KR20210032727A - 보체 인자의 모집에 의한 종양 또는 암의 세포 또는 조직 사멸을 유도하는 신규 이중 특이적 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보체 인자의 모집에 의한 표적 세포 사멸을 유도하는 이중 특이적 압타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 이중 특이적 압타머는, 저비용으로 인공 합성이 가능하여, 종래의 항체에 비하여 단가가 저렴하고, 생체 친화성이 우수하다. 또한 표적 세포의 표면 분자 및 보체 인자에 대한 이중 특이적으로 인해, 보체 인자의 모집을 억제하여 면역 저항성을 가지는 표적 세포, 특히 췌장암과 같은 종양 및 암 세포에 보체 인자를 모집함으로써, 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 추가적 변형을 통해 생체 내에서 분해되지 않고 충분히 오랫동안 활성을 유지하도록 하여, 보다 효율적으로 종양 및 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

보체 인자의 모집에 의한 종양 또는 암의 세포 또는 조직 사멸을 유도하는 신규 이중 특이적 압타머 및 이의 용도 {Novel bispecific aptamer for inducing tumor or cancer cell death by complement factor recruitment and uses thereof}

본 발명은 보체 인자의 모집에 의한 종양 또는 암의 세포 사멸을 유도하는 이중 특이적 압타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자(complement factor)에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 이중 특이적 압타머, 상기 압타머를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 압타머 또는 약학 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

압타머(Aptamer)는 높은 결합력으로 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 한 종류이다. 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)라 불리는 in vitro 진화 과정(evolution process)을 통하여, 거대한 무작위-서열 핵산 라이브러리로부터 유래할 수 있다. 현재까지, 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리 상수 값에서, 표적 분자와 결합하는, 광범위한 DNA- 및 RNA-기반 압타머가 규명되었다. 상기 압타머는 이의 수많은 독특한 특징으로 인하여 종래의 대표적인 인지 분자였던 항체의 대체물질로 각광받고 있다. 우선 첫 번째로, 압타머는 항체 사용시 요구되었던 세포주 또는 동물을 사용해야만 하는 한계가 극복될 수 있는 장점을 지닌다. 압타머는 일단 선택되면, 중합 효소 연쇄반응 또는 전사를 통한 후속적인 증폭을 거쳐, 고순도로 많은 양이 생산될 수 있다. 두 번째로, 압타머는 단순한 화학 구조를 가지므로, 실험적 목적에 따라 작용기를 추가적인 변형시킬 수 있는 이점이 있다. 마지막으로, 압타머는 항체보다 더 안정적이어서, 가혹한 조건(예컨대, 높은 온도 또는 과한 pH)에 적용하는 경우 항체에 비해 보다 적합한 이점이 있다.

한편, 췌장암, 특히 췌관선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)은 가장 공격적이고 치명적인 악성 종양 중 하나이다. 종종 조용한 살인자(silent killer)로 묘사되곤 하는 PDAC는 비교적 질병이 진행된 상태에서 진단되어 통상의 암의 치료를 위해 사용되는 외과적 제거 방법을 사용하는데 어려움이 있다(Marino, PA, and Adams, DO(1980), Cell Immunol 54: 11-25). 따라서, 조기 진단은 장기 생존의 가능성을 높이는 하나의 수단으로 간주되어 왔다. 현재 PDAC에 통상적으로 사용되는 혈청 마커는 탄수화물 항원 19-9(CA19-9)뿐이나(Hassan, MM, et al.(2007), Am J Gastroenterol 102: 2696-2707.), 해당 마커는 위양성율이 높고, 예방 보다는 질병의 진행 정도를 확인 하는데 가장 적합하다. PDAC에 대한 예측 가능한 바이오 마커를 발견하기 위한 수많은 연구가 있어 왔으나, 임상적으로 성공을 거둔 사례가 매우 드물다.

또한, 조기 진단만으로는 상기 암의 진단을 받은 환자의 예후를 개선하기에 충분하지 않다. PDAC는 내약성 및 내화학성을 가지기 때문에, 이를 치료하기 위한 효과적인 방법을 찾으려는 수많은 시도가 있었다. 체크포인트 억제제, 치료용 백신(Mallik, PK, el al.(2010), Nucleic Acids Res 38: e93 및 Cohen, M(2012), Janeway's Immunobiology. Garland Science, Taylor & Francis Group.) 및 텔로머레이즈 펩타이드(Li, D, Xie, K, Wolff, R, and Abbruzzese, JL(2004). Pancreatic cancer. The Lancet 363: 1049-1057.)와 같은 다양한 전략이 제시되었으며, 일부는 임상시험에서 테스트 되기도 하였으나, PDAC의 새로운 마커나 치료법을 찾으려는 시도는 대부분 실패로 돌아갔다.

또한, 세포 매개 면역이 종양의 제거에 중요한 역할을 한다는 것이 막연하게 알려져 있으나, 최근 연구에 의해, 보체 시스템 활성화로 생성된 생산물이 면역반응을 촉진함으로써, 암세포를 직접적으로 죽이거나, 암세포의 제거에 효과적일 수 있음이 명확하게 드러나고 있다. 보체 시스템은 30개가 넘는 단백질의 커다란 집합이며, 선천성 면역의 주요 구성요소이다. 보체 시스템은 항원 인식 면역의 복합적인 조절에 기여하며, 선천성 면역 및 적응 면역 사이의 중요한 연결고리가 된다(Carroll, MC(2008). Complement and humoral immunity. Vaccine 26 Suppl 8: I28-33.).

보체 시스템의 활성화는 백혈구의 모집 및 탈과립, 혈관 침투성 증가 및 백혈구와 내피 세포에 영향을 주는 전 염증성 조건의 유도를 포함하는 다양한 생물학적 효과를 유도한다(Genard, G, Lucas, S, and Michiels, C(2017), Front Immunol 8: 828.). 보체 시스템의 이러한 다양한 역할 중에서 옵소닌 작용(opsonization)은 암의 치료에 대한 연구에 있어서, 주목을 받는다. 일부 보체 시스템 단백질 또는 옵소닌(opsonin)은 암세포에 부착하여, 면역 세포에 의한 식세포 작용 및 세포 살해에 더욱 노출되기 쉽도록 한다.

보체 단백질 C3는 보체 활성화 경로(complement activation pathway)의 핵심 인자로서, 단백질 분해 연속 증폭 반응(cascade of proteolytic reaction)을 통해 C3b 및 iC3b 등으로 더 분해된다(Hilmi, M, Bartholin, L, and Neuzillet, C(2018), World journal of gastroenterology 24: 2137.). C3-유도체는 암세포에 결합된 상태로 남아있으며, 각각에 상응하는 수용체와의 결합을 통해 면역세포에 인식되고 면역 반응을 유발한다.

대식 세포의 CR3 수용체에 의한 iC3b의 인식은 iC3b가 결합된 세포에 대한 보체 의존성 세포 독성을 유발한다. 활성화된 대식 세포와 표적 암세포 사이의 밀착은 세포 독성 효과를 유발할 수 있음이 보고된 바 있다(Cummings, KL, et al.(2007), Viral immunology 20: 505-524.) 또한, iC3b를 인식하는 CR3수용체는 대식 세포뿐 아니라 여포성 수지상 세포(follicular dendritic cells), NK 세포 및 T 세포와 같은 다른 면역 세포에도 발현되는 것으로 알려져 있으며, 이들 세포에서도 면역반응을 유발할 것으로 예상된다.

암의 면역 저항 수단 중, 상기 보체 시스템과 관련하여 막 보체 조절 단백질(membrane complement regulatory proteins, mCRPs)의 발현이 주목 받고 있다(Genard, G, Lucas, S, and Michiels, C(2017), Front Immunol 8: 828.). mCRPs는 보체 활성화의 후기단계에서 형성되는 보체 막 공격 복합체(MAC)의 조립을 차단하거나 C3 활성화 단계에서 보체 카스케이드에 간섭함으로써, 면역 저항성을 획득한다. 특히 보체 카스케이드에 대한 간섭은 종양 세포 표면에서의 iC3b의 축적(deposition)을 방해하여, 보체 시스템을 이용한 종양 또는 암의 치료에 어려움이 있다(Hassan, MM, et al.(2007), Am J Gastroenterol 102: 2696-2707.).

이러한 기술적 배경 아래에서, 본 발명자들은 종양 및 암의 면역 저항성을 회피하여, 보체 시스템에 의한 암의 사멸을 유도하고자 예의 노력한 결과, 표적 세포 특이적 보체 인자의 모집에 의한 세포 사멸을 유도하는 신규한 이중 특이적 압타머를 개발하였다. 상기 이중 특이적 압타머의 표적 세포 및 보체 인자에 대한 이중 표적 특이적 결합 능력 및 결합 강도를 확인하고, 이중 특이적 결합 능력을 통해 표적 세포 표면에 보체 인자를 축적함으로써, 각각의 압타머를 혼합하여 사용하는 것보다 현저하게 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 보체 인자의 모집에 의한 종양 또는 암의 세포 또는 조직의 사멸을 유도하는 이중 특이적 압타머를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중 특이적 압타머를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 치료방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자(complement factor)에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 이중 특이적 압타머(bispecific Aptamer)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이중 특이적 압타머를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 약학 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 이중 특이적 압타머는, 저비용으로 인공 합성이 가능하여, 종래의 항체에 비하여 단가가 저렴하고, 생체 친화성이 우수하다. 또한 종양 또는 암의 세포의 표면 분자 및 보체 인자에 대한 이중 특이성으로 인해, 보체 인자의 모집을 억제하여 면역 저항성을 가지는 표적 세포, 특히 췌장암과 같은 종양 및 암 세포에 보체 인자를 모집함으로써, 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 추가적 변형을 통해 생체 내에서 분해되지 않고 충분히 오랫동안 활성을 유지하도록 하여, 보다 효율적으로 종양 및 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 이중 특이적 압타머 C3SQ2의 설계 및 특성 분석을 나타낸 것이다.
도 1A는 제조된 이중 특이적 압타머 C3SQ2의 2차 구조의 예측도이다.
도 1B는 C3SQ2의 조립을 보여주는 6% Native PAGE의 결과를 나타낸 것이다.
도 1C는 본 발명에서 수행된 샌드위치 ELISA의 개략도를 나타낸 것이다.
도 1D는 재조합 인간 iC3b 단백질에 대한 샌드위치 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 1E는 다양한 농도의 소혈청 알부민(BSA) 테스트 결과를 나타낸 것으로, 단백질로 코팅된 웰을 Panc-1 분비물 및 사전 배양된 C3SQ2 또는 C3+SQ2(어댑터 서열 없는 개별 압타머 혼합물)와 함께 배양하였다. 각 데이터는 독립된 3번의 실험 결과에 대한 평균 ± 표준 오차(SE) 값이다.
도 2는 각각의 타겟에 대한 C3SQ2의 결합력을 나타낸 것이다. 샌드위치 ELISA는 iC3b 또는 Panc-1 분비물을 가지고 수행되었다. x축 상에 기록된 샘플을 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 인간 재조합 iC3b 단백질로 코팅할 때, 항-ALPPL2 항체를 사용하여 검출하였으며, Panc-1 분비물로 코팅되는 경우, 항-iC3b 항체를 사용하여 검출하였다. 데이터는 3번의 독립 실험 결과의 평균 ± 표준 오차(SE) 값이다.
도 3은 THP-1 세포 표면에서의 CR3(CD18/CD11b)의 발현을 나타낸 것이다.
PMA 200nM로 1, 2, 3 및 4일 동안 처리된 분화된 THP-1 세포에서 CD11b의 Real-time quantitative RT-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. mRNA 수준은 처리되지 않은 샘플(대조군)에 대한 처리 샘플의 비율을 나타낸다. 데이터는 세 번의 독립 실험 결과의 평균 ± 표준 오차(SE) 값이다. P-value 는 짝지음 t-test(paired t test)를 이용하여 계산되었다. 차이는 p<0.005에서 유의미한 것으로 나타났다.
도 4는 iC3b 및 이중 특이적 압타머 존재 아래 공동 배양된 THP-1 세포 및 Panc-1 세포의 형광 현미경 분석 결과이다. Panc-1 세포와 THP-1 세포는 300pmole의 C3SQ2 이중 특이적 압타머 또는 두 개의 압타머 혼합물(C3+SQ2) 및 iC3b와 함께 무혈청 배지에서 37℃에서 4시간 배양되었다. 공동 배양 전에, THP-1 세포는 Hoechst 33342로 염색되었다. C3SQ2와 함께 배양 후, 세포는 FITC-Annexin V로 염색되었다. 이미지는 200x 배율로 얻어진 결과이며, 스케일 바는 100μm를 나타낸다.
도 5는 보체 시스템 매개 세포 사멸 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5A는 보체 시스템 매개 세포 사멸 분석의 개략도이다. 이중 특이적 압타머 C3SQ2 또는 C3+SQ2는 인간 재조합 iC3b와 함께 배양하였다. 이어서, Panc-1 세포 또는 HeLa 세포와 함께 배양하고 THP-1 세포를 첨가하였다. THP-1 세포는 PMA로 분석하기 전 72시간 자극되었다. 세포의 사멸은 지질 이중층의 포스파티딜 세린(phosphatidylserine) 및 ANnexin V가 연결된 루시퍼레이즈의 상호작용을 통해 모니터링하였다.
도 5B는 Panc-1 세포에 대한 보체 시스템 매개 세포 사멸 분석 결과이다. P-value 는 짝지음 t-test(paired t test)를 이용하여 계산되었다. 차이는 *p<0.0005 에서 유의하게 나타났다(NT 및 C3SQ2). NT와 C3+SQ2사이에는 유의한 차이가 없었다(p-값 >0.05).
도 5C는 HeLa 세포에 대한 보체 시스템 매개 세포 사멸 분석 결과이다. C3SQ2는 NT와 유사한 결과를 나타내었다.
도 5D는 그리스 시약(Griess reagent)을 사용하여 측정한 아질산염(Nitrite NO2-)의 양이다. p값은 모든 시점에서 p<0.0005 이었으므로 그래프에 표시하지 않았다.
도 6은 C18 폴리에틸렌 링커를 사용해 혼성화한 이중 특이적 압타머의 타겟 인식 특이성을 확인한 ELISA 결과이다. X-축의 단백질은 플레이트에 코팅된 단백질을 의미하며, Y-축은 450nm에서의 흡광도를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

종양 세포에 대항하기 위한 많은 치료방법들이 적용되고 개발되어 왔다. 그러나, 불행히도 치료전략이 진화함에 따라 종양 세포 또한 진화하고, 보체 시스템을 기반으로 하는 암 면역 치료 또한 예외는 아니다. 암이 가지는 면역-저항의 여러 방법 중에서도, 막 보체 조절 단백질(membrane Complement Regulatory Proteins, mCRPs)의 발현은 보체 시스템 면역의 막 공격 복합체(MAC)의 조립을 차단하거나, C3 활성화 단계에서 보체 시스템 면역 경로에 간섭함으로써, 면역 저항성을 가지고 치료에 대항한다. 특히 C3에 대한 저항 능력으로 종양 세포 표면에서 iC3b의 침착을 억제 시켜, 대식 세포의 인식으로 인한 세포 사멸을 억제하게 한다.

본 출원의 발명자들은, 이러한 종양의 면역 저항 기작에 대항하여, 종양 세포 주변에 iC3b등의 보체 인자를 모집하여 숫자를 증가시킴으로써, 종양 세포의 mCRPs 방해 효과를 억제하기 위해, 보체 인자 및 표적 세포를 특이적으로 인식하는 이중 특이적 압타머를 개발하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 종양 세포의 특이적 발현 분자인 ALPPL2에 특이적으로 결합하는 압타머(SQ2) 및 보체 인자 중 보체 매개성 세포 독성(CDCC)에 중요한 분자인 C3b 및 iC3b에 특이적으로 결합하는 압타머(C3)를 이중가닥으로 된 어댑터 서열을 통해 결합하여 in vivo에서 안정적으로 유지되는 이중 특이적 압타머를 제조하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서, 각 압타머의 단순 혼합물(C3+SQ2)이 암세포 사멸 효과를 유도할 수 없음과 달리, 종양의 mCRPs 방해 기작을 회피하여, 종양 세포 특이적인 CDCC를 일으켜 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있는 현저한 효과를 달성할 수 있음을 확인하고, 하나의 분자의 이중 특이적 압타머가 종양 또는 암의 치료에 효과적일 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자(complement factor)에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 이중 특이적 압타머(bi-specific Aptamer)에 관한 것이다.

본 발명의 용어 “압타머(Aptamer)”는 안정된 삼차 구조를 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산이다. 1990년 콜로라도 대학의 래리 골드 연구팀이 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 기술을 이용하여 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 발굴하기 시작한 뒤로 다양한 표적분자에 대한 압타머와 응용 및 변형 기술이 개발되고 있다. 항체와 같이 특이적 결합을 제공하면서도, 저렴한 비용 및 비교적 단순한 과정을 통해 고순도로 많은 양을 제조할 수 있고, 단순한 화학 구조 및 크기적 이점으로 추가적인 변형 가능성, 안정성, 생체 적합성 등의 장점을 가져 항체의 대체 기술로 지목되고 있다.

본 발명에 있어서, 모든 압타머 및 링커는 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있다.

본 발명의 용어 “이중 특이적 압타머(bi-specific Aptamer)”는 하나의 분자로 두 가지의 분자 또는 그 이상의 분자에 특이적인 결합 능력을 가지는 압타머를 의미한다. 이중 특이적 압타머는 하나의 작동 부위가 다른 종류의 분자에 특이적으로 결합할 수도 있으며, 다른 부위가 각각 다른 종류의 분자에 특이적으로 결합할 수도 있다.

본 발명의 용어 “보체 인자(complement factor)”는 혈액 및 조직의 항원을 제거하기 위해 선천성 면역 시스템(innate immune system) 및 적응 면역 시스템(adaptive immune system) 모두와 협력하는 일련의 혈청 분자를 의미한다. 보체 인자는 옵소닌화(opsonization), 막 공격 복합체 형성(membrane attack complex) 및 염증 반응(inflammation) 등의 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 담당한다.

본 발명의 일 실시예에서, 이중가닥 어댑터 서열 및 C18 링커(Claudia M. Dollins, et al. DOI 10.1016/j.chembiol.2008.05.016)를 사용하여, 이중 특이적 압타머를 제조하였으며, 이 경우 iC3b 및 ALPPL2 모두를 동시에 인식하여 보체인자를 표적 인자에 모집할 수 있다는 것을 확인 하였다. 본 발명의 다른 실시예에서, 이중 특이적 압타머의 이중 특이성이 보체인자를 표적 세포 또는 조직에 모집하고 이로써 표적 세포 특이적으로 사멸을 유도할 수 있다는 점을 확인하였다.

따라서 본 발명에 있어서, 상기 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머는 직접적으로 연결되거나 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 어댑터 서열(adaptor sequence), C18 폴리에틸렌(C18 polyethylene), PNA, 에틸렌 글리콜-기반 아미노에톡시에톡시 아세테이트 링커(ethylene glycol-based aminoethoxyethoxy acetate linker, AEEA), 아조벤젠 아미노산 링커(azobenzene amino acid linker, C0-AZO) 또는 스페이서 접합 아조벤젠 아미노산 링커(spacer conjugated azobenzene amino acid linker (C3-, C4-, C5- 및 C6-AZO)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “링커”는 각각의 압타머(종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머)를 연결하는 분자를 의미하는 것으로서, 바람직하게는 단일 또는 이중 가닥 어댑터 서열(adaptor sequence), C18 폴리에틸렌(C18 polyethylene), PNA, 에틸렌 글리콜-기반 아미노에톡시에톡시 아세테이트 링커(ethylene glycol-based aminoethoxyethoxy acetate linker, AEEA), 아조벤젠 아미노산 링커(azobenzene amino acid linker, C0-AZO) 또는 스페이서 접합 아조벤젠 아미노산 링커(spacer conjugated azobenzene amino acid linker (C3-, C4-, C5- 및 C6-AZO)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이중 가닥 어댑터 서열의 각 가닥이 두 개의 압타머의 말단에 융합되어 혼성화(annealing)되어 연결되는 것일 수 있다(Shinjiro Sawada, Toshifumi Takao, Nobuo Kato 및 Kunihiro Kaihatsu, Design of Tail-Clamp Peptide Nucleic Acid Tethered with Azobenzene Linker for Sequence-Specific Detection of Homopurine DNA, Molecules 2017, 22, 1840; doi:10.3390/molecules22111840).

본 발명의 용어 “어댑터 서열(adaptor sequence)”은, 각 압타머를 연결하는 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA를 의미하는 것으로서, 본 발명의 일 실시예에서, 이중 가닥으로 된 어댑터 서열의 일 가닥 및 이에 상보적인 가닥이 각각 압타머의 말단에 결합하여, 혼성화를 통해 두 개의 압타머를 연결하여 하나의 이중 특이적 압타머를 구성한다. 또한, 본 발명에 있어서, 어댑터 서열은 염기 서열 중간에 C18(carbon ethylene)을 포함할 수 있으며 비제한적인 예로서, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 C18 linker(실시예 5 참조)가 있다.

하기 표 1은 상기 각 링커 종류의 대표적인 한 예일뿐이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

링커의 예

PNA	에틸렌 글리콜-기반 아미노에톡시에톡시 아세테이트 링커 (AEEA)
아조벤젠 아미노산 링커 (C0-AZO)	스페이서 접합 아조벤젠 아미노산 링커 (C3-, C4-, C5- 및 C6-AZO (n = 1, 2, 3 및 4)

본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 세포의 표면에 발현하는 ALPPL2에 특이적으로 결합하는 압타머(SQ2) 및 보체 인자 iC3b에 특이적으로 결합하는 압타머(C3)는 이중가닥으로 된 어댑터 서열(adaptor sequence)에 의해 연결되었다. 이중가닥 어댑터 서열에 의해 연결된 이중 특이적 압타머 C3SQ2는 각각의 압타머 혼합물(사멸 효과 나타나지 않음)과 비교하여 현저한 보체 인자 모집 능력 및 표적 세포 사멸효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 종양 또는 암의 세포 또는 조직의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “표면 분자”는 당단백질, 단백질, 지질 등 세포 또는 조직의 표면에 발현하는 모든 분자를 의미한다. 바람직하게는, 상기 표면 분자는 종양 또는 암의 세포 또는 조직의 표면에 특이적으로 발현하는 것일 수 있으며, 해당 세포 표면 분자에 특이적으로 결합함으로써, 표적 세포 또는 조직에 특이적으로 접근할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 표면 분자는 종양 세포 또는 종양 조직의 표면 분자일 수 있으며, 바람직하게는 알카라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase), 더욱 바람직하게는 ALPPL2일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “알카라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)”는 인산가수분해효소로서, 그 중에서도 무기인산을 방출하는 최적 pH가 알칼리성인 것을 의미한다. 상기 효소는 정상시에 간에서 배출되기도 하나, 각종 질환에 있어서, 세포 표면의 항원으로서 발현되거나, 혈액 내에서 활성 또는 농도에 변화가 일어나 임상적 진단의 대상이 되기도 한다.

본 발명의 “ALPPL2”는 알카라인 포스파테이즈의 한 종류로서, 배 세포(alkaline phosphatase, germ cell, ALPG)로 재명명된 신규한 PDAC 관련 바이오 마커인 알카라인 포스파테이즈 플라센탈 유사 2(alkaline phosphatase placental like 2, ALPPL2)를 의미한다. 본 출원인들은 종전의 연구에서, 이를 개발하고, 등록 받은 바 있다(한국 특허 등록번호 10-1699-1050000). ALPPL2는 글리코실 포스파티딜 이노시톨(glycosyl phosphatidyl inositol, GPI) 고정 단백질(anchor protein)로 췌장암 세포 표면에 많이 발현되며, 체액으로 종종 배출되기도 한다(Dua, P, Kang, HS, Hong, SM, Tsao, MS, Kim, S, and Lee, DK(2013). Alkaline phosphatase ALPPL-2 is a novel pancreatic carcinoma-associated protein. Cancer Res 73: 1934-1945.).

최근의 연구에 따르면, 상기 ALPPL2는 유방암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 흑생종, 자궁암, 전립선암, 신장암, 림프종, 대장암, 중피종 및 백혈병과 같은 여러 유형의 종양 또는 암에서 발현되는 것으로 보고되었다(Liu, S, Mao, Q, Xue, W, Zhang, X, Qi, Y, Wang, Y, et al.(2019), Human pathology 86: 49-56.).

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 세포는 ALPPL2를 세포 표면에 발현하는 모든 세포을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 유방암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 흑생종, 자궁암, 전립선암, 신장암, 림프종, 대장암, 중피종 및 백혈병의 병변이 발생한 부위의 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 보체 인자(complement factor)는 C3 보체 단백질(C3 complement protein) 또는 C3 보체 단백질-유도체(C3 complement protein-derivatives)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “C3 보체 단백질(C3 complement protein)”은 보체 인자의 한 종류로서, 약 1.2mg/ml의 농도로 혈액에서 가장 풍부한 보체 성분이다. 보체 시스템의 주요 경로는 각각 다른 원인으로 발생하나, 모두 C3 보체 단백질의 전환에 의해 시작된다. C3 보체 단백질의 절단 효소의 생성 및 활성으로 인해 C3a, C3b를 포함하는 많은 “C3 보체 단백질-유도체(C3 complement protein derivatives)”로 전환되고, 이에 의해 면역 반응이 발생한다.

본 발명의 용어 “C3 보체 단백질-유도체(C3 complement protein derivatives)”는 C3에서 유래하는 모든 종류의 변이체, 돌연변이, 단백질 가수분해 결과물, C3의 단편을 의미한다. 바람직하게는, 단백질의 가수분해 결과물일 수 있으며, 예를 들어, C3a, C3b, iC3b일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명에 있어서 “C3 보체 단백질-유도체(C3 complement protein derivatives)”는 “C3-유도체(C3- derivatives)” 등과 호환적으로 사용될 수 있다

C3b는 특히 보체 시스템에 있어 중심적인 역할을 수행한다. C3b는 세포의 표면에 결합하여 표지자(tag)로서 작동하고, C3b 수용체가 있는 식균세포가 이를 인식하여 세포독성을 일으킬 수 있도록 하는 옵소닌화(opsonization) 작용을 하며, C5를 활성화 시켜 막 공격 복합체를 구성하도록 하기도 한다(kubi immunology, W. H. Freeman and Company, New York). iC3b는 C3b의 절단 산물로서, C3b와 유사한 역할을 수행한다.

이러한 특성으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에서, 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머로 C3b 및 iC3b에 특이적으로 결합하는 압타머인 C3를 이용하여 이중 특이적 압타머를 제작 하였으며, 상기 이중 특이적 압타머가 iC3b를 효과적으로 모집함으로써, 표적 세포에 대해 세포독성을 유도하여 세포의 사멸을 이끌어냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, C3-유도체(C3-derivatives)는 C3b 또는 iC3b인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 iC3b인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, ALPPL2 및 C3 보체 단백질 유도체(C3b 및 iC3b)을 표적으로 하는 압타머 SQ2 및 C3를 제조한 뒤, 각 압타머 서열의 3’ 말단에 이중가닥 어댑터 서열의 각 단일 가닥을 부가하여 SQ2-ADP 및 C3-ADP를 수득하고, 이를 어닐링 하여, 이중 특이적 압타머 C3SQ2를 제조하였다. 제조한 각 압타머 및 어댑터의 서열은 하기 표 2의 서열번호 3 내지 8로 표시된 서열과 같다.

또한, 종전의 연구에서 밝혀진 각 압타머의 표적 결합 활성 부위는 서열번호 1 및 2로 표시된 서열과 같다(ALPPL2 결합 압타머(SQ2); Dua, P, Kim, S, and Lee, D-k (2015). Nucleic acid therapeutics 25: 180-187. 및 C3 결합 압타머(AptC3-1); Mallik, PK, Nishikawa, K, Millis, AJ, and Shi, H (2010). Nucleic Acids Res 38: e93.)

압타머 및 어댑터 서열

압타머 및 어댑터	서열(5' -> 3')	서열번호
SQ2 결합 활성 서열	AGCUUAUUCGAAUUGCCUCGAAAAGCUAUCGC	1
AptC3-1 결합 활성 서열	GGCUAGAAGAAUAUGACGGAUUGACCGUAUCAGGGUAGCC	2
SQ2	GGAGCUUAUUCGAAUUGCCUCGAAAAGCUAUCGCUAA	3
AptC3-1	GGGCCCUUCGGCUAGAAGAAUAUGACGGAUUGACCGUAUCAGGGUAGCCGAAGGGAA	4
Adaptor(ADP, Forward 23nt)	AAUUUCAUCUCCUGAACAAGCUU	5
Adaptor(ADP, Reverse 23nt)	AAGCUUGUUCAGGAGAUGAAAUU	6
SQ2-ADP	GGAGCUUAUUCGAAUUGCCUCGAAAAGCUAUCGCUAAAAUUUCAUCUCCUGAACAAGCUU	7
C3-ADP	GGGCCCUUCGGCUAGAAGAAUAUGACGGAUUGACCGUAUCAGGGUAGCCGAAGGGAAAAGCUUGUUCAGGAGAUGAAAUU	8

상기 표 2의 압타머는 혈청 핵산분해효소(serum nuclease)에 대한 보호가 없기 때문에, 하기 표 3과 같이 SQ2 및 이에 결합되는 ADP에 2’-F 변형을 주어 안정성을 강화하였다.

2'F-변형된 서열

압타머	변형 서열(5' -> 3')
SQ2'(37nt)	GGAG CUU A UUC GAA UU G CCUC GAAAAG CU A UC G CU AA
Adaptor'(ADP, Forward 23nt)	AA UUUC A UCUCCU GAA C AAG CUU
SQ2'-ADP	GGAG CUU A UUC GAA UU G CCUC GAAAAG CU A UC G CU AAAA UUUC A UCUCCU GAA C AAG CUU
밑줄 표시된 염기는 2'-F- 변형된 염기를 의미함.

본 발명에 있어서, 상기 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 서열번호 1로 표시되는 ALPPL2 결합 활성 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1과 염기서열 상동성이 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머는 서열번호 2로 표시되는 C3 결합 활성 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2와 염기서열 상동성이 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머의 서열은 서열번호 3(SQ2)로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 3과 염기서열 상동성이 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머의 서열은 서열번호 4(AptC3-1)로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 4와 염기서열 상동성이 염기서열 상동성이 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 어댑터 서열(adaptor sequence)의 제1가닥이 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머에 융합되고, 상기 제1가닥에 상보적인 제2가닥이 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머의 말단에 융합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 상기 이중가닥 어댑터 서열은 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 5 및 서열번호 6과 염기서열 상동성이 염기서열 상동성이 40% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 “상보적 가닥”은 폴리 뉴클레오타이드 서열을 지칭 할 때, 염기쌍 규칙(base-pairing rules)에 의한 또 다른 핵산 분자의 염기 서열에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 분자의 2개의 가닥 사이 또는 단일체 상의 주형 가닥과 상보적 가닥 사이의 뉴클레오타이드 또는 핵산 간의 염기쌍을 의미한다. 주형의 가닥과 상보적인 가닥의 약 90% 이상, 통상적으로 약 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 염기서열이 쌍을 이룬다. 상보적인 가닥은 잘 알려진 컴퓨터 알고리즘 및 소프트웨어, 예를 들어 BLAST 프로그램의 사용을 포함하는 다양한 접근법에 의해 동정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 어댑터 서열(adaptor sequence)이 말단에 융합된 압타머의 염기서열은 각각 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 7 및 서열번호 8과 염기서열 상동성이 40% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 어댑터 서열 이외에도 C18 폴리에틸렌을 링커로 사용한 경우에도, 이중 특이성이 유지되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 이중 특이적 압타머는 표 5의 SQ2-linker, C3-linker 및 C18 linker를 모두 혼성화(annealing)하여 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이중 특이적 압타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 유사체로 치환된 것임을 특징으로 할 수 있다. 상기 변형된 뉴클레오티드 유사체는 본 기술 분야에서, 압타머 등의 올리고 뉴클레오티드의 물리적, 화학적, 생물학적 특성을 향상시키기 위해서 수행되는 물리적, 화학적 변형을 의미한다.

상기 변형은 예를 들어, 뉴클레오티드 내 당 구조의 2’ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 뉴클레오티드가 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid)로 치환; 및 PEG(polyethylene glycol) 또는 콜레스테롤의 결합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 상기 표 3의 SQ2'이고, 이중 가닥 어댑터 서열의 제1가닥은 상기 표 3의 Adaptor'이고, 어댑터 서열이 연결된 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머의 염기서열은 상기 표 3의 SQ2'-ADP의 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 가장 바람직하게는, 상기 표 2의 C3-ADP 및 상기 표 3의 SQ2'-ADP가 혼성화(annealing)되어 생성된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 이중 특이적 압타머는, 세포/조직 특이적 표면 분자(예, ALPPL2)에 특이적으로 결합하고, 보체 인자(예, C3b, iC3b)에 특이적으로 결합하여, 표적 종양 또는 암의 세포/조직에 특이적으로 보체인자를 모집함으로써, 옵소닌화 작용에 의해 종양 또는 암의 세포/조직의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하며, 이를 통해 종양 또는 암의 예방 또는 치료 용도로서 사용이 가능하다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 이중 특이적 압타머(bi-specific aptamer)를 유효성분으로 함유하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

최근의 연구에 따르면, 상기 ALPPL2는 유방암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 흑생종, 자궁암, 전립선암, 신장암, 림프종, 대장암, 중피종 및 백혈병과 같은 여러 유형의 종양 또는 암에서 발현되는 것으로 보고되었다(Liu, S, Mao, Q, Xue, W, Zhang, X, Qi, Y, Wang, Y, et al.(2019), Human pathology 86: 49-56.).

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 종양 또는 암은 ALPPL2를 표면에 발현하는 것을 특징으로 하는 모든 종양 또는 암을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 유방암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 흑생종, 자궁암, 전립선암, 신장암, 림프종, 대장암, 중피종 및 백혈병일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 면역 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 면역 질환 또는 염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물은 이중 특이적 압타머 성분의 상술한 표적 세포 예를 들어, ALPPL2를 발현하는 종양 또는 암세포에 대하여 보체 인자 예를 들어, iC3b의 모집을 통해 종양 또는 암세포의 사멸을 유도하는 항종양 또는 항암 효과를 나타낸다.

상기 약학 조성물은 상기 이중 특이적 압타머를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 이중 특이적 압타머 또는 상기 약학 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 치료방법에 관한 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

사용된 단백질 및 핵산

인간 iC3b 단백질은 Calbiochem에서 구입하였으며, ALPPL2는 아래의 별도 섹션에서 제조를 나타낸다. 올리고핵산(oligonucleotides)은 Bioneer와 Dharmacon Inc. 에서 구입하였다. RNA 압타머는 MEGAshortscript T7 전사 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 in vitro에서 전사를 통해 제조되었으며, RNA압타머의 2’-F-변형은 Lucigen Corporation(USA)의 DuraScribe T7 전사 키트를 이용하였다.

세포의 배양 및 세포 배양 분석

본 발명에 사용된 모든 세포는 the American Tissue Culture Collection에서 얻었으며, 5% CO₂ 대기아래 37℃ 가습조건에서 배양하였다. PANC-1(ATCC® CRL1469™)세포 및 HeLa(ATCC® CCL-2™) 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen) 및 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Panc-1: Gibco, HeLa: Corning, USA) 배지에서 유지되었다. THP-1(ATCC® TIB-202™) 세포는 페놀 레드없이 10% FBS, 100U/mL penicillin-streptomycin(Gibco), 0.05mM 2-mercaptoethanol(Gibco) 및 10mM HEPES(Gibco)가 보충된 RPMI 배지 또는 RPMI=1640 배지에서 배양되었으며, 면역 자극을 위해 THP-1 세포를 200nM phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA, Sigma-Aldrich, USA)로 분화 유도 하였다.

실시예 1: 세포 및 보체 인자 iC3b에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 압타머의 제조

이전의 연구에서 동정된 압타머인 ALPPL2를 표적으로 하는 2’F- 변형된 RNA 압타머 SQ-2 및 C3b 및 iC3b를 모두 표적으로 하는 비변형 RNA 압타머 AptC3-1에 기초하여 이중 특이적 압타머를 개발하였다. 이중 특이적 압타머의 표적 보체 인자로서 iC3b를 선택하여 상기 두 가지 압타머를 각각 제조하였다. 두 가지 압타머는 타겟을 인식하고, 핵심 구조를 유지하는데 중요한 서열을 이용하여 제조하였으며, 각각 57nt의 AptC3-1 및 37nt의 SQ-2를 제조하였다. 각각의 RNA 압타머는 MEGAshortscript T7 전사 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 in vitro에서 제조되었으며, RNA 압타머의 2’F- 변형은 DuraScribe T7 전사 키트(Lucigen Corporation, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 각각의 압타머의 서열은 표 4와 같다.

제조한 압타머 및 어댑터 서열

압타머 및 어댑터	압타머 서열(5' -> 3')
SQ2'(37nt)	GGAG CUU A UUC GAA UU G CCUC GAAAAG CU A UC G CU AA
C3(57nt)	GGGCCCUUCGGCUAGAAGAAUAUGACGGAUUGACCGUAUCAGGGUAGCCGAAGGGAA
Adaptor'(ADP, Forward 23nt)	AA UUUC A UCUCCU GAA C AAG CUU
Adaptor(ADP, Reverse 23nt)	AAGCUUGUUCAGGAGAUGAAAUU
SQ2'-ADP	GGAG CUU A UUC GAA UU G CCUC GAAAAG CU A UC G CU AAAA UUUC A UCUCCU GAA C AAG CUU
C3-ADP	GGGCCCUUCGGCUAGAAGAAUAUGACGGAUUGACCGUAUCAGGGUAGCCGAAGGGAAAAGCUUGUUCAGGAGAUGAAAUU
밑줄 표시된 염기는 2'-F- 변형된 염기를 의미함.

각각의 압타머 SQ2 및 C3를 제조한 뒤, 각 압타머 서열의 3’ 말단에 상보적인 어댑터 서열을 부가하여 SQ2-ADP 및 C3-ADP를 수득하였다(표 2). 각 압타머에 부가된 서열은 서로 상보적이므로 어닐링을 통해 하나의 이중 특이적 압타머 C3SQ2를 생성할 수 있다. 생성된 각각의 RNA 압타머-ADP(C3-ADP 및 SQ2-ADP)를 37℃에서 1시간 동안 TMS 버퍼(5mM MgCl₂, 100mM NaCl, 89mM Tris-HCl, pH7.6)에서 같은 몰비로 혼합하여 이중 특이적 압타머 C3SQ2를 제조하였다.

실시예 2: 압타머 특성 분석

상기 실시예 1에서 제조된 이중 특이적 압타머 C3SQ2의 특성을 분석하였다. 각 압타머 및 C3SQ2의 2차구조는 NUPACK(http://www.nupack.org/partition/new)을 통해 예측되었다(도 1A). 도 1A에서 예측된 2차 구조(2nd structure)는 두 압타머가 이중 특이적 포맷에 적절한 이차 구조를 유지하고 있음을 나타낸다.

어닐링된 C3SQ2는 저온에서 90분동안 TBM 버퍼(5mM MgCl₂, 200mM 붕산(boric acid), 8.9mM Tris-HCl, pH7.6)에서 6% Native PAGE를 통해 분석되었다(도 1B). 첫째로, 어댑터 서열을 가진 압타머의 각각의 표적에 대한 결합을 실험하였다. ELISA 결과는 어댑터 서열이 포함된 각각의 압타머(SQ2-ADP, C3-ADP)가 각 표적에 높은 친화도로 인해 표적을 검출할 수 있음을 나타내었다(도 2).

실시예 3: 이중 특이적 압타머 C3SQ2의 특이적 및 결합력 확인

다음으로, 표적 단백질에 대한 이중 특이적 압타머의 특이적 및 결합력을 확인하였다. 도 1C에 도시된 것과 같은 샌드위치 ELISA를 사용하였으며, 재조합 인간 iC3b 단백질 및 Panc-1 세포에서 발현하는 ALPPL2의 세포 분비체를 사용하였다.

PANC-1(ATCC® CRL1469??) 세포의 분비체는 당업계에 공지된 방법으로 준비하였다(Liu, S, Mao, et al.(2019), Human pathology 86: 49-56.). 구체적으로, 세포를 80%의 집적도(confluency)까지 성장시켰다. 조정배지의 제조를 위해 세포를 MgCl₂ 및 CaCl₂가 보충된 둘베코 포스페이트 버퍼 살린(Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, PBS, Invitrogen)으로 3회 세척한 뒤, 100U/mL 페니실린 및 100mg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 FBS-free 배양 배지에서 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 36시간 배양하였다. 배양한 조정 배지를 수집하고, 2,000g에서 10분간 원심 분리함으로써 죽은 세포 및 세포 파편을 제거하여 분비체를 정제하였다. 이러한 분비체를 10,000g에서 30분간 원심 분리하여, 큰 비지클(vesicle) 및 세포 사멸 사체(apoptotic body)를 제거하였다. 상등액을 수집하고 초원심분리기(ultracentrifuge, Beckman Coulter Inc., Optima MAX-XP, MLA-50 rotor, USA)를 사용하여 100,000g에서 70분간 4℃에서 초원심 분리하였다. 다시 상층액을 수집하여 10KDa 원심분리 필터(10 KDa centrifugal filters, Amicon® Ultra-15 centrifugal filter, Millipore, USA)를 사용하여 초여과하여(ultrafilteration) 농축하고, 둘베스코 PBS 4℃에서 밤새 투석 하였다. 농축된 세포 분비체를 -80℃에 보관하고, 상층액은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, USA)를 사용하여 정량하였다.

샌드위치 ELISA는 100μL의 1x 결합 버퍼를 사용하여 수행되었다. 인간 재조합 iC3b 단백질 및 Panc-1 세포 분비체는 단백질 샘플로 사용되었다. 상기 샘플은 1x PBS에 희석되었으며, Nunc-면역 96 마이크로웰 플레이트(Thermo Scientific)에 4℃에서 밤새도록 코팅되었다. 상기 플레이트를 세척 버퍼(0.05% Tween-20을 함유하는 결합 버퍼)로 세척하고, 2% BSA 함유 결합 버퍼(20mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM NaCl 및 10mM MgCl₂)로 상온에서 2시간동안 블로킹하였다. 동시에, 5mg/ml BSA 및 0.1μg/μl 효모 tRNA를 포함하는 1x 결합 버퍼에서, 300pmole의 압타머를 20μg의 Panc-1 세포 분비체와 혼합하여, 37℃에서 1시간 배양하였다. 그 후, 혼합물을 iC3b 단백질 코팅 플레이트에 옮기고 상온에서 2시간동안 배양하였다. ALPPL2의 존재는 마우스 단일클론 항-ALPPL2 항체(0.8 μg/100 ml, Abnova, USA)를 이용하여 37℃에서 4시간 배양하여 확인하였다. 상기 혼합물에 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 2차 항체(horseradish peroxidase-linked secondary antibody, 1:150, Santa Cruz Biotechnology)를 37℃에서 90분동안 처리하고, 100μl의 Ultra TMB-ELISA 시약(Thermo Scientific??, USA)을 첨가하였다. 적절한 시간을 들여 발색한 뒤, 2N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 종료하고, Multiskan microplate photometer(Thermo Scientific)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 1D에 도시된 바와 같이, C3SQ2 이중 특이적 압타머는 iC3b 단백질의 농도가 증가함에 따라 양성 신호를 나타내었으며, 약 20nM의 iC3b에서 포화상태가 되었다. 대조적으로, 링커가 없는 개별 압타머의 혼합물인 C3+SQ2는 어떠한 결합도 보이지 않았으며(도 1E), 이는 어댑터 서열의 존재가 압타머의 이중 특이적 특성에 있어서, 중요하다는 것을 입증한다. 이중 특이적 압타머의 iC3b 성분에 대한 특이적을 시험하기 위해 iC3b를 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 대체하였다. 이중 특이적 압타머 C3SQ2 및 C3+SQ2는 모두 무시할 수 있는 신호를 나타내어 이중 특이적 압타머가 특이적으로 표적을 탐지하고 잠재적으로 ALPPL2를 발현하는 PDAC 세포의 보체 경로를 모집(recruit)할 수 있다는 것을 증명하였다.

실시예 4: 이중 특이적 압타머 C3SQ2의 보체 매개성 세포 사멸 유도

대식 세포는 보체 이펙터의 기능을 수행하는 핵심 요소로 알려져 있으므로, 이중 특이적 압타머 C3SQ2가 표적 세포에 대식 세포를 모집하여 세포 독성 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다. iC3b가 어떠한 이펙터 매커니즘(effector mechanism)을 이끌어내기 위해서는 CR1, CR2, CR3, CR4 및 CRIg와 같은 수용체와의 상호작용이 필요하다, 따라서, 먼저 인간 단구 세포주(human monocytic cell line)인 THP-1 세포에 이러한 수용체가 존재함을 확인하였으며, 그 중에서도 CR3가 가장 두드러진 수용체라는 것을 확인하였다(도 3).

다음으로, 이중 특이적 압타머가 가지는 ALPPL2를 발현하는 췌장암 세포에 대한 대식세포에 의한 식균작용의 촉진능력을 확인하였다. 이중 특이적 압타머와 iC3b의 존재 하에 공동 배양된 대식 세포와 Panc-1 세포의 형광 현미경 사진은 iC3b 단독 또는 압타머의 혼합물에 노출된 세포보다 유의하게 높은 세포 자살 이벤트(apoptotic events)와 함께 두 세포 종류의 공동-지역화(co-localization)를 나타내었다(도 4). 항종양성 반응의 일부로서, 대식세포는 TNFα 및 IL-1β와 같은 사이토카인 및 일부 다른 분자와 함께 산화질소(NO)를 생성한다(Genard, G, Lucas, S, and Michiels, C(2017), Front Immunol 8: 828). 따라서 아질산염(Nitrite NO2-) 측정을 통한 분석을 수행하였다. 면역 반응의 결과로 생성된 아질산염의 양을 Griess Reagent System kit(Promega, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 그 결과, 형광 현미경 관찰 결과와 일치하게도, C3SQ2의 존재아래서의 THP-1 세포와 Panc-1 세포의 공동 배양은 NT 대조군 또는 C3+SQ2(압타머 단순 혼합물)과 비교하여 아질산염(NO2-) 형태로의 산화질소의 생산을 증가시켰다(도 5D).

다음으로, 도 5A에 도시된 바와 같이 보체 시스템 매개 세포자살 분석(complement system mediated apoptosis assay)을 이용하여, 지속적인 세포의 사멸을 관찰하였다. 구체적으로 300pmole의 압타머를 40U의 RNaseOUT(Invitrogen)을 포함하는 1x TMS 버퍼에 재구성(reconstitution)하였다. 0.1mg/mL BSA, 1μg/μl 효모 tRNA 및 10x 결합 버퍼(above)를 포함하는 무혈청 RPMI-1640 배지(in serum-free RPMI-1640 media)에서 상기 압타머와 5μg의 인간 iC3b 단백질을 혼합하여 1시간동안 37℃에서 배양하였다. 약 6x10³개의 Panc-1 세포를 준비된 복합체에 혼합하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 그 뒤, 상기 혼합물을 6x10⁴ 개의 THP-1 세포에 옮기고 37℃, 5% CO₂ 대기 및 가습 조건에서 30분 내지 12시간 동안 배양하였다. 죽은 세포의 백분율은 RealTime-Glo?? Annexin V Apoptosis kit(Promega, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 확인되었다.

그 결과, 식세포작용과 일치하여, iC3b 단독 또는 C3+SQ2(어댑터 서열 없는 단순 혼합물)로 처리된 세포와 비교하여 이중 특이적 압타머 C3SQ2를 처리한 세포에서 약 30% 세포 사멸의 증가가 관찰되었고, 이는 CDCC(complement-dependent cellular cytotoxicity)의 강화에서 이중 특이적 압타머의 구조적 중요성을 시사한다(도 5B).

췌장암 세포에 대한 이중 특이적 압타머의 특이적인 표적화를 확인하기 위하여, ALPPL2 미발현 인간 자궁 경부암 세포주인 HeLa 세포를 사용하여 세포 사멸 분석을 수행했다. 도 5C에 나타난 바와 같이, 이중 특이적 압타머는, NT 대조군에 비해 HeLa세포의 사멸을 증가시키지 못하였으며, 이중 특이적 압타머 C3SQ2는 대식 세포를 ALPPL2를 발현하는 췌장암 세포에 특이적으로 모집함으로써, 보체 매개성 암세포 사멸을 나타내었다.

실시예 5: C18 폴리에틸렌 링커를 이용한 이중 특이적 압타머의 표적 인식 특이성 확인

상기 이중가닥 어댑터 서열 이외의 링커를 이용하여 제조한 경우에도, ALPPL2 및 보체 인자에 대한 이중 특이성이 유지되는지 여부를 확인하기 위해 C18 폴리에틸렌을 링커로 사용하여 이중 특이적 압타머 C3SQ2(C18 linker)를 제조하였다. 이중 특이적 압타머의 제작에 사용된 각 링커 융합 압타머 및 C18 linker의 서열은 하기 표 5와 같으며, SQ2-linker, C3-linker 및 C18 linker를 모두 혼성화(annealing)하여 제조하였다.

이중 특이적 압타머 C3SQ2(C18 linker)의 제작에 사용된 서열

이름	서열(5' -> 3')
SQ2-linker	AG CUU A UUC GAA UU G CCUC GAAAAG CU A UC G CCC AA UUC G C AG U GA U
C3- linker	ACUCGCUGAGGAUCCGAGAUCUAGGCUAGAAGAAUAUGACGGAUUGACCGUAUCAGGGUAGCCGAAGGGAGACAGAAGUACUACAAGCUUCUGGACUCGGU
C18 linker	TCTCGGATCCTCAGCGAGT C(18) ATCACTGCGAATTGGGCGA
상기 C(18)은 폴리에틸렌을 의미함. 밑줄 표시된 염기는 2'-F- 변형된 염기를 의미함.

C18 linker로 연결된 이중 특이적 압타머의 이중 특이성을 확인하기 위해 ALISA(Aptamer Linked ImmunoSorbent Assay)를 수행하였다. 구체적으로, ALISA는 100μL의 1x결합 버퍼를 사용하여 수행되었다. 인간 재조합 iC3b 단백질 및 Panc-1 세포 분비체 및 BSA는 단백질 샘플로 사용되었다. 상기 샘플은 1x PBS에 희석되었으며, Nunc-면역 96 마이크로웰 플레이트(Thermo Scientific)에 4℃에서 밤새도록 코팅되었다. 상기 플레이트를 세척 버퍼(0.05% Tween-20을 함유하는 결합 버퍼)로 세척하고, 2% BSA 함유 결합 버퍼(20mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM NaCl 및 10mM MgCl2)로 상온에서 2시간동안 블로킹하였다. 그 후, 5mg/ml BSA 및 0.1μg/μl 효모 tRNA를 포함하는 1x 결합 버퍼에 녹인 300pmole의 압타머를 단백질 코팅 플레이트에 옮기고 상온에서 1시간동안 배양하였다. 이 때 C3SQ2(C18 linker), C3 linker(C18 linker와 결합한 상태), C18 linker는 3'말단에 biotin이 달린 C18 linker를 사용되었고, SQ2(6-31)과 SQ2 mutant는 3'말단에 biotin이 붙어 있는 상태이다. 그 후, 3번의 washing을 거친 후에 0.5% BSA를 포함한 1x 결합 버퍼에 2000배로 희석한 streptavidin-Poly HRP conjugate(Pierce)를 넣어 30분동안 상온에서 배양하고, 100μl의 Ultra TMB-ELISA 시약(Thermo Scientific??, USA)을 첨가하였다. 적절한 시간을 들여 발색한 뒤, 2N H2SO4를 첨가하여 반응을 종료하고, Multiskan microplate photometer(Thermo Scientific)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.

ALISA 분석 결과 C18을 링커로 하여 연결된 경우에도 Panc-1 분비체 및 iC3b에 모두 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 6). 상기 결과는 C18 등의 다른 링커을 사용하여 이중 특이적 압타머를 제작하는 경우에도, 이중 특이성을 가지고, 이로 인해 표적 세포에 보체인자를 모집하여, 실시예 4에서 확인한 것과 같이 표적 세포에 대한 보체 인자 매개성 세포독성을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Novel bispecific aptamer for inducing tumor or cancer cell death by complement factor recruitment and uses thereof <130> P19-B166 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SQ2 biding acitivity site <400> 1 agcuuauucg aauugccucg aaaagcuauc gc 32 <210> 2 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AptC3-1 biding acitivity site <400> 2 ggcuagaaga auaugacgga uugaccguau caggguagcc 40 <210> 3 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SQ2 aptamer <400> 3 ggagcuuauu cgaauugccu cgaaaagcua ucgcuaa 37 <210> 4 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AptC3-1 aptamer <400> 4 gggcccuucg gcuagaagaa uaugacggau ugaccguauc aggguagccg aagggaa 57 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor sequence Foward <400> 5 aauuucaucu ccugaacaag cuu 23 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adaptor sequence Reverse <400> 6 aagcuuguuc aggagaugaa auu 23 <210> 7 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SQ2-ADP <400> 7 ggagcuuauu cgaauugccu cgaaaagcua ucgcuaaaau uucaucuccu gaacaagcuu 60 60 <210> 8 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3-ADP <400> 8 gggcccuucg gcuagaagaa uaugacggau ugaccguauc aggguagccg aagggaaaag 60 cuuguucagg agaugaaauu 80

Claims (17)

1. 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자(complement factor)에 특이적으로 결합하는 압타머를 포함하는 이중 특이적 압타머(bi-specific aptamer).
   
2. 제1항에 있어서, 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머 및 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머는 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 링커는 단일 또는 이중 가닥 어댑터 서열(adaptor sequence), C18 폴리에틸렌(C18 polyethylene), PNA, 에틸렌 글리콜-기반 아미노에톡시에톡시 아세테이트 링커(ethylene glycol-based aminoethoxyethoxy acetate linker, AEEA), 아조벤젠 아미노산 링커(azobenzene amino acid linker, C0-AZO) 및 스페이서 접합 아조벤젠 아미노산 링커(spacer conjugated azobenzene amino acid linker (C3-, C4-, C5- 및 C6-AZO)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 종양 또는 암의 세포 또는 조직의 알카라인 포스파테이즈(alkaline phosphatase)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 알카라인 포스파테이즈는 ALPPL2(alkaline phosphatase placental like 2)인 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 보체 인자(complement factor)는 C3 보체 단백질(C3 complement protein) 또는 C3 보체 단백질 유도체(C3 complement protein derivatives)인 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 C3 보체 단백질 유도체(C3 complement proteun derivatives)는 C3b 또는 iC3b인 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
   
10. 제3항에 있어서, 상기 링커는 이중 가닥 어댑터 서열이고,
    상기 이중 가닥 어댑터 서열의 일 가닥이 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머의 말단에 융합되고,
    상기 일 가닥에 상보적인 가닥이 보체 인자에 특이적으로 결합하는 압타머의 말단에 융합된 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 어댑터 서열은 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
    
12. 제2항에 있어서, 상기 이중 특이적 압타머 또는 링커에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드 유사체로 치환된 것임을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 변형은 하기의 (a) 내지(c)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변형인 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머:
    (a) 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH₃(메틸), -OCH₃(methoxy), -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필로 치환;
    (b) 뉴클레오티드가 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid)로 치환; 및
    (c) PEG(polyethylene glycol) 또는 콜레스테롤의 결합.
14. 제12항에 있어서,
    상기 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 하기 표의 SQ2'의 RNA 염기서열로 표시되고;
    상기 이중 가닥 어댑터 서열의 일 가닥은 하기 표의 Adaptor'의 RNA 염기서열로 표시되고;
    상기 이중 가닥 어댑터 서열이 연결된 종양 또는 암의 세포 또는 조직에 특이적으로 결합하는 압타머는 SQ2'-ADP의 RNA 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
    

    

    
    
15. 제12항에 있어서,
    하기 표의 SQ2-linker 및 C3-linker의 서열로 표시되는 각각의 압타머가 하기 표의 C18 linker의 서열로 표시되는 C18 폴리에틸렌 링커로 연결되어 형성되는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 압타머.
    

    

    
    
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 이중 특이적 압타머(bi-specific aptamer)를 포함하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 암은 유방암, 췌장암, 폐암, 방광암, 난소암, 흑생종, 자궁암, 전립선암, 신장암, 림프종, 대장암, 중피종 및 백혈병으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료용 조성물.

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