KR20210024061A

KR20210024061A - 점막하 유체 쿠션으로서 세포외 기질(ecm) 하이드로겔

Info

Publication number: KR20210024061A
Application number: KR1020217002118A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 프란시스 바디락; 린지 타미코 살딘; 후안 디에고 나란조 구티에레즈
Original assignee: 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2021-03-04
Also published as: CA3103093A1; US20210244396A1; JP2021527686A; AU2019288588B2; CN112334169B; CN115487364A; CN112334169A; US20220354473A1; WO2019246444A1; ES2966711T3; EP3810214A4; AU2019288588A1; CN115487364B; EP3810214B1; JP7412777B2; EP3810214A1; JP2024023739A

Abstract

대상의 기관 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 개시되며, 여기서 기관은 식도가 아니다. 일부 실시예에서, 기관은 위장관에 있다. 이러한 방법은 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 기관에 점막하 주사하여 기관의 부위에서 점막하와 아래에 존재하는 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도.

Description

점막하 유체 쿠션으로서 세포외 기질(ECM) 하이드로겔

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 전체가 본 명세서에 참조로 포함된 2018 년 6 월 21 일에 출원된 미국 가출원 번호 62 / 688,198의 이익을 주장한다.

분야

이것은 내시경 절제술(endoscopic resection), 특히 식도(esophagus)가 아닌 기관의 부위에서 고유근(muscularis propria)으로부터 점막(mucosa) 및 점막하(submucosa)를 분리하기 위한 점막하 쿠션으로서 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 하이드로겔의 사용에 관한 것이다.

내시경 검사(Endoscopy)는 침습적 수술을 사용하지 않고 내시경(endoscope)이라고 하는 도구를 사용하여 속이 빈 장기 또는 체강(cavity)를 검사할 수 있는 과정(procedure)이다. 내시경 검사는 출혈 혈관의 소작(cauterization), 폴립(polyp), 선종(adenoma) 및 작은 종양(tumor)의 제거, 생검 수행(biopsie) 또는 이물질 제거와 같은 외과적 과정에 사용할 수 있다. 내시경술은 위장관(gastrointestinal tract), 호흡기(respiratory tract), 귀(ear), 요로(urinary tract), 여성 생식계(female reproductive system)에서와 정상적으로 폐쇄된 체강인 복강(abdominal cavity) 또는 골반강(pelvic cavity)(복강경(laparoscopy)), 관절내부(interior of a joint)(관절경(arthroscopy)) 및 흉부(chest)의 장기(흉강경(thoracoscopy) 및 종격 내시경(mediastinoscopy))에서 작은 절개(incision)를 통해 수행할 수 있다. 내시경 검사는 상부 위장관 또는 하부 위장관에서 수행할 수 있다. 내시경은 진단 또는 치료 목적으로, 일반적으로 도구(예: 겸자(forcep), 수술용 전기칼(electrosurgical knife), 내시경 주사 바늘 또는 가위)의 통과를 가능하게 하거나 생체 시료의 제거를 용이하게 하는 하나 이상의 작업 채널(working channel)이 있는 속이 빈 기관 또는 부분(예: 방광(bladder), 식도(esophagus), 위(stomach) 또는 장(intestine))의 내부를 시각화(visualizin)하기 위한 빛이 나는(illuminated), 일반적으로 광섬유의 유연하거나 단단한 관형 도구이다. 원위 부분(distal portion)에 적절한 램프와 영상 장치가 포함되어 있으며 입, 항문, 귀, 코와 같은 신체의 자연 발생 개구부를 통해 삽입하거나 작은 수술 절개를 통해 삽입할 수 있다. 내시경술을 통해 검사할 수 있는 다양한 신체 기관 또는 체강를 감안할 때 후두경(laryngoscope), 흉강경(thoracoscope), 혈관경(angioscope), 대장 내시경(colonoscope), 장 내시경(enteroscope), S상 내시경(sigmoidoscope), 직장경(rectoscope), 직장경(proctoscope), 항문경(anoscope), 관절경(arthroscope), 비경(rhinoscope), 복강경(laparoscope), 자궁경(hysteroscope), 뇌경(encephaloscope), 신장경(nephroscope), 식도경(esophagoscope), 기관지경(bronchoscope), 위 내시경(gastroscope), 양수경(amnioscope), 방광경(cystoscope) 등과 같은 여러 유형의 특수 내시경이 존재한다.

내시경술은 상부 및 하부 위장관을 포함하는 위장관에 널리 적용된다. 예를 들어, 내시경술을 사용하여 위장강(gastrointestinal cavity)을 덮고 있는 점막을 검사하고 염증 조직, 폴립, 가성 폴립(pseudo-polyp), 톱니 모양의 병변(serrated lesion), 선종, 궤양(ulceration), 이형성증(dysplasia), 전 종양(pre-neoplastic)과 종양의 형성 및 종양과 같은 크고 작은 병리학적 병변(pathological lesion)을 감지할 수 있다. 내시경술은 생검과 병리학적 병변(폴립, 선종, 이형성증, 전 종양 및 종양의 형성 및 종양)의 제거에 사용될 수 있다. 외과적 개입에는 병리학적 병변을 제거하기 위해 위장 내시경에서 일반적으로 사용되는 두 가지 유형의 내시경 절제술이 포함된다: 내시경 점막 절제술(endoscopic mucosal resection, EMR) 및 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection, ESD). 이 두 가지 기술은 림프절 전이(lymph-node metastasis)의 위험을 최소화하는 위장 폴립, 선종, 이형성증 및 초기 단계 암의 최소 침습적 치료를 허용한다. 이러한 수술에 사용되는 물질에 대한 필요성이 남아 있다.

대상의 기관 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 이 출원에 개시되며, 여기서 기관은 식도가 아니다. 이러한 방법은 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 기관에 점막하 주사하여 기관 부위에서 점막하와 아래에 존재하는 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 가지며, 고유근으로부터 점막과 점막하를 분리하고 대상의 기관 부위에서 염증을 억제한다.

a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화 시간;

b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도(flow viscosity); 및

c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도(stiffness);

다른 실시예에서, 이러한 방법은 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 기관에 점막하 주사하여 기관 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함하며 이에 의해 하부 고유근으로부터 점막과 점막하를 분리하고 대상의 기관 부위에서 염증을 억제한다.

상기 기관은 상부 또는 하부 위장관을 포함하는 위장관의 기관일 수 있다. 예시적인 기관으로 위(stomach), 소장(small intestine), 대장(large intestine)(횡행(transverse) 결장, 상행(ascending) 결장 또는 하행(descending) 결장을 포함하는 결장(colon)) 또는 직장(rectum)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시예에서, 분리 방법은 내시경 점막 절제술(resection) 또는 내시경 점막 박리술(dissection)를 포함한다.

발명의 전술한 특징, 다른 특징 및 이점은 첨부 도면을 참조하여 진행되는 여러 실시예의 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1A-1E. 점탄성 특성(Viscoelastic properties). ELEVIEW ^TM 및 식도 세포외 기질(eECM) 12mg / mL의 점도 프로파일은 10 °C 에서 전단 속도(0.1 - 1000 1 / s)를 증가시키면서 테스트 되었다(A). 겔화를 유도하고 최대 저장(G ') 및 손실 계수(G' ') 를 측정하기 위해 온도를 37 °C로 빠르게 올렸다(B). 타임 스윕(time sweep)의 대표적인 그래프는 ELEVIEW ^TM(C) 및 12mg / mL에서 eECM 하이드로겔(D)로 표시된다. eECM 12 mg / mL에서 50 % 겔화까지의 시간은 측정되었지만 ELEVIEW ^TM는 겔화되지 않았기 때문에 ELEVIEW ^TM에 대해서는 측정할 수 없었다(타임 스윕 테스트 중 G''> G') (E).
도 2A-2B. 점막접착(Mucoadhesive) 강도. ELEVIEW^TM 및 eECM 12 mg / mL의 점막 접착 강도는 돼지 근육(A) 또는 점막(B)에 적용하였다.
도 3. 대식세포(Macrophage) 활성화(activation). eECM 및 ELEVIEW^TM에 노출된 후 항염증(anti-inflammatory) 및 전염증(pro-inflammatory) 마커의 대식세포 발현.
도 4A-4C. 점막하 유체 쿠션 - 결장. ELEVIEW^TM와 비교하여 eECM을 사용한 시간 경과에 따른 점막하 유체 쿠션의 상승 측정(A). 시험 물질(test agent) 2mL의 주사 후 75 분 후 조직의 모습(B). 75 분 후 시험 물질의 분리 및 노출(C).
도5A-5C. 점막하 유체 쿠션 - 위. eECM 또는 ELEVIEW^TM를 사용한 시간 경과에 따른 점막하 유체 쿠션의 상승 측정(A). 시험 물질 2mL의 주사 후 75 분 후 조직의 모습(B). 75 분 후 시험 물질의 분리 및 노출(C).

대상의 기관 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 출원에 개시되며, 상기 기관은 식도가 아니다. 일부 실시예에서, 기관은 위장관에 있다. 이들 방법은 세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 기관에 점막하 주사하여 기관 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함한다. 상기 기관은 예를 들어 위, 소장, 대장 (횡행 결장, 상행 결장 또는 하행 결장을 포함하는 결장) 또는 직장일 수 있다.

용어(Terms)

달리 명시되지 않는 한, 기술적인 용어는 통상적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 공통적인 용어들의 정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 찾아 볼 수 있다.

본 개시의 다양한 실시예의 검토를 촉진시키기 위하여, 특정 용어들에 대한 다음 설명이 제공된다:

산성 프로테아제(Acid Protease): 펩타이드 결합을 절단하는 효소로서, 이 효소는 산성 pH에서 펩타이드 결합을 절단하는 활성이 증가한다. 예를 들어, 산성 프로테아제는 펩신 및 트립신을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

염기(Base): pH가 7보다 큰 화합물 또는 화합물의 용액. 예를 들어, 염기는 알칼리 수산화물 또는 알칼리 수산화물의 수용액을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 특정 실시예에서, 염기는 NaOH 또는 PBS에 있는 NaOH이다.

분쇄하다(Comminute) (분쇄 (comminution) 및 분쇄하는 (comminuting)): 빻고(grinding), 섞고(blending), ??고(shredding), 절편으로 하고 (slicing), 갈고 (milling), 자르고(cutting), ??는(shredding) 것을 포함하되 이에 국한 되지 않는, 큰 입자들을 작은 입자들로 감소 시키는 공정. 세포외 기질(ECM)은 수화물 형태(hydrate form), 냉동(frozen), 공기-건조(air-dried), 동결건조(lyophilized), 분말(powdered), 쉬트-형태(sheet-form)를 포함하지만 이에 국한되지 않는 어느 형태로 있는 동안에 분쇄될 수 있다.

대장암(Colon Cancer): 대장의 암. 관상 선종(Tubular adenoma)은 결장 폴립(colonic polyp)의 일종이며 대장암의 전조이다. 대장암은 예를 들어 결장 유암종(colonic carcinoi) 또는 선암(adenocarcinoma) 일 수 있다. 대장암 진단은 병변의 위치에 따라 일반적으로 결장경 검사 또는 S상 결장 검사 중에 종양 발생 가능성이 의심되는 결장 부위를 샘플링하여 수행된다.

진단(Diagnosis): 신호(sign), 증상(symptom) 및 여러 가지 검사 결과들에 의해 질병을 동정하는 과정. 이 과정을 통해 도달하는 결론은 또한 "진단" (a diagnosis)이라고 불린다. 보통 수행되는 검사의 형태에는 혈액 검사(blood test), 의학적 이미징(medical imaging), 및 생체검사(biopsy)가 포함된다.

분리(Dissection): 예를 들어 수술 과정에서 조직을 분리하거나 절단하는 과정.

내시경 주사 바늘 또는 내시경 주사 바늘 카테터(Endoscopic injection needles or endoscopic injection needle catheters): 일반적으로 길고(예를 들어, 최대 약 230cm) 슬라이드 가능하게 배치된 원위(distal) 주사 바늘을 가지는 내부 주사 튜브가 있는 긴 카테터를 포함하는 장치. 일반적으로, 근위 작동 핸들은 카테터 및 주사 튜브에 결합되어 하나를 상대적으로 다른 하나에 이동시킨다. 바늘은 집어 넣을 수 있다. 주사 튜브에 대한 유체의 접근은 일반적으로 핸들의 루어 커넥터(luer connector)를 통해 제공된다.

내시경 주사 바늘은 일반적으로 내시경의 카테터를 통해 주사 부위로 전달된다. 내강이 손상되지 않도록 보호하기 위해 주입 바늘 장치의 핸들을 조작하여 장치를 내시경에 삽입하기 전에 원위 주사 바늘을 카테터의 내강으로 빼낸다. 내시경 주사 바늘 장치의 원위 말단이 주사 부위에 위치할 때, 핸들을 조작하여 주사 바늘을 카테터의 내강에서 말단으로 이동시킨다. 일부 실시예에서, 가장 원위 위치로 전진할 때, 주사 바늘의 노출된 부분은 길이가 약 4-6 mm일 수 있다.

내시경 점막 절제술(Endoscopic Mucosal resection, EMR): 위장(gastrointestinal, GI) 관의 표면층(점막 및 점막하)에 국한된 고착성 또는 편평한 신생물(neoplasm)을 제거하기 위해 개발된 내시경 기술이다. 점막과 점막하는 하부 고유근으로부터 절제된다. 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection, ESD)은 위장관과 같은 더 큰 병변을 제거하기 위해 특별히 개발된 내시경 기술을 의미하며, 여기서 점막과 점막하는 위장관의 다른 층으로부터 분리된다. EMR과 ESD는 일반적으로 점막하와 하부 고유근 사이의 표적 병변 아래에 물질을 주사하여 쿠션 역할을 하고 점막하와 상부 점막을 상승시킨다. EMR을 사용하여 스네어(snare)로 상승된 병변을 제거하고 흡입을 통해 작은 컵으로 이동한다. ESD를 사용하면 병변 아래의 점막하를 특수 나이프로 분리하여 점막하와 상부 점막을 분리한다. ESD는 치료 의도를 가진 EMR로 가능한 것보다 더 크고 잠재적으로 더 깊은 병변을 제거할 수 있다. EMR과 ESD는 모두 장기의 점막하 평면에 물질을 주사하여 촉진되며, 이는 상부 점막을 하부 고유근으로부터 효과적으로 분리하고 동시에 인접한 식도 점막 위로 점막을 상승시킨다. 이러한 층 분리와 영향을 받은 조직의 상승은 외과의가 관심있는 조직을 분리(isolate), 파악(grasp) 및 제거(remove)하는데 도움이 된다.

세포외 기질(Extracellular Matrix, ECM): 조직과 기관의 비세포(non-cellular) 성분. 천연 ECM(포유류 및 인간과 같은 다세포 유기체에서 발견되는 ECM)은 콜라겐(collagens), 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글라이코스아미노글라이칸(glycosaminoglycans), 프로테오글라이칸(proteoglycans), 항미생물제(antimicrobials), 화학유인물(chemoattractants), 싸이토카인(cytokines), 및 성장 인자(growth factors)를 포함하되 제한적이지 않은 구조적 및 비구조적 생체분자들의 혼합물로 일반적으로 다른 조직과 기관 사이의 특정 구성이 다르다. 포유류에서는, ECM은 종종 건조 중량 기준으로 약 90%의 다양한 형태의 콜라겐(collaagen)을 포함한다. ECM으로 구성된 생물학적 스캐폴드(Biologic scaffold)는 ECM 뒤에 남겨진 주어진 조직이나 기관에서 세포를 제거하여 만들 수 있다. ECM의 조성 및 구조는 조직의 근원(source)에 따라 다르다. 예를 들어, 소장 점막하(small intestine submucosa) (SIS), 방광 기질(urinary bladder matrix) (UBM), 식도(esophagus) (E), 및 간 기질 ECM(liver stroma ECM)는 각 조직마다 필요로 하는 독특한 세포적인 영역(cellular niche) 때문에 이들의 전체적인 구조 및 조성이 각각 다르다. 온전한 "세포외 기질(extracellular matrix)" 및 " 온전한 ECM(intact ECM)"은 바이오스캐폴드(bioscaffold)는 용해되지 않은 세포외 기질로 구성되고, 3차원 미세 구조를 유지하며, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 글라이코스아미노글라이칸, 프로테오글라이칸, 항미생물제, 화학유인물, 싸이토카인, 및 성장 인자를 포함하지만 여기에 설명된 바와 같이 분쇄된(comminuted) ECM에 제한적이지 않은 구조적 및 비구조적 생체분자들의 활성을 유지하고 있다.

ECM 내의 생체 분자의 활성은 화학적으로 또는 기계적으로, 예를 들어 화학적 또는 효소적 가교(cross-linking) 및/또는 ECM 투석(dialyzing)에 의해 변경될 수 있다. 온전한 ECM은 본질적으로 효소로 소화, 교차 결합 및 / 또는 투석되지 않으며, 이는 ECM이 소화, 투석 및 / 또는 교차 결합 과정을 거치지 않았거나 용해 전에 ECM을 보관 및 취급하는 동안 자연적으로 발생하는 조건이 아님을 의미한다. 따라서, 투석된 ECM (본 출원에 설명된 사용에서 ECM의 겔화 및 기능적 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 사소한 방식을 제외하고)은 "온전한"것으로 간주되지 않는다.

위내시경(Esophagogastroduodenoscopy) (EGD) 또는 상부 위장관 내시경(Upper Gastrointestinal Endoscopy): 위장관의 상부에서 십이지장까지 시각화하는 진단 내시경술이다. 내시경은 때때로 EGD 또는 상부 위장관 내시경의 일부로 수행될 수 있다. 명시적으로 언급하지 않는 한 이 용어는 상호 배타적이지 않는다.

위장관(Gastrointestinal tract): 음식을 섭취하고 소화하고 남은 노폐물을 배출하는 포유류의 장기 시스템. 구강, 인두, 식도, 위 및 십이지장은 상부 위장관을 형성한다. 하부 위장관에는 소장, 대장(결장) 및 직장이 포함된다.

겔화(Gelation): 솔(sol)에서 겔(gel)이 형성되는 것.

유동 점도(Flow Viscosity): 전단 응력 또는 인장 응력에 의한 점진적 변형에 대한 유체의 저항 측정. 점도는 다른 속도로 움직이는 유체에서 유체의 두 표면 사이의 상대 운동에 반대하는 유체의 속성이다. 유체가 튜브를 통과할 때 유체를 구성하는 입자는 일반적으로 튜브 축 근처에서 더 빠르게 이동하고 벽 근처에서 더 느리게 이동한다. 유체가 계속 움직이도록 입자층 사이의 마찰을 극복하려면 응력 (튜브의 두 끝 사이의 압력 차이와 같은)이 필요하다. 주어진 속도 패턴에 대해 필요한 응력은 유체의 점도에 비례한다. 점도는 점도계(viscometer)와 유량계(rheometer)로 측정된다. 점도는 파스칼 초 (Pa * s)로 측정할 수 있다. 20 °C의 물의 점도는 1.002mPa * s이다.

하이드로겔(Hydrogel): 친수성 고분자 사슬의 네트워크로, 때로는 물이 분산매인 콜로이드겔(colloidal gel)로 발견된다. 하이드로겔은 흡수성이 높은 천연 또는 합성 고분자 네트워크다. 하이드로겔은 또한 천연 조직과 유사한 유연성을 가지고 있다. 용어 "방광 ECM 하이드로겔(urinary bladder ECM hydrogel)"은 방광 기질(UBM, urinary bladder matrix) 및 방광 점막하(UBS, urinary bladder submucosa) 하이드로겔을 포함한다.

염증(Inflammation): 조직 손상에 의해 유발되는 국소 반응. 염증은 정상적인(건강한) 상황에서 그러한 조직 부위 내에서 발견되는 그러한 세포의 수를 초과하는 숫자로 모든 종류의 백혈구의 조직 공간, 단위 또는 부위로의 출현 또는 이동을 특징으로 한다. 염증은 병원체, 손상된 세포 또는 자극제와 같은 유해한 자극에 대한 혈관 조직의 복잡한 생물학적 반응에 의해 조정된다.

등장 완충 용액(Isotonic Buffered Solution): pH7.2에서 7.8 사이로 완충되고 등장 환경을 촉진하기 위해 균형잡힌 염 농도를 갖는 용액.

저도 이형성증 및 고도 이형성증 및 대사(Low Grade Dysplasia and High Grade Dysplasia and Metaplasia): 병리학적 상태는 비정상적인 세포 형태를 특징으로 하지만 세포 유형은 여전히 편평 상피(squamous epithelium)로 인식할 수 있다. 일반적으로 이형성증에서는 위장관 부분의 내부 관벽 세포(internal lining cell)에 정점 점액(apical mucin)이 없다. 낮은 배율에서는 이러한 영역은 관련되지 않은 영역에 비해 더 과염색성(hyperchromatic)으로 보일 수 있다.

고도 이형성증의 경우 세포 형태의 변화가 더 두드러 지지만 세포는 여전히 기술적으로 편평 상피의 한 유형이다.

세포가 편평 상피 세포에서 흔히 입방형(cuboidal) 또는 원주형(columnar)인 샘세포(glandular cell)와 같은 다른 세포 유형으로 변할 때, 그 과정을 화생(metaplasia)이라고 한다. 화생의 경우, 조직의 샘(glandular) 구조의 왜곡이 일반적으로 존재하며 표시될 수 있다. 그것은 크립트(crypts)의 가지(branching)와 측면 버딩(lateral budding), 점막 표면의 융모의 배열, 또는 "서로 마주하고 있는(back-to-back)" 샘의 소공질 패턴(cribriform pattern)을 형성하기 위한 상피의 샘내 가교(intraglandular bridging)로 구성되어 있다. 점막 표면에 핵의 "라운딩 업(rounding up)"으로 특징되는 핵 극성(nuclear polarity)이 상실된 비정상적인 상피가 있으며, 서로 핵의 일관된 관계(consistent relationship)가 없다.

예방 또는 치료(Preventing or treating): 질병 억제(Inhibiting)는 예를 들어 염증으로 인한 질병과 같은 질병에 걸릴 위험이 있는 사람에서 질병의 부분적 또는 전체적인 발달을 억제하는 것을 의미한다. 질병 과정을 억제하는 것은 질병의 발병을 예방하는 것을 포함한다. "치료(treatment)"는 질병이 발병한 후, 질병 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 중재를 의미한다.

전단 응력(Sheer Stress): 재료 단면과 동일 평면상 응력(stress coplanar)의 구성 요소. 전단 응력은 단면에 평행한 힘 벡터(force vector) 구성 요소에서 발생한다. 평균 전단 응력을 계산하는 공식은 단위 면적당 힘이다.

여기서 T = 전단 응력, F = 적용된 힘, A = 적용된 힘 벡터에 평행한 면적을 가진 재료의 단면적.

경도(stiffness): 물체 또는 유체의 단단함. ECM의 경도는 경도 구배(durotaxis)에서 세포의 이동을 안내하는데 중요하다. 경도는 제곱 미터(square meter)당 1 뉴턴인 Pascal (Pa) 단위로 측정할 수 있다.

치료제(therapeutic agent): 일반적인 의미로 사용되며 치료제(treating agent), 예방제(prophylactic agent) 및 대체제(replacement agent)를 포함한다. "치료(treatment)"또는 "치료하는(treating)"는 ECM 하이드로겔과 같은 물질을 임의의 질병 증상을 어느 정도 감소, 억제 또는 완화하거나, 질병 진행을 늦추거나, 질병 퇴행을 유발하기에 충분한 양으로 환자에게 제공하는 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 질환의 치료는 환자가 질환의 증상을 나타내기 전에 시작될 수 있다. 개시된 방법은 식도 염증을 억제하고/하거나 식도 염증의 효과를 완화시킨다.

치료적으로 유효한 양(Therapeutically effective amount): ECM 하이드로겔과 같은 조성물의 "치료적으로 유효한 양"은 환자에게 투여될 때 증상 개선, 감소되는 진전의 감소 또는 질병 퇴행과 같은 치료적 이점을 제공하는 데 효과적인 양을 의미한다. ECM 하이드로겔의 양은 기관의 점막하 조직에 주사될 때 겔을 형성하고 하부 고유근으로부터 상부 점막을 분리하는 것과 같이 치료되는 대상에서 원하는 효과를 달성하기에 충분하다면 치료적으로 효과적이다.

점막하 쿠션을 형성하기 위한 유효량은 적용되는 제제, 치료할 대상, 고통의 중증도 및 유형 그리고 투여 방식에 따라 달라진다. 본 출원에 개시된 방법에서 사용되는 ECM 하이드로겔은 의학적 및 수의학적 환경에서 모두에서 적용된다. 따라서, 일반 용어 "대상(subject)"또는 "환자(patient)"는 인간 또는 다른 영장류, 개, 고양이, 말 및 소와 같은 수의학적 대상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 동물을 포함하는 것으로 이해된다.

방광 ECM(Urinary Bladder ECM): 모든 포유류의 방광에서 추출한 세포외 기질. 이 용어에는 방광 기질(urinary bladder matrix, UBM) ECM 및 방광 점막하(urinary bladder submucosa, UBS) ECM이 포함된다. 방광의 벽은 다음과 같은 층으로 구성된다: 내강(luminal)에서부터 내강에서 먼(abluminal) 측면까지의 두께 단면에 나열된 점막(tunica mucosa)(전이 상피층(transitional epithelium layer) 및 고유막(tunica propria) 포함), 점막하층, 최대 3 개의 근육층 및 외막(adventitia)(느슨한 결합 조직층). UBS는 내강에서 먼 근육층으로부터 박리된 방광 점막하 조직 및 척추 동물 방광의 분절의 점막의 적어도 내강 부분을 포함하는 조직 조성물로부터 제조된다(본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,554,389 참조). UBM ECM은 방광 상피 기저막(urinary bladder epithelial basement) 및 기저막(basement membrane) 바로 아래에 있는 고유막으로부터 제조된다(본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 6,576,265 참조).

달리 설명하지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어 "a", "an"및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 유사하게, "또는(or)"이라는 단어는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 "와(and)"를 포함하도록 의도된다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량(molecular weight) 또는 분자 질량 값(molecular mass value)은 근사치이며 설명을 위해 제공된 것임을 추가로 이해해야 한다. 본 출원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재된다. 용어 "구성하다(comprises)"는 "포함하다(includes)"를 의미한다. 용어 "약(about)"은 5 % 이내를 나타낸다. 본 출원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우 용어 설명을 포함해서 본 설명이 통제된다. 또한 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.

세포외 기질(ECM) 하이드로겔

ECM 하이드로겔의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 8,361,503에 개시되어 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있는 하이드로겔을 생성하기 위해 임의의 유형의 세포외 기질 조직을 사용할 수 있다(미국 특허 번호 4,902,508; 4,956,178; 5,281,422; 5,352,463; 5,372,821; 5,554,389; 5,573,784; 5,645,860; 5,771,969; 5,753,267; 5,762,966; 5,866,414; 6,099,567; 6,485,723; 6,576,265; 6,579,538; 6,696,270; 6,783,776; 6,793,939; 6,849,273; 6,852,339; 6,861,074; 6,887,495; 6,890,562; 6,890,563; 6,890,564; 및 6,893,666은 ECM과 관련 됨). 특정 실시예에서, ECM은 척추동물, 예를 들면 인간, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 양을 포함 하나 이에 제한되지 않는 온혈 포유류 척추 동물로부터 분리된다. 특정 비제한적 예에서, ECM은 돼지 또는 인간이다.

ECM은 방광, 장, 대장(결장), 간, 식도 및 진피를 포함 하나 이에 제한되지 않는 모든 기관 또는 조직에서 유래될 수 있다. ECM은 신장, 심장, 자궁, 뇌, 혈관, 폐, 뼈, 근육, 췌장, 위, 비장 또는 결장에서 유래될 수 있다. 한 실시예에서, ECM은 방광으로부터 유래한다. 다른 실시예에서, ECM은 식도에서 유래한다. ECM은 ECM의 기저막 부분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 실시예에서, ECM은 기저막의 적어도 일부를 포함한다. 다른 실시예에서, ECM은 세포 배양으로부터 얻는다. ECM 하이드로겔은 둘 이상의 조직 근원을 조합하여 생산할 수 있다.

미국 특허 제 8,361,503 호(본 출원에 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이, 돼지 방광 ECM과 같은 방광 ECM은 외과용 핸들(scalpel handle)과 축축한 거즈로 세로로 닦는 동작(longitudinal wiping motion)을 하여 방광 조직을 마모시켜서(abrading) 장막(tunica serosa), 외근층(tunica muscularis externa), 점막하조직(tunica submucosa)을 포함하는 내강에서 먼 층을 제거함으로써 제조된다. 조직 분절의 외전 후, 점막(tunica mucosa)의 내강 부분은 동일한 닦는 동작을 사용하여 하부 조직에서 박리한다. 장막(tunica serosa), 외근층 (tunica muscularis externa), 점막하조직 (tunica submucosa) 및 대부분의 근막점막(muscularis mucosa)은 효소 치료(enzymatic treatment), 수분 공급(hydration) 및 마모(abrasion)의 조합으로 제거할 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 조직의 기계적 제거는 예를 들어 Adson-Brown 겸자 및 Metzenbaum 가위로 장간막 조직(mesenteric tissue)을 제거하고 외과용 핸들 또는 축축한 거즈로 싼 다른 단단한 물체로 세로로 닦는 동작을 사용하여 근층(tunica muscularis)과 점막하조직(tunica submucosa)을 닦음으로써 달성된다. 다른 실시예에서, 점막(tunica mucosa)의 상피 세포는 또한, 예를 들어 고삼투압 식염수를 포함하되 이에 국한되지 않는 탈상피화 용액에 조직을 담가서 해리될 수 있다. 생성된 UBM은 점막(tunica mucosa) 및 인접한 고유막(tunica propria)의 기저막(basement membrane)을 포함하며, 이는 과산화아세트산(peracetic acid)으로 추가 처리되고 동결 건조되고 분말화된다(미국 특허 번호 8,361,503 참조).

다른 실시예에서, ECM은 방광에서 유래된다. 방광 기질(UBM) ECM을 생성하는 방법은 본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 6,576,265에 개시되어 있다. 방광 점막하(UBS) ECM을 생성하는 방법은 본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,554,389에 개시되어 있다. 이러한 유형의 방광 ECM 둘 다 본 출원에 개시된 방법으로 사용된다. UBM에서 상업적으로 이용 가능한 제제를 사용할 수 있다(Acell Corporation; Jessup, Md.).

본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 제 6,893,666 호는 또한 방광, 피부, 식도 및 소장으로부터 ECM의 생산을 개시한다. 탈세포화된 진피 세포외 기질(dermal ECM)로부터 하이드로겔의 생산은 Wolf et al., Biomaterials 33 : 7028-7038, 2012 (본 출원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 식도 조직으로부터 ECM의 생산은 예를 들어 Badylak et al. J Pediatr Surg. 35 (7) : 1097-103, 2000 및 Badylak et al., J. Surg. Res. 2005 September; 128 (1) : 87-97, 2005에서 둘 다 본 출원에 참조로 포함된다.

시판 ECM 제제는 또한 본 출원에 기재된 방법, 장치 및 조성물에 사용될 수 있다. 한 실시예에서, ECM은 소장 점막하 또는 SIS로부터 유래된다. 시판 제제는 SURGISIS ^TM, SURGISIS-ES ^TM, STRATASIS ^TM 및 STRATASIS-ES ^TM (Cook Urological Inc .; Indianapolis, Ind.) 및 GRAFTPATCH ^TM (Organogenesis Inc .; Canton Mass.)를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 다른 실시예에서, ECM은 진피로부터 유래된다. 시판 제제에는 PELVICOL ^TM (유럽에서 PERMACOL ^TM로 판매 됨; Bard, Covington, GA), REPLIFORM ^TM (Microvasive; Boston, Mass.) 및 ALLODERM ^TM (LifeCell; Branchburg, N.J.)이 포함된다. 시판 UBM ECM은 MATRISTEM UBM ^TM (Acell, Layfayette, IN)이다.

ECM의 준비에 사용되는 근원 조직은 매우 다양한 방법으로 거둘 수 있으며, 일단 거두면 거둔 조직의 다양한 부분을 사용할 수 있다. ECM은 식도와 소장에서 제조되었고, 하이드로겔은 ECM에서 제조되었다(예: Keane et al., Tissue Eng. Part A, 21 (17-18) : 2293-2300, 2015, 본 출원에 참조로 포함됨). 식도 ECM은 외근(muscularis externa)으로부터 점막과 점막하를 기계적으로 분리하고 트립신을 포함한 버퍼에서 점막층을 소화한 다음 자당(sucrose), TRITON-X100®, 디옥시콜산(deoxycholic acid)과 과산화아세트산(peracetic acid) 및 DNAse에 노출시켜 제조할 수 있다. 소장 점막하(SIS)는 온전한 소장에서 점막(tunica mucosa), 장막(tunica serosa) 및 외근층(tunica muscularis externa)의 표피층(superficial layer)을 기계적으로 제거하고 점막하, 근막점막(muscularis mucosa) 및 기저의 치밀층(basilar stratum compactum)은 그대로 두어 제조할 수 있다. 그다음에 SIS를 과산화아세트산으로 처리한다. 예시 프로토콜은 Keane et al.에 제공되었다.

일부 실시예에서, 상피 세포(epithelial cell)는 10 분 내지 4 시간 범위의 기간 동안 예를 들어 1.0 N염분의 고삼투압 식염수(hypertonic saline)은 포함하되 국한되지 않는 탈상피화 용액에 조직을 먼저 담가서 박리될 수 있다. 고삼투압 식염수에 노출되면 하부 기저막에서 상피 세포가 효과적으로 제거된다. 초기 박리 절차 후 남은 조직은 상피 기저막과 상피 기저막에 내강에서 먼 조직층을 포함한다. 이 조직은 다음으로 상피 기저막이 아닌 대부분의 내강에서 먼 조직을 제거하기 위해 추가 처리를 받는다. 외부 장막(outer serosal), 외막(adventitial), 연근육 조직(smooth muscle tissue), 점막하조직(tunica submucosa) 및 대부분의 근막점막(muscularis mucosa)은 기계적 마모 또는 효소 처리, 수화 및 마모의 조합에 의해 나머지 탈상피 조직에서 제거된다.

ECM은 과산화아세트산 노출, 저선량 감마선, 가스 플라즈마 살균, 산화 에틸렌 처리, 초임계 CO₂ 또는 전자빔 처리를 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 표준 기술에 의해 소독(disinfection) 또는 살균(sterilization)될 수 있다. 보다 일반적으로 ECM의 소독은 0.1 % (v / v) 과산화아세트산, 4 % (v / v) 에탄올 및 95.9 % (v / v) 멸균수에 2 시간 동안 담가서 이루어진다. 과산화아세트산 잔류물(residue)은 PBS (pH = 7.4)로 15 분 동안 2 회, 멸균수로 15 분 동안 2 회 세척하여 제거한다. ECM 물질(material)은 프로필렌옥사이드(propylene oxide) 또는 에틸렌옥사이드(ethylene oxide) 처리, 감마선 조사 처리(0.05 ~ 4mRad), 가스 플라즈마 살균, 초임계 CO₂ 또는 전자빔 처리로 살균할 수 있다. ECM은 또한 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 처리하여 단백질 물질의 가교 결합(cross linking)을 유발할 수 있지만, 이 처리는 물질이 천천히 재흡수되거나 전혀 재흡수되지 않도록 물질을 실질적으로 변경하고 구조적인 리모델링보다는 더 밀접하게 유사한 흉터조직 형성(scar tissue formation)이나 캡슐화(encapsulation)와 같은 다른 형태의 숙주(host) 리모델링을 유도한다. 단백질 물질의 가교 결합은 또한 카르보디이미드(carbodiimide) 또는 디하이드로터말(dehydrothermal) 또는 광산화(photooxidation) 방법으로 유도될 수 있다. 미국 특허 번호 8,361,503에 개시된 바와 같이, ECM은 0.1 % (v / v)과산화아세트산 (a), 4 % (v / v) 에탄올 및 96 % (v / v) 멸균수에 2 시간 동안 담가서 소독한다. ECM 물질은 PBS (pH = 7.4)로 15 분 동안 2 회, 탈이온수로 15 분 동안 2 회 세척한다.

관심 조직의 분리 후, 탈세포화는 다양한 방법, 예를 들지만 이에 국한되지 않는 고삼투압 식염수, 과산화아세트산, TRITON-X® 또는 기타 세정제(detergent)에 대한 노출에 의해 수행된다. 소독과 탈세포화는 동시에 가능하다. 예를 들지만 이에 국한되지 않고, 위에서 설명한 과산화아세트산으로 소독하는 것도 ECM을 탈세포화하는 역할을 할 수 있다. 탈세포화된 ECM은 동결 건조(freeze-dried) 또는 공기 건조로 건조할 수 있다. 건조된 ECM은 찢기(tearing), 갈기(milling), 절단(cutting), 빻기(grinding) 및 전단(shearing)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법으로 분쇄할 수 있다. 분쇄된 ECM은 또한 예를 들지만 이에 국한되지 않고, 동결 또는 동결 건조 상태에서 빻기 또는 갈기와 같은 방법에 의해 분말 형태로 추가 처리될 수 있다.

ECM 하이드로겔 제조에 사용하기 위해 용해된(solubilized) ECM 조직을 준비하기 위해, 분쇄된(comminuted) ECM을 산성 용액에서 산성 프로테아제로 소화하여 소화 용액(digest solution)을 형성한다. ECM의 소화 용액은 일반적으로 실온에서 일정 시간동안 일정한 교반 상태로 유지된다. ECM 다이제스트(digest)는 즉시 사용하거나 -20 ° C에서 보관하거나 예를 들지만 이에 국한되지 않는 -20 °C 또는 -80 ° C에서 냉동 할 수 있다.

일단 ECM이 용해되면 (일반적으로 실질적으로 완전히) 용액의 pH는 7.2와 7.8 사이로, 하나의 실시예에 따르면 pH 7.4로 올라간다. NaOH를 포함한 수산화 이온(hydroxyl ion)을 함유하는 염기와 같은, 염기는 용액의 pH를 높이는 데 사용할 수 있다. 마찬가지로 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)를 포함 하나 이에 국한되지 않는 등장 버퍼와 같은 버퍼를 사용하여 용액을 목표 pH로 만들거나 겔의 pH 및 이온 강도를 생리적 pH 및 이온 조건과 같은 목표 수준으로 유지하는 데 도움을 줄 수 있다. 이것은 "프리겔(pre-gel)"용액을 형성한다. 프리겔은 실온에서 점성 용액으로 액체 형태이다. 중화된 소화 용액(프리겔)은 37 °C에 가까운 온도에서 겔화 될 수 있으며, 여기서 온도는 생리적 온도에 근접한다. 이 방법은 일반적으로 겔화 이전에 투석(dialysis) 단계를 포함하지 않으며, 일반적으로 특정 속도로 37 ° C에서 겔화되는, 보다 완전한 ECM 유사 기질을 생성한다(하기 참조).

따라서, ECM은 일반적으로, 예를 들어 방광(urinary bladder), 진피(dermis), 식도(esophagus), 소장(small intestine), 신장(kidney), 간(liver), 심장(heart), 자궁(uterus), 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 폐(lung), 뼈(bone), 근육(muscle), 췌장(pancreas), 위(stomach), 비장(spleen) 또는 결장(colon)을 포함하되 이에 국한되지 않는 포유류 조직으로부터 유래 될 수 있다. ECM 하이드로겔은 2 개, 3 개 또는 4 개의 조직 근원과 같은 2 개 이상의 조직 근원으로부터 생성될 수 있다. 비제한적인 하나의 실시예에서, ECM은 동결 건조되고 분쇄된다. ECM은 산성 용액에서 산성 프로테아제로 용해되어 식도 ECM과 같은 소화된 ECM을 생성한다. 산성 프로테아제는 제한없이 펩신 또는 트립신이거나 이들의 조합 일 수 있다. ECM은 프로테아제에 적합하거나 최적인 산성 pH, 예를 들어 약 pH 2보다 크거나 또는 pH4 사이, 예를 들어 0.01M HCl 용액에서 용해될 수 있다. 용액은 일반적으로 혼합(섞기(stirring), 휘젖기(agitation), 혼합(admixing), 혼합(blending), 회전(rotating), 기울기(tilting) 등)과 함께 조직 유형(예를 들어, 아래 예 참조)에 따라 약 12 내지 약 48 시간 동안 용해된다. ECM 하이드로겔은 (i) 세포외 기질을 분쇄하고, (ii) 산성 용액에서 산성 프로테아제로 소화하여 온전한, 비투석(non-dialyzed) 또는 비가교된(non-cross-linked) 세포외 기질을 용해시켜 소화 용액을 생성하고, (iii) 소화 용액의 pH를 7.2와 7.8 사이의 pH로 상승시켜 중화된 소화 용액 (프리겔 용액)을 생성하고, (iv) 관심 대상의 기관 내에서 대략 37 °C의 온도에서 용액을 겔화한다. 산성 프로테아제를 사용하여 ECM을 소화하는 경우, 프리겔 용액과 생성된 하이드로겔은 비활성화된 프로테아제를 포함할 수 있다.

ECM 하이드로겔은 약 37 °C의 온도에 노출되면 겔을 형성한다. "프리겔"형태의 ECM 하이드로겔은 예를 들지만 이에 국한되지 않고 -20 °C 또는 -80 °C에서 냉동 및 보관할 수 있다. "프리겔"형태의 ECM 하이드로겔은 약 25 °C와 같은 실온에서 보관할 수 있다. 따라서 ECM 하이드로겔은 37 °C 미만, 예를 들어 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 °C 에서 프리겔 형태이다. ECM 하이드로겔은 냉동 보관이 가능하므로 0 °C 이하에서 보관할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "프리겔 형태"또는 "프리겔"은 pH가 증가하지만 겔화되지 않은 ECM 하이드로겔을 의미한다. 예를 들어지만 이에 국한되지 않고, 프리겔 형태의 ECM 하이드로겔은 pH가 7.2와 7.8 사이이다. ECM 하이드로겔은 내시경을 사용하여 대상에게 프리겔 형태로 전달할 수 있다.

프리겔 형태의 ECM 하이드로겔은 식도가 아닌 위장관 기관과 같은 환자의 기관에 도입될 수 있다. 약 37 °C의 기관에 점막하로 도입되면 ECM 하이드로겔은 겔화되고 고유근과 기관의 점막하 사이에 ECM 하이드로겔의 쿠션을 생성하여 외과적 절제를 위해 점막하를 들어 올린다. 이론에 얽매이지 않고, ECM 하이드로겔은 사이토카인(cytokine)을 포함하되 이에 국한되지 않는, 많은 천연 가용성 인자를 포함한다. 다양한 조직으로부터 제조된 투석되지 않는(전체 ECM) 제제의 특정한 특성이 여기에 개시되어 있다.

일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30분 미만의 50 % 겔화에 이르는 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) i) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), ii) 약 10 내지 약 450 Pa; iii) 약 10 내지 약 600 Pa, iv) 약 5 내지 약 1,000 Pa, v) 약 10 내지 1,000 Pa, 또는 vi) 약 10 내지 약 70 Pa의 경도.

실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 300 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 450 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 600 Pascal (Pa)의 경도.

다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 5 내지 약 1,000 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 1,000 Pascal (Pa)의 경도. 더 많은 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 10-70 파스칼 (Pa)의 경도. 기관은 식도를 제외한 위장관의 모든 기관일 수 있다.

일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화에 이르는 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) i) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), ii) 약 10 내지 약 450 Pa; iii) 약 10 내지 약 600 Pa, iv) 약 5 내지 약 1,000 Pa, v) 약 10 내지 1,000 Pa, 또는 vi) 약 10 내지 약 70 Pa의 경도.

일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화에 이르는 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) i) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), ii) 약 10 내지 약 450 Pa; iii) 약 10 내지 약 600 Pa, iv) 약 5 내지 약 1,000 Pa, v) 약 10 내지 1,000 Pa, 또는 vi) 약 10 내지 약 70 Pa의 경도.

실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화에 이르는 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 300 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 450 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 600 Pascal (Pa)의 경도.

다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 5 내지 약 1,000 Pascal (Pa)의 경도. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 1,000 Pascal (Pa)의 경도. 더 많은 실시예에서, ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 20 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 10-70 파스칼 (Pa)의 경도.

또 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 a) 약 37 °C에서 10 분 미만의 50 % 겔화까지의 시간; b) 기관으로의 주입에 충분한 유동 점도; c) 약 10 내지 약 300 Pascal (Pa)의 경도; d) 상기 하이드로겔은 식도 하이드로겔이다.

특정 비제한적 예에서, ECM 하이드로겔은 식도 하이드로겔이다. 다른 특정 비제한적 예에서, ECM 하이드로겔은 둘 이상의 조직 근원으로부터 생성될 수 있다. 추가적인 비제한적 예에서, ECM 하이드로겔은 방광 또는 소장에서 생성될 수 있다. ECM 하이드로겔은 UBM ECM 또는 UBS ECM일 수 있다.

추가적인 특정 비제한적 예에서, ECM 하이드로겔은 (a) 산성 용액에서 산성 프로테아제로 조직을 소화하여 무세포(acellular) 세포외 기질(ECM)을 용해시켜 소화된 식도 ECM을 생성하고; (b) 소화된 ECM의 pH를 7.2와 7.8 사이의 pH로 올려 중화된 소화 용액을 생성하는 단계; (c) 소화된 ECM을 약 2mg / ml 내지 약 16mg / ml의 농도, 예를 들어 약 8mg / ml 내지 약 12mg / ml의 ECM 하이드로겔로 희석하는 단계. 이 하이드로겔은 대상의 기관에 도입되어 겔화된다. 상기 ECM은 식도 ECM일 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 ECM 하이드로겔은 약 37 °C의 온도, 예컨대 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 분 미만에서 30 분 미만의 50 % 겔화 시간을 갖는다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 약 37 °C의 온도에서 10 분 미만의 50 % 겔화에 이르는 시간을 갖는다. 일부 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 30 분이다. 추가적인 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 10 분이다. 더 많은 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 3 내지 약 10 분이다. 다른 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 약 3 내지 약 30 분이다. 추가 실시예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 약 4 내지 약 10 분이다. 또 다른 실시예에서, 겔화 50 %까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 약 5 내지 약 10 분 또는 약 10 내지 약 20 분이다.

개시된 ECM 하이드로겔은 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 0.2 / s의 전단 속도에서 약 10 내지 약 100 Pa * s, 예컨대 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 Pa * s의 유동 점도를 가진다. 추가 실시예에서, 유동 점도는 약 0.1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 100 Pa * s이고 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.2 Pa * s이다. 더 많은 실시예에서, 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 30 Pa * s이고, 약 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa * s이다.

일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 1 / s의 전단 속도에서 유동 점도가 약 0.1 내지 약 30 Pa * s이다. 추가 실시예에서, ECM 하이드로겔은 약 0.1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 100 Pa * s의 유동 점도를 갖는다. 특정 비제한적 예에서, ECM 하이드로겔은 0.5 내지 약 50 Pa * s의 유동 점도를 갖거나, ECM 하이드로겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 약 1 내지 약 40 Pa * s의 유동 점도를 갖는다. 예시적인 유동 점도는 0.1 / s의 전단 속도에서 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80 90 또는 100 Pa * s이다.

다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.20 Pa * s, 또는 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.10 Pa * s, 예를 들면0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.19 또는 0.2 Pa*s의 유동 점도를 갖는다.

더 많은 실시예에서, ECM 하이드로겔은 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa * s, 또는 100 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 0.8 Pa * s, 예를 들면 약 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.08 Pa * s를 갖는다.

다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은1/s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 30 Pa * s, 예컨대 약 1 내지 약 20 Pa * s, 또는 1 내지 약 10 Pa * s, 또는 0.5 내지 25 Pa * s, 예를 들면 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 Pa*의 유동 점도를 갖는다. 유동 점도는 예를 들어 1 / s의 전단 속도에서 5, 10, 20 또는 30 Pa * s 일 수 있다. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8과 같은 약 0.02 내지 약 0.8의 유동 점도를 갖는다. 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 30 Pa * s 일 수 있고, 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa * s 일 수 있다. 추가 실시예에서, 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 1 내지 약 10 Pa * s이고, 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.5이다.

추가 실시예에서, ECM 하이드로겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 약 10 내지 약 100 Pa * s의 유동 점도를 갖는다. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.2 Pa * s의 유동 점도를 갖는다. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 0.1 / s의 전단 속도에서 약 1 내지 약 40 Pa * s의 유동 점도를 갖고 1000 / s의 전단 속도에서 0.01 내지 0.2 Pa * s의 유동 점도를 갖는다.

개시된 ECM 하이드로겔은 i) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa), ii) 약 10 내지 약 600 Pa, iii) 약 5 내지 약 1,000 Pa, iv) 약 10 내지 1,000 Pa, 또는 v) 약 10 내지 70 Pa의 경도를 갖는다. ECM 하이드로겔은 약 10 내지 약 300 Pascal (Pa), 예를 들어 약 10 내지 약 70 Pa, 약 10 내지 약 100 Pascal (Pa), 또는 약 10 내지 약 150 Pa, 약 10 내지 약 200 Pa, 또는 약 10 내지 약 300 Pa의 경도를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 개시된 ECM 하이드로겔은 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70 Pa의 경도를 갖는다. 다른 실시예에서, 개시된 ECM 하이드로겔은 약 10 내지 약 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 또는 400 Pa의 경도를 갖는다. 추가 실시예에서, 개시된 ECM 하이드로겔은 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300Pa의 경도를 갖는다.

일부 실시예에서, 하이드로겔 내의 ECM 농도는 약 2 mg / ml 내지 약 20 mg / ml, 예컨대 약 8 mg / ml 내지 약 12 mg / ml 또는 약 2 mg / ml 내지 약 16 mg / ml이다. 다른 실시예에서, 하이드로겔의 ECM 농도는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 mg / ml이다. 예시적인 사용 농도는 약 9mg / ml 내지 약 11mg / ml, 및 약 10mg / ml 내지 약 12mg / ml를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가적인 예시의 농도는 약 8mg / ml 내지 약 10mg / ml, 약 8mg / ml 내지 약 11mg / ml, 약 8mg / ml 내지 약 13mg / ml, 약 8mg / ml 내지 약 14mg / ml, 약 8 mg / ml 내지 약 15 mg / ml, 및 약 8 mg / ml 내지 약 16 mg / ml를 포함한다. 추가적인 예시의 사용 농도는 또한 약 6 mg / ml 내지 약 12 mg / ml, 약 13 mg / ml, 약 14 mg / ml, 약 15 mg / ml 또는 약 16 mg / ml를 포함한다.

개시된 ECM 하이드로겔은 키트(kit)의 성분으로 제공될 수 있다. ECM 하이드로겔은 냉동 또는 동결 건조된 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 하이드로 겔을 형성하는 데 필요한 성분, 예컨대 동결 건조된 형태와 같은 하이드로겔을 포함하는 하나의 용기(container), 동결 건조된 하이드로겔을 용해시키기 위한 용액을 포함하는 하나의 용기, 및 선택적으로 용해된 형태를 중화하기 위해 중화 용액을 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 키트는 용해된 하이드로겔을 포함하는 용기 및 중화제를 포함하는 제 2 용기를 포함할 수 있다.

선택적으로, 이러한 키트는 포장, 설명서 및 버퍼, 기질 또는 다른 치료 성분과 같은 다양한 기타 시약을 포함한 추가 구성 요소를 포함한다. 키트는 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 유리병(vial), 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 전형적으로 ECM 하이드로겔을 포함하는 조성물을 보유하며, 예를 들어 냉동 또는 동결 건조된 형태는 대상에서 식도 염증을 억제하고 /하거나 식도 염증의 효과를 완화하는데 효과적이다. 여러 실시예에서, 용기는 멸균 접근 포트(sterile access port)를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 정맥으로 들어가는 용액 백(solution bag) 또는 마개가 있는 유리병(vial)일 수 있다). 라벨 또는 패키지 삽입물은 이 조성물이 결장 직장암(colorectal cancer)과 같은 특정 상태에 대한 내시경 절차에 사용됨을 나타낸다.

일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입물에는 사용 지침이 추가로 포함된다. 패키지 삽입물은 일반적으로 치료 제품의 사용에 관한 징후(indication), 사용법, 투여량, 투여, 금기 및 / 또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적 패키지에 관례 적으로 포함된 지침을 포함한다. 교육 자료는 전자 형식(예: 컴퓨터 디스켓(computer diskette) 또는 콤팩트 디스크(compact disk))으로 작성되거나 시각적 자료(예: 비디오 파일)로 작성될 수 있다. 키트는 또한 바늘 또는 카테터와 같이 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하는 추가 구성 요소를 포함할 수 있다. 키트는 특정 방법의 실행에 일상적으로 사용되는 버퍼 및 기타 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트 및 적절한 내용물은 당업자에게 잘 알려져 있다.

치료 방법(Methods of Treatment)

대상의 기관 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법이 본 출원에 개시되며, 여기서 기관은 식도(esophagus)가 아니다. 기관은 위장관(gastrointestinal tract)에 있을 수 있으며 예를 들어 십이지장(duodenum), 위(stomach), 소장(small intestine), 대장(large intestine)(결장(colon)) 또는 직장(rectum)이다. 기관은 방광(bladder), 구강 호흡기 기관(organs of the oral-respiratory system)(폐(lung), 인후(throat)(인두(pharynx)), 혀(tongue), 비강(nasal passages), 부비강(sinus)), 피부(skin) 또는 자궁(uterus) 및 질관(vaginal tract)일 수 있다. 특정 조직의 예는 호흡기 상피(respiratory epithelium), 비강 상피(nasal epithelium), 진피(dermal) 또는 표피 조직(epidermal tissue) 및 자궁 상피(uterine epithelium)이다. 방법은 점막 및 점막하를 갖는 임의의 기관에서 사용되며, 여기서 악성(malignant) 또는 전 악성(pre-malignant) 병변과 같은 표면 병변이 형성될 수 있다. 여기서 기관은 식도가 아니다.

이들 방법은 ECM 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 기관에 점막하 주사하여 기관의 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 기관은 식도가 아니다. 상기 방법은 내시경 점막 절제술(EMR) 또는 내시경 점막하 박리술(ESD)일 수 있다.

EMR는 위장관의 표재층(점막 및 점막하)에 국한된 고착성 또는 편평한 신생물을 제거하기 위해 개발된 내시경 기술이다. EMR는 일반적으로 2cm 미만의 병변을 제거하거나 더 큰 병변을 단편적으로 제거하는 데 사용된다. EMR는 또한 정확한 병리학적 병기를 위해 절제된 표본을 평가하는 데 중요한 역할을 한다. 용종 절제술(polypectomy)과는 대조적으로, EMR는 점막하 층에 일반적으로 생리 식염수(normal saline, NS) 용액을 주입하여 근육층에서 병변을 들어 올리는 것을 포함한다. EMR는 림프절 전이의 위험을 결정하기 위해 정확한 조직병리학적 병기 (histopathological staging)를 위한 표본을 얻는데도 유용하다. EMR는 장벽 점막하의 중간 또는 더 깊은 부분을 절제하여 감염된 점막의 완전한 제거를 용이하게 한다. 다양한 EMR 기술이 설명되었으며 스네어 절제(snare resection)를 포함하는 네 가지 방법이 일반적으로 사용된다. (1) 주사 및 절단 방법(the inject and cut method); (2) 주사, 들어 올리기 및 절단 방법(inject, lift, and cut method); (3) 캡-보조 내시경 점막 절제(cap-assisted EMR, EMRC); 및 (4) 결찰(ligation)이 있는 EMR (EMRL). 주사 및 절단 기술에서 병든 점막은 점막하 액체 쿠션을 생성하여 근육층에서 들어 올려서 잡고 수술용 전기 스네어(electrosurgical snare)를 사용하여 꽉 조인 다음 절제한다. 그러나 얇은 점막하 층에 주사하는 것은 섬세한 과정이며, 주사된 용액은 빠르게 소멸되는 경향이 있으며, 튀어 나온 병변에 비해 스네어로 편평하고 눌린 병변을 포착하기 어렵고 크거나 처리하기 곤란한 곳에 위치한 병변은 제거하기 어려울 수 있다(Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008 : 2 131-138). 주사 보조 내시경 점막 절제술(Injection-assisted EMR)은 크고 편평한 결장 폴립에 자주 사용된다.

ESD는 더 큰 병변을 제거하기 위해 특별히 개발되었다. 병변은 수술용 전기칼을 사용하여 점막하 층을 따라 직접 분리하여 큰 병변도 일괄 절제(en-bloc resection)한다. ESD는 특정 암 단계 치료에서 기존 수술을 대체할 것으로 예측되었지만 기존 EMR보다 천공(perforation) 및 출혈 합병증(bleeding complication) 비율이 더 높기 때문에 EMR보다 더 많은 내시경 기술과 경험이 필요하다. ESD는 절연팁 투열성 나이프(insulation-tipped diathermic knife), 바늘 나이프(needle knife), 후크 나이프(hook knife), 플렉스 나이프(flex knife), 삼각형 팁 나이프(triangle tipped knife), 플러시 나이프(flush knife), 스플래시 바늘(splash needle) 및 작은 구경 팁 투명 후드(small-caliber tip transparent hood)와 같은 수많은 수술용 전기칼을 사용할 수 있다. 이 칼은 고주파 전기 수술 전류 (high frequency electrosurgical current, HFEC) 발생기와 함께 사용할 수 있다. ESD의 특징은 다음 세 단계이다: (1) 점막하 쿠션을 형성하기 위해 유체를 주사하여 근육층에서 병변을 높이고; (2) 병변 주변 점막의 원주형 절단 (circumferential cutting); 및 (3) 병변 아래 점막하의 결합 조직의 분리 (Kakushima et al., Wold J. Gstroenterol. 14 (9) : 2962-2967, 2008 참조, 본 출원에 참고로 포함됨). 다양한 점막하 주사 용액은 이전에 개발되어 EMR 동안 사용하기에 만족스러운 것으로 나타났지만 더 긴 ESD 과정을 도입하려면 점막하 층을 분리하는 동안에 절단 선을 식별하는데 도움이되는 더 오래 지속되는 용액이 요구되었다(Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008 : 2 131-138). 현재 개시된 방법은 이러한 요구를 충족시킨다.

EMR에서 사용하는 점막하 주사는 점막하 쿠션에 유체를 주입하면 스네어로 표적 병변을 포착하기 직전에 제거할 조직의 분리를 용이하게 하여 열 손상과 천공 및 출혈의 위험을 줄이고 또한 절제를 용이하게 한다. 점막하 주사는 EMR 과정에서 중요한 역할을 하는데 이는 용액이 충분한 기간 동안 제자리에 유지되어야 하고 스네어로 잡는 것을 용이하게 하기 위해 반구 모양을 형성해야 하기 때문이다. 또한 충분히 높은 점막하 상승을 제공하면 ESD 과정 중에 안전한 점막하 절단이 가능하다(Uraoka et al., Drug Design, Development and Therapy 2008 : 2 131-138). 게다가 수술로 인해 염증이 생기기 때문에 수술 부위에 남아있는 쿠션은 항염(anti-inflammatory) 작용을 해야 한다. ECM 하이드로겔은 협착(stricture)을 완화하고 재상피화(re-epithelialization)를 촉진한다. 현재 개시된 방법은 또한 이러한 요구를 충족시킨다.

일부 실시예에서, 개시된 방법은 항염증 특성을 갖고, 저렴하고, 무독성이며, 주사하기 쉽고, 높고 오래 지속되는 점막하 쿠션을 제공하는 ECM 하이드로겔을 사용한다. ECM 하이드로겔은 프리겔(pre-gel) 형태로 투여된 후 주사 부위에서 겔화되어 쿠션을 형성한다. 쿠션은 수술 중에 분리되어 일부 하이드로겔이 하부 고유근에 남아 치유를 돕는다. 개시된 ECM 하이드로겔은 절제된 점막 / 점막하의 제거에 의해 생성된 상처의 폐쇄를 용이하게 한다. 일부 실시예에서, 이 수술은 ESD이다. 다른 실시예에서, 이 수술은 EMR이다.

정상 식염수 (NS) 및 희석 용액(thinner solution)(예: ELEVIEW ^TM, 미국 특허 번호 9,226,996 참조)이 내시경 절제를 위한 점막하 쿠션으로 사용되었지만, 이러한 용액의 고유한 특성인 용액의 빠른 분산으로 인해 적절한 점막하 유체 쿠션을 생성하고, 원하는 높이에서 유지되며 원하는 위치에 쿠션을 유지하는 것이 어려웠다. 더욱이 ESD에서 일단 점막 / 점막하 막이 제거되면 이러한 제제는 하부 고유근에 유지되지 않는다. 또한, 이러한 제제는 염증 감소와 같은 치유 과정을 돕지 않는다. ECM 하이드로겔의 사용은 이러한 요구를 충족한다.

본 출원에 개시된 ECM 하이드로겔은 임의의 ESD 또는 EMR에서 사용될 수 있다. 본 출원에 참고로 포함된 미국 특허 제 9,364,580 호에 개시된 바와 같이, 내시경 주사 바늘은 길이(최대 약 230cm)가 길고 원위(distal) 주사 바늘이 있는 내부 주사 튜브가 슬라이드 가능하게 배치된 비교적 긴 카테터를 포함하는 장치이다. 근위(proximal) 작동 핸들은 필요할 때 하나를 다른 하나에 대해 상대적으로 이동시키기 위해 카테터 및 주사 튜브에 결합한다. 주사 튜브에 대한 유체 접근은 일반적으로 핸들의 리어 커넥터(eer connector)를 통해 제공된다. 내시경 주사 바늘 장치는 일반적으로 내시경의 작업 채널을 통해 주사 부위로 전달된다. 내시경 작업 채널의 내강이 손상되지 않도록 보호하기 위해 주입 바늘 장치의 핸들을 조작하여 장치를 내시경에 삽입하기 전에 원위 주사 바늘을 카테터의 내강으로 빼낸다. 이것은 장치가 내시경의 내강을 통해 이동할 때 주사 바늘의 날카로운 부분이 노출되는 것을 방지한다. 내시경 주사 바늘 장치의 원위 말단이 주사 부위에 위치 할 때, 그 핸들을 다시 조작하여 주사 바늘을 카테터의 내강에서 말단으로 이동시킨다. 가장 먼 위치로 전진할 때 주사 바늘의 노출 된 부분의 길이는 약 4-6mm이다.

주사 부위를 뚫은 후, 주사 바늘 핸들에 연결된 루어락 피팅(luer-lock fitting)과 함께 제공된 5ml ~ 10ml 주사기에 들어있는 프리겔 형태의 ECM을 주사 튜브와 바늘을 통해 점막하와 하부 고유근 사이와 같은 주사 부위로 전달할 수 있다.

내시경술 중에 일반적으로 사용되는 주사 바늘 및 기타 부대용품, 예를들어 용종 절제술용 스네어, 클리핑(clipping) 장치, 생검 겸자 등은 일반적으로 작업 채널 또는 수술 채널이라고 하는 내시경의 하나 이상의 특정 채널을 통과한다. GI 내시경에 사용되는 내시경의 유형 (예: 위내시경(gastroscope), 소장내시경(enteroscope), 대장경(colonoscope), 십이지장경(duodenoscope), S자 결장경(sigmoidoscope) 등)에 따라 작업 채널의 내경이 상당히 다양하다. 그러나 GI 내시경에 사용되는 가장 일반적인 내시경에는 내경이 약 2mm에서 약 5mm 범위인 작업 채널이 있다. 일반적으로 내시경 부대용품 제조업체는 모든 작업 채널에 맞는 외경이 있는 부대용품을 생산한다. 일부 실시예에서, 내시경 주사 바늘, 카테터의 외경은 약 1.9, 2.0, 2.1, 2.2 또는 2.3cm와 같이 1.9mm 내지 2.3mm 범위이다. 따라서 내부 주사 튜브가 외부 카테터에 포함되어 있음을 고려할 때 내경은 일반적으로 1mm 이하이다. 프리겔 형태의 개시된 ECM 하이드로겔은 이러한 카테터를 쉽게 통과할 수 있다.

프리겔 형태의 ECM 하이드로겔은 주사기를 사용하여 1 차 용기에서 에멀젼 볼륨을 흡입하고 표재성 점막층 바로 아래 내시경의 작업 채널에 삽입된 내시경 주사 바늘을 사용하여 상기 에멀젼의 적절한 볼륨을 주사하여, 제자리에 있을 때 쿠션이 되는 점막하층에 액체 볼륨을 배치하기 위한 내시경 절제술에 사용할 수 있다: 병변이 편평하여 장이나 위 내강과 같은 내강으로 튀어 나오지 않더라도 내시경술을 수행하는 동안 점막 표면의 상승으로 내시경 시술의가 발견된 점막 병변을 쉽게 절제할 수 있다.

쿠션에 적어도 하나의 염료가 있으면 내시경 시술의가 점막 아래의 구조(예: 점막하층 및 외부 근육벽)를 시각화하는데 도움이 될 수 있으므로 절제술을 수행하는 내시경 시술의가 상기 구조에 손상을 일으킬 수 있는 위험을 낮출 수 있다. 염료를 사용하면 쿠션 구멍(cavity)과 점막 기저부를 시각화 할 수 있다. 점막 표면에서 병변을 제거하면 점막에 상처가 생긴다. 약학적 조성물의 주사된 볼륨에 의해 생성된 쿠션의 지속성은 재주입할 필요 없이 내시경 절제술을 수행할 수 있게 한다. 프리겔 형태의 ECM 하이드로겔은 병변 또는 종양의 부위와 같은 대상 기관의 관심 부위에 점막하 주사하여 기관의 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성한다. 쿠션이 분리되어 ECM 하이드로겔의 일부가 하부 고유근에 유지되고 치유 과정을 돕는다.

상기 기관은 위장관 기관과 같은 관심 기관일 수 있다. 여기서 기관은 식도가 아니다. 기관은 인두, 혀 또는 입과 같은 상부 위장관에 있을 수 있다. 기관은 방광, 질관 또는 자궁일 수 있다. 일부 실시예에서, 기관은 결장, 십이지장, 위, 맹장, 결장, S 상 결장, 직장, 소장 또는 대장이다. 비제한적인 하나의 예에서, 기관은 위, 소장 또는 대장이고, 방법은 위로부터 암종 또는 선암을 분리하는 방법을 포함한다. 추가의 비제한적인 예에서, 기관은 결장이고, 여기서 방법은 결장으로부터 폴립 또는 암종을 분리하는 것을 포함한다.

본 출원에 개시된 바와 같이 ECM 하이드로겔은 겔화되는 온도 이하, 예컨대 실온 이하(예를 들어, 약 25 °C에서 유지된다. ECM 하이드로겔은 예를 들어 투여 전에 25°C 또는 4°C에서 유지될 수 있다. 그런 다음 유효량의 ECM 하이드로겔를 프리겔 형태로 사용한다. ECM 하이드로겔은 약 37°C의 온도인 대상의 조직에서 겔화된다. ECM 하이드로겔은 동결 건조 또는 동결된 형태로 제공될 수 있으며 대상의 기관 부위에 투여하기 직전에 재구성될 수 있다.

개시된 방법은 인간 및 수의학적 대상를 포함하는 임의의 대상에서 사용된다. 대상은 모든 연령이 될 수 있다. 대상은 성인 또는 청소년일 수 있다. 한 실시예에서, 프리겔 형태의 ECM 하이드로겔을 포함하는 조성물은 기관의 표적 조직에 주사되어 쿠션을 형성하고, 그 다음에 선택적으로 절제술과 같은 내시경 절제술이 적용된다. ECM은 치료중인 대상과 동일한 종에서 유래하거나 다른 종에서 유래할 수 있다. 일부 실시예에서, 대상은 인간이고 ECM 하이드로겔은 인간 또는 돼지ECM으로부터 유래된다. 다른 실시예에서, ECM 하이드로겔은 비인간 영장류, 개, 고양이, 말 또는 소로부터 유래된다. ECM은 상업적 원천에서 제공될 수도 있다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 돼지 또는 인간 조직과 같지만 이에 제한되지 않는 임의의 포유류 조직으로부터 유래될 수 있고, 일부 비제한적인 예에서는 방광, 소장 또는 식도일 수 있다. 상기에 개시된 임의의 ECM 하이드로겔은 점막하 쿠션 및 / 또는 임의의 개시된 방법으로 사용될 수 있다. 하이드로겔은 식도 ECM 하이드로겔 또는 방광 하이드로겔일 수 있다.

개시된 방법은 대상의 장 기관의 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 주사를 필요로 하기 때문에 침습적이다. 따라서 세포외 기질(ECM)은 위장관 기관과 같은 기관의 표면에 적용되지 않는다. 개시된 방법은 식도에서 실행되지 않는다.

본 출원에 개시된 임의의 방법은 ECM 하이드로겔을 포함하는 약학적 조성물을 대상의 기관에 점막하 주사하여 기관의 부위에서 점막하와 하부 고유근 사이에 쿠션을 형성하는 것을 포함할 수 있다. ECM 하이드로겔은 다음과 같은 특징을 갖는다: a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화 시간; b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도; 및 c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도. 상기 방법은 상기 개시된 하이드로겔 중 임의의 것을 이용할 수 있다. ECM 하이드로겔은 겔화되고 하부 고유근으로부터 점막과 점막하를 분리되며 대상의 기관 부위에서 염증을 억제한다. ECM 하이드로겔은 프리겔 형태로 내시경 또는 카테터를 통해 투여할 수 있다. 일부 실시예에서, 기관은 결장, 위, 맹장, S 자 결장, 직장, 소장 또는 대장이다.

일부 실시예에서, 절제술은 EMR 또는 ESD이다. 추가 실시예에서, 기관은 위, 소장 또는 대장이고, 방법은 결장으로부터 폴립, 암종 또는 선암을 분리하는 방법을 포함한다. 더 많은 실시예에서, 방법은 이형성증이 있는 환자의 기관으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 것을 포함한다. 특정 비제한적 예에서, 방법은 결장으로부터 폴립 또는 암종을 분리하는 것을 포함한다. 일반적으로 상기 기관은 식도가 아니다.

방법은 또한 쿠션에 내시경 절제술을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 방법은 하이드로겔이 기관의 하부 고유근에 유지되고 점막 및 점막하가 기관의 부위로부터 제거되도록 쿠션을 분할하는 것을 포함한다.

일부 실시예에서, 하이드로겔의 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C의 온도에서 30 분 이상이다. 일부 특정 비제한적인 예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 30 분이다. 다른 특정 비제한적 예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 10 분이다. 추가의 비제한적인 예에서, 50 % 겔화까지의 시간은 약 3 내지 약 10 분이다.

추가 실시예에서, 프리겔 형태의 유동 점도는 관심 기관에 주사하기에 충분하다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔의 유동 점도는 유동 점도가 약 0.1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 100 Pa * s이고 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.2 Pa * s이다. 일부 비제한적인 예에서, 유동 점도는 1 / s의 전단 속도에서 약 30 Pa * s이고, 약 100 / s의 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa * s이다.

추가 실시예에서, ECM 하이드로겔은 조직 내로 도입될 때 약 10 내지 약 300 Pascal (Pa)의 경도를 가지며; 여기서 ECM 하이드로겔은 10-70 Pa의 경도를 갖는다. 추가 실시예에서, 하이드로겔의 ECM 농도는 2 mg / ml 내지 약 16 mg / ml이다.

ECM 하이드로겔은 본 출원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 (a) 산성 용액에서 산성 프로테아제로 조직을 소화하여 탈세포화된 ECM을 용해시켜 소화된 ECM을 생성하고; (b) 소화된 ECM의 pH를 7.2 내지 7.8의 pH로 상승시켜 중화된 소화 용액을 생성하는 단계에 의해 생성된다. 추가 실시예에서, 단계 (b)에서 소화된 ECM의 pH를 높이는 것은 염기 또는 등장 버퍼을 첨가하여 소화된 ECM의 pH를 높이는 것을 포함한다. 추가 실시예에서, 펩신, 트립신 또는 이들의 조합과 같은 산성 프로테아제가 사용된다. 상기 ECM 하이드로겔은 식도 ECM 하이드로겔일 수 있다. 상기 ECM 하이드로겔은 방광 ECM 하이드로겔일 수 있다.

일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 대상에게 투여하기 전에 25 °C이하에서 유지된다. 일부 실시예에서, ECM 하이드로겔은 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 °C와 같은 약 4 °C 내지 약 28 °C에서 유지된다. ECM 하이드로겔은 사용 직전에 약 4 °C에서 유지하고 약 4 °C에서 약 25 °C에서 사용하거나 약 25 °C로 데울 수 있다. 일부 실시예에서, 온도 조절은 ECM 하이드로겔이 프리겔 형태로 유지되도록 보장하고, 따라서 점막하와 하부 고유근 사이의 주사에 적합하다. 추가 실시예에서, 하이드로겔은 예를 들어 37 °C의 온도에 도달할 때와 같이 대상에게 투여될 때 겔화된다.

실시예(EXAMPLES)

ELEVIEW ^TM와 ECM 하이드로겔은 서로 다른 생체 재료이다. ELEVIEW ^TM (Aries Pharmaceuticals, Inc, 더블린, 아일랜드)는 EMR 및 ESD 수술을 위한 점막하 들어 올리기를 제공하기 위해 임상적으로 사용되는 Poloxamer 188의 상업적으로 이용가능한 저점도 에멀젼이다. ELEVIEW ^TM는 37 °C에서 안정적으로 형성된 하이드로겔을 형성하지 않고 37 °C에서 한 시간에 걸쳐 액체 상태로 남아 있음이 여기에 개시되어 있다. 대조적으로, 12 mg / mL의 식도 ECM 하이드로겔(eECM)(본 출원에 개시된 방법에 따라, 즉 ECM의 프로테아제 소화에 의해 제조됨)은 37 °C (체온)에서 안정적으로 형성되는 하이드로겔을 형성한다. ELEVIEW ^TM 및 eECM은 점막 아래에 주사할 수 있다. 이상적인 생체 재료는 두 층 모두에 부착된다. 근육에 대한 ELEVIEW ^TM와 eECM 12mg / mL 사이에 점막접착 강도(mucoadhesive strength)에는 차이가 없었다. 놀랍게도 eECM은 ELEVIEW ^TM보다 점막에 대한 점막 접착력(mucoadhesion)이 더 강했다. 게다가, eECM은 리모델링 표현형으로 대식세포 분극화(polarization)에 의한 생물학적 활성을 입증했다. 이것은 세포외 기질 하이드로겔이 점막하 쿠션으로 효과적으로 사용될 수 있고, 따라서 하부 고유근으로부터 점막하를 분리하는데 사용될 수 있음을 입증한다.

실시예1(Example1)

재료 및 방법(Materials and Methods)

유동학(Rheology)

ELEVIEW ^TM 및 eECM 12 mg / mL의 점탄성(viscoelastic) 특성은 온도 조절식 40mm 평행 플레이트(parallel plate) 유량계(rheometer) (AR2000)로 측정되었다. 샘플을 4 °C로 유지하고 10 °C로 사전 냉각된 평행 플레이트 구조를 사용하여 유량계에 로드(load)했다. 샘플 플레이트 인터페이스(interface)를 밀봉하고 테스트 중 증발을 최소화하기 위해 미네랄 오일이 사용되었다. 일련의 유동학적 테스트가 각 샘플에 순서대로 수행되었다. 전단 속도 범위(0.1-1000 s^-1)에서 샘플의 점도 프로파일(profile)을 결정하기 위해 10 °C에서 정상 상태 흐름 곡선(steady state flow curve)을 수행하였다. 플레이트 온도는 10 ° C에서 37 °C로 급격히 상승했으며, 최대 저장 계수(maximum storage modulus)(G '), 최대 손실 계수(maximum loss modulus)(G '') 및 겔화 역학(gelation kinetics)을 측정하기 위해 1rad / s의 주파수에서 작은, 0.5 %의 진동 변형(oscillatory strain)을 적용하여 37 °C에서 진동 타임 스윕(oscillatory time sweep)을 수행하였다. 데이터는 통계 분석(n = 3)을 위해 Prism (버전 6, GraphPad)에서 추출 및 분석되었다.

근육에 대한 점막접착력(Muco-adhesion to muscularis)

돼지 점막과 근육(muscularis)은 하부 근육층에서 점막과 점막하를 벗겨서 기계적으로 분리되었다. ELEVIEW ^TM 및 eECM(12 mg / mL)을 6 웰 플레이트에 피펫팅(pipetting)하였다. ELEVIEW ^TM 또는 eECM 위에 놓인 반구(직경 40mm)의 바닥 표면에 점막 또는 근육을 접착하여 ELEVIEW ^TM 또는 eECM과 접촉하는 점막 또는 근육의 표면적이 모든 테스트에서 일정하게 유지되도록 하였다. 이 구조물을 점막 또는 근육에 부착하기 위해 37 °C에서 1 시간 동안 배양되었다. 1 시간 후, 구조물을 10N로드셀(load cell) 및 볼 버스트 어태치먼트(ball burst attachment)가 있는 MTS Insight 인장 시험기(tensile machine)에 배치하고 10Hz의 측정 주파수로 설정했다. 볼 버스트 어태치먼트를 반구에 단단히 부착하고 반구를 5mm / 분으로 올렸다. 최대 힘 값(maximum force value)은 자유롭게 매달린 구조물의 힘에 의해 감산된 접착력(adhesion force)으로 간주되었다. 측정은 점막 또는 근육과 하이드로겔 사이에 박리가 발생한 경우에만 허용되었다(n = 3).

체외 점막하 유체 쿠션 성능(Ex-vivo submucosal fluid cushion performance)

돼지의 결장과 위를 37 °C 인큐베이터에 넣고 체온계로 조직이 37 °C에 도달할 때까지 온도를 모니터링했다. 목표 온도에 도달한 후 23G 바늘을 사용하여 2mL의 ELEVIEW ^TM 또는 중화된 eECM을 점막하에 12mg / mL로 주사했다. eECM은 수술 중에 얼음에 보관되었다. 조직은 최대 75 분 동안 15 분 간격으로 미터법 위트니스(metric witness)와 함께 평가 및 사진 촬영되었다. 조직은 수술 내내 37 °C에서 배양되다. 75 분 후, 시험 약제(test agent)가 주사된 부위를 분리하고 평가하였다. ImageJ는 실험 전반에 걸쳐 약제 주사 후 점막의 상승을 정량화하는데 사용되었다.

대식세포 분리 및 활성화(Macrophage isolation and activation

마우스 골수(bone marrow)를 이전에 서술되어 있는 방법으로 수확하였다[1, 2]. 간단히 말해서, 암컷 6-8 주령 C57bl / 6 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 CO₂흡입 및 경추 탈구(cervical dislocation)를 통해 안락사시켰다. 무균 상태에서, 근위 뒷다리(proximal hind limb)에서 발까지의 피부가 제거되고 족근(tarsus)과 뒷무릎관절(stifle)이 탈구되고 경골(tibia)이 분리되었다. 엉덩넙적다리 관절(coxafemoral joint)은 대퇴골(femur)의 분리를 위해 탈구되었다. 과도한 조직을 제거한 후, 뼈를 얼음 위에 보관하고 DMEM(Gibco, Grand Island, NY), 10 % 소 태아 혈청(FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% L929 상청액(supernatant) [2], 50uM 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol) (Gibco), 100U / ml 페니실린(penicillin), 100ug / ml 스트렙토마이신(streptomycin), 10mM 비필수 아미노산(non-essential amino acid) (Gibco) 및 10mM 허피스 버퍼(hepes buffer)로 구성된 대식세포 완전 배지(complete medium)를 포함하는 멸균 접시에서 헹구었다. 뼈의 끝을 절개하고 골수를 수집하기 위해 골수강(marrow cavity)을 완전 배지로 흘러나오게 했다. 세포를 세척하고 2 x 106 세포 / ml로 플레이팅하고 37 °C, 5 % CO2에서 7 일 동안 대식세포로 분화하도록 허용하고 이전에 설명한대로 48 시간마다 배지를 완전히 교체하였다[3]. 7 일 후, 생성된 나이브(naive) 대식세포를 DMEM 중 10 % FBS, 100 ug / ml 스트렙토마이신, 100 U / ml 페니실린 및 이전에 서술되어 있는 대로 다음 조건 중 하나로 구성된 기본 배지로 처리하였다. (1) 20 ng / ml IFNγ 및 M1 유사 표현형(M1-like phenotype)을 촉진하기 위한 100 ng / ml의 LPS, (2) M2 유사 표현형(M2-like phenotype)을 촉진하기 위한 20 ng / ml IL-4, (3) 250 ug / ml 펩신 대조군 버퍼, (4) 250 ug / ml의 식도ECM, 또는 (5) 37 °C, 5 % CO2 에서 24 시간 동안 동일한 양의 ELEVIEW^TM[4].

대식세포의 면역 표지(Immuno-labeling of Macrophages)

24 시간 후, 대식세포를 세척하고 2 % 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. PBS 세척 후, 세포를 0.1 % Triton-X 100, 0.1 % Tween 20, 4 % 정상 염소 혈청(normal goat serum) 및 2 % 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 차단(blocking) 용액에서 실온에서 1 시간 동안 배양하여 비특이적인 항체 결합(antibody binding)을 방지하였다. 다음 1차 항체를 차단 용액에 희석하였다: (1) 팬-대식세포 마커(pan-macrophage marker)인 단일 클론성의 항-F4 / 80 (monoclonal anti-F4/80)(Abcam, Cambridge, MA)을 1 : 100로 희석, (2) M1 마커인 다클론성의 항-iNOS(polyclonal anti-iNOS) (Abcam, Cambridge, MA)를 1 : 100로 희석, (3) M2 마커인 다클론성 항-Fizz1 (polyclonal anti-Fizz1)(Peprotech, Rocky Hill, NJ)를 1 : 100로 희석, (4) M2 유사(M2-like) 마커인 간 아르기나아제(Arginase)에 대한 다클론(Abcam, Cambridge, MA )을 1 : 100로 희석[5-7]. 세포는 4 °C에서 16 시간 동안 1 차 항체에서 배양되었다. PBS 세척 후, 세포를 형광 단(fluorophore)이 결합된 2차 항체(Alexa Fluor goat anti-rat 488 또는 goat anti-rabbit 488, Invitrogen)에서 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. PBS 세척 후, 핵(nuclei)을 라이브 세포 현미경(live-cell microscope)을 사용하여 3 개의 200X 필드를 이미징하기 전에 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 카운터 염색하였다. 빛 노출 시간은 네거티브 아이소타입 컨트롤(negative isotype control)로 표준화하였고 이미지 전반에 걸쳐 일정하게 유지되었다. CellProfiler 이미지 분석(CellProfiler Image Analysis) 소프트웨어를 사용하여 이미지를 정량화하여 양성 F4 / 80, iNOS, Fizz1 및 Arginase1 백분율을 얻었다.

동물을 바로 누운 자세(supine position)로 놓고 Pentax EG3430K 내시경을 사용하여 기관를 평가한다. 기관의 기준(reference point)을 확인한 후, 4°C에서 Olympus Injectorforce 4mm 23G 바늘을 사용하여 8mg / ml의 파란색으로 염색된 방광 기질-하이드로겔(Urinary Bladder Matrix - hydrogel) 주사로 절제 부위의 점막과 점막하층을 분리했다. 이 온도는 바늘의 겔화 및 잠재적인 막힘을 방지하기 위해 항상 유지된다. 부위 당 약 2-5ml의 파란색 겔이 주입된다. 5cm 길이의 점막 전체 둘레(100 %)는 밴드-라이게이션(band-ligation) EMR 기술을 사용하여 제거된다. EMR의 경우 라이게이션 밴드(ligation band)가 있는 Cook Duette Kit가 사용된다. 그런 다음 스네어를 사용하여 점막을 절제한다.

통계(Statistics)

2-way ANOVA는 종속 변수(dependent variable) 점도에 대한 독립 변수(independent variable) 전단 속도와 샘플의 효과를 비교하는데 사용되었으며 또한 종속 변수 계수(dependent variable modulus)에 대한 독립 변수 샘플 및 계수 유형의 효과를 비교하는데 사용되었다. Sidak post-hoc 다중 비교 테스트(Sidak post-hoc multiple comparisons test)가 사용되었으며 95 % 신뢰 구간을 사용하여 유의성을 결정하고 다중 비교를 위해 p-value을 조정하였다. ELEVIEW^TM와 식도 세포외 기질(eECM) 12 mg / mL를 비교하여 점막 부착 강도(mucoadhesive strength)에 대해 t- 테스트를 수행하였다.

실시예2(Example2)

점탄성 특징(Viscoelastic properties)

ELEVIEW^TM는 0.1 1 / s 전단 속도 (p <0.0001)에서 eECM 12 mg / mL보다 점성이 현저히 적었으며 1 1 / s (p = 0.054)에서는 차이가 덜 두드러지는 경향이 있었다(도 1A). ELEVIEW^TM는 손실 계수(G '') 평균(0.09±0.04 Pa)이 저장 계수(G ') 평균(0.05±0.01 Pa)보다 크기 때문에 안정한 하이드로겔 형태를 형성하지 못하고 반면에 eECM 12mg / mL은 안정적으로 형성된 ECM 하이드로겔의 정의와 같이(Freytes et al., Biomaterials, 2008. 29(11): p. 1630-7) 손실 계수(G '') (7.62±6.30 Pa)보다 더 큰 수를 가지는 저장 계수(G ') (56.95±66.72 Pa)을 가진다(도 1B). ELEVIEW^TM의 타임 스윕에 대한 대표적인 그래프는 ELEVIEW^TM가 하이드로겔을 형성하지 않고(도 1C), 반면에 eECM 12 mg / mL 저장 계수는 S 자형으로 증가하고 시간이 지남에 따라 안정 상태를 유지한다(도 1D). 따라서 50 % 겔화까지의 겔화 시간은 eECM 12mg / mL (4.5±3.5 분)에 대해 계산할 수 있지만 ELEVIEW^TM에 대해서는 계산할 수 없다(도 1E).

실시예3(Examle3)

근육에 대한 점막접착력(Mucoadhesive force to the muscularis)

ELEVIEW^TM(0.16±0.05 N) 및 eECM (0.21±0.08 N)은 근육에 대해 유의하게 다른 점막접착력을 나타내지 않았다(도 2A). eECM은 ELEVIEW^TM (0.15±0.06N) (p = 0.0053)보다 점막에 대한 점막 접착력 강도(0.37±0.02N)가 더 높았다(도 2B).

실시예4(Example4)

대식세포 활성화(Macrophage activation)

eECM에 노출된 대식세포는 최소한의 iNOS 발현(전염증 마커(anti-inflammatory marker))을 갖는 항염증 마커(anti-inflammatory marker)인 FIZZ1의 활성화를 나타내었다. iNOS 발현은 ELEVIEW^TM, eECM 및 운반체(펩신) 대조군 간에 유사하였다(도 3). ELEVIEW^TM는 어떠한 생체 활성도 보여주지 않았다.

실시예5(Example5)

체외에서 점막하 유체 쿠션 성능(Ex-vivo submucosal fluid cushion performance)

ELEVIEW^TM 및 eECM은 결장(도 4) 또는 위(도 5)에 2mL의 시험 제제를 주입하여 유체 쿠션을 성공적으로 생성하였다. 2 개의 시험 제제는 23G 바늘로 쉽게 주사할 수 있었다. ELEVIEW^TM는 주사 순간부터 확산되는 것처럼 보였다. 쿠션 높이의 측정 및 육안으로 보이는 외관은 시험된 두 조직에 대해 이러한 관찰을 확인시켰다(도 4A, 4B, 5A, 5B). 결장과 위에서는 0 분에서 15 분까지 쿠션 높이의 더 큰 손실을 보였다(도 4A, 5A). 쿠션 높이의 손실은 eECM보다 ELEVIEW^TM에서 더 컸다. 두 시험 물질 모두 쿠션 높이의 감소가 계속되었지만 결장에서의 ELEVIEW^TM 손실이 더 컸다는 것이 분명하였다. 그러나 위에서는 두 시험 물질이 유사한 쿠션 높이의 손실을 보였다(도 5A).

75분 후의 분리는 모든 조직에서 ELEVIEW^TM와 eECM 간의 차이를 보여주었다. ELEVIEW^TM를 주사한 부위는 점막이나 기저 근육층에 뚜렷한 접착이 없는 점성 유체를 나타내었다. 이전에 eECM을 주사한 부위는 점막과 기저 근육에 부착되어 있는 명확하고 정의된 겔 덩어리를 보여주었다(도 4C, 5C). 이는 ELEVIEW^TM가 겔을 형성할 수 없음을 입증한 위의 결과 (실시예 2 참조)와 일치한다(도 1D).

실시예6(Example6)

생체 내에서 EMR를 위한 점막하 유체 쿠션으로 ECM사용

(In-vivo use of ECM as submucosal fluid cushion for EMR)

ECM 하이드로겔은 저항없이 긴 내시경 바늘을 통해 전달된다. 점막의 상승은 EMR 수술을 용이하게 하기 위해 성공적으로 달성되고 유지되었으며 파란색 염료는 제거를 위해 절개가 생성된 장소를 나타내었다. 스네어를 사용하여 조직을 제거하였다. 육안으로 관찰하면 제거된 점막 조직은 겔의 일부를 포함한다. 하이드로겔의 파란색 염료는 점막을 제거한 후 기관의 둘레를 가로 질러 확산되는 것으로 보이며 하이드로겔을 사용하여 전체 둘레가 성취된다.

본 발명의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예의 관점에서, 예시된 실시예는 본 발명의 예일 뿐이며 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안된다는 것을 인식해야 한다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에 의해 정의된다. 따라서 우리는 이러한 청구의 범위 및 정신에서 나오는 모든 것을 우리의 발명으로 주장한다.

Claims

세포외 기질(ECM) 하이드로겔(hydrogel)을 포함하는 약학적 조성물을 기관에 점막하 주사하여 기관의 부위(region of an organ)에서 점막하(submucosa)와 점막하 아래에 존재하는 고유근(underlying muscularis propria) 사이에 쿠션을 형성하는 단계를 포함하되,
상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은:
a) 약 37 °C의 온도에서 30 분 미만의 50 % 겔화(gelation) 시간;
b) 기관으로의 주입에 적합한 유동 점도(flow viscosity); 및
c) 약 10 내지 약 400 Pascal (Pa)의 경도(stiffness)의 특징을 가져,
식도(esophagus)를 제외한 기관의 부위에서 고유근으로부터 점막(mucosa)과 점막하를 분리하고 염증을 억제하는 특징을 갖는 것을 특징으로 하는, 기관의 부위에서 고유근으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 50% 겔화 시간은 약 37 °C에서 약 2 내지 약 30 분인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 50% 겔화 시간은 약 37 ℃에서 약 2 내지 약 10 분인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 50 % 겔화 시간은 약 3 내지 약 10 분인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 점도(flow viscosity)가 약 0.1 / s의 전단 속도(shear rate)에서 약 0.1 내지 약 100 Pa * s이고 1000 / s의 전단 속도에서 약 0.01 내지 약 0.2 Pa * s인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동 점도가 1 / s의 전단 속도에서 약 0.1 내지 약 30 Pa * s이고, 약 100 / s 전단 속도에서 약 0.02 내지 약 0.8 Pa * s 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔이 10 내지 300 Pa의 경도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔이 식도 세포외 기질(ECM) 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로겔 중 ECM 농도가 2 mg / ml 내지 약 16 mg / ml 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔이 내시경(endoscope) 또는 카테터(catheter)를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 산성 용액에서 산성 프로테아제(acid protease)로 조직을 소화하여 탈세포화된(decellularized) ECM을 용해시켜 소화된 식도 ECM을 생성하는 단계; 및
(b) 소화된 ECM의 pH를 7.2와 7.8 사이의 pH로 올려 중화된 소화 용액을 생성하는 단계에 의해 생산되는 것을 특징으로하는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔의 제조 방법.
제11항에 있어서, (b)의 소화된 ECM의 pH를 높이는 것은 염기 또는 등장 버퍼(isotonic buffer)를 첨가하여 소화된 ECM의 pH를 높이는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 산성 프로테아제가 펩신(pepsin), 트립신(trypsin) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은 대상에게 투여되기 전에 25 ℃ 이하에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은 내시경으로 또는 카테터를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질(ECM) 하이드로겔은 대상에게 투여되기 전에 25 ℃ 이하에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관이 결장(colon), 위(stomach), 맹장(cecum), S상 결장(sigmoid colon), 직장(rectum), 소장(small intestine) 또는 대장(large intestine)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관이 위, 소장 또는 대장이고, 방법이 기관으로부터 선암(adenocarcinoma) 또는 암종(carcinoma)을 분리하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 결장으로부터 점막 및 점막하를 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관이 결장이고, 방법이 결장으로부터 폴립(polyp) 또는 암종을 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 쿠션에서 내시경 절제술을 수행하여 분리된 점막 및 점막하를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 절제술이 내시경 점막 절제술(endoscopic mucosal resection) 또는 내시경 점막하 박리술(endoscopic submucosal dissection)인 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 방법은 쿠션을 분할하는 것은 하이드로겔이 기관의 하부 고유근에 유지되고 점막 및 점막하가 기관 부위에서 제거되는 것을 포함하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관이 위장관(gastrointestinal tract)에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관이 십이지장, 위, 소장, 결장 또는 직장으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
세포외 기질(ECM) 하이드로겔을 포함하는 조성물로서, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위해 다음과 같은 특징을 갖는 세포외 기질(ECM) 하이드로겔:
a) 약 37 °C에서 10 분 미만의 50 % 겔화 시간;
b) 기관으로의 주입에 충분한 유동 점도; 및
c) 약 10 내지 약 300 Pascal (Pa)의 경도.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항 또는 제27항의 조성물에 있어서, 상기 절개 방법이 내시경 점막 절제술 또는 내시경 점막하 박리술를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.