KR20210031645A

KR20210031645A - Il-11ra 항체

Info

Publication number: KR20210031645A
Application number: KR1020207037233A
Authority: KR
Inventors: 스튜어트 알렉산더 쿡; 세바스찬 섀퍼
Original assignee: 싱가포르 헬스 서비시즈 피티이 엘티디; 베링거 잉겔하임 인터내셔날 게엠베하; 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2021-03-22
Also published as: EA202092605A1; TW202016140A; CA3101401A1; AU2019286797A1; CL2020003218A1; JP7437325B2; JP2021527086A; CR20210010A; GB201809700D0; CO2020015376A2; DOP2020000236A; PH12020552229A1; CN113226471A; JOP20200300A1; PE20211500A1; ECSP21001499A; US20190389957A1; US20200377605A9; MX2020013468A; US11084878B2

Abstract

IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자, 이를 사용하는 의학적 치료 및 예후 방법이 제공된다.

Description

IL-11RA 항체

본 발명은 2018년 6월 13일자로 출원된 제GB1809700.6호로부터의 우선권을 주장하고, 이의 내용 및 요소는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 도입된다.

본 발명은, 분자 생물학, 보다 구체적으로는 항체 기술에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 의학적 치료 및 예방 방법에 관한 것이다. 특히, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자가 제공된다.

IL-11-매개 신호전달은 조혈을 자극하고, 파골세포 활성을 자극하고, 신경신생을 자극하고, 지방생성을 억제하고, 염증유발(pro inflammatory) 사이토킨 발현을 감소시키고, 세포외 매트릭스(ECM) 대사를 조절하고 위장 상피 세포의 정상 성장 조절을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 인터류킨 11(IL-11)의 생리학적 역할은 아직 명확하지 않다. IL-11/IL-11R 신호전달은 조혈 세포의 활성화 및 혈소판 생성과 가장 밀접하게 관련되어 있지만, 항-염증, 혈관형성촉진(pro-angiogenic) 및 신생물에 중요할 뿐만 아니라 염증-유발성인 것으로 시사되어 있다.

제1 태양에서, 본 발명은, IL-11Rα에 결합할 수 있는, 임의로 단리된, 항원-결합 분자로서,

항원-결합 분자가

(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및

(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3

을 포함하는, 항원-결합 분자를 제공한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는

(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및

(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3

을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는

(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및

(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3

을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는

서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및

서열번호 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역

을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 70의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 70 또는 73의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드, 및 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 IL-11 매개 신호전달을 억제할 수 있다.

본 발명은 또한, (i) 본원에 기재된 항원-결합 분자 및 (ii) IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함하는, 임의로 단리된, 항원-결합 분자를 제공한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항원-결합 분자 또는 CAR을 코딩하는, 임의로 단리된, 핵산 또는 복수의 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 핵산 또는 복수의 핵산을 포함하는, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 복수의 핵산, 또는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 포함하는, 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터 항원-결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건하에서, 본원에 기재된 핵산 또는 복수의 핵산 또는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 복수의 핵산, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 또는 세포를 포함하는, 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 복수의 핵산, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 섬유증(fibrosis), 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 염증을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 복수의 핵산, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 섬유증, 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 또는 염증을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 복수의 핵산, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 치료학적 또는 예방학적 유효량의 항원-결합 분자, CAR, 핵산 또는 복수의 핵산, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 세포 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유증, 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 또는 염증을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, IL-11Rα-발현 세포를 본원에 기재된 항원-결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, IL-11 매개 신호전달을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체에 결합된, 본원에 기재된 항원-결합 분자를 포함하는, 임의로 단리된, 시험관내 복합체(in vitro complex)를 제공한다.

본 발명은 또한, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기재된 항원-결합 분자와 접촉하는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, IL-11Rα-표적화 제제(IL-11Rα-targeted agent)로 치료하기 위한 대상체를 선택 또는 계층화(stratifying)하는 방법으로서, 상기 방법은, 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플을 본원에 기재된 항원-결합 분자와 접촉하는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 시험관내 또는 생체내 진단 또는 예후 제제로서의 본원에 기재된 항원-결합 분자의 용도를 제공한다.

설명

본 발명은, 공지된 항-IL-11Rα 항체와 비교하여, 개선된 특성을 갖는 신규한 IL-11Rα-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 IL-11Rα-결합 분자는, 종래 기술에 개시된 IL-11Rα 결합 항원-결합 분자와 비교하여 바람직한 생물리학적 및 기능적 특성의 조합을 제공한다.

인터류킨 11 및 IL-11의 수용체

지방생성 억제 인자로서도 공지된 인터류킨 11(IL-11)은 다면발현 사이토킨이고, IL-6, IL-11, IL-27, IL-31, 온코스타틴, 백혈병 억제 인자(LIF), 카디오트로핀-1(CT-1), 카디오트로핀-유사 사이토킨(CLC), 섬모 신경영양 인자(CNTF) 및 뉴로포에틴(NP-1)을 포함하는 사이토킨의 IL-6 계열의 구성원이다.

인터류킨 11(IL-11)은 다양한 간엽계 세포 유형에서 발현된다. IL-11 게놈 서열은 19번 염색체와 71번 염색체의 중심 영역으로 맵핑되고, 세포로부터 효율적 분비를 보장하는 표준 신호 펩티드로 전사된다. 이의 프로모터 서열 내에 위치된 IL-11의 활성화인자 단백질 복합체, cJun/AP-1은 IL-11의 기본적 전사 조절에 중요하다[참조: Du and Williams., Blood 1997, Vol 89: 3897-3908]. 인간 IL-11의 미성숙 형태는 199개 아미노산 폴리펩티드인 반면, IL-11의 성숙 형태는 178개 아미노산 잔기의 단백질을 코딩한다[참조: Garbers and Scheller., Biol. Chem. 2013; 394(9):1145-1161]. 인간 IL-11 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P20809 (P20809.1 GI:124294; 서열번호 1)하에 이용가능하다. 또한, 재조합 인간 IL-11(오프렐베킨)도 시판되고 있다. 마우스, 랫트, 돼지, 소, 경골 어류 및 영장류의 몇몇 종을 포함하는 다른 종으로부터의 IL-11도 클로닝 및 서열결정되어 있다.

본 명세서에서, "IL-11"은 임의 종으로부터의 IL-11을 지칭하고, 임의 종으로부터의 IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단백질의 "단편", "변이체" 또는 "상동체"는 임의로 참조 단백질의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 참조 단백질의 단편, 변이체, 이소형 및 상동체는 참조 단백질에 의해 실행된 기능을 실행하는 능력을 특징으로 할 수 있다.

"단편"은 일반적으로 참조 단백질의 분획을 지칭한다. "변이체"는, 참조 단백질의 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 기타 변형을 포함하지만, 참조 단백질의 아미노산 서열과 상당한 정도의 서열 동일성(예: 적어도 60%)을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. "이소형"은 일반적으로 참조 단백질의 종과 동일한 종에 의해 발현된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. "상동체"는 일반적으로, 참조 단백질의 종과 비교하여, 상이한 종에 의해 생성된 참조 단백질의 변이체를 지칭한다. 상동체는 동족체를 포함한다. "단편"은 임의 길이(아미노산의 수에 의한)의 것일 수 있지만, 임의로 참조 단백질(즉, 단편이 유래하는 단백질) 길이의 적어도 20%일 수 있고, 참조 단백질 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. IL-11의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 195개 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, IL-11은 포유동물(예: 영장류(코뿔소, 사이노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류(예: 랫트 또는 뮤린) IL-11)로부터의 IL-11이다. IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는, 임의로, 소정 종, 예를 들면, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 IL-11 이소형의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-11은 서열번호 1과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는, 임의로, IL-11 수용체(예: 바람직하게는 동일한 종으로부터의 IL-11Rα, gp130 및/또는 IL-11Rα 및 gp130을 포함하는 복합체)에 결합하고 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다[예를 들면, 문헌[참조: Curtis et al. Blood, 1997, 90(11); or Karpovich et al. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 바와 같음).

IL-11은, 편재적으로 발현된 당단백질 130(gp130; 또한 당단백질 130, IL-6ST, IL-6-베타 또는 CD130으로도 공지됨)의 호모이량체를 통해 신호전달한다. Gp130은, IL-6 수용체 계열과 유형 I 사이토킨 수용체의 하나의 아단위를 형성하는 막관통 단백질이다. 특이성은 개별 인터류킨 11 수용체 아단위 알파(IL-11Rα)를 통해 수득되고, 이는 신호 전달에 직접 관여하지 않지만, α-수용체에 대한 최초의 사이토킨 결합 사상은 gp130과의 최종 복합체 형성을 유도한다.

인간 gp130(22개 아미노산 신호 펩티드를 포함)은 918개 아미노산 단백질이고, 성숙 형태는, 597개 아미노산 세포외 도메인, 22개 아미노산 막관통 도메인 및 277개 아미노산 세포내 도메인을 포함하는 866개 아미노산이다. 단백질의 세포외 도메인은 gp130의 사이토킨-결합 모듈(CBM)을 포함한다. gp130의 CBM은 Ig-유사 도메인 D1, 및 gp130의 피브로넥틴-유형 II 도메인 D2 및 D3을 포함한다. 인간 gp130의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P40189-1(서열번호 2)하에 입수가능하다.

인간 IL-11Rα는 422개 아미노산 폴리펩티드(UniProt Q14626)이고 뮤린 IL-11Rα와 약 85% 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 동일성을 공유한다[참조: Du and Williams., Blood Vol, 89, No,11, June 1, 1997]. IL-11Rα의 2개 이소형이 보고되어 있다 - HCR1(서열번호 3) 및 HCR2(서열번호 4) - 이는 세포질 도메인이 상이하고; 이소형 HCR1의 C-말단 32개 아미노산은 HCR2에는 부재한다[참조: Du and Williams, supra]. IL-11 수용체 α-쇄(IL-11Rα)는 IL-6 수용체 α-쇄(IL-11Rα)와 다수의 구조적 및 기능적 유사성을 공유한다. 세포외 도메인은, 특징적 보존된 Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS) 모티프를 포함하는 24% 아미노산 동일성을 나타낸다. 짧은 세포질 도메인은, JAK/STAT 신호전달 경로의 활성화에 요구되는 Box 1 및 2 영역을 결여한다.

뮤린 IL-11의 수용체 결합 부위가 맵핑되었고, 3개 부위(부위 I, II 및 III)이 동정되었다. gp130에 대한 결합은 부위 II 영역에서의 치환 및 부위 III 영역에서의 치환에 의해 감소된다. 부위 III 돌연변이체는 검출가능한 작용제 활성을 나타내지 않고, IL-11Rα 길항제 활성을 갖는다[참조: Cytokine Inhibitors Chapter 8; edited by Gennaro Ciliberto and Rocco Savino, Marcel Dekker, Inc. 2001].

본 명세서에서, IL-11 수용체/IL-11용의 수용체(IL-11R)은 IL-11 및/또는 IL-11을 포함하는 복합체에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, IL-11 수용체는 IL-11 및/또는 IL-11을 포함하는 복합체에 결합할 수 있고, IL-11 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 유도할 수 있다. "IL-11을 포함하는 복합체"는 IL-11의 비-공유 복합체, 및 IL-11과 비공유 결합할 수 있는 폴리펩티드일 수 있다.

IL-11 수용체는 임의의 종으로부터 유래할 수 있고, 임의 종으로부터의 IL-11 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 종은 인간(호모 사피엔스)이다.

일부 실시형태에서, IL-11 수용체(IL-11R)은 IL-11Rα일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11용의 수용체는 IL-11Rα를 포함하는 폴리펩티드 복합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11 수용체는 IL-11Rα 및 gp130을 포함하는 폴리펩티드 복합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11 수용체는 gp130, 또는 IL-11이 결합하는 gp130을 포함하는 복합체일 수 있다.

본 명세서에서, "IL-11Rα"는 임의 종으로부터의 IL-11Rα를 지칭하고, 임의 종으로부터의 IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체를 포함한다. IL-11Rα의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400 또는 415 중 하나의 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, IL-11Rα는 포유동물(예: 영장류(코뿔소, 사이노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 및/또는 설치류(예: 랫트 또는 뮤린) IL-11)로부터의 IL-11Rα이다. IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 임의로, 소정 종, 예를 들면, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 IL-11Rα 이소형의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 IL-11Rα는 서열번호 3 또는 4와 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 임의로, IL-11 및/또는 IL-11을 포함하는 복합체(바람직하게는 동일한 종으로부터)에 결합하고 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다(예를 들면, 문헌[참조: Curtis et al. Blood, 1997, 90(11) or Karpovich et al. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재됨).

IL-11/IL-11R 신호전달

IL-11은 낮은 친화성(Kd 약 10nmol/L)으로 IL-11Rα에 결합하고, 이들 결합 파트너 사이의 상호작용은 단독으로 생물학적 신호를 전달하는데는 불충분하다. 고친화성 수용체(Kd 약 400 내지 800pmol/L)의 생성에는 IL-11Rα 및 gp130의 공-발현을 필요로 한다[참조: Curtis et al (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12; Hilton et al., EMBO J 13:4765, 1994; Nandurkar et al., Oncogene 12:585, 1996]. 세포-표면 IL-11Rα에 대한 IL-11의 결합은 헤테로이량체화, 티로신 포스포릴화, gp130의 활성화 및 주로 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)-캐스케이드 및 야누스 키나제/신호 전달물질 및 전사(Jak/STAT) 경로의 활성화인자를 통한 하류 신호전달을 유도한다[참조: Garbers and Scheller, supra].

원칙적으로, 가용성 IL-11Rα는 또한 IL-11과 생물학적 활성의 가용성 복합체를 형성할 수 있고[참조: Pflanz et al., 1999 FEBS Lett, 450, 117-122], 이는, IL-6과 유사하게, IL-11이 일부 경우에 세포-표면 gp130에 결합하기 전에 가용성 IL-11Rα에 결합할 가능성을 상승시킨다[참조: Garbers and Scheller, supra]. 문헌[참조: Curtis et al (Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12)]은 가용성 뮤린 IL-11Rα 쇄(sIL-11R)의 발현을 기재하고, gp130을 발현하는 세포에서 신호전달을 조사했다. 막관통 IL-11R에서는 아닌 gp130의 존재하에, sIL-11R은 M1 백혈병 세포의 IL-11 의존성 분화, Ba/F3 세포에서의 증식, 및 막관통 IL-11R을 통한 신호전달과 유사한 gp130, STAT3 및 SHP2의 포스포릴화를 포함하는 초기 세포내 사상을 매개했다. 가용성 IL-11Rα에 결합된 IL-11에 의해 세포-막 결합된 gp130을 통한 신호전달의 활성화는 최근에 입증되었다[참조: Lokau et al., 2016 Cell Reports 14, 1761-1773]. 이러한 소위 IL-11 트랜스 신호전달은 IL-11-매개 신호전달의 매우 중요한 요소일 수 있고, 심지어 IL-11-매개 신호전달의 가장 일반적 형태일 수 있으며, 이는, IL-11Rα의 발현이 세포 유형의 비교적 작은 서브세트로 한정되어도, gp130이 광범위한 세포 유형에서 발현되기 때문이다.

본원에서 사용된 바와 같이, IL-11 신호전달", "IL-11-매개 신호전달" 및 "IL-11/IL-11R 신호전달"은, IL-11의 수용체에 대한 IL-11, 성숙 IL-11 분자의 기능을 갖는 이의 단편, 또는 IL-11 또는 성숙 IL-11 분자의 기능을 갖는 이의 단편의 결합에 의해 매개된 신호전달을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, "IL-11 트랜스 신호전달"은, gp130에 대한, IL-11α에 결합된 IL-11의 결합에 의해 유발되는 신호전달을 지칭하기 위해 사용된다. IL-11은 비-공유 복합체로서 IL-11α에 결합할 수 있다. gp130은 막-결합된 것이고, IL-11:IL-11α 복합체가 gp130에 결합한 후에 신호전달이 발생하는 세포에 의해 발현된다. 일부 실시형태에서, IL-11α은 가용성 IL-11α일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가용성 IL-11α는 IL-11α의 가용성(분비된) 이소형이다(예를 들면, 막관통 도메인을 결여함). 일부 실시형태에서, 가용성 IL-11α는, 세포 막 결합된 IL-11α의 세포외 도메인의 단백질분해 절단의 유리된 생성물이다. 일부 실시형태에서, IL-11α는 세포 막-결합된 것일 수 있고, gp130을 통한 신호전달은, "IL-11 시스 신호전달"로 지칭되는, 세포-막-결합된 IL-11α에 결합된 IL-11의 결합에 의해 유발될 수 있다.

IL-11-매개 신호전달은 조혈 및 혈전형성을 자극하고, 파골세포 활성을 자극하고, 신경신생을 자극하고, 지방생성을 억제하고, 염증유발 사이토킨 발현을 감소시키고, 세포외 매트릭스(ECM) 대사를 조절하고, 위장 상피 세포의 정상 성장 조절을 매개하는 것으로 밝혀져 있다[참조: Du and Williams, supra].

인터류킨 11(IL-11)의 생리학적 역할은 불분명하다. IL-11은, 조혈 세포의 활성화 및 혈소판 생성과 가장 강력하게 관련되어 있지만, 염증유발성 및 항-염증성, 혈관형성촉진성이고, 신생물에 중요한 것으로 시사되어 있다. TGFβ1 또는 조직 손상이 IL-11 발현을 유발할 수 있다는 것이 공지되어 있다[참조: Zhu, M. et al. PLOS ONE 10, (2015); Yashiro, R. et al. J. Clin. Periodontol. 33, 165-71 (2006); Obana, M. et al. Circulation 121, 684-91 (2010); Tang, W et al. J. Biol. Chem. 273, 5506-13 (1998)].

IL-11은, TGFβ-매개 신호전달의 중요한 전사후 조절인자이다. TGFβ1은 IL-11의 AP-1 프로모터 영역을 자극하는 것으로 밝혀졌고, IL-11의 TGFβ-유발된 분비는 장 근섬유아세포에서 ERK p42/44 및 p38 MAP 키나제의 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌다[참조: Bamba et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. (2003)(285(3):G529-38]. MAP 키나제 억제제는 TGFβ-유발된 IL-11 분비를 유의적으로 감소시킬 수 있고, mRNA의 p38 MAP 키나제-매개된 안정화는 IL-11의 TGFβ-유발된 분비에 중요한 것으로 밝혀졌다.

IL-11 매개 신호전달은, 다종 다양한 조직의 섬유성 프로세스에서 중요한 역할을 담당한다는 것이 최근 입증되었다[참조: 예를 들면, WO 2017/103108 A1 및 Schafer et al. (2017) Nature 552: 110-115, 이들 둘 다는 참조에 의해 이들 전체가 본원에 도입된다].

WO 제2017/103108 A1호(본원에 이의 전체가 참조로서 도입됨)는, IL-11 매개 신호전달을 위한 전-섬유성 역할을 보고하고, 섬유증의 치료/예방에서 IL-11 매개 신호전달의 길항제의 치료적 유용성을 확립한다. WO 제2017/103108 A1호의 실시예 2 및 도 7A 및 7B는, 초대 인간 심방 섬유아세포를 재조합 인간 IL-11과 인큐베이션하면, 섬유아세포에 의한 콜라겐의 침착이 증가하는 것을 입증하고, 이는 확립된 섬유화 프로세스이다. 중화 항-IL-11 항체(이소타입 대조군 항체는 아님)에 의한 치료는, TGFβ1(공지된 섬유화촉진 자극)에 의한 섬유아세포의 자극에 의해 유도된 콜라겐 생성을 폐지하는 것으로 밝혀졌다. WO 제2017/103108 A1호의 실시예 3 및 도 10은, 다양한 기타 섬유화촉진 자극(ANG2, PDGF, ET-1)에 반응하여 인간 심방 섬유아세포에 의한 콜라겐 생성의 증가를 폐지하는 중화 항-IL-11 항체의 능력을 추가로 입증한다. WO 제2017/103108 A1호는 심장 조직에서 IL-11의 섬유화촉진 역할을 뒷받침하는 추가 데이터를 제공한다. 인간 심방 섬유아세포는, 이들 인자의 생성이 섬유화촉진 자극 TGFβ1에 의한 치료에 반응하여 증가하는 것과 동일한 방식으로, 인간 IL-11 단백질에 의한 치료에 반응하여, 세포외 매트릭스 성분(콜라겐, 페리오스틴)의 생성의 유의한 증가 및 섬유화촉진 마커(αSMA, IL-6, MMP2, TIMP1)의 발현의 증가를 나타내는 것으로 밝혀졌다. WO 제2017/103108 A1호의 실시예 5.3.1 및 38A 내지 38D는 또한 인간 IL-11에 의한 치료에 반응하여 인간 초대 간 섬유아세포에 의한 세포외 매트릭스 성분의 생성 증가 및 섬유성 마커의 발현 증가, 및 또한 TGFβ1에 의한 자극의 섬유화촉진 효과를 폐지하는 중화 항-IL-11 항체의 능력을 나타낸다. WO 제2017/103108 A1호의 도 22A 내지 22F 및 23A 및 23B는, TGFβ1-매개된 섬유증이 중화 항-IL-11 항체를 사용한 치료에 의해 억제될 수 있음을 나타내고, 추가로 도 24는, IL-11-결합 데코이 수용체 분자, 중화 항-IL-11Rα 항체, 및 IL-11 및 IL-11RA 유전자 발현의 안티센스 녹다운을 위한 siRNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드가 유사하게는 섬유아세포의 myo 섬유아세포(섬유증 이펙터 세포)로의 TGFβ1-매개된 전이를 억제할 수 있음을 나타낸다. 데코이 IL-11 수용체를 사용한 TGFβ1-매개된 섬유성 반응의 억제를 나타내는 추가 데이터는 WO 제2017/103108 A1호의 도 32A 및 32B에 제공되어 있다. WO 제2017/103108 A1호의 실시예 5.3.3 및 도 21B 및 21C는, IL-11이 다양한 조직에서 섬유화촉진성인 것을 입증하는 생체내 데이터를 제공한다. 재조합 마우스 IL-11을 마우스에게 주사하면, 심장, 신장, 폐, 간의 상대 중량이 증가하고(도 21B), 이는 이들 조직에서 콜라겐 함량의 증가와 연관되었다(도 21C). IL-11의 섬유화촉진 역할을 뒷받침하는 추가의 생체내 데이터는 WO 제2017/103108 A1호의 실시예 7.2 및 7.3, 및 도 27A 내지 27D에 제공되어 있다. 이들 실험은, IL-11RA 녹아웃 마우스가 섬유화촉진 자극에 의해 유발된 심장 및 신장 조직의 섬유증으로부터 보호되어 있음을 나타내고, 이는 섬유화 프로세스의 중요한 매개인자로서 IL-11 수용체를 통한 신호전달을 나타낸다. 추가로, WO 제2017/103108 A1호의 도 31의 범례에서 요약된 도 31A 및 31B는, 섬유주 절제술 후 7일에서 IL-11RA 녹아웃 마우스보다도 야생형 마우스로부터 수득된 안구 절편에서 보다 많은 섬유증이 검출되었음을 보고한다. 따라서, WO 제2017/103108 A1호는 시험관내 및 생체내 연구 둘 다로부터의 풍부한 데이터를 제공하고, IL-11/IL-11R 신호전달은 광범위한 조직에서 섬유증의 중요한 매개인자임을 증명하고, IL-11 매개 신호전달의 억제가, 섬유화 반응의 다양한 마커의 분석에 의해 결정된 바와 같이, 섬유증을 감소시키는 것을 입증한다.

IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자

본 발명은 IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 제공한다.

"항원-결합 분자"는 표적 항원에 결합할 수 있는 분자를 지칭하고, 이들이 관련 표적 분자(들)에 대한 결합을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체), 및 항체 단편(예를 들면, Fv, scFv, Fab, scFab, F(ab')₂, Fab₂, 디아바디, 트리아바디, scFv-Fc, 미니바디, 단일 도메인 항체(예를 들면, VhH) 등)을 포함한다. "항체"에는, 합성 항체 및 단편을 포함하는, 단편 및 이의 유도체가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체는, 관련 표적 분자(즉, 항체가 특이적인 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 본 발명에 따르는 항체 및 항원-결합 분자는 단리된 형태로 제공된다.

모노클로날 항체 기술에 관련하여 현대 기술에 비추어, 항체는 대부분의 항원에 대하여 제조할 수 있다. 항원-결합 부분은 항체(예를 들면, Fab 단편) 또는 합성 항체 단편(예를 들면, 단쇄 Fv 단편[ScFv])의 일부일 수 있다. 선택된 항원에 대한 적합한 모노클로날 항체는 공지된 기술, 예를 들면, 문헌[참조: "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)]에 기재된 것들에 의해 제조할 수 있다. 키메라 항체는 문헌[참조: Neuberger et al (1988, 8^th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)]에 의해 언급되어 있다.

모노클로날 항체(mAb)는 본 발명의 방법에 유용하고, 항원 상의 단일 에피토프를 특이적으로 표적화하는 항체의 균질한 모집단이다.

Fab 및 Fab₂ 단편 등의 항체의 항원 결합 단편은 또한, 유전자 조작된 항체 및 항체 단편과 동일하게 사용/제조될 수 있다. 항체의 가변 중쇄(V_H) 및 가변 경쇄(V_L) 도메인은 항원 인식에 관여하고, 이는 초기 프로테아제 소화 실험에 의해 최초로 인식된 사실이다. 추가의 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 밝혀졌다. 수득된 항체가 설치류 모체 항체의 항원 특이성을 보유하도록, 설치류 기원의 가변 도메인을 인간 기원의 불변 도메인에 융합시킬 수 있다[참조: Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855].

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 완전 인간 항체/항체 단편이다. 완전 인간 항체/항체 단편은 인간 핵산 서열(들)에 의해 코딩되어 있다. 완전 인간 항체/항체 단편은 비-인간 아미노산 서열을 결여하고 있다.

완전 인간 항체의 생산에 가장 일반적으로 사용되는 2개 기술은 (i) 인간 항체 유전자가 파지 디스플레이 라이브러리에서 발현되는 파지 디스플레이, 및 (ii) 인간 항체 유전자를 갖도록 조작된 유전자도입 마우스에서 항체의 생산(문헌[참조: Park and Smolen Advances in Protein Chemistry (2001) 56: 369-421]에 기재됨)이다. 요약하면, 인간 항체 유전자-파지 디스플레이 기술에서는, VH 및 VL 쇄를 코딩하는 유전자는 "네이브" 인간 림프구로부터 PCR 증폭 및 클로닝에 의해 생성되고, 라이브러리로 조립되고, 이들로부터 디설파이드-결합 Fab 단편 또는 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 발현될 수 있다. Fab- 또는 scFv-코딩 유전자는 사상 박테리오파지의 표면 코트 단백질에 융합시키고, 이어서 목적하는 표적에 결합할 수 있는 Fab 또는 scFv는 라이브러리를 항원으로 스크리닝함으로써 동정할 수 있다. Fab/scFv 단편의 친화성을 증강시키기 위해, 분자 진화 또는 친화성 성숙 절차를 사용할 수 있다. 유전자도입 마우스 기술에서는, 내인성 뮤린 Ig 유전자 유전자좌가 이들의 인간 상동체와의 상동성 재조합에 의해 치환되어 있는 마우스를 항원으로 면역화시키고, 모노클로날 항체를 종래의 하이브리도마 기술에 의해 제조하여 완전 인간 모노클노날 항체를 수득한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 뮤린 항체/항체 단편이다. 일부 실시형태에서, 항체/항체 단편은 인간 네이브 항체 유전자 라이브러리를 사용한 파지 디스플레이에 의해 제조할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 마우스/인간 키메라 항체/항체 단편(예를 들면, 뮤린 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 포함하는 항원-결합 분자)이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 인간화 항체/항체 단편(예를 들면, 뮤린 CDR 및 인간 프레임워크 및 불변 영역을 포함하는 항원-결합 분자)이다.

마우스/인간 키메라 항원-결합 분자는, 예를 들면, 문헌[참조: Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, Michael Steinitz (Editor), Methods in Molecular Biology 1060, Springer Protocols, Humana Press (2014), in Chapter 8 thereof, in particular section 3 of Chapter 8]에 기재된 바와 같이, 키메라화의 프로세스에 의해 마우스 모노클로날 항체로부터 제조할 수 있다.

인간화 항원-결합 분자는, 예를 들면, 문헌[참조: Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, Michael Steinitz (Editor), Methods in Molecular Biology 1060, Springer Protocols, Humana Press (2014), in Chapter 7 thereof, in particular section 3.1 of Chapter 7 entitled 'Antibody Humanization']에 기재된 바와 같이, 인간화의 프로세스에 의해 마우스 항체로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 항원-결합 분자는 표적 항원(들)에 결합할 수 있는 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는, 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 표적 항원에 결합할 수 있는 앱타머, 예를 들면, 핵산 앱타머(참조: 예를 들면, Zhou and Rossi Nat Rev Drug Discov. 2017 16(3):181-202)를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 표적 항원에 결합할 수 있는 모이어티는 항원-결합 펩티드/폴리펩티드, 예를 들면, 펩티드 앱타머, 티오레독신, 모노바디, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아비머, 놋틴, 피노머, 아트리머, DARPin, 아피바디, 나노바디(즉, 단일-도메인 항체(sdAb)) 아필린, 아르마딜로 반복 단백질(ArmRp), 오바디(OBody) 또는 피브로넥틴을 포함하거나 이들로 이루어진다(예를 들면, 문헌[참조: Reverdatto et al., Curr Top Med Chem. 2015; 15(12): 1082-1101] 참조, 이는 이의 전체가 본원에 참조로서 도입된다(또한, 예를 들면, 문헌[Boersma et al., J Biol Chem (2011) 286:41273-85 and Emanuel et al., Mabs (2011) 3:38-48] 참조).

본 발명의 항원-결합 분자는 일반적으로, 표적 항원에 결합할 수 있는 항체의 VH 및 VL을 포함하는 항원-결합 도메인을 포함한다. 또한, VH 및 VL에 의해 형성된 항원-결합 도메인은 본원에서 Fv 영역으로서 지칭될 수 있다.

항원-결합 분자는 항원-결합 폴리펩티드 또는 항원-결합 폴리펩티드 복합체일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 항원-결합 분자는, 함께 항원-결합 도메인을 형성하는, 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 공유결합 또는 비공유결합으로 회합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 포함하는 보다 큰 폴리펩티드의 일부를 형성한다(예를 들면, VH 및 VL을 포함하는 scFv의 경우, 또는 VH-CH1 및 VL-CL을 포함하는 scFab의 경우).

항원-결합 분자는 하나 이상의 폴리펩티드(예를 들면, 2, 3, 4, 6 또는 8개 폴리펩티드)의 비공유 또는 공유 복합체, 예를 들면, 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 IgG-유사 항원-결합 분자를 지칭할 수 있다.

본 발명의 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 모노클로날 항체(mAb)의 서열을 사용하여 설계 및 제조될 수 있다. 또한, 단쇄 가변 단편(scFv), Fab 및 F(ab')₂ 단편 등의 항체의 항원-결합 영역을 사용/제공할 수 있다. "항원-결합 영역"은, 소정 항체가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편이다.

항체는 일반적으로 6개의 상보성-결정 영역 CDR을 포함한다: 중쇄 가변(VH) 영역에 3개: HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 경쇄 가변(VL) 영역에 3개: LC-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3. 6개 CDR은 함께 항체의 파라토프를 정의하고, 이는 표적 항원에 결합하는 항체의 일부이다.

VH 영역 및 VL 영역은 각 CDR의 양 측에 프레임워크 영역(FR)을 포함하고, 이는 CDR의 스캐폴드를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단까지, VH 영역은 하기 구조: N 말단-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C 말단을 포함하고; VL 영역은 하기 구조: N 말단-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C 말단을 포함한다.

항체 CDR 및 FR을 정의하기 위한 몇몇 상이한 규칙, 예컨대, 문헌[참조: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), and VBASE2]에 기재된 것들, 문헌[참조: Retter et al., Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674]에 기재된 것들이 있다. 본원에 기재된 항체 클론의 VH 영역 및 VL 영역의 CDR 및 FR은 카뱃 시스템에 따라 정의되었다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 FR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 CDR 및 FR을 포함한다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 본원에 기재된 IL-11Rα-결합 항체 클론의 VH/VL 영역이거나 이들로부터 유래하는 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다(예를 들면, 항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7(9A7 VH, 9A7 VH 1, 9A7 VH 2, 9A7 VH 3, 9A7 VH 4 또는 9A7 VH 5 및 9A7 VL, 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3 또는 9A7 VL 4를 포함)).

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 서열번호 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 여기서 위치 91에 상응하는 위치는 아르기닌이 아니고/아니거나, 위치 105에 상응하는 위치는 메티오닌이 아니다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 서열번호 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하고, 여기서 위치 91에 상응하는 위치는 세린이고/이거나, 위치 105에 상응하는 위치는 류신 또는 이소류신이다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 서열번호 59의 아미노산 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 VL 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 펩티드/폴리펩티드를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 서열번호 60의 아미노산 서열과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 LC-CDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 LC-CDR3을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 펩티드/폴리펩티드를 포함하지 않는다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (1) 내지 (3) 중의 하나에 따르는 VH 영역을 포함한다:

(1) (9A7 VH, 9A7 VH 1, 9A7 VH 2, 9A7 VH 3, 9A7 VH 4, 9A7 VH 5) 하기 CDR을 도입한 VH 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,

또는, HC-CDR1, HC-CDR2 또는 HC-CDR3 중의 하나 이상에서 1 또는 2 또는 3개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 이의 변이체.

(2) (9A7 VH, 9A7 VH 1, 9A7 VH 2, 9A7 VH 3, 9A7 VH 4) 하기 CDR을 도입한 VH 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,

(3) (9A7 VH 5) 하기 CDR을 도입한 VH 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (4) 내지 (9) 중의 하나에 따르는 VH 영역을 포함한다:

(4) (9A7 VH) 하기 FR을 도입한 VH 영역:

서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1

서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2

서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3

서열번호 37의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,

또는, HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 또는 HC-FR4 중의 하나 이상에서 1 또는 2 또는 3개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 이의 변이체.

(5) (9A7 VH 1) 하기 FR을 도입한 VH 영역:

서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1

서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2

서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3

서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,

(6) (9A7 VH 2) 하기 FR을 도입한 VH 영역:

서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1

서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2

서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3

서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,

(7) (9A7 VH 3) 하기 FR을 도입한 VH 영역:

서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1

서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2

서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3

서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,

(8) (9A7 VH 4) 하기 FR을 도입한 VH 영역:

서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1

서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2

서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3

서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,

(9) (9A7 VH 5) 하기 FR을 도입한 VH 영역:

서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR1

서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR2

서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR3

성려번호 38의 아미노산 서열을 갖는 HC-FR4,

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (1) 내지 (3) 중의 하나에 따르는 CDR 및 상기 (4) 내지 (9) 중의 하나에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (10) 내지 (15) 중의 하나에 따르는 VH 영역을 포함한다:

(10) (9A7 VH) (2)에 따르는 CDR 및 (4)에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역.

(11) (9A7 VH 1) (2)에 따르는 CDR 및 (5)에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역.

(12) (9A7 VH 2) (2)에 따르는 CDR 및 (6)에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역.

(13) (9A7 VH 3) (2)에 따르는 CDR 및 (7)에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역.

(14) (9A7 VH 4) (2)에 따르는 CDR 및 (8)에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역.

(15) (9A7 VH 5) (3)에 따르는 CDR 및 (9)에 따르는 FR을 포함하는 VH 영역.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (16) 내지 (21) 중의 하나에 따르는 VH 영역을 포함한다:

(16) (9A7 VH) 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.

(17) (9A7 VH 1) 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.

(18) (9A7 VH 2) 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.

(19) (9A7 VH 3) 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.

(20) (9A7 VH 4) 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.

(21) (9A7 VH 5) 서열번호 12의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (22)에 따르는 VL 영역을 포함한다:

(22) (9A7 VL, 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3, 9A7 VL 4) 하기 CDR을 도입한 VL 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,

또는, LC-CDR1, LC-CDR2 또는 LC-CDR3 중의 하나 이상에서 1 또는 2 또는 3개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 이의 변이체.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (23) 내지 (27) 중의 하나에 따르는 VL 영역을 포함한다:

(23) (9A7 VL) 하기 FR을 도입한 VL 영역:

서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1

서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2

서열번호 45의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3

서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,

또는, LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 또는 LC-FR4 중의 하나 이상에서 1 또는 2 또는 3개 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 이의 변이체.

(24) (9A7 VL 1) 하기 FR을 도입한 VL 영역:

서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1

서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2

서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3

서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,

(25) (9A7 VL 2) 하기 FR을 도입한 VL 영역:

서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1

서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2

서열번호 47의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3

서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,

(26) (9A7 VL 3) 하기 FR을 도입한 VL 영역:

서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1

서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2

서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3

서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,

(27) (9A7 VL 4) 하기 FR을 도입한 VL 영역:

서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR1

서열번호 44의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR2

서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR3

서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 LC-FR4,

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (22)에 따르는 CDR 및 상기 (23) 내지 (27) 중의 하나에 따르는 FR을 포함하는 VL 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (28) 내지 (32) 중의 하나에 따르는 VL 영역을 포함한다:

(28) (9A7 VL) (22)에 따르는 CDR 및 (23)에 따르는 FR을 포함하는 VL 영역.

(29) (9A7 VL 1) (22)에 따르는 CDR 및 (24)에 따르는 FR을 포함하는 VL 영역.

(30) (9A7 VL 2) (22)에 따르는 CDR 및 (25)에 따르는 FR을 포함하는 VL 영역.

(31) (9A7 VL 3) (22)에 따르는 CDR 및 (26)에 따르는 FR을 포함하는 VL 영역.

(32) (9A7 VL 4) (22)에 따르는 CDR 및 (27)에 따르는 FR을 포함하는 VL 영역.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 하기 (33) 내지 (37) 중의 하나에 따르는 VL 영역을 포함한다:

(33) (9A7 VL) 서열번호 13의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.

(34) (9A7 VL 1) 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.

(35) (9A7 VL 2) 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.

(36) (9A7 VL 3) 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.

(37) (9A7 VL 4) 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 상기 (1) 내지 (21) 중의 어느 하나에 따르는 VH 영역 및 상기 (22) 내지 (37) 중의 어느 하나에 따르는 VL 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (10) 또는 (16)에 따르는 VH 영역 및 (28) 또는 (33)에 따르는 VL 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (14) 또는 (20)에 따르는 VH 영역 및 (32) 또는 (37)에 따르는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (14)에 따르는 VH 영역 및 (32)에 따르는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (20)에 따르는 VH 영역 및 (37)에 따르는 VL 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (13) 또는 (19)에 따르는 VH 영역 및 (30) 또는 (35)에 따르는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (13) 또는 (19)에 따르는 VH 영역 및 (31) 또는 (36)에 따르는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (13) 또는 (19)에 따르는 VH 영역 및 (32) 또는 (37)에 따르는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (14) 또는 (20)에 따르는 VH 영역 및 (30) 또는 (35)에 따르는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 (14) 또는 (20)에 따르는 VH 영역 및 (31) 또는 (36)에 따르는 VL 영역을 포함한다.

하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 본 발명에 따르는 실시형태에서, 치환은, 예를 들면, 하기 표에 따르는 보존적 치환일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중앙의 컬럼에서 동일한 블록 내의 아미노산이 치환되어 있다. 일부 실시형태에서, 최우측 컬럼에서 동일 라인 내의 아미노산이 치환되어 있다:

일부 실시형태에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 즉, 일부 실시형태에서, 치환은, 동등한 비치환된 분자와 비교하여, 치환을 포함하는 항원-결합 분자의 하나 이상의 기능 특성(예를 들면, 표적 결합)에 영향을 미치지 않는다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않는다).

일부 실시형태에서, 참조 VH 또는 VL 서열에 대한 치환(들)은 VH 또는 VL 서열의 특정 영역 또는 영역들에 집중될 수 있다. 예를 들면, 참조 VH 또는 VL 서열로부터의 변화는 하나 이상의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)에 집중될 수 있다.

항체의 항원-결합 영역의 VH 및 VL 영역은 함께 Fv 영역을 구성한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합하는 Fv 영역을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, Fv의 VH 및 VL 영역은, 링커 영역, 즉 단쇄 Fv(scFv)에 의해 결합된 단일 폴리펩티드로서 제공된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 면역글로불린 중쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들면, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM의 중쇄 불변 서열이거나 이들로부터 유래한다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G1 불변 서열(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1; 서열번호 53)이다. 서열번호 53의 위치 1 내지 98은 CH1 영역(서열번호 54)을 형성한다. 서열번호 53의 위치 99 내지 110은 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 힌지 영역(서열번호 55)을 형성한다. 서열번호 53의 위치 111 내지 223은 CH2 영역(서열번호 56)을 형성한다. 서열번호 53의 위치 224 내지 330은 CH3 영역(서열번호 57)을 형성한다.

일부 실시형태에서, CH1 영역은, 서열 54의 서열, 또는 서열 54의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH1-CH2 힌지 영역은, 서열번호 55의 서열, 또는 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH2 영역은, 서열번호 56의 서열, 또는 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH3 영역은, 서열번호 57의 서열, 또는 서열번호 57의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 4 불변 서열(IGHG4; UniProt: P01861, v1; 서열번호 61)이다. 서열번호 61의 위치 1-98은 CH1 영역(서열번호 62)을 형성한다. 서열번호 61의 위치 99-110은 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 힌지 영역(서열번호 63)을 형성한다. 서열번호 61의 위치 111-220은 CH2 영역(서열번호 64)을 형성한다. 서열번호 61의 위치 221-327은 CH3 영역(서열번호 65)을 형성한다.

일부 실시형태에서, CH1 영역은, 서열번호 62의 서열, 또는 서열번호 62의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH1-CH2 힌지 영역은, 서열번호 63의 서열, 또는 서열번호 63의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH2 영역은, 서열번호 64의 서열, 또는 서열번호 64의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH3 영역은, 서열번호 65의 서열, 또는 서열번호 65의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은, 본 발명의 항원-결합 분자에 개선된 특성을 부여하는 아미노산 치환을 포함하는 인간 면역글로불린 G 4 불변 서열(IGHG4; UniProt: P01861, v1)이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 치환 S241P 및/또는 L248E을 포함하는 인간 IgG4이다. S241P 돌연변이는 힌지 안정화이고, L248E 돌연변이는 IgG4의 이미 낮은 ADCC 이펙터 기능을 추가로 저하시킨다[참조: Davies and Sutton, Immunol Rev. 2015 Nov; 268(1):139-159; Angal et al Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8]. 보다 낮은 ADCC 활성은 항체의 잠재적 피하 투여에 유리하다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은, 서열번호 66에 기재된 바와 같이, 치환 S241P(카뱃 시스템에 따라 넘버링됨)을 포함하는 인간 면역글로불린 G 4 불변 서열(IGHG4; UniProt: P01861, v1)이다. 서열번호 66의 위치 1-99는 CH1 영역(서열번호 62)을 형성한다. 서열번호 66의 위치 99-110은, S241P 치환을 포함하는 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 힌지 영역(서열번호 67)을 형성한다. 서열번호 66의 위치 111-220은 CH2 영역(서열번호 64)을 형성한다. 서열번호 66의 위치 221-327은 CH3 영역(서열번호 65)을 형성한다.

일부 실시형태에서, CH1 영역은, 서열번호 62의 서열, 또는 서열번호 62의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH1-CH2 힌지 영역을, 서열번호 67의 서열, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH2 영역은, 서열번호 64의 서열, 또는 서열번호 64의 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH3 영역은, 서열번호 65의 서열, 또는 서열번호 65의 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은, 서열번호 68에 기재된 바와 같이, 치환 S241P 및 L248E(카뱃 시스템에 따라 넘버링됨)을 포함하는 인간 면역글로불린 G 4 불변 서열(IGHG4; UniProt: P01861, v1)이다. 서열번호 68의 위치 1-98은 CH1 영역(서열번호 62)을 형성한다. 서열번호 68의 위치 99-110은 S241P 치환을 포함하는 CH1과 CH2 영역 사이에 힌지 영역(서열번호 67)을 형성한다. 서열번호 68의 위치 111-220은 L248E 치환을 포함하는 CH2 영역(서열번호 69)을 형성한다. 서열번호 68의 위치 221-327은 CH3 영역(서열번호 65)을 형성한다.

일부 실시형태에서, CH1 영역은, 서열번호 62의 서열, 또는 서열번호 62의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH1-CH2 힌지 영역은, 서열번호 67의 서열, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH2 영역은, 서열번호 69의 서열, 또는 서열번호 69의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CH3 영역은, 서열번호 65의 서열, 또는 서열번호 65의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 면역글로불린 경쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 카파 불변 서열(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2; 서열번호 58)이다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 람다 불변 서열(IGLC; Cλ), 예를 들면, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 또는 IGLC7(서열번호 75, 76, 77, 78 또는 79)이다. 일부 실시형태에서, CL 영역은, 서열번호 58의 서열, 또는 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, CL 영역은, 서열번호 75, 76, 77, 78 또는 79의 서열, 또는 서열번호 75, 76, 77, 78 또는 79의 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

항체의 항원-결합 영역의 VL 및 경쇄 불변(CL) 영역 및 VH 영역 및 중쇄 불변 1(CH1) 영역은 함께 Fab 영역을 구성한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 VH, CH1, VL 및 CL(예를 들면, Cκ 또는 Cλ)를 포함하는 Fab 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab 영역은 VH 및 CH1을 포함하는 폴리펩티드(예를 들면, VL-CH1 융합 폴리펩티드) 및 VL 및 CL을 포함하는 폴리펩티드(예를 들면, VL-CL 융합 폴리펩티드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab 영역은 VH 및 CL을 포함하는 폴리펩티드(예를 들면, VH-CL 융합 폴리펩티드) 및 VL 및 CH를 포함하는 폴리펩티드(예를 들면, VL-CH1 융합 폴리펩티드)를 포함하고; 즉, 일부 실시형태에서, Fab 영역은 CrossFab 영역이다. 일부 실시형태에서, Fab 또는 CrossFab의 VH, CH1, VL 및 CL 영역은, 링커 영역에 의해 결합된 단일 폴리펩티드로서, 즉 단쇄 Fab(scFab) 또는 단쇄 CrossFab(scCrossFab)로서 제공된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합하는 Fab 영역을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합하는 전체 항체를 포함하거나 이들로 이루어진다. 본원에 사용된 바와 같이, "전체 항체"는, 면역글로불린(Ig)의 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 상이한 종류의 면역글로불린 및 이들의 구조는, 예를 들면, 문헌[참조: Schroeder and Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52, 이는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다.

유형 G의 면역글로불린(즉, IgG)은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 약 150kDa 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 중쇄는 VH, 이어서 3개 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 유사하게는 경쇄는 VL, 이어서 CL을 포함한다. 중쇄에 따라, 면역글로불린은 IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들면, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM으로 분류될 수 있다. 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합하는 IgG(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들면, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 IL-11Rα에 대한 적어도 1가 결합이다. 결합 원자가는 제공된 항원 결정기의 항원 결합 분자 내의 결합 부위의 수를 지칭한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항원-결합 부위는 IL-11Rα에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 대한 하나 이상의 결합 부위, 예를 들면, 2, 3 또는 4개 결합 부위를 포함한다. 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 예를 들면, IL-11Rα에 대해 2가, 3가 또는 4가이다.

본 발명의 태양은 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. "다중특이적"이란, 항원-결합 분자가 하나 이상의 표적에 대하여 특이적 결합을 나타내는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 이중특이적 항원-결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 적어도 2개의 상이한 항원-결합 도메인(즉, 예를 들면, 동일하지 않은 VH 및 VL를 포함하는, 적어도 2개의 항원-결합 도메인)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 IL-11Rα 및 또 다른 표적(예를 들면, IL-11Rα 이외의 항원)에 결합하고, 따라서 적어도 이중특이적이다. 용어 "이중특이적"은 항원-결합 분자가 적어도 2개의 상이한 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따르는 항원-결합 분자(예를 들면, 다중특이적 항원-결합 분자)는, 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 예를 들면, IL-11Rα, 및 IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자는 (i) IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자 및 (ii) IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자(예를 들면, 다중특이적 항원-결합 분자)는, 항원-결합 분자가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항원-결합 폴리펩티드 또는 항원-결합 폴리펩티드 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 예를 들면, (i) 경쇄 폴리펩티드(구조 VL-CL을 포함) 및 중쇄 폴리펩티드(구조 VH-CH1-CH2-CH3을 포함)을 포함하는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 폴리펩티드 복합체, 및 (ii) 경쇄 폴리펩티드(구조 VL-CL을 포함) 및 중쇄 폴리펩티드(구조 VL-CH1-CH2-CH3을 포함)를 포함하는, IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 폴리펩티드 복합체를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 보다 큰 항원-결합 분자의 성분 항원-결합 분자(예를 들면, 다중특이적 항원-결합 분자)는, 예를 들면, 보다 큰 항원-결합 분자의 "항원-결합 도메인" 또는 "항원-결합 영역"으로 지칭될 수 있다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자, 및 IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-11Rα 이외의 항원은 면역 세포 표면 분자이다. 일부 실시형태에서, IL-11Rα 이외의 항원은 암 세포 항원이다. 일부 실시형태에서, IL-11Rα 이외의 항원은 수용체 분자, 예를 들면, 세포 표면 수용체이다. 일부 실시형태에서, IL-11Rα 이외의 항원은 세포 신호전달 분자, 예를 들면, 사이토킨, 케모킨, 인터페론, 인터류킨 또는 림포킨이다. 일부 실시형태에서, IL-11Rα 이외의 항원은 성장 인자 또는 호르몬이다.

암 세포 항원은, 암 세포에 의해 발현 또는 과-발현되는 항원이다. 암 세포 항원은, 임의의 펩티드/폴리펩티드, 당단백질, 리포단백질, 글리칸, 당지질, 지질 또는 이의 단편일 수 있다. 암 세포 항원의 발현은 암과 관련될 수 있다. 암 세포 항원은 암 세포에 의해 비정상적으로 발현될 수 있거나(예를 들면, 암 세포 항원은 비정상 국재화로 발현될 수 있음), 암 세포에 의해 비정상 구조로 발현될 수 있다. 암 세포 항원은 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 암 세포의 세포 표면에서 발현된다(즉, 암 세포 항원은 암 세포 표면 항원이다). 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자에 의해 결합되는 항원의 부분은 암 세포의 외부 표면에 표시된다(즉, 세포외이다). 암 세포 항원은 암-연관 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포 항원은, 이의 발현이 암 증상의 발달, 진행 또는 중증도와 연관되는 항원이다. 암-연관 항원은, 암의 원인 또는 병상과 연관될 수 있거나, 암의 결과로서 비정상적으로 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포 항원은, 예를 들면, 비교가능한 비-암성 세포(예를 들면, 동일한 조직/세포 유형으로부터 유래하는 비-암성 세포)에 의한 발현 수준과 비교하여, 이의 발현이 암의 세포에 의해 상향조절(예를 들면, RNA 및/또는 단백질 수준에서)되는 항원이다. 일부 실시형태에서, 암-연관 항원은 암성 세포에 의해 우선적으로 발현될 수 있고, 필적하는 비-암성 세포(예를 들면, 동일한 조직/세포 유형으로부터 유래하는 비-암성 세포)에 의해 발현되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관 항원은, 돌연변이된 종양 또는 돌연변이된 종양 억제 유전자의 생성물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관 항원은 과발현된 세포 단백질, 발암성 바이러스에 의해 생성된 암 항원, 암태아 항원, 또는 세포 표면 당지질 또는 당단백질의 생성물일 수 있다.

면역 세포 표면 분자는, 면역 세포의 세포 표면에서 또는 표면 상에서 발현된 임의의 펩티드/폴리펩티드, 당단백질, 지단백질, 글리칸, 당지질, 지질 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자에 의해 결합되는 면역 세포 표면 분자의 부분은 면역 세포의 외부 표면 상에 있다(즉, 세포외이다). 면역 세포 표면 분자는 임의의 면역 세포의 세포 표면에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 조혈 기원의 세포, 예를 들면, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지상 세포, 림프구 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는, 예를 들면, T 세포, B 세포, 천연 킬러(NK) 세포, NKT 세포 또는 자연 림프 세포(ILC) 또는 이의 전구체(예를 들면, 흉선 또는 프리-B 세포)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 분자는 공자극 분자(예를 들면, CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 또는 CD27) 또는 이의 리간드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포 표면 분자는 체크포인트 억제제(예를 들면, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 또는 BTLA) 또는 이의 리간드일 수 있다.

본 발명에 따르는 다중특이적 항원-결합 분자는 임의의 적합한 포맷, 예컨대, 문헌[참조: Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212, 이는 본원에서 그 전체가 참조로서 도입됨]에 기재된 포맷으로 제공될 수 있다. 적합한 포맷은 문헌[Brinkmann and Kontermann MAbs (2017) 9(2): 182-212]의 도 2에 제시된 것들: 항체 접합체, 예를 들면, IgG₂, F(ab')₂ 또는 CovX-Body; IgG 또는 IgG-유사 분자, 예를 들면, IgG, 키메라 IgG, κλ-체 공통 HC; CH1/CL 융합 단백질, 예를 들면, scFv2-CH1/CL, VHH2-CH1/CL; "가변 도메인 단독" 이중특이적 항원-결합 분자, 예를 들면, 탠덤 scFv(taFV), 트리플바디, 디아바디(Db), dsDb, Db(kih), DART, scDB, dsFv-dsFv, tandAbs, 트리플 헤드, 댄덤 dAb/VHH, 3가 dAb.VHH; 비-Ig 융합 단백질, 예를 들면, scFv₂-알부민, scDb-알부민, taFv-알부민, taFv-독소, 미니항체, DNL-Fab₂, DNL-Fab₂-scFv, DNL-Fab₂-IgG-사이토킨₂, ImmTAC(TCR-scFv); 변형된 Fc 및 CH3 융합 단백질, 예를 들면, scFv-Fc(kih), scFv-Fc(CH3 전하 쌍), scFv-Fc(EW-RVT), scFv-fc(HA-TF), scFv-Fc(SEEDbody), taFv-Fc(kih), scFv-Fc(kih)-Fv, Fab-Fc(kih)-scFv, Fab-scFv-Fc(kih), Fab-scFv-Fc(BEAT), Fab-scFv-Fc(SEEDbody), DART-Fc, scFv-CH3(kih), TriFabs; Fc 융합체, 예를 들면, 디-바디, scDb-Fc, taFv-Fc, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, Fab-scFv-Fc, scFv₄-Ig, scFv₂-Fcab; CH3 융합체, 예를 들면, 디아-디아바디, scDb-CH3; IgE/IgM CH2 융합체, 예를 들면, scFv-EHD2-scFv, scFvMHD2-scFv; Fab 융합 단백질, 예를 들면, Fab-scFv(바이바디), Fab-scFv₂(트리바디), Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-VHH, 직교 Fab-Fab; 비-Ig 융합 단백질, 예를 들면, DNL-Fab₃, DNL-Fab₂-scFv, DNL-Fab₂-IgG-사이토킨₂; 비대칭 IgG 또는 IgG-유사 분자, 예를 들면, IgG(kih), IgG(kih) 공통 LC, ZW1 IgG 공통 LC, Biclonics 공통 LC, CrossMab, CrossMab(kih), scFab-IgG(kih), Fab-scFab-IgG(kih), 직교 Fab IgG(kih), DuetMab, CH3 전하 쌍 + CH1/CL 전하 쌍, 힌지/CH3 전하 쌍, SEED-바디, 듀오바디(Duobody), 포-인-원(four-in-one)-CrossMab(kih), LUZ-Y 공통 LC; LUZ-Y scFab-IgG, FcFc*; 부가 및 Fc-변형된 IgG, 예를 들면, IgG(kih)-Fv, IgG HA-TF-Fv, IgG(kih)scFab, scFab-Fc(kih)-scFv2, scFab-Fc(kih)-scFv, 절반 DVD-Ig, DVI-Ig(포-인-원), CrossMab-Fab; 변형된 Fc 및 CH3 융합 단백질, 예를 들면, Fab-Fc(kih)-scFv, Fab-scFv-Fc(kih), Fab-scFv-Fc(BEAT), Fab-scFv-Fc-SEEDbody, TriFab; 부가 IgG-HC 융합체, 예를 들면, IgG-HC, scFv, IgG-dAb, IgG-taFV, IgG-CrossFab, IgG-직교 Fab, IgG-(CαCβ) Fab, scFv-HC-IgG, 탠덤 Fab-IgG(직교 Fab) Fab-IgG(CαCβ Fab), Fab-IgG(CR3), Fab-힌지-IgG(CR3); 부가 IgG-LC 융합체, 예를 들면, IgG-scFv(LC), scFv(LC)-IgG, dAb-IgG; 부가 IgG-HC 및 LC 융합체, 예를 들면, DVD-Ig, TVD-Ig, CODV-Ig, scFv₄-IgG, Zybody; Fc 융합체, 예를 들면, Fab-scFv-Fc, scFv₄-Ig; F(ab')2 융합체, 예를 들면, F(ab')₂-scFv₂; CH1/CL 융합 단백질, 예를 들면, scFv₂-CH1-힌지/CL; 변형된 IgG, 예를 들면, DAF(투-인-원(two-in one)-IgG), DutaMab, Mab²; 및 비-Ig 융합체, 예를 들면, DNL-Fab₄-IgG를 포함한다.

당업자는, 이중특이적 항원-결합 분자를 설계 및 제조할 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: Segal and Bast, 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16, 이는 그 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.]에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 환원성 디설파이드 결합 또는 비-환원성 티오에테르 결합에 의한 항원-결합 분자 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)를 사용하여, 예를 들면, 힌지 영역 SH-그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키고, 디설파이드-결합된 이중특이적 F(ab)₂ 헤테로이량체를 생성할 수 있다.

이중특이적 항원-결합 분자를 생산하는 다른 방법은, 예를 들면, 문헌[참조: D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antigen-binding molecules. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같이, 항체-생산 하이브리도마를, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시켜, 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마 세포를 생산하는 것을 포함한다.

본 발명에 따르는 이중특이적 항원-결합 분자는 또한, 예를 들면, 항원-결합 분자의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로부터의 발현에 의해, 예를 들면, 문헌[참조: Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antigen-binding molecules: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), or French, How to make bispecific antigen-binding molecules, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339, 이들 모두의 전체 내용은 본원에서 참조에 의해 도입된다.]에 기재된 바와 같이, 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 2개의 항원-결합 단편을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(즉, IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 단편의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 또 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원-결합 단편의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 코딩하고 DNA 작제물, 및 항원-결합 단편 사이에 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조할 수 있다. 이어서, 재조합 이중특이적 항체는 적합한 숙주 세포(예를 들면, 포유동물 숙주 세포)에서 작제물의 발현(예를 들면, 시험관내)에 의해 생산할 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 임의로 정제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 Fc 영역을 포함한다. Fc 영역은 하나의 폴리펩티드의 CH2 및 CH3 영역, 및 또 다른 폴리펩티드의 CH2 및 CH3 영역으로 구성되어 있다. 2개 폴리펩티드로부터의 CH2 및 CH3 영역은 함께 Fc 영역을 형성한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, Fc 영역의 회합을 촉진하는 CH2 및 CH3 영역 중의 하나 이상에서 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 항원-결합 분자의 구성 폴리펩티드의 재조합 공-발현 및 후속의 회합은 몇몇 가능한 조합을 유도한다. 재조합 생산에서 항원-결합 분자 중의 폴리펩티드의 원하는 조합의 수율을 개선하기 위해, 중쇄 폴리펩티드의 원하는 조합의 회합을 촉진하는 변형(들)을 Fc 영역에 도입하는 것이 유리하다. 변형은, 예를 들면, 상이한 폴리펩티드 쇄의 CH2 및/또는 CH3 영역 사이의 소수성 및/또는 정전기적 상호작용을 촉진할 수 있다. 적합한 변형은, 예를 들면, 문헌[참조: Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394, 이는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원 항원-결합 분자는, 문헌[참조: Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394: KiH, KiH_s-s, HA-TF, ZW1, 7.8.60, DD-KK, EW-RVT, EW-RVT_s-s, SEED or A107]의 표 1에 제시된 바와 같이, 하기 포맷 중의 하나에 따라 Fc 영역의 CH3 영역에 쌍을 이룬 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.

폴리펩티드

본 발명은 또한, 항원-결합 분자의 폴리펩티드 구성요소를 제공한다. 폴리펩티드는 단리된 또는 실질적으로 정제된 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩티드의 복합체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.

폴리펩티드가 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함하는 본 명세서에서는, 복수의 도메인/영역이 바람직하게는 동일한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 것으로 이해된다. 즉, 폴리펩티드가 하나 이상의 도메인을 포함하거나, 영역은 도메인/영역을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 본원에 기재된 VH를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 본원에 기재된 VL을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 항체 중쇄 불변 영역(CH)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 항체 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 면역글로불린(Ig)의 CH1, CH2 영역 및/또는 CH3 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 CH1 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 CH1-CH2 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 CH2 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 CH3 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는, 상기 참조에 의해 도입된 문헌[참조: Ha et al., Front. Immnol (2016) 7:394]의 표 1에 제시된 아미노산 치환/아미노산 치환의 조합 중의 어느 하나를 포함하는 CH3 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 CH2 및/또는 CH3 영역은, CH2 및/또는 CH3 영역을 포함하는 또 다른 폴리펩티드와의 폴리펩티드의 회합을 촉진하기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 불변 서열의 하나 이상의 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 CL 영역을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 하기 중의 하나에 따르는 N-말단으로부터 C-말단까지의 구조를 포함한다:

(i) VH

(ii) VL

(iii) VH-CH1

(iv) VL-CL

(v) VL-CH1

(vi) VH-CL

(vii) VH-CH1-CH2-CH3

(viii) VL-CL-CH2-CH3

(ix) VL-CH1-CH2-CH3

(x) VH-CL-CH2-CH3

또한, 본 발명에 의해 제공된 것은 본 발명의 폴리펩티드로 구성된 항원-결합 분자이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩티드의 하기 조합 중의 하나를 포함한다:

(A) VH + VL

(B) VH-CH1 + VL-CL

(C) VL-CH1 + VH-CL

(D) VH-CH1-CH2-CH3 + VL-CL

(E) VH-CL-CH2-CH3 + VL-CH1

(F) VL-CH1-CH2-CH3 + VH-CL

(G) VL-CL-CH2-CH3 + VH-CH1

(H) VH-CH1-CH2-CH3 + VL-CL-CH2-CH3

(I) VH-CL-CH2-CH3 + VL-CH1-CH2-CH3

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 상기 (A) 내지 (I)에 제시된 조합의 폴리펩티드 중의 하나 이상을 포함한다. 예를 들면, 상기 (D)를 참조하면, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 구조 VH-CH1-CH2-CH3를 포함하는 2개 폴리펩티드 및 구조 VL-CL을 포함하는 2개 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 폴리펩티드의 하기 조합 중의 하나를 포함한다:

(J) VH (항-IL-11Rα) + VL (항-IL-11Rα)

(K) VH (항-IL-11Rα)-CH1 + VL (항-IL-11Rα)-CL

(L) VL (항-IL-11Rα)-CH1 + VH (항-IL-11Rα)-CL

(M) VH (항-IL-11Rα)-CH1-CH2-CH3 + VL (항-IL-11Rα)-CL

(N) VH (항-IL-11Rα)-CL-CH2-CH3 + VL (항-IL-11Rα)-CH1

(O) VL (항-IL-11Rα)-CH1-CH2-CH3 + VH (항-IL-11Rα)-CL

(P) VL (항-IL-11Rα)-CL-CH2-CH3 + VH (항-IL-11Rα)-CH1

(Q) VH (항-IL-11Rα)-CH1-CH2-CH3 + VL (항-IL-11Rα)-CL-CH2-CH3

(R) VH (항-IL-11Rα)-CL-CH2-CH3 + VL (항-IL-11Rα)-CH1-CH2-CH3

여기서: "VH (항-IL-11Rα)"는, 예를 들면, (1) 내지 (21) 중의 어느 하나에 정의된, 본원에 기재된 IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VH를 지칭하고, "VL (항-IL-11Rα)"는, 예를 들면, (22) 내지 (37) 중의 어느 하나에 정의된, 본원에 기재된 IL-11Rα에 결합할 수 있는 항원-결합 분자의 VL을 지칭한다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는, 서열번호 7 내지 17 중의 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 서열번호 70의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 서열번호 71의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 서열번호 72의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 서열번호 73의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 서열번호 74의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다.

링커 및 추가 서열

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 아미노산 서열 사이에 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 링커 서열은, 항원-결합 분자/폴리펩티드의 VH, VL, CH1-CH2 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역 중의 하나 이상의 한쪽 또는 양 말단에 제공될 수 있다.

링커 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369, 이는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 유연한 링커 서열일 수 있다. 유연한 링커 서열은 링커 서열에 의해 연결되어 있는 아미노산 서열의 상대적 이동을 가능하게 한다. 유연한 링커는 당업자에게 공지되어 있고, 몇몇은 문헌[참조: Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369]에 확인되어 있다. 유연한 링커 서열은 종종 글리신 및/또는 세린 잔기를 높은 비율로 포함한다.

일부 실시형태에서, 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및/또는 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 또는 1-10의 아미노산 길이를 갖는다.

본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 추가의 아미노산 또는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는, 항원-결합 분자/폴리펩티드의 발현, 폴딩, 수송, 프로세싱, 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위해 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 분자/폴리펩티드는, 임의로 항원-결합 분자/폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서, His, (예를 들면, 6XHis), Myc, GST, MBP, FLAG, HA, E 또는 비오틴 태그를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자/폴리펩티드는 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 형광, 발광, 면역-검출가능한, 방사성, 화학적, 핵산 또는 효소적 표지를 포함한다.

본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는, 신호 펩티드(또한 리더 서열 또는 신호 서열로서도 공지됨)을 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 통상, 단일 알파 헬릭스를 형성하는 5-30 소수성 아미노산의 서열로 구성되어 있다. 분비된 단백질 및 세포 표면에서 발현된 단백질은 종종 신호 펩티드를 포함한다.

신호 펩티드는, 항원-결합 분자/폴리펩티드의 N-말단에 존재할 수 있고, 새롭게 합성된 항원-결합 분자/폴리펩티드에 존재할 수 있다. 신호 펩티드는, 항원-결합 분자/폴리펩티드의 효율적 수송 및 분비를 제공한다. 신호 펩티드는 종종 절단에 의해 제거되고, 따라서 항원-결합 분자/폴리펩티드를 발현하는 세포로부터 분비된 성숙 항원-결합 분자/폴리펩티드에 포함되지 않는다.

신호 펩티드는 다수의 단백질을 위해 공지되어 있고, 데이터베이스, 예컨대, GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, 단백질 정보 리소스, 단백질 데이터 뱅크, Ensembl 및 InterPro에 기록되어 있고/있거나, 예를 들면, SignalP[참조: Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786] 또는 Signal-BLAST[참조: Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176] 등의 아미노산 서열 분석 도구를 사용하여 동정/예측할 수 있다.

표지 및 접합체

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티 또는 화학적 모이어티를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지, 면역-검출가능한 표지(예: 에피토프 태그), 방사성표지, 화학물질, 핵산 또는 효소 표지를 포함한다. 항원-결합 분자는 검출가능한 모이어티로 공유 또는 비공유 표지될 수 있다.

형광 표지는, 예를 들면, 플루오레세인, 로다민, 알로피코시아닌, 에오신 및 NDB; 에로피움(Eu), 테르븀(Tb) 사마륨(sm) 등의 희토류의 녹색 형광 단백질(GFP) 킬레이트, 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드, 4-메틸 움벨리페론, 7-아미노-4-메틸 쿠마린, Cy3 및 Cy5를 포함한다. 방사성표지는 요오드¹²³, 요오드¹²⁵, 요오드¹²⁶, 요오드¹³¹, 요오드¹³³, 브롬⁷⁷, 테크네튬^99m, 인듐¹¹¹, 인듐^113m, 갈륨⁶⁷, 갈륨⁶⁸, 루테늄⁹⁵, 루테늄⁹⁷, 루테늄¹⁰³, 루테늄¹⁰⁵, 수은²⁰⁷, 수은²⁰³, 레늄^99m, 레늄¹⁰¹, 레늄¹⁰⁵, 스칸듐⁴⁷, 텔루륨^121m, 텔루륨^122m, 텔루륨^125m, 툴륨¹⁶⁵, 툴륨¹⁶⁷, 툴륨¹⁶⁸, 구리⁶⁷, 불소¹⁸, 이트륨⁹⁰, 팔라듐¹⁰⁰, 비스무트²¹⁷ 및 안티몬²¹¹ 등의 방사성동위원소를 포함한다. 발광 표지는 방사성발광, 화학발광(예를 들면, 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미놀) 및 생물발광 표지를 포함한다. 면역-검출가능한 표지는 합텐, 펩티드/폴리펩티드, 항체, 수용체 및 리간드, 예컨대, 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 디곡시게닌을 포함한다. 핵산 표지는 앱타머를 포함한다. 효소 표지는, 예를 들면, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코즈 옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 루시퍼라제를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 화학적 모이어티에 접합되어 있다. 화학적 모이어티는 치료 효과를 제공하기 위한 모이어티일 수 있다. 항체-약물 접합체는, 예를 들먼, 문헌[참조: Parslow et al., Biomedicines. 2016 Sep; 4(3):14]에 검토되어 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 모이어티는 약물 모이어티(예를 들면, 세포독성제)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 모이어티는 화학요법제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 모이어티는 칼리케아미신, DM1, DM4, 모노메틸라우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸라우리스타틴 F(MMAF), SN-38, 독소루비신, 유오카마이신, D6.5 및 PBD로부터 선택된다.

항원-결합 분자의 기능적 특성

본원에 기재된 항원-결합 분자는 특정 기능적 특성을 참조하여 특징지워질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자는 하기 특성 중의 하나 이상을 가질 수 있다:

a) IL-11Rα(예를 들면, 인간 IL-11 및/또는 마우스 IL-11Rα)에 대한 특이적 결합;

b) 예를 들면, ELISA에 의해 결정된 바와 같이, EC50 = 1000ng/ml 미만의 결합 친화성으로 IL-11Rα(예를 들면, IL-11Rα)에 대한 결합;

c) IL-11Rα와 IL-11 사이의 상호작용의 억제;

d) IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용의 억제;

e) IL-11Rα:gp130 수용체 복합체와 IL-11 사이의 상호작용의 억제;

f) IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 억제;

g) IL-11/IL-11R 신호전달의 억제;

h) IL-11에 의해 매개된 신호전달의 억제;

i) IL-11Rα:gp130 수용체 복합체에 대한 IL-11의 결합에 의해 매개된 신호전달의 억제;

j) gp130에 대한 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개된 신호전달의 억제(즉, IL-11 트랜스 신호전달);

k) 섬유아세포 증식의 억제;

l) 섬유아세포로부터 근섬유아세포 생성의 억제;

m) 섬유아세포로부터 근섬유아세포 생성의 역전/퇴행;

n) 성상 세포, 예를 들면, 간 또는 췌장 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성의 억제;

o) 성상 세포, 예를 들면, 간 또는 췌장 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성의 역전/퇴행;

p) 섬유아세포, 성상 세포 또는 근섬유아세포의 이동성 및/또는 침윤성 거동의 억제;

q) 기관 내의 면역 세포의 존재의 억제;

r) IL-11/IL-11R 신호전달에 의해 매개된 병리학적 프로세스의 억제;

s) 섬유증의 억제;

t) 섬유증의 역전/퇴행;

u) 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA(ACTA2), TIMP1, MMP2, TNFα, CCL2 중의 하나 이상의 섬유아세포 또는 성상 세포에서의 유전자 또는 단백질 발현의 억제, 예를 들면, 섬유화촉진 인자에 의한 자극 후;

v) 섬유아세포 또는 성상 세포에 의한 세포외 매트릭스 생산의 억제;

w) 암의 세포의 증식 및/또는 생존의 억제;

x) 생체내에서 암의 발생 및/또는 진행의 억제;

y) 종양 성장의 억제;

z) IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸.

본원에서, "억제"는 대조군 조건과 비교하여 감소, 저하 또는 경감을 지칭한다. 예를 들면, 항원-결합 분자에 의한 프로세스의 억제는 항원-결합 분자의 부재하에 및/또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재하에 당해 프로세스의 범위/정도의 감소, 저하 또는 경감을 지칭한다.

본원에서 억제는 또한 중화 또는 길항작용을 지칭할 수 있다. 즉, 기능 또는 프로세스(예를 들면, IL-11Rα 또는 IL-11Rα-함유 복합체에 의해 매개된 상호작용, 신호전달 또는 기타 활성)을 억제시킬 수 있는 IL-11Rα 결합 항원-결합 분자는, 관련 기능 또는 프로세스와 관련하여 "중화" 또는 "길항작용" 항원-결합 분자인 것으로 언급될 수 있다. 예를 들면, IL-11 매개 신호전달을 억제할 수 있는 항원-결합 분자는, IL-11 매개 신호전달을 매개할 수 있는 항원-결합 분자로서 지칭되거나, IL-11 매개 신호전달의 길항제로서 지칭될 수 있다.

당업자는, 소정의 검정에 적절한 대조군 조건을 확인할 수 있다. 예를 들면, 대조군 항원-결합 분자는, 검정에서 조사되는 특성에 관여하는 역할을 갖지 않는 것으로 공지되어 있는 표적 단백질에 대해 지시된 항원-결합 분자일 수 있다. 대조군 항원-결합 분자는, 분석되는 항-IL-11Rα 항원-결합 분자와 동일한 이소형의 것일 수 있고, 예를 들면, 동일한 불변 영역을 가질 수 있다.

본원에 기재된 항원-결합 분자는 바람직하게는 IL-11Rα에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은, 항원에 대해 특이적이고 비-표적 항원에 대한 비-표적 결합으로부터 구별할 수 있는 결합을 지칭한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자는 바람직하게는, 다른 비-표적 분자에 결합하는 것보다 높은 친화성으로 및/또는 보다 긴 지속기간으로 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 항체/단편은, IL-6 수용체 계열의 하나 이상의 구성원보다도 IL-11Rα에 대해 보다 높은 친화성으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 항원-결합 분자는 IL-6Rα, 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR), 온코스타틴 M 수용체(OSMR) 및 섬모 신경영양 인자 수용체 알파(CNTFRα) 중의 하나 이상보다 IL-11Rα에 대해 보다 높은 친화성으로 결합할 수 있다.

실시형태에서, IL-11-매개 신호전달의 억제는, IL-11 매개된 시스 신호전달을 파괴하지만 IL-11-매개된 트랜스 신호전달을 파괴하지 않음으로써 달성되고, 예를 들면, IL-11-매개 신호전달의 억제는, 막 결합된 IL-11Rα를 수반하는 gp130-매개된 시스 복합체를 억제함으로써 달성된다. 실시형태에서, IL-11-매개 신호전달의 억제는, IL-11-매개된 트랜스 신호전달을 파괴하지만 IL-11-매개된 시스 신호전달을 파괴하지 않음으로써 달성되고, 즉 IL-11-매개 신호전달의 억제는, 가용성 IL-11Rα에 결합된 IL-11 또는 가용성 IL-6R에 결합된 IL-6 등의 gp130-매개된 트랜스 신호전달 복합체를 억제함으로써 달성된다. 실시형태에서, IL-11-매개 신호전달의 억제는 IL-11-매개 시스 신호전달 및 IL-11-매개 트랜스 신호전달을 파괴함으로써 달성된다.

소정 분자에 특이적으로 결합하는 소정 폴리펩티드의 능력은 당해 기술분야에 공지된 방법, 예컨대, ELISA, 표면 플라즈몬 공명(SPR; 예를 들면, 문헌[참조: Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442]), 생물-층 간섭계(예를 들면, 문헌[Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507] 참조), 유세포 분석, 또는 방사성표지 항원-결합 검정(RIA) 효소-결합된 면역흡착 검정에 의해 결정될 수 있다. 이러한 분석을 통해, 소정 분자에 대한 결합을 측정하고 정량화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합은 소정 검정에서 검출된 반응일 수 있다.

일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 결합 정도는, 예를 들면, ELISA, SPR, 생물-층 간섭계 또는 RIA에 의해 측정된 바와 같이, 표적 분자에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 또는, 결합 특이성은, 항원-결합 분자가 비-표적 분자에 대한 항원-결합 분자의 K_D보다 적어도 0.1 자릿수(즉, 0.1×10ⁿ, 여기서 n은 자릿수를 나타내는 정수이다) 큰 해리 상수(K_D)로 IL-11Rα에 결합하는 결합 친화성의 관점에서 반영될 수 있다. 이는 임의로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5 또는 2.0 중의 하나일 수 있다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 인간 IL-11Rα에 대한 결합을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 마우스 IL-11Rα에 대한 결합을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 인간 IL-11Rα 및 마우스 IL-11Rα에 대한 결합을 나타낸다. 즉, 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 인간 IL-11Rα 및 마우스 IL-11Rα에 대해 교차-반응성이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 비-인간 영장류의 IL-11Rα와 교차-반응성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 5μM 이하, 바람직하게는 ≤1 μM, ≤ 500nM, ≤ 100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤500 pM 중 하나의 K_D로 IL-11Rα에 결합한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 예를 들면, SPR 분석에 의해 결정된 바와 같이, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM 또는 6≤ nM의 K_D로 IL-11Rα(예를 들면, 인간 IL-11Rα)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, ≥1 nM 및 ≤20 nM, 예를 들면, ≥1 nM 및 ≤15 nM, 또는 ≥1 nM 및 ≤10 nM의 K_D로 IL-11Rα에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 ≥5 nM 및 ≤20 nM, 예를 들면, ≥5 nM 및 ≤15 nM, 또는 ≥5 nM 및 ≤10 nM의 K_D로 IL-11Rα에 결합한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, EC50 = 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 ≤900 ng/ml, ≤800 ng/ml, ≤700 ng/ml, ≤600 ng/ml, ≤500 ng/ml, ≤400 ng/ml, ≤300 ng/ml, ≤200 ng/ml, ≤100 ng/ml, ≤90 ng/ml, ≤80 ng/ml, ≤70 ng/ml, ≤60 ng/ml, ≤50 ng/ml, ≤40 ng/ml, ≤30 ng/ml, ≤20 ng/ml, ≤15 ng/ml, ≤10 ng/ml, ≤7.5 ng/ml, ≤5 ng/ml, ≤2.5 ng/ml 또는 ≤1 ng/ml 중 하나의 결합 친화성(예를 들면, ELISA에 의해 측정됨)으로 IL-11Rα에 결합한다.

항원-결합 분자에 의한 IL-11Rα에 결합하는 친화성은 ELISA 검정에 의해 시험관내에서 분석할 수 있다. 적합한 검정은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Antibody Engineering, vol. 1 (2^nd Edn), Springer Protocols, Springer (2010), Part V, pp657-665]에 기재된 바와 같이, 당업자에 의해 실시될 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 분자에 의한 IL-11Rα에 대한 결합 친화성은 실험예에서 본원에 기재된 방법론에 따라 분석할 수 있다.

2개 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은, 예를 들면, 항원-결합 분자와의 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다의 존재하에 또는 인큐베이션 후에 상호작용의 분석에 의해 결정할 수 있다. 소정 항원-결합 분자가 2개 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있는지를 결정하는 적합한 검정의 예는 경쟁 ELISA 검정이다.

상호작용(예를 들면, IL-11Rα와 IL-11 사이, 또는 IL-11Rα와 gp130 사이, 또는 IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이, 또는 IL-11:IL-11Rα와 gp130 사이)을 억제할 수 있는 항원-결합 분자는, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 상호작용의 수준과 비교하여, 항원-결합 분자의 존재(또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다의 인큐베이션 후)하에 상호작용 파트너 사이의 상호작용의 수준의 감소/저하를 관찰함으로써 동정된다. 적합한 분석은, 예를 들면, 재조합 상호작용 파트너를 사용하거나 상호작용 파트너를 발현하는 세포를 사용하여 시험관내에서 실시할 수 있다. 상호작용 파트너를 발현하는 세포는 내인적으로 수행할 수 있거나, 세포에 도입된 핵산으로부터 수행할 수 있다. 이러한 검정의 목적을 위해, 상호작용 파트너 및/또는 항원-결합 분자 중 하나 또는 둘 다는 상호작용의 수준을 검출 및/또는 측정할 목적으로 검출가능한 실체와 조합하여 표지 또는 사용될 수 있다.

2개의 결합 파트너 사이의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은 이러한 상호작용의 하류 기능적 결과, 예를 들면, 수용체 신호전달의 분석에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이 또는 IL-11:IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용의 하류 기능적 결과는 섬유아세포의 증식, 섬유아세포로부터의 근섬유아세포 생성, 또는 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA, TIMP1, MMP2 중 하나 이상의 유전자 또는 단백질 발현을 포함한다.

본 개시내용에 따르는 섬유아세포는, 간, 폐, 신장, 심장, 혈관, 눈, 피부, 췌장, 비장, 장(예를 들면, 대장 또는 소장), 뇌 및 골수를 포함하는 임의의 조직으로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 분자의 분석을 목적으로, 섬유아세포는 심장 섬유아세포(예를 들면, 심방 섬유아세포), 피부 섬유아세포, 폐 섬유아세포, 신장 섬유아세포 또는 간 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 COL1A, ACTA2, 프롤릴-4-하이드록실라제, MAS516 및 FSP1 중의 하나 이상의 유전자 또는 단백질 발현을 특징으로 할 수 있다.

유전자 발현은, 당업자에게 공지되어 있는 다양한 수단에 의해, 예를 들면, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)에 의해 또는 리포터-기반 방법에 의해 mRNA의 수준을 측정함으로써 측정할 수 있다. 유사하게는, 단백질 발현은, 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 항체-기반 방법, 예를 들면, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유세포 분석, ELISA, ELISPOT 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유증의 하나 이상의 마커의 단백질 발현, 예를 들면, 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA, TIMP1, MMP2 중의 하나 이상의 단백질 발현을 억제할 수 있다.

IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이의 상호작용을 억제하는 항원-결합 분자의 능력은, 예를 들면, TGFβ1로 섬유아세포를 자극하고, 항원-결합 분자의 존재하에 세포를 인큐베이팅하고, 규정된 시간 후에 αSMA-양성 표현형을 갖는 세포의 비율을 분석함으로써 분석할 수 있다. 이러한 예에서, IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이의 상호작용의 억제는, 세포가 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 또는 적절한 항원-결합 분자의 존재하에 TGFβ1으로 처리되는 양성 대조군 조건과 비교하여, αSMA-양성 표현형을 갖는 세포의 비율이 낮은 것을 관찰함으로써 확인할 수 있다.

이러한 검정은 또한 IL-11 매개 신호전달을 억제하는 항원-결합 분자의 능력을 분석하는 데에도 적합하다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11Rα와 IL-11 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11Rα와 IL-11 사이의 상호작용 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11Rα와 IL-11 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11Rα와 IL-11 사이의 상호작용 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용 수준의 ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이의 상호작용 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11Rα:gp130와 IL-11 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11Rα:gp130과 IL-11 사이의 상호작용 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을, 항원-결합 분자의 부재하에 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 억제할 수 있다.

IL-11 매개 신호전달의 억제는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Curtis et al. Blood, 1997, 90(11) and Karpovich et al. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 것 등의 ³H-티미딘 도입 및/또는 Ba/F3 세포 증식 검정을 사용하여 분석할 수 있다. Ba/F3 세포는 IL-11Rα 및 gp130을 공-발현한다.

본원에 사용된 바와 같이, IL-11 매개 신호전달 및/또는 IL-11 매개 신호전달에 의해 매개된 프로세스는 IL-11 또는 IL-11Rα의 단편, 및 IL-11, IL-11Rα 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드 복합체에 의해 매개된 신호전달을 포함한다. IL-11 매개 신호전달은 인간 IL-11 또는 IL-11Rα 및/또는 마우스 IL-11 또는 IL-11Rα에 의해 매개된 신호전달일 수 있다. IL-11 매개 신호전달은, IL-11 또는 복합체가 결합하는 수용체에 대한 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체의 결합 후에 발생할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항체 및 단편은, IL-11, IL-11Rα, 또는 IL-11 또는 IL-11Rα 함유 복합체의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체/단편은, IL-11 또는 gp130에 대한 결합에 중요한 영역에서 IL-11Rα에 결합하고, 이에 의해 결합 및/또는 IL-11 매개 신호전달을 방해한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, IL-11Rα 및/또는 gp130, 예를 들면, IL-11Rα:gp130을 포함하는 수용체를 통한 신호 전달에 의해 활성화되는 하나 이상의 신호전달 경로의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, IL-11Rα 및/또는 gp130, 예를 들면, IL-11Rα:gp130을 포함하는 하나 이상의 면역 수용체 복합체를 통해 신호전달을 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 IL-11-매개 신호전달을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 신호전달 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 IL-11 매개 신호전달을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 신호전달 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, IL-11 매개 신호전달은, IL-11Rα:gp130 수용체에 대한 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호전달이다. 이러한 신호전달은, 예를 들면, IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포를 IL-11로 처리함으로써 또는 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 IL-11 생산을 자극함으로써 분석할 수 있다.

IL-11 매개 신호전달의 억제를 위한 항원-결합 분자의 IC₅₀은, 예를 들면, 인간 IL-11 및 IL-11 결합제의 존재하에 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 Ba/F3 세포를 배양하고 DNA 내로 ³H-티미딘 도입을 측정함으로써 결정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 이러한 검정에서 10㎍/ml 이하, 바람직하게는 ≤5㎍/ml, ≤4㎍/ml, ≤ 3.5㎍/ml, ≤3㎍/ml, ≤2㎍/ml, ≤1㎍/ml, ≤ 0.9㎍/ml, ≤ 0.8㎍/ml, ≤0.7㎍/ml, ≤ 0.6㎍/ml 또는 ≤0.5㎍/ml의 IC₅₀을 나타낼 수 있다.

일부 실시형태에서, IL-11 매개 신호전달은, gp130에 대한 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호전달일 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11:IL-11Rα 복합체는 가용성, 예를 들면, IL-11Rα 및 IL-11의 세포외 도메인의 복합체, 또는 가용성 IL-11Rα 이소형/단편 및 IL-11의 복합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가용성 IL-11Rα는 IL-11Rα의 가용성(분비된) 이소형이거나, 세포 막 결합된 IL-11Rα의 세포외 도메인의 단백질분해 절단의 유리된 산물이다. gp130에 대한, IL-11Rα에 결합된 IL-11의 결합에 의해 매개된 IL-11 매개 신호전달은 본원에서 "IL-11 트랜스 신호전달"로서 지칭된다.

일부 실시형태에서, IL-11:IL-11Rα 복합체는 세포-결합된, 예를 들면, 세포-막 결합된 IL-11Rα 및 IL-11의 복합체일 수 있다. gp130에 대한 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개된 신호전달은 gp130을 발현하는 세포를 IL-11:IL-11Rα 복합체, 예를 들면, IL-11Rα의 세포외 도메인에 펩티드 링커에 의해 결합된 IL-11(예를 들면, 본원에 기재된 하이퍼 IL-11)을 포함하는 재조합 융합 단백질로 처리함으로써 분석할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 gp130에 대한 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있고, 또한 IL-11Rα:gp130 수용체에 대한 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 섬유아세포 증식을 억제할 수 있다. 섬유아세포의 증식은 일정 기간에 걸쳐 세포 분열을 분석함으로써 결정할 수 있다. 섬유아세포의 소정 모집단에 대한 세포 분열은, 예를 들면, 문헌[참조: Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564, 전체가 참조에 의해 본원에 도입됨]에 기재된 바와 같이, 예를 들면, ³H-티미딘의 도입의 시험관내 분석 또는 CFSE 희석 검정에 의해 분석할 수 있다. 또한, 증식 세포(예를 들면, 증식 섬유아세포)는, 예를 들면, 문헌[참조: Buck et al., Biotechniques. 2008 Jun; 44(7):927-9, and Sali and Mitchison, PNAS USA 2008 Feb 19; 105(7): 2415-2420, 둘 다는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재된 바와 같이, 적절한 검정에 의해 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 분석에 의해 확인할 수 있다.

본 개시내용에 따르는 섬유아세포는, 간, 폐, 신장, 심장, 혈관, 눈, 피부, 췌장, 비장, 장(예를 들면, 대장 또는 소장), 뇌 및 골수를 포함하는 임의 조직으로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 분자의 분석의 목적으로, 섬유아세포는, 심장 섬유아세포(예를 들면, 심방 섬유아세포), 피부 섬유아세포, 폐 섬유아세포, 신장 섬유아세포 또는 간 섬유아세포일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유아세포 증식을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유아세포 증식 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 섬유아세포 증식을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유아세포 증식 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 예를 들면, 섬유화촉진 인자(예를 들면, TGFβ1)에 의한 자극 후에, IL-11/IL-11R 신호전달에 의해 매개된 병리학적 프로세스를 억제할 수 있다. IL-11/IL-11R 신호전달에 의해 매개된 병리학적 프로세스는 섬유증을 포함하고, 시험관내 또는 생체내에서 평가할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유증을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유증을 역전 또는 퇴행시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 확립된 또는 중증 섬유증이다. 본원에 사용된 바와 같이, 섬유증의 억제(inhibiting) 또는 억제(inhibition)는 섬유증의 발증을 감소, 억제 또는 예방하는 항원-결합 분자의 능력을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 섬유증의 억제는, 예를 들면, 섬유증의 발증이 방지되는 예방적 효과를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 섬유증의 억제는, 예를 들면, 기존의 초기 또는 후기 단계의 섬유증이 더욱 진행된 단계로 발달 또는 진행하는 것을 방지하는 치료 효과를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 섬유증의 역전(reversing)/역전(reversal) 또는 퇴행(regressing)/퇴행(regression)은, 섬유증 상태를 더욱 발달된 상태로부터 덜 발달된 상태로 개선하는, 또는 섬유증 자체의 중증도 또는 이의 증상을 경감하는 항원-결합 분자의 능력을 지칭한다. 섬유증의 역전(reversing)/역전(reversal)은 섬유증 상태의 개선과 연관될 수 있다.

본원의 실험예에서, 섬유증의 억제, 역전 또는 퇴행은, 예를 들면, 오퍼레타(Operetta) 고함량 이미징 시스템을 사용하여 ACTA2^+ve 세포의 수 또는 퍼센트를 측정하고, 하이드록시프롤린 함량을 평가하여 세포 또는 기관 콜라겐 함량을 측정하고, 웨스턴 블롯에 의해 ERK 활성화/포스포릴화를 측정하고/하거나, 정량적 PCR에 의해 TNFα 또는 CCL2 등의 염증 마커 또는 TGFβ1, αSMA(ACTA2), TIMP1, COL1A1, COL1A2 또는 COL3A1 등의 섬유증 마커의 발현 수준을 측정함으로써 분석된다. 간 등의 조직에서, 섬유증의 억제, 역전 또는 퇴행은, 예를 들면, 트리글리세라이드 함량 또는 혈청 ALT 수준을 결정함으로써 분석된다.

섬유증은 특정 조직 또는 몇몇 조직, 예를 들면, 간, 폐, 신장, 심장, 혈관, 눈, 피부, 췌장, 비장, 장(예를 들면, 대장 또는 소장), 뇌 또는 골수의 것일 수 있다. 섬유증은 당업자에게 공지된 수단, 예를 들면, 소정 조직 또는 조직들에서 하나 이상의 근섬유아세포 마커의 유전자 또는 단백질 발현 및/또는 섬유증의 하나 이상의 마커의 유전자 또는 단백질 발현을 분석함으로써 측정할 수 있다.

근섬유아세포 마커는 증가된 αSMA, 비멘틴, 팔라딘, 코필린 또는 데스민 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 섬유증의 마커는 증가된 수준의 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA, TIMP1 및 MMP2, 세포외 매트릭스 성분, 근섬유아세포의 수/비율 및 기관 중량을 포함한다.

섬유증의 억제/역전/퇴행은 시험관내 또는 생체내에서 측정할 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 분자가 소정 조직에서 섬유증을 억제/역전/퇴행시킬 수 있는지는, 해당 조직으로부터 유래하는 섬유아세포를 섬유화촉진 자극으로 처리하고, 이어서 항체가 섬유아세포로부터 근섬유아세포 생성(또는 예를 들면, 섬유증의 다른 마커)을 감소 또는 역전시킬 수 있는지를 분석함으로써 시험관내에서 분석할 수 있다. 항원-결합 분자가 섬유증을 억제/역전/퇴행시킬 수 있는지는, 예를 들면, 항원-결합 분자를 대상체(예를 들면, 섬유화촉진 자극 노출된 대상체)에게 투여하고 조직(들)을 섬유증의 하나 이상의 마커에 대해 분석함으로써 생체내에서 분석할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유증을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유증 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제/역전/퇴행시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 섬유증을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유증 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.8배, ≤0.85배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 억제/역전/퇴행시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 예를 들면, 섬유아세포 또는 성상 세포를 섬유화촉진 인자에 노출시킨 후, 섬유아세포 또는 성상 세포(예를 들면, 간 또는 췌장 성상 세포)로부터 근섬유아세포 생성을 억제할 수 있다. 섬유아세포 또는 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성은 근섬유아세포 마커에 대한 분석에 의해 조사할 수 있다. 본 발명에 따르는 섬유화촉진 인자는, 예를 들면, TGFβ1, IL-11, IL-13, PDGF, ET-1, 온코스타틴 M(OSM) 또는 ANG2(AngII)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유화촉진 인자에 의한 섬유아세포 또는 성상 세포 활성화를 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 성상 세포 노화를 촉진시킬 수 있다. 노화는 P16, P21 및 P53 등의 노화 마커의 발현을 검출함으로써 측정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 예를 들면, 섬유화촉진 인자에 의한 자극 후, 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA, TIMP1, MMP2, TNFα, CCL2 중의 하나 이상의 섬유아세포, 성상 세포, 또는 섬유아세포/성상 세포-유래 세포(예를 들면, 근섬유아세포)에서의 유전자 또는 단백질 발현을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 예를 들면, 섬유화촉진 인자에 의한 자극 후, 하나 이상의 매트릭스 성분의 섬유아세포 또는 섬유아세포-유래 세포(예를 들면, 근섬유아세포)에서의 유전자 또는 단백질 발현을 억제할 수 있다.

본원의 실험예에서, 섬유아세포 또는 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성은, TGFβ1에 의한 섬유아세포의 자극 후에 오퍼레타 고함량 이미징 시스템(Operetta High-Content Imaging System)을 사용하여 αSMA 단백질 발현 수준을 측정함으로써 분석한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유아세포 또는 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유아세포 또는 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 섬유아세포 또는 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유아세포 또는 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 예를 들면, 섬유화촉진 인자(예를 들면, TGFβ1)에 의한 자극 후에, 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA, TIMP1, MMP2, TNFα, CCL2 중 하나 이상의 섬유아세포, 성상 세포 또는 근섬유아세포에서의 유전자 또는 단백질 발현을 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 유전자 또는 단백질 발현을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 유전자 또는 단백질 발현 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 유전자 또는 단백질 발현을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 유전자 또는 단백질 발현 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 예를 들면, 섬유화촉진 인자(예를 들면, TGFβ1)에 의한 자극 후에, 섬유아세포 또는 성상 세포에 의한 세포외 매트릭스 생산을 억제할 수 있다. 세포외 매트릭스 생산은, 예를 들면, 세포외 매트릭스 성분의 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 본 발명에 따르는 세포외 매트릭스 성분은, 예를 들면, 프로테오글리칸, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴 설페이트, 히알루론산, 콜라겐, 페리오스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, 니도겐, 젤라틴 및 아그레칸을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유아세포, 성상 세포 및/또는 근섬유아세포로부터 콜라겐 분비를 억제할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유아세포 또는 성상 세포에 의한 세포외 매트릭스 생산을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 섬유아세포 또는 성상 세포에 의한 세포외 매트릭스 생산 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 섬유아세포 또는 성상 세포에 의한 세포외 매트릭스 생산을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 세포외 매트릭스 생산 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 지방생성 및/또는 β-산화에 관여하는 하나 이상의 유전자/단백질의 간 세포에서의 유전자 또는 단백질 발현을 상향조절할 수 있다. 이러한 유전자/단백질은, 예를 들면, ACOX1(아실-CoA 옥시다제 1), SCD1(스테아로일-CoA 데사투라제 1), FASN(지방산 신타제) 또는 SREBF1(스테롤 조절 요소-결합 단백질 1)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 유전자 또는 단백질 발현을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 유전자 또는 단백질 발현 수준의 1배 초과, 예를 들면, ≥1.01배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.15배, ≥1.2배, ≥1.25배, ≥1.3배, ≥1.35배, ≥1.4배, ≥1.45배, ≥1.5배, ≥1.55배, ≥1.6배, ≥1.65배, ≥1.7배, ≥1.75배, ≥1.8배, ≥1.85배, ≥1.9배, ≥1.95배, ≥2배, ≥2.5배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배 중 하나까지 상향조절할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유아세포, 성상 세포 또는 근섬유아세포의 이동성 및/또는 침윤성 거동을 억제, 즉 이동 및/또는 침윤을 억제할 수 있다. 이러한 세포의 이동 및 침윤은 섬유증의 병리학에서 중요할 수 있다. 세포의 이동은, 예를 들면, TGFβ1 또는 CCL2 등의 폴리카보네이트 막 및 침윤성 자극제를 사용하여 평가할 수 있다. 세포의 침윤은, 예를 들면, 보이든 챔버 침윤 검정 또는 ECM-코팅된 마트리겔을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 섬유아세포, 성상 세포 또는 근섬유아세포의 이동 및/또는 침윤을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 이동 및/또는 침윤 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 이동 및/또는 침윤을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 이동 및/또는 침윤 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 기관에서 면역 세포의 존재를 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 기관에서 면역 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 기관은 섬유증에 감수성이거나 이를 앓고 있는 기관, 예를 들면, 간 또는 신장일 수 있다. 면역 세포는 CD45⁺세포, 예를 들면, CD3⁺CD4⁺ T 세포, CD3⁺CD8⁺ T 세포, B 림프구, 과립구 및 단핵구일 수 있다. 면역 세포는 뮤린 단핵구 마커 LyC6을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 기관에서 면역 세포의 수를, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 기관에서 면역 세포 수의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 기관에서 면역 세포의 수를, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 기관에서 면역 세포 수의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 암 세포의 증식 및/또는 생존을 억제할 수 있다. 당업자는, 예를 들면, 암 세포에 대한 항원-결합 분자의 효과를 분석함으로써 항원-결합 분자가 암 세포의 증식 및/또는 생존을 억제할 수 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들면, 세포의 증식은, 예를 들면, ³H 티미딘 도입 또는 CFSE 희석 검정에 의해 본원에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다. 세포 생존은, 항원-결합 분자로 처리한 후, 세포 생존율/세포 사멸의 마커에 대해 세포를 측정함으로써 분석할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 암 세포의 증식 및/또는 생존을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 암 세포의 증식 및/또는 생존 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 암 세포의 증식 및/또는 생존을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 암 세포의 증식 및/또는 생존 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 생체내에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 예를 들면, 이펙터 면역 세포에 의한 암 세포의 사멸을 유발한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 예를 들면, 적절한 대조군 조건과 비교하여, 생체내에서 암 세포 수의 감소를 유발한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는, 예를 들면, 경시적으로 종양 크기/체적을 측정함으로써 결정되는 바와 같이 종양 성장을 억제한다.

본 발명의 항원-결합 분자는, 적절한 생체내 모델에서 암의 발달 및/또는 진행을 억제하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 암은, IL-11 매개 신호전달 및/또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포가 병리학적으로 관여하는 암이다. 이러한 암은 문헌[참조: Xu et al., Cancer Lett. (2016) 373(2):156-63 and Johnstone et al., Cytokine & Growth Reviews (2015) 26(5): 489-498, 이들 모두는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재된 것들을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자의 투여는, 예를 들면, 암의 적절한 생체내 모델에서 결정된 바와 같이, 암의 발달/진행의 억제, 암의 발증의 지연/예방, 종양 성장의 감소/지연/예방, 전이의 감소/지연/예방, 암 증상의 중증도의 감소, 암 세포 수의 감소, 종양 크기/용적의 감소 및/또는 생존의 증가(예를 들면, 무진행 생존) 중의 하나 이상을 유발할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, 단독으로 투여되는 화학요법제와 비교하여, 화학요법제와 조합하여, 예를 들면, 별도로, 동시에 또는 순차로 투여하는 경우, 부가 효과를 제공한다. 부가 효과는, IL-11 신호전달의 감소, 암의 발달/진행의 억제 및/또는 종양 성장의 억제 등의 본원에 기재된 임의의 효과일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는 종양 성장을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 종양 성장 수준의 100% 미만, 예를 들면, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하 중 하나까지 억제할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 종양 성장을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 종양 성장 수준의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸을 유발할 수 있다. IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸은 항원-결합 분자의 이펙터 기능을 통해 증가시킬 수 있다. 항원-결합 분자가 Fc 영역을 포함하는 실시형태에서, 항원-결합 분자는 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및 항체-의존성 세포 식작용(ADCP) 중의 하나 이상을 통해 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸을 유발할 수 있다.

IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸을 유발할 수 있는 항원-결합 분자는, 적절한 검정에서, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 검출한 세포 사멸 수준과 비교하여, 항원-결합 분자의 존재하에 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸 수준을 관찰함으로써(또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포를 항원-결합 분자와 함께 인큐베이션 후) 확인할 수 있다. CDC, ADCC 및 ADCP의 검정은 당업자에게 공지되어 있다. IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸 수준은 또한, 상이한 처리 조건에 노출시킨 후, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 생존 및/또는 비-생존 세포의 수/비율을 측정함으로써 결정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 사멸을, 항원-결합 분자의 부재(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재)하에 관찰된 사멸 수준의 1배 이상, 예를 들면, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥3배, ≥4배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배 또는 ≥10배 중의 하나까지 유발할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 수를, 비교가능한 검정에서, 항원-결합 분자의 부재하에 인큐베이션 후(또는 적절한 대조군 항원-결합 분자의 존재하에 인큐베이션 후)에 검출한 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포 수의 1배 미만, 예를 들면, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배, ≤0.05배 또는 ≤0.01배 감소시킬 수 있다. 세포 수 및 비율은, 예를 들면, 세포 유형의 검출을 가능하게 하는 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/이의 항원-결합 단편과 비교하여, 하나 이상의 유사한 또는 개선된 특성을 갖는다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/이의 항원-결합 단편과 비교하여, 하기 특성 중의 하나 이상을 나타낸다:

(i) 유사하거나 보다 큰 특이성으로 IL-11Rα에 결합하는 것(즉, IL-11Rα 이외의 IL-6 사이토킨 수용체 계열의 단백질에 대해 유사하거나 감소된 교차-반응성을 가짐);

(ii) 유사하거나 보다 큰 특이성(예를 들면, ELISA에 의해 결정된 유사하거나 보다 낮은 EC50을 갖고; 예를 들면, SPR 분석에 의해 결정된 유사하거나 보다 낮은 K_D를 가짐)으로 IL-11Rα(예를 들면, 인간 IL-11Rα 및/또는 마우스 IL-11Rα)에 결합하는 것;

(iii) IL-11Rα와 IL-11Rα 사이의 상호작용의 유사하거나 보다 큰 억제;

(iv) IL-11Rα과 gp130 사이의 상호작용의 유사하거나 보다 큰 억제;

(v) IL-11Rα:gp130 수용체 복합체와 IL-11 사이의 상호작용의 유사하거나 보다 큰 억제;

(vi) IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 유사하거나 보다 큰 억제;

(vii) IL-11:IL-11R 신호전달의 유사하거나 보다 큰 억제;

(viii) IL-11에 의해 매개된 신호전달의 유사하거나 보다 큰 억제(예를 들면, 적합한 검정에서 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 유사하거나 보다 낮은 IC50을 가짐);

(ix) IL-11Rα:gp130 수용체 복합체에 대한 IL-11의 결합에 의해 매개된 신호전달의 유사하거나 보다 큰 억제;

(x) gp130에 대한 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개된 신호전달(즉, IL-11 트랜스 신호전달)의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xi) 섬유아세포 증식의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xii) 섬유아세포로부터 근섬유아세포 생성의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xiii) 섬유아세포로부터 근섬유아세포의 유사하거나 보다 큰 역전/퇴행;

(xiv) 성상 세포, 예를 들면, 간 또는 췌장 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xv) 성상 세포, 예를 들면, 간 또는 췌장 성상 세포로부터 근섬유아세포 생성의 유사하거나 보다 큰 역전/퇴행;

(xvi) 섬유아세포, 성상 세포 또는 근섬유아세포의 이동성 및/또는 침윤성 거동의 유사하거나 보다 큰 억제(즉, 이동 및/또는 침윤의 억제);

(xvii) 기관에서 면역 세포 존재의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xviii) IL-11/IL-11R 신호전달에 의해 매개된 병리학적 프로세스의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xix) 섬유증의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xx) 섬유증의 유사하거나 보다 큰 역전/퇴행;

(xxi) 예를 들면, 섬유화촉진 인자에 의한 자극 후, 콜라겐, 피브로넥틴, 페리오스틴, IL-6, IL-11, αSMA(ACTA2), TIMP1, MMP2, TNFα, CCL2 중 하나 이상의 섬유아세포에서의 유전자 또는 단백질 발현의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xxii) 섬유아세포 또는 성상 세포에 의한 세포외 매트릭스 생산의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xxiii) 암 세포의 증식 및/또는 생존의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xxvi) 생체내에서 암의 발달 및/또는 진행의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xxv) 종양 성장의 유사하거나 보다 큰 억제;

(xxvi) IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 유사하거나 보다 큰 사멸.

일부 실시형태에서, "보다 큰 특이성" 또는 "보다 큰 친화성" 또는 "보다 큰 억제" 또는 "보다 큰 사멸"은 각각, 적절한 검정으로 결정한 바와 같이, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/이의 항원-결합 단편에 의해 나타난 수준의 1배 초과, 예를 들면, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배인 특이성, 친화성, 억제 또는 사멸의 수준을 지칭한다.

일부 실시형태에서, "유사한 특이성" 또는 "유사한 친화성" 또는 "유사한 억제" 또는 "유사한 사멸"은 각각, 적절한 검정으로 결정된 바와 같이, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/이의 항원-결합 단편에 의해 나타난 수준의 ≥0.2배 및 ≤5배, 예를 들면, ≥0.3배 및 ≤4배, ≥0.4배 및 ≤3배, ≥0.5배 및 ≤2배, ≥0.6배 및 ≤1.75배, ≥0.7배 및 ≤1.5배, ≥0.75배 및 ≤1.25배, ≥0.8배 및 ≤1.2배, ≥0.85배 및 ≤1.15배, ≥0.9배 및 ≤1.1배, ≥0.91배 및 ≤1.09배, ≥0.92배 및 ≤1.08배, ≥0.93배 및 ≤1.07배, ≥0.94배 및 ≤1.06배, ≥0.95배 및 ≤1.05배, ≥0.96배 및 ≤1.04배, ≥0.97배 및 ≤1.03배, ≥0.98배 및 ≤1.02배, 또는 ≥0.99배 및 ≤1.01배인, 특이성, 친화성, 억제 또는 사멸의 수준을 지칭한다.

일부 실시형태에서, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/이의 항체 단편은 항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/이의 항체 단편은 항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7의 VH 및 VL 서열을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.

일부 실시형태에서, IL-11Rα에 결합할 수 있는 참조 항체/항체 단편은, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 VH, 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 VL을 포함할 수 있다.

키메라 항원 수용체(CAR)

본 발명은 또한, 본 발명의 항원-결합 분자 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.

CAR은, 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능 둘 다를 제공하는 재조합 수용체이다. CAR 구조 및 조작은, 예를 들면, 문헌[참조: Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1), 이는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.]에 검토되어 있다. CAR은, 세포 막 앵커 영역 및 신호전달 영역에 연결된 항원-결합 영역을 포함한다. 임의의 힌지 영역은 항원-결합 영역과 세포 막 앵커 영역 사이의 분리를 제공할 수 있고, 유연한 링커로서 작용할 수 있다.

본 발명의 CAR은, 본 발명의 항원-결합 분자를 포함하거나 이들로 이루어지거나, 본 발명에 따르는 폴리펩티드를 포함하거나 이들로 이루어지는, 항원-결합 영역을 포함한다.

세포 막 앵커 영역은 CAR의 항원-결합 영역과 신호전달 영역 사이에 제공되고, 세포외 공간에 항원-결합 영역을 갖고 세포 내부에 신호전달 영역을 갖는, CAR을 발현하는 세포의 세포 막에 CAR을 고정시키는 것을 제공한다. 일부 실시형태에서, CAR은, CD3-ζ, CD4, CD8 또는 CD28 중의 하나의 막관통 영역 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 이로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 세포 막 앵커 영역을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 참조 아미노산 서열"로부터 유래"하는 영역은, 참조 서열에 대해 적어도 60%, 예를 들면, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

CAR의 신호전달 영역은 T 세포의 활성화를 가능하게 한다. CAR 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함하고, 이는 CAR-발현 T 세포의 포스포릴화 및 활성화를 위한 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 제공한다. FcγRI 등의 다른 ITAM-함유 단백질의 서열을 포함하는 신호전달 영역은 또는 CAR에 사용되어 왔다[참조: Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187]. CAR의 신호전달 영역은 또한, 표적 단백질에 결합할 때에 CAR-발현 T 세포의 활성화를 촉진하기 위해, 공-자극 분자의 신호전달 영역으로부터 유래하는 공-자극 서열을 포함할 수 있다. 적합한 공-자극 분자는 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27을 포함한다. 일부 경우에, CAR은 상이한 세포내 신호전달 경로의 공-자극을 제공하도록 조작된다. 예를 들면, CD28과 연관된 신호전달은 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 경로를 우선적으로 활성화시키고, 4-1BB-매개 신호전달은 TNF 수용체 연관된 인자(TRAF) 어댑터 단백질을 통해 수행된다. 따라서, CAR의 신호전달 영역은 종종, 하나 이상의 공-자극 분자의 신호전달 영역으로부터 유래하는 공-자극 서열을 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은, CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27 중 하나 이상의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 이로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 하나 이상의 공-자극 서열을 포함한다.

임의의 힌지 영역은 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이의 분리를 제공할 수 있고, 유연한 링커로서 작용할 수 있다. 힌지 영역은 IgG1로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR은, IgG1의 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 이로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지는 힌지 영역을 포함한다.

또한, 본 발명에 따르는 CAR을 포함하는 세포가 제공된다. 본 발명에 따르는 CAR은 CAR-발현 면역 세포, 예를 들면, CAR-T 또는 CAR-NK 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 면역 세포로의 CAR의 조작은 시험관내에서 배양 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 CAR의 항원-결합 영역은 임의의 적합한 포맷, 예를 들면, scFv, scFab 등으로 제공될 수 있다.

핵산 및 벡터

본 발명은, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자, 폴리펩티드 또는 CAR을 코딩하는 핵산 또는 복수의 핵산을 제공한다.

일부 실시형태에서, 핵산은, 예를 들면, 다른 핵산, 또는 천연-존재 생물학적 재료로부터 정제 또는 단리된다. 일부 실시형태에서, 핵산(들)은 DNA 및/또는 RNA를 포함하거나 이들로 이루어진다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산을 포함하는 벡터 또는 복수의 벡터를 제공한다.

뉴클레오티드 서열은 벡터, 예를 들면, 발현 벡터에 함유될 수 있다. 본원에 사용된 "벡터"는, 외인성 핵산을 세포에 전달하기 위한 비히클로서 사용된 핵산 분자이다. 벡터는, 세포 내에서 핵산을 발현시키기 위한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는, 발현되는 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈을 사용하여, 본 발명에 따르는 벡터로부터 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

용어 "작동적으로 연결된"은, 선택된 핵산 서열 및 조절 핵산 서열(예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서)이, 핵산 서열의 영향 또는 조절하에 핵산 서열의 발현을 배치하는 방식으로 공유적으로 연결되는 상황을 포함할 수 있다(이에 의해 발현 카세트를 형성한다). 따라서, 조절 서열이 핵산 서열의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우, 조절 서열은 선택된 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 이어서, 수득되는 전사물(들)을 목적하는 펩티드(들)/폴리펩티드(들)로 번역할 수 있다.

적합한 벡터는 플라스미드, 이원 벡터, DNA 벡터, mRNA 벡터, 바이러스 벡터(예를 들면, 감마레트로바이러스 벡터(예를 들면, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)-유래 벡터), 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터), 트랜스포손-기반 벡터 및 인공 염색체(예를 들면, 효모 인공 염색체)를 포함한다.

일부 실시형태에서, 벡터는 진핵생물 벡터, 예를 들면, 진핵 세포에서 벡터로부터 단백질의 발현에 필요한 요소를 포함하는 벡터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는, 예를 들면, 단백질 발현을 유도하기 위한 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 SV40 프로모터를 포함하는 포유동물 벡터일 수 있다.

본 발명에 따르는 항원-결합 분자의 구성 폴리펩티드는 복수의 핵산의 상이한 핵산에 의해 또는 복수의 벡터의 상이한 벡터에 의해 코딩될 수 있다.

항원-결합 분자 및 폴리펩티드를 포함/발현하는 세포

본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자, 폴리펩티드 또는 CAR을 포함하거나 발현하는 세포를 제공한다. 또한, 본 발명에 따르는 핵산, 복수의 핵산, 벡터 또는 복수의 벡터를 포함 또는 발현하는 세포가 제공된다.

세포는 진핵 세포, 예를 들면, 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물은 영장류(코뿔소, 사이노몰구스, 비인간 영장류 또는 인간) 또는 비-인간 포유동물(예를 들면, 래빗, 기니아 피그, 랫트, 마우스 또는 기타 설치류(설치 목의 임의의 동물 포함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소(소, 예를 들면, 젓소, 또는 보스(Bos) 목의 임의의 동물 포함), 말(말(Equidae) 목의 임의의 동물 포함), 당나귀 및 비-인간 영장류)일 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 핵산, 복수의 핵산, 벡터 또는 복수의 벡터를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 본 발명에 따르는 핵산(들) 또는 벡터(들)을 포함하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 단리된 핵산(들) 또는 벡터(들)을 세포에 도입하는 것은 형질전환, 형질감염, 전기천공 또는 형질도입(예를 들면, 레트로바이러스 형질도입)을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 핵산, 복수의 핵산, 벡터 또는 복수의 벡터를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자, 폴리펩티드 또는 CAR을 발현/포함하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 세포에 의한 핵산(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적합한 조건하에 세포를 배양하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 시험관내에서 수행된다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 세포를 제공한다.

항원-결합 분자 및 폴리펩티드의 생산

본 발명에 따르는 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 폴리펩티드의 생산 방법에 따라 제조할 수 있다.

폴리펩티드는 화학적 합성, 예를 들면, 액체 또는 고체 상 합성에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 펩티드/폴리펩티드는, 예를 들면, 문헌[참조: Chandrudu et al., Molecules (2013), 18: 4373-4388, 이는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재된 방법을 사용하여 합성할 수 있다.

또는, 항원-결합 분자 및 폴리펩티드는 재조합 발현에 의해 생산할 수 있다. 폴리펩티드의 재조합 생산에 적합한 분자 생물학 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문헌[참조: Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition), Cold Spring Harbor Press, 2012, and in Nat Methods. (2008); 5(2): 135-146, 이들 둘 다는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다. 또한, 항원-결합 분자의 재조한 생산을 위한 방법은 문헌[참조: Frenzel et al., Front Immunol. (2013); 4: 217 and Kunert and Reinhart, Appl Microbiol Biotechnol. (2016) 100: 3451-3461, 이들 둘 다는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다.

일부 경우에, 본 발명의 항원-결합 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 이러한 경우, 항원-결합 분자의 생산은 하나 이상의 폴리펩티드의 전사 및 번역, 및 이어서 항원-결합 분자를 형성하기 위한 폴리펩티드 쇄의 회합을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르는 재조합 생산을 위해, 폴리펩티드의 발현에 적합한 임의의 세포를 사용할 수 있다. 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 고세균 또는 박테리아 세포 등의 원핵 세포이다. 일부 실시형태에서, 박테리아는 장내세균과의 세균, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 등의 그람-음성 박테리아일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들면, CHO, HEK(예를 들면, HEK293), HeLa 또는 COS 세포 등의 진핵 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는, 폴리펩티드를 일시적 또는 안정적으로 발현하는 CHO 세포이다.

일부 경우에, 일부 원핵 세포는 진핵 세포와 동일한 폴딩 또는 번역후 변형을 가능하게 하지 않기 때문에, 세포는 원핵 세포가 아니다. 또한, 진핵생물에서는 매우 높은 발현 수준이 가능하고, 적절한 태그를 사용하여 진핵생물로부터 단백질을 보다 용이하게 정제할 수 있다. 배지로 단백질의 분비를 증강시키는 특정 플라스미드를 또한 이용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 폴리펩티드는, 예를 들면, 문헌[참조: Zemella et al. Chembiochem (2015) 16(17): 2420-2431, 이는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재된 시스템을 사용하여 세포-비함유-단백질 합성(CFPS)에 의해 제조할 수 있다.

생산은, 목적의 폴리펩티드(들)를 발현하도록 변형된 진핵 세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양소, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급이 제공된 생물반응기에서 수행할 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 배지/발효 브로쓰를 분배하고, 단백질 내용물을 추출하고, 개개 단백질을 분리하여 분비된 폴리펩티드(들)을 단리함으로써 수집할 수 있다. 배양, 발효 및 분리 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th Edition; 상기 본원에 참조로서 도입됨)]에 기재되어 있다.

생물반응기는 세포가 배양될 수 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 생물반응기에서의 배양은, 반응기로 반응물의 연속 유동 및 반응기로부터 배양된 세포의 연속 유동과 함께 연속적으로 발생할 수 있다. 또는, 배양은 배치로 발생할 수 있다. 생물반응기는, 배양 중의 세포에 최적 조건이 제공되도록, pH, 산소, 유속, 용기 내의 교반 등의 환경 조건을 모니터링하고 조절한다.

항원-결합 분자/폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양한 후, 목적의 폴리펩티드(들)를 단리할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 세포로부터 단백질을 분리하는 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 폴리펩티드를 단리하기 위해, 영양 배지로부터 세포를 분리할 필요가 있을 수 있다. 폴리펩티드가 세포로부터 분비되는 경우, 세포는, 목적의 분비된 폴리펩티드(들)를 함유하는 배양 배지로부터 원심분리에 의해 분리할 수 있다. 목적의 폴리펩티드(들)가 세포 내에 수집되는 경우, 단백질 분리는 세포 배양 배지로부터 세포를 분리하기 위한 원심분리, 용해 완충액에 의한 세포 펠렛의 처리 및, 예를 들면, 초음파처리, 신속 동결-해동 또는 삼투압 용해에 의한 세포 파괴를 포함할 수 있다.

이어서, 다른 단백질 및 비-단백질 성분을 함유할 수 있는 상청액 또는 배양 배지로부터 목적의 폴리펩티드(들)를 단리하는 것이 바람직할 수 있다. 상청액 또는 배양 배지로부터 단백질 성분을 분리하는 일반적 접근방식은 침전에 의한 것이다. 상이한 용해도의 단백질은, 황산암모늄 등의 상이한 농도의 침전제에서 침전된다. 예를 들면, 저농도의 침전제에서는, 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 상이한 농도의 침전제를 첨가함으로써, 상이한 용해도의 단백질을 구별할 수 있다. 이어서, 투석을 사용하여, 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거할 수 있다.

상이한 단백질을 구별하는 다른 방법, 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 크로마토그래피는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들은 침전 대신에 사용될 수 있거나, 침전 후에 수행할 수 있다.

목적의 폴리펩티드(들)가 배양물로부터 단리되는 경우, 폴리펩티드(들)를 농축하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 한외여과 또는 동결건조 등의 단백질을 농축하는 다수의 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다.

조성물

본 발명은 또한 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.

본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터 및 세포는 임상 사용을 위한 약제학적 조성물 또는 의약으로서 제형화될 수 있고, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다. 조성물은, 주사 또는 주입을 포함할 수 있는 국소, 비경구, 전신, 강내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내, 안내, 결막내, 종양내, 피하, 피내, 척수강내, 경구 또는 경피 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.

적합한 제형은, 멸균 또는 등장성 배지 중의 항원-결합 분자를 포함할 수 있다. 의약 및 약제학적 조성물은, 겔을 포함하는 유체 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은, 인체 또는 동물 신체의 선택된 영역에 주사 또는 주입(예를 들면, 카테터를 통해)에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 조성물은, 예를 들면, 혈관 또는 종양으로의 주사 또는 주입을 위해 제형화된다.

본원에 기재된 발명에 따르면, 약제학적으로 유용한 조성물의 제조를 위한 방법이 또한 제공되고, 이러한 제조 방법은, 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수) 또는 세포를 생성하는 단계; 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수) 또는 세포를 단리하는 단계; 및/또는 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수) 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.

예를 들면, 본원에 기재된 발명의 추가의 태양은 질환/병태(예를 들면, 암)의 치료에 사용하기 위한 의약 또는 약제학적 조성물을 제형화 또는 생산하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수) 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약제학적 조성물 또는 의약을 제형화하는 것을 포함한다.

치료 및 예방 적용

본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물은 치료 및 예방 방법에서 사용된다.

본 발명은, 의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물을 제공한다. 또한, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 의약의 제조에서 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물의 용도가 제공된다. 또한, 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

이 방법은, 질환/병태의 발증 또는 진행을 감소시키거나, 질환/병태의 증상의 완화 또는 질환/병태의 병리의 감소에 효과적일 수 있다. 이 방법은 질환/병태의 진행을 예방하고, 예를 들면, 질환/병태의 악화를 예방하거나 이의 진행 속도를 지연시키는데 효과적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 질환/병태의 개선, 예를 들면, 질환/병태의 증상의 감소 또는 질환/병태의 중증도/활성의 일부 다른 상관의 감소를 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 후기 단계(예를 들면, 만성 단계 또는 전이)의 질환/병태의 발달을 예방할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 질환/병태를 역전 또는 퇴행시키는데 효과적일 수 있고, 예를 들면, 질환/병태의 병리는 후기 발달 단계로부터 초기 발달 단계까지 역전될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 질환/병태의 증상 또는 질환/병태의 중증도/활성의 일부 다른 상관을 역전 또는 퇴행시키는데 효과적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 질환/병태를 갖지 않는 대상체에서 관찰된 상태와 유사한 상태로 질환/병태를 역전/퇴행시키는데 효과적일 수 있다.

본 발명의 제품은, IL-11 매개 신호전달의 수준의 감소(즉, 억제 또는 길항작용), 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현하는 세포의 수 및/또는 활성의 감소로부터 치료적 또는 예방적 이익을 유도하는, 임의의 질환/병태의 치료/예방에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

예를 들면, 질환/병태는, IL-11 매개 신호전달이 병리학적으로 관련되어 있는 질환/병태, 예를 들면, IL-11 매개 신호전달의 수준 증가가 질환/병태의 발증, 발달 또는 진행 및/또는 질환/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 양으로 연관되어 있거나, IL-11 매개 신호전달의 수준 증가가 질환/병태의 발증, 발달 또는 진행의 위험 인자인 질환/병태일 수 있다.

예를 들면, 질환/병태는, IL-11Rα를 발현하는 세포가 병리학적으로 관련되어 있는 질환/병태, 예를 들면, IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율의 증가가 질환/병태의 발증, 발달 또는 진행 및/또는 질환/병태의 하나 이상의 증상의 중증도와 양으로 연관되어 있거나, IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율의 증가가 질환/병태의 발증, 발달 또는 진행의 위험 인자인 질환/병태일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료/예방되는 질환/병태는, 질환/병태의 부재하에 IL-11 매개 신호전달/이의 상관의 수준과 비교하여 IL-11 매개 신호전달 또는 이의 상관의 수준의 증가(예를 들면, 질환/병태의 증상이 나타나는 기관/조직에서)를 특징으로 하는 질환/병태이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료/예방되는 질환/병태는, 예를 들면, 질환/병태의 부재하에 IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율/활성과 비교하여, IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율/활성의 증가를 특징으로 하는 질환/병태이다.

일부 실시형태에서, 대상체는, 말초에서, 또는 질환/병태에 의해 영향을 받는 기관/조직(예를 들면, 질환/병태의 증상이 나타나는 기관/조직)에서, IL-11 매개 신호전달 또는 이의 상관의 수준 증가 및/또는 IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율/활성의 증가의 검출에 기초하여 본원에 기재된 바와 같은 치료/예방을 위해 선택할 수 있다. 질환/병태는 임의의 조직 또는 기관 또는 기관 시스템에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환/병태는 몇몇 조직/기관/기관 시스템에 영향을 미칠 수 있다.

일부 실시형태에서, 대상체는, 건강한 대상체에서 L-11 매개 신호전달/이의 상관의 수준 또는 IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율/활성과 비교하여, 예를 들면, 말초에서 또는 기관/조직에서, 대상체가 IL-11 매개 신호전달 또는 이의 상관의 수준 증가 및/또는 IL-11Rα를 발현하는 세포의 수/비율/활성의 증가를 갖는다는 결정에 기초하여 본 발명에 따르는 치료/예방을 위해 선택할 수 있다.

본 발명의 항원-결합 분자는 바람직하게는 IL-11Rα 및 IL-11Rα-함유 분자/복합체(예를 들면, IL-11:IL-11Rα 복합체)에 결합할 수 있고 이의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원-결합 분자는, IL-11Rα가 질환/장애의 병리에 관련되어 있는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 사용된다. 즉, 본 발명의 항원-결합 분자는, IL-11 매개 신호전달과 연관된 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 사용된다.

일부 실시형태에서, 질환/장애는, 예를 들면, 대조군(즉, 비-질환) 상태와 비교하여, IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130 유전자 또는 단백질 발현의 증가와 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환/장애는, 대조군 상태와 비교하여, IL-11-매개 신호전달(예를 들면, IL-11/IL-11R 신호전달)의 수준 증가와 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환/장애는, 대조군 상태와 비교하여, ERK 및/또는 STAT3 경로를 통한 신호전달 수준의 증가와 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130의 발현/활성 증가 및/또는 IL-11-매개 신호전달의 수준 증가는 질환/장애의 이펙터 세포에서 관찰될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130의 발현/활성 증가 및/또는 IL-11-매개 신호전달의 수준 증가는 이펙터 세포 이외의 세포에서 관찰될 수 있다.

ERK를 통한 신호전달은, 예를 들면, 문헌[참조: Assay Guidance Manual: Phospho-ERK Assays, Kim E. Garbison, Beverly A. Heinz, Mary E. Lajiness, Jeffrey R. Weidner, and G. Sitta Sittampalam, Eli Lilly & Company, Sittampalam GS, Coussens NP, Nelson H, et al., editors Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004]에 기재된 검정 등의 ERK 포스포릴화를 위한 검정을 사용하여 측정할 수 있다. STAT3을 통한 신호전달은, 예를 들면, 포스포-STAT3(Tyr705) 세포 검정 키트(Cisbio Assays) 등의 STAT3의 포스포릴화를 위한 검정을 사용하여 측정할 수 있다.

일부 실시형태에서, 치료는, IL-11 매개 신호전달의 감소가 치료적인 질환/장애의 것이다. 일부 실시형태에서, 치료는 과다한 ERK 및/또는 STAT3 신호전달과 연관된 병태/장애의 것이다. 일부 실시형태에서, 치료는, 섬유아세포의 과다한 증식 또는 과활성화와 연관되거나 과다한 근섬유아세포와 연관된 질환/장애의 것이다.

일부 실시형태에서, 치료는, 근섬유아세포 또는 αSMA-양성 섬유아세포의 수 또는 비율을 감소시킴으로써 질환/장애를 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 할 수 있다.

일부 실시형태에서, 질환/장애는 섬유증, 섬유증 상태, 또는 섬유증을 특징으로 하는 질환/장애일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "섬유증"은, 세포외 매트릭스 성분, 예를 들면, 콜라겐의 과다한 침착의 결과로서 과다한 섬유성 결합 조직의 형성을 지칭한다. 섬유성 결합 조직은, 콜라겐 함량이 높은 세포외 매트릭스(ECM)를 갖는 것을 특징으로 한다. 콜라겐은, 불규칙적으로 배열 또는 정렬될 수 있다. 섬유성 결합 조직의 ECM은 또한 글리코스아미노글리칸을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "과다한 섬유성 결합 조직"은, 섬유증의 부재, 예를 들면, 정상의 비-병리학적 조건하에 그 장소에 존재하는 결합 조직의 양보다 큰, 소정 장소(예를 들면, 소정 조직 또는 기관, 또는 소정 조직 또는 기관의 일부)에서 결합 조직의 양을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "세포외 매트릭스 성분의 과다한 침착"은, 섬유증의 부재, 예를 들면, 정상의 비-병리학적 조건하의 침착 수준보다 큰, 하나 이상의 세포외 매트릭스 성분의 침착 수준을 지칭한다.

섬유증의 세포 및 분자 메카니즘은 문헌[참조: Wynn, J. Pathol. (2008) 214(2): 199-210, and Wynn and Ramalingam, Nature Medicine (2012) 18:1028-1040, 이는 참조에 의해 그 전체가 본원에 도입된다.]에 기재되어 있다. 섬유증의 주요 세포 이펙터는 콜라겐-풍부 세포외 매트릭스를 생성하는 근섬유아세포이다.

조직 손상에 반응하여, 손상된 세포 및 백혈구는 TGFβ, IL-13 및 PDGF 등의 섬유화촉진 인자를 생성하고, 이는 섬유아세포를 αSMA-발현 근섬유아세포로 활성화하고, 손상 부위로 근섬유아세포를 동원한다. 근섬유아세포는 대량의 세포외 매트릭스를 생성하고, 창상의 수축 및 폐쇄를 보조하는 중요한 매개인자이다. 그러나, 지속 감염의 조건하에 및 만성 염증 동안, 근섬유아세포의 과활성화 및 동원, 따라서 세포외 매트릭스 성분이 과잉-생성되어, 과다한 섬유성 결합 조직의 형성을 야기할 수 있다.

일부 실시형태에서, 섬유증은, TGFβ1 등의 섬유화촉진 인자의 생성을 유도하는 병리학적 상태, 예를 들면, 병태, 감염증 또는 질환 상태에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 물리적 손상/자극, 화학적 손상/자극 또는 환경적 손상/자극에 의해 유발될 수 있다. 의원성 원인 등, 수술 중에 물리적 손상/자극이 발생할 수 있다. 화학적 손상/자극은, 예를 들면, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 아미오다론, 프로카인아미드, 페니실아민, 금 및 니트로푸란토인 등의 약물의 만성 투여 후, 약물 유도된 섬유증을 포함할 수 있다[참조: Daba et al., Saudi Med J 2004 Jun; 25(6): 700-6]. 환경적 손상/자극은 석면 섬유 또는 실리카에 대한 노출을 포함할 수 있다.

섬유증은 신체의 다수의 조직에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 섬유증은 폐, 간(예를 들면, 간경변), 신장, 심장, 혈관, 눈, 피부, 췌장, 비장, 장(예를 들면, 대장 또는 소장), 뇌 및 골수에서 발생할 수 있다. 섬유증은 또한 한번에 복수의 기관에서 발생할 수 있다.

본원의 실시형태에서, 섬유증은, 위장계 기관, 예를 들면, 간, 소장, 대장 또는 췌장의 기관을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 호흡계 기관, 예를 들면, 폐를 포함할 수 있다. 실시형태에서, 섬유증은 심혈관계의 기관, 예를 들면, 심장 또는 혈관의 기관을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 피부를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 신경계 기관, 예를 들면, 뇌의 기관을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 비뇨기계의 기관, 예를 들면, 신장을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 근골격계 기관, 예를 들면, 근육 조직을 포함할 수 있다.

일부 바람직한 실시형태에서, 섬유증은 심장 또는 심근 섬유증, 간 섬유증 또는 신장 섬유증이다. 일부 실시형태에서, 심장 또는 심근 섬유증은 심장의 근조직 또는 전기적 특성의 기능 부전, 또는 심장의 벽 또는 판막의 비후와 연관된다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 심장의 심방 및/또는 심실의 것이다. 심방 또는 심실 섬유증의 치료 또는 예방은 심방 세동, 심실 세동 또는 심근 경색의 발증의 위험 또는 발증을 감소시키는 데 도움을 줄 수 있다.

일부 바람직한 실시형태에서, 간 섬유증은 만성 간 질환 또는 간 경변과 연관된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 신장 섬유증은 만성 신장 질환과 연관된다.

본 발명에 따르는 섬유증을 특징으로 하는 질환/장애는 호흡기 상태, 예컨대, 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 특발성 폐 섬유증(IPF)(idiopathic pulmonary fibrosis), 진행성 대규모 섬유증(progressive massive fibrosis), 경피증(scleroderma), 폐색성 기관지염(obliterative bronchiolitis), 헤르만스키-푸들락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 만성 폐 고혈압(chronic pulmonary hypertension), AIDS 연관 폐 고혈압(AIDS associated pulmonary hypertension), 유육종증(sarcoidosis), 폐 질환의 종양 스트로마(tumor stroma in lung disease) 및 천식(asthma); 만성 간질환(chronic liver disease), 원발성 담즙성 간경변(PBC)(primary biliary cirrhosis), 주혈흡충성 간 질환(schistosomal liver disease), 간 경변증(liver cirrhosis), 지방간염(steatohepatitis), 비-알콜성 지방간염(NASH)(non-alcoholic steatohepatitis), 초기 NASH, 후기 NASH, 알콜성 지방간염(alcoholic steatohepatitis), 지방증(steatosis); 비-알콜성 지방간 질환(NAFLD)(non-alcoholic fatty liver disease), 췌장 질환, 예컨대, 만성 췌장염(chronic pancreatitis) 및 췌장 섬유증(pancreatic fibrosis); 심혈관 질환(cardiovascular conditions), 예컨대, 비대성 심근병증(hypertrophic cardiomyopathy), 확장성 심근병증(DCM)(dilated cardiomyopathy), 심방 섬유증(fibrosis of the atrium), 심방 세동(atrial fibrillation), 심실 섬유증(fibrosis of the ventricle), 심실 세동(ventricular fibrillation), 심근 섬유증(myocardial fibrosis), 브루가다 증후군(Brugada syndrome), 심근염(myocarditis), 심근내막 섬유증(endomyocardial fibrosis), 심근 경색증(myocardial infarction), 섬유성 혈관 질환(fibrotic vascular disease), 고혈압성 심장 질환(hypertensive heart disease), 부정맥성 우심실 심근병증(ARVC)(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy), 세뇨관 간질(tubulointerstitial) 및 사구체 섬유증(glomerular fibrosis), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 정맥류(varicose veins), 뇌경색(cerebral infarcts); 신경학적 상태(neurological conditions), 예컨대, 신경교증(gliosis) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease); 근이영양증(muscular dystrophy), 예컨대, 듀헨 근이영양증(DMD)(Duchenne muscular dystrophy) 또는 벡커 근이영양증(BMD)(Becker's muscular dystrophy); 위장 질환(gastrointestinal conditions), 예컨대, 크론병(Crohn's disease), 현미경적 대장염(microscopic colitis) 및 원발성 경화성 담관염(PSC)(primary sclerosing cholangitis); 피부 상태(skin conditions), 예컨대, 강피증(scleroderma), 신성 전신성 섬유증(nephrogenic systemic fibrosis) 및 피부 켈로이드(cutis keloid); 관절섬유증(arthrofibrosis); 듀푸이트렌 구축(Dupuytren's contracture); 종격동 섬유증(mediastinal fibrosis); 후복막 섬유증(retroperitoneal fibrosis); 골수섬유증(myelofibrosis); 페이로니병(Peyronie's disease); 접착성 캡슐염(adhesive capsulitis); 신장 질환(예를 들면, 신장 섬유증(renal fibrosis), 신 증후군(nephritic syndrome); 알포트 증후군(Alport's syndrome), HIV 연관 신장병증(HIV associated nephropathy), 다낭성 신장 질환(polycystic kidney disease), 파브리병(Fabry's disease), 당뇨병성 신장병증(diabetic nephropathy), 만성 사구체신염(chronic glomerulonephritis), 전신성 루푸스와 연관된 신장염(nephritis), 신장 간질성 섬유증(IF)(kidney interstitial fibrosis)); 신장 손상(kidney injury), 예를 들면, 급성 신장 장애/신 부전; 신독성(nephrotoxicity); 진행성 전신성 경화증(PSS)(progressive systemic sclerosis); 만성 이식편 대 숙주 질환(chronic graft versus host disease); 안 및 연관 질환, 예컨대, 그레이브 안병증(Grave's opthalmopathy), 망막외 섬유증(epiretinal fibrosis)(예를 들면, 당뇨병성 망막병증(DR)(diabetic retinopathy)), 녹내장(glaucoma), 망막하 섬유증(subretinal fibrosis)(예를 들면, 황반 변성 관련(예를 들면, 습성 또는 건성 연령 관련 황반 변성(AMD)(wet or dry age-related macular degeneration))), 황반 부종(macular edema), 드루센 형성(drusen formation), 맥락막 혈관신생(CNV)(choroidal neovascularization), 수술후 섬유증(post-surgical fibrosis)(예를 들면, 백내장 수술 후의 후낭(posterior capsule following cataract surgery), 또는 녹내장에 대한 섬유주절제술 후의 수포(bleb following trabeculectomy for glaucoma)), 결막 섬유증(conjunctival fibrosis), 결막하 섬유증(subconjunctival fibrosis); 관절염(arthritis); 섬유성 전종양성(fibrotic pre-neoplastic) 및 섬유성 종양성 질환; 및 화학적 또는 환경적 상해(예를 들면, 암 화학요법, 살충제, 방사선/암 방사선요법)에 의해 유발된 섬유증을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.

조기 NASH는 본원에서 지방간 질환, 예를 들면, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD)의 지방증 단계를 지칭하고, 이는 간에 염증이 발생한 NASH 상태로 연결될 수 있다. 후기 NASH는 본원에서, 섬유증을 포함할 수 있는 지속성 간 염증의 상태를 지칭한다.

상기 수록된 질환/병태의 다수는 상호 연관되어 있다. 예를 들면, 심실의 섬유증은 심근 경색 후에 발생할 수 있고, DCM, HCM 및 심근염과 연관되어 있다.

특정 실시형태에서, 질환/병태는, 폐 섬유증, 심방 세동, 심실 세동, 비대성 심근증(HCM), 확장성 심근증(DCM), 비알콜성 지방 간염(NASH), 간경변, 만성 신장 질환, 강피증, 전신성 경화증, 켈로이드, 낭포성 섬유증, 만성 질환, 수술 후 섬유증 또는, 예를 들면, 습성 노화-관련 황반 변성(AMD)과 연관된 망막 섬유증 중의 하나일 수 있다.

일부 실시형태에서, 이 방법은, 섬유증을 역전 또는 퇴행시키는데 효과적일 수 있다. 섬유증은 확립된 섬유증 또는 중증 섬유증일 수 있고, 본원에 기재된 질환/장애의 어느 것과 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은, 본원에 제공된 질환/장애의 어느 하나를 역전 또는 퇴행시키는데 효과적일 수 있다.

섬유증은, 직접 또는 간접적으로, 질환/장애의 발증으로 이어질 수 있고/있거나 발증에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 간세포 암(HCC)의 80% 이상이 섬유성 또는 간경변에서 발생하고[참조: Affo et al. 2016, Annu Rev Pathol.], 이는 간의 전암 환경(PME)에서 간 섬유증의 중요한 역할을 시사한다.

따라서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 섬유증이 연관되고/되거나, 섬유증이 위험 인자인 질환/장애의 치료 및 예방 방법에 사용된다. 일부 실시형태에서, 섬유증과 연관되거나 섬유증이 위험 인자인 질환/장애는 암, 예를 들면, 간암(예를 들면, 간세포 암종)이다.

IL-11 매개 신호전달은 또한, 다른 질환/장애의 병리와 관련되어 있고, 따라서 본 발명의 항원-결합 분자는 이들 질환/장애의 증상을 치료, 예방, 완화 및/또는 역전 또는 퇴행시키는 방법에서 사용된다.

일부 실시형태에서, 섬유증은, 예를 들면, 눈에서의 혈관신생과 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 섬유증을 치료 또는 예방하는 방법, 이러한 치료/예방을 위해 대상체의 적합성을 결정하는 방법 및 본원에 기재된 섬유증을 진단/예측하는 방법은 또한 혈관신생을 치료/예방/진단/예측하기 위해 적용가능하고, 그 반대도 마찬가지다. 눈의 섬유증은 맥락막 혈관신생(CNV)과 연관될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 대사성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 즉, 본 발명은, 예를 들면, 세포, 조직/기관/기관계/대상체에서 IL-11 매개 신호전달의 억제를 통해 대사성 질환의 치료/예방을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "대사성 질환"은, 비정상 대사에 의해 유발되거나 비정상 대사를 특징으로 하는 임의의 질환 또는 병태를 지칭한다. 이러한 맥락에서 "대사"는 에너지 공급원, 예를 들면, 영양을 제공하기 위해 소비되는 물질을 에너지로 및/또는 저장용으로 신체적 전환/처리하는 것을 지칭한다. "정상 대사"는, 예를 들면, 대사성 질환을 갖지 않는 또는 대사성 질환의 증상/상관을 갖지 않는, 질환을 갖지 않는 건강한 대상체의 대사일 수 있다.

대사성 질환을 갖는 대상체는 비정상 대사를 나타낼 수 있다. 대사성 질환을 갖는 대상체는 비정상 대사의 증상/상관을 가질 수 있다. 대사성 질환을 갖는 대상체는 대사성 질환을 갖는 것으로 진단될 수 있다. 대상체는, 대사성 질환의 진단을 위한 진단 기준을 충족할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은, 대사성 질환이 예후 불량을 제공하는 대상체에서 질환/병태의 치료/예방을 제공한다.

일부 실시형태에서, 대사성 질환은 간장, 췌장, 심혈관계, 소화기계, 배설계, 호흡기계, 신장계, 생식계, 순환기계, 근육계, 내분비계, 외분비계, 림프계, 면역계, 신경계 및/또는 골격계 중의 하나 이상에 영향을 미친다.

일부 실시형태에서, 대사성 질환은 비만, 2형 당뇨병(T2D), 1형 당뇨병(T1D), 전당뇨병, 과체중, 대사 증후군, 임신-연관 고혈당(즉, 임신성 당뇨병), 담즙정체성 간 질환, 고혈당, 고지혈증, 고트리글리세라이드혈증, 고콜레스테롤 혈증, 소모, 악액질, 화학요법-연관 체중 감소, 췌장 기능부전, 췌장염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 지방증, 비-알콜성 지방간 질환(NAFLD)(non-alcoholic fatty liver disease), 비-알콜성 지방간(NAFL)(non-alcoholic fatty liver), 비-알콜성 지방간염(NASH), 지방이영양증, 지방비대, 지방위축증, 인슐린 결핍, 인슐린 저항성 및 고혈당이거나, 이를 포함(예를 들면, 특징으로 함)한다. 일부 실시형태에서, 대사성 질환은 비만이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대사성 질환은 담즙 정체, 즉 간에서 십이지장으로의 담즙 유동의 감소이거나, 이를 포함한다. 질환은, 예를 들면, 원발성 담즙성 담관염(PBC) 및 원발성 경화성 담관염(PSC)을 포함하여, 담즙정체성 간 질환일 수 있다[참조: Jansen et al., Hepatology (2017) 65(2):722-738 and Pollock and Minuk, J Gastroenterol Hepatol (2017) 32(7):1303-1309, 이들 모두는 그 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.].

본 발명의 태양은, 대사에서 역할을 하는 세포/조직(들)/기관(들)/기관계의 비정상 및/또는 불충분한 기능의 치료 및/또는 예방과 관련된다. 특히, 췌장/췌장 조직/췌장의 세포의 비정상 기능 및/또는 불충분한 기능의 치료 및/또는 예방은, 간/간장 조직/간의 세포의 비정상 기능 및/또는 불충분한 기능의 치료 및/또는 예방과 마찬가지로, 본원에서 고려된다.

일부 실시형태에서, 대사성 질환은 소모이거나 이를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소모"는, 진행성 및/또는 퇴행성일 수 있는, 비자발적 체중 감소를 지칭한다. 소모는 체지방의 손실과 관계 없이 근육 손실로서 정의될 수 있고, 통상 형저한, 일반적으로 비자발적, 체질량 손실(골격근 포함)을 수반하고, 지방 조직의 손실을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일부 예에서, 지방 조직 소모는, 지방 이영양증 질환에서 볼 수 있는 바와 같이, 단독으로 발생할 수 있다. 소모는, 음식물 섭취의 감소 및 비정상 대사의 가변적 조합에 의해 유발되는 부정적 단백질 및 에너지 균형을 특징으로 할 수 있다[참조: Fearon et al. Lancet Oncol. (2011) 12(5):489-95]. 소모는, 진행성 기능 장애, 생활의 질 저하, 이환율 및 사망 위험 증가를 유도할 수 있다. 일부 경우에, 소모는 무력증(비정상 신체적 쇠약 또는 에너지 결여) 및/또는 빈혈(혈중 적혈구 또는 헤모글로빈의 결핍)을 유도할 수 있다. 일부 경우에, 소모는, 종래의 영양 지원, 또는 현재까지 시행된 치료적 개입에 의해 완전히 역전시킬 수 없다. 사망은 통상, 체중 감소가 환자의 역사적 안정 체중의 30%에 도달하면 발생한다[참조: Tisdale, Nature Reviews Cancer, 2, 862-871 (2002)].

소모를 특징으로 하는 질환/병태는 악액질(cachexia)(비-연령-관련 근육량 손실), 근육감소증(sarcopenia)(근육량 손실: 예를 들면, 연령-관련, 폐기, 우주 여행 또는 탈신경), 식욕부진 장애(단백질-에너지 영양실조), 근육 이영양증, 지방이영양증(예를 들면, 지방 조직의 비정상 또는 퇴행성 상태), 지방 위축(안면 및 기타 조직의 연령 관련 피하 지방 손실) 및 근감소증(만성 질환에서 근육 소모; 문헌[참조: Fearon et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2011; 2:1-3]에서 제안됨)을 포함한다. 본원에서, 소모를 특징으로 하는 질환/병태는 또한 "소모성 질환(wasting disease)"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따르는 소모성 질환은 악액질, 전-악액질, 난치성 악액질, 근육감소증, 식욕부진, 지방 이영양증, 지방 위축증 및/또는 근감소증이다. 본원에 기재된 다양한 태양에 따르는 일부 실시형태에서, 소모성 질환은 악액질, 전-악액질 및/또는 난치성 악액질이다.

만성 질환에 기인하는 소모성 질환은, "경도 근육 소모성 질환"(허약의 존재 또는 부재), "중등도 근육 소모성 질환"(허약의 존재 또는 부재; 종종 "전-악액질"로서 공지됨), 또는 "중증 근육 소모성 질환"(종종 "악액질"로서 불리우고, 종종 허약이 존재함)을 포함할 수 있다. 악액질은, 역사적으로 안정한 체중으로부터 >5%의 비자발적 체중 감소, 어느 정도의 체중 손실 >2%과 함께 <20kg/m2(65세 미만의 사람) 또는 <22kg/m2(65세 이상의 사람)의 체질량 지수(BMI), 또는 어느 정도의 체중 손실 >2%과 함께 근육감소증과 일치하는 골격근 지수로서 정의될 수 있다. 대상체는 또한 <10%의 체지방 및/또는 <35g/l의 낮은 혈중 알부민 수준을 나타낼 수 있다. 이들 기준은, 소모성 질환을 발증하는 "위험이 있는" 모집단을 특정하는데 도움을 줄 수 있다[참조: Fearon et al. Lancet Oncol. 2011; 12(5):489-95].

악액질의 3단계 분류가 제안되어 있고, 진행중의 체중 감소의 정도와 조합하여, 에너지 저장 및 신체 단백질(BMI)의 고갈의 정도에 따라 중증도가 분류된다.

1. 전-악액질 - 환자의 체중 감소가 <5%이지만, 심각한 합병증을 아직 발증하지 않은 경우.

2. 악액질 - 증후군이 상기 언급된 파라미터를 초과하는 체중 감소와 함께 진행하고 있지만, 여전히 치료될 가능성이 있는 경우.

3. 난치성 악액질 - 질환이 치료에 반응하지 않는 시점, 또는 치료 효과가 부담 및 위험을 상회하는 경우[참조: Fearon et al, supra]. 종종, 난치성 단계는, 하기 설명하는 기저 질환의 전체적 단계 및 환자의 병태에 의해 결정된다.

대사성 질환은 급성 또는 만성 질환 환경에 존재할 수 있다. 본 발명의 태양은, 대사성 질환과 연관되는 질환/병태의 치료/예방을 제공한다. 대사성 질환과 연관된 질환/병태는 대사성 질환의 발증과 적극적으로 연관되는 질환/병태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대사성 질환과 연관되는 질환/병태는, 대사성 질환을 유발할 수 있는/유발하는/유발한(즉, 이를 유도할 수 있는, 유도하거나, 유도한) 것이다.

대사성 질환과 연관된 질환/병태는 또한, 대사성 질환에 의해 유발되고/되거나 악화되는(악화하는, 진행하는 및 복잡해지는) 질환/병태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대사성 질환과 연관된 질환/병태는 대사성 질환의 발증과 적극적으로 연관될 수 있고, 또한 대사성 질환에 의해 악화될 수 있다. "연관된" 질환/병태는 대사성 질환-관련 병리를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시형태에서, 대사성 질환, 또는 대사성 질환과 연관된 질환/병태는 임의의 기관/조직, 예컨대, 심장, 간, 신장, 뇌, 피부, 근육계, 위장, 소장, 대장, 췌장, 구강, 타액선, 인두, 식도, 담낭, 기관, 후두, 방광, 난소, 자궁, 정소, 내분비계의 선, 예를 들면, 뇌하수체 또는 갑상선, 림프계, 예를 들면, 비장에 존재하거나 이에 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 실시형태에서, 대사성 질환과 연관된 질환/병태는 암, 심장병, 신장병, 폐 질환, 간 질환, 만성 감염, 신경 퇴행성 질환, 급성 손상, 외상성 손상/트라우마, 수술후 상태 또는 노화/노령화 중의 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다양한 태양에 따르면, 본 발명에 따르는 대사성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법은 하기 중의 하나 이상을 포함할 수 있다:

혈중 지질 수준의 저하;

혈중 글루코즈 수준의 감소;

글루코즈 내성의 증가 (예를 들면, 글루코즈 불내성 대상체의);

인슐린 내성의 증가(예를 들면, 인슐린 내성 대상체의);

췌장 기능의 증가;

체중의 감소(예를 들면, 과체중/비만 대상체의);

체지방량 감소;

근육량 증가;

공복시 혈중 글루코즈 수치 저하;

혈청 트리글리세라이드 수준의 저하;

혈청 콜레스테롤 수준의 저하;

글루코즈 내성 증가;

췌장 기능의 증가(예를 들면, 외분비 및/또는 내분비 기능);

췌장 조직 성장의 증가;

췌장 조직의 재생;

췌장 중량의 증가;

췌도 세포 과형성의 감소;

글루카곤 발현의 감소;

인슐린 발현의 증가;

체중의 증가(예를 들면, 소모성 질환, 예를 들면, 악액질을 갖는 대상체의);

간에서 IL-11 단백질의 발현의 저하;

간에서 Erk 활성화의 감소;

예를 들면, 간의 지방증의 감소;

간 트리글리세라이드 수준의 감소;

혈청 ALT 수준의 저하;

염증유발성 인자(예를 들면, TNFa, CCL2, CCL5, IL-6, CXCL5 및/또는 CXCL1)의 발현의 감소;

섬유화촉진 인자(예를 들면, IL-11, TIMP1, ACTA2, TGFβ1, MMP2, TIMP2, MMP9, COL1A2, COL1A1 및/또는 COL3A1)의 발현의 감소;

TGFβ1 수준의 저하;

IL-11, ACTA2, MMP2, TGFβ1, PDGF, ANG II, bFGF, CCL2 및/또는 H2O2의 HSC에 의한 발현/생산의 감소;

HSC에 의한 HSC-대-근섬유아세포 전이의 억제;

간에서 근섬유아세포의 수/비율의 감소;

간 하이드록시프롤린 수준의 감소;

간 기능의 증가;

대사성 질환에 의해 영향을 받는 기관/조직의 기능의 증가;

간 손상의 감소; 및

간에서 CD45+ 세포의 수/비율의 감소.

IL-11 매개 신호전달은, 다양한 암의 발생 및 진행과 관련되어 있다. 연구에 따르면, IL-11 매개 신호전달은, STAT3의 과도한 활성화를 통해, 만성 위염 및 연관 위암, 결장암, 간세포암 및 유방암 종양형성을 촉진하는데 중요하고[참조: Ernst M, et al. J Clin Invest. (2008);118:1727-1738), IL-11은 JAK-STAT 세포내 신호전달 경로를 유발함으로써 종양형성을 촉진시킬 수 있고 또한 PI3K-AKT-mTORC1 경로를 통한 신호전달에 의해 전이를 촉진할 수 있다는 것이 시사되어 있다[참조: Xu et al., Cancer Letters (2016) 373(2): 156-163]. STAT3를 통해, IL-11은 생존, 증식, 침윤성 혈관신생 및 전이를 촉진하고, IL-11/GP130/JAK/STAT3 신호전달 축은 위장 종양의 진행 속도를 제한할 수 있으며, IL-11 발현 상승은 유방암 환자의 예후 불량과 연관된다[참조: Johnstone et al., Cytokine & Growth Reviews (2015) 26(5): 489-498]. 또한, IL-11은 유방암 줄기 세포 역학 및 종양 불균일성에 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다[참조: Johnstone et al., Cytokine & Growth Reviews (2015) 26(5): 489-498]. 최근, IL-11 매개 신호전달은 폐 선암의 화학 저항성과 관련되어 있고; 암 연관된 섬유아세포는 IL-11을 상향조절하고 IL-11/IL-11R/STAT3 항-아폽토시스 신호전달 경로의 활성화를 통해 화학저항성을 폐암 세포에 부여하는 것으로 밝혀졌다[참조: Tao et al. 2016, Sci Rep. 6;6:38408]. IL-11 매개 신호전달은, 전-악성 환경(PME) 및 종양 미소-환경(TME)에서 섬유아세포-대-근섬유아세포 전이 및 섬유아세포에 의한 세포외 매트릭스 생산을 촉진할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 암을 치료/예방하기 위한 방법에 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 암은 염증 및/또는 섬유증을 간접 또는 직접적으로 유도하는 암일 수 있다.

암은, 바람직하지 않은 세포 증식(또는 바람직하지 않은 세포 증식에 의해 자체적으로 나타나는 임의의 질환), 신생물 또는 종양, 또는 바람직하지 않은 세포 증식, 신생물 또는 종양의 위험 또는 요인의 증가일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있고, 원발성 또는 속발성(전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은, 세포의 임의의 비정상적 성장 또는 증식일 수 있고, 임의의 조직에 위치할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 암, 예를 들면, 상피 세포암, 유방암, 위장암(예를 들면, 식도암, 위암, 췌장암, 간암(예를 들면, HCC), 담낭암, 결장직장암, 항문암, 위장 카르시노이드 종양), 및 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암(NSCLC) 또는 소세포 폐암(SCLC))을 치료/예방하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 암은, 급성 및/또는 만성 염증이 위험 인자인 암이다. 일부 실시형태에서, 암은, 섬유증(예를 들면, 본원에 기재된 바와 같음)을 특징으로 하는 질환/장애가 위험 인자인 암이다.

일부 실시형태에서, 암은 IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130 유전자 또는 단백질 발현의 증가와 연관될 수 있다. 예를 들면, 암 세포는, 동등한 비-암성 세포와 비교하여, IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130의 발현의 증가를 가질 수 있거나, 암의 부재(예를 들면, 건강한 대조군 대상체)하에 동등한 세포에 의한 발현 수준과 비교하여, 다른 세포(예를 들면, 비-암성 세포)에 의한 IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130의 발현 증가와 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 세포는, 동등한 비-암성 세포와 비교하여, ERK 및/또는 STAT3 경로를 통한 신호전달의 증가된 수준을 갖는 것으로 결정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 암은 IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130의 돌연변이와 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 유전자 또는 단백질 발현 수준의 증가와 연관될 수 있거나, 돌연변이의 부재하에 관찰된 발현/신호전달 수준과 비교하여 IL-11/IL-11R 신호전달의 수준 증가와 연관될 수 있다.

IL-11/IL-11R 신호전달은 또한 염증을 특징으로 하는 질환/장애와 관련되어 있다. IL-11의 관절내 주사는 관절 염증을 유발하는 것으로 밝혀져 있고[참조: Wong et al., Cytokine(2005) 29:72-76], IL-11은 IL-13-매개된 조직 염증의 부위에서 염증유발성인 것으로 밝혀져 있다[참조: Chen et al., J Immunol (2005) 174:2305-2313]. IL-11 발현은 또한, 아토피성 피부염의 만성 피부 병변에서 현저히 증가하는 것으로 관찰되어 있고, 기관지 염증에 관여하는 것으로 공지되어 있다[참조: Toda et al., J Allergy Clin Immunol (2003) 111:875-881]. IL-11-매개 신호전달은, 염증성 장 질환(IBD) 및 천식과 관련되어 있다[참조: Putoczki and Ernst, J Leuko Biol (2010) 88(6)1109-1117]. IL-11은 또한 다발성 경화증의 위험 인자로서 확인되어 있고; IL-11은, 대조군 대상체와 비교하여, 임상적으로 단리된 증후군(CIS)을 갖는 환자의 뇌척수액에서 상승하고, IL-11의 혈청 수준은 재발-관해형 다발성 경화증을 갖는 환자의 재발시에 높아지고, IL-11은 CD4+ T 세포의 TH17 표현형으로의 분화를 촉진할 수 있고, TH17 세포는 다발성 경화증의 병인에서 중요한 세포이다[참조: Zhang et al., Oncotarget (2015) 6(32): 32297-32298].

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 염증을 특징으로 하는 질환/장애를 치료/예방하는 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 염증을 특징으로 하는 질환 또는 장애는 암 및/또는 섬유증을 직접 또는 간접적으로 유도하는 질환/장애일 수 있다. 염증을 특징으로 하는 질환은, 예를 들면, 알러지성 천식 및 기관지 염증 등의 알러지성 염증, 아토피성 피부염, 알러지성 비염 및 안구 알러지성 질환, 및 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 만성 활동성 간염, 1형 진성 당뇨병, 체강병, 그레이브병, 포도막염, 천포창, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 빈혈 및 자가면역 갑상선염 등의 자가면역 질환을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 간독성(hepatotoxicity) 및 간독성을 특징으로 하는 질환/장애를 치료/예방하는 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 간독성은 간 세포/조직의 손상 및/또는 사멸을 지칭한다. 간독성은, 특히 간 내의 간세포 세포의 사멸을 수반하는, 간에 대한 독성 손상의 상태를 지칭할 수 있다. 간독성은 하기 기재된 바와 같이 간독성의 하나 이상의 상관물을 검출함으로써 결정/진단될 수 있다. 간독성은 간독성 상해의 결과로서 발생할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "간독성 상해"는 간독성을 일으키는 임의의 치료, 사상 또는 상태를 지칭한다. 예를 들면, 간독성 상해는 화학적/물리적/경험, 또는 기체 상태에 의해 유발될 수 있다. 일부 실시형태에서, 간독성 상해는, 예를 들면, 약물-유발 간 손상의 경우에, 예를 들면, APAP-유발 간독성의 경우에 화학적이다. 일부 실시형태에서, 간독성 상해는, 예를 들면, 간 조직에 대한 외과적 손상의 결과로서 발생하는 간독성의 경우에 물리적이고, 이는, 예를 들면, 질환을 치료하기 위한 수술 및/또는 간 이식을 위해 발생할 수 있다(예를 들면, 간독성은 의원성 원인을 가질 수 있다). 일부 실시형태에서, 간독성 상해는, 예를 들면, 허혈의 결과로서 저산소증으로부터 발생하거나, 재관류로부터 발생할 수 있다(예를 들면, 간독성 상해는 IRI로부터 발생할 수 있다).

간독성은 화학물질-유발 간 손상, 예를 들면, 의약, 화학물질, 허혈, 재관류, 패혈증 또는 허브 또는 식이 보조제에 의해 유발된 손상 또는 상해일 수 있다. 일부 실시형태에서, 간독성은 약물-유발 간 손상(DILI)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 간독성은 간독소에 의해 유발된 간 손상을 지칭한다. 간독소는 알콜일 수 있다. 또한, 간독성은 독성 간염으로 불리운다. 간독성은 급성 및/또는 만성 간독성을 지칭할 수 있다.

간독성은, 직접 또는 간접적으로, 예를 들면, 만성적 알콜 섭취 등의 알콜 섭취에 의해 유발될 수 있다. 본원에서 지칭되는 간독성은, 직접 또는 간접적으로, 금식, 영양실조, 감염원(예를 들면, 간염 바이러스(예를 들면, A형, B형, C형, D형 또는 E형 간염), HIV)에 의한 감염, 암 또는 약물 상호작용에 의해 유발될 수 있다.

간독성은, 다른 장애, 질환 및 병태와 관련하여 존재할 수 있다. 간독성과 연관된 장애, 질환 또는 병태는 급성 간 손상(ALI), 급성 간 부전, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 간 손상, 간염, 예를 들면, 바이러스성 간염, 알콜성 간염, 간 허혈-재관류 손상(IRI), 예를 들면, "온(warm)" 허혈-재관류(WIR), 방사선-유발 간 질환(RILD), 약물-유발 간 손상(DILI), 자가면역 간 손상, 답즙정체성 간 질환, HIV 및 암을 포함한다.

약물-유발 간 손상(DILI)은 내재적 및 특이적 간독성을 포함하고, 특이적 DILI은 추가로 알러지성 및 비알러지성 반응을 포함한다. 내재성 메카니즘은 용량 의존성 간독성과 관련되고, 특이적 간독성은 용량 의존성이 아니고 예측할 수 없는 방식으로 발생할 수 있다. 알러지성 특이적 간독성은 추가로, 발혈, 피부 반응, 호산구 증가증, 자가항체의 형성, 및 특히 재-노출 후의 짧은 잠복 시간을 포함하는, 적응 면역계 반응에 전형적인 증상 및 징후의 존재를 특징으로 한다[참조: Khoury et al., J Clin Transl Hepatol. 2015 Jun 28; 3(2): 99-108].

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 아세트아미노펜(APAP)-유발 간독성의 진단, 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 아세트아미노펜은 또한 N-아세틸-p-아미노페놀 또는 파라세타몰로서, 또는 상표명 타이레놀 및 파나돌에 의해 공지되어 있다. 아세트아미노펜 중독은, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 등의 간세포 누출 효소의 혈청 농도의 증가, 중심엽 변성 및 괴사, 및 쿠퍼 세포의 활성화와 연관된 간독성을 야기한다[참조: Trepicchio WL et al., Toxicol Pathol. 2001; 29(2):242-9].

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 신장 손상, 예를 들면, 급성 신장 손상(AKI: 급성 신장 부전), 또는 신장 손상과 연관된 질환/장애를 치료/예방하는 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 신장 손상은, 관상 상피 세포(TEC)의 손상 및/또는 TEC의 상피-대-간엽계 세포-유사 표현형(즉, EMT)로의 전이를 특징으로 할 수 있다. TEC의 간엽계 세포-유사 표현형으로의 전이는, 예를 들면, E-카드헤린의 발현 감소, SNAIL의 발현 증가 및/또는 ACTA2의 발현 증가를 특징으로 할 수 있다. 신장 손상은 임의의 원인을 가질 수 있고, 예는 기계적(즉, 물리적) 손상 또는 상해, 화학적 손상 또는 상해, 허혈 또는 유전적 소인으로부터 발생하는 신장 손상을 포함한다. 원인 또는 손상은 통상 신장 기능의 손상을 야기할 수 있고, 이는 신부전을 유도할 수 있다. 기계적 손상 또는 상해는 대상체, 신장, TEC 또는 유족세포에 대한 물리적 손상을 포함할 수 있다. 이는 또한, 예를 들면, 요로의 관상 폐색/차단을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 신장 손상은 약물-유발 신장 손상 또는 약물-유발 급성 신장 손상이다.

허혈성 손상은, 예를 들면, 패혈증, 혈액 손실 또는 수술로 인한 저혈압, 또는, 예를 들면, 또 다른 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여된 의약 또는 약물 등의 화학 약품의 효과 등의 다수의 요인에 의해 유발될 수 있는 신장에 대한 혈류의 감소로부터 발생할 수 있다. 허혈에 의해 유발된 신장 손상은 허혈-유발 신장 손상 또는 허열-유발 급성 신장 손상일 수 있다. 압착 손상에 의해 유발된 신장 손상은 혈관 수축을 수반하는 허혈-유발 신장 손상일 수 있거나, 관상 캐스트 기계적 요인 또는 순환 요인, 예를 들면, 미오글로빈의 독성 효과에 의해 유발될 수 있다.

일부 실시형태에서, AKI일 수 있는 신장 손상은, 일부 경우에, 신장의 관상 상피 세포(TEC), 즉 신장 관상 상피 세포를 포함하거나 이의 사멸을 유도할 수 있는 손상을 특징으로 한다. TEC는 근위 또는 원위일 수 있고, 이들 둘 다는, 신장 사구체의 유족세포와 동일하게, AKI에서 손상될 수 있다. TEC에 대한 손상은 또한 임의 유형의 손상, 상해 또는 발작일 수 있고, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같이, 이는 기계적, 화학적 또는 허혈성 손상일 수 있다. TEC에 대한 손상은, 신장 손상, 특히 AKI의 일반적 원인 인자이다. TEC의 증식은 신장 기능의 회복 및 복귀를 위한 메카니즘을 제공하고, TEC 증식의 실패는, 예를 들면, 만성 신장 질환 또는 신부전으로의 질환 발증 및 진행을 유도할 수 있다. 사구체 기능을 회복하기 위해 유족세포 전구체의 증식이 또한 발생할 수 있지만, TEC 증식만큼 충분히 기재되어 있지는 않다. 기계적 손상은, 예를 들면, 편측 요관 폐쇄(UUO)를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 신장 손상은 신독성이고, 이는 신장의 독성을 지칭한다. 신독성은 신장 기능에 대한 특정 물질의 독성 효과의 결과로서 발생할 수 있고, 따라서 화학적 손상 또는 상해의 결과로서 볼 수 있다. 화학적 손상 또는 상해와 마찬가지로, 신독성은, 신장에서 발생하지 않거나 신장 및 하나 이상의 다른 조직 둘 다에서 발생하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제 투여의 부작용일 수 있다. 일부 실시형태에서, 신독성은, 암을 예방 또는 치료하기 위해 대상체에게 투여된 화학요법제 투여의 부작용일 수 있다. 따라서, 신독성은 약물-유발 신장 손상 또는 약물-유발 급성 신장 손상의 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 신장 손상은 엽산에 의해 유도될 수 있고, 즉 엽산-유발 신장 손상이다.

일부 실시형태에서, 항원-결합 분자는 시스플라틴-유발 신장 손상의 진단, 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 제공된다. 이는 시스플라틴-유발 급성 신장 손상 또는 시스플라틴-유발 신독성을 포함한다. 시스플라틴(디클로로디아미노 플라티늄; SP-4-2)-디아민디클로로플라티늄(II))은, 두경부암, 유방암, 폐암, 정소암, 난소암, 뇌암 및 방광암을 포함하는 다양한 암의 치료에 광범위하게 사용되고 관상 손상 및 괴사를 포함하는 신장 손상 및 기능부전을 유도하는 것으로 광범위하게 공지되어 있는 화학요법제이다[참조: 예를 들면, Oh et al., Electrolyte Blood Press 2014 Dec; 12(2): 55-65; PA Arunkumar et al., Asian Pac J Trop Biomed 2012 Aug 2(8): 640-644]. 기타 플라티늄-기반 화학요법제는 또한 신장 손상을 유발한다.

신장 손상을 갖는 대상체는 또한, 분리가능한 병인을 갖는 질환 상태로서 또는 신장 손상의 이차 효과로서 신장의 섬유증을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 진단, 치료 또는 예방되는 신장 손상은 신장의 섬유증, 예를 들면, 신장 섬유증이 아니다. 일부 실시형태에서, 대상체는 섬유증을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, TEC 손상은 섬유증의 부재하에 발생한다. 일부 실시형태에서, 섬유증은, 예를 들면, TEC의 불완전한 재생에 기인하여, AKI와 별도로 발생한다(예를 들면, 이차적으로). 일부 실시형태에서, 대상체에서 손상된 TEC는 섬유화촉진 TEC가 아니다. 일부 실시형태에서, 섬유증은 발생하지 않는다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 항원-결합 분자는, 감염과 연관된 질환/장애, 특히 감염이 섬유증, 암 또는 염증을 직접 또는 간접적으로 유도하는 질환/장애를 치료/예방하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 감염과 연관된 질환은, 관련 감염원에 의한 감염에 의해 야기되거나 악화되는 질환일 수 있거나, 관련 감염원에 의한 감염이 위험 인자인 질환일 수 있다.

감염은 임의의 감염 또는 감염성 질환, 예를 들면, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염일 수 있다. 특정 실시형태에서, 질환/장애는 바이러스 감염과 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, 이러한 감염이 염증, 암 및/또는 섬유증과 연관되는 만성/지속성 감염을 치료하는 것이 특히 바람직할 수 있다.

감염은 만성, 지속성, 잠재성 또는 지연성일 수 있고, 박테리아. 바이러스, 진균 또는 기생충 감염의 결과일 수 있다. 이와 같이, 치료는 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 갖는 환자에게 제공될 수 있다. 박테리아 감염의 예는 폐의 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 의한 감염을 포함한다. 바이러스 감염은 EBV, HPV, HIV, B형 간염 또는 C형 간염에 의한 감염을 포함한다.

치료는 IL-11 신호전달과 연관된 임의 질환/장애/병태를 개선, 치료 또는 예방하는 것을 포함하고/하거나, 본원에 기재된 바와 같이, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 생물학적 활성을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 치료는, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 억제함으로써 질환/장애의 역전 또는 퇴행을 포함할 수 있다. 이러한 방법은, 본 발명에 따르는 항체/단편/조성물을 투여하여, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체에 결합시키고 이의 생물학적 활성을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 생물학적 활성을 억제하는 것은 "중화"로서 지칭될 수도 있다.

치료 방법은, 임의로, 암을 치료하는 약제(예를 들면, 화학요법), 방사선 또는 수술에 의한 치료 등의 암을 치료하는 통상의 요법과 조합하여 생물학적 애주번트(예를 들면, 인터류킨, 사이토킨, 바실루스 코메테-구에린, 모노포스포릴 지질 A 등)의 동시-투여를 포함할 수 있다. 의학적 치료 방법은 또한, 자가 및/또는 이종성 세포 또는 면역화 세포주를 사용하는 것들을 포함하여, 생체내, 생체외 및 양자 면역요법을 포함할 수 있다.

치료는, 과활성/상승된 IL-11 매개 신호전달과 연관된 질환/장애의 예방을 목적으로 할 수 있다. 따라서, 항체, 항원 결합 단편 및 폴리펩티드는 약제학적 조성물 및 의약을 제형화하기 위해 사용될 수 있고, 대상체는 질환 상태의 증상의 발증에 대해 예방적으로 치료될 수 있다. 이는, 질환 상태의 증상의 발증 전에 발생할 수 있고/있거나, 질환 또는 장애의 위험이 높은 것으로 고려되는 대상체에게 제공될 수 있다.

본 개시내용에 따르는 약제의 투여는, 바람직하게는 "치료학적으로 유효한" 또는 "예방학적으로 유효한" 양이고, 이는 대상체에서 이익을 나타내기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 시간-경과는 질환/병태의 성질 및 중증도 및 약제의 성질에 의존한다. 치료 처방, 예들 들면, 용량 등의 결정은 일반 개업의 및 기타 의사의 책임 범위 내이고, 통상 치료되는 질환/병태, 개개 대상체의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 개업의에게 공지된 기타 인자를 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 발견할 수 있다.

본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 조성물은 바람직하게는 당해 기술분야에 공지된 하나 이상의 기타 약제학적으로 허용되는 성분과 함께 의약 또는 약제로서 제형화되고, 이는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제, 희석제, 충전제, 완충제, 방부제, 항-산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제(예를 들면, 습윤제), 마스킹제, 착색제, 향미제 및 감미제를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제 또는 합병증이 없고, 합리적 이익/위험 비율에 상응하는, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 해당 대상체(예를 들면, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 성분, 재료, 조성물, 용량 형태 등에 관한 것이다. 각각의 담체, 보조제, 부형제 등은 또한 제형의 다른 성분과 적합성이 있다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 적합한 담체, 보조제, 부형제 등은 표준 의약품 텍스트, 예를 들면, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 발견할 수 있다.

제형은, 치료되는 질환/병태에 적합한 투여를 위해 제조할 수 있다. 예를 들면, 제형은 국소, 비경구, 전신, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내, 안내, 국소 안(예를 들면, 결막하, 유리체내, 안구후, 전방내), 결막내, 피하, 경구, 또는 주사를 포함할 수 있는 경피 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 제제는 유체 또는 고체 형태로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인간 또는 동물 신체의 선택된 영역으로의 주사 또는 주입에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사가능한 제형은 멸균 또는 등장성 배지에 선택된 제제를 포함할 수 있다.

제형은 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 방법은, 활성 화합물을, 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 담체(예를 들면, 액체 담체, 미분된 고체 담체 등)과 균일하게 및 친밀히 결합시키고, 이어서 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조된다.

본 발명에 따르면, 이 방법은 약제학적으로 유용한 조성물의 제조에 제공되고, 이러한 제조 방법은, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 단리하는 단계; 및/또는 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 추가의 태양은 의학적 치료 방법에서 사용하기 위한 의약 또는 약제학적 조성물을 제형화 또는 제조하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약제학적 조성물 또는 의약을 제형화하는 것을 포함한다.

복수 용량의 항원 결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물이 제공될 수 있다. 하나 이상 또는 각각의 용량은 또 다른 치료제의 동시 또는 연속 투여를 수반할 수 있다.

복수 용량은, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 중의 하나이도록 선택될 수 있는, 소정 시간 간격으로 분리할 수 있다. 예를 들면, 용량은 7일, 14일, 21일 또는 28일당 1회(±3, 2 또는 1일) 제공될 수 있다.

본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 조성물은 단독으로, 또는 다른 치료적 또는 예방적 개입과 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 다른 치료적 또는 예방적 개입은 본 개시에 의해 포함된 치료의 전, 동안 및/또는 후에 발생할 수 있고, 다른 치료적 또는 예방적 개입은 본 개시내용의 치료와 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 발생할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 및 조성물의 투여는, 감염을 치료 또는 예방하기 위한 제제(예를 들면, 항생물질, 항-바이러스제, 항진균제 또는 항-기생충제)를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 분자 또는 조성물에 의한 치료는 염증을 치료 또는 예방하기 위한 제제(예를 들면, 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID))를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 분자 또는 조성물에 의한 치료는 방사선요법(즉, 이온화 방사선, 예를 들면, X-선 또는 γ-선에 의한 치료) 및/또는 암을 치료 또는 예방하기 위한 제제(예를 들면, 화학요법제)를 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 알킬화제, 예를 들면, 시스플라틴이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 조성물은 면역요법과의 병용 요법의 일부로서 투여될 수 있다.

동시 투여는, 예를 들면, 제제를 함유하는 약제학적 조성물로서(즉, 조합 제제) 또는 서로 직후에 및 임의로 동일한 투여 경로를 통해, 예를 들면, 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관에 제제를 함께 투여하는 것을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 동시 투여시, 2개 이상의 제제는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동시 투여는 동일한 시간 또는, 예를 들면, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 내의 투여를 지칭한다.

연속 투여는, 하나 이상의 제제의 투여, 이어서 소정 시간 간격 후에, 또 다른 제제의 투여를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 2개 제제를 동일한 경로에 의해 투여할 필요는 없지만, 일부 실시형태에서는 그러한 경우가 있다. 시간 간격은, 시간, 일, 주, 개월 또는 년을 포함하는 임의의 시간 간격일 수 있다. 일부 실시형태에서, 연속 투여는 적어도 10분, 30분, 1시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일 1주, 2주, 3주, 1개월, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 중 하나의 시간 간격으로 분리된 투여를 지칭한다.

검출 방법

본 발명은 또한, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체, 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포를 검출, 국재화 또는 영상화하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 물품을 제공한다. 본원에 기재된 항원-결합 분자는, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체에 대한 항원-결합 분자의 결합을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 결합된 복합체의 검출을 포함할 수 있다.

IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 검출은, IL-11 매개 신호전달 및/또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포가 병리학적으로 관련되어 있는 질환/병태를 진단/예후하고, 이러한 질환/병태를 발증할 위험에 있는 대상체를 확인하는 방법에 유용할 수 있고/있거나, 치료적 개입에 대한 대상체의 반응을 예후하는 방법에 유용할 수 있다.

이와 같이, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체, 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기재된 항원-결합 분자와 접촉하는 단계, 및 항원-결합 분자와 IL-11Rα/IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또한, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기재된 항원-결합 분자와 접촉하는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 발현/포함하는 세포와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

적합한 방법 포맷은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 샌드위치 검정, 예를 들면, ELISA 등의 면역검정을 포함한다. 이 방법은 항원-결합 분자 또는 표적(들) 또는 이들 둘 다를 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 형광 표지, 인광 표지, 발광 표지, 면역-검출가능한 표지, 방사선표지, 화학적, 핵산 또는 효소적 표지로 표지하는 것을 포함할 수 있다. IL-11Rα 발현은, 예를 들면, 생검에 의해 수득된 조직 샘플의 면역조직화학(IHC)에 의해 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표지는, 방사선-뉴클레오티드, 양전자-방출 방사성핵종(예를 들면, 양전자 방출 단층촬영(PET)), MRI 조영제 또는 형광 표지로부터 선택될 수 있다.

검출 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 표지제에 상응하도록 선택될 수 있다. IL-11/IL-11R 신호전달에 의해 매개된 프로세스의 시험관내 또는 생체내 분석은, 예를 들면, 적절하게 표지된 종의 검출에 의해, 양전자 방출 단층촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI) 또는 형광 영상화에 의한 분석을 포함할 수 있다.

이러한 종류의 방법은, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 검출 및/또는 정량화를 필요로 하는 질환 또는 병태의 진단 방법의 기초를 제공할 수 있다. 이러한 방법은 대상체 샘플에 대해 시험관내에서 수행할 수 있거나, 대상체 샘플의 처리 후에 수행할 수 있다. 샘플이 수집되면, 대상체는 수행되는 시험관내 진단 방법을 위해 존재할 필요가 없고, 따라서 이 방법은 인간 또는 동물 신체에서 실시되지 않는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따르는 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물은 본원에 기재된 진단, 검출 또는 정량화의 임의의 방법에서 사용하기 위해 제공된다.

이러한 방법은, 예를 들면, 환자 샘플에서, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체, 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현하는 세포를 검출 또는 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법이 관련 인자를 정량화하는 것을 포함하는 경우, 이 방법은, 진단 또는 예후 평가의 일부로서, 결정된 양을 표준 또는 참조 값과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 다른 진단/예후 시험은, 진단 또는 예후의 정확도를 증강시키거나 본원에 기재된 시험을 사용하여 수득된 결과를 확인하기 위해, 본원에 기재된 것들과 조합하여 사용할 수 있다.

IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 샘플에서의 검출은, 대상체에서 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 암성 병태의 진단, 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 암성 병태에 대한 예후의 진단, 또는 감염성 질환, 자가면역 질환 또는 암성 병태의 예후(예후 진단)를 제공할 목적으로 사용될 수 있다. 진단 또는 예후는, 기존(이전에 진단된) 감염성, 염증성 또는 자가면역 질환/장애 또는 암성 병태와 관련될 수 있다.

증가된 수준의 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체가 검출되는 경우, 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 존재(또는 증가된 수/비율)가 대상체로부터 수득된 샘플에서 검출되는 경우, 대상체는 본 개시내용에 따르는 질환/병태를 갖거나 이러한 질환/병태를 발증할 위험이 있는 것으로 진단될 수 있다. 이러한 방법에서, 세포의 "증가된" 수준의 발현 또는 수/비율은, 예를 들면, 건강한 대상체로부터 수득된 비교가능한 샘플(예를 들면, 동일한 유체, 조직, 기관 등으로부터 수득된, 예를 들면, 동일한 종류의 샘플)에서 검출된 수준/수/비율 등의 적절한 대조군 조건에 대해 결정된 수준/수/비율보다 큰 수준/수/비율을 지칭한다.

증가된 수준의 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체가 검출되는 경우, 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 세포의 존재(또는 증가된 수/비율)가 대상체로부터 수득된 샘플에서 검출되는 경우, 대상체는, 비교가능한 샘플(예를 들면, 동일한 유체, 조직, 기관 등으로부터 수득된, 예를 들면, 동일한 종류의 샘플)에서, 낮은 수준의 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현/포함하는 낮은 수/비율의 세포를 갖는 것으로 결정된 대상체와 비교하여, 불량한 예후를 갖는 것으로 결정될 수 있다.

따라서, 본 발명은, 본 발명에 따르는 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산, 발현 벡터, 세포 또는 조성물로 치료하기 위한 대상체를 선택/계층화하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 본 발명에 따르는 치료/예방을 위해 선택되거나, 예를 들면, 대상체로부터 수득된 샘플에서, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체, 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현하는 세포의 검출/정량화에 기초하여, 이러한 치료/예방으로부터 이익을 받을 수 있는 대상체로서 확인된다. 대상체 샘플에 존재하는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 수준은, 대상체가 본 발명에 따르는 항원-결합 분자 또는 조성물에 의한 치료에 반응할 수 있는지를 나타낼 수 있다. 샘플 중에 높은 수준의 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 존재는 본원에 기재된 치료를 위해 대상체를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원-결합 분자는 IL-11Rα-표적화된 요법에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는데 사용할 수 있다.

샘플은 임의의 조직 또는 체액으로부터 채취할 수 있다. 샘플은, 소정량의 혈액; 피브린 응고 또는 혈액 세포의 제거 후에 수득된 혈액의 유체 부분을 포함할 수 있는 개개 혈액으로부터 유래하는 소정량의 혈청; 조직 샘플 또는 생검; 뇌척수액(CSF); 또는 개체로부터 단리된 세포를 포함하거나 이들로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은, 질환/장애(예를 들면, 질환의 증상이 나타나거나, 질환/장애의 병인에 관여하는 조직 또는 조직들)에 의해 영향을 받는 조직 또는 조직들로부터 수득하거나 유래할 수 있다.

본 발명에 따른 진단 또는 예후 방법은, 대상체로부터 수득된 샘플에 대해 수행할 수 있거나, 대상체로부터 수득된 샘플의 처리 후에 수행할 수 있다. 샘플이 수집되면, 환자는 수행되는 시험관내 진단 또는 예후의 방법을 위해 존재할 필요가 없고, 따라서 이 방법은 인간 또는 동물 신체에서 수행되지 않는 것이다. 용어 "시험관내"는 배양 중의 세포를 사용한 실험을 포함하는 것을 의도하고, 용어 "생체내"는 무손상 다세포 생물을 사용한 실험 및/또는 치료를 포함하는 것을 의도한다.

본 발명의 진단 및 예후 방법은, 질환 및/또는 치료의 전체 과정의 복수 시점에서 대상체로부터 수득된 샘플에 대하여 수행할 수 있고, 예를 들면, 대상체에게 투여된 치료에 반응하여, 경시적으로 질환/병태의 진행을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법에 따르는 특성평가의 결과를 사용하여, 대상체에 대해 언제 및 어느 종류의 요법을 투여할지에 대한 임상적 결정을 알려줄 수 있다.

대상체

본원에 기재된 발명의 태양에 따르는 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 비-인간 포유동물일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 치료를 필요로 하는 질환 또는 병태(예를 들면, 암)로 진단되었거나, 이러한 질환/병태를 갖는 것으로 의심되거나, 이러한 질환/병태를 발달/발증할 위험에 있을 수 있다.

대상체/환자는, IL-11 매개 신호전달의 수준 감소(즉, 억제 또는 길항작용), 또는 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 발현하는 세포의 수 및/또는 활성의 감소로부터 치료적 또는 예후적 이익을 유도할 수 있는 질환/장애를 가질 것이다. 대상체/환자는 본원에 기재된 질환/장애를 가질 수 있다. 대상체/환자는 치료를 필요로 하는 본원에 기재된 바와 같은 질환/장애로 진단되었거나, 이러한 질환/장애를 갖는 것으로 의심되거나, 이러한 질환/장애를 발증할 위험에 있을 수 있다.

본 발명에 따르는 실시형태에서, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 일부 실시형태에서, 본원 발명의 치료적 또는 예방적 방법에 따라 치료되는 대상체는 암을 갖거나 암을 발증할 위험에 있는 대상체이다. 본 발명에 따르는 실시형태에서, 대상체는, 이러한 질환/병태의 특정 마커의 특성평가에 기초하는 방법에 따라 치료를 위해 선택될 수 있다.

키트

본원에 기재된 발명의 일부 태양에서, 부품의 키트(kit of parts)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물의 소정 양을 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트는, 본원에 기재된 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물을 생산하기 위한 재료를 포함한다.

키트는, 특정 질환/병태를 치료하기 위해 환자에게 투여하기 위한 지침과 함께 항원-결합 분자, 폴리펩티드, CAR, 핵산(또는 이의 복수), 발현 벡터(또는 이의 복수), 세포 또는 조성물을 제공할 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트는, 소정량의 또 다른 치료제(예를 들면, 항-감염제 또는 화학요법제)를 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 키트는 또한, 2개 의약 또는 약제학적 조성물이 동시에 또는 별도로 투여되어 이들이 특정 질환 또는 병태에 대한 병용 치료를 제공하도록, 제2 의약 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 치료제는 또한 종양 또는 혈액에 대한 주사 또는 주입에 적합하도록 제형화할 수 있다.

서열 동일성

본원에 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은, 서열 사이의 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬시키고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후에, 참조 서열 중의 뉴클레오티드/아미노산 잔기와 동일한 대상 서열 중의 뉴클레오티드/아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭한다. 2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 목적으로 쌍별 및 다중 서열 정렬은, 예를 들면, ClustalOmega(Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960), T-coffee(Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217), Kalign(Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)) 및 MAFFT(Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780) 소프트웨어 등의 공적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우, 예를 들면, 갭 페널티 및 확장 패널티를 위한 디펄트 파라미터를 사용하는 것이 바람직하다.

서열

본 발명의 태양 및 실시형태에 관한 넘버링 단락(파라):

1. IL-11Rα에 결합할 수 있는, 임의로 단리된, 항원-결합 분자로서,

항원-결합 분자가

(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및

(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3

을 포함하는, 항원-결합 분자.

2. 단락 1에 있어서, 항원-결합 분자가

(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및

(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3

을 포함하는, 항원-결합 분자.

3. 단락 1에 있어서, 항원-결합 분자가

(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:

서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1

서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2

서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및

(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:

서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1

서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2

서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3

을 포함하는, 항원-결합 분자.

4. 단락 1 내지 3 중의 어느 하나에 있어서, 항원-결합 분자가

서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및

을 포함하는, 항원-결합 분자.

5. 단락 1 내지 4 중의 어느 하나에 있어서, 항원-결합 분자가 IL-11 매개 신호전달을 억제할 수 있는, 항원-결합 분자.

6. (i) 단락 1 내지 5 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자 및 (ii) IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함하는, 임의로 단리된, 항원-결합 분자.

7. 단락 1 내지 6 중의 어느 하나에 있어서, 항원-결합 분자가 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있는, 항원-결합 분자.

8. 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).

9. 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자 또는 단락 8에 따르는 CAR을 코딩하는, 임의로 단리된, 핵산 또는 복수의 핵산.

10. 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산을 포함하는, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터.

11. 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자, 단락 8에 따르는 CAR, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 또는 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 포함하는, 세포.

12. 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터 항원-결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건하에서, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산 또는 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.

13. 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자, 단락 8에 따르는 CAR, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 또는 단락 11에 따르는 세포를 포함하는, 조성물.

14. 의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자, 단락 8에 따르는 CAR, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 단락 11에 따르는 세포, 또는 단락 13에 따르는 조성물.

15. 섬유증, 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 또는 염증을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자, 단락 8에 따르는 CAR, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 단락11에 따르는 세포, 또는 단락 13에 따르는 조성물.

16. 섬유증, 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 또는 염증을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에서, 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자, 단락 8에 따르는 CAR, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 단락11에 따르는 세포, 또는 단락 13에 따르는 조성물의 용도.

18. 치료학적 또는 예방학적 유효량의 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자, 단락 8에 따르는 CAR, 단락 9에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 단락 10에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 단락 11에 따르는 세포 또는 단락 13에 따르는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 섬유증, 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 또는 염증을 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.

19. IL-11Rα-발현 세포를 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, IL-11 매개 신호전달을 억제하는 방법.

20. IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체에 결합된 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자를 포함하는, 임의로 단리된, 시험관내 복합체.

21. IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자와 접촉하는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.

22. IL-11Rα-표적화 제제로 치료하기 위한 대상체를 선택 또는 계층화하는 방법으로서, 상기 방법은, 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플을 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자와 접촉하는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.

23. 시험관내 또는 생체내 진단 또는 예후 제제로서의 단락 1 내지 7 중의 어느 하나에 따르는 항원-결합 분자의 용도.

***

본 발명은, 이러한 조합이 명백하게 불투과성이거나 명시적으로 회피되는 경우를 제외하고는, 기재된 태양 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.

본원에서 사용된 섹션 제목은 구조적 목적만을 위한 것이고, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명의 태양 및 실시형태는, 첨부 도면을 참조하여, 예로서 설명한다. 추가의 태양 및 실시형태는 당해 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다. 이 텍스트에 언급된 모든 문서는 참조에 의해 본원에 도입된다.

이하의 특허청구범위를 포함하는 본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 변형 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은, 지정된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해되지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제하는 것은 아니다.

본 명세서 및 첨부 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게는, 값이 근사치로서 표현되는 경우, 선행어 "약"의 사용에 의해, 특정 값이 또 다른 실시형태를 형성하는 것으로 이해된다.

핵산 서열이 본원에 개시되는 경우, 이의 역 보체도 또한 명시적으로 고려된다.

본원에 기재된 방법은 바람직하게는 시험관내에서 수행될 수 있다. 용어 "시험관내"는 배양 중의 세포를 사용하여 수행되는 절차를 포함하는 것으로 의도되고, 용어 "생체내"는 무손상 다세포 생물을 사용하여/이에 대한 절차를 포함하는 것으로 의도된다.

이제, 본 발명의 원리를 설명하기 위한 실시형태 및 실험은 첨부 도면을 참조하여 설명한다.
도 1. 17 항-인간 IL-11Rα 항체 클론을 요약한 표.
도 2. 항-IL-11Rα 항체의 존재하에, TGFβ1로 자극한 후, 대조군(비자극된) 섬유아세포와 비교하여, αSMA 양성 세포의 퍼센트의 배수 변화에 의해 결정된 바와 같이, 인간 심방 섬유아세포에서 시험관내에서 IL-11에 의해 매개된 신호전달의 항-IL-11Rα 항체에 의한 억제를 나타내는 막대 차트.
도 3. 항-IL-11α 항체의 존재하에, TGFβ1로 자극한 후, 대조군(비자극된) 섬유아세포와 비교하여, αSMA 양성 세포 퍼센트의 배수 변화에 의해 결정된 바와 같이, 마우스 심방 섬유아세포에서 시험관내에서 IL-11에 의해 매개된 신호전달의 항-IL-11α 항체에 의한 억제를 나타내는 막대 차트.
도 4. 항-IL-11α 항체의 존재하에, 하이퍼 IL-11로 자극한 후, 대조군(비자극된) 섬유아세포와 비교하여, 세포 배양 상청액 중의 MMP2 양의 배수 변화에 의해 결정된 바와 같이, 인간 심방 섬유아세포에서 시험관내에서 하이퍼 IL-11에 의해 매개된 IL-11 트랜스 신호전달의 항-IL-11α 항체에 의한 억제를 나타내는 막대 차트.
도 5. 항-IL-11α 항체에 대한 도 2 내지 4의 배수-변화 데이터를 요약한 표. 1 내지 17로 넘버링된 항체 후보는 도 1에 나타낸 바와 같은 클론 명칭에 상응한다. "산업 표준"은 모노클로날 항-IL-11 IgG2A(클론 #22626; 카탈로그 번호 MAB218; R&D Systems, MN, USA)이다.
도 6a 및 6b. 하이퍼 IL-11에 반응하여 섬유아세포 활성화를 나타내는 그래프. 세포는 하이퍼 IL-11 또는 재조합 IL-11의 지시된 양(ng/ml)으로 자극시키고, 섬유아세포 활성화는 α-SMA 양성 세포 퍼센트의 분석에 의해 측정했다. (6a) 및 (6b)는 2개 상이한 실험의 결과를 나타낸다.
도 7. 하이퍼 IL-11에 의한 초대 섬유아세포에서 IL-11 분비의 유도를 나타내는 그래프. 세포는 하이퍼 IL-11로 자극시키고, IL-11 RNA 및 천연 IL-11 단백질 수준은 지시된 시점에서 ELISA에 의해 세포 배양 상청액에서 측정했다.
도 8a 내지 8h. 8a 및 8b: iQue 분석에 의해 결정된 바와 같이, 인간 IL-11α에 대한 마우스-항-IL-11α 항체의 결합을 나타내는 표 및 막대 차트. (8a) 실험의 결과를 요약한 표. (8b) 양성 대조군 항-FLAG 항체(100%)와 비교하여 결합의 강도를 나타내는 표; 넘버는 도 1에 나타낸 클론에 상응한다. 8c 및 8d: IL-11α에 특이적으로 결합하여 인간(8c) 및 마우스(8d) 섬유아세포 활성화를 중화하는 항체의 능력을 나타내는 그래프. 100% 억제는 비자극된 섬유아세포의 수준을 나타내고, 0%는 완전히 활성화된 섬유아세포를 나타낸다. 8e 및 8f: IL-11α에 결합하고, 상호작용으로부터 내인적으로 생성된 IL-11을 차단하고 인간 심방 섬유아세포(8e)에서 섬유형성 단백질 MMP2 및 TIMP1의 생성을 억제하는 항-IL-11α 항체 5E5, 9A7 및 13B10의 능력을 나타내는 그래프. (8f)는 항체가 트랜스 IL-11 신호전달을 중화하는 것을 확인한다. (8g)는 9A7이 외인성 또는 내인성 IL-11 또는 하이퍼 IL-11을 차단하고 마우스 심장 섬유아세포에서 시스 및 트랜스 IL-11 신호전달을 중화시키고 섬유형성 단백질 생산을 억제하는 것을 나타낸다. (8h)는 내인성 IL-11(상부) 또는 외인성 IL-11(하부)에 의해 유도된 인간 간 성상 세포에서 섬유형성 단백질(MMP2) 생산을 억제하는 9A7의 능력을 나타낸다.
도 9a 및 9b. 신장 섬유증의 마우스 모델에서 상이한 처리를 받은 마우스의 신장 절편의 조직학적 분석의 결과를 나타내는 이미지 및 그래프. 신장 섬유증은, 비히클(0.3M NaHCO₃) 마우스에 엽산(FA, 180mg/kg)의 복강내(IP) 주사에 의해 유발했고; 대조군 마우스는 비히클 단독을 투여했다. 마우스는, 엽산 손상후 1일부터 실험 동안 이소형 대조군 IgG2(20mg/kg, 3×1주당, 복강내), 항-IL-11Ra 항체(20mg/kg, 3×1주당, 복강내)를 투여했다. 동물은 엽산-유발 신장 손상의 28일 후에 희생시키고, 매슨(Masson) 트리크롬 염색을 사용하여 섬유증에 대해 조직학적으로 분석했다. (9a) 매슨 트리크롬 염색된 신장 절편의 이미지. 콜라겐을 함유하는 섬유성 영역은 보다 밝게 보이는 건강한 영역과 비교하여 어둡게 보인다. (9b) 총 신장 면적의 퍼센트(%)로서 콜라겐 면적의 절반-정량 분석을 나타내는 그래프. ***, FA+IgG, ANOVA와 비교하여 P< 0.001.
도 10a 및 10b. (10a) 신장 섬유증의 마우스 모델에서 상이한 처리를 받은 마우스의 뇨중 알부민/크레아틴 비율을 나타내는 그래프. 신장 섬유증은 비히클(0.3M NaHCO₃) 마우스에서 엽산(FA, 180mg/kg)의 복강내(IP) 주사에 의해 유발했고; 대조군 마우스는 비히클 단독을 투여했다. FA 처리 마우스는 엽산 손상후 1일부터 실험 동안 이소형 대조군 IgG2(20mg/kg, 3×1주당, 복강내) 또는 항-IL11Ra 항체(20mg/kg, 3×1주당, 복강내)를 투여했다. 마우스를 대사 케이지에 넣고, 뇨중 크레아틴 및 알부민을, 제조업자의 지시에 따라 시판 검정(Abcam)을 사용하여 측정했다. ***, FA+IgG, ANOVA와 비교하여 P< 0.001. (10b) 마우스 모델에서 엽산-유발된 신장 섬유증에서 신장 콜라겐 함량에 대한 항-IL-11α 항체의 용량-의존적 효과를 나타내는 그래프.
도 11a 및 11b. 급성 신장 손상의 마우스 모델에서 상이한 처리를 받은 마우스의 신장 절편의 조직학적 분석의 결과를 나타내는 이미지 및 그래프. (11a) 마우스는, 모의 수술 또는 1개 뇨관의 뇨관 폐색에 의해 처리했다. 마우스는 IgG, 항-IL-11Ra 항체(수술일 -1, 1, 3, 5일에 20mg/kg)을 제공받았고, 손상된 신장(UUO IgG, IL-11Ra) 또는 대측(Con) 손상되지 않은 신장(Con IgG, IL-11)을 수술후 7일에 수거했다. (11b) 관상 손상의 절반-정량 평가는, 실험 조건에 대해 블라인드된 캐스트, 관상 위축 또는 관상 확장의 조직학적 분석에 의해 결정했다(관상 손상 스코어: 0, 없음; 1, 최소; 2, 경도; 3, 중등도; 4, 중도). *, UUO IgG, ANOVA와 비교하여 P<0.05 .
도 12a 및 12b. 심장 섬유증의 마우스 모델에서 상이한 처리를 받은 마우스의 심장 섬유증의 조직학적 분석의 결과를 나타내는 이미지 및 막대 차트. 마우스(C57Bl6, 수컷, 8-12주령)는 섬유증-유발 횡 대동맥 수축(TAC) 또는 모의 수술을 받았다. TAC-처리 동물은 대조군 항체(20mg/kg, 3×/주, 복강내) 또는 중화 항-IL-11Ra 항체(20mg/kg, 3×/주, 복강내)를 제공받았다. 2주 후, 심장을 수거하고, 매슨 트리크롬 염색(12a)을 사용하여 섬유증 정도를 평가했다. (12b)는, Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 하이드록시프롤린의 비색 검출에 의해 결정된 바와 같이, 심장에서 총 콜라겐의 양을 나타낸다. **, P<0.01; ns, SHAM에 대해 유의성 없음. #, P<0.05, TAC+IgG 대조군 대 TAC+항-IL11RA. Ab, 항체.
도 13a 내지 13h. HSC 및 IL-11 사이의 관계를 나타내는 그래프. (13a) TGFβ1으로 자극한 간 성상 세포(HSC)에서 IL-11 발현; FC: 배수 변화. (13b) HSC에서 IL6R, gp130 및 IL11RA 발현; TPM: 100만당 전사물. (13c) 건강한 개체 및 NASH를 앓고 있는 환자의 인간 간 샘플로부터 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 IL-11 발현의 밀도측정을 나타내는 그래프. (13d, e) 자극 없이(-), 또는 TGFβ1, PDGF 또는 IL-11 자극하에 HSC의 인큐베이션 후의 (13d) ACTA2^+ve 세포 및 (13e) 콜라겐 I 면역염색의 자동화 형광 정량화를 나타내는 그래프. (13f) TGFβ1, PDGF 또는 IL-11로 자극시킨 HSC의 콜라겐 분비 상청액을 나타내는 그래프(시리우스 레드 검정). (13g) IL-11에 의해 유발된 HSC의 용량-의존적 마트리겔 침윤. (13h) 상대적 간 하이드록시프롤린 함량, 섬유화촉진 마커의 mRNA 발현, 및 21일 동안 IL-11을 매일 투여한 마우스로부터 혈청 ALT 수준을 나타내는 그래프. FC: 배수 변화.
도 14a 내지 14d. 초기 단계 NASH의 마우스 모델(E-F)에서 근섬유아세포에 대한 HSC 활성화 및 HSC 침윤 능력(A-D)에 대한 항-IL-11Rα 항체의 효과를 나타내는 차트. (14a) TGFβ1로 자극하고 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 HSC 배양물에서 ACTA2^+ve 세포 수. (14b) PDGF(20ng/ml), CCL2(5ng/ml), 안지오텐신 II(100nM), bFGF(10ng/ml) 또는 H₂O₂(0.2mM)로 자극하고 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 HSC 배양물에서 ACTA2^+ve 세포 수. (14c) PDGF- 및 CCL2-유발 HSC 침윤에 대한 항체 및 IgG 대조군의 효과. (14d) 자극된 HSC 배양물에 의한 콜라겐 I 생산에 대한 항-IL-11Rα 항체의 효과. (14e 및 14f) HFMCD 식이에 의해 마우스에서 유발된 초기 단계 NASH에서 ALT 수준 및 콜라겐 생산에 대한 항-IL-11Rα 항체의 효과.
도 15a 내지 15d. 진행된 NASH의 마우스 모델에서 항-IL-11Rα 항체의 치료 효과. (a-c) NASH는 고지방 메티오닌/콜린 결핍(HFMCD) 식이에 의해 6주 동안 자극하고, 이어서 격주로 4주간 항-IL-11Rα 항체 처리로 처리했다. IgG를 대조군으로 사용했다. (15a) 마우스 간 ERK 활성화 상태의 웨스턴 블롯. (15b) 상대적 간 하이드록시프롤린 함량. (15c) 혈청 ALT 수준. (15d) NASH는 스트렙토조토신의 단일 피하 주사에 의해 자극하고, 마우스는 4주 동안 정상 고형사료 식이로, 이어서 7주 동안 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군과 함께 HFMCD 식이를 공급했다. 그래프는 7주 후 섬유증 및 염증 유전자의 RNA 발현을 나타낸다.
도 16. 간 섬유증에 대한 항-IL-11Rα 요법의 역전 효과. 중증 간 섬유증은 HFMCD 식이로 10주 동안 마우스에서 확립하고, 이어서 마우스는, 여전히 HFMCD 식이와 함께, 6주 동안 1주 2회 식이 + 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG(20mg/kg)으로 처리했다. (16a) 총 간 하이드록시프롤린 함량.
도 17a 내지 17e. TGFβ1 또는 PDGF에 의해 72시간 동안 자극한 후, 진행중의 TGFβ1 또는 PDGF 자극의 존재하에 24시간 동안 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 형질전환 HSC에 대한 항-IL-11Rα 요법의 효과. (17a) TGFβ1, 이어서 항체로 처리한 후, 처리 스케쥴 및 ACTA2^+ve 세포 퍼센트의 정량화. (17b) PDGF, 이어서 항체에 의한 처리 후, ACTA2^+ve 세포 퍼센트 정량화(17A에서와 같은 처리 스케쥴). (17c) TGFβ1, 이어서 항체에 의한 처리 후, 분비된 콜라겐의 양. (17d) PDGF, 이어서 항체에 의한 처리 후, 분비된 콜라겐의 양. (17e) TGFβ1, 이어서 항체에 의한 처리 후의 ERK 활성. (A-D) 데이터는 중앙(중앙 선), 제25-제27 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(위스커)를 갖는 박스-및-위스커로서 제시되어 있다.
도 18a 내지 18k. 1주 동안 HFMCD 식이, 이어서 5주 동안 식이 + 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG를 사용하여 마우스에서 확립한, 초기 단계 NASH에서 항-IL-11Rα 요법의 효과. (18a) IgG 또는 항-IL-11Rα 처리 5주 후, 대표적 총 간 이미지 및 간의 대표적 매슨 트리크롬 염색된 이미지. (18b) 처리 5주 후의 간 트리글리세라이드 수준. (18c) 혈청 ALT 수준. (18d) 혈청 ALT 수준의 역전에 대한 3주 항-IL-11Rα 요법의 용량-의존적 효과. (18e) 간 하이드록시프롤린 함량. (18f) 총 하이드록시프롤린 함량에 대한 항-IL-11Rα 요법의 용량 의존적 효과. (18g) 치료 5주 후의 간 ERK 포스포릴화. (18h) 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군에 의한 처리 후, 정상 고형사료 식이를 섭취한 마우스 및 HFMCD 식이를 섭취한 마우스에서 섬유화촉진 및 염증 유전자 Z-스코어의 차등 발현 히트맵. (18i) 염증유발성 유전자의 RNA 발현. (18j) 섬유화촉진 유전자의 RNA 발현. (18k) 항-IL-11Rα 항체가 IgG와 비교하여 간 지질 대사를 개선시켰음을 나타내는 지방생성 및 β-산화 유전자의 차등 발현 히트맵.
도 19a 내지 19c. 간 염증 세포 모집단에 대한 초기 단계 NASH 모델에서 항-IL-11Rα 요법의 효과. (19a) CD45^+ve 면역 세포 수. (19b) 총 CD45^+ve 모집단에서 Ly6C^+ve TGFβ1^+ve 세포. (19c) 혈청 TGFβ 수준(n≥그룹). 데이터는 중앙(중앙 선), 제25-제27 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(위스커)를 갖는 박스-및-위스커로서 제시되어 있다. (a-b) 양측 스튜던트 t-검정; (c) 양측 터키-보정 스튜던트 t-검정.
도 20. 인간 IL-11Rα에 대한 항-IL-11Rα 항체의 결합 친화성의 멀티-사이클 동태 분석의 결과를 나타내는 센소그램 및 표. 2개 개별 분석의 결과가 제시되어 있다.
도 21. 5ng/ml TGFβ1으로 자극한 HSC에 의한 MMP2 분비의 억제에서 항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7의 용량-반응 곡선 및 IC50 값.
도 22a 및 22b. 방사선표지된 ¹²⁵I-9A7 항-IL-11Rα 항체 클론의 반감기(22a) 및 간 흡수(22b)를 나타내는 그래프.
도 23a 및 23b. 소모-관련 체중 손실의 모델에서 체중(a) 및 음식 소비(b)에 대한 항-IL-11Rα(9A7) 항체 처리의 효과를 나타내는 그래프. HFMCD 식이를 공급한 마우스는 0.5, 1, 5 또는 10mg/kg 항-IL-11Rα 항체로 2×/주 처리했다. 대조군 마우스는 정상 고형사료(NC)를 공급하거나, HFMCD 식이를 공급하고, IgG 이소형 대조군으로 처리했다.
도 24. IL-11 신호전달을 중화하는 항-IL-11Rα 항체 9A7 및 6개 9A7 인간화 클론의 능력을 나타내는 그래프. 초대 인간 심방 섬유아세포를 TGFβ1로 자극하고, 섬유형성 단백질 MMP2 생산을 상이한 농도의 항체에서 측정했다. IC50 값이 제되어 있다.
도 25. IL-11 신호전달을 중화하는 인간화 항-IL-11Rα 항체 VH3/VL3 및 VH4/VL4의 능력을 나타내는 그래프. 인간 간 성상 세포를 TGFβ1로 자극하고, 섬유형성 단백질 MMP2 생산을 상이한 농도의 항체로 측정했다. IC50 값이 제시되어 있다.
도 26. IL-11 신호전달을 중화하는 9A7 및 인간화 항-IL-11Rα 항체 VH3/VL3 및 VH4/VL4의 능력을 나타내는 그래프. 인간 폐 섬유아세포를 TGFβ1로 자극하고, 섬유형성 단백질 TIMP1 단백질을 상이한 농도의 항체에서 측정했다. IC50 값이 제시되어 있다.
도 27a 내지 27j. 대사성 질환을 갖는 마우스에서 항-IL-11Rα 항체의 효과에 대한 연구 결과. (27a 및 27b) 정상 고형사료(NC) 또는 프럭토즈를 포함하는 서양 식이(WDF)를 공급하고 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 마우스에 대한 체중의 변화를 나타내는 그래프 및 박스 플롯. (27A)는 시간 경과에 따라 체중의 퍼센트 변화(주)를 나타낸다. (27B)는 전체 체지방량과 근육량 사이의 퍼센트 사이를 나타낸다. (27c 및 27d). 복강내 글루코즈 내성 시험(ipGTT)에 의해 측정된, 프럭토즈를 포함하는 서양 식이(WDF)를 공급하고 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 마우스에 대한 글루코즈 내성을 나타내는 그래프, 개략도 및 막대 차트. (27C)는 1분 시점으로부터 글루코즈 수준(mM)의 변화를 나타낸다. (27D)는 곡선하의 면적을 나타낸다. *P<0.05, ** P<0.01. (27e) 정상 고형사료(NCD) 또는 프럭토즈를 포함하는 서양 식이를 공급하고 상이한 시점으로부터 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 마우스의 췌장 중량을 나타내는 박스 플롯. ****P<0.0001. (27f 내지 27h) 지시된 시점에서, 정상 고형사료(NCD) 또는 프럭토즈를 포함하는 서양 식이(WDF)를 공급하고 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 마우스의 (27F) 혈청 콜레스테롤 수준(mg/dl), (27G) 혈청 트리글리세라이드 수준(mg/g) 및 (27H) 공복 혈중 글루코즈 수준(mM)을 나타내는 박스 플롯. (27i 및 27j) 정상 고형사료(NCD)를 공급한 마우스 또는 프럭토즈를 포함하는 서양 식이(WDF)를 공급하고 16주부터 항-IL-11RA 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 마우스로부터 24주에 수득한 췌장 조직 절편의 (27I) 글루카곤 함량 및 (27J) 인슐린 함량의 면역조직화학 분석 결과를 나타내는 이미지.
도 28a 내지 28g. 항-IL-11Rα 항체의 중화는 HFMCD- 및 WDF-유발 NASH 병리를 억제한다. 마우스는 WDF를 16주 동안 공급하여 NASH를 유발하고, 이어서 이들에게 지속적으로 WDF를 공급하면서, (10mg/kg) 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG로 8주 동안 처리했다. (a) 24주 동안 NC 또는 WDF를 투여한 마우스의 간에서 p-Erk 및 Erk의 웨스턴 블롯. (b) 총 간 하이드록시프롤린 함량, NC 및 IgG- 및 항-IL-11Rα-처리된 WDF(n≥/그룹)을 투여한 마우스에서 (c) 간 트리글리세라이드, (d) 혈청 ALT, (e) 공복시 혈중 글루코즈, (f) 혈청 트리글리세라이드 및 (g) 혈청 콜레스테롤의 수준. (b-g) 데이터는 중앙(중앙 선), 제25-제27 백분위수(박스) 및 최소-최대 백분위수(위스커)로서 제시되어 있고; (b) 양측 스튜던트 t-검정 (c-g) 양측, 터키-보정 스튜던트 t-검정. FC: 배수 변화; NC: 정상 고형사료; WDF: 서양 식이+15%(w/v) 프럭토즈.
도 29a 및 29b. HFMCD에서 10주까지 섬유증을 확립한 후, 1, 3 또는 6주에서 항-IL-11Rα 항체에 의한 중증 간 섬유증의 역전. (a) 마우스에게 HFMCD를 10주 동안 공급한 다음, 이를 NC로 교환하여 항체 요법을 개시함으로써 섬유증이 확립된 역전 실험을 나타내는 개략도. 제시된 시점에서 마우스를 안락사시켰다. (b) IgG 또는 항-IL-11Rα 항체로 6주 동안 처리한 마우스로부터 간 콜라겐 함량의 정량화 매슨 트리크롬 염색
도 30a 내지 30f. (a-c) 간에 대한 IL-11의 효과. (30a) 초대 인간 간세포는 IL-11Rα 수용체를 발현한다. (30b) IL-11 처리(0.019-10ng/ml) 후의 상청액에서 ALT 수준의 용량-의존적 증가. (30c) H₂O₂-유발 IL-11 발현. (d-f) APAP-유발 간 손상의 마우스 모델에서 간독성에 대한 항-IL-11Rα 항체 요법의 효과. IgG 항체는 대조군으로 사용되었다. (30d) 간 손상의 정도를 나타내는 ALT 수준. (30e) 간 질량의 APAP-유발 손상의 효과. (30f) 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리한 마우스의 간 조직에서 중심엽 괴사의 정도를 나타내는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색.
도 31a 및 31b. (31a) 항-IL-11Rα 항체가 APAP-매개 간세포 사멸을 방지하는 것을 나타내는 산포도. 인간 간세포는 항-IL-11Rα(2㎛/ml) 또는 IgG 대조군 항체의 존재 또는 부재(BL)하에 APAP(20mM)로 처리했다. 이어서, 세포를 아넥신 V 및 PI로 염색하고, 세포 사멸을 유세포 분석에 의해 분석했다 BL=기준선. (31b) 항-IL-11Rα 항체가 Erk 및 KnK의 APAP-매개 활성화를 방지하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지. 인간 간세포를 항-IL-11Rα(2㎛/ml) 또는 IgG 대조군 항체의 존재 또는 부재(BL)하에 APAP(10mM)로 처리했다. 세포 추출물을 제조하고, 웨스턴 블롯을 수행하여, Erk 및 Jnk 키나제의 활성화(포스포릴화) 상태를 평가했다. BL=기준선.
도 32a 및 32b. APAP 과복용 16시간 전에 제공된 항-IL-11Rα 요법이 급성 간 손상을 방지하는 것을 나타내는 박스 플롯 및 이미지. 중증 APAP 과복용(400mg/kg)을, 20mg/kg 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군 항체의 IP 투여 16시간 후에 마우스에게 투여했다. 24시간 후, 마우스를 안락사시켰다. (32a) 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)는 급성 간 손상 및 간세포 세포 사멸의 마커로서 측정했다. (32b) 간을 수거하고, 10% 중성-완충된 포르말린에서 고정시키고, 탈수하고, 파라핀 블록에 포매하고, 절편화하고, 이어서 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여, APAP 과복용에서 관찰된 특징적 중심엽 간세포 괴사를 시각화했다.
도 33a 내지 33c. (a-b) APAP 과복용 10시간 후에 제공된 항-IL-11Rα 요법이 급성 간 손상을 치료하는 것을 나타내는 이미지 및 박스 플롯. 중증 APAP 과복용(400mg/kg)을 마우스에게 투여하고, 10시간 후, 마우스는 20mg/kg 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군 항체를 IP 투여했다. (33a) 간을 지시된 시점에서 수거하고, 10% 중성-완충된 포르말린에서 고정시키고, 전체 형태 및 외관을 기록했다. (33b) 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 지시된 시점에서 급성 간 손상 및 간세포 세포 사멸의 마커로서 측정했다. (33c) APAP 과복용 10시간 후에 제공된 항-IL-11Rα 요법이 Jnk 및 ERK의 활성화를 억제하는 것을 나타내는 웨스턴 블롯의 이미지. 중증 APAP 과복용(400mg/kg)을 마우스에게 투여하고, 10시간 후, 마우스는 20mg/kg 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군 항체를 IP 투여했다. 간을 지시된 시점에서 수거하고, 웨스턴 블롯을 수행하여, Erk 및 Jnk 키나제의 활성화(포스포릴화) 상태를 평가했다.
도 34a 내지 34c. APAP 과복용 10시간 후에 제공된 항-IL-11Rα 요법이 급성 간 손상에 기인하는 사멸을 방지하고 간 기능을 회복하는 것을 나타내는 그래프, 이미지 및 박스 플롯. 치사 APAP 과복용(550mg/kg)을 마우스에게 투여하고, 10시간 후, 마우스는 20mg/kg 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군 항체를 IP 투여했다. (34a) 2개 처리 그룹에서 과복용후 8일에 걸친 사망률을 나타내는 그래프. (34b) 간을 지시된 시점에서 수거하고, 10% 중성-완충된 포르말린에서 고정시키고, 전체 형태 및 외관을 기록했다. (34c) 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)는, 정상 대조군 마우스에서의 수준과 비교하여, 항-IL-11Rα 항체 처리 마우스에서 과복용후 8일에서 간 손상 및 간세포 세포 사멸의 마커로서 측정했다.

실시예

하기 실시예에서, 본 발명자들은 항-IL-11Rα 항체의 생성 및 항체의 기능적 특성화를 기재한다.

실시예 1: 항-인간 IL-11Rα 항체

인간 IL-11Rα 단백질에 대한 마우스 모노클로날 항체는 다음과 같이 생성했다.

인간 IL-11Rα의 아미노산을 코딩하는 cDNA를 발현 플라스미드(Aldevron GmbH, Freiburg, Germany)에 클로닝했다.

마우스는, 입자-충격("유전자 총")을 위한 휴대용 장치를 사용하여 DNA-코팅된 금-입자의 피내 적용에 의해 면역화시켰다. 혈청 샘플을 일련의 면연화 후에 마우스로부터 수집하고, 인간 IL-11Rα 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨 HEK 세포에서 유세포 분석으로 시험했다(일시적으로 형질감염시킨 HEK 세포에 의한 인간 IL-11Rα의 세포 표면 발현은 IL-11Rα 단백질의 N-말단에 부가된 태그를 인식하는 항-태그 항체로 확인했다).

항체-생산 세포를 마우스로부터 단리하고, 표준 절차에 따라 마우스 골수종 세포(Ag8)와 융합시켰다.

IL-11Rα에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마는 유세포 분석에 의해 IL-11Rα 발현 HEK 세포에 결합하는 능력을 스크리닝함으로써 동정했다.

양성 하이브리도마 세포의 세포 펠렛은 RNA 보호제(RNAlater, cat. #AM7020 by ThermoFisher Scientific)를 사용하여 제조하고, 항체의 가변 도메인의 서열분석을 위해 추가로 처리했다.

제조업자의 지시에 따라 BigDye® Terminator v3.1 Cycle 서열분석 키트(Life Technologies®)를 사용하여 서열분석을 수행했다. 모든 데이터는 3730xl DNA 분석기 시스템 및 통합 데이터 수집 소프트웨어(Life Technologies®)를 사용하여 수집했다. 서열 조립은 CodonCode Aligner(CodonCode Corporation)를 사용하여 수행했다. 혼합 베이스 콜은 가장 일반적 베이스 콜을 혼합 베이스 콜에 자동적으로 할당함으로써 해결했다. 유병률은 베이스 콜의 빈도 및 베이스콜의 개별 품질 둘 다에 의해 결정했다.

전체적으로, 17개 마우스 모노클로날 항-인간 IL-11Rα 항체 클론을 생성했다(도 1); 클론 BSO-1E3, BSO-2C1, BSO-2E5, BSO-4G3, BSO-5E5, BSO-7G9, BSO-9A7, BSO-10D11, BSO-13B10, BSW-1D3, BSW-1F6, BSW-4G5, BSW-6H3, BSW-7E9, BSW-7G8, BSW-7H8 및 BSW-8B7.

VL 및 VH 도메인 서열은 항체 클론 BSO-1E3, BSO-2E5, BSO-4G3, BSO-5E5, BSO-7G9, BSO-9A7, BSO-10D11 및 BSO-13B10에 대해 결정했다. 클론 BSO-9A7에 대해 결정된 VH 및 VL 서열은 서열번호 7 및 13에 제시되어 있다.

실시예 2: 항-인간 IL-11Rα 항체의 기능적 특성

2.1 인간 IL-11/IL-11R 매개 신호전달을 억제하는 능력

인간 IL-11/IL-11R 매개 신호전달을 중화하는 항-IL-11Rα 항체의 능력을 조사하기 위해, 심장 심방 인간 섬유아세포를 24시간 동안 TGFβ1(5ng/ml)의 존재하에 항-IL-11Rα 항체의 존재 또는 부재하에 96-웰 플레이트의 웰에서 배양했다. 이러한 섬유화촉진 자극은 IL-11의 발현을 촉진하고, 또한 정지 섬유아세포의 활성화된 αSMA-양성 섬유아세포로의 전이를 유도한다. IL-11을 중화하면, αSMA-양성 섬유아세포로의 TGFβ1-유발 전이를 방지하는 것이 이전에 밝혀져 있다.

TGFβ1로 자극한 섬유아세포 배양물에 항-IL-11Rα 항체(2㎍/ml)를 첨가하고, 24시간 배양 기간의 종료시에, αSMA-양성 섬유아세포의 퍼센트를 측정했다. 퍼센트는, TGFβ1로 자극하지 않은 섬유아세포의 배양물에서 관찰된 αSMA-양성 섬유아세포의 퍼센트에 기초하여 정규화했다.

αSMA의 발현은, 자동화 고처리양 방식으로 오퍼레타 고함량 이미징 시스템(Operetta High-Content Imaging System)으로 분석했다.

결과는 도 2 및 5에 제시되어 있다. TGFβ1에 의한 자극은, 항-IL-11Rα 항체의 부재하에 24시간 배양 기간의 종료시에 αSMA-양성, 활성화된 섬유아세포의 수에서 1.58배 증가를 가져왔다.

상업용 모노클로날 마우스 항-IL-11 항체(Monoclonal Mouse IgG2A; Clone #22626; Catalog No. MAB218; R&D Systems, MN, USA)는 대조군으로 포함되었다. 이 항체는 활성화된 섬유아세포 퍼센트를 비자극된 배양물(즉, TGFβ1에 의한 자극의 부재하에)에서 활성화된 섬유아세포 퍼센트의 0.89배까지 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

항-IL-11Rα 항체는 인간 섬유아세포에서 IL-11/IL-11R 신호전달을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 몇몇은 IL-11/IL-11R 신호전달을 모노클로날 마우스 항-IL-11 항체: BSO-1E3, BSO-5E5 및 BSO-13B10보다 대폭적으로 억제할 수 있었다.

2.2 마우스 IL-11 매개 신호전달을 억제하는 능력

또한, 마우스 IL-11-매개 신호전달을 억제하는 항-IL-11Rα 항체의 능력은, 상기 섹션 2.1에 기재된 것과 동일한 절차에 따라, 그러나 인간 심방 섬유아세포 대신에 마우스 심방 섬유아세포를 사용하여 조사했다.

결과는 도 3 및 5에 제시되어 있다. TGFβ1에 의한 자극은, 항-IL-11Rα 항체의 부재하에 24시간 배양 기간의 종료시에 αSMA-양성, 활성화된 섬유아세포 수에서 2.24배 증가를 가져왔다.

상업용 모노클로날 마우스 항-IL-11 항체(Monoclonal Mouse IgG2A; Clone #22626; Catalog No. MAB218; R&D Systems, MN, USA)는 대조군으로 포함되었다. 이 항체는, 활성화된 섬유아세포의 퍼센트를 비자극된 배양물(즉, TGFβ1에 의한 자극의 부재하에)에서 활성화된 섬유아세포의 퍼센트의 1.44배까지 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

항-IL-11Rα 항체는 마우스 섬유아세포에서 IL-11/IL-11R 신호전달을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 몇몇은 IL-11/IL-11R 신호전달을 모노클로날 마우스 항-IL-11 항체: BSO-1E3, BSO-2C1, BSO-5E5, BSO-9A7 및 BSO-13B10보다 대폭적으로 억제할 수 있었다.

2.3 IL-11Rα와의 복합체에서 IL-11에 의한 IL-11 트랜스 신호전달을 억제하는 능력

트랜스 신호전달은 IL-6 신호전달의 주요 측면으로 인시되고, IL-6과 IL-6Rα의 복합체는, gp130을 발현하지만 IL-6 수용체를 결여하는 세포를 활성화할 수 있다[참조: Hunter and Jones, 2015 Nature Immunology 16, 448-457].

최근에, IL-11과 가용성 IL-11Rα의 복합체에 의한 트랜스 신호전달이 또한 IL-11 생물학에 중요한 것으로 시사되었다[참조: Lokau et al., Cell Reports (2016) 14, 1761-1773]. IL-11 및 IL-11Rα의 재조합 융합 단백질을 사용하여(문헌[참조: Pflanz et al., Febs Lett (1999) 450: 117-122]에 기재된 바와 같이), 항-IL-11 항체를, IL-11:IL-11Rα 복합체에 의해 매개된 트랜스 신호전달을 억제하는 능력에 대해 스크리닝했다.

중요하게는, IL-11:IL-11Rα 복합체에 의한 고전적 IL-11 매개 신호전달 및 IL-11 트랜스 신호전달 둘 다를 억제할 수 있는 항체는 IL-11/IL-11R 신호전달의 모든 공지된 모드를 억제할 수 있다.

IL-11:IL-11Rα 융합 단백질(이하, 하이퍼 IL-11로서 지칭됨)은 IL-11에 결합된 IL-11 수용체 알파(IL-11Rα)의 세포외 도메인으로 이루어져 있다. 본 실시예에서 사용된 IL-11:IL-11Rα 융합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다.

하이퍼 IL-11은 재조합 IL-11 단백질보다 인간 섬유아세포의 보다 강력한 활성화인자인 것으로 밝혀졌다. 요약하면, 2개의 분리 실험에서, 인간 섬유아세포는, 상이한 양의 하이퍼 IL-11(0.008ng/ml, 0.04ng/ml, 0.2ng/ml, 1ng/ml 및 5ng/ml), 또는 상업적 공급원으로부터 수득된 5ng/ml 재조합 인간 IL-11의 존재하에, 자극 없이(기준선) 배양하고, 섬유아세포 활성화는 본원에 기재된 αSMA-양성 세포의 퍼센트를 결정함으로써 분석했다. 결과는 (도 6A 및 6B)에 제시되어 있다. 하이퍼-IL-11은 용량-의존적 방식으로 섬유아세포를 활성화시켰고, IL-11보다 강력한 활성화인자였다.

IL-11:IL-11Rα 융합 단백질은 다음과 같이 제조했다:

· IL-11:IL-11Rα 융합 단백질(즉 서열번호 98)을 코딩하는 DNA를 pTT5 벡터에 클로닝하고, 혈청-비함유 FreeStyel^TM 293 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 배양 중의 293-6E 세포에 형질감염시켰다. 세포는 오비탈 쉐이커(VWR Scientific) 상에서 37℃로 5% CO₂와 함께 엘렌마이어 플라스크(Corning Inc.)에 유지했다.

· 세포 배양 상청액을 6일에 수집하고, 정제에 사용했다.

· 세포 배양 상청액을 친화성 정제 컬럼에 로딩했다.

· 적절한 완충액으로 세척 및 용출시킨 후, 용출된 분획을 풀링하고, 완충액을 최종 제형 완충액으로 교환했다.

· 정제된 IL-11:IL-11Rα 융합 단백질을 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯으로 분석하여, 분자량 및 순도를 확인했다.

시험관내에서 배양하고 하이퍼 IL-11로 자극한 섬유아세포는, ELISA에 의해 결정된 바와 같이, IL-11 단백질 발현을 상향조절하는 것으로 밝혀졌다(도 7). 흥미롭게도, IL-11 RNA 수준의 증가는 하이퍼 IL-11에 의한 자극에 반응하여 검출되지 않았다. RNA 및 단백질 수준 둘 다에서 IL-11 발현을 증가시키는 TGFB1과는 달리, 하이퍼 IL-11은, 단백질 수준에서, 전사후에만 IL-11 발현을 상향조절하는 것으로 보인다.

하이퍼 IL-11에 의해 매개된 신호전달을 억제하는 마우스 항-IL-11Rα 항체의 능력을 조사했다.

인간 심방 섬유아세포를 항-IL-11Rα 항체(2㎍/ml) 또는 이소형 대조군 항체의 존재하에 하이퍼 IL-11(0.2ng/ml)과 함게 24시간 동안 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 세포 배양 상청액을 MMP2에 대해 분석했다. 하이퍼 IL-11에 의한 자극은, 비자극된 배양물과 비교하여, MMP2 분비의 증가를 가져왔다.

실험 결과는 도 4 및 5에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 항체는 하이퍼 IL-11에 의해 매개된 신호전달(즉, IL-11 트랜스 신호전달)을 중화할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 몇몇은 트랜스 신호전달을 상업용 모노클로날 마우스 항-IL-11 항체(모노클로날 마우스 IgG2A; Clone #22626; Catalog No. MAB218; R&D Systems, MN, USA): BSO-1E3(RA1), BSO-2E5(RA3), BSO-5E5(RA5), BSO-9A7(RA7), BSO-13B10(RA9) 및 BSW-1F6(RA11)보다 대폭적으로 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

클론 BSO-1E3(RA1), BSO-5E5(RA5), BSO-9A7(RA7), BSO-13B10(RA9)은 추가의 개발을 위한 유망한 후보로서 확인되었고(도 5에서 강조 표시됨), 이는 인간 및 마우스 IL-11/IL-11R 신호전달 둘 다를 억제하는 우수한 능력 및 IL-11 트랜스 신호전달의 우수한 억제를 나타낸다.

2.4 IL-11Rα에 결합하는 능력에 대한 스크리닝

항-인간 IL-11Rα 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마를 서브-클로닝하고, 서브클로닝된 하이브리도마로부터의 세포 배양 상청액을, (i) 인간 IL-11Rα에 결합하는 능력 및 (ii) IL-11Rα 이외의 항원에 대한 교차 반응성에 대해 "혼합-및-측정" iQue 검정에 의해 분석했다.

요약하면, 표지된 대조군 세포(세포 표면에서 IL-11Rα를 발현하지 않음) 및 이들의 표면에서 인간 IL-11Rα를 발현하는 비표지된 표적 세포(FLAG-태그된 인간 IL-11Rα를 코딩하는 플라스미드로 일시적 형질감염 후)를 세포 배양 성청액(마우스-항-IL-11Rα 항체) 및 이차 검출 항체(형광-표지된 항-마우스 IgG 항체)와 함께 혼합했다.

이어서, 세포는 2개 표지(즉 세포 표지 및 이차 항체 상의 표지)에 대해 HTFC 스크리닝 시스템(iQue)를 사용하여 분석했다. 비표지된 IL-11Rα 발현 세포 상에서 이차 항체의 검출은 IL-11Rα에 결합하는 마우스-항-IL-11Rα 항체의 능력을 나타냈다. 표지된 대조군 세포 상에서 이차 항체의 검출은 IL-11Rα 이외의 표적에 대한 마우스-항-IL-11Rα 항체의 교차-반응성을 나타냈다.

양성 대조군 조건으로서, 표지된 및 비표지된 세포를 일차 항체로서 마우스 항-FLAG 태그 항체와 함께 인큐베이팅했다.

결과는 도 8A 및 8B에 제시되어 있다. 대부분의 서브클로닝된 하이브리도마는, 인간 IL-11Rα에 결합할 수 있고 고도의 특이성으로 이러한 표적을 인식한 항체를 발현했다. 서브클론 BSO-1E3에 의해 생산된 항체는 인간 IL-11Rα에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다.

항체 BSO-2C1 및 BSO-9A7은, 태그용의 양성 대조군 항-태그 항체의 신호보다 IL-11Rα에 결합하는 보다 강력한 신호를 나타냈고, 이는 이들 항체가 매우 높은 친화성으로 IL-11Rα에 결합하는 것을 나타낸다.

2.5 인간 IL-11Rα에 대한 항체 친화성의 분석

항-인간 IL-11Rα 항체는 ELISA 검정에 의해 인간 IL-11Rα에 결합하는 이들의 친화성에 대해 분석한다.

재조합 인간 IL-11Rα는 젠스크립트(Genscript)로부터 수득하고, 호세라디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-인간 IgG(Fc-특이적) 항체는 시그마(Sigma)로부터 수득한다. 코닝 96-웰 ELISA 플레이트는 시그마로부터 수득한다. 피어스 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) ELISA 기질 키트는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(0.4g/mL TMB 용액, 시트르산 완충액 중의 0.02% 과산화수소)로부터 수득한다. 소 혈청 알부민 및 황산은 시그마로부터 수득한다. 세척 완충액은 인산염 완충 식염수(PBS-T) 중에 0.05% 트윈-20을 포함한다. 정제된 IgG 대조군은 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 구매한다. 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 200 PRO NanoQuant를 사용하여 흡광도를 측정한다.

크리스-교차 연속 희석 분석을 문헌[참조: Hornbeck et al., (2015) Curr Protoc Immunol 110, 2.1.1-23]에 기재된 바와 같이 수행하여, 코팅 항원, 일차 및 이차 항체의 최적 농도를 결정한다.

간접 ELISA를 수행하여, 이전에 기재된 바와 같이[참조: Unverdorben et al., (2016) MAbs 8, 120-128.], 50%의 유효 농도(EC₅₀)에서 마우스 항-IL-11Rα 항체의 결합 친화성을 평가한다. ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 1㎍/ml의 재조합 인간 IL-11Rα로 코팅하고, 나머지 결합 부위를 PBS 중의 2% BSA로 차단한다. 항체를 PBS 중의 1% BSA로 희석하고, 적정하여 800, 200, 50, 12.5, 3.125, 0.78, 0.195 및 0.049ng/mL의 작업 농도를 수득하고, 실온에서 2시간 동안 이중으로 인큐베이팅한다. 항원-항체 결합의 검출은 15.625ng/mL의 HRP-접합된 항-마우스 IgG 항체로 수행한다. 검출 항체와 함께 2시간 인큐베이션 후, 100㎕의 TMB 기질을 15분 동안 첨가하고, 발색 반응을 100㎕의 2M H₂SO₄로 중지시켰다. 흡광도 판독은 450nm에서 측정하고, 참조 파장은 570nm에서 보정한다. 데이터는 항체 농도의 로그 변환을 수반하는 GraphPad Prism 소프트웨어에 적합시키고, 이어서 비대칭 (5-파라미터) 로지스틱 용량-반응 곡선으로 비-선형 회귀 분석에 의해 개별 EC50 값을 결정한다.

2.5.1 인간 및 마우스 섬유아세포에서 내인성 IL-11 생산을 차단하는 섬유증 스크리닝

섬유아세포는, 심방 섬유아세포에서 IL-11 발현의 가장 강력한 자극인자인 TGFβ1의 최대 용량으로 자극하고, 이는 통상 IL-11 농도가 24시간 후에 상청액에서 500pg ml-1 내지 1ng ml-1로 된다. 이러한 접근법은 생리학적으로 관련된 최대 생산 수준에서 정확하게 폴딩되고 내인적으로 생산된 IL-11의 억제를 보장한다. 섬유아세포에 대해 직접 IL-11의 섬유증-관련 분비 활성은 이 검정에서 중화된다.

TGFβ1은 IL-11의 발현을 자극하고, 이는 후속적으로 정지 섬유아세포로부터 활성화된(ACTA2-양성) 근섬유아세포로의 전이를 유도한다. 중화 IL11RA 항체는 이러한 전이를 억제해야 한다. 따라서, TGFB1 자극 후에 활성화된 섬유아세포 퍼센트를 저하시키는 항체는 중화인자 및 항-섬유화제인 것으로 간주될 수 있다.

섬유아세포를 1×10⁴/cm의 밀도로 96-웰 셀캐리어(CellCarrier) 플레이트에 파종하고, 24시간 동안 섬유화촉진 사이토킨 TGFB1(5ng/ml) 및 마우스 모노클로날 항-IL11RA 항체(6㎍/ml)로 자극시켰다. 실험 조건에 따라, 세포를 인산염-완충 식염수(PBS)에서 세정하고, 4% 파라포름알데히드에서 고정시키고, PBS 중의 0.1% 트리톤 X-100으로 투과시켰다. 비-특이적 부위는 차단 용액(PBS 중의 0.5% BSA 및 0.1% 트윈-20)을 사용하여 차단했다. 세포를 밤새 4℃에서 마우스 모노클로날 항-평활근 액틴과 함께 인큐베이팅하고, 차단 용액에서 1:500으로 희석한 다음, 세척하고(PBS 중의 0.25% BSA 및 0.1% 트윈-20), 1시간 동안 실온에서 암 상태로 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-마우스 IgG(1:1000)과 함께 인큐베이팅했다. 세포를 차단 용액 중의 로다민-팔로이딘(1:1000) 및 DAPI(1㎍/ml)으로 대비-염색했다. 플레이트를 스캐닝하고, 이미지를 오퍼레타 고함량 이미징 시스템으로 수집했다. ACTA2+ve 세포의 분획은 하모니(Harmony) 소프트웨어 버전 4.1(PerkinElmer)을 사용하여 평가했다.

도 8c는, IL11RA에 특이적으로 결합하는 몇몇 세포가 인간 섬유아세포 활성화를 중화할 수 있음을 나타낸다. 100% 억제는 비자극된 섬유아세포의 수준을 나타내고, 0%는 완전히 활성화된 섬유아세포를 나타낸다.

상기 실험은 종간 중화 능력을 조사하기 위해 초대 마우스 피부 섬유아세포로 반복했다. 도 8d는, IL11RA에 특이적으로 결합하는 몇몇 항체가 마우스 섬유아세포 활성화를 중화할 수 있음을 나타낸다. 100% 억제는 비자극된 섬유아세포의 수준을 나타내고, 0%는 완전히 활성화된 섬유아세포를 나타낸다.

2.5.2 항-IL-11Rα 항체의 시험관내 성능

중화 검정은 5E5, 9A7 및 13B10 클론의 연속 희석을 사용하여 수행했다. 우심방 생검으로부터 단리된 인간 심방 섬유아세포를 1×10⁴/cm의 밀도로 96-웰 셀캐리어(CellCarrier) 플레이트에 파종했다. 세포를 섬유화촉진 사이토킨 TGFB1(5ng/ml)로 자극시키고, 상이한 농도에서 5E5, 9A7 또는 13B10와 함께 24시간 동안 인큐베이팅했다. 배지를 수집하고, MMP2 및 TIMP1 ELISA를 프로토콜에 따라 수행했다. 섬유아세포에 의한 상청액으로의 MMP2 및 TIMP1 분비를 평가하여 억제 %를 추정했다. 고농도의 시판되는 항-IL-11 항체(2㎍/ml)를 양성 대조군으로 사용하고, 100% 중화인 것으로 간주했다. IgG 대조군과 함께 인큐베이팅된 자극된 세포의 단백질 수준은 0% 중화를 나타낸다.

도 8e는 항체가 IL-11Rα에 결합하고 상호작용으로부터 내인적으로 생산된 IL-11을 차단하는 것을 나타낸다. IL-11 신호전달은 중화되어, 섬유형성 단백질 MMP2 및 TIMP1의 생산을 억제한다.

IL-11:IL11RA(0.2ng/ml) 및 상이한 농도의 5E5, 9A7 및 13B10을 사용하여 이 실험을 반복하여 트랜스-신호전달 사상의 차단을 확인했다.

도 8f는 항체가 섬유아세포에서 트랜스 IL-11 신호전달을 중화하고 섬유형성 단백질 생산을 억제하는 것을 나타낸다. 섬유아세포에 의한 상청액으로의 MMP2 및 TIMP1 단백질 분비를 평가하여 억제 %를 추정했다.

상기 실험은 초대 마우스 심장 섬유아세포를 사용하여 반복했다. 시험관내에서 섬유성 반응의 중화는 MMP2 수준을 모니터링함으로써 평가했다. 초대 마우스 심장 섬유아세포를 TGFB1(5ng/ml), IL-11(2ng/ml) 또는 IL-11:IL11RA(0.2ng/ml) 및 상이한 농도의 9A7과 함께 인큐베이팅했다. 섬유아세포에 의한 상청액으로의 MMP2 분비를 평가하여 억제 %를 추정했다.

도 8g는 항-IL-11Rα 항체 9A7이 외인성 또는 내인성 IL-11을 차단하거나, 하이퍼 IL-11이 섬유아세포에서 IL-11 신호전달을 중화하고 섬유형성 단백질 생산을 억제하는 것을 나타낸다.

IgG 대조군 또는 2㎍/ml의 9A7 항체의 존재하에 24시간 동안 재조합 원숭이 IL-11(5ng/ml)로 자극한 원숭이 피부 섬유아세포에서 9A7에 대한 종간 반응성을 확인했다. 콜라겐, ACTA2+ve 및 EdU+ve 세포는 오퍼레타 고함량 이미지 플랫폼을 사용하여 정량했다. 분비된 콜라겐은 열량측정 시리우스 레드 콜라겐 검정을 사용하여 정량했다. 9A7은 비-IL-11 처리된 대조군에 필적하는 각 섬유성 마커의 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

2.6 다양한 조직에서 인간 IL-11/IL-11R 신호전달을 억제하는 능력

각종 상이한 조직으로부터 수득된 섬유아세포에서 IL-11/IL-11R 신호전달 및 트랜스 신호전달을 중화하는 항체의 능력은, 심장 심방 인간 섬유아세포 대신에 간, 폐, 신장, 눈, 피부, 췌장, 비장, 장, 뇌 및 골수로부터 유래하는 인간 섬유아세포를 이 실험에 사용한 것을 제외하고는, 본질적으로 섹션 2.1 및 2.3에 기재된 바와 같이 조사했다.

항-IL-11Rα 항체는, 항체 부재하의 배양물과 비교하여, 항-IL-11Rα 항체의 존재하에 24시간 배양 기간의 종료시에 αSMA-양성 섬유아세포 비율의 상대적 저하의 관찰에 의해 결정된 바와 같이, 각종 상이한 조직으로부터 유래하는 섬유아세포에서 IL-11/IL-11R 신호전달을 중화할 수 있는 것으로 입증된다.

실시예 3: 마우스 항-인간 IL-11 항체의 키메라 및 인간화 버전

실시예 1의 마우스 모노클로날 항-인간 IL-11Rα 항체의 마우스/인간 키메라 및 인간화 버전을 표준 방법에 따라 제조한다.

3.1 마우스/인간 키메라 항체

마우스/인간 키메라 항체는, 문헌[참조: Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, Michael Steinitz (Editor), Methods in Molecular Biology 1060, Springer Protocols, Humana Press (2014), in Chapter 8 thereof]에 기재된 바와 같이 마우스 모노클로날 항-인간 IL-11Rα 항체로부터 제조한다.

요약하면, 마우스 항-인간 IL-11Rα 항체를 생산하는 하이브리도마의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA 서열을 결정하고, 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 서열과 조합하여 마우스/인간 키메라 항체 서열을 생산하고, 이로부터 키메라 마우스/인간 항체가 포유동물 세포에서 발현된다.

3.2 인간화 항체

BSO-9A7 VH 및 VL 서열의 인간화 버전을 또한 설계하고, 이들은 서열번호 8 내지 12 및 14 내지 17에 제시되어 있다.

인간화 항체는, 문헌[참조: Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, Michael Steinitz (Editor), Methods in Molecular Biology 1060, Springer Protocols, Humana Press (2014), in Chapter 7 thereof, in particular at section 3.1 of Chapter 7 entitled 'Antibody Humanization']에 기재된 바와 같이 마우스 모노클로날 항-인간 IL-11Rα 항체로부터 제조한다.

요약하면, 마우스 항-인간 IL-11Rα 항체를 생산하는 하이브리도마의 VH 및 VL을 코딩하는 DNA 서열을 결정하고, 인간 항체 가변 영역 프레임워크 영역 및 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 서열에 삽입하여 인간화 항체 서열을 생산하고, 이로부터 인간화 항체가 포유동물 세포에서 발현된다.

인간화 항체의 특성화는 실시예 14에 기재되어 있다.

실시예 4: 항-IL-11Rα 항체의 추가 생화학적 분석

상기 기재된 항체를 추가 생화학적 분석에 제공한다.

항체를 BIAcore, Biolayer 간섭측정(BLI) 및 MicroScale Thermophoresis(MST) 분석에 의해 분석하여, 인간 IL-11Rα에 결합하는 친화성을 결정한다.

표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에 의한 항체 친화성의 BIAcore 결정은 문헌[참조: Rich et al., Anal Biochem. 2008 Feb 1; 373(1):112-20]에 기재된 바와 같이 수행한다.

항체 친화성의 Biolayer 간섭측정 분석은 문헌[참조: Concepcion et al., Comb Chem High Throughput Screen. 2009 Sep; 12(8):791-800]에 기재된 바와 같이 수행한다.

항체 친화성의 MicroScale Thermophoresis 분석은 문헌[참조: Jerabek-Willemsen et al., Assay Drug Dev Technol. 2011 Aug; 9(4): 342-353]에 기재된 바와 같이 수행한다.

항체의 응집은 문헌[참조: Iacob et al., J Pharm Sci. 2013 Dec; 102(12): 4315-4329]에 기재된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석한다.

항체의 소수성은 문헌[참조: Haverick et al., MAbs. 2014 Jul-Aug;6(4):852-8]에 기재된 바와 같이 수소성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 분석한다.

항체의 용융 온도는 문헌[참조: Menzen and Friess, J Pharm Sci. 2013 Feb;102(2):415-28]에 기재된 바와 같이 시차 주사 형광 측정법(DSF)에 의해 분석한다.

실시예 5: 항-IL-11Rα 항체를 사용한 생체내에서 섬유증의 억제

항-인간 IL-11Rα 항체의 치료적 유용성은 각종 상이한 조직에 대한 섬유증의 마우스 모델에서 생체내에서 입증된다. 이 실험에 사용된 마우스는 야생형(즉, IL-11RA+/+) 마우스이다.

5.1 심장 섬유증

펌프를 이식하고, 마우스를 28일 동안 AngII(2mg/kg/day)로 처리한다.

중화 항-IL-11Rα 항체 또는 대조군 항체를 정맥내 주사에 의해 상이한 그룹의 마우스에게 투여한다. 실험의 종료시에, 콜라겐 함량은 열량측정 하이드록시프롤린-기반 검정 키트를 사용하여 마우스의 심방에서 평가하고, 마커 또는 섬유증 Co11A1, αSMA(ACTA2) 및 피브로넥틴(Fn1)의 RNA 발현 수준을 qPCR에 의해 분석했다.

중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는, 섬유증의 마커의 감소된 발현에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 심장 조직에서 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

5.2 신장 섬유증

신장 섬유증의 마우스 모델을 확립하고, 여기서 섬유증은 비히클(0.3M NaHCO₃) 중의 엽산(180mg/kg)의 복강내 주사에 의해 유발하고; 대조군 마우스는 비히클 단독을 투여했다.

중화 항-IL-11Rα 항체 또는 대조군 항체를 정맥내 주사에 의해 상이한 그룹의 마우스에게 투여한다. 신장을 28일에 제거하고, 칭량하고, 매슨 트리크롬 및 시리우스 염색을 위해 10% 중성-완충 포르말린에 고정시키거나, 콜라겐 검정, RNA 및 단백질 연구를 위해 급속-동결시킨다.

총 RNA는, 트리졸 시약(Invitrogen) 및 Qiagen TissueLyzer 방법, 이어서 RNeasy 컬럼(Qiagen) 정제를 사용하여 급속-동결된 신장으로부터 추출한다. cDNA는, 제조업자의 지시에 따라, 각각의 반응물이 1㎍의 총 RNA를 함유하는 iScriptTM cDNA 합성 키트를 사용하여 제조한다. 정량적 RT-PCR 유전자 발현 분석은, 40 사이클에 걸쳐, TaqMan(Applied Biosystems) 또는 StepOnePlusTM(Applied Biosystem)을 사용하는 고속 SYBR 그린(Qiagen) 기술로 삼중 샘플에 대해 수행한다. 발현 데이터는 GAPDH mRNA 발현 수준에 대해 정규화하고, 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 배수-변화를 계산한다. 급속-동결 신장은 50mg/ml(95℃, 20시간)의 농도로 6M HCl에서 가열시킴으로써 산 가수분해에 제공한다. 가수분해물 중의 총 콜라겐의 양은, 제조업자의 지시에 따라 Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 하이드록시프롤린의 비색 검출에 기초하여 정량화한다.

중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는, 섬유증 마커의 발현 감소에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 항체로 처리한 마이스와 비교하여, 신장 조직에서 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

5.3 폐 섬유증

마우스는, 0일에 블레오마이신의 기관내 투여에 의해 처리하여, 폐에서 섬유성 반응(폐 섬유증)을 확립한다.

중화 항-IL-11Rα 항체 또는 대조군 항체는, 정맥내 주사에 의해 상이한 그룹의 마우스에게 투여한다. 마우스를 21일에 희생시키고, 섬유증 마커의 차이에 대해 분석한다.

중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는, 섬유증 마커의 발현 감소에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 폐 조직에서 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

5.4 피부 섬유증

마우스는, 0일에 블레오마이신의 피하 투여에 의해 처리하여, 피부의 섬유성 반응을 확립한다.

중화 항-IL-11Rα 항체 또는 대조군 항체는, 정맥내 주사에 의해 상이한 그룹의 마우스에게 투여한다. 마우스는 21일에 희생시키고, 섬유증 마커의 차이에 대해 분석한다.

중화 항-IL-11Rα로 처리한 마우스는, 섬유증 마커의 감소된 발현에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 피부 조직에서 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

5.5 눈 섬유증

눈의 섬유증을 분석하기 위해, IL-11RA -/- 마우스 및 IL-11RA +/+ 마우스는 0일에 섬유주절제술(여과 수술)을 거쳐 눈에서 창상 치유 반응을 개시한다. 녹내장 여과 수술의 이러한 마우스 모델은, 눈의 창상 치유 반응을 평가하기 위한 효율적 모델인 것으로 밝혀져 있고[참조: Khaw et al. 2001, Curr Opin Ophthalmol 12, 143-148; Seet et al. 2011, Mol. Med. 17, 557-567], 생체내에서 섬유증 조절인자의 유익한 효과를 성공적으로 입증했다[참조: Mead et al. 2003, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3394-3401; Wong et al. 2003 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 1097-1103; Wong et al. 2005, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 2018-2022].

요약하면, 결막을 절개하여 하부 공막을 노출시키고, 이어서 30게이지 니들을 사용하여 공막을 통해 눈의 전방 챔버에 절개를 수행한다. 생성된 누공은 방수가 결막 중으로 및 하부로 배출되도록 한다. 이어서, 절개된 결막은, 10-0(0.2미터법) 에틸론 블랙 모노필라멘트 나일론 공막 봉합사에 의해 윤부에서 고정시키고 밀폐한다. 수술의 종료시에 푸시탈믹 연고를 주입한다. 수술은, 0.1ml 케타민/자일라진 혼합물의 복강내 주사, 및 1% 자일로카인의 안구당 1액적의 국소 적용에 의해 마취하에 수행한다. 푸시탈믹 연고는 감염을 예방하기 위해 수술후에 주입한다. 수술은, 70% 프로필 알콜로 멸균된 수술용 가위 및 겸자 멸균 니들을 사용하여 수행한다.

봉합된 결막 하부에 축적된 액체는 결막 수포로 관찰된다. 마우스는 분석을 위해 수술후 7일에 안락사시킨다. 정량적 면역-조직학적 분석을 위해, 마우스로부터의 안구를 적출에 의해 수거한 다음, 절편화한다. 콜라겐 섬유의 성숙은 피크로-시리우스 레드/편광 기술을 사용하여 평가하고[참조: Szendroi et al. 1984, Acta Morphol Hung 32, 47-55]; 오렌지색-적색은 성숙 콜라겐을 나타내고, 황색/녹색은 새롭게 형성된 미성숙 콜라겐을 나타낸다.

중화 항-IL-11Rα 항체 또는 대조군 항체는, 정맥내 주사에 의해 상이한 그룹의 마우스에게 투여하고, 섬유증을 안구 조직에서 모니터링한다.

중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는, 섬유증 마커의 발현 감소에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 안구 조직에서 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

5.6 기타 조직

섬유증에 대한 중화 항-IL-11Rα 항체의 처리 효과는 또한 간, 신장, 장 등의 다른 조직에 대한 섬유증의 마우스 모델에서 또한 분석하고, 다기관(즉, 전신) 섬유증과 관련된 모델에서 또한 분석한다.

섬유화 반응을 측정하고, 중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스와 대조군 항체로 처리한 마우스를 비교한다. 중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는, 섬유증 마커의 발현 감소에 의해 입증된 바와 같이, 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

항-IL-11Rα 항체 9A7의 중화 성능은, 실시예 2.5.2의 프로토콜에 따라, MMP2 농도를 측정함으로써 초대 인간 간 성상(간) 세포에서 측정했다. 초대 인간 HSC를 TGFB1(5ng/ml; 내인성 IL-11) 또는 외인성 IL-11(2ng/ml) 및 상이한 농도의 9A7과 함께 인큐베이팅했다. 섬유아세포에 의한 상청액으로의 MMP2 분비를 평가하여 억제 %를 추정했다.

도 8h는, 항-IL-11Rα 항체 9A7이 내인성 IL-11(상부) 또는 외인성 IL-11(하부)에 의해 유발된 섬유형성 단백질 생산을 억제하는 것을 나타내고, 따라서 섬유성 반응의 중화를 입증한다.

실시예 6: 항-IL-11Rα 항체를 사용한 생체내 암의 치료

암에 대한 중화 항-IL-11Rα 항체에 의한 치료 효과를 암의 마우스 모델에서 분석한다.

유방, 폐 및 위장 암의 모델을 마우스에서 확립하고, 마우스를 중화 항-IL-11Rα 항체 또는 대조군 항체의 투여에 의해 치료하고, 암의 발생/진행을 모니터링한다.

항암 효과는, 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 암의 감소된 증상 및/또는 증가된 생존에 의해 입증된 바와 같이, 중화 항-IL-11Rα 항체에 대해 관찰된다.

화학요법제, 예를 들면, 시스플라틴과 조합된 중화 항-IL-11Rα 항체의 효과를 또한 조사한다.

항-IL-11Rα 항체를 화학요법제와 조합하여 사용하는 경우, 종양 성장의 억제에 대한 상가 효과가 관찰된다.

실시예 7: 항-IL-11Rα 항체를 사용한 AMD의 치료

중화 항-IL-11Rα 항체에 의한 치료 효과는, 습윤성 연령-관련 황반 변성(AMD)에서 조사한다.

중화 항-IL-11Rα 항체를 습윤성 AMD를 갖는 대상체에게 투여한다. 일부 치료 조건에서, 대상체는 VEGF 길항제 요법(예를 들면, 라니비주맙, 베바시주맙, 페가프타닙, 브로루시주맙 또는 아플리버셉트), PDGF 길항제 요법(예를 들면, 페그플라닙)으로 투여되거나, 항-IL-11Rα 항체의 치료에 추가하여 레이저 응고 요법에 의해 치료된다.

습윤성 AMD 병리의 감소 및/또는 습윤성 AMD 증상의 개선은, 항-IL-11Rα 항체로 치료하지 않은 대상체와 비교하여, 항-IL-11Rα 항체로 치료한 대상체에서 관찰된다.

실시예 8: 항-IL-11Rα 항체를 사용한 신장 섬유증 또는 신장 손상의 억제

유사한 중량을 갖는 10-12주령 동복 마우스는, 비히클(0.3M NaHCO3) 중의 엽산(180mgkg^-1)의 복강내(i.p.) 주사에 의해 유발된 신장 섬유증을 갖고; 대조군 마우스는 비히클 단독을 투여했다.

항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7(VH = 서열번호 7, VL = 서열번호 13)을 엽산 처리후 1일에 및 이어서 20mg/kg의 용량으로 주당 3회 투여했다. 마우스를 주사후 28일에 안락사시켰다.

우레아 및 크레아티닌의 마우스 혈장 수준은, 제조업자의 지시에 따라, 각각 우레아 검정 키트(ab83362, Abcam) 및 크레아티닌 검정 키트(ab65340, Abcam)를 사용하여 정량했다. 신장 중의 총 콜라겐의 양은 Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 하이드록시프롤린의 비색 검출에 기초하여 정량했다. 모든 비색 검정은 제조업자의 지시에 따라 수행했다.

조직을 파라핀-포매하고, 신장을 3㎛로 절편화했다. 파라핀 절편의 경우, 조직을 24시간 동안 실온에서 10% 중성-완충된 포르말린(Sigma-Aldrich)에 고정하고, 탈수하고, 파라핀에 포매했다. 동결절편의 경우, 새롭게 해부된 기관을 Tissue-Tek 옵티멀 커팅 템퍼러처(Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature) 컴파운드(VWR International)로 포매했다. 이어서, 크리오몰드를 액체 질소에서 냉각시킨 이소펜탄과 함께 금속 비이커에서 동결시키고, 절편을 -80℃에서 저장했다. 총 콜라겐은 제조업자의 지시에 따라 매슨 트리크롬 염색 키트(HT15, Sigma-Aldrich)로 염색했다. 절편의 이미지를 캡쳐하고, 청색-염색된 섬유증 영역을 ImageJ 소프트웨어(버전 1.49)로 반-정량적으로 결정했다. 면역조직화학의 경우, 조직 절편을 항-ACTA2 항체(ab5694, Abcam)와 함께 인큐베이팅했다. 1차 항체 염색은, 염색체로서 ImmPACT DAB 퍼옥시다제 기질(Vector Laboratories)을 갖는 ImmPRESS HRP 항-래빗 IgG 폴리머 검출 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 시각화했다. 이어서, 절편을 마이어 헤마톡실린(Merck)으로 대비염색했다.

도 9a 및 9b는, 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스가 콜라겐에 대해 유의적으로 감소된 염색을 갖는 것을 나타내고, 이는 항-IL-11Rα 항체 치료가 신장 섬유증을 억제시켰음을 나타낸다.

도 10a는 요중 알부민/크레아틴 비율이 항-IL-11Rα 항체에 의한 처리에 의해 유의적으로 감소되었음을 나타내고, 이는 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스에서 신장 손상의 감소된 수준을 나타낸다.

항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7은, 상이한 농도(0.5, 1, 5 및 10mg/kg)에서 엽산-유발된 신장 섬유증을 감소시키는 이의 능력에 대해 평가했다. IgG(10mg/kg)을 대조군으로 사용했다. 항체 주사는 엽산 처리 1일 전에 개시하고, 격주로 수행했다. 동물은, PHA 검정을 사용하여 신장 콜라겐 함량을 평가하기 위해 엽산 유발된 손상의 3주 후에 희생시켰다.

도 10b는, 항-IL-11Rα 요법이 용량-의존적 방식으로 엽산-유발된 신장 섬유증에서 신장 콜라겐 함량을 감소시킴을 나타낸다.

또 다른 실험에서, 급성 신장 손상의 마우스 모델을 편측 뇨관 폐색(UUO)에 의해 유발했다. 요약하면, 마우스를 모의 수술 또는 뇨관 상의 뇨관 폐색에 의해 처리했다. 마우스에게 IgG 및 항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7(20mg/kg; 수술일 -1, 1, 3, 5)을 제공하고, 손상된 신장("UUO") 또는 대측 손상되지 않은 신장(Con)을 수술 7일 후에 수거했다.

관상 손상의 반-정량적 평가는, 실험 조건에 대해 블라인드된 캐스트, 관상 위축 또는 관상 확장의 조직학적 분석에 의해 수행했다(관상 손상 스코어: 0, 없음; 1, 최소; 2, 경도, 3, 중등도; 4, 중증).

도 11a 및 11b는 항-IL-11Rα 항체에 의한 치료가 급성 신장 손상의 마우스 모델에서 관상 손상을 감소시켰음을 나타낸다.

실시예 9: 항-IL-11Rα 항체를 사용한 심장 섬유증의 억제

항-IL-11Rα 항체 치료의 항-섬유화 효과는 심장 섬유증의 마우스 모델에서 분석했다.

요약하면, 횡 대동맥 수축(TAC)은 이전에 기재된 바와 같이[참조: Tarnavski, O. et al. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol. Genomics 16, 349-360 (2004)], 수컷 마우스에서 수행했다. 연령-일치 마우스는 TAC 없이 모의 수술 절차를 받았다. 경-흉부 2차원 도플러 심초음파를 사용하여 증가된 압력 구배(>40mm Hg)를 확인하고, 이는 성공적 TAC를 나타낸다.

마우스는 조직학적 및 분자적 평가를 위해 TAG후 2주에서 안락사시켰다. 항-IL-11Ra 항체 클론 BSO-9A7(VH = 서열번호 7, VL = 서열번호 13) 또는 대조군 IgG 항체를 20mg/kg의 용량으로 주당 3회 복강내 투여했다. 2주 후, 심장을 수거하고, 제조업자의 지시에 따라 매슨 트리크롬 염색 키트(HT15, Sigma-Aldrich)를 사용하여 섬유증 정도에 대해 평가했다. 심장에서 총 콜라겐의 양은, Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 하이드록시프롤린의 비색 검출에 기초하여 정량화했다.

분석 결과는 도 12a 및 12b에 제시되어 있다. 중화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는, IgG 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하고, 심장에서 감소된 수준의 콜라겐을 갖고(도 12a), IgG 대조군 항체로 처리한 마우스와 비교하여, 심외막, 심내막 및 혈관주변 영역에서 감소된 수준의 섬유증을 갖는 것으로 밝혀졌다(도 12b).

실시예 10: 항-IL-11Rα 항체를 사용한 간 섬유증의 억제 및 역전

비-알콜성 지방간염(NASH)은 염증으로부터 섬유증까지, 및 심지어 간 부전으로의 진행을 특징으로 하는 일반적 간 질환이다. 간 성상 세포(HSC)는 NASH의 병인에 중요한 역할을 한다. 섬유화촉진 자극, 예를 들면, TGFβ1, PDGF 및 염증유발성 인자는 HSC를 활성화하고, HSC를 간 근섬유아세포로 변화시키고, 이는 섬유아세포-유래 근섬유아세포와 특징을 공유한다. NASH는 간 섬유증의 예로서 사용되었다.

10.1 IL-11 및 간 섬유증

TGFβ1로 자극한 HSC에서 IL-11의 발현은 qPCR에 의해 검출했다. 총 RNA는 트리졸(Invitrogen), 이어서 RNeasy 컬럼(Qiagen) 정제를 사용하여 HSC 용해물로부터 추출했다. cDNA는 제조업자의 지시에 따라 iScriptTM cDNA 합성 키트(Bio-Rad)로 합성했다. 유전자 발현 분석은 40 사이클에 걸쳐 StepOnePlusTM(Applied Biosystem)을 사용하는 TaqMan(Applied Biosystems) 또는 고속 SYBR 그린(Qiagen) 기술로 이중 샘플에 대해 수행했다. 발현 데이터는 GAPDH mRNA 발현에 대해 정규화하고, 배수 변화(FC)는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산했다. IL6R, gp130 및 IL-11Rα의 HSC에서 발현 수준도 또한 qPCR에 의해 검출했다.

환자 간 샘플 중의 IL-11 수준은, 24시간 동안 절단하고 TGFβ1과 함께 인규베이팅한 인간 정밀 절단 간 슬라이스로부터 검출했다. 웨스턴 블롯을 수행하고, 블롯의 밀도측정을 GAPDH의 참조 수준과 비교하여 플롯했다.

결과는 도 13a 내지 13c에 제시되어 있다. IL-11은 TGFβ1로 자극한 HSC에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(13a). HSC는 높은 수준의 IL-11 수용체 아단위 알파(IL-11Rα)를 발현한다(13b). NASH 환자 간 샘플 중의 IL-11 수준은 건강한 개체와 비교하여 증가하는 것으로 밝혀졌다(13c).

세포를 IL-11, TGFβ1 또는 PDGF로 자극하여, HSC 활성화 및 침윤에 대한 IL-11의 효과를 조사했다.

HSC는, 웰당 5×10³ 세포의 밀도로 96-웰 블랙 셀캐리어(CellCarrier) 플레이트(PerkinElmer)에 파종했다. 실험 조건에 따라, 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA, 28908, Thermo Fisher Scientific)에 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100(Sigma)으로 투과시키고, 비-특이적 부위를 PBS 중의 0.5% BSA 및 0.1% 트윈-20으로 차단시켰다. 세포를 밤새(4℃) 일차 항체(1:500)와 함께 인큐베이팅하고, 이어서 적절한 AlexaFluor 488 이차 항체(1:1000)와 함께 인큐베이팅했다. EdU-Alexa Fluor 488은 제조업자의 프로토콜에 따라 Click-iT EdU 표지화 키트(C10350, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 도입했다. 세포를 차단 용액 중의 1㎍ ml^-1 DAPI(D1306, Thermo Fisher Scientific)로 대비염색했다. 각 조건은, 오퍼레타 고함량 이미징 시스템 1483(PerkinElmer)을 사용하여 복제된 웰 및 웰당 최소 7개 필드로부터 이미지화했다. 근섬유아세포의 수를 나타내는 ACTA2+ve 세포의 정량화는 하모니(Harmony) v3.5.2(PerkinElmer)를 사용하여 측정했다. 콜라겐 I의 면적당 형광 강도(세포 수로 정규화함)의 측정은 콜럼버스(Columbus) 2.7.1(PerkinElmer)을 사용하여 측정했다. 세포 배양 상청액 중의 총 분비된 콜라겐은 시리우스 적색 콜라겐 검출 키트(9062, Chondrex)를 사용하여 정량화했다.

인간 HSC의 침윤성 거동은 24-웰 보이든(Boyden) 챔버 침윤 검정(Cell Biolabs Inc.)을 사용하여 검정했다. 혈청-비함유 HSC 배지 중의 동일한 수의 HSC를 ECM-코팅된 마트리겔에 삼중으로 파종하고, 0.2% FBS를 함유하는 HSC 배지를 향해 침윤시켰다. 자극과 함께 인큐베이션 28시간 후, 배지를 흡인하고, 비-침윤성 세포는 면봉을 사용하여 제거했다. 하부 챔버를 향해 침윤한 세포를 세포 염색 용액(Cell Biolabs Inc.)으로 염색하고, 각 막의 5개 비-중첩 필드로부터의 침윤성 세포를 이미지화하고 40× 배율로 계수했다.

결과는 도 13d 내지 13g에 제시되어 있다. IL-11은 HSC를 TGFβ1 또는 PDGF와 유사한 정도로 활성화시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 정지 HSC를 ACTA2+ve 근섬유아세포(13d)로 변환하여, 콜라겐을 생성하고(13e) 분비한다(13f). IL-11은 또한 용량-의존적 HSC 매트릭스 침윤을 촉진하는 것으로 밝혀졌다(13g; 침윤은 NASH에서 HSC 병리의 중요한 측면이다).

생체내에서, 재조합 마우스 Il-11(rmIl-11: 100㎍/kg)을 21일 동안 매일 마우스에게 피하 투여한다. 간의 총 하이드록시프롤린 함량은 Quickzyme 총 콜라겐 검정 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 측정했다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 마우스 혈청 수준은 알라닌 트랜스아미나제 활성 검정 키트(ab105134, abcam)를 사용하여 측정했다. 섬유화촉진 마커 Acta2, Col1a1, Col1a2 및 Col1a3의 RNA 발현은 전과 같이 qPCR에 의해 측정했다.

결과는 도 13h에 제시되어 있다. IL-11 투여는 간 콜라겐 함량, 섬유증 마커 mRNA 및 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준을 증가시켰다.

이들 데이터는 HSC가 인간 간에서 IL-11의 공급원 및 유망한 표적 둘 다이고 IL-11이 NASH에서 상승되어 있음을 나타낸다. IL-11은 간 성상 세포 활성화 및 간 섬유증을 유발한다.

10.2 항-IL-11Rα 요법을 사용한 NASH의 치료

항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7은 NASH에서 섬유증을 치료하는 이의 능력에 대해 평가했다.

HSC를 항-IL-11Rα 항체의 존재 또는 부재하에 NASH-촉진 인자로 처리하여 HSC의 근섬유아세포로의 형질전환을 조사했다. HSC 배양물을 IgG 또는 항-IL-11Rα 항체(6㎍/ml)의 존재하에 5ng/ml TGFβ1로 24시간 동안 자극시켰다. ACTA2^+ve 세포 수(활성화된 근섬유아세포)를 상기 기재된 바와 같이 오퍼레타 플랫폼으로 측정했다. HSC 배양물을 IgG 또는 항-IL-11Rα 항체(2㎍/ml)의 존재하에 24시간 동안 NASH 자극 PDGF(20ng/ml), CCL2(5ng/ml), 안지오텐신 II(100nM), bFGF(10ng/ml) 또는 산화적 스트레스(H₂O₂; 0.2mM)로 별도 자극했다. ACTA2^+ve 세포 비율 및 HSC의 침윤은 전과 같이 측정했다. 이러한 HSC 배양에 의해 생산된 콜라겐 1을 면역염색하고, 형광을 정량화했다. IgG 항체를 대조군으로 사용했다.

결과는 도 14a 내지 14d에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 항체는, PDGF, CCL2, 안지오텐신 II, bFGF 또는 산화적 스트레스(14B)로 자극한 HSC 뿐만 아니라 TGFβ1로 자극한 HSC 배양물 중의 ACTA2^+ve 세포 수를 감소시키는 것으로 밝혀졌고(14a), 즉 항체 처리는 HSC의 근섬유아세포로의 자극-유래 전환을 차단시켰다. 항-IL-11Rα 항체는 또한 PDGF 또는 CCL2에 의해 유발된 HSC 침윤을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(14c). 콜라겐 1 생산은 항-IL-11Rα 항체에 의한 처리 후에 감소되는 것으로 밝혀졌다(14d).

따라서, 항-IL-11Rα 요법에 의한 IL-11 신호전달의 억제는 간 성상 세포 활성화 및 간 섬유증을 예방한다.

초기 NASH에서 간 질환 예방 연구는, 생체내에서 9A7의 항-섬유화 및 간 보호 활성을 검증하기 위해 수행했다. C57B1/6Ntac 마우스는, 간 손상 및 섬유증을 유발하기 위해, 60kcal% 지방(A06071302, Research Diets)(HFMCD 식이)가 보충된 NASH-유발 메티오닌/콜린 결핍(MCD) 식이를 공급했다. NASH 식이 1주일 후(ALT 수준이 ~800u/L이고(정상 고형사료와 비교하여 ~40배 증가), 그 시점에서 확립된 및 강력한 지방간염이 있는 경우), 동물은 4주 기간 동안 주 2회 IgG 대조군 또는 항-IL-11Rα 항체로 개시했다. 4주 후, 동물을 안락사시키고, 분석을 위해 샘플을 수집했다. 데이터는 평균±SD이고; 각 점은 생물학적 복제를 나타낸다; 9A7 처리 대 IgG 대조군의 듄네트(Dunnett) 검정; * P<0.05; ** P<0.01; **** P<0.0001.

도 14e 및 14f는, 항-IL-11Rα 항체의 0.5mg/kg 처리에서도 마우스 모델에서 혈청 ALT 수준에 현저한 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 보다 높은 투여량은 확립된 간 손상을 거의 완전히(>90%) 역전시키고 이러한 매우 극단적 모델에서 간 섬유증을 강력하게 예방하는 것으로 밝혀졌다.

생체내 실험을 수행하여, 후기 NASH에 대한 항-IL-11Rα 항체의 효과를 결정했다.

5주령 수컷 C57BL/6N 마우스에게 60kcal% 지방(A06071302, Research Diets)(HFMCD 식이)가 보충된 NASH-유발 메티오닌/콜린 결핍(MCD) 식이를 공급했다. 대조군 마우스는 정상 고형사료(NC, Specialty Feeds)를 공급했다. HFMCD 식이로 6주 후, IL-11이 상향조절되고 콜라겐이 축적되는 경우, 항-IL-11Rα 항체 BSO-9A7(10mg/kg)을 4주 동안 격주로 투여했다. 간 및 혈청을 10주에서 수집하고, ERK 활성화, 간 하이드록시프롤린 함량 및 혈청 ALT 수준에 대해 분석했다. 간에서 총 및 포스포릴화 ERK 수준은 Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickyme Biosciences)를 사용하여 측정하고, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 혈청 수준은 알라닌 트랜스아미나제 활성 검정 키트(ab105134, abcam)를 사용하여 측정했다.

결과는 도 15a 내지 15c에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 요법은 ERK 활성화를 폐지하고(15a) 간 섬유증(15b) 및 혈청 ALT 수준(15c)의 진행을 억제한 반면, 지방간은 변화하지 않았다.

항-IL-11Rα 요법은, 고도의 NASH의 또 다른 모델에서 조사했다. 2일령 C57BL/6 마우스에게 200㎍ 스트렙토조토신의 단일 피하 주사를 투여하고, 4주 동안 정상 고형사료 식이를 공급했다. 이어서, 마우스를 HFMCD 식이로 7주 동안 교환하고, 이어서 후속 7주 동안 주당 3회 10mg/kg 항-IL-11Rα 항체 BSO-9A7 또는 IgG 대조군을 HFMCD 식이와 함께 처리했다. RNA 발현은 섬유증 및 염증 유전자 Col1a1, Col1a2, Col1a3, Timp1, Tgfβ1, Mmp2, Tnfα, Ccl2 및 Ccl5에 대해 측정했다.

결과는 도 15d에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 요법은 섬유증 및 염증을 나타내는 유전자의 발현을 강력하게 억제하는 것으로 밝혀졌다.

10.3 IL-11 신호전달의 중화는 간 섬유증을 역전시킨다

몇몇 간 섬유증은 마우스에게 10주 동안 NASH MCD 식이를 공급함으로써 확립했다. 이어서, 사료를 정상 고형사료(NC)로 교환하고, 마우스를 6주 동안 주당 2회 항-IL-11Rα 항체 BSO-9A7(20mg/kg)로 처리했다. 실험 동안 마우스에게 NC 식이를 공급하고, IgG 항체를 대조군으로 사용했다. 총 콜라겐은 상기 기재된 바와 같이 간 하이드록시프롤린 함량을 검출함으로써 측정했다. mRNA 발현은 상기 기재된 바와 같이 qPCR에 의해 측정했다.

결과는 도 16에 제시되어 있다. 간 콜라겐 함량은 항-IL-11Rα 항체 처리의 3주 후에 유의적으로 역전되었고, 보다 큰 역전은 6주에서 관찰되었다(16A). 특히, 간 콜라겐 함량은, 실험 동안 IgG 대조군-처리된 동물에서 변화하지 않았다. 그래프는 10주에서 항체를 첨가한 후의 총 수를 나타낸다.

간 섬유증의 역전은, 형질전환된 HSC가 노화 또는 불활성, ACTA2^-ve 세포 상태에 대한 역전을 받는 경우에 바람직하다. 항-IL-11Rα 항체 요법은 Acta2, Mmp2 및 Timp1 발현을 감소시키고 노화 마커 p21, p16 및 p53을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

IL-11 신호전달이 형질전환된 상태에서 HSC를 유지하는데 필요한지를 직접 조사하기 위해, HSC를 72시간 동안 TGFβ1(5ng/ml) 또는 PDGF(20ng/ml)로 자극시키고, 이어서 진행 TGFβ1 또는 PDGF 자극의 존재하에 항-IL-11Rα 항체 BSO-9A7 또는 IgG 대조군(2㎍/ml)으로 추가로 24시간 동안 처리했다. 비자극된 HSC를 비-섬유성 대조군으로 사용했다. ACTA2^+ve 세포 및 분비된 콜라겐을 면역염색에 의해 검출하고, 형광을 정량화했다. ERK 활성은 웨스턴 블롯에 의해 검출했다.

결과는 도 17a 내지 17e에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 처리는, ACTA2^+ve 세포의 퍼센트(17a, b) 및 분비된 콜라겐의 양(17c, d)을 IL-11 신호전달 억제의 24시간 이내에 기준선 수준에 근접하게 역전시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, ERK 활성은, 진행 TGFβ1/PDGF 자극에도 불구하고, 24시간 이내에 대폭 감소하는 것으로 밝혀졌다(17e).

따라서, 항-IL-11Rα 요법에 의한 IL-11 의존적 HSC 형질전환의 억제는 HSC 노화 및 역전을 유발하여 섬유증 퇴행을 유도한다.

초기 단계 NASH에서 항-IL-11Rα 요법의 효과를 조사했다. NASH의 HFMCD 식이 모델에서, 염증은 6주에서 피크에 도달하고, 이어서 중증 섬유증의 단계가 이어진다. 마우스는 1주 동안 HFMCD 식이를 공급하고, 이어서 10mg/kg 항-IL-11Rα 항체 BSO-9A7 또는 IgG 대조군으로 식이를 추가 5주 동안 주당 2회 처리했다. 정상 고형사료(NC) 식이를 대조군으로 사용했다. 또한, 간 하이드록시프롤린 함량 및 혈청 ALT 수준은 0.5, 1 및 5mg/kg 항-IL-11Rα 항체를 사용하여 검출했다. ERK 포스포릴화, 간 하이드록시프롤린 함량 및 혈청 ALT 수준은 전과 같이 평가했다. 간 트리글리세라이드(TG) 측정은 트리글리세라이드 비색 검정 키트(10010303, Cayman)를 사용하여 수행했다. 간 조직은 48시간 동안 실온에서 10% 중성-완충된 포르말린(NBF)에서 고정시키고, 탈수하고, 파라핀 블록에 포매하고, 7㎛로 절편화했다. 매슨 트리크롬으로 염색한 절편은 광학 현미경, 스케일 바 100㎛에 의해 검사했다.

결과는 도 18a 내지 18g에 제시되어 있다. 초기 지방간염 동안 항-IL-11Rα 요법을 사용한 IL-11 신호전달의 억제는, 지방증이 현저히 낮고 지질 액적(18a) 및 트리글리세라이드 함량(18b) 둘 다가 유의적으로 감소된 간을 갖는 마우스를 가져 왔다. HFMCD 식이는 1주 후에 현저한 지방간염 및 간 손상을 유발하고(ALT>700 U L-1), 이는 항-IL-11Rα 요법의 3주 후에 용량-의존적 방식으로 정상 근처로 역전시켰다(18c, 18d). 간 하이드록시프롤린(콜라겐) 함량(18e) 및 ERK 포스포릴화(18G)는 6주에 걸쳐 증가하지 않았고, 이는 항-IL-11Rα 처리된 마우스가 실험 동안 섬유증을 발생하지 않았음을 입증하고 IL-11 신호전달의 억제와 연관된 강력한 항-섬유화 효과를 재확인한다. 항-IL-11Rα 요법은 간 하이드록시프롤린(콜라겐) 함량에 대해 용량-의존적 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(18f).

NASH 마우스 모델에서 섬유화촉진 및 염증유발성 유전자의 발현에 대한 항-IL-11Rα 처리의 효과는 전과 같이 수행된 RNA-seq 및 qPCR을 사용하여 평가했다. 지질 대사와 관련된 유전자의 발현(ACOX1, SCD1, FASN 및 SREBF1)도 또한 평가했다.

결과는 도 18h 내지 18k에 제시되어 있다. 섬유화촉진 및 염증유발성 유전자의 상향조절은 항-IL-11Rα 요법 후에 폐지되었다. 섬유화촉진 및 염증유발성 유전자 Z-스코어(백만 맵핑된 판독치당 전사물, TMP)의 차동 발현 히트맵은 항-IL-11Rα 처리가, NC 대조군 식이(비-NASH)를 공급한 마우스에서 관찰된 것과 유사한 섬유화촉진 및 염증유발성 유전자의 발현을 생성했음을 나타낸다(18g). 염증 마커 Tnfα 및 Ccl2(18i) 또는 섬유화촉진 마커 Tgfβ1, Acta2, Timp1, Col1a1, Col1a2 또는 Col3a1(18j)은 항-IL-11Rα 요법으로 처리한 마우스에서 상향조절되지 않았다. 지질 대사 유전자 발현은 또한 항-IL-11Rα 요법에 의해 재확립되는 것으로 밝혀졌다(18k).

따라서, IL-11 신호전달의 중화는 초기 단계 NASH에서 간 손상을 역전시킨다.

상주 마크로파지 및 침윤 단핵구는 NASH 병인에 중요하고, 질환 진행 동안 TGFβ1의 주요 공급원이다. 초기 NASH 모델에서 간 염증 세포 모집단을 일반적으로 면역(CD45⁺) 세포의 존재 및 특히 Ly6C^+veTGFβ1^+ve 세포의 존재에 대해 검사했다.

면역 세포는 이전에 기재된 바와 같이 단리했다[참조: Sheng, J., Ruedl, C. & Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity 43, 382-393 (2015)]. 간 조직을 다지고, 37℃에서 1시간 동안 100㎍/ml 콜라게나제 IV 및 20U/ml DNase I으로 소화시켰다. 소화 후, 세포를 스트레이너에 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수득하고, 면역 세포의 단리를 위해 퍼콜 구배 원심분리에 제공했다. CyTOF(비행 시간별 질량 세포분석) 염색을 이전에 기재된 바와 같이 수행했다[참조: Chew, V. et al. Delineation of an immunosuppressive gradient in hepatocellular carcinoma using high-dimensional proteomic and transcriptomic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, E5900-E5909 (2017)]. 세포를 해동시키고, 시스플라틴(Fluidigm)으로 염색하여 살아있는 세포를 동정하고, 이어서 바코드화 목적을 위해 금속-접합된 CD45 항체로 염색했다. 바코드화 후, 세포를 금속-접합된 세포 표면 항체(Ly6C)로 염색했다. 이어서, 세포를 1.6% PFA로 고정시키고, 100% 메탄올에 투과시키고, 세포내 항체 염색(TGFβ1)을 실시했다. 세포를 최종적으로 DNA 인터칼레이터로 표지한 다음, 헬리오스(Helios) 질향 세포분석(Fluidigm)으로 취득했다. 분석을 위해, 최초 살아있는 단일 세포를 확인하고, 이어서 바코드를 해독하여 개개 샘플을 확인했다. 수동 게이팅은 Flowjo 소프트웨어(Flowjo, LLC, USA)를 사용하여 수행했다.

결과는 도 19a 내지 19c에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 항체 요법은 처리된 간에서 CD45⁺ 세포의 수를 감소시키고(19a) Ly6C^+veTGFβ1^+ve 세포에서는 특정의 감소를 유발하는 것으로 밝혀졌다(19b). 순환 TGFβ1 수준은 HFMCD 식이에 의해 상승되지만, 항체 요법에 의해 감소되었고, 이는 항-IL-11Rα 요법이 질환을 변형하는 것을 나타낸다(19c).

요약하면, IL-11은 HSC 활성화 및 형질전환에 필요하고, HSC 병리생물학에 중심 역할을 한다. IL-11 중화 항체는 항-섬유증 효과 뿐만 아니라 질환-변형 요법 효과를 나타낸다. IL-11Rα 항체는 TGFβ1 또는 PDGF의 하류에서 간 성상 세포(HSC) 활성화를 역전시킬 수 있다. IL-11 신호전달의 억제는 염증 및 지방증을 예방하고, 질환의 후기 단계 동안 간 섬유증 및 간세포 손상을 역전시킬 수 있다. 조기에 제공될 때, 지방간염 동안, 항-IL-11 요법은 HSC로부터 염증 신호를 차단하고, 간세포 손상을 예방하고, HSC-마크로파지 상호작용의 억제를 통해 대사 기능을 개선시킨다. 본 발명자들은 간 병리생물학에서 IL-11의 인식되지 않은 중심적 역할을 확인했다. IL-11 신호전달을 중화 항체로 표적화하는 것은 NASH의 스펙트럼에 걸쳐 섬유증, 지방증, 간세포 사멸 및 염증을 역전시킨다.

실시예 11: IL-11Rα에 대한 9A7의 결합의 친화성 분석

항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7(VH = 서열번호 7, VL = 서열번호 13)은 BIAcore T200을 사용하여 멀티-사이클 동력학 분석에 의해 인간 IL-11Rα에 대한 결합 친화성에 대해 분석했다.

요약하면, 재조합 인간 IL-11Rα(Sino Biological Cat. No. 10252-H08H)을 칩 상에 고정화하고, 작동 완충액(0.5% BSA 및 150mM NaCl을 함유하는 HBS-P+ 완충액)에서 40㎕/min의 유속으로 칩 상에 IgG1 포맷으로 상이한 농도의 항체를 유동시킴으로써 수행했다. 결합 시간은 240초였고, 해리 시간은 400초였다. 표면은 글리신 pH 1.7을 사용하여 재생시켰다.

2개의 별도 분석을 수행했다:

· 제1(도 20에서 (1))은 하기 농도의 BSO-9A7을 사용했다: 100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM, 3.125nM 및 1.56nM.

· 제2(도 20에서 (2))는 하기 농도의 BSO-9A7을 사용: 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM, 3.125nM 및 1.56nM.

수득된 생 데이터의 분석은 BIAcore T200 평가 소프트웨어 V2.0.1을 사용하여 수행하고, 배경-차감 데이터를 1:1 상호작용 모델에 적합시켰다.

2개 분석의 결과는 도 20에 제시되어 있다. BSO-9A7은 나노몰 친화성으로 인간 IL-11Rα에 결합하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 12: 9A7의 생화학적 분석

항-IL-11Ra 항체 클론 BSO-9A7은 IL-11 신호전달을 억제하는 이의 능력에 대해 분석했다.

HSC를 IgG(4㎍/ml) 및 상이한 농도의 9A7(4㎍/ml 내지 61pg/ml; 4배 희석)의 존재하에 TGFβ1(5ng/ml, 24시간)으로 자극시켰다. 상청액을 수집하고, 분비된 MMP2의 양에 대해 검정했다. 용량-반응 곡선은, 최소 제곱(통상) 적합을 사용하여, 9A7 시험 농도(pM) 대 상응하는 퍼센트 억제 값의 로그를 플롯팅함으로써 생성했다. IC50 값은 로그(억제제) 대 정규화 반응-변수 구배 방정식을 사용하여 계산했다.

결과는 도 21에 제시되어 있다. BSO-9A7은, 5.4pM의 IC50으로, HSC로부터 섬유형성 단백질 분비를 차단했다.

항-IL-11Rα 항체 클론 BSO-9A7을 약물동태 연구에 사용했다. C57BL/6J 마우스(10-12주령)에게 안와 후방 주사했다(PBS 중의 100㎕의 새롭게 방사성표지된 ¹²⁵I-9A7(5μCi, 2.5㎍)을 분석). 마우스는 2% 이소플루란으로 마취하고, 혈액을 하악 출혈을 통해 주사후 몇몇 시점(2, 5, 10, 15, 30분, 1, 175 2, 4, 6, 8시간, 1, 2, 3, 7, 14 및 21일)에서 수집했다. 생체내분포 연구를 위해, 혈액을 심장 천자를 통해 수집하고, 조직을 하기 시점에서 수거했다: 주사후 1, 4시간, 1, 3, 7, 14, 21일. 붕괴-보정(100㎕ 용량의 100× 희석)과 함께 감마 카운터(2480 Wizard2, Perkin Elmer)를 사용하여 방사능 함량을 측정했다. 측정된 방사능을 % 주사된 용량/조직 g으로 정규화했다.

결과는 도 22a 및 22b에 제시되어 있다. ¹²⁵I-9A7을 사용한 약물동태 연구는 18일 초과의 생체내 반감기(22a) 및 간에서 강력한 흡수(22b)를 나타냈다.

실시예 13: 소모성 질환에 대한 항-IL-11Rα 항체의 효과

HFMCD 식이의 동물은 체중을 상실하고, 매우 몸이 불편해졌다(또한 실시예 10.2 참조). IL-11 신호전달의 억제는 HFMCD에 의해 유발된 체중 감소를 개선하고, 9A7 항체는 체중 증가에 대한 용량 의존적 효과를 나타냈다.

5주령 수컷 마우스는, 소모를 유도하기 위해 1주일 전에 HFMCD 또는 정상 고형사료(NC) 식이를 공급하여, MCD 마우스에서 체중의 ~15% 감소를 가져 왔다. 첫주 후, 마우스에게 0.5, 1, 5 또는 10mg/kg의 항-IL-11Rα 항체 9A7을 주당 2회 복강내 주사했다. 10mg/kg의 IgG 이소형 항체를 대조군으로 사용했다. 체중 및 음식 소비는 매주 측정했다. 음식 소비의 경우, 평균 음식 섭취는 케이지(케이지당 n=3 마우스)의 음식 호퍼에서 측정했다(g/마우스/주).

결과는 도 23a 및 23b에 제시되어 있다. 항-IL-11Rα 요법은 체중의 용량-의존적 증가(23a) 및 음식 소비(23b)를 제공하는 것으로 밝혀졌고, 이는 소모의 역전을 나타낸다. 최고 용량은 최대 소모-역전 효과를 나타냈다. NC 식이를 공급한 마우스는 착실하게 체중이 증가했지만, HFMCD 식이를 공급하고 IgG 대조군으로 처리한 마우스는 처리 과정에서 체중의 약 30%를 상실했다. 최고 용량은 음식 소비에 대해 최대 효과를 가졌지만, IgG 대조군으로 처리한 마우스는 음식 소비에서 약간의 감소를 나타냈다.

급성 질환, 예를 들면, 외상 또는 패혈증은 소모, 예를 들면, 식욕부진 및 악액질과 연관될 수 있다. 급성 신장 손상의 마우스 모델에서 식욕부진 및 악액질에 대한 IL-11-매개 신호전달의 길항작용의 효과를 연구했다. 신장 손상은 10주령 수컷 마우스에게 비히클(0.3M NaHCO3) 중의 엽산(180mg/kg)의 IP 주사에 의해 유발하고; 대조군 마우스는 비히클 단독을 투여했다. 동물은 주사후 28일에 희생시켰다. 마우스는, 엽산 투여 1시간 전에 개시하여 마우스가 희생될 때까지, 20mg/kg의 항-IL-11RA 항체 또는 동일한 농도의 IgG 이소형 대조군으로 3일마다 복강내 주사했다.

엽산-유발된 신장 손상은 중증 및 양측성 신장 손상의 급성기와 연관된 급속한 식욕부진/악액질-연관 체중 감소를 야기하는 것으로 밝혀졌다. 손상 시점 및 손상 기간 동안 항-IL-11Rα 항체를 제공받은 마우스(n=7/그룹)는, IgG 대조군과 비교하여, 조기에 체중을 회복했고, 3주 후까지 정상 체중 또는 거의 정상 체중으로 회복했다.

별도로, 신장 손상은 엽산의 IP 주사에 의해 전과 같이 유발한다. 마우스는 신장 손상의 21일부터 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 대조군으로 처리했다. 동물 체중은 항체 처리 전후에 평가한다. 엽산을 제공받지 않은 건강한 마우스를 대조군으로 사용했다. 항-IL-11Rα 항체로 처리한 동물은 처리 개시시에 체중을 획득하기 시작하고, 이는 소모-연관된 체중 감소가 후기 질환에서 개선될 수 있음을 나타낸다.

실시예 14: BSO-9A7의 인간화 변이체의 특성화

BSO-9A7 VH 및 VL 서열의 인간화 버젼은, 서열번호 8 내지 12 및 14 내지 17에 제시된 바와 같이 설계했다.

14.1 결합 분석

5개 인간화 중쇄 및 4개 인간화 경쇄의 조합을 생성하고, IL-11Rα에 대한 결합에 대해 시험했다. IL-11R에 대한 20개 인간화 변이체의 결합은 단일 사이클 동력학 분석에 의해 시험했다:

· VH1/VL1; VH1/VL2; VH1/VL3; VH1/VL4;

· VH2/VL1; VH2/VL2; VH2/VL3; VH2/VL4;

· VH3/VL1; VH3/VL2; VH3/VL3; VH3/VL4;

· VH4/VL1; VH4/VL2; VH4/VL3; VH4/VL4;

· VH5/VL1; VH5/VL2; VH5/VL3; VH5/VL4.

이 분석으로부터, 6개 항체를 추가로 평가하기 위해 동정했다: VH3/VL2; VH3/VL3; VH3/VL4; VH4/VL2; VH4/VL3 및; VH4/VL4.

6개 항체는, Biacore T200 장치를 사용하여, 0.1% BSA를 함유하는 HBS-P+ 작동 완충액(pH 7.4)으로 실행하는, 1㎍/ml의 최종 농도에서 다중-사이클 동력학 분석에 의해 평가했다.

동력한 파라미터는 하기 표에 제시되어 있다. 상대적 KD는 인간화 변이체의 KD를 동일한 실험에서 분석한 9A7 항체의 KD로 나누어 계산했다. 6개 모든 인간화 항체는 9A7의 2배 이내에서 IL-11R에 결합했다(서열번호 7 및 13).

14.2 인간화 항-IL-11Rα 항체의 시험관내 성능

6개 항체는, TGFβ1에 반응하여 초대 인간 심방 섬유아세포로부터 분비된 내인성 IL-11을 중화하는 능력에 대해 시험했다. 9A7은 양성 대조군으로 포함되었다. 검정은 실시예 2.5.2에 기재된 바와 같이 수행했다. 인간 섬유아세포에 의한 상청액으로의 MMP2 분비를 평가하여, 억제 %를 추정했다.

결과는 도 24에 제시되어 있다. 모든 항체는 IL-11Rα에 결합하고, 내인적으로 생산된 IL-11이 수용체와 상호작용하는 것을 차단한다. IL-11 신호전달은 중화되고, 섬유형성 단백질 MMP2의 생산을 억제한다.

선택된 인간화 클론의 성능은, 인간 간 성상 세포에서 추가로 시험했다. 이전과 같이, 세포를 5ng/ml TGFβ1 및 상이한 농도의 VH3/VL3 또는 VH4/VH4와 함께 인큐베이팅했다. 시험관내 섬유성 반응의 중화는 상청액 내로 MMP2 분비를 모니터링함으로써 평가하여, 억제 %를 추정했다.

도 25는, 항-IL-11Rα 항체가 내인성 IL-11 신호전달을 차단하고 섬유형성 단백질 MMP2의 생산을 억제하는 것을 나타낸다.

유사한 검정은 인간 폐 섬유아세포에서 수행했다. 초대 인간 폐 섬유아세포를 TGFB1(5ng/ml) 및 상이한 농도의 9A7, VH3/VL3 또는 VH4/VH4와 함께 인큐베이팅했다. 섬유성 반응의 중화는 상청액 내로 TIMP1 분비를 모니터링함으로써 평가하여, 억제 %를 추정했다.

도 26은 항-IL-11Rα 항체가 내인성 IL-11 신호전달을 차단하고, 섬유형성 단백질 TIMP1의 생산을 억제하는 것을 나타낸다.

14.3 인간화 항-IL-11Rα 항체의 생체내 성능

인간화 항-인간 IL-11Rα 항체의 치료적 유용성은, 예를 들면, 실시예 5, 6, 10 및 12에서 수행된 바와 같이, 각종 상이한 조직에 대한 섬유증의 마우스 모델에서 생체내 임증된다.

중화 인간화 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는 감소된 섬유화 반응을 갖는다.

실시예 15: 대사 장애에 대한 항-IL-11Rα 항체의 효과

인간화 항-IL-11Rα 항체 VH4/VL4의 효과는 비만 및 II형 당뇨병 등의 대사성 질환을 갖는 마우스에서 조사했다. 프럭토즈와 함께 서양 식이(WDF)을 사용하여, 비만, II형 당뇨병 및 비-알콜성 지방 간 질환(NAFLD) 동안 인간의 것과 가장 유사한 대사 장애를 확립했다[참조: Baena et al., Sci Rep (2016) 6: 26149, Machado et al., PLoS One (2015) 10:e0127991]. 마우스는, 연령 12주부터, 16주 동안 음료수(WDF) 중에 15% 중량/용적 프럭토즈가 보충된 서양 식이(D12079B, Research Diets)를 공급했다. 대조군 대상체는 정상 고형사료(NC, Specialty Feeds) 및 음료수를 공급했다. IgG 항체를 대조군으로 사용했다.

도 27a 및 27b는 WDF를 공급한 항-IL-11Rα 항체-처리된 마우스가, WDF를 공급한 대조군 IgG 항체-처리된 마우스와 비교하는 경우, 체중(A) 및 지방 양(B)의 유의적 감소를 나타냈음을 보여준다. 또한, 근육량의 증가가 IgG 대조군-처리된 마우스와 비교하여 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스에서 관찰되었고, 이는 WDF-유발된 대사 병인 동안 IL-11 신호전달의 억제가 근육량을 회복했음을 시사한다. 추가로, 복강내 글루코즈 내성 시험(ipGTT) 결과는, 공복 글루코즈와 함께, 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스에서 글루코즈 내성의 현저한 개선을 나타냈다(도 27c 및 27d).

분석은 췌장에 대한 효과까지 확장했다. WDF를 공급한 항-IL-11Rα 항체-처리된 마우스는, 예상외로, IgG 대조군-처리된 마우스와 비교하는 경우, 8 내지 16주 처리(대사성 질환과 연관된 효과에 대한 보호) 또는 16 내지 24주 처리(대사성 질환과 연관된 효과의 역전)하든지 췌장의 WDF-유발된 손상에 대한 현저한 보호를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 27e).

도 27f는, WDF를 공급한 항-IL-11Rα 항체-처리된 마우스가, WDF를 공급한 대조군 IgG 항체-처리된 마우스와 비교하여 현저히 낮은 혈청 콜레스테롤 수준을 갖는 것을 나타내고, 도 27g는, WDF를 공급한 항-IL-11Rα 항체-처리된 마우스가, WDF를 공급한 대조군 IgG 항체-처리된 마우스와 비교하여, 현저히 낮은 혈청 트리글리세라이드 수준을 갖는 것을 나타낸다. 도 27h는, WDF를 공급한 항-IL-11Rα 항체-처리된 마우스가, WDF를 공급한 대조군 IgG 항체-처리된 마우스와 비교하여, 현저히 낮은 공복 혈중 글루코즈 수준을 갖는 것을 나타낸다.

더욱이, 췌장의 면역-조직학은 또한, II형 당뇨병의 고전적 특징인 IgG 처리된 WDF 공급 마우스에서 췌도 과형성(도 27i 및 27j)과 함께 췌도에서 글루카곤 및 인슐린 염색의 증가를 나타냈다[참조: Bonner-Weir and O'Brien Diabetes (2008) 57:2899-2904]. 16주부터 24주까지 WDF 공급 마우스에서 항-IL-11Rα 항체 처리는, 췌도 과형성 및 글루카곤 염색을 현저히 감소시켰을 뿐만 아니라 WDF로 공급한 마우스의 췌도에서 인슐린 발현을 개선시켰고, 이는 IL-11 매개 신호전달의 길항작용이 서양형 식이에 의해 유발된 대사성 질환을 개선 및 역전시키는데 유용하다는 것을 시사한다.

HFMCD 모델은 조기 발증형 지방성 간엽, 이어서 섬유증을 갖는다. 그러나, 이 모델은 비만 또는 인슐린 저항성은 아니다. WDF-유발된 NASH의 모델을 사용하여, 비만, 인슐린 저항성 및 당뇨병과 관련하여 항-IL-11R 요법의 효과를 시험했다. 마우스는 16주 동안 WDF를 공급했고, 이때 이들은 비만이고 간 지방증, 염증 및 섬유증과 함께 인슐린 저항성이었다. 이어서, 항-IL-11Rα 항체에 의한 처리를 개시했다. IL-11 신호전달이 표적화되는 경우, 간 Erk 활성화는 NASH 간에서 억제되었다(도 28A), 유사한 체중 증가에도 불구하고, 항-IL-11Rα 요법에 따르는 마우스에서는 간 섬유증, 지방증, 염증의 역전 및 혈청 ALT 수준의 감소가 관찰되었다. 이는 혈청 글루코즈, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준의 감소를 수반했다(도 28B-28G). 따라서, 중화 항-IL-11Rα 요법은 WDF-유발된 NASH 병태를 역전시킨다.

따라서, 데이터는, 항-IL-11Rα 요법이 섬유증을 역전시키는 것을 나타냈지만, 이 효과가 지속성 및 진행성인지는 평가하지 않았다. 추가로, 병용 요법은 NASH에서 섬유증의 역전에 유익할 수 있다. 이러한 점을 해결하기 위해, 중증 간 섬유증을 10주 동안 HFMCD를 사용하여 확립하고, 이어서 마우스를 정상 고형사료로 전환하고, 강력한 대사 개입을 모방하고, 항-IL-11Rα 항체 처리를 병행하여 개시했다(도 29a). 대사 자극을 제거하면, Erk 활성화는 서서히 퇴행하고, 이는 항체 처리에 의해 가속되었다. 섬유증은 실험 기간 동안 IgG 처리된 동물에서 변하지 않았고, 이는 완전한 대사 보정만으로는 섬유증을 역전시키지 않거나 섬유증을 매우 서서히 역전시키는 것을 시사한다. 대조적으로, 간 콜라겐 함량은, 6주에서 추가의 역전(46%)과 함께 항체 처리 3주 후에 현저히 역전되었고(24%), 이는 진행성 및 지속성 효과를 나타낸다(도 29b).

섬유증의 퇴행은 보다 낮은 TIMP 및 보다 높은 MMP 수준과 연관되고, 이는 바람직한 매트릭스 리모델링을 촉진한다. 이와 일치하여, 중증 섬유증을 갖는 항-IL-11Rα 항체 처리된 마우스는 Mmp2를 신속하게 상향조절하고 Timp1을 하향조절하는 것으로 밝혀졌다. 간 섬유증의 역전은, 형질전환된 HSC가 아폽토시스, 노화 및/또는 불활성 ACTA2-ve 상태로 복귀하는 경우에 유리하다. IL-11이 형질전환된 상태에서 HSC를 유지하는데 필요한지를 확인하기 위해, HSC를 TGFβ1 또는 PDGF로 자극하고, 이어서 IL-11 신호전달을 억제했다. IL-11 억제 24시간 이내에, ACTA2+ve 세포의 퍼센트 및 분비된 콜라겐의 양은 거의 기준선 수준으로 역전되었고, ERK 활성은 TGFβ1/PDGF 자극이 진행하고 있음에도 불구하고 크게 감소했다.

실시예 16: 간독성에서 IL-11 신호전달의 억제 효과

16.1 간독성에 대한 항-IL-11 요법의 효과

IL-11은 직접 간세포 세포 사멸을 유발하고, 간의 재생 능력을 제한하는 것으로 공지되어 있는 간세포를 기능부전의 부분 상피 간엽계 세포 전이(EMT) 상태로 유도한다[참조: Grant Rowe et al. Molecular and Cellular Biology 2011; 31 (12): 2392-2403]. 초대 인간 간세포는 IL-11Rα 수용체를 고도로 발현하는 것으로 밝혀졌고, IL-11 자극은, 생리학적 관련 용량 범위에 걸쳐 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)에서 점진적 증가에 의해 입증된 바와 같이, 용량-의존적 간세포 세포 사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌고, H₂O₂에 의한 인간 간세포의 자극은 상청액에서 10배까지 IL-11 상향조절을 야기한다(도 30a 내지 30c).

아세트아미노펜(APAP)-유발된 간 손상의 마우스 모델을 사용하여, 간독성에 대한 항-IL-11 요법의 효과를 조사했다. 12-14주령 수컷 마우스를 공복상태로 되게 하고, APAP(A3035, Sigma) 주사(IP, 400mg/kg) 16시간 전에 10mg/kg의 항-IL-11Rα 항체 또는 IgG 이소형 대조군을 복강내(IP) 주사했다. 마우스를 APAP 투여 24시간 후에 희생시켰다. 마우스 혈장 및 간세포 상청액 중의 IL-11의 수준은, 제조업자의 프로토콜에 따라, 각각 마우스 IL-11 DuoSet(DY418 및 DY008, R&D Systems) 및 인간 IL-11 Quantikine ELISA 키트(D1100, R&D Systems)를 사용하여 정량화했다. 간 샘플을 절개하고, 48시간 동안 실온에서 10% 중성-완충된 포르말린(NBF)에 고정시키고, 탈수시키고, 파라핀 블록에 포매하고, 7㎛로 절편화했다. 절편은 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 광학 현미경으로 검사했다.

도 30d 내지 30f는 단일 용량의 항-IL-11Rα 항체 요법을 제공받은 마우스가 현저히 낮은 ALT 수준(IgG 대조군과 비교하여 55% 낮음; 30d)을 갖고, 즉 간 손상의 정도를 현저히 감소시킨 것을 나타낸다. 항-IL-11 요법은 또한, IgG 대조군 항체에서 간 질량의 24% 감소와 비교하여(간 지수: 30e), 간 세포의 파괴를 반영하는 간 질량의 APAP-유발된 감소를 방지하는 것으로 밝혀졌다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의한 간 조직학은 IgG-처리된 마우스에서 중증 중심엽 괴사, APAP 독성의 전형적 조직학적 특징을 나타냈고, 이는 항-IL-11Rα 요법에서 감소하는 것으로 밝혀졌다(30f).

IgG 대조군 또는 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스의 이동성 및 활성을 APAP 처리 24시간 후에 관찰했다. 대조군 IgG-처리된 마우스는 불량한 건강의 시각적 특징(예를 들면, 입모, 구부러진 자세)을 갖는 정적/빈사 상태인 것으로 밝혀진 반면, 항-IL-11Rα 항체로 처리한 마우스는 정상 이동성 및 활성을 가졌다.

따라서, IL-11Rα를 차단함으로써 IL-11 신호전달의 억제는 APAP-유발된 간 손상(약물 유발된 간 손상; DILI)의 허용된 번역 모델에서 간독성을 방지한다.

16.2 IL-11 매개 신호전달의 길항작용은 약물-유발된 세포 사멸로부터 간세포를 보호한다.

간세포 생존율에 대한 IL-11 매개 신호전달의 길항작용의 효과를 시험관내에서 분석했다.

인간 간세포를, 길항제 항-IL-11Rα 항체(2㎍/ml) 또는 이소형-일치 IgG 대조군(IgG, 2㎍/ml)의 부재(기준선, BL) 또는 존재하에 최종 농도 20mM로 24시간 동안 APAP(A3035, Sigma)로 처리했다.

이어서, 제조업자의 지시에 따라 FITC 아넥신 V/사멸 세포 아폽토시스 키트(V13242, Thermo Fisher)를 사용하여 간세포를 염색하고, 아넥신 V-FITC/PI-염색된 세포는 BD LSRFortessa 유세포 분석기(BD Bioscience)를 사용하여 유세포 분석에 의해 분석했다. 샘플당 10,000 세포를 분석했다. 데이터는 FlowJo 버전 7 소프트웨어를 사용하여 분석했다.

도 31a는, IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제에 의한 간세포의 처리가 사멸 간세포의 비율을 실질적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌음을 나타낸다.

별도의 실험에서, 간세포를 길항체 항-IL-11Rα 항체(2㎍/ml) 또는 이소형-일치 IgG 대조군 항체(IgG, 2㎍/ml)의 부재(기준선, BL) 또는 존재하에 24시간 동안 10mM의 최종 농도로 APAP(A3035, Sigma)로 처리했다. 단백질 추출물은, 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Thermo Scientifics)를 함유하는 방사성면역침전 검정(RIPA) 완충액을 사용하여 간세포로부터 제조하고, 이어서 원심분리하여 용해물을 제거했다. 단백질 농도는 브레드포드(Bradford) 검정(Bio-Rad)으로 결정했다. 동일한 양의 단백질 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 막으로 옮기고, 지시된 일차 항체(ERK, pERK, pJNK)에 대한 면역블롯 분석을 수행했다. 단백질은 적절한 이차 항체로 ECL 검출 시스템(Pierce)을 사용하여 시각화했다.

도 31b는, APAP에 의한 간세포의 처리가 p-ERK 및 pJNK(참조: BL 대 IgG)의 수준을 현저히 상향조절하는 것으로 밝혀졌음을 나타낸다. IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제에 의한 간세포의 처리는 p-ERK 및 pJNK(참조: IgG 대 항-IL-11Rα 항체)의 수준을 실질적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌음을 나타낸다.

16.3 IL-11 매개 신호전달의 길항작용은 약물-유발된 간 손상으로부터 보호한다.

중증 APAP 과복용(400mg/kg) 또는 동등한 용적의 식염수를 IP 주사에 의해 12-14주령 수컷 마우스에게 투여하고, 16시간 후 20mg/kg의 길항제 항-IL-11Rα 항체 또는 이소형-일치 IgG 대조군 항체를 IP 투여했다.

APAP 투여 24시간 후, 마우스를 안락사시켰다. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 수준은 제조업자의 지시에 따라 ALT 활성 검정 키트(ab105134, Abcam)를 사용하여 측정하고, 간을 회수하고, 48시간 동안 실온에서 10% 중성-완충된 포르말린(NBF)에 고정시키고, 탈수하고, 파라핀 블록에 포매하고, 7㎛로 절편화했다. 절편을 표준 프로토콜에 따라 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고, 광학 현미경으로 검사했다.

결과는 도 32a 및 32b에 제시되어 있다. IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제에 의한 전처리는, 혈청 ALT 수준의 실질적 감소에 의해 결정된 바와 같이, 간 기능의 DILI-연관 억제로부터 마우스를 현저히 보호하는 것으로 밝혀졌다(도 32a). 또한, IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제로 전처리된 마우스의 간은, IgG-처리된 대조군의 간과 비교하여, 실질적으로 적은 간세포 괴사를 나타냈다(도 32b).

16.4 약물-유발된 간 손상 후에 IL-11 매개 신호전달의 길항작용은 간 손상의 증상을 역전시키고 간 기능을 회복시킨다.

중증 APAP 과복용(400mg/kg) 또는 동등한 용적의 식염수를 IP 주사에 의해 12-14주령 수컷 마우스에게 투여하고, 10시간 후, 마우스에게 20mg/kg의 길항제 항-IL-11Rα 항체 및 이소형-일치 IgG 대조군 항체를 IP 투여하거나, 무처리했다. 마우스를 24, 36 및 48시간에서 안락사시켰다. 혈청 ALT 수준은 실시예 16.3에 기재된 바와 같이 분석했다. 간을 수거하고, 실시예 16.3에 기재된 바와 같이 고정시키고, 디지탈 사진을 촬영했다.

결과는 도 33a 및 33b에 제시되어 있다. 중증 APAP 과복용의 10시간 후에 투여된 IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제는, APAP로 처리하지 않은 마우스의 것으로 총 간 형태를 회복시키는 것으로 밝혀졌다(도 33a). 추가로, 중증 APAP 과복용의 10시간 후에 투여된 IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제는, 혈청 ALT 수준에서 실질적 감소에 의해 결정된 바와 같이, 간 기능의 DILI-연관 억제로부터 마우스를 구제하는 것으로 입증되었다(도 33b).

또한, 마우스의 간으로부터 제조된 단백질 추출물에 대해 웨스턴 블롯을 수행했다. 간 조직을, 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Thermo Scientifics)를 함유하는 방사성면역침전 검정(RIPA) 완충액에서 균질화하고, 이어서 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 도 33c는 APAP 과복용이 p-ERK, pJNK1 및 pJNK2(참조: 대조군 대 10시간)의 수준을 현저히 상향조절하고, IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제에 의한 후속 처리가 p-ERK, pJNK1 및 pJNK2(참조: IgG 대 항-IL-11Rα)의 수준을 실질적으로 감소시켰음을 나타낸다.

추가의 실험에서, 치사량의 APAP 과복용(550mg/kg) 또는 동등한 용적의 식염수를 IP 주사에 의해 12-14주령 수컷 마우스에게 투여하고, 10시간 후, 마우스에게 20mg/kg의 길항제 항-IL-11Rα 항체 및 이소형-일치 IgG 대조군 항체를 IP 투여하거나 무처리했다.

마우스의 생존은 APAP/식염수 투여 후에 8시간 동안 모니터링하고, 결과는 도 34A에 제시되어 있다. IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제에 의한 처리는, IgG-처리된 대조군과 비교하여, 치사량 APAP가 투여된 마우스의 생존을 현저히 개선시켰다.

마우스를 24시간 및 192시간(8일)에서 안락사시켰다. 혈청 ALT 수준은 실시예 16.3에 기재된 바와 같이 분석했다. 간을 수거하고, 실시예 16.3에 기재된 바와 같이 고정하고, 디지탈 사진을 촬영했다.

결과는 도 34b 및 34c에 제시되어 있다. 치사량의 APAP 과복용 후 10시간에 투여된 IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제는, 8일후 APAP로 처리하지 않은 마우스의 것으로 총 간 형태를 회복시키는 것으로 밝혀졌다(도 34b). 치사량의 APAP 과복용후 10시간에 투여된 IL-11 매개 신호전달의 길항제 항체 억제제는 추가로 간 기능의 DILI-연관 억제로부터 마우스를 구제하는 것으로 입증되었고; 혈청 ALT 수준은 8일 후 정상(식염수 투여된) 대조군 마우스의 수준과 유의적으로 상이하지 않았다(도 34c).

DILI-연관 간독성을 역전시키고 중증/치사량의 APAP 과복용 후에 투여된 대상체의 사망을 예방하는, 간독성 상해 후 10시간에 투여된 IL-11 매개 신호전달의 길항제에 의한 처리 능력은 정말로 놀라운 결과였다. 마우스에서 과복용후 10시간은 인간에서 과복용후 약 24시간에 상당하는 것으로 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> SINGAPORE HEALTH SERVICES PTE. LTD. (all states) NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE (all states) ENLEOFEN BIO PTE. LTD. (all states) CLEGG, Richard (LS only) <120> IL-11RA Antibodies <130> 007487291 <150> GB 1809700.6 <151> 2018-06-13 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens IL-11 (UniProt: P20809) <400> 1 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro 1 5 10 15 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser 20 25 30 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 50 55 60 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr 115 120 125 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro 145 150 155 160 Leu Ala Pro Pro Ser 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VH 3, 9A7 VH 4, 9A7 VH 5 HC-CDR1 <400> 18 Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH, 9A7 VH 1, 9A7 VH 2, 9A7 VH 3, 9A7 VH 4 HC-CDR2 <400> 19 Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 5 HC-CDR2 <400> 20 Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH, 9A7 VH 1, 9A7 VH 2, 9A7 VH 3, 9A7 VH 4, 9A7 VH 5 HC-CDR3 <400> 21 Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL, 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3, 9A7 VL 4 LC-CDR1 <400> 22 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL, 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3, 9A7 VL 4 LC-CDR2 <400> 23 Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL, 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3, 9A7 VL 4 LC-CDR3 <400> 24 Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH HC-FR1 <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 1 HC-FR1 <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 2 HC-FR1 <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 3, 9A7 VH 4, 9A7 VH 5 HC-FR1 <400> 28 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH HC-FR2 <400> 29 Trp Leu Lys Gln Arg Pro Val Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 1, 9A7 VH 2 HC-FR2 <400> 30 Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 3, 9A7 VH 4 HC-FR2 <400> 31 Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 5 HC-FR2 <400> 32 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH HC-FR3 <400> 33 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 1 HC-FR3 <400> 34 Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln 1 5 10 15 Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 2, 9A7 VH 3 HC-FR3 <400> 35 Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 4, 9A7 VH 5 HC-FR3 <400> 36 Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH HC-FR4 <400> 37 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH 1, 9A7 VH 2, 9A7 VH 3, 9A7 VH 4, 9A7 VH 5 HC-FR4 <400> 38 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL LC-FR1 <400> 39 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Met Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys 20 <210> 40 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3, 9A7 VL 4 LC-FR1 <400> 40 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL LC-FR2 <400> 41 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 1 LC-FR2 <400> 42 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 2 LC-FR2 <400> 43 Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 3, 9A7 VL 4 LC-FR2 <400> 44 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 45 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL LC-FR3 <400> 45 Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Ser Phe Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 46 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 1 LC-FR3 <400> 46 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Ser Phe Ser Ser Leu Glu Thr Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 2 LC-FR3 <400> 47 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Thr Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 3 LC-FR3 <400> 48 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 49 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 4 LC-FR3 <400> 49 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL LC-FR4 <400> 50 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL 1, 9A7 VL 2, 9A7 VL 3, 9A7 VL 4 LC-FR4 <400> 51 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH HC-CDR2 consensus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa - K or Q <400> 52 Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Xaa 1 5 10 15 Asp <210> 53 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens IgG1 constant region (IGHG1; UniProt:P01857-1, v1) <400> 53 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 54 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 IgG1 (positions 1-98 of P01857-1, v1) <400> 54 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge IgG1 (positions 99-110 of P01857-1, v1) <400> 55 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 1 5 10 <210> 56 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 IgG1 (positions 111-223 of P01857-1, v1) <400> 56 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 35 40 45 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 50 55 60 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 65 70 75 80 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 85 90 95 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 100 105 110 Lys <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 IgG1 (positions 224-330 of P01857-1, v1) <400> 57 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ckappa CL (IGCK; UniProt: P01834-1, v2) <400> 58 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7O VL <400> 59 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Met Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Phe Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Arg Tyr Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 100 105 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7O VL LC-CDR3 <400> 60 Gln Gln Arg Tyr Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 61 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens IgG4 constant region (IGHG4; UniProt: P01861, v1) <400> 61 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 62 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 IgG4 (positions 1-98 of P01861, v1) <400> 62 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge IgG4 (positions 99-110 of P01861, v1) <400> 63 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 64 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 IgG4 (positions 111-220 of P01861, v1) <400> 64 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 IgG4 (positions 221-327 of P01861, v1) <400> 65 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 66 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens IgG4 constant region (IGHG4; UniProt: P01861, v1; <400> 66 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge IgG4 (positions 99-110 of P01861, v1; S241P) <400> 67 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 68 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens IgG4 constant region (IGHG4; UniProt: P01861, v1; <400> 68 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 69 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 IgG4 (positions 111-220 of P01861, v1; L248E) <400> 69 Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 70 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH4 - Human IgG1 constant region (IGHG1; UniProt:P01857-1, v1) <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 71 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH4 - Human IgG4 constant region (IGHG4; UniProt: P01861, v1) <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 72 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH4 - Human IgG4 constant region (IGHG4; UniProt: P01861, v1; S241P) <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 73 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VH4 - Human IgG4 constant region (IGHG4; UniProt: P01861, v1; S241P and L248E) <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 74 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9A7 VL4 - VL-Ckappa CL (IGCK; UniProt: P01834-1, v2) <400> 74 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 75 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL CL (IGLC1; UniProt: P0CG04, v1) <400> 75 Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL CL (IGLC2; UniProt: P0DOY2, v1) <400> 76 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 77 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL CL (IGLC3; UniProt: P0DOY3, v1) <400> 77 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 78 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL CL (IGLC6; UniProt: P0CF74, v1) <400> 78 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 79 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL CL (IGLC7; UniProt: A0M8Q6, v3) <400> 79 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105

Claims

IL-11Rα에 결합할 수 있는, 임의로 단리된, 항원-결합 분자로서,
항원-결합 분자가
(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:
서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:
서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원-결합 분자.
제1항에 있어서, 항원-결합 분자가
(i) 하기 CDR을 도입한 중쇄 가변(VH) 영역:
서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 하기 CDR을 도입한 경쇄 가변(VL) 영역:
서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3
을 포함하는, 항원-결합 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항원-결합 분자가
서열번호 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함하는, 항원-결합 분자.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가
서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; 및
서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
을 포함하는, 항원-결합 분자.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가 IL-11 매개 신호전달(signalling)을 억제할 수 있는, 항원-결합 분자.
(i) 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자 및 (ii) IL-11Rα 이외의 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 분자를 포함하는, 임의로 단리된, 항원-결합 분자.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가 IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체의 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 억제할 수 있는, 항원-결합 분자.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자 또는 제8항에 따르는 CAR을 코딩하는, 임의로 단리된, 핵산 또는 복수의 핵산.
제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산을 포함하는, 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자, 제8항에 따르는 CAR, 제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 또는 제10항에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 포함하는, 세포.
핵산(들) 또는 발현 벡터(들)로부터 항원-결합 분자 또는 CAR의 발현에 적합한 조건하에서, 제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 또는 제10항에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자, 제8항에 따르는 CAR, 제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 제10항에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 또는 제11항에 따르는 세포를 포함하는, 조성물.
의학적 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자, 제8항에 따르는 CAR, 제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 제10항에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 제11항에 따르는 세포, 또는 제13항에 따르는 조성물.
섬유증(fibrosis), 섬유증을 특징으로 하는 질환, 암, 염증, 염증을 특징으로 하는 질환, 간독성(hepatotoxicity), 간독성을 특징으로 하는 질환, 대사성 질환, 소모성 질환(wasting disease), 신장 손상, 신독성(nephrotoxicity), 또는 간독성을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자, 제8항에 따르는 CAR, 제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 제10항에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 제11항에 따르는 세포, 또는 제13항에 따르는 조성물.
IL-11Rα-발현 세포를 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, IL-11 매개 신호전달을 억제하는 방법.
IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체에 결합된, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자를 포함하는, 임의로 단리된, 시험관내 복합체(in vitro complex).
IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자와 접촉시키는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
IL-11Rα-표적화 제제(IL-11Rα-targeted agent)로 치료하기 위한 대상체를 선택 또는 계층화(stratifying)하는 방법으로서, 상기 방법은, 시험관내에서, 대상체로부터의 샘플을 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자와 접촉시키는 단계, 및 항원-결합 분자와, IL-11Rα 또는 IL-11Rα를 포함하는 복합체와의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
시험관내 또는 생체내 진단 또는 예후 제제로서의, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자의 용도.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 항원-결합 분자, 제8항에 따르는 CAR, 제9항에 따르는 핵산 또는 복수의 핵산, 제10항에 따르는 발현 벡터 또는 복수의 발현 벡터, 제11항에 따르는 세포, 또는 제13항에 따르는 조성물을 소정량 포함하는 부품의 키트(kit of part).