다이피리딜 등을 포함한다.　

알칼로이드 수준은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 기체-액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 방사성-면역검정 및 효소-연결 면역흡착 검정에 기반한 정량화에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 니코틴 알칼로이드 수준은 CORESTA 권장 방법 7번(1987년)에 기반한 GC-FID 방법 및 모세관 칼럼과 FID 검출기가 장착된 기체-액체 크로마토그래피를 사용하는 방법에 대한 ISO 표준(ISO TC 126N 394 E. 또한, 문헌[Hibi et al.,　Plant Physiology 100: 826-35 (1992)] 참조)에 의해 측정될 수 있다.

별도로 명시되지 않는 한, 알칼로이드 및 니코틴 수준은 CORESTA 방법 62번(문헌[Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by Gas Chromatographic Analysis, February 2005])에 따른 방법 및 1999년 3월 23일자로 연방 관보(Federal Register Vol. 64, No. 55)에 공개(Vol. 74, No. 4에서 개정, 2009년 1월 7일)된 문헌[Centers for Disease Control and Prevention's Protocol for Analysis of Nicotine, Total Moisture and pH in Smokeless Tobacco Products]에 정의된 방법을 사용하여 측정된다. 대안적으로, 담배 총 알칼로이드는 스카라 인스트루먼트 코포레이션(Skalar Instrument Co)(펜실베이니아주 웨스트체스터 소재)에 의해 적합화되고 문헌[Collins et al., Tobacco Science 13:79-81 (1969)]에 의해 기술된 바와 같이, 담배 샘플의 분석을 위해 개발된 분할-흐름 비색법(segmented-flow colorimetric method)을 사용하여 측정될 수 있다. 요컨대, 담배 샘플은 총 알칼로이드 및 환원당을 분석하기 전에 건조, 분쇄 및 추출될 수 있다. 그런 다음, 방법은 아세트산/메탄올/물 추출 및 탈색을 위한 목탄을 사용한다. 총 알칼로이드의 결정은 아로마족 아민의 존재하에 사이아노겐 클로라이드와 니코틴 알칼로이드가 반응하여 460㎚에서 측정되는 착색된 복합체를 형성하는 것에 기초한다. 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 나타내는 총 알칼로이드 수준 또는 니코틴 수준은 건조 중량 기준(예를 들어, 총 알칼로이드 백분율 또는 니코틴 백분율)이다.

일 양태에서, 담배 식물은 건조 중량 기준으로 약 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.75%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 및 9%로 이루어진 군으로부터 선택되는 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 다른 양태에서, 담배 식물은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.02%, 0.02% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.75%, 0.75% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.15%, 0.15% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3%, 0.3% 내지 0.35%, 0.35% 내지 0.4%, 0.4% 내지 0.5%, 0.5% 내지 0.6%, 0.6% 내지 0.7%, 0.7% 내지 0.8%, 0.8% 내지 0.9%, 0.9% 내지 1%, 1% 내지 1.1%, 1.1% 내지 1.2%, 1.2% 내지 1.3%, 1.3% 내지 1.4%, 1.4% 내지 1.5%, 1.5% 내지 1.6%, 1.6% 내지 1.7%, 1.7% 내지 1.8%, 1.8% 내지 1.9%, 1.9% 내지 2%, 2% 내지 2.1%, 2.1% 내지 2.2%, 2.2% 내지 2.3%, 2.3% 내지 2.4%, 2.4% 내지 2.5%, 2.5% 내지 2.6%, 2.6% 내지 2.7%, 2.7% 내지 2.8%, 2.8% 내지 2.9%, 2.9% 내지 3%, 3% 내지 3.1%, 3.1% 내지 3.2%, 3.2% 내지 3.3%, 3.3% 내지 3.4%, 3.4% 내지 3.5% 내지 3.5% 내지 3.6%로 이루어진 군으로부터 선택되는 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 또 다른 양태에서, 담배 식물은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.2%, 0.03% 내지 0.3%, 0.04% 내지 0.4%, 0.05% 내지 0.5%, 0.75% 내지 1%, 0.1% 내지 1.5%, 0.15% 내지 2%, 0.2% 내지 3% 내지 0.3% 내지 3.5%로 이루어진 군으로부터 선택되는 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다.

본 개시내용은 또한 다른 담배 형질(형질), 예를 들어 잎의 등급 지수 값에 대한 부정적인 영향 없이 니코틴 수준이 변경된 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 저-니코틴 또는 니코틴이 없는(nicotine-free) 담배 품종은 상업적으로 허용 가능한 등급의 건조 담배를 제공한다. 담배 등급은 잎 줄기의 위치, 잎의 크기, 잎의 색상, 잎의 균일성 및 온전성, 성숙도(ripeness), 질감, 탄성, 광택(sheen)(잎의 강도 및 착색의 깊이뿐만 아니라 윤기와 관련됨), 흡습성(주변 습기를 흡수하고 유지하는 담배 잎의 기능) 및 녹색 뉘앙스(green nuance) 또는 캐스트(cast)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인자에 기초하여 평가된다. 잎의 등급은 예를 들어, 미국 농무부의 농업 마케팅 서비스(Agricultural Marketing Service of the US Department of Agriculture)(7 U.S.C. §511)에 의해 발표된 공식 표준 등급(Official Standard Grade)을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 벌리 담배(Burley Tobacco)(미국 유형 31 및 외국 유형 93)에 대한 공식 표준 등급, 1990년 11월 5일부로 시행(55 F.R. 40645); 철관-건조 담배(Flue-Cured Tobacco)(미국 유형 11, 12, 13, 14 및 외국 유형 92)에 대한 공식 표준 등급, 1989년 3월 27일부로 시행(54 F.R. 7925); 펜실베이니아 시드 잎 담배(Pennsylvania seedleaf Tobacco)(미국 유형 41)에 대한 공식 표준 등급, 1965년 1월 8일부로 시행(29 F.R. 16854); 오하이오 시가-잎 담배(Ohio Cigar-Leaf Tobacco)(미국 유형 42, 43 및 44)에 대한 공식 표준 등급, 1963년 12월 8일부로 시행(28 F.R. 11719 및 28 F.R. 11926); 위스콘신 시가-바인더 담배(Wisconsin Cigar-Binder Tobacco)(미국 유형 54 및 55)에 대한 공식 표준 등급, 1969년 11월 20일부로 시행(34 F.R. 17061); 위스콘신 시가-바인더 담배(Wisconsin Cigar-Binder Tobacco)(미국 유형 54 및 55)에 대한 공식 표준 등급, 1969년 11월 20일부로 시행(34 F.R. 17061); 조지아 및 플로리다 셰이드 그로운 시가-래퍼 담배(Georgia and Florida Shade-Grown Cigar-Wrapper Tobacco)(미국 유형 62)에 대한 공식 표준 등급, 1971년 4월부로 시행 참조. USDA 등급 지수 값은 산업적으로 인정된 등급 지수에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bowman et al, Tobacco Science, 32:39-40(1988); Legacy Tobacco Document Library (Bates Document #523267826-523267833, July 1, 1988, Memorandum on the Proposed Burley Tobacco Grade Index); 및 Miller et al., 1990, Tobacco Intern., 192:55-57] 참조(전술한 참조문헌 모두 그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음). 일 양태에서, USDA 등급 지수는 일반적으로 인정되는 연방 등급의 0 내지 100의 숫자 표현이며, 모든 줄기 위치의 가중 평균(weighted average)이다. 높은 등급 지수는 높은 품질을 나타낸다. 대안적으로, 잎의 등급은 초-스펙트럼 이미징을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, WO 2011/027315(2011년 3월 10일 공개되었으며, 그 전문이 참조에 의해 원용되어 있음) 참조.

일 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장할 때 대조군 담배 식물과 비교하여 유사한 수준의 하나 이상의 담배 아로마(aroma) 화합물을 포함한다. 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 담배 식물은 유사한 성장 조건에서 성장할 때 대조군 담배 식물과 비교하여, 3-메틸발레르산, 발레르산, 아이소발레르산, 랍데노이드(labdenoid), 셈브레노이드(cembrenoid), 당 에스터 및 환원당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유사한 수준의 하나 이상의 담배 아로마 화합물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 담배 아로마 화합물은 담배 연기의 풍미(flavor) 및 아로마와 연관된 화합물이다. 이러한 화합물은 3-메틸발레르산, 발레르산, 아이소발레르산, 셈브레노이드 및 랍데노이드 다이테르펜 및 당 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 담배 아로마 화합물의 농도는 기체 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS), 핵 자기 공명 분광법, 액체 크로마토그래피-결합 질량 분석법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 공지된 대사물질 프로파일링 방법에 의해 측정될 수 있다. 문헌[The Handbook of Plant Metabolomics, edited by Weckwerth and Kahl, (Wiley-Blackwell) (May 28, 2013)] 참조.

본 명세서에서 사용되는 "환원당(들)"은 알데하이드기 또는 케톤기가 없거나 또는 없을 가능성이 있는 임의의 당(단당류 또는 다당류)이다. 글루코스 및 프럭토스는 연기의 pH를 낮추고 "유리" 비양성자화 니코틴의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 담배 연기에서 니코틴 완충제의 역할을 한다. 환원당은 니코틴 및 기타 담배 알칼로이드의 감각적 영향을 변경함으로써 연기 풍미의 균형을 맞춘다. 당 함량과 알칼로이드 함량 간의 역관계는 담배 품종, 동일한 품종 내 및 식재 조건(planting)으로 인한 동일한 식물 계통 내에서 보고되었다. 환원당 수준은 스카라 인스트루먼트 코포레이션(펜실베이니아주 웨스트 체스터 소재)에 의해 적합화되고 문헌[Davis, Tobacco Science 20:139-144 (1976)]에 의해 기술된 담배 샘플의 분석을 위해 개발된 분할-흐름 비색법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 탄산나트륨 용액에 대해 투석한다. 구리 네오큐프로인(Copper neocuproin)을 샘플에 첨가하고, 용액을 가열한다. 구리 네오큐프로인 킬레이트는 당의 존재하에 환원되어 460㎚에서 측정되는 착색된 복합체를 생성한다.

일 양태에서, 담배 식물은 하나 이상의 PMT 유전자 좌위로부터 PMT 효소 활성을 감소 또는 제거하는 하나 이상의 PMT 유전자 좌위에 하나 이상의 비-자연적으로 존재하는 돌연변이체 대립유전자를 포함한다. 일 양태에서, 이러한 돌연변이체 대립유전자는 니코틴 수준을 낮춘다. 돌연변이체 pmt 대립유전자는 무작위 또는 표적 돌연변이 유발 접근법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 유발 방법은 제한 없이, 에틸 메틸설페이트(ethyl methylsulfate: EMS)(문헌[Hildering and Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon press, pp 317-320, 1965]) 또는 UV-조사, X-선 및 고속 중성자 조사(예를 들어, 문헌[Verkerk, Neth. J. Agric. Sci. 19:197-203, 1971; 및 Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd ed), 1987] 참조), 트랜스포존 태깅(문헌[Fedoroff et al., 1984]; 미국 특허 제4,732,856호 및 미국 특허 제5,013,658호)뿐만 아니라 T-DNA 삽입법(문헌[Hoekema et al., 1983]; 미국 특허 제5,149,645호)으로 종자를 처리하는 것을 포함한다. EMS-유도성 돌연변이 유발은 게놈 길이에 걸쳐 무작위 점 돌연변이를 화학적으로 유도하는 것으로 구성된다. 고속 중성자 돌연변이 유발은 종자를 이중 가닥 DNA 절단을 통해 큰 결실을 일으키는 중성자 충격에 노출시키는 것으로 구성된다. 트랜스포존 태깅은 유전자의 발현을 감소 또는 제거하기 위해 내인성 유전자 내에 트랜스포존을 삽입하는 것을 포함한다. 담배 유전자에 존재할 수 있는 돌연변이의 유형은 예를 들어, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 중복 및 역위를 포함한다. 이러한 돌연변이는 바람직하게는 담배 유전자의 코딩 영역에 존재하지만; 담배 유전자의 프로모터 영역 및 인트론, 또는 비번역 영역에 있는 돌연변이 또한 바람직할 수 있다.

또한, 변성 HPLC 또는 선별된 PCR 산물의 선택적 엔도뉴클레이스 분해를 사용하는 화학적으로 유도된 돌연변이를 스크리닝하기 위한 고속 및 자동화 방법인 게놈에서의 표적화 유도 국소 병변(Targeting Induced Local Lesions In Genome: TILLING)을 또한 본 개시내용에 적용할 수 있다. 문헌[McCallum et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457] 참조. 유전자 발현에 영향을 주거나 또는 유전자 기능을 방해하는 돌연변이는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 유전자 엑손 내의 삽입 돌연변이는 주로 널-돌연변이체를 생성한다. 보존된 잔기 내의 돌연변이는 특히 단백질의 기능을 저해하는데 효과적일 수 있다. 일 양태에서, 담배 식물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 PMT 유전자에 넌센스(예를 들어, 정지 코돈) 돌연변이를 포함한다.

돌연변이를 확인할 때, 내인성 참조 DNA 서열은 동일한 품종의 담배로부터 유래되는 것이어야 함을 이해할 것이다. 예를 들어, 돌연변이를 포함하는 변형된 담배 식물이 품종 TN90으로부터 유래된 경우, 내인성 참조 서열은 다른 담배 품종(예를 들어, K326)으로부터의 상동성 서열이 아닌 내인성 TN90 서열이어야 한다. 유사하게는, 돌연변이를 포함하는 변형된 담배 세포가 TN90 세포인 경우, 내인성 참조 서열은 다른 담배 품종(예를 들어, K326)으로부터의 담배 세포가 아닌 내인성 TN90 서열이어야 한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 또한 상업적으로 허용 가능한 잎 품질을 유지하면서 니코틴 수준이 변경된 담배 계통을 제공한다. 이러한 계통은 돌연변이를 정밀한 게놈 공학 기술, 예를 들어 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레이스(Transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 메가뉴클레이스, 아연 핑거 뉴클레이스 및 클러스터된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(clustered regularly-interspaced short palindromic repeat: CRISPR)/Cas9 시스템, CRISPR/Cpf1 시스템, CRISPR/Csm1 시스템 및 이들의 조합을 통해 하나 이상의 PMT 유전자에 도입함으로써 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 제2017/0233756호 참조). 예를 들어, 문헌[Gaj et al., Trends in Biotechnology, 31(7):397-405 (2013)] 참조.

돌연변이된 담배 식물의 스크리닝 및 선별은 당업자에게 알려진 임의의 방법을 통해 이루어질 수 있다. 스크리닝 및 선별 방법의 예는 서던 분석, 폴리뉴클레오타이드의 검출을 위한 PCR 증폭, 노던 블롯, RNase 보호, 프라이머-연장, RNA 전사체의 검출을 위한 RT-PCR 증폭, 생어 시퀀싱, 차세대 시퀀싱 기술(예를 들어, 일루미나(Illumina), 퍼시픽바이오(PacBio), Ion Torrent, 454), 효소 또는 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 검정 및 폴리펩타이드를 검출하기 위한 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯, 면역침강 및 효소-연결 면역검정을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 인 시투 혼성화, 효소 염색 및 면역 염색과 같은 다른 기법이 또한 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 존재 또는 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 참조된 모든 기술을 수행하는 방법은 공지되어 있다.

일 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 담배 식물 또는 식물 게놈은 메가뉴클레이스, 아연-핑거 뉴클레이스(ZFN), 전사 활성자-유사 효과기 뉴클레이스(TALEN), CRISPR/Cas9 뉴클레이스, CRISPR/Cpf1 뉴클레이스 또는 CRISPR/Csm1 뉴클레이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레이스에 의해 돌연변이되거나 편집된다.

본 명세서에서 사용되는 "편집" 또는 "게놈 편집"은 내인성 식물 게놈 핵산 서열의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오타이드의 표적 돌연변이 유발, 또는 내인성 식물 게놈 핵산 서열의 제거 또는 대체를 지칭한다. 일 양태에서, 제공되는 편집된 핵산 서열은 내인성 핵산 서열과 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는다. 일 양태에서, 제공되는 편집된 핵산 서열은 서열번호 1 내지 10 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 양태에서, 제공되는 편집된 핵산 서열은 서열번호 11 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 99.9%, 적어도 99.5%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 또는 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는다.

메가뉴클레이스, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9, CRISPR/Csm1 및 CRISPR/Cpf1은 이후에 상동 재조합(HR) 또는 비-상동성 말단-연결(NHEJ)의 천연 과정에 의해 복구되는, 게놈 서열의 표적 부위에의 이중 가닥 DNA 절단을 유도한다. 그런 다음, NHEJ의 경우 유전자 파괴를 초래하는 결실 또는 삽입, 또는 HR에 의한 공여체 핵산 서열의 통합을 포함할 수 있는, 절단된 부위에서의 서열 변형이 발생한다. 일 양태에서, 제공되는 방법은 공여체 폴리뉴클레오타이드와 함께 HR을 통해 게놈 식물에서 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개 또는 10개 이상의 뉴클레오타이드를 변형시키기 위해 제공되는 뉴클레이스와 편집 식물 게놈을 포함한다. 일 양태에서, 제공되는 돌연변이는 뉴클레이스를 사용하는 게놈 편집에 의해 발생한다. 다른 양태에서, 제공되는 돌연변이는 비-상동성 말단-연결 또는 상동 재조합에 의해 발생한다.

미생물에서 일반적으로 확인되는 메가뉴클레이스는 높은 활성 및 긴 인식 서열(14bp 초과)를 갖는 고유한 효소로, 표적 DNA의 부위-특이적 분해를 유발한다. 자연 발생적 메가뉴클레이스의 조작된 버전은 전형적으로 확장된 DNA 인식 서열(예를 들어, 14 내지 40bp)을 갖는다. 메가뉴클레이스의 DNA 인식 및 절단 기능이 단일 도메인에 밀접하게 관련되어 있기 때문에, 메가뉴클레이스의 조작은 ZFN 및 TALEN의 조작보다 더 어려울 수 있다. 고유한 서열을 인식하며 개선된 뉴클레이스 활성을 가지는 새로운 메가뉴클레이스 변이체를 생성하기 위해 특수화된 돌연변이 유발 및 고처리량 스크리닝 방법이 사용되었다.

ZFN은 FokI 제한 엔도뉴클레이스의 절단 도메인에 융합된 조작된 아연 핑거 DNA-결합 도메인으로 구성되는 합성 단백질이다. ZFN은 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 변형을 위해 이중 가닥 DNA의 거의 모든 신전부(stretch)를 절단하도록 설계될 수 있다. ZFN은 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작된 아연 핑거 어레이에 융합된 FokI 엔도뉴클레이스의 비-특이적 DNA 절단 도메인으로 구성된 단량체로부터 이량체를 형성한다.

ZFN의 DNA-결합 도메인은 전형적으로 3개 내지 4개의 아연-핑거 어레이로 구성된다. 표적 DNA에 대한 부위-특이적 결합에 기여하는 아연 핑거 ∞-헬릭스의 시작에 대해 -1, +2, +3 및 +6의 위치에 있는 아미노산은 특정 표적 서열에 맞게 변경 및 맞춤화될 수 있다. 다른 아미노산은 상이한 서열 특이성을 갖는 ZFN을 생성하기 위해 컨센서스 골격을 형성한다. ZFN에 대한 표적 서열을 선별하기 위한 규칙은 당업계에 공지되어 있다.

FokI 뉴클레이스 도메인은 DNA를 절단하기 위해 이량체화를 필요하기 때문에, 절단 부위의 반대쪽 DNA 가닥(5 내지 7bp로 분리됨)에 결합하기 위해서는 C-말단 영역이 있는 2개의 ZFN이 필요하다. ZFN 단량체는 2개의 ZF-결합 부위가 회문식(palindromic)인 경우, 표적 부위를 절단할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 ZFN은 광범위하며, 다른 ZFN의 도움 없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체 ZFN을 포함한다. 용어 ZFN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작용하도록 조작된 한 쌍의 ZFN 중 하나 또는 둘 모두의 구성원을 지칭하는데 사용된다.

임의의 과학적 이론에 제한되지 않고, 아연 핑거 도메인의 DNA-결합 특이성은 원칙적으로 다양한 방법 중 하나를 사용하여 재-조작될 수 있기 때문에, 이론적으로 거의 모든 유전자 서열을 표적으로 하는 맞춤형 ZFN을 구축할 수 있다. 아연 핑거 도메인을 조작하기 위해 공개적으로 사용 가능한 방법은 컨텍스트-의존적 어셈블리(Context-dependent Assembly: CoDA), 올리고머화된 혼주 조작(Oligomerized Pool Engineering: OPEN) 및 모듈식 어셈블리를 포함한다.

TALEN은 전사 활성자-유사 효과기(Transcription activator-like effector: TALE) DNA 결합 도메인을 FokI 뉴클레이스 도메인에 융합시킴으로써 생성되는 인공 제한 효소이다. TALEN 쌍의 각 구성원이 표적 부위 옆에 있는 DNA 부위에 결합하는 경우, FokI 단량체가 이량체화되어 표적 부위에서 이중 가닥 DNA 절단을 일으킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어 TALEN은 광범위하며, 다른 TALEN의 도움없이 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있는 단량체 TALEN을 포함한다. 용어 TALEN은 또한 동일한 부위에서 DNA를 절단하기 위해 함께 작용하는 한 쌍의 TALEN 중 하나 또는 둘 모두의 구성원을 지칭하는데 사용된다.

전사 활성자-유사 효과기(TALE)는 거의 모든 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. TALE 단백질은 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 다양한 식물 세균성 병원체로부터 유래되는 DNA-결합 도메인이다. 잔토모나스 병원체는 감염동안 숙주 식물 세포에 TALE을 분비한다. TALE은 핵으로 이동하여, 숙주 게놈에 있는 특정 유전자의 프로모터 영역에 있는 특정 DNA 서열의 프로모터 영역에 있는 특정 DNA 서열을 인식하고 이에 결합한다. TALE은 33 내지 34개의 아미노산의 13 내지 28개의 반복 단량체로 구성된 중앙 DNA-결합 도메인을 갖는다. 각 단량체의 아미노산은 12번 및 13번 위치의 초가변 아미노산 잔기를 제외하고는 고도로 보존된다. 2개의 가변 아미노산은 반복-가변 이잔기(repeat-variable diresidue: RVD)라 불린다. RVD의 아미노산 쌍 NI, NG, HD 및 NN은 각각 아데닌, 티민, 사이토신 및 구아닌/아데닌을 우선적으로 인식하며, RVD의 조절은 연속적인 DNA 염기를 인식할 수 있다. 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 이러한 간단한 관계는 적절한 RVD를 함유하는 반복 세그먼트의 조합을 선택함으로써 특정 DNA 결합 도메인의 조작을 가능하게 하였다,

야생형 FokI 절단 도메인 외에도, 돌연변이를 갖는 FokI 절단 도메인의 변이체가 절단 특이성 및 절단 활성이 개선되도록 설계되었다. FokI 도메인은 이량체로 기능하며, 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈의 부위에 대해 고유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구성체가 필요하다. TALEN DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수는 모두 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 매개변수이다.

아미노산 서열과 TALE 결합 도메인의 DNA 인식 사이의 관계는 단백질을 설계 가능하게 한다. DNA Works와 같은 소프트웨어 프로그램이 TALE 작제물을 설계하는데 사용될 수 있다. TALE 작제물을 설계하는 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 문헌[Doyle et al,. Nucleic Acids Research (2012) 40: W117-122.; Cermak et al., Nucleic Acids Research (2011). 39:e82] 및 tale-nt.cac.cornell.edu/about 참조.

CRISPR/Cas9 시스템, CRISPR/Csm1 또는 CRISPR/Cpf1 시스템은 FokI-기반 방법인 ZFN 및 TALEN에 대한 대안이다. CRISPR 시스템은 표적 부위에서 DNA 서열을 인식하기 위해 상보적 염기쌍을 사용하는 RNA-가이드된 조작된 뉴클레이스에 기초한다.

CRISPR/Cas9, CRISPR/Csm1 및 CRISPR/Cpf1 시스템은 세균 및 고세균의 적응 면역 시스템의 일부로, 서열-의존적 방식으로 외래 DNA를 절단함으로써 바이러스와 같은 침입 핵산으로부터 보호한다. 면역력은 CRISPR 유전자좌의 근위 말단에서 2개의 인접한 반복 사이의 스페이서로 알려진 침입 DNA의 짧은 단편의 통합에 의해 획득된다. 스페이서를 포함하는 CRISPR 어레이는 침입 DNA와의 후속 대면 동안 전사되고, 약 40nt 길이의 작은 방해 CRISPR RNA(crRNA)로 가공되며, 이는 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)와 결합하여 Cas9 뉴클레이스를 활성화하고 가이드한다. 이것은 침입 DNA에서 프로토스페이서로 알려진 상동성 이중 가닥 DNA 서열을 절단한다. 절단을 위한 필수 부위는 표적 DNA의 보존된 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 하류에 존재하며, 이는 주로 서열 5-NGG-3을 갖지만 덜 빈번하게는 NAG를 갖는다. 특이성은 RNA와 표적 DNA 간에 일치해야 하는 PAM의 대략 12개 염기 상류에 있는 소위 "시드 서열"에 의해 제공된다. Cpf1 및 Csm1은 Cas9와 유사한 방식으로 작용하지만, Cpf1 및 Csm1은 tracrRNA를 필요로 하지 않는다.

여전히 다른 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하며, 니코틴 데메틸레이스를 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에 하나 이상의 돌연변이가 없는 대조군 식물과 비교하여, 감소된 양의 노르니코틴을 부여하는 니코틴 데메틸레이스를 암호화하는 하나 이상의 유전자좌에 있는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, CYP82E4, CYP82E5, CYP82E10)를 더 포함한다(미국 특허 제8,319,011호; 제8,124,851호; 제9,187,759호; 제9,228,194호; 제9,228,195호; 제9,247,706호 참조). 일 양태에서, 기재된 담배 식물은 유사한 조건하에 성장 및 건조될 때 대조군 식물과 비교하여 감소된 니코틴 데메틸레이스 활성을 더 포함한다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 야생형 대조군 담배 식물로부터의 잎의 아나바신 수준보다 적은 아나바신 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는 돌연변이를 더 포함한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 야생형 대조군 담배 식물로부터의 잎의 아나바신 수준의 5% 미만, 10% 미만, 20% 미만, 25% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만 또는 80% 미만의 아나바신 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 대조군 담배 식물로부터의 잎과 비교하여 2배 초과 감소된 아나타빈 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는 추가의 돌연변이를 포함한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 야생형 대조군 담배 식물로부터의 잎과 비교하여 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배 또는 13배 초과 감소된 아나타빈 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는 추가의 돌연변이를 포함한다. 일 양태에서, 더 낮은 수준의 아나타빈을 제공하는 돌연변이는 미국 공개 제2014/0283165호 및 미국 공개 제2016/0010103호에 기재된 돌연변이이다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체는 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼레이스(quinolate phosphoribosyl transferase: QPT) 또는 퀴놀리네이트 신테이스(quinolinate synthase: QS) 유전자에 돌연변이를 더 포함한다. 또 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 식물은 QPT 또는 QS 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 이식유전자 또는 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 야생형 대조군 담배 식물로부터의 잎의 노르니코틴 수준의 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만 또는 35% 미만의 노르니코틴 수준을 제공할 수 있는 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 2ppm 미만, 1.9ppm 미만, 1.8ppm 미만, 1.7ppm 미만, 1.6ppm 미만, 1.5ppm 미만, 1.4ppm 미만, 1.3ppm 미만, 1.2ppm 미만, 1.1ppm 미만, 1.0ppm 미만, 0.9ppm 미만, 0.8ppm 미만, 0.7ppm 미만, 0.6ppm 미만, 0.5ppm 미만, 0.4ppm 미만, 0.3ppm 미만, 0.2ppm 미만, 0.15ppm 미만, 0.1ppm 미만 또는 0.05ppm 미만의 총 N-니트로소노르니코틴(N-nitrosonornicotine: NNN) 수준을 포함하는 건조된 잎을 생산할 수 있다.

다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 2 내지 0.05ppm, 1.9 내지 0.05ppm, 1.8 내지 0.05ppm, 1.7 내지 0.05ppm, 1.6 내지 0.05ppm, 1.5 내지 0.05ppm, 1.4 내지 0.05ppm, 1.3 내지 0.05ppm, 1.2 내지 0.05ppm, 1.1 내지 0.05ppm, 1.0 내지 0.05ppm, 0.9 내지 0.05ppm, 0.8 내지 0.05ppm, 0.7 내지 0.05ppm, 0.6 내지 0.05ppm, 0.5 내지 0.05ppm, 0.4 내지 0.05ppm, 0.3 내지 0.05ppm, 0.2 내지 0.05ppm, 0.15 내지 0.05ppm, 또는 0.1 내지 0.05ppm(백만분의 일)의 총 NNN 수준을 포함하는 건조된 잎을 제공할 수 있다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 2ppm 미만, 1.9ppm 미만, 1.8ppm 미만, 1.7ppm 미만, 1.6ppm 미만, 1.5ppm 미만, 1.4ppm 미만, 1.3ppm 미만, 1.2ppm 미만, 1.1ppm 미만, 1.0ppm 미만, 0.9ppm 미만, 0.8ppm 미만, 0.7ppm 미만, 0.6ppm 미만, 0.5ppm 미만, 0.4ppm 미만, 0.3ppm 미만, 0.2ppm 미만, 0.15ppm 미만, 0.1ppm 미만 또는 0.05ppm 미만의 총 니코틴-유래 니트로사민 케톤(nicotine-derived nitrosamine ketone: NNK) 수준을 포함하는 건조된 잎을 생산할 수 있다.

다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 2 내지 0.05ppm, 1.9 내지 0.05ppm, 1.8 내지 0.05ppm, 1.7 내지 0.05ppm, 1.6 내지 0.05ppm, 1.5 내지 0.05ppm, 1.4 내지 0.05ppm, 1.3 내지 0.05ppm, 1.2 내지 0.05ppm, 1.1 내지 0.05ppm, 1.0 내지 0.05ppm, 0.9 내지 0.05ppm, 0.8 내지 0.05ppm, 0.7 내지 0.05ppm, 0.6 내지 0.05ppm, 0.5 내지 0.05ppm, 0.4 내지 0.05ppm, 0.3 내지 0.05ppm, 0.2 내지 0.05ppm, 0.15 내지 0.05ppm 또는 0.1 내지 0.05ppm의 총 NNK 수준을 포함하는 건조된 잎을 생산할 수 있다.

일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 하나 이상의 항산화제의 증가된 수준을 제공하는 돌연변이 또는 이식유전자를 더 포함한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 내인성 유전자에 유전자 변형을 더 포함하고, 유전자 변형이 없는 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 건조된 잎에서 하나 이상의 항산화제의 증가된 수준을 더 포함하며, 여기서 내인성 유전자는 항산화제 생합성 효소, 항산화제의 조절 전사 인자, 항산화제 수송자, 항산화제 대사 효소 또는 이들의 조합을 암호화한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 이식유전자를 더 포함하고, 이식유전자가 없는 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 건조된 잎에서 하나 이상의 항산화제의 증가된 수준을 더 포함하며, 여기서 이식유전자는 항산화제 생합성 효소, 항산화제의 조절 전사 인자, 항산화제 수송자, 항산화제 대사 효소 또는 이들의 조합을 암호화하거나 또는 직접 조절한다. 일 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 AtPAP1, NtAN2, NtAN1, NtJAF13, NtMyb3, 코리스메이트 뮤테이스 및 아로게네이트 데하이드로테이스(arogenate dehydrotase: ADT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 발현하는 이식유전자 또는 동종 유전자 작제물을 더 포함한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 항산화제를 증가시키거나 또는 WIPO 공개 제2018/067985호 또는 미국 공개 제2018/0119163호에 기재된 바와 같은 하나 이상의 TSNA를 감소시키기 위한 하나 이상의 이식유전자 또는 유전자 변형을 더 포함한다.

일 양태에서, 기재된 담배 식물은 변형된 담배 식물이다. 식물의 맥락에서, 본 명세서에서 사용되는 "변형된(modified)"은 소정의 목적을 위해 그리고 천연의 다형성을 넘어서는 도입된 유전적 변화를 포함하는 식물을 지칭한다.

일 양태에서, 기재된 담배 식물은 동종 유전자 식물이다. 본 명세서에서 사용되는 "동종기원(cisgenesis)" 또는 "동종 유전자(cisgenic)"는 모든 구성성분(예를 들어, 프로모터, 공여체 핵산, 선별 유전자)이 식물 기원(즉, 비-식물 기원의 구성성분이 사용되지 않음)만을 갖는 식물, 식물 세포 또는 식물 게놈의 유전자 변형을 지칭한다. 일 양태에서, 제공되는 식물, 식물 세포 또는 식물 게놈은 동종 유전자이다. 제공되는 동종 유전자 식물, 식물 세포 및 식물 게놈은 즉시 사용 가능한(ready-to-use) 담배 계통으로 이어질 수 있다. 다른 양태에서, 제공되는 담배 식물은 비-담배 유전자 물질 또는 서열을 포함하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자 발현" 또는 유전자의 발현은 유전자 산물의 전사 및/또는 번역을 포함하는 유전자 산물의 생합성 또는 생산을 지칭한다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하고, 니코틴 생합성 또는 수송에 관련된 하나 이상의 유전자의 감소된 발현 또는 활성을 더 포함한다. 니코틴 생합성에 관련된 유전자는 아르기닌 데카복실레이스(arginine decarboxylase: ADC), 메틸푸트레신 옥시데이스(methylputrescine oxidase: MPO), NADH 데하이드로게네이스, 오르니틴 데카복실레이스(ornithine decarboxylase: ODC), 포스포리보실안트라닐레이트 아이소머레이스(phosphoribosylanthranilate isomerase: PRAI), 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼레이스(quinolate phosphoribosyl transferase: QPT) 및 S-아데노실-메티오닌 신테테이스(S-adenosyl-methionine synthetase: SAMS)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 니코틴산 유도체와 메틸피롤리늄 양이온 사이의 축합 단계를 촉매하는 니코틴 신테이스는 두 개의 후보 유전자(A622 및 NBB1)가 제안되었지만 아직 밝혀지지 않았다. US 2007/0240728A1 및 US 2008/0120737A1를 참조. A622는 아이소플라본 리덕테이스-유사 단백질을 암호화한다. 또한, 여러 수송자가 니코틴의 전위에 관련될 수 있다. MATE라는 수송자 유전자가 클로닝되고 특성화되었다(문헌[Morita et al., PNAS 106:2447-52 (2009)]).

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하고, 대조군 담배 식물과 비교하여 MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택되는 생성물을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 mRNA, 단백질 또는 둘 모두의 감소된 수준을 더 포함한다. 다른 양태에서, 제공되는 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하고, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택되는 생성물을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 직접 억제하는 이식유전자를 더 포함한다. 다른 양태에서, 제공되는 담배 식물은 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하고, MPO, QPT, ADC, ODC, PRAI, SAMS, BBL, MATE, A622 및 NBB1로 이루어진 군으로부터 선택되는 생성물을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 이식유전자 또는 돌연변이를 더 포함한다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 철관-건조(flue-cured) 담배, 그늘-건조("음건")(air-cured) 담배, 음지 그늘-건조(dark air-cured) 담배, 훈증종담배(dark fire-cured tobacco), 갈파오 담배(Galpao tobacco) 및 오리엔탈 담배(Oriental tobacco)로 이루어진 군으로부터 선택되는 담배 유형으로부터 유래된다. 다른 양태에서, 제공되는 담배 식물은 벌리 담배, 메릴랜드(Maryland) 담배 및 다크(dark) 담배로 이루어진 군으로부터 선택되는 담배 유형으로부터 유래된다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 철관-건조 담배 배경에 있거나 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 철관-건조 담배 특징을 나타낸다. 철관-건조 담배(버니지아(Virginia) 또는 브라이트 담배라고도 함)는 세계 담배 생산량의 대략 40%에 이른다. 철관-건조 담배는 또한 건조 중에 도달하는 황금색에서 진한 오렌지색으로 인해 종종 "브라이트 담배(bright tobacco)"로도 지칭된다. 철관-건조 담배는 가볍고 밝은 향과 맛이 있다. 철관-건조 담배는 일반적으로 당 함량은 높고 오일 함량은 적다. 주요 철관-건조 담배 재배 국가는 아르헨티나, 브라질, 중국, 인도, 탄자니아 및 미국이다. 일 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 CC 13, CC 27, CC 33, CC 37, CC 65, CC 67, CC 700, GF 318, GL 338, GL 368, GL 939, K 346, K 399, K326, NC 102, NC 196, NC 291, NC 297, NC 299, NC 471, NC 55, NC 606, NC 71, NC 72, NC 92, PVH 1118, PVH 1452, PVH 2110, SPEIGHT 168, SPEIGHT 220, SPEIGHT 225, SPEIGHT 227, SPEIGHT 236 및 전술한 품종 중 어느 하나로부터 본질적으로 유래되는 임의의 품종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 철관-건조 담배 배경에 있다. 다른 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 Coker 48, Coker 176, Coker 371-Gold, Coker 319, Coker 347, GL 939, K 149, K326, K 340, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, NC 27NF, NC 37NF, NC 55, NC 60, NC 71, NC 72, NC 82, NC 95, NC 297, NC 606, NC 729, NC 2326, McNair 373, McNair 944, Ox 207, Ox 414 NF, Reams 126, Reams 713, Reams 744, RG 8, RG 11, RG 13, RG 17, RG 22, RG 81, RG H4, RG H51, Speight H-20, Speight G-28, Speight G-58, Speight G-70, Speight G-108, Speight G-l11, Speight G-l17, Speight 168, Speight 179, Speight NF-3, Va 116, Va 182 및 전술한 품종 중 어느 하나로부터 본질적으로 유래되는 임의의 품종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 철관-건조 담배 배경에 있다. WO 2004/041006 A1 참조. 또 다른 양태에서, 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물, 종자, 잡종, 품종 또는 계통은 K326, K346 및 NC196으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 철관 건조 배경에 있다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 그늘-건조 담배 배경에 있거나 또는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 그늘-건조 담배 특징을 나타낸다. 그늘-건조 담배는 벌리, 메릴랜드 및 다크 담배를 포함한다. 일반적인 요인은 건조가 주로 인공적인 열과 습기의 원천이 없다는 것이다. 벌리 담배는 밝은 갈색에서 어두운 갈색으로, 오일 함량은 높고 당 함량은 낮다. 벌리 담배는 헛간에서 그늘-건조된다. 주요 벌리 재배 국가는 아르헨티나, 브라질, 이탈리아, 말라위 및 미국이다. 메릴랜드 담배는 매우 푹신하고, 타는 특성이 좋으며, 니코틴이 낮고 및 중성적인 향이 있다. 주요 메릴랜드 재배 국가는 미국 및 이탈리아를 포함한다. 일 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 Clay 402, Clay 403, Clay 502, Ky 14, Ky 907, Ky 910, Ky 8959, NC 2, NC 3, NC 4, NC 5, NC 2000, Tn 86, Tn 90, Tn 97, R 610, R 630, R 711, R 712, NCBH 129, Bu 21ХKy 10, HB04P, Ky 14ХL 8, Kt 200, Newton 98, Pedigo 561, Pf561 및 V509로 이루어진 군으로부터 선택되는 벌리 담배 배경에 있다. 또 다른 양태에서, 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물, 종자, 잡종, 품종 또는 계통은 TN 90, KT 209, KT 206, KT212 및 HB 4488로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 벌리 배경에 있다. 다른 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 Md 10, Md 40, Md 201, Md 609, Md 872 및 Md 341로 이루어진 군으로부터 선택되는 메릴랜드 담배 배경에 있다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 음지 그늘-건조 담배 배경에 있거나 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 음지 그늘-건조 담배 특징을 나타낸다. 음지 그늘-건조 담배는 음지 그늘-건조 담배에 중간 내지 어두운 갈색과 뚜렷한 향을 주는 건조 과정에 의해 다른 유형과 구분된다. 음지 그늘-건조 담배는 씹는 담배 및 코담배의 생산에 주로 사용된다. 일 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 수마트라, 자팀, 도미니카 쿠바노, 베수키, 원 서커, 그린 리버, 버니지아 태양-건조 및 파라구앙 퍼사도로 이루어진 군으로부터 선택되는 음지 그늘-건조 담배 배경에 있다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 훈증종담배 배경에 있거나 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 훈증종담배 특징을 나타낸다. 훈증종담배는 일반적으로 밀폐된 건조 헛간의 바닥에서 낮은 연소성 장작불로 건조된다. 이들의 잎은 당 함량은 낮지만 니코틴 함량은 높다. 훈증종담배는 파이프 블렌드, 궐련, 씹는 담배, 코담배 및 강한 맛의 시가를 제조하기 위해 사용된다. 훈증종담배의 주요 재배 지역은 미국 켄터키주 테네시와 버니지아주이다. 일 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 Narrow Leaf Madole, Improved Madole, Tom Rosson Madole, Newton's VH Madole, Little Crittenden, green Wood, Little Wood, Small Stalk Black Mammoth, DT 508, DT 518, DT 592, KY 171, DF 911, DF 485, TN D94, TN D950, VA 309 및 VA 359로 이루어진 군으로부터 선택되는 훈증종담배 배경에 있다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 오리엔탈 담배 배경에 있거나 또는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 오리엔탈 담배 특징을 나타낸다. 오리엔탈 담배는 또한 전형적으로 터키, 그리스, 불가리아, 마케도니아, 시리아, 레바논, 이탈리아 및 루마니아와 같은 지중해 동부 지역에서 재배된다는 사실로 인해 그리스, 아로마 및 터키 담배로도 칭해진다. 오늘날 오리엔탈 품종의 특징인 작은 식물 및 잎 크기뿐만 아니라 고유한 향기 특성은 지난 수세기 동안 발전한 열악한 토양과 스트레스가 많은 기후 조건에 식물이 적응한 결과이다. 일 양태에서, 제공되는 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물 또는 종자는 Izmir, Katerini, Samsun, Basma 및 Krumovgrad, Trabzon, Thesalian, Tasova, Sinop, Izmit, Hendek, Edirne, Semdinli, Adiyanman, Yayladag, Iskenderun, Duzce, Macedonian, Mavra, Prilep, Bafra, Bursa, Bucak, Bitlis, Balikesir 및 전술한 품종 중 어느 하나로부터 본질적으로 유래되는 임의의 품종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 오리엔탈 담배 배경에 있다.

일 양태에서, 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물, 종자, 잡종, 품종, 또는 계통은 BU 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CU 263, DF911, Galpao tobacco, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14 x L8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, 'Perique' tobacco, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR(Tom Rosson) Madole, VA 309, 또는 VA359, Maryland 609, HB3307PLC, HB4488PLC, KT206LC, KT209LC, KT210LC, KT212LC, R610LC, PVH2310, NC196, KTD14LC, KTD6LC, KTD8LC, PD7302LC, PD7305LC, PD7309LC, PD7318LC, PD7319LC, PD7312LC, ShireyLC 또는 당업계에 공지된 표준 담배 육종 기법에 따른 임의의 상업적 담배 품종으로부터 본질적으로 유래되거나 또는 이들의 유전적 배경에 있다.

앞서 언급한 모든 특정 품종의 음지 그늘-건조, 벌리, 메릴랜드, 음지 열-건조 또는 오리엔탈 유형은 예시적인 목적으로만 열거된다. 임의의 추가적인 음지 그늘-건조, 벌리, 메릴랜드, 음지 열-건조, 오리엔탈 품종도 또한 본 발명에서 상정된다.

또한, 기재된 담배 식물의 개체군이 제공된다. 일 양태에서, 담배 식물의 개체군은 에이커당 약 5,000 내지 약 8000개, 약 5,000 내지 약 7,600개, 약 5,000 내지 약 7,200개, 약 5,000 내지 약 6,800개, 약 5,000 내지 약 6,400개, 약 5,000 내지 약 6,000개, 약 5,000 내지 약 5,600개, 약 5,000 내지 약 5,200개, 약 5,200 내지 약 8,000개, 약 5,600 내지 약 8,000개, 약 6,000 내지 약 8,000개, 약 6,400 내지 약 8,000개, 약 6,800 내지 약 8,000개, 약 7,200 내지 약 8,000개 또는 약 7,600 내지 약 8,000개의 식물의 식재 밀도를 갖는다. 다른 양태에서, 담배 식물의 개체군은 비옥도가 낮거나 중간인 토양 유형이다.

또한, 기재된 담배 식물로부터의 종자의 용기도 제공된다. 본 개시내용의 담배 종자의 용기는 임의의 수, 무게 또는 부피의 종자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기는 적어도 또는 약 100개 초과, 200개 초과, 300개 초과, 400개 초과, 500개 초과, 600개 초과, 700개 초과, 800개 초과, 900개 초과, 1000개 초과, 1500개 초과, 2000개 초과, 2500개 초과, 3000개 초과, 3500개 초과, 4000개 초과 또는 그 이상의 종자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 용기는 적어도 또는 약 1 온스 초과, 5 온스 초과, 10 온스 초과, 1 파운드 초과, 2 파운드 초과, 3 파운드 초과, 4 파운드 초과, 5 파운드 초과 또는 그 이상의 종자를 포함할 수 있다. 담배 종자의 용기는 당업계에서 이용 가능한 임의의 용기일 수 있다. 비-제한적 예로서, 용기는 박스, 백, 포켓, 파우치, 테이프 롤, 튜브 또는 보틀일 수 있다.

또한, 기재된 저-알칼로이드 또는 저-니코틴 담배 식물로부터 제조되는 건조된 담배 재료가 제공된다. 총 알칼로이드 또는 니코틴 수준이 높은 기재된 담배 식물로부터 제조되는 건조된 담배 재료가 더 제공된다.

"건조하는(Curing)"은 수분을 감소시키고 엽록소를 파괴하여 담배 잎을 황금색으로 만들고 전분이 당으로 전환되는 노화 과정이다. 따라서, 건조된 담배는 수확된 녹색 잎에 비해 환원당 함량은 높고 전분 함량은 낮다. 일 양태에서, 제공되는 녹색 잎 담배는 종래의 수단, 예를 들어 철관-건조, 헛간-건조(barn-cured), 화건(fire-cured), 그늘-건조 또는 태양-건조를 사용하여 건조될 수 있다. 예를 들어, 상이한 유형의 건조 방법의 설명을 위해 문헌[Tso(1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford)] 참조. 건조된 담배는 주로 10% 내지 약 25% 범위의 수분 함량으로 수 년(예를 들어, 2년 내지 5년) 동안 압축된 상태로 나무 드럼(예를 들어, 큰 통(hogshead)) 또는 판지 상자에서 숙성된다. 미국 특허 제4,516,590호 및 제5,372,14호 참조. 그런 다음, 건조되고 숙성된 담배는 추가로 가공될 수 있다. 추가 가공은 다양한 온도, 저온 살균 및 발효에서 증기를 도입하거나 사용하지 않고 진공하에 담배를 컨디셔닝하는 것을 포함한다. 발효는 전형적으로 높은 초기 수분 함량, 열 생성 및 건조 중량의 10% 내지 20%의 손실을 특징으로 한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,528,993호, 제4,660,577호, 제4,848,373호, 제5,372,149호; 미국 공개 제2005/0178398호; 문헌[Tso(1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford)] 참조. 건조, 숙성 및 발효된 담배는 추가로 가공될 수 있다(예를 들어, 절단(cut), 파쇄(shredded), 팽화(expanded) 또는 혼합(blended)). 예를 들어, 미국 특허 제4,528,993호; 제4,660,577호; 및 제4,987,907호 참조. 일 양태에서, 본 개시내용의 건조된 담배 재료는 태양-건조된다. 다른 양태에서, 본 개시내용의 건조된 담배 재료는 철관-건조, 그늘-건조 또는 화건된다.

건조된 담배 상에 곰팡이의 존재는 건조된 잎의 품질 및 시장성(예를 들어, 잎의 등급)을 현저하게 감소시킬 수 있다. 곰팡이의 성장은 대략 10℃(50℉) 내지 32.2℃(90℉)의 온도에서 장기간의 높은 습도(예를 들어, 70% 초과의 상대 습도) 동안 발생할 수 있는 일반적인 문제이다. 곰팡이는 고온에서 더 많이 발생하는 경향이 있다.

1개 이상의 PMT 유전자, 2개 이상의 PMT 유전자, 3개 이상의 PMT 유전자, 4개 이상의 PMT 유전자 또는 5개의 PMT 유전자에 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 본 명세서에서 제공되는 담배 식물, 품종 및 계통은 저 알칼로이드 담배 품종 LA 벌리 21(LA BU 21)과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 나타낸다. 유사하게는, 1개 이상의 PMT 유전자, 2개 이상의 PMT 유전자, 3개 이상의 PMT 유전자, 4개 이상의 PMT 유전자 또는 5개의 PMT 유전자의 발현 또는 번역을 하향조절하는 RNAi 작제물을 포함하는 본 명세서에 제공되는 담배 식물, 품종 및 계통은 저 알칼로이드 담배 품종 LA 벌리 21(LA BU 21)과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 나타낸다.

LA BU 21은 쿠바산 시가 품종으로부터의 저 알칼로이드 유전자(들)를 여러 번의 역교배를 통해 혼입함으로써 생산되는 낮은 총 알칼로이드 담배 계통이다(문헌[Legg et al.,　Crop Science,　10:212 (1970)]). 이는 모(parent)인 벌리 21의 약 3.5%(건조 중량)와 비교하여 대략 0.2% 총 알칼로이드(건조 중량)를 가지고 있다. LA BU 21은 상업적으로 허용 가능한 표준보다 훨씬 낮은 잎의 등급을 가지고 있다.

일 양태에서, pmt1a의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, pmt1b의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, pmt2의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, pmt3의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, pmt4의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, pmt1a의 돌연변이체 대립유전자, pmt1b의 돌연변이체 대립유전자, pmt2의 돌연변이체 대립유전자, pmt3의 돌연변이체 대립유전자 및 pmt4의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다.

일 양태에서, pmt1a의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다. 다른 양태에서, pmt1b의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다. 다른 양태에서, pmt2의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다. 다른 양태에서, pmt3의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다. 다른 양태에서, pmt4의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다. 다른 양태에서, pmt1a의 돌연변이체 대립유전자, pmt1b의 돌연변이체 대립유전자, pmt2의 돌연변이체 대립유전자, pmt3의 돌연변이체 대립유전자 및 pmt4의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다.

일 양태에서, 표 4A 내지 표 4E, 표 10 또는 표 14 중 어느 하나에 제공되는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 표 4A 내지 표 4E, 표 10 또는 표 14 중 어느 하나에 제공되는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 담배 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다.

일 양태에서, 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E 중 어느 하나에 제공되는 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 관찰 가능한 곰팡이 감염을 포함하지 않는다. 다른 양태에서, 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E 중 어느 하나에 제공되는 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎과 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 포함한다.

pmt1a의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다. 일 양태에서, pmt1b의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다. 일 양태에서, pmt2의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다. 일 양태에서, pmt3의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다. 일 양태에서, pmt4의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다. 다른 양태에서, pmt1a의 돌연변이체 대립유전자, pmt1b의 돌연변이체 대립유전자, pmt2의 돌연변이체 대립유전자, pmt3의 돌연변이체 대립유전자 및 pmt4의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 담배 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다.

일 양태에서, 표 4A 내지 표 4E, 표 10, 또는 표 14 중 어느 하나에 제공되는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다

일 양태에서, 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E 중 어느 하나에 제공되는 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하는 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터의 건조된 잎은 품종 LA BU 21로부터의 대조군의 건조된 잎보다 높은 잎의 등급을 포함한다.

일 양태에서, "감소된 곰팡이 감염"은 감염된 잎의 감소된 면적을 지칭한다. 다른 양태에서, "감소된 곰팡이 감염"은 감염된 잎에서 감소된 수의 생존 가능한 곰팡이 포자를 지칭한다. 생존 가능한 곰팡이 포자를 검출 및 계수하는 표준 방법은 공지되어 있으며, 당업계에서 이용 가능하다.

일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 1%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 2%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 3%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 4%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 5%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 10%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 15%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 20%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 25%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 30%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 35%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 40%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 50%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 60%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 70%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 75%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 80%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 90%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 적어도 95%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다.

일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 90%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 80%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 70%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 60%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 50%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 40%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 30%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 20%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 1% 내지 10%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 10% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 20% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 30% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 40% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 50% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 60% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 70% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 80% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 90% 내지 100%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 10% 내지 75%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 25% 내지 75%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다. 일 양태에서, 감소된 곰팡이 감염은 대조군 잎과 비교하여 25% 내지 50%의 감염된 잎 면적의 감소를 포함한다.

일 양태에서, 곰팡이 감염 건조 담배는 클라도스포리움(Cladosporium), 페니실리움(Penicillium), 알테르나리아(Alternaria), 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 무코(Mucor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 것이다.

본 개시내용의 담배 계통, 품종 또는 잡종으로부터 수득된 담배 재료는 담배 제품을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "담배 제품"은 사람이 사용하거나 소비하도록 의도된 담배에서 제조되거나 이로부터 유래된 모든 제품으로 정의된다.

제공되는 담배 제품은 제한 없이, 궐련 제품(예를 들어, 궐련 및 비디 궐련(bidi cigarette)), 시가 제품(예를 들어, 시가 래핑 담배 및 시가릴로(cigarillo)), 파이프 담배 제품, 담배로부터 유래되는 제품, 담배-유래 니코틴 제품, 무연 담배 제품(예를 들어, 습식 코담배, 건식 코담배 및 씹는 담배), 필름, 츄어블, 탭, 성형 부품, 겔, 소모성 유닛, 불용성 매트릭스, 속이 빈 모양, 재생 담배, 팽화 담배 등을 포함한다. 예를 들어, 미국 공개 US 2006/0191548 참조.

본 명세서에서 사용되는 "궐련(cigarette)"은 "막대(rod)" 및 "충전제(filler)"를 갖는 담배 제품을 지칭한다. 궐련 "막대"는 궐련지, 필터, 플러그 랩(여과 물질을 포함하는데 사용됨), 궐련지(충전제를 포함)를 필터에 고정하는 티핑 페이퍼 및 이러한 구성요소를 함께 고정하는 모든 접착제를 포함한다. "충전제"는 (1) 재생 및 팽화 담배를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 모든 담배, (2) 비-담배 대용품(궐련지에 말아서 담배를 피울 수 있는 허브, 비-담배 식물 재료 및 기타 향료를 포함하지만 이들로 제한되지 않음), (3) 케이싱, (4) 풍미료 및 (5) 기타 모든 첨가제(담배 및 대용품에 섞어 궐련에 말아 넣는 것)를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "재생 담배(reconstituted tobacco)"는 담배 먼지 및 다른 담배 스크랩 재료로 제조되고, 시트 형태로 가공되며, 담배와 유사한 스트립으로 절단된 담배 충전제의 일부를 지칭한다. 비용 절감 외에도, 재생 담배는 암모니아와 당 사이의 반응을 사용하여 풍미 개발을 처리함으로써 궐련 맛에 기여한다는 점에서 매우 중요하다.

본 명세서에서 사용되는 "팽화 담배(expanded tobacco)"는 적절한 가스의 팽창을 통해 처리되어 담배가 "부풀어"지면서 밀도가 감소되고 충전 용량이 더 커지는 담배 충전제의 일부를 지칭한다. 이는 궐련에 사용되는 담배의 무게를 줄인다.

본 개시내용의 식물로부터 유래되는 담배 제품은 또한 궐련 및 기타 흡연 물품, 특히 필터 요소를 포함하는 흡연 물품을 포함하며, 여기서 흡연 가능한 재료의 막대는 담배 블렌드 내에 건조된 담배를 포함한다. 일 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 시가릴로, 비-통기 리세스 필터 궐련(non-ventilated recess filter cigarette), 통기 리세스 필터 궐련(vented recess filter cigarette), 시가(cigar), 코담배(snuff), 파이프 담배(pipe tobacco), 시가 담배(cigar tobacco), 궐련 담배(cigarette tobacco), 씹는 담배(chewing tobacco), 잎 담배(leaf tobacco), 물담배(hookah tobacco), 각초(shredded tobacco) 및 절단 담배(cut tobacco)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 무연 담배 제품이다. 무연 담배 제품은 연소되지 않으며, 씹는 담배, 습식 무연 담배, 스누스(snus) 및 건식 코담배를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 씹는 담배는 전형적으로 큰-파우치형 패키지에 포장되어 플러그식 또는 트위스트식으로 사용되는 굵게 분할된 담배 잎이다. 습식 무연 담배는 성긴 형태 또는 파우치 형태로 제공되며, 전형적으로 둥근 캔에 패키지되어 끼워서 사용하거나 성인 담배 소비자의 볼과 잇몸 사이에 놓이는 파우치로 사용되는 습식의, 더 미세하게 분할된 담배이다. 스누스는 열 처리된 무연 담배이다. 건식 코담배는 입에 넣거나 비강으로 사용되는 미세하게 분쇄된 담배이다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 루스 리프식 씹는 담배, 플러그식 씹는 담배, 습식 코담배 및 비강 코담배로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 전자 가열 궐련, e-궐련, 전자 흡연 장치로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 블렌드된 담배 제품일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 저 니코틴 담배 제품일 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용의 담배 제품은 약 3 ㎎/g 미만의 수준으로 노르니코틴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 제품 내의 노르니코틴 함량은 3.0 ㎎/g, 2.5 ㎎/g, 2.0 ㎎/g, 1.5 ㎎/g, 1.0 ㎎/g, 750 ㎍/g, 500 pg/g, 250 pg/g, 100 pg/g, 75 pg/g, 50 pg/g, 25 pg/g, 10 pg/g, 7.0 pg/g, 5.0 pg/g, 4.0 pg/g, 2.0 pg/g, 1.0 pg/g, 0.5 pg/g, 0.4 pg/g, 0.2 pg/g, 0.1 pg/g, 0.05 pg/g, 0.01 pg/g이거나 또는 검출 불가능할 수 있다.

일 양태에서, 제공되는 건조된 담배 재료 또는 담배 제품은 건조 중량 기준으로 약 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.75%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 및 9%로 이루어진 군으로부터 선택되는 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 다른 양태에서, 제공되는 건조된 담배 재료 또는 담배 제품은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.02%, 0.02% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.75%, 0.75% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.15%, 0.15% 내지 0.2%, 0.2% 내지 0.3%, 0.3% 내지 0.35%, 0.35% 내지 0.4%, 0.4% 내지 0.5%, 0.5% 내지 0.6%, 0.6% 내지 0.7%, 0.7% 내지 0.8%, 0.8% 내지 0.9%, 0.9% 내지 1%, 1% 내지 1.1%, 1.1% 내지 1.2%, 1.2% 내지 1.3%, 1.3% 내지 1.4%, 1.4% 내지 1.5%, 1.5% 내지 1.6%, 1.6% 내지 1.7%, 1.7% 내지 1.8%, 1.8% 내지 1.9%, 1.9% 내지 2%, 2% 내지 2.1%, 2.1% 내지 2.2%, 2.2% 내지 2.3%, 2.3% 내지 2.4%, 2.4% 내지 2.5%, 2.5% 내지 2.6%, 2.6% 내지 2.7%, 2.7% 내지 2.8%, 2.8% 내지 2.9%, 2.9% 내지 3%, 3% 내지 3.1%, 3.1% 내지 3.2%, 3.2% 내지 3.3%, 3.3% 내지 3.4%, 3.4% 내지 3.5% 내지 3.5% 내지 3.6%로 이루어진 군으로부터 선택되는 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제공되는 건조된 담배 재료 또는 담배 제품은 건조 중량 기준으로 약 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.2%, 0.03% 내지 0.3%, 0.04% 내지 0.4%, 0.05% 내지 0.5%, 0.75% 내지 1%, 0.1% 내지 1.5%, 0.15% 내지 2%, 0.2% 내지 3% 내지 0.3% 내지 3.5%로 이루어진 군으로부터 선택되는 평균 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함한다.

본 개시내용은 또한 목적하는 수준의 총 알칼로이드 또는 니코틴, 예를 들어 저 니코틴을 포함하거나 또는 니코틴이 없는 담배 계통, 재배종 또는 품종을 육종하는 방법을 제공한다. 육종은 임의의 공지된 절차를 통해 수행될 수 있다. DNA 핑거프린팅, SNP 매핑, 1배체형(haplotype) 매핑 또는 유사 기술이 목적하는 형질 또는 대립유전자룰 담배 식물로 전달하거나 육종하기 위해 마커-보조 선별(marker-assisted selection: MAS) 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들어, 육종자는 F1 잡종 식물을 사용하여 F₂또는 역교배 세대에서 분리 개체군을 생성하거나, 또는 F1 잡종 식물을 농경학적으로 바람직한 유전자형을 갖는 다른 공여체 식물과 추가로 교배할 수 있다. F₂ 또는 역교배 세대의 식물은 당업계에 공지되거나 본 명세서에 열거된 기법 중 하나를 사용하여 바람직한 농경학적 형질 또는 바람직한 화학적 프로파일에 대해 스크리닝될 수 있다. 예상되는 유전 패턴 또는 사용되는 MAS 기술에 따라, 목적하는 개별 식물의 확인을 돕기 위해 역교배의 각 주기 전에 선택된 식물의 자가-수분이 수행될 수 있다. 역교배 또는 다른 육종 절차는 반복친(recurrent parent)의 목적하는 유전형이 회복될 때까지 반복될 수 있다. 본 개시내용의 반복친은 철관-건조 품종, 벌리 품종, 음지 그늘-건조 품종, 음지 열-건조 품종 또는 오리엔탈 품종일 수 있다. 다른 육종 기법은 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되어 있는 문헌[Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y.]에서 찾을 수 있다.

기재된 담배 식물을 사용하는 식물 육종 프로그램의 결과는 본 개시내용의 유용한 계통, 재배종, 품종, 후대, 근친교배종 및 잡종을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "품종(variety)"은 동일한 종의 다른 식물과는 서로 다른 일정한 특징을 공유하는 식물의 개체군을 지칭한다. 항상 그런 것은 아니지만 종종 품종은 상업적으로 판매된다. 하나 이상의 독특한 형질을 가지고 있지만, 품종은 그 품종 내에서 개체 간의 전체적인 차이가 매우 작다는 것을 더 특징으로 한다. "순계(pure line)" 품종은 여러 세대의 자가-수분 및 선별, 또는 조직 또는 세포 배양 기법을 사용하는 한쪽 부모로부터의 식물 번식에 의해 생성될 수 있다. 품종은 다른 계통 또는 품종으로부터 본질적으로 유래될 수 있다. 새로운 품종의 식물의 보호를 위한 국제 협약(1961년 12월 2일, 1972년 11월 10일, 1978년 10월 23일 및 1991년 3월 19일 제네바에서 개정됨)에 의해 정의된 바와 같이, 품종은 다음과 같은 경우에 초기 품종으로부터 "본질적으로 유래(essentially derived)"된다: a) 초기 품종으로부터 주로 유래되거나, 또는 초기 품종으로부터 주로 유래된 품종으로부터 유래되는 반면, 초기 품종의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 발생하는 본질적인 특징의 발현을 유지함; b) 초기 품종과 명확하게 구별됨; 및 c) 파생의 행위로 인한 차이를 제외하고, 초기 품종의 유전자형 또는 유전자형의 조합으로부터 발생하는 본질적인 특징의 발현에 있어서 초기 품종에 부합함. 본질적으로 유래된 품종은 예를 들어, 천연의 또는 유도된 돌연변이체, 체세포 변이체, 초기 품종, 역교배 또는 형질전환의 식물로부터의 개별 변이체의 선별에 의해 수득될 수 있다. 제1 품종이 본질적으로 유래되는 제1 담배 품종 및 제2 담배 품종은 본질적으로 동일한 유전적 배경을 갖는 것으로 간주된다. 품종과 구별되는 "계통(line)"은 흔히 예를 들어, 식물 연구에서 비-상업적으로 사용되는 식물의 그룹을 나타낸다. 계통은 전형적으로 관심 있는 하나 이상의 형질에 대한 개체 간의 전체적인 차이를 거의 나타내지 않지만, 다른 형질에 대한 개체 간의 약간의 차이가 있을 수 있다.

일 양태에서, 본 개시내용은 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E 중 어느 하나에 제공되는 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하는 담배 식물, 품종, 계통 또는 세포를 제공한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 표 4A 내지 표 4E, 표 10 또는 표 14 중 어느 하나에 제공되는 임의의 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터 유래되는 담배 식물, 품종, 계통 또는 세포를 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH203 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임(male sterile) 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH341 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1678 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1680 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1804 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1898 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH207 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH342 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH343 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH348 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH349 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH355 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH359 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH64 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH682 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH692 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH697 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH922 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH957 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1808 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1810 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1886 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1888 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1889 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH189 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1893 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1901 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1902 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH3 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH125 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH208 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH403 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH414 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH434 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH436 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH437 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH449 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH706 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH709 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH710 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH716 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH729 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH731 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH752 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH756 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH768 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH771 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH776 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH800 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH818 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH10and F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH1004 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH1033 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH132 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH134 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH217 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH456 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH457 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH460 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH465 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH71 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH830 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH831 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH836 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH841 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH974 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH981 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH994 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1905 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH128 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH130 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH131 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH133 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH136 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH216 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH227 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH5 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH6 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH65 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH66 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH69 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH72 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH73 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH74 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH78 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH79 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH8 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH9 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1696 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1717 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1719 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1729 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1736 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1737 및 F₁또는F₂₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1739 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1740 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1835 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1848 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1849 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1912 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1937 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1940 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1943 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1944 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH1051 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH22 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH34 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH473 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH49 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH50 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH848 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH850 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH851 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1699 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1708 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1722 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1724 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1725 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1845 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1846 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1847 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1911 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1912 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1915and F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1918 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1928 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1932 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1933 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1936 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH20 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH28 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH31 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH47 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH51 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH52 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS107 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS106 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS115 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1809-13 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS111 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS112 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1678-60 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS131 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH709-01 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH709-08 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH414-11 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH414-19 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH437-04 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH437-08 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH437-32 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH437-39 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH449-26 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH449-33 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH125-48 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS102 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS103 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1719-30 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1740-36 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1698-22 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1700-13 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1702-17 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1849-01 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1849-48 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 17GH1737-24 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS118 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS133 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS120 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH1108-07 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH2162 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS164 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS163 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS146 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS147 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS150 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS151 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS148 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS149 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS152 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS153 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS143 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH2169 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH2171 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS165 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 CS118 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 계통 18GH2254-7 및 F₁또는F₂ 담배 식물, 또는 이로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 저 니코틴 형질을 담배 품종에 이입하는(introgressing) 방법을 제공하며, 방법은 (a) 저 니코틴 형질을 포함하는 제1 담배 품종과 저 니코틴 형질이 없는 제2 담배 품종을 교배하여 하나 이상의 후대 담배 식물을 생산하는 단계; (b) 표 4A 내지 표 4E, 표 5A 내지 표 5E, 표 10 및 표 12A 내지 표 12E에 열거된 것들로부터 선택되는 pmt 돌연변이체 대립유전자에 대해 하나 이상의 후대 담배 식물의 유전형을 분석하는 단계; 및 (c) pmt 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 후대 담배 식물을 선별하는 단계를 포함한다. 다른 양태에서, 이러한 방법은 선별된 후대 담배 식물과 제2 담배 품종을 역교배하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 양태에서, 이러한 방법은 (d) 선별된 후대 식물을 그 자신 또는 제2 담배 품종과 교배하여 하나 이상의 또 다른 후대 담배 식물을 생산하는 단계; 및 (e) 저 니코틴 형질을 포함하는 또 다른 후대 담배 식물을 선별하는 단계를 더 포함한다. 일 양태에서, 선별하는 단계 (e)는 마커-보조 선별을 포함한다. 일 양태에서, 이러한 방법은 저 니코틴 형질을 포함하는 단일 유전자 전환을 생성한다. 일 양태에서, 이러한 방법은 pmt 돌연변이체 대립유전자를 포함하는 단일 유전자 전환을 생성한다. 일 양태에서, 제2 담배 품종은 엘리트 품종이다. 다른 양태에서, 이러한 방법의 유전형 분석 단계는 하나 이상의 분자 마커 검정을 포함한다. 다른 양태에서, 유전형 분석은 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP), DNA 서열에서의 삽입 또는 결실(Indel), DNA 서열의 단순 서열 반복(simple sequence repeat: SSR), 제한 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism: RFLP) 및 태그 SNP로 이루어진 군으로부터 선택되는 다형성을 포함하는 다형성 마커를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "유전자좌(locus)"는 다형성 핵산, 형질 결정기, 유전자, 또는 마커가 위치하는 염색체 유전자좌 또는 영역이다. "유전자좌"는 상응하는 유전자좌 또는 영역을 지칭하기 위해 2개의 상동성 염색체에 의해 공유될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "대립유전자(allele)"는 유전자 또는 특정 유전자좌(예를 들어, 동일한 유전자 또는 유전자좌에 대한 다른 대립유전자와 상이한 유전자 또는 유전자좌의 핵산 서열)의 대안적인 핵산 서열을 지칭한다. 이러한 대립유전자는 (i) 야생형 또는 (ii) 하나 이상의 돌연변이 또는 편집이 야생형 대립유전자와 비교하여 돌연변이체 대립유전자에 존재하는 경우, 돌연변이체로 간주될 수 있다. 유전자에 대한 돌연변이체 대립유전자는 야생형 대립유전자와 비교하여 유전자의 활성 또는 발현 수준이 감소 또는 제거될 수 있다. 담배와 같은 2배체 유기체의 경우, 제1 대립유전자는 하나의 염색체에서 발생할 수 있고, 제2 대립유전자는 제2 상동성 염색체 상의 동일한 유전자좌에서 발생할 수 있다. 식물의 하나의 염색체 상의 유전자좌에 있는 하나의 대립유전자가 돌연변이체 대립유전자이고 식물의 상동성 염색체 상의 다른 상응하는 대립유전자가 야생형인 경우, 식물은 돌연변이체 대립유전자에 대해 이형접합성인 것으로 설명된다. 그러나, 유전자좌에 있는 두 대립유전자 모두가 돌연변이체 대립유전자인 경우, 식물은 돌연변이체 대립유전자에 대해 동형접합성인 것으로 설명된다. 유전자좌에서 돌연변이체 대립유전자에 동형접합성인 식물은 이형대립유전자 또는 이중 대립유전자인 경우, 동일한 돌연변이체 대립유전자 또는 상이한 돌연변이체 대립유전자를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "이입(introgression)" 또는 "이입하다(introgress)"는 하나의 유전적 배경에서 다른 유전적 배경으로의 유전자 좌위의 목적하는 대립유전자의 전이를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "교배된(crossed)" 또는 "교배하다(cross)"는 수정(예를 들어 세포, 종자 또는 식물)을 통해 후대를 생산하는 것을 의미하며, 식물(생식)과 자가-수정(자가생식) 사이의 교배를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "역교배하다(backcross)" 및 "역교배하는(backcrossing)"은 후대 식물이 부모 중 한쪽에 반복적으로 교배되는 과정을 지칭한다. 역교배 계획에서, "공여(donor)" 친은 이입될 목적하는 유전자 또는 유전자좌를 갖는 부모 식물을 지칭한다. "수여(recipient)" 친(1회 이상 사용됨) 또는 "반복(recurrent)" 친(2회 이상 사용됨)은 유전자 또는 유전자좌가 이입되는 부모 식물을 지칭한다. 초기 교배는 F1 세대를 발생시킨다. 용어 "BC1"은 반복친의 두 번째 사용을 지칭하고, "BC2"는 반복친의 세 번째 사용 등을 지칭한다. 일 양태에서, 역교배가 반복적으로 수행되며, 각각의 연속 역교배 세대의 후대 개체는 그 자체가 동일한 모 유전자형에 역교배된다.

본 명세서에서 사용되는 "단일 유전자 전환된(single gene converted)" 또는 "단일 유전자 전환(single gene conversion)"은 역교배로 알려진 식물 육종 기법을 사용하거나 또는 유전 공학을 통해 개발된 식물을 지칭하며, 여기서 역교배 기법 또는 유전 공학을 통해 품종으로 전달된 단일 유전자에 더하여 본질적으로 품종의 목적하는 형태 및 생리학적 특징이 모두 회복된다.

본 명세서에서 사용되는 "엘리트 품종(elite variety)"은 우수한 농경학적 성능을 위한 육종 및 선별로 인해 생성된 임의의 품종을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 마커-보조 선별 또는 육종의 맥락에서 "선별하는(selecting)" 또는 "선별(selection)"은 소정의 미리 결정된 기준에 기초하여 일반적으로 개체군으로부터 목적하는 개체를 고르거나 선택하는 행위를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "형질(trait)"은 유전자형에 의해 영향을 받을 수 있는 세포 또는 유기체의 하나 이상의 검출 가능한 특징을 지칭한다. 표현형은 육안으로 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 평가 수단, 예를 들어 현미경, 생화학적 분석, 유전체 분석, 특정 질환 내성에 대한 검정 등으로 관찰될 수 있다. 일부 경우에, 표현형은 단일 유전자 또는 유전자좌, 예를 들어 "단일 유전자 형질(single gene trait)"에 의해 직접 제어된다. 다른 경우에, 표현형은 여러 유전자의 결과이다.

본 명세서에서 사용되는 "마커 검정(marker assay)"은 특정 방법, 예를 들어 적어도 하나의 표현형(예컨대, 종자 색상, 꽃 색상 또는 다른 시각적으로 검출 가능한 형질)의 측정, 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 단일 염기 확장, 전기 영동, 서열 정렬, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 혼성화(allelic specific oligonucleotide hybridization: ASO), 무작위 증폭된 다형성 DNA(random amplified polymorphic DNA: RAPD), 마이크로어레이-기반 기술 및 핵산 시퀀싱 기술 등을 사용하여 특정 유전자좌에서 다형성을 검출하기 위한 방법을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "마커 보조 선별(marker assisted selection: MAS)"은 표현형을 마커 유전자형에 기초하여 선별하는 과정이다. "마커 보조 선별 육종(Marker assisted selection breeding)"은 식물로부터 하나 이상의 핵산을 검출함으로써 식물 또는 식물들에서 목적하는 형질 또는 형질들을 선별하는 과정을 지칭하며, 여기서 핵산이 목적하는 형질에 연결되고, 그 후 하나 이상의 핵산을 보유하는 식물 또는 생식질을 선별한다.

본 명세서에서 사용되는 "다형성(polymorphism)"은 개체군에서 하나 이상의 변이의 존재를 의미한다. 다형성은 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 변이 또는 단백질의 아미노산 서열의 변이로 나타날 수 있다. 다형성은 하나 이상의 개체의 개체군에서 하나 이상의 유전자좌에서 핵산 서열 또는 핵산 특징의 하나 이상의 변이의 존재를 포함한다. 변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기 변화, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 다형성은 핵산 복제에서 무작위 과정으로부터, 돌연변이 유발을 통해, 이동성 유전체 요소의 결과로, 카피 수 변화로부터 및 감수 분열과정, 예컨대 불균등 교차, 게놈 중복 및 염색체 절단 및 융합 동안에 발생할 수 있다. 변이는 일반적으로 발견될 수 있거나 또는 개체군 내에서 낮은 빈도로 존재할 수 있으며, 전자는 일반적인 식물 육종에 더 큰 유용성을 가지고, 후자는 드물지만 중요한 표현형 변이와 관련이 있을 수 있다. 유용한 다형성은 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), DNA 서열에서의 삽입 또는 결실(Indel), DNA 서열의 단순 서열 반복(SSR), 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 및 태그 SNP를 포함할 수 있다. 유전자 마커, 유전자, DNA-유래 서열, RNA-유래 서열, 프로모터, 유전자의 5' 비번역 영역, 유전자의 3' 비번역 영역, 마이크로RNA, siRNA, 내성 유전자좌, 위성 마커, 이식유전자, mRNA, ds mRNA, 전사 프로파일 및 메틸화 패턴도 또한 다형성을 포함할 수 있다. 또한, 이전의 카피 수의 존재, 부재 또는 변이는 다형성을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "SNP" 또는 "단일 뉴클레오타이드 다형성"은 게놈 서열에서 단일 뉴클레오타이드(A, T, C 또는 G)가 변경되거나 가변적일 때 발생하는 서열 변이를 의미한다. "SNP 마커"는 SNP가 게놈 상의 부위에 매핑될 때 존재한다.

본 명세서에서 사용되는 "마커" 또는 "분자 마커" 또는 "마커 유전자좌"는 게놈 상의 특정 유전자좌를 특성화하기에 충분히 고유한 핵산 또는 아미노산 서열을 나타내는데 사용되는 용어이다. 임의의 검출 가능한 다형성 형질은 차별적으로 유전되고 관심 있는 표현형 형질과 연관 불균형(linkage disequilibrium)을 나타내는 한 마커로서 사용될 수 있다. 따라서, 각 마커는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA의 특정 세그먼트의 지표이다. 맵 위치는 서로에 대한 특정 마커의 상대적 위치의 측정을 제공한다. 형질이 주어진 마커에 연결되어 있다고 언급되는 경우, 그 서열이 형질에 영향을 미치는 실제 DNA 세그먼트는 일반적으로 마커와 공동 분리된다는 것을 이해할 것이다. 마커가 형질의 양쪽에서 확인되면, 형질의 더욱 정확하고 명확한 위치가 얻어질 수 있다. 교배의 후대에서 마커(들)의 출현(appearance)을 측정함으로써, 형질의 실제 평가가 형질이 발현될 수 있는 단계 및/또는 환경 조건하에 식물을 성장시키는 것을 필요로 한다는 점 때문에 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있는 형질 자체의 출현을 실제로 평가하는 것 없이 상대적으로 간단한 분자 테스트에 의해 형질의 존재를 검출할 수 있다.

본 개시내용의 임의의 담배 식물은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 유전자 작제물 또는 이식유전자로 형질전환시킴으로써 추가적인 농경학적으로 바람직한 형질을 더 포함할 수 있음이 이해된다. 제한 없이, 목적하는 형질의 예는 제초제 저항성, 해충 저항성, 질환 저항성; 높은 수율; 높은 등급 지수 값; 건조성(curability); 건조(curing) 품질; 기계적 수확성; 보유 능력; 잎의 품질; 키, 식물 성숙(예를 들어, 조기 성숙, 조기에서 중기 성숙, 중기 성숙, 중기에서 후기 성숙 또는 후기 성숙); 줄기 크기(예를 들어, 작은, 중간 또는 큰 줄기); 또는 식물당 잎의 수(예를 들어, 적은(예를 들어, 5 내지 10개의 잎), 중간(예를 들어, 11 내지 15개의 잎) 또는 많은(예를 들어, 16 내지 21개) 수의 잎), 또는 임의의 조합이다. 일 양태에서, 개시된 저-니코틴 또는 니코틴이 없는 담배 식물 또는 종자는 예를 들어, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 결정 단백질 또는 VIP3과 같은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터의 식물 살충성 단백질과 같은 하나 이상의 살충성 단백질을 발현하는 하나 이상의 이식유전자를 포함한다(예를 들어, 문헌[Estruch et al. (1997)　Nat. Biotechnol .15:137] 참조). 다른 양태에서, 담배 식물은 갈색 줄기 부패에 대한 저항성(미국 특허 제5,689,035호) 또는 낭종 선충류에 대한 저항성(미국 특허 제5,491,081호)을 부여하는 이입된 형질을 더 포함한다.

본 개시내용은 또한 변경된 니코틴 또는 총 알칼로이드 수준을 포함하지만 이러한 니코틴 수준 변경이 없는 상응하는 초기 담배 식물의 수율과 비슷한 수율을 갖는 pmt 돌연변이체 담배 식물을 제공한다. 일 양태에서, pmt 돌연변이체 품종은 약 1200 내지 3500 lbs/에이커, 1300 내지 3400 lbs/에이커, 1400 내지 3300 lbs/에이커, 1500 내지 3200 lbs/에이커, 1600 내지 3100 lbs/에이커, 1700 내지 3000 lbs/에이커, 1800 내지 2900 lbs/에이커, 1900 내지 2800 lbs/에이커, 2000 내지 2700 lbs/에이커, 2100 내지 2600 lbs/에이커, 2200 내지 2500 lbs/에이커 및 2300 내지 2400 lbs/에이커로 이루어진 군으로부터 선택되는 수율을 제공한다. 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 품종은 약 1200 내지 3500 lbs/에이커, 1300 내지 3500 lbs/에이커, 1400 내지 3500 lbs/에이커, 1500 내지 3500 lbs/에이커, 1600 내지 3500 lbs/에이커, 1700 내지 3500 lbs/에이커, 1800 내지 3500 lbs/에이커, 1900 내지 3500 lbs/에이커, 2000 내지 3500 lbs/에이커, 2100 내지 3500 lbs/에이커, 2200 내지 3500 lbs/에이커, 2300 내지 3500 lbs/에이커, 2400 내지 3500 lbs/에이커, 2500 내지 3500 lbs/에이커, 2600 내지 3500 lbs/에이커, 2700 내지 3500 lbs/에이커, 2800 내지 3500 lbs/에이커, 2900 내지 3500 lbs/에이커, 3000 내지 3500 lbs/에이커 및 3100 내지 3500 lbs/에이커로 이루어진 군으로부터 선택되는 수율을 제공한다. 또 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 pmt 돌연변이(들)를 제외하고 본질적으로 동일한 유전적 배경을 갖는 대조군 식물의 수율의 65% 내지 130%, 70% 내지 130%, 75% 내지 130%, 80% 내지 130%, 85% 내지 130%, 90% 내지 130%, 95% 내지 130%, 100% 내지 130%, 105% 내지 130%, 110% 내지 130%, 115% 내지 130% 또는 120% 내지 130%의 수율을 제공한다. 또 다른 양태에서, pmt 돌연변이체 담배 식물은 pmt 돌연변이를 제외하고 본질적으로 동일한 유전적 배경을 갖는 대조군 식물의 수율의 70% 내지 125%, 75% 내지 120%, 80% 내지 115%, 85% 내지 110% 또는 90% 내지 100%의 수율을 제공한다.

일 양태에서, 개시된 담배 식물(예를 들어, 저-니코틴, 니코틴이 없는 또는 저-알칼로이드 담배 품종)은 수율, 숙성 및 노화, 초식 곤충에 대한 감수성, 토핑 후 폴리아민 함량, 엽록소 수준, 단위 잎 면적당 엽육 세포 수 및 건조 후 최종 제품의 품질로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질에 실질적으로 영향을 주지 않고 목적하는 형질(예를 들어, 저-니코틴, 니코틴이 없는 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함한다.

일 양태에서, 개시된 담배 식물은 목적하는 형질(예를 들어, 저-니코틴, 니코틴이 없는 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형 대조군 식물과 실질적으로 비슷한 형질을 더 포함하며, 여기서 형질은 수율, 숙성 및 노화, 초식 곤충에 대한 감수성, 토핑 후 폴리아민 함량, 엽록소 수준, 단위 잎 면적당 엽육 세포 수 및 건조 후 최종 제품의 품질로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 개시된 담배 식물은 목적하는 형질(예를 들어, 저-니코틴, 니코틴이 없는 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형 대조군 식물의 수율과 비교하여 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 100% 초과, 105% 초과, 110% 초과, 115% 초과, 120% 초과, 125% 초과, 130% 초과, 135% 초과 또는 140% 초과인 수율을 더 포함한다. 일 양태에서, 개시된 담배 식물은 목적하는 형질(예를 들어, 저-니코틴, 니코틴이 없는 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형 대조군 식물의 수율과 비교하여 70% 내지 140%, 75% 내지 135%, 80% 내지 130%, 85% 내지 125%, 90% 내지 120%, 95% 내지 115% 또는 100% 내지 110%인 수율을 더 포함한다. 일 양태에서, 개시된 담배 식물은 목적하는 형질(예를 들어, 저-니코틴, 니코틴이 없는 또는 저-알칼로이드)을 부여하는 변형을 포함하고, 비변형 대조군 식물의 수율과 비교하여 70% 내지 80%, 75% 내지 85%, 80% 내지 90%, 85% 내지 95%, 90% 내지 100%, 95% 내지 105%, 105% 내지 115%, 110% 내지 120%, 115% to 125%, 120% 내지 130%, 125 내지 135% 또는 130% 내지 140%인 수율을 더 포함한다.

일 양태에서, 개시된 저-니코틴 또는 니코틴이 없는 담배 품종은 기계 수확에 대해 적합화된다. 다른 양태에서, 개시된 저-니코틴 또는 니코틴이 없는 담배 품종은 기계로 수확된다.

일 양태에서, 제공되는 담배 식물은 잡종 식물이다. 잡종은 제1 품종의 자성 부모 식물(예를 들어, 자방친(seed parent))의 자가-수분을 방지하고, 제2 품종의 웅성 부모 식물로부터의 꽃가루로 자성 부모 식물을 수정시키고, F1 잡종 종자가 자성 식물에 형성되도록 함으로써 생성될 수 있다. 자성 식물의 자가-수분은 꽃 발달 초기에 꽃을 제웅(emasculating)시킴으로써 방지될 수 있다. 대안적으로, 웅성 불임의 한 형태를 사용하여 자성 부모 식물에서 꽃가루 형성이 방지될 수 있다. 예를 들어, 웅성 불임은 웅성 불임(male sterility: MS), 또는 이식유전자가 미세포자 형성 및/또는 꽃가루 형성을 저해하는 형질전환 웅성 불임 또는 자가-불화합성(self-incompatibility)에 의해 생성될 수 있다. MS를 함유하는 자성 부모 식물이 특히 유용하다. 자성 부모 식물이 MS인 양태에서, 꽃가루는 웅성 가임 식물로부터 수확되고, MS 자성 부모 식물의 암술머리에 수동으로 적용되어 그 결과 생성된 F1 종자가 수확된다.

식물은 단일-교배 담배 F1 잡종을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 웅성 부모 식물로부터의 꽃가루는 제웅된 자성 부모 식물 또는 웅성 불임인 자성 부모 식물로 수동으로 옮겨져 F1 종자를 형성한다. 대안적으로, 단일-교배 F1 잡종이 자성 부모로서 사용되며 상이한 웅성 부모와 교배되는 삼원 교배가 수행될 수 있다. 다른 대안으로, 상이한 단일-교배의 F1 후대가 그 자신과 교배되는 이중-교배 잡종이 생성될 수 있다. 자가-불화합성은 이중-교배 잡종을 형성할 때 자성 부모의 자가-수분을 방지하기 위해 특별한 이점으로 사용될 수 있다.

일 양태에서, 저-니코틴 또는 니코틴이 없는 담배 품종은 웅성 불임이다. 다른 양태에서, 저-니코틴 또는 니코틴이 없는 담배 품종은 세포질 웅성 불임이다. 웅성 불임 담배 식물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 웅성 불임 담배를 생산하는 방법은 문헌[Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y. 761 pp]에 기술되어 있다.

일 양태에서, 본 개시내용은 표 5A 내지 표 5E 및 표 12A 내지 표 12E 중 어느 하나에 제공되는 하나 이상의 pmt 돌연변이를 포함하는 웅성 불임 담배 식물, 품종 또는 계통을 제공한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 표 4A 내지 표 4E, 표 10, 또는 표 14 중 어느 하나에 제공되는 임의의 담배 식물, 품종 또는 계통으로부터 유래되는 웅성 불임 담배 식물, 품종 또는 계통을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS11을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS12를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS13을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS14를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS15를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS16을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS17을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dCS18을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 웅성 불임 계통 dS697을 제공한다.

또 다른 양태에서, 제공되는 담배 부분은 잎, 줄기, 뿌리, 종자, 꽃,　꽃가루, 꽃밥, 밑씨, 작은 꽃자루, 과일, 분열 조직, 떡잎, 배축, 꼬투리, 배아, 배유, 외식편, 캘러스, 조직 배양, 싹, 세포 및 원형질체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 양태에서, 제공되는 담배 부분은 종자를 포함하지 않는다. 일 양태에서, 본 개시내용은 생식 물질이 아니며 식물의 자연 번식을 매개하지 않는 담배 식물 세포, 조직 및 기관을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 생식 물질이며 식물의 자연 번식을 매개하는 담배 식물 세포, 조직 및 기관을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 광합성을 통해 스스로를 유지할 수 없는 담배 식물 세포, 조직 및 기관을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 체세포 담배 식물 세포를 제공한다. 생식계열 세포와는 달리, 체세포는 식물 번식을 매개하지 않는다.

세포, 조직 및 기관은 종자, 과일, 잎, 떡잎, 배축, 분열 조직, 배아, 배유, 뿌리, 싹, 줄기, 꼬투리, 꽃, 꽃차례(infloresence), 대, 꽃자루, 스타일, 암술머리, 꽃턱, 꽃잎, 꽃받침, 꽃가루, 꽃밥, 수술대, 씨방, 밑씨, 과피, 체관, 관다발 조직으로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 담배 식물 엽록체를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상피 세포, 기공 세포, 잎 또는 근모, 저장근, 또는 덩이줄기를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 담배 원형질체를 제공한다.

당업자들은 담배 식물이 무성 생식 또는 식물 번식을 통해서가 아닌 종자를 통해 자연적으로 번식한다는 것을 이해한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 담배 배유를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 담배 배유 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 인간의 개입 없이 번식할 수 없는 웅성 또는 자성 불임 담배 식물을 제공한다.

일 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 및 이들의 단편에 대해 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 일 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 11 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 제공한다.

2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성(sequence identity)" 또는 "동일성(identity)"은 특정 비교 창에 대한 최대 관련성을 위해 정렬될 때 동일한 2개의 서열에서의 잔기를 참조한다. 서열 동일성의 퍼센트가 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 종종 동일하지 않은 다른 것으로 인식되며, 여기서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되므로 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환에서 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다.

본 개시내용은 개시된 담배 식물로부터의 담배 재료를 포함하는 담배 제품을 제조하는 방법을 더 제공한다. 일 양태에서, 방법은 수분 함량을 약 12.5% 내지 약 13.5% 내지 약 21%로 증가시키기 위해 담배 식물로부터 제조된 노화된 담배 재료를 컨디셔닝하는 단계, 켠디셔닝된 담배 재료를 블렌딩하여 목적하는 블렌드를 생산하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 담배 제품을 제조하는 방법은 블렌드를 케이싱하거나 맛을 내는 단계를 더 포함한다. 일반적으로, 케이싱 과정 동안, 케이싱 또는 소스 재료가 화학적 조성물의 균형을 맞춤으로써 품질을 향상시키고, 소정의 목적하는 풍미 특징을 개발하기 위해 블렌드에 첨가된다. 케이싱 과정에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌[Tobacco Production, Chemistry and Technology, Edited by L. Davis and M. Nielsen, Blackwell Science, 1999]에서 찾을 수 있다.

제공되는 담배 재료는 또한 열 처리(예를 들어, 쿠킹, 토스팅), 맛내기, 효소 처리, 팽화 및/또는 건조를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 방법을 사용하여 가공될 수 있다. 발효 및 비-발효 담배 모두 이러한 기법을 사용하여 가공될 수 있다. 적합한 가공 담배의 예는 음지 그늘-건조, 음지 열-건조, 벌리, 철관 건조, 및 시가 충전제 또는 래퍼뿐만 아니라 전체 잎 줄기제거(stemming) 작업으로부터의 제품을 포함한다. 일 양태에서, 담배 섬유는 새로운 중량 기준으로 최대 70%의 다크 담배를 포함한다. 예를 들어, 담배는 미국 공개 제2004/0118422호 또는 제2005/0178398호에 기재된 바와 같은 가열, 발한 및/또는 저온살균 단계에 의해 컨디셔닝될 수 있다.

제공되는 담배 재료는 발효를 거칠 수 있다. 발효는 전형적으로 높은 초기 수분 함량, 열 생성 및 건조 중량의 10% 내지 20%의 손실을 특징으로 한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,528,993호; 제4,660,577호; 제4,848,373호; 및 제5,372,149호 참조. 잎의 향을 변경하는 것 외에도, 발효는 잎의 색과 질감을 변경시킬 수 있다. 또한, 발효 과정 동안, 탈리 기체(evolution gas)가 생성될 수 있고, 산소가 흡수될 수 있으며, pH가 변할 수 있고, 유지되는 물의 양이 변할 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 제2005/0178398호 및 문헌[Tso(1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford)] 참조. 건조된, 또는 건조되고 발효된 담배는 구강 제품에 포함되기 전 추가로 가공(예를 들어, 절단, 팽화, 혼합, 제분 또는 분쇄)될 수 있다. 일부 경우에, 담배는 공중합체 및 선택적으로 풍미제 및 기타 첨가제와 혼합하기 전에 오븐 휘발성 함량이 48 내지 50 중량%인 길이가 긴 절단 발효 건조 습식 담배이다.

일 양태에서, 제공되는 담배 재료는 목적하는 크기로 가공될 수 있다. 일 양태에서, 담배 섬유는 200 마이크로미터 미만의 평균 섬유 크기를 갖도록 가공될 수 있다. 일 양태에서, 담배 섬유는 75 내지 125 마이크로미터이다. 다른 양태에서, 담배 섬유는 75 마이크로미터 이하의 크기를 갖도록 가공된다. 일 양태에서, 담배 섬유는 길이가 긴 절단 담배를 포함하며, 이는 약 10 컷/인치에서 최대 약 110 컷/인치의 폭과 약 0.1 인치에서 최대 약 1 인치의 길이로 잘리거나 썰릴 수 있다. 이중 절단 담배 섬유는 이중 절단 담배 섬유의 약 70%가 -20 메쉬 내지 80 메쉬의 메쉬 크기에 속하도록 다양한 입자 크기를 가질 수 있다.

제공되는 담배 재료는 약 10 중량% 초과; 약 20 중량% 초과; 약 40 중량% 초과; 약 15 중량% 내지 약 25 중량%; 약 20 중량% 내지 약 30 중량%; 약 30 중량% 내지 약 50 중량%; 약 45 중량% 내지 약 65 중량%; 또는 약 50 중량% 내지 약 60 중량%의 총 오븐 휘발성 물질 함량을 갖도록 가공될 수 있다. 당업자는 "습식(moist)" 담배가 전형적으로 약 40 중량% 내지 약 60 중량%(예를 들어, 약 45 중량% 내지 약 55 중량% 또는 약 50 중량%)의 오븐 휘발성 물질 함량을 갖는 담배를 지칭함을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "오븐 휘발성 물질(oven volatile)"은 미리 가온된 강제 통풍 오븐에서 110℃에서 3.25시간 동안 샘플을 건조시킨 후 샘플에 대한 중량 손실 퍼센트를 계산함으로써 결정된다. 구강 제품은 구강 제품을 제조하는데 사용되는 담배 섬유의 오븐 휘발성 물질 함량과는 다른 전체 오븐 휘발성 물질 함량을 가질 수 있다. 기재된 가공 단계는 오븐 휘발성 물질 함량을 감소시키거나 증가시킬 수 있다.

이제 본 개시내용을 일반적으로 설명하였지만, 예시로 제공되며 명시되지 않는 한 본 개시내용을 제한하고자 의도되는 것이 아닌 하기 실시예를 참조하여 동일한 내용이 보다 쉽게 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 5개의 PMT 유전자의 발현 프로파일링.

니코틴 생합성 효소 푸트레신 N-메틸 트랜스퍼레이스(PMT)에 의해 폴리아민 푸트레신이 N-메틸푸트레신으로 전환되는 것으로 시작한다. 이것은 니코틴 생합성에 전구체 대사산물을 도입하는 단계이다. PMT(PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4)를 암호화하는 유전자는 담배(니코티아나 타바쿰) 게놈에 존재한다. 표 1A는 5개의 PMT 유전자의 유전체 DNA 서열, cDNA 서열 및 단백질 서열을 열거한다. 표 1B 및 1C는 5개의 PMT 유전자 간의 서열 동일성을 제공한다. 토핑 전부터 수확까지 혼주된 발현 수준은 임의의 특정 이론에 제한되지 않고, PMT1a 및 PMT3이 2개의 주요 PMT 유전자를 나타냄을 지지한다(도 1).

[표 1A]

[표 1B]

[표 1C]

[표 1D]

[표 1E]

[표 1F]

[표 1G]

[표 1H]

실시예 2: PMT 게놈 편집 및 담배 계통 개발

PMT 넉아웃 돌연변이체는 다양한 PMT 유전자를 편집함으로써 생성된다. 담배 원형질체를 게놈 편집 기술 1(GET 1) 단백질 또는 게놈 편집 기술(GET) 2 단백질 및 목적하는 위치에서 PMT 유전자를 표적화하는 특정 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 플라스미드와 함께 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 형질감염시켰다. 표 2는 PMT 편집을 위해 사용되는 gRNA 서열을 열거한다. 일부 gRNA(예를 들어, 서열번호 6 및 7)는 단일 형질감염에서 다중 PMT 유전자를 표적화하기 위해 함께 혼주하였다.

그런 다음, 형질감염된 원형질체를 1% 아가로스 비드에 고정화시키고, 조직 배양하였다. 캘리(calli)가 직경 약 1㎜까지 자라면, TOM2 플레이트에 뿌렸다. 단편 분석을 사용하여 표적 위치에서 삽입 또는 결실(Indel)에 대해 캘리를 스크리닝하였다. 추가 배양을 위해 야생형 대조군과 비교하여 크기 변화를 보이는 후보를 선택하고, 생성된 싹을 다시 단편 분석으로 테스트하여 Indel의 존재를 확인하였다. 뿌리 내린 싹을 화분에 심고, 결실된 서열을 정확하게 결정하기 위해 시퀀싱하였다. 각 식물로부터 어린 잎을 수확하고, phirekit을 사용하여 PMT 단편에 대해 PCR 증폭하였다. 각 계통에 대한 PMT 라이브러리를 인덱싱하고, 384 계통을 혼주하고 Miseq를 사용하여 시퀀싱하였다.

각 PMT 유전자좌에서 정확하게 편집된 pmt 돌연변이체 대립유전자 서열 및 접합 상태를 모두 결정하기 위해 SNP 분석을 수행하였다. 표 3은 대표적인 편집된 식물의 접합성 정보를 제공한다. 표 4A 내지 표 4E는 다양한 담배 품종(예를 들어, K326, TN90, NLM, 오리엔탈)의 각 편집된 계통에서의 Indel 서열 정보를 제공한다. 표 5A 내지 표 5E는 게놈 서열의 중간(예를 들어, 결실된 또는 삽입된 서열 부위의 각 측면에서 20개의 뉴클레오타이드)에 편집된 부위를 갖는 각 pmt 돌연변이체 대립유전자로부터의 약 40개의 뉴클레오타이드의 게놈 서열을 제공한다.

[표 2]

[표 3]

[표 4A]

[표 4B]

[표 4C]

[표 4D]

[표 4E]

[표 5A]

[표 5B]

[표 5C]

[표 5D]

[표 5E]

실시예 3: PMT 편집된 계통의 알칼로이드 분석

게놈 편집된 담배 식물과 대조군을 75PPM 비료를 사용하여 온실에서 10인치 화분에서 재배하였다. 개화 단계에서, 식물을 토핑하고, 토핑 후 2주째에 엽편(lamina)의 샘플을 식물의 꼭대기로부터 제3, 제4, 제5의 잎으로부터 수집하고, CORESTA 방법 62번(문헌[Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by Gas Chromatographic Analysis, February 2005])에 따른 방법 및 1999년 3월 23일자로 연방 관보(Federal Register Vol. 64, No. 55)에 공개(Vol. 74, No. 4에서 개정, 2009년 1월 7일)된 문헌[Centers for Disease Control and Prevention's Protocol for Analysis of Nicotine, Total Moisture and pH in Smokeless Tobacco Products]에 정의된 방법을 사용하여 알칼로이드 수준을 측정하였다(표 6A 내지 표 6C).

간략하게는, 대략 0.5g의 담배를 액체/액체 추출을 사용하여 내부 표준물질을 함유하는 유기 용매로 추출하고, 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용하여 가스 크로마토그래피(GC)로 분석하였다. 결과는 있는 그대로 또는 건조 중량 기준으로 중량 퍼센트(Wt %)로 보고될 수 있다. 건조 중량 기준으로 데이터를 보고하려면 오븐 휘발성 물질(oven volatile: OV) 결정이 필요하다. 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 나타낸 총 또는 개별 알칼로이드 수준 또는 니코틴 수준은 건조 중량 기준(예를 들어, 총 알칼로이드 백분율 또는 니코틴 백분율)이다.

식물을 또한 밭에 심고, 수확하고, 건조된 담배에서 알칼로이드 및 TSNA 수준을 테스트하였다. 잎의 수율과 잎의 등급 둘 다를 또한 PMT 편집된 식물에 대해 평가하였다. 또한, 개별 PMT 유전자의 상이한 돌연변이체 조합을 생성하고 테스트하였다(예를 들어, 단일, 이중, 삼중 또는 사중 돌연변이체).

실시예 4: 다른 저-알칼로이드 담배 식물과 오중 pmt 넉-아웃 돌연변이체의 비교

오중 pmt 넉-아웃 돌연변이체 계통 CS15(NLM(Ph Ph) 배경의 유전자형에 대해서는 표 4E를 참조)를 pmt RNAi 형질전환 계통(미국 공개 제2015/0322451호에 기재된 바와 같이 VA359 배경에 있음) 및 저-니코틴 KY171("LN KY171") 품종(nic1 및 nic2 이중 돌연변이를 포함하는 KY 171 배경)과 나란히 재배하였다. 잎을 수확하고, 음지 열 건조 방법을 통해 건조시켰다. 각 계통을 니코틴 및 총 알칼로이드 수준, 잎의 수율 및 잎의 품질(도 2 내지 도 5)에 대해 분석하였다. 데이터는 5개의 PMT 유전자를 모두 편집하여 PMT 유전자 활성을 억제하는 것이 잎의 수율 또는 품질을 포함하지 않고 니코틴 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다.

실시예 5: 하나 이상의 PMT 유전자에 편집된 돌연변이체 대립유전자를 갖는 담배 계통의 수득.

개별 PMT 유전자에 돌연변이를 갖거나 또는 PMT 유전자의 선택된 조합을 갖는 담배 계통을 표 3에 열거된 담배 계통으로부터 수득하였다. 오중, 사중, 삼중 또는 이중 돌연변이체(각각 5개, 4개, 3개 또는 2개의 PMT 유전자에 돌연변이를 가짐)를 비-돌연변이된 대조군 계통으로 교배시키고, 특정 PMT 돌연변이 조합을 위해 분리 후대 식물을 선택한다. 표 7A 내지 표 7E는 수득되는 가능한 돌연변이체 조합을 나타낸다. 각각의 돌연변이된 유전자는 돌연변이에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 표 4A 내지 표 4E 및 표 10에 열거된 각 돌연변이체 대립유전자는 단일, 이중, 삼중, 오중, 또는 사중 돌연변이체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예시적인 개별 pmt 돌연변이체 대립유전자는 표 9A 내지 표 9E에 열거되어 있다.

실시예 6: pmt 돌연변이를 다른 유전자의 돌연변이와 조합함으로써 총 알칼로이드의 추가 감소.

총 알칼로이드 및/또는 선택된 개별 알칼로이드를 추가로 감소시키기 위하여, pmt 돌연변이체를 담배에서의 알칼로이드 생합성과 관련된 추가적인 유전자, 예컨대 퀴놀레이트 포스포리보실 트랜스퍼레이스(QPT) 또는 퀴놀리네이트 신테이스(QS)의 돌연변이와 조합하였다. 간략하게는, 목적하는 pmt 돌연변이체 배경(예를 들어, 사중 또는 오중 pmt 돌연변이체)에서 선택된 QPT 및/또는 QS 유전자를 돌연변이시키는데 유전자 편집을 사용하였다. 생성된 조합된 qpt/pmt 또는 qs/pmt 돌연변이체에서, 알칼로이드 및 TSNA 수준을 건조 담배에서 테스트하였다. 잎의 수율 및 잎의 등급 둘 다를 또한 평가하였다.

[표 6A]

[표 6B]

[표 6C]

[표 7]

[표 8A]

[표 8B]

[표 8C]

[표 8D]

[표 8E]

실시예 7: PMT 게놈 편집 및 담배 계통 개발

추가적인 PMT 넉아웃 돌연변이체를 상이한 담배 계통에서 5개의 PMT 유전자(PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4)를 모두 편집하여 생성하였다. 담배 원형질체를 게놈 편집 기술(GET2) 단백질 및 목적하는 위치에서 PMT 유전자를 표적화하는 특정 가이드 RNA(gRNA)를 암호화하는 플라스미드와 함께 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 형질감염시켰다. 표 9는 PMT 편집을 위해 사용되는 gRNA 서열을 열거한다. 일부 gRNA(예를 들어, 서열번호 6 및 서열번호 7)를 단일 형질감염에서 다중 PMT 유전자를 표적화하기 위해 함께 혼주하였다.

[표 9]

각 PMT 유전자좌에서 정확하게 편집된 pmt 돌연변이체 대립유전자 서열 및 접합 상태를 모두 결정하기 위해 SNP 분석을 수행하였다. 표 10은 다양한 담배 품종(예를 들어, Basma, K326, Katerini, TN90, Izmir)의 각 편집된 계통에서의 Indel 서열 정보를 제공한다.

[표 10]

표 11은 표 10에 제공되는 바와 같은 각 계통에서의 각 유전자에 대한 각각의 PMT indel의 길이(뉴클레오타이드에서)를 제공한다.

[표 11]

표 12A 내지 표 12E는 게놈 서열의 중간에 편집된 부위를 갖는 각 pmt 돌연변이체 대립유전자로부터의 대략 90개의 뉴클레오타이드의 게놈 서열을 제공한다 (예를 들어, 결실되거나 삽입된 서열 부위의 각 측면에 45개의 뉴클레오타이드).

[표 12A]

[표 12B]

[표 12C]

[표 12D]

[표 12E]

실시예 8. PMT 편집된 계통의 알칼로이드 분석.

실시예 7로부터의 동형접합성 게놈 편집된 담배 계통을 대조군 계통과 함께 밭에서 재배하였다. 개화 단계에서, 식물을 토핑하고, 토핑 후 2주째에, 엽편의 샘플을 식물의 꼭대기에서 제3, 제4 및 제5의 잎을 수집하고, CORESTA 방법 62번(문헌[Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by Gas Chromatographic Analysis, February 2005])에 따른 방법 및 1999년 3월 23일자로 연방 관보(Federal Register Vol. 64, No. 55)에 공개(Vol. 74, No. 4에서 개정, 2009년 1월 7일)된 문헌[Centers for Disease Control and Prevention's Protocol for Analysis of Nicotine, Total Moisture and pH in Smokeless Tobacco Products]에 정의된 방법을 사용하여 식물 및 알칼로이드 수준을 측정하였다(표 13A 내지 표 13C 참조).

대략 0.5g의 담배를 액체/액체 추출을 사용하여 내부 표준물질을 함유하는 유기 용매로 추출하고, 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용하여 가스 크로마토그래피(GC)로 분석하였다. 결과는 있는 그대로 또는 건조 중량 기준으로 중량 퍼센트(Wt %)로 보고될 수 있다. 건조 중량 기준으로 데이터를 보고하려면 오븐 휘발성 물질(OV) 결정이 필요하다. 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 나타낸 총 또는 개별 알칼로이드 수준 또는 니코틴 수준은 건조 중량 기준(예를 들어, 총 알칼로이드 백분율 또는 니코틴 백분율)이다.

식물을 또한 밭에 심고, 수확하고, 건조된 담배에서 알칼로이드 및 TSNA 수준을 테스트하였다. 잎의 수율과 잎의 등급 둘 다를 또한 PMT 편집된 식물에 대해 평가하였다.

[표 13A]

[표 13B]

[표 13C]

실시예 9. 웅성 불임 PMT 편집된 계통의 개발

PMT 편집 된 잡종 계통은 실시예 7의 계통을 사용하여 개발하였다. 잡종 계통을 밭에서 재배하고, 웅성 불임 계통의 선조로 사용하였다. 표 14 참조.

[표 14]

실시예 10. PMT 편집된 계통은 건조 중에 곰팡이에 저항한다

여러 저 알칼로이드 담배 계통으로부터 수확된 담배 잎에 표준 그늘 건조를 실시하였다. 건조 완료 후, 담배 잎을 곰팡이에 대해 조사하였다.

LA BU 21로부터의 담배는 5개의 PMT 유전자를 모두 하향조절하기 위한 RNAi 작제물을 포함하는 TN90 LC, TN90 품종, 알칼로이드 생합성 유전자 PR50을 하향조절하기 위한 RNAi 작제물을 포함하는 TN90 품종 및 TN90 유전적 배경에 있는 4개 PMT 편집된 계통(CS47, CS59, CS63 및 CS64)보다 더 많은 곰팡이 감염을 나타낸다. 표 15 및 도 6A 내지 도 6E 및 도 7 참조.

[표 15]

SEQUENCE LISTING <110> ALTRIA CLIENT SERVICES LLC <120> COMPOSITIONS AND METHODS BASED ON PMT ENGINEERING FOR PRODUCING TOBACCO PLANTS AND PRODUCTS HAVING ALTERED ALKALOID LEVELS <130> PCT/US2019/043640 <131> 2019-07-26 <140> WO 2020/023864 <141> 2020-01-30 <150> US 62/703,775 <151> 2018-07-26 <150> US 62/848,159 <151> 2019-05-15 <160> 729 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4317 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 agtctcagac ttaatccagt atatcccatc ttatctcaca ttatcccatc aaatgtgaga 60 ttattttatc tcatctctca tgtggtataa attagtcatg aaattataat ctcgggataa 120 tttagtccgc gtaccaaacg accccaagtg ctttattgtt ttcttattga cagagtaagt 180 gtatgggaac ttaccataga aatccttcgc tcaaaaggaa atacttgcaa gaactggcca 240 aacccaaaga tgaataaact caattacttg attcttaaac tcttaaaaat gaattcaatg 300 gagaaggaaa atatttccag tgtaaacaca agtgaatgaa gagaagccaa aataatctct 360 atcattcaag ccttaggtgg agattaaaaa aattatttac tttcttatca aagtaatagg 420 tgatcaacag ctttcgtaaa acgtcattag gagaatatta taatctcttt tatgctgaag 480 aacccacata aggaagatca taaaatacat gactttcaga tgacttcttg gagctttatt 540 tttaaagagt ggctagctgg tcagcaaaga ggtgctcgtc agatatcata aaattttact 600 attatttgtt ttaagaggga gatggggcac acatgcttgt gacaaaagta agaggaagaa 660 aggagacaga agaggaaata gatttggggg gggggggggg gtttcacaat caaagaaaat 720 ttttaaaatg gagagagaaa tgagcacaca catatactaa caaaatttta ctaataattg 780 caccgagaca aacttatatt ttagttccaa aatgtcagtc taaccctgca cgttgtaatg 840 aatttttaac tattatatta tatcgagttg cgccctccac tcctcggtgt ccaaattgta 900 tttaaatgca tagatgttta ttgggagtgt acagcaagct ttcggaaaat acaaaccata 960 atactttctc ttcttcaatt tgtttagttt aattttgaaa atggaagtca tatctaccaa 1020 cacaaatggc tctaccatct tcaagaatgg tgccattccc atgaacggcc accaaaatgg 1080 cacttctgaa cacctcaacg gctaccagaa tggcacttcc aaacaccaaa acgggcacca 1140 gaatggcact ttcgaacatc ggaacggcca ccagaatggg acatccgaac aacagaacgg 1200 gacaatcagc catgacaatg gcaacgagct actgggaagc tccgactcta ttaagcctgg 1260 ctggttttca gagtttagcg cattatggcc aggttagtac taagaaagca actcaaatgc 1320 atcggcctct tgttgctact aaatatagag agctatcata cttttaggga ctaactaaaa 1380 aggaaagatt atcacaggga cgaagtgagc agttaacttc gcatattatc agacgcatta 1440 atttgaaata atcgaatttt gcaggtgaag cattctcact taaggttgag aagttactat 1500 tccaggggaa gtctgattac caagatgtca tgctctttga ggtaattaat attctaatac 1560 acatgcttta atttaaagtg atacttttaa tttactttta gtttattgca tgtgcacgta 1620 cagtcagcaa cttatgggaa ggttctgact ttggatggag caattcaaca tacagagaat 1680 ggtggatttc catacactga aatgattgtt catctaccac ttggttccat cccaaaccca 1740 aaaaaggttt tgatcatcgg cggaggaatt ggttttacat tattcgaaat gcttcgttat 1800 ccttcaatcg aaaaaattga cattgttgag atcgatgacg tggtagttga tgtaagtcaa 1860 acttctttta cccacataaa gaaaatgatt tagattgcaa ttctttttat ttttctaaaa 1920 gaataaatat attctctttt tttttttaaa acaaaattct ctttcttaca ggtatccaga 1980 aaatttttcc cttatctggc agctaatttt aacgatcctc gtgtaaccct agttctcgga 2040 gatggtgcgt atatgatagt ctcgttttat attttatttc acttgatttt tacctttttt 2100 tgtggttaat taatcatcta ccattggttc tctttacctt caggagctgc atttgtaaag 2160 gctgcacaag cgggatatta tgatgctatt atagtggact cttctgatcc cattggtacg 2220 ctattactat ttaataccaa gactattctt attaaataag ctactaagaa actaattgaa 2280 taattaataa acgtaactgt aattgatttc taaaataata tatataattt caggtccagc 2340 aaaagatttg tttgagaggc cattctttga ggcagtagcc aaagccctta ggccaggagg 2400 agttgtatgc acacaggctg aaagcatttg gcttcatatg catattatta agcaaatcat 2460 tgctaactgt cgtcaagtct ttaagggttc tgtcaactat gcttggacaa ccgttccaac 2520 atatcccacg tattcttttt ctctctctct cttcctgtct ttttcgatgc aatgtaaatt 2580 tataaaattg gaagtccgtt ttacttttct atagacgtag atcctaaaat tgtcaagaaa 2640 tggagaattg acttacaaga aaaatcaact tcttttcatt tactattctt tttggtgaca 2700 aactttactt attatttcgt tctaaaatga aaatttattt ttatatttta aaataattta 2760 gctttaaact tttaatttta cttgttatat ttttaataaa aaagatttat agtcaaataa 2820 atgttgtgac catataaaaa cctccgcatt tttaagatca taagtttcag agtcaaacga 2880 gttaatttat ttttagtatg ccggtgcgga gtcaaattat gtcataaaaa ttgaaacgga 2940 gtgagaacat ttttatttcg agtaaacttt caaggtattg tgtttaattt caagtgatac 3000 tgatcaatga tgtcttaaat attttgattt cagcggtgtg atcggttata tgctctgctc 3060 tactgaaggg ccagaagttg acttcaagaa tccagtaaat ccaattgaca aagagacaac 3120 tcaagtcaag tccaaattag gacctctcaa gttctacaac tctgatgtaa cttcatatct 3180 cacaatttct ttttccgttt tactgtatgt tcttcgtcaa attttataac taactctttt 3240 catattgtct tttttttcag attcacaaag cagcattcat tttaccatct ttcgccagaa 3300 gtatgatcga gtcttaatca agtgaataat gaacactggt agtacaatca ttggaccaag 3360 atcgagtctt aatcaagtga ataaataagt gaaatgcgac gtattgtagg agaattctgc 3420 agtaattatc ataatttcca attcacaatc attgtaaaat tctttctctg tggtgtttcg 3480 tactttaata taaattttcc tgctgaagtt ttgaatcgac gtttcaactc aatcctcgca 3540 aatcagttca ttaccctctt tcagtgtact atagtaaaca aatctcatag ttaccgtggt 3600 gttgtttttt gactatgaga ttttcgatct ttattaaggt tttggtctat gttttggaat 3660 tgtattgaat atatttgtaa cttactatgt atctaaatcg gctagtctct cttttttaat 3720 aaatggcgtc attgccgttg tagtttgttt actcggtact attttatcag cagtttcgat 3780 ttgtttgctc attttttaga agagggttga aatgtctttg ttgtaagata actttaccat 3840 atcttataga ttagtataga atgacccgtt ctgagccggg gccaaactta tattatttta 3900 taaaaagaat ggataaattt ctttgatatg tatcagttta ttgttattaa ttagagatat 3960 agtttgagaa gctcaatgcg atgaaagaga gtaacatcgc tatattaaac taatcacaaa 4020 atagcacttt gaataagtct tcggatccca tgttgtagta ggacaaacaa taactttgtt 4080 tctatttatt tatcgttcta ttttcaccca tcaaacaaaa agtaaatttg tttctattta 4140 gtttgaatag tcgcgtagaa aattcggtag atagcagaac aaagaaaata aattcaagcc 4200 aaaaatagat catatttact gttgttcttt cagcaactac tattttgcat cagttacaag 4260 accaatatgc tttaccgtat aacaaaaata taaatgtata tgccagtaaa ttacaga 4317 <210> 2 <211> 4210 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 2 gaattttgta aatgcttttt ttggctcagt gattttgtgg agttgggaaa aatcctattg 60 gaaagtaggt cgtggttttt tcaccttttg aaccaggtat ttttcatgta aaaatacttg 120 tgttctttac tttttgcatt tactattcca caactgtagt gtaaggaaca cgtagaagaa 180 ccatgtccta taatctgtgc acgcgaaaaa ttggacacca cgcaaatcac ccttattgtg 240 tgtcattgaa atataaaaca tcaagctcaa tcatagatta atcttttttt agtaccaaca 300 tcatatgcaa aaatcaattc aacccccaaa acataataca accaatgtta atgcaatatc 360 tctgctgcta tcacgaaaat aattgtagct cacgaaagta ggatacatta tgtaggttac 420 atcacataga ggtaatctaa agctcccaat aataagatgt gtaatgttga ttatgtagaa 480 atttgccagg ttatttagaa taaacaagaa gaggagaaaa aaagtacaat ttacctgaac 540 tcttgaatgt atcctacaaa taacctagac ttcatggacg tcagttgtca gtttactttt 600 gttttaatgg tacatcattt gtcaaatact ttatttggat aaaaacagtt ttgcctaagg 660 agtaaacaga tccggagtaa gaaagcagac gattaaagca atttttaaaa aaggagagag 720 aaattaatga gcacacacat atactagtga aattagggta ctaatttact aataattgca 780 ccgagacaaa cttatatttt agttccaaaa tgtcagtcta accctgcacg ttgtaataaa 840 tttttaactc tattatatta tatcgagttg cgccctccac tcctcggtgt ccaaattgta 900 tttaaatgca tagatgttta atgggagtgt acagcaagct ttcggaaaat acaaaccata 960 atactttctc ttcttcaatt tgtttagttt aattttgaaa atggaagtca tatctaccaa 1020 cacaaatggc tctaccatct tcaagaatgg tgccattccc atgaacggcc accaaaatgg 1080 cacttctgaa cacctcaacg gctaccagaa tggcacttcc aaacaccaaa acgggcacca 1140 gaatggcact ttcgaacatc ggaacggcca ccagaatggg acatccgaac aacagaacgg 1200 gacaatcagc catgacaatg gcaacgagct actgggaagc tccgactcta ttaagcctgg 1260 ctggttttca gagtttagcg cattatggcc aggttagtat taagaaagaa actcaaatgc 1320 atcgtactct tgtattttgg tttgtgtata atttataata tggataaatt atgacgaagt 1380 aaactcgcat acattaattt gaaataatct aattttgcag gtgaagcatt ctcacttaag 1440 gttgagaagt tactattcca ggggaagtct gattaccaag atgtcatgct ctttgaggta 1500 attaatattc tgatacacat gctttaatct aaagtgatac ttttaattta cttttagttt 1560 attgcatgtg cacgtacagt cagcaactta tgggaaggtt ctgactttgg atggagcaat 1620 tcaacataca gagaatggtg gatttccata cactgaaatg attgttcatc taccacttgg 1680 ttccatccca aacccaaaaa aggttttgat catcggcgga ggaattggtt ttacattatt 1740 cgaaatgctt cgttatcctt caatcgaaaa aattgacatt gttgagatcg atgacgtggt 1800 agttgatgta agtcaaactt cttttaccca cataaagaaa atgatttaga ttgcaattct 1860 ttttattttt ctaaaagaat aaatatattc tctctttttt tttttaaaac aaaattctct 1920 ttcttacagg tatccagaaa atttttccct tatctggcag ctaattttaa cgatcctcgt 1980 gtaaccctag ttctcggaga tggtgcgtat atgatagtct cgttttatat tttatttcac 2040 ttgattttta cctttttttg tggttaatta atcatctacc attggttctc tttaccttca 2100 ggagctgcat ttgtaaaggc tgcacaagcg ggatattatg atgctattat agtggactct 2160 tctgatccca ttggtacgct attactattt aataccaaga ctattcttat tatataagct 2220 actaagaaac taattgaata attaataaac gtaactgtaa ttgatttcta aaataatata 2280 tataatttca ggtccagcaa aagatttgtt tgagaggcca ttctttgagg cagtagccaa 2340 agcccttagg ccaggaggag ttgtatgcac acaggctgaa agcatttggc ttcatatgca 2400 tattattaag caaatcattg ctaactgtcg tcaagtcttt aagggttctg tcaactatgc 2460 ttggacaacc gttccaacat atcccacgta ttctttttct ctctctcttc ctgtcttttt 2520 cgatgcaatg taaatttata aaattggaag tccgttttac ttttctatag acgtagatcc 2580 taaaattgtc aagaaatgga gaattgactt acaagaaaaa tcaacttctt ttcatttact 2640 attctttttg gtgacaaact ttacttatta tttcgttcta aaatgaaaat ttatttttat 2700 attttaaaat aatttagctt taaactttta attttacttg ttatattttt aataaaaaag 2760 atttattgtc aaataaatgt tgtggccata caataagttt caaattatgt cacaaaaatt 2820 gaaacagagt gagcaaattt ttatttcaag taaactttca aggaattgtg tttaagtttt 2880 ctcaactgat actgatcaat gatgtcttaa atattttgat ttcagcggtg tgatcggtta 2940 tatgctctgc tctactgaag ggccagaagt tgacttcaag aatccagtaa atccaattga 3000 caaagagaca actcaagtca agtccaaatt aggacctctc aagttctaca actctgatgt 3060 aacttcatat ctcacaattt ctttttccgt tttactgtat gttcttcatc aaattttata 3120 actaactctt ttcatattgt cttttttttt cagattcaca aagcagcatt cattttacca 3180 tctttcgcca gaagtatgat cgagtcttaa tcaagtgaat aatgaacact ggtcgtacaa 3240 tcattggacc aagatcaagt cttaatcaag tgaataaata agtgaaatgc aacgtattgt 3300 atgagaattc tgcagtaatt atcataattt ccaattcact aattgttgta aaattctttc 3360 tctgtggtgt ttggtacttt aatataaatt ttcctgctga agttttaaaa tggacgttcc 3420 aattcgatcc tcgcaaatca gttcattatc cttctttcag tgtactaaag ccaacaaatc 3480 tcatagttac cgtggtgttg tttttactat gggatttgcg atcttattaa ggttttggtc 3540 tatgttttgg aattgtaata ttcatatttt taagttactc tgtatctaaa tcggcctagt 3600 ctctcttttt taataaatgg cgtcatcgtc gttgcagttt gtttgctcat ttttcagaag 3660 tatgatggtt tgaaatgtct ttgtttctat ggcctcttta ctgcagctta ccgatttgct 3720 tatgttggat attgcttctg attcatatgg gatatgaagt ttggtatttg ttgaatgatt 3780 aaggaaaaaa tttacaacaa taactatgcc tcaatcccaa cctaattatg atcagcgctt 3840 caaaaaaaaa aaaaaagtag aactaaaatt tttaagctta gatgcaaatc cataacactg 3900 taaaaaaaag tagggatttc tgttcctttc ttttatagtt aagaaagaac tctctgcctt 3960 gtgaatctta ttgcatctct ctaattcagc aaaataattg aacaatgact aggataaaat 4020 atttcagcta agataaccct aattttctgg atggaatcac cttctccacc aagttgttat 4080 tttcttgcat tgtgagcaga ctagttcaat tacaccatta gagttttttc tcagcactat 4140 cctggcaatg atgcgctaag ctctgaaaac caattagcct taatagagtt ggagctcccc 4200 aataactctt 4210 <210> 3 <211> 3686 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 3 ttgtgagaga tttggtgtcc tctacaatga ttgttgaagt ccctatttat agctatacac 60 aggaaacaaa atcctaggat caagcccctc ttaaatgaca ataatggggt taatgatgaa 120 tatgtagcgg catgacatga atgccaaaat tctccgcaac gactatttat ttaatattga 180 ggaatatttt ttattaaata ctatctggtg acaagcattc gtttgcttcc gttgattacg 240 ttgattttgg gatctactct ataccaaccg aagccgttgt ccttgatctt cgctttcatt 300 taattcatct tccgtctgcc tccgatttca caagtcatgc acccattcaa ttatttaatg 360 gaaaccaatt ttaccctata caaatggtac atcattcgtc aaatacttta cttggatata 420 aacaattttg cccgaggagt aaacagatgc gaagaaagaa agcagacgat taaagaaatt 480 tttaaaaaag gagagagaaa tgaacacaca catgtactaa taaaattagg gtactacttt 540 actaataatt ggacagagac taaattcata ttttagttcc aaaatgtctc gggcagtcca 600 accatgcacg ttgtaatgat tttttaactc tattatatcg agttgcgccc tccactcctc 660 ggtgtccaaa ttgtatataa atgcatatgt gtctattggg agtgtacatc aagctttcat 720 aaagtacaaa tcgtaatact tgttgaaaca taatactttc tcttctccaa tttgtttagt 780 ttaattttga aaatggaagt catatctacc aacacaaatg gctctaccat cttcaagagt 840 ggtgccattc ccatgaatgg ccaccataat ggcacttcca aacaccaaaa cggccacaag 900 aatgggactt ccgaacaaca gaacgggaca atcagccttg ataatggcaa cgagctactg 960 ggaaactcca attgtattaa gcctggttgg ttttcagagt ttagcgcatt atggccaggt 1020 tagtactgag aaagaaactc aaatgcatat ttaaagttaa aattgttagg ctaatataag 1080 gagttgatat tcttttagtg attaattaaa aaggaaaaag tatcaaataa attcaaaaaa 1140 tggatagtaa cttcgcatat tactctacac attaatttga aataaatcga attttgcagg 1200 tgaagcattc tcacttaagg ttgagaagtt actgttccag gggaagtctg actaccaaga 1260 tgtcatgctc tttgaggtaa ataatatttt aatacacatg cttccattta aattgatact 1320 tttaatttac ttttacttta ttgcatgtgt acgtacagtc agcaacttat gggaaggttc 1380 tgactttgga tggagcaatt caacacacag agaatggtgg atttccatac actgaaatga 1440 ttgttcatct tccacttggt tccatcccaa acccaaaaaa ggttttgatc atcggcggag 1500 gaattggttt tacattattc gaaatgcttc gttatcctac aatcgaaaaa attgacattg 1560 ttgagatcga tgacgtggta gttgatgtaa gtcaaacttc ttttactcac ataaaaaaat 1620 ggtttagatt gcttcttgtt atttttctaa aagaatacta tttttttaaa acaaaatttt 1680 cttttttaca ggtatctaga aaatttttcc cttatctcgc tgctaatttt aacgatcctc 1740 gtgtaaccct agtccttgga gatggtgcgt atttgataat ctcgcttttg ttttatcttt 1800 tatttttatt gcatttaatt tttacctttt ggtgtgtggt taattcacct gccattggtt 1860 ctctttcatt tcaggggctg catttgtaaa ggctgcacaa gcagaatatt atgatgctat 1920 tatagtggac tcttctgatc ccattggtac tctattactt cttaatacca agactaatct 1980 tattgaataa gctactaata aacggtaatt gatttctaaa acaatataat ttcaggtcca 2040 gcaaaagatt tgtttgagag gccattcttt gaggcagtag ctaaagccct aaggccagga 2100 ggagttgtat gcacacaggc tgaaagcatt tggcttcata tgcatattat taagcaaatc 2160 attgctaact gtcgtcaagt ctttaagggc tctgtcaact atgcttggac tactgttcca 2220 acatatccaa cgtatttttc tctctctctc tcttcctata aaattggaag ttttgattct 2280 ataattgtca agaaatggag aatcagttcc aagaaaaacc aacttctttt cttttactct 2340 tcaaggtatt gtgtttaatt ttttttcaac tgatatgatc aattattttg atttcagcgg 2400 tgtgattggt tatatgctct gctctactga aggaccagaa attgacttca agaatccagt 2460 aaatccaatt gacaaagaga cagctcaagt caagtccaaa ttagcacctc tcaagttcta 2520 caactctgat gtaacttcat atctcacaat ttcttttttc ctattgtact ttatgttctt 2580 cgtcaaattt tataattaac tcttttcaaa ttgtcttttt ttttttcaga ttcacaaagc 2640 agcattcatt ttgccatctt tcgccagaag tatgatcgag tcttaatcaa ctgattaatg 2700 aatactggtg gtacaatcat tggaccaaga tcaataagtg aaagacgtat tgtatgagaa 2760 ttctgcagta attaattatc ataatttcca atttaccaat tattgtaaaa ttctttctct 2820 gtggtgtttg gtactttaat ataaattttc ctgcttaagt tttgaatcga cgtatcaact 2880 caatcctcgc aaatcacttc attaccctcc tttcagtgta ctaaagtaaa ctgttgcgga 2940 atatcgtggg ttaactagaa cacaatcaca cacaaatcaa atagagaaga atttattaac 3000 ggggttcggc taagcctaat cctcaggaca aaagcagaga gagttttcca ctatgaatga 3060 gaagaaaaac acaatacaat atataaaatc ctcaactaca acccctatat atgatcccaa 3120 aaggtcccaa acatatatga gaaaagtttc ccaatttgac aaagattata ggttttcctt 3180 tcccaaatct attagggcaa tgggttttct taaacctatg gggactatgg ctttcctaaa 3240 aatacaagga aataattcaa accacaaata ataaatcttc cccttggctt gaattctctt 3300 catcaacagg aacaatagct ctctaccttg ccctcaaccc tcgcaagggc tctattgatt 3360 gtcgcacaca tcaaccaagt ctaggcaacg cctaaacttg ttatgagact taatctcttc 3420 agccatagca ctaatccgtc gatttggttc tgtacccgaa atagcttttg gatagctata 3480 acactgaaac acatcagtgg tctctgcaac taccaaagca aatcccacag tattcgtata 3540 tccaagaaga tttccatcaa ctacgtttgc aaacctttgc ggtcggttga tcactctctt 3600 ctctctgtat gttgcaatgc tatatggttg ttgttgcgca ggtgcatcaa cattatcgtc 3660 ttgatcaata ttttgtacct cctcta 3686 <210> 4 <211> 4035 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 4 ggaagagtgt ggtatgggag atgcctccca gggagtacct aaagctgaat actgatggaa 60 gttttaacaa acaaattggg aaagcaggga ttggagggat tctcagagat gaagagggag 120 gctttgtcat ggctttttcg atgcctataa tctataataa catcagtgaa gcagaattga 180 aagccatcaa gtatgggtgt gaatggtgca aatacaaagg aatatcaaac ttcattgtgg 240 aaactgactc gaggatgatc tatgacatac tacagaccaa aaatctaagc aacaacaagt 300 tgaaacaaga gaccgagaaa ttaatggaga ttctggacac ctgcaggaca cctgttaccc 360 attgccttcg cgaagcaaat caagtggcag actggtttgc taaagaggcc accagagcta 420 acgaaggtat cactcataca gattttagac aggtatcaaa agcggccaag ggccctttct 480 tcatggatat gtggcaggtc ccttatttta gaattagata tgaaaaatct aatttttttt 540 tgtaagttaa ttctgtgtat agtgagagga aatcgtctaa tatgtatttt tgcccataga 600 ctcttcctct ccttaggtaa aaaggtagct ccgaggtaag gtttatgttc ccctcagtgt 660 aacctttttt tgtttatata atagacatgg tatgggtcca gctaaacccc caacaccaca 720 ggggatagat acctgggtga ttggtttatt ttttaaaaaa aaaaacttta ctaataattg 780 cacggagaca aaacttatat tttagttcca aaatgacagt ccaaccatgc acgttgtaat 840 gattttttaa ctctattata tcgagttccg ccctccactc ctcggtgtcc aaattgtatt 900 taaatgcata gatatgttta ttgggagtgt acatcaagct ttcagaaaat acaaaccata 960 atactttctc ttctccaatt tgcttagttt aatttggaaa atggaagtca tatctaccaa 1020 cacaaatggc tctactatct tcaagaatgg tgccattccc atgaacggtt accagaatgg 1080 cacttccaaa caccaaaacg gccaccagaa tggcacttcc gaacatcgga acggccacca 1140 gaatgggatt tccgaacacc aaaacggcca ccagaatggc acttccgagc atcagaacgg 1200 ccatcagaat gggacaatca gccatgacaa cggcaacgag ctacagctac tgggaagctc 1260 caactctatt aagcctggtt ggttttcaga gtttagcgca ttatggccag gttagtacta 1320 agaaagaaac tcaaatgcat cgtactcttg tattctgctt tgcgtataat ttagatgatg 1380 gtgtttgact aagcactgag tttaaaaata aaaagtttaa agttaaattg ttactataga 1440 gagctatatc tttaggaact aactaaaaag gaaaaattat cacataaaat tgggatgaag 1500 taagcagtta acttcgcata ttattcgaca cattaatttg aaataaatcg aattttgcag 1560 gtgaagcatt ctcacttaag gttgagaagt tactattcca ggggaagtct gattaccaag 1620 atgtcatgct ctttgaggta attaattaat actaatagtc aagctcatgt atgattatat 1680 ttaaagtggt atttttcgtt tatttttaat ttattgcacg tgtacgtaca gtcagcaaca 1740 tatgggaagg ttctgacttt ggatggagca attcaacaca cagagaatgg tggatttcca 1800 tacactgaaa tgattgttca tcttccactt ggttccatcc caaaccctaa aaaggttttg 1860 atcatcggcg gaggaattgg ttttacatta ttcgaaatgc ttcgttatcc tacaatcgaa 1920 aaaattgaca ttgttgagat cgatgacgtg gtagttgatg taagtcaaac ttcttttact 1980 cacataaaaa aatgatttag attcttattt ttctaaaaga attaaaacaa aattttccgt 2040 tttacaggta tctagaaaat ttttccctta tcttgctgct aattttagcg atcctcgtgt 2100 aaccctagtc cttggagatg gtgcgtattt gataatctcg tttttatttt atcttttact 2160 tttattttat ttaattttta cctttttgtg tgtggttaat tcacctgcca ttggttcttt 2220 ttatttcagg ggctgcattt gtaaaggccg cacaagcagg atattatgat gctattatag 2280 tggactcttc tgatcccatt ggtactctat tactacttaa taccaagact attcttatta 2340 aataagctac taataaacgt aactctgata gttttctaaa ataatataat ttcaggtcca 2400 gcaaaagact tgtttgagag gccattcttt gaggcagtag ccaaagccct aaggccagga 2460 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aggttgagaa gttactattc caggggaagt ctgattacca agatgtcatg 360 ctctttgagt cagcaactta tgggaaggtt ctgactttgg atggagcaat tcaacataca 420 gagaatggtg gatttccata cactgaaatg attgttcatc taccacttgg ttccatccca 480 aacccaaaaa aggttttgat catcggcgga ggaattggtt ttacattatt cgaaatgctt 540 cgttatcctt caatcgaaaa aattgacatt gttgagatcg atgacgtggt agttgatgta 600 tccagaaaat ttttccctta tctggcagct aattttaacg atcctcgtgt aaccctagtt 660 ctcggagatg gagctgcatt tgtaaaggct gcacaagcgg gatattatga tgctattata 720 gtggactctt ctgatcccat tggtccagca aaagatttgt ttgagaggcc attctttgag 780 gcagtagcca aagcccttag gccaggagga gttgtatgca cacaggctga aagcatttgg 840 cttcatatgc atattattaa gcaaatcatt gctaactgtc gtcaagtctt taagggttct 900 gtcaactatg cttggacaac cgttccaaca tatcccaccg gtgtgatcgg ttatatgctc 960 tgctctactg aagggccaga agttgacttc aagaatccag taaatccaat tgacaaagag 1020 acaactcaag tcaagtccaa attaggacct ctcaagttct acaactctga tattcacaaa 1080 gcagcattca ttttaccatc tttcgccaga agtatgatcg agtcttaa 1128 <210> 8 <211> 1062 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 8 atggaagtca tatctaccaa cacaaatggc tctaccatct tcaagagtgg tgccattccc 60 atgaatggcc accataatgg cacttccaaa caccaaaacg gccacaagaa tgggacttcc 120 gaacaacaga acgggacaat cagccttgat aatggcaacg agctactggg aaactccaat 180 tgtattaagc ctggttggtt ttcagagttt agcgcattat ggccaggtga agcattctca 240 cttaaggttg agaagttact gttccagggg aagtctgact accaagatgt catgctcttt 300 gagtcagcaa cttatgggaa ggttctgact ttggatggag caattcaaca cacagagaat 360 ggtggatttc catacactga aatgattgtt catcttccac ttggttccat cccaaaccca 420 aaaaaggttt tgatcatcgg cggaggaatt ggttttacat tattcgaaat gcttcgttat 480 cctacaatcg aaaaaattga cattgttgag atcgatgacg tggtagttga tgtatctaga 540 aaatttttcc cttatctcgc tgctaatttt aacgatcctc gtgtaaccct agtccttgga 600 gatggggctg catttgtaaa ggctgcacaa gcagaatatt atgatgctat tatagtggac 660 tcttctgatc ccattggtcc agcaaaagat ttgtttgaga ggccattctt tgaggcagta 720 gctaaagccc taaggccagg aggagttgta tgcacacagg ctgaaagcat ttggcttcat 780 atgcatatta ttaagcaaat cattgctaac tgtcgtcaag tctttaaggg ctctgtcaac 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gggtatatgc tctgctctac tgaagggcca gaagttgact tcaagaatcc aataaatcca 1140 attgacaaag agacaactca agtcaagtcc aaattagcac ctctcaagtt ttacaattct 1200 gatattcaca aagcagcatt cattttgcca tctttcgcca gaagtatgat cgagtcttaa 1260 <210> 11 <211> 375 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 11 Met Glu Val Ile Ser Thr Asn Thr Asn Gly Ser Thr Ile Phe Lys Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Pro Met Asn Gly His Gln Asn Gly Ser Ser Glu His Leu 20 25 30 Asn Gly Tyr Gln Asn Gly Ile Ser Lys His Gln Asn Gly His Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Ser Glu His Arg Asn Gly His Gln Asn Gly Thr Ser Glu Gln 50 55 60 Gln Asn Gly Thr Ile Ser His Asp Asn Gly Asn Glu Leu Leu Gly Ser 65 70 75 80 Ser Asn Ser Ile Lys Pro Gly Trp Phe Ser Glu Phe Ser Ala Leu Trp 85 90 95 Pro Gly Glu Ala Phe Ser Leu Lys Val Glu Lys Leu Leu Phe Gln Gly 100 105 110 Lys Ser Asp Tyr Gln Asp Val Met Leu Phe Glu Ser Ala Thr Tyr Gly 115 120 125 Lys Val Leu Thr Leu Asp Gly Ala Ile Gln His Thr Glu Asn Gly Gly 130 135 140 Phe Pro Tyr Thr Glu Met Ile Val His Leu Pro Leu Gly Ser 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oligonucleotide <400> 18 gttgttcgga tgtcccattc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ctaaactctg aaaaccaacc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 tttcagagtt tagcgcatta 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 gatggagcaa ttcaacatac aga 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 gatggagcaa ttcaacacac aga 23 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 tggcatttcc aaacaccaaa cgggcaccag aatggcactt 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ccaactctat taagcctggt ggttttcaga gtttagcgca 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ttctgacttt ggatggagca atacagagaa tggtggattt 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 ctgactttgg atggagcaat gagaatggtg gatttccata 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 tgactttgga tggagcaatt cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 tgactttgga tggagcaatt agaatggtgg atttccatac 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gactttggat ggagcaattc agagaatggt ggatttccat 40 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 gactttggat ggagcaattc gagaatggtg gatttccata 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 gactttggat ggagcaattc agaatggtgg atttccatac 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 gactttggat ggagcaattc tggatttcca tacactgaaa 40 <210> 33 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 actttggatg gagcaattca tacagagaat ggtggatttc c 41 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 actttggatg gagcaattca cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 actttggatg gagcaattca agagaatggt ggatttccat 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 actttggatg gagcaattca gagaatggtg gatttccata 40 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 actttggatg gagcaattca atacactgaa atgattgttc 40 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ctttggatgg agcaattcaa tacagagaat ggtggatttc 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 ctttggatgg agcaattcaa cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ctttggatgg agcaattcaa gagaatggtg gatttccata 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ctttggatgg agcaattcaa agaatggtgg atttccatac 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 tttggatgga gcaattcaac tacagagaat ggtggatttc 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 tttggatgga gcaattcaac cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 44 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 tttggatgga gcaattcaac agagaatggt ggatttccat 40 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 tttggatgga gcaattcaac gagaatggtg gatttccata 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 tttggatgga gcaattcaac agaatggtgg atttccatac 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 tttggatgga gcaattcaac aatggtggat ttccatacac 40 <210> 48 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ttggatggag caattcaaca cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 ttggatggag caattcaaca gagaatggtg gatttccata 40 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 tggatggagc aattcaacat agagaatggt ggatttccat 40 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 tggatggagc aattcaacat gagaatggtg gatttccata 40 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 tggatggagc aattcaacat agaatggtgg atttccatac 40 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 tggatggagc aattcaacat aatggtggat ttccatacac 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 ggatggagca attcaacata gagaatggtg gatttccata 40 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 caattcaaca tacagagaat gtggatttcc atacactgaa 40 <210> 56 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 gcacttccaa acaccaaaac agggcaccag aatggcactt t 41 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 ttctgacttt ggatggagca atacagagaa tggtggattt 40 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 ttctgacttt ggatggagca gagaatggtg gatttccata 40 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 ctgactttgg atggagcaat acagagaatg gtggatttcc 40 <210> 60 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 ctgactttgg atggagcaat gagaatggtg gatttccata 40 <210> 61 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 tgactttgga tggagcaatt cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 tgactttgga tggagcaatt agaatggtgg atttccatac 40 <210> 63 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gactttggat ggagcaattc agagaatggt ggatttccat 40 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 gactttggat ggagcaattc gagaatggtg gatttccata 40 <210> 65 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 gactttggat ggagcaattc agaatggtgg atttccatac 40 <210> 66 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 gactttggat ggagcaattc gaatggtgga tttccataca 40 <210> 67 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 gactttggat ggagcaattc tggatttcca tacactgaaa 40 <210> 68 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 68 actttggatg gagcaattca atacagagaa tggtggattt 40 <210> 69 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 actttggatg gagcaattca acagagaatg gtggatttcc 40 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 actttggatg gagcaattca agagaatggt ggatttccat 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 actttggatg gagcaattca gagaatggtg gatttccata 40 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 actttggatg gagcaattca agaatggtgg atttccatac 40 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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78 ctttggatgg agcaattcaa agaatggtgg atttccatac 40 <210> 79 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 tttggatgga gcaattcaac tacagagaat ggtggatttc c 41 <210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 tttggatgga gcaattcaac agagaatggt ggatttccat 40 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 tttggatgga gcaattcaac gagaatggtg gatttccata 40 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 tttggatgga gcaattcaac agaatggtgg atttccatac 40 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 tttggatgga gcaattcaac gaatggtgga tttccataca 40 <210> 84 <211> 40 <212> DNA 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Synthetic oligonucleotide <400> 89 ttggatggag caattcaaca agaatggtgg atttccatac 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ttggatggag caattcaaca gaatggtgga tttccataca 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 91 ttggatggag caattcaaca aatggtggat ttccatacac 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 92 tggatggagc aattcaacat agagaatggt ggatttccat 40 <210> 93 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 tggatggagc aattcaacat agaatggtgg atttccatac 40 <210> 94 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 94 tggatggagc aattcaacat atggtggatt tccatacact 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 tttggatgga gcaattcaac acagagaatg gtggatttcc 40 <210> 117 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 tttggatgga gcaattcaac agagaatggt ggatttccat 40 <210> 118 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 tttggatgga gcaattcaac gagaatggtg gatttccata 40 <210> 119 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 tttggatgga gcaattcaac agaatggtgg atttccatac 40 <210> 120 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 tttggatgga gcaattcaac aatggtggat ttccatacac 40 <210> 121 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 tttggatgga 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 tttggatgga gcaattcaac gagaatggtg gatttccata 40 <210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 ttggatggag caattcaaca cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 ttggatggag caattcaaca gagaatggtg gatttccata 40 <210> 162 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 ttggatggag caattcaaca agaatggtgg atttccatac 40 <210> 163 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 ttggatggag caattcaaca ggatttccat acactgaaat 40 <210> 164 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 tggatggagc aattcaacac agagaatggt ggatttccat 40 <210> 165 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 tggatggagc aattcaacac agaatggtgg atttccatac 40 <210> 166 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 tggatggagc aattcaacac tggtggattt ccatacactg 40 <210> 167 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 ggatggagca attcaacaca gagaatggtg gatttccata 40 <210> 168 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 tggagcaatt caacacacag atggtggatt tccatacact 40 <210> 169 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 tggagcaatt caacacacag tggtggattt ccatacactg 40 <210> 170 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 ggagcaattc aacacacaga aatggtggat ttccatacac 40 <210> 171 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 caattcaaca cacagagaat atttccatac actgaaatga 40 <210> 172 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 aacacacaga gaatggtgga aaatgattgt tcatcttcca 40 <210> 173 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 cggcacttcc aaacaccaaa cggccaccat aatggcactt 40 <210> 174 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 ttttgacttt ggatggagca agagaatggt ggatttccat 40 <210> 175 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 ttgactttgg atggagcaat gaatggtgga tttccataca 40 <210> 176 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 tgactttgga tggagcaatt cagagaatgg tggatttcca 40 <210> 177 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 tgactttgga tggagcaatt agaatggtgg atttccatac 40 <210> 178 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 gactttggat ggagcaattc aatggtggat ttccatacac 40 <210> 179 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 gactttggat ggagcaattc tggtggattt ccatacactg 40 <210> 180 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 actttggatg 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Synthetic oligonucleotide <400> 191 ttggatggag caattcaaca agaatggtgg atttccatac 40 <210> 192 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 tggatggagc aattcaacac agagaatggt ggatttccat 40 <210> 193 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 tggatggagc aattcaacac gagaatggtg gatttccata 40 <210> 194 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 tggatggagc aattcaacac agaatggtgg atttccatac 40 <210> 195 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 tggatggagc aattcaacac atggtggatt tccatacact 40 <210> 196 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 ggatggagca attcaacaca gagaatggtg 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tabacum <400> 305 tggatggagc aattcaacac acagagaatg gtggatttcc ata 43 <210> 306 <211> 44 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 306 tggatggagc aattcaacac acagagaatg gtggatttcc atac 44 <210> 307 <211> 42 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 307 ggatggagca attcaacaca cagagaatgg tggatttcca ta 42 <210> 308 <211> 44 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 308 ggatggagca attcaacaca cagagaatgg tggatttcca taca 44 <210> 309 <211> 49 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 309 ggatggagca attcaacaca cagagaatgg tggatttcca tacactgaa 49 <210> 310 <211> 46 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 310 gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt ggatttccat acactg 46 <210> 311 <211> 41 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 311 tggcacttcc aaacaccaaa acggccacca gaatggcact t 41 <210> 312 <211> 41 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 312 ccaactctat taagcctggt tggttttcag agtttagcgc a 41 <210> 313 <211> 42 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 313 aacatatggg aaggttctga ctttggatgg agcaattcaa ca 42 <210> 314 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60 atacactgaa atgattgttc atctt 85 <210> 698 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 698 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 699 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 699 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 700 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 700 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 701 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 701 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 702 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 702 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 703 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 703 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 704 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 704 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 705 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 705 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 706 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 706 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 707 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 707 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 708 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 708 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 709 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 709 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 710 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 710 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 711 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 711 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 712 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 712 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 713 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 713 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 714 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 714 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 715 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 715 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 716 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 716 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 717 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 717 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 718 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 718 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 719 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 719 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 720 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 720 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 721 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 721 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 722 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 722 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 723 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 723 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 724 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 724 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 725 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 725 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 726 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 726 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 727 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 727 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 728 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 728 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93 <210> 729 <211> 93 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 729 tcagcaacat atgggaaggt tttgactttg gatggagcaa ttcaacacac agagaatggt 60 ggatttccat acactgaaat gattgttcat ctt 93

Claims

담배 식물 또는 이의 일부로서,
PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하되,
상기 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 갖지 않는 대조군 담배 식물로부터의 잎의 니코틴 수준보다 적은 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 4개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항에 있어서, 상기 담배 식물은 PMT1a, PMT1b, PMT2, PMT3 및 PMT4로 이루어진 군으로부터 선택되는 5개의 PMT 유전자에 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자를 갖지 않는 대조군 담배 식물로부터의 잎의 니코틴 수준의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 또는 0.25% 미만의 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 상기 대조군 담배 식물로부터의 잎의 총 알칼로이드 수준의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 또는 0.25% 미만의 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제7항에 있어서, 상기 담배 식물은, 유사한 조건하에 성장 및 가공될 때, 상기 대조군 담배 식물로부터의 잎의 총 알칼로이드 수준의 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 또는 5% 미만의 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는,담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 프로모터, 5' UTR, 제1 엑손, 제1 인트론, 제2 엑손, 제2 인트론, 제3 엑손, 3' UTR, 종결인자 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 영역에 돌연변이를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이, 스플라이스-부위 돌연변이 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 유형을 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 다음의 pmt 단백질 절단, 비-번역가능 PMT 유전자 전사체, 비-기능성 PMT 단백질, pmt 유전자에서의 조기 정지 코돈 및 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 초래하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 야생형 PMT 유전자와 비교하여, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 중복 및 역위로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 동형접합성(homozygous), 이형접합성(heterozygous) 및 이형대립유전자(heteroallelic)로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합성 상태를 포함하는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 적어도 1개 내지 5개의 PMT 유전자에서 동형접합성 또는 이형대립유전자인, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 적어도 4개의 PMT 유전자에서 동형접합성 또는 이형대립유전자인, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이체 대립유전자는 5개의 PMT 유전자 모두에서 동형접합성 또는 이형대립유전자인, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 PMT 유전자는 PMT1a 및 PMT3인, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담배 식물은 0.15% 미만, 0.125% 미만, 0.1% 미만, 0.08% 미만, 0.06% 미만, 0.05% 미만, 0.04% 미만, 0.03% 미만, 0.02% 미만 및 0.01% 미만의 건조 중량으로 이루어진 군으로부터 선택되는 니코틴 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담배 식물은 1% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만 및 0.2% 미만의 건조 중량으로 이루어진 군으로부터 선택되는 총 알칼로이드 수준을 포함하는 잎을 생산할 수 있는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담배 식물은 2 내지 0.05ppm, 1.9 내지 0.05ppm, 1.8 내지 0.05ppm, 1.7 내지 0.05ppm, 1.6 내지 0.05ppm, 1.5 내지 0.05ppm, 1.4 내지 0.05ppm, 1.3 내지 0.05ppm, 1.2 내지 0.05ppm, 1.1 내지 0.05ppm, 1.0 내지 0.05ppm, 0.9 내지 0.05ppm, 0.8 내지 0.05ppm, 0.7 내지 0.05ppm, 0.6 내지 0.05ppm, 0.5 내지 0.05ppm, 0.4 내지 0.05ppm, 0.3 내지 0.05ppm, 0.2 내지 0.05ppm, 0.15 내지 0.05ppm 또는 0.1 내지 0.05ppm의 총 TSNA 수준을 포함하는 건조된 잎(cured leaf)을 생산할 수 있는, 담배 식물 또는 이의 일부.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 담배 식물의 개체군.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 담배 식물로부터의 건조된 담배 재료.
제22항에 있어서, 상기 건조된 담배 재료는 철관 건조(flue curing), 그늘 건조(air curing), 열 건조(fire curing) 및 태양 건조(sun curing)로 이루어진 군으로부터 선택되는 건조 과정에 의해 제조되는, 건조된 담배 재료.
제22항에 있어서, 상기 건조된 담배 재료는 담배 잎을 포함하되, 상기 담배 잎은 품종 LA 벌리 21(LA Burley 21)로부터의 대조군의 건조된 담배 재료와 비교하여 감소된 곰팡이 감염을 나타내는, 건조된 담배 재료.
제22항의 상기 건조된 담배 재료를 포함하는 담배 블렌드(tobacco blend).
제25항에 있어서, 상기 건조된 담배 재료는 상기 담배 블렌드의 건조 담배의 약 적어도 10 중량%, 적어도 15 중량%, 적어도 20 중량%, 적어도 25 중량%, 적어도 30 중량%, 적어도 35 중량%, 적어도 40 중량%, 적어도 45 중량%, 적어도 50 중량%, 적어도 55 중량%, 적어도 60 중량%, 적어도 65 중량%, 적어도 70 중량%, 적어도 75 중량%, 적어도 80 중량%, 적어도 85 중량%, 적어도 90 중량% 또는 적어도 95 중량%를 구성하는, 담배 블렌드.
제25항에 있어서, 상기 건조된 담배 재료는 상기 담배 블렌드의 건조 담배의 약 적어도 10 부피%, 적어도 15 부피%, 적어도 20 부피%, 적어도 25 부피%, 적어도 30 부피%, 적어도 35 부피%, 적어도 40 부피%, 적어도 45 부피%, 적어도 50 부피%, 적어도 55 부피%, 적어도 60 부피%, 적어도 65 부피%, 적어도 70 부피%, 적어도 75 부피%, 적어도 80 부피%, 적어도 85 부피%, 적어도 90 부피% 또는 적어도 95 부피%를 구성하는, 담배 블렌드.
제22항의 건조된 담배 재료를 포함하는 담배 제품.
제28항에 있어서, 상기 담배 제품은 궐련(cigarette), 시가릴로(cigarillo), 비-통기 리세스 필터 궐련(non-ventilated recess filter cigarette), 통기 리세스 필터 궐련(vented recess filter cigarette), 시가(cigar), 코담배(snuff), 파이프 담배(pipe tobacco), 시가 담배(cigar tobacco), 궐련 담배(cigarette tobacco), 씹는 담배(chewing tobacco), 잎 담배(leaf tobacco), 각초(shredded tobacco) 및 절단 담배(cut tobacco)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 담배 제품.
제28항에 있어서, 상기 담배 제품은 무연 담배 제품인, 담배 제품.
제30항에 있어서, 상기 무연 담배 제품은 루스 리프식 씹는 담배(loose leaf chewing tobacco), 플러그식 씹는 담배(plug chewing tobacco), 습식 코담배(moist snuff) 및 비강 코담배(nasal snuff)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 담배 제품.
제22항의 건조된 담배 재료를 포함하는 재생 담배(reconstituted tobacco).