KR20210018955A - 특정 탈수초화 및 수초형성부전-기초 장애를 치료하고/하거나 재수초화를 촉진하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈수초화(demyelination) 및/또는 수초형성부전(dysmyelination)의 치료, 뉴런의 재수초화(remyelination)의 촉진 및/또는 수초 관련 질환의 발생의 예방을 필요로 하는 대상자에게 (치료 또는 예방) 유효량의 원소 금 결정 나노현탁액을 투여함으로써 탈수초화 및/또는 수초형성부전을 치료하고/하거나, 뉴런의 재수초화를 촉진하고/하거나 수초 관련 질환의 발생을 예방하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

특정 탈수초화 및 수초형성부전-기초 장애를 치료하고/하거나 재수초화를 촉진하는 방법{METHODS AND TREATMENT FOR CERTAIN DEMYELINATION AND DYSMYELINATION-BASED DISORDERS AND/OR PROMOTING REMYELINATION}

본 발명은 뉴런의 수초형성부전(dysmyelination) 및/또는 탈수초화(demyelination)의 원인의 치료 및/또는 수초 및 축삭 관련 질환의 발생의 예방 및/또는 재수초화(remyelination)의 촉진을 필요로 하는 대상자에게 (치료 또는 예방) 유효량 및 농도의 원소 금 나노현탁액, 바람직한 실시양태에서 본원에 개시된 표면-청정 금-기제 나노결정 현탁액을 투여함으로써 뉴런의 수초형성부전 및/또는 탈수초화의 원인을 치료하고/하거나, 수초 및 축삭 관련 질환의 발생을 예방하고/하거나 재수초화를 촉진하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

탈수초화 질환은 뉴런의 수초가 손상되는 중추신경계("CNS") 및/또는 말초신경계("PNS")의 임의의 질환이다. 수초에의 손상은 전형적으로 영향받은 신경에서 신호의 전도에 불리한 영향을 미치고/미치거나 기저 뉴런(들)의 일부 유형의 비정상적인 또는 열등한 성능을 초래한다. 관련된 수초 손상은 뉴런/수초가 손상되었는지 아니면 정상적이지 않은지에 따라 감각, 인지, 운동 기술 및 다른 기능 중 어느 하나 또는 전부의 결핍을 초래한다.

탈수초화 및 수초형성부전의 정확한 기작은 명확히 이해되어 있지 않다. 수초는 중추신경계 및 말초신경계 각각에서 뉴런에 대한 중추적인 단백질-기제 덮개인 것으로 공지되어 있다. 이 중추적인 단백질은 전형적으로 포유동물에서 많은 뉴런 주변에서 "수초"로서 지칭되는 외피를 생성한다. 건강한 수초는 전기 전위가 신경 축삭에 의해 빠르게 전달되게 하기 때문에 건강하고 결함이 없는 수초는 신경 신호가 빠르고 완전하게 할 것이고/것이거나; 예를 들면, 영양 및 대사 지지체의 상실을 포함하는, 기저 뉴런의 건강한 구조 및/또는 기능을 촉진한다. 수초가 축삭으로부터 부분적으로 또는 완전히 제거될 때(예를 들면, 탈수초화), 신호의 실제 전위 속도는 그의 정상적인 수초화된 속도보다 >>30배까지 느릴 수 있다.

추가로, 수초는 원형질막으로서도 공지된 신경아교세포(예를 들면, 중추신경계의 희소돌기아교세포 및 말초신경계의 슈반(Schwann) 세포)의 세포막(plasmalemmal)으로서 공지된 것에 의해 형성된다. 수초는 수초화의 활성기 동안 상대적으로 빠른 속도로 생성된다. 구체적으로, 중추신경계의 희소돌기아교세포는 정상적인 건강한 작용 동안 천연 "재수초화"를 유발하기에 충분한 수초를 생성할 필요가 있다. 따라서, 새로 합성된 수초는 정기적으로 생성되는 것이 중요하다.

재수초화는 성인 CNS에서 벗겨진 축삭 주변에서의 새로운 수초의 생성을 포함한다. 재수초화의 즉각적인 결과는 란비어(Ranvier) 결절에서의 이온 채널의 적절한 재분포뿐만 아니라 도약 전도의 복구도 포함한다. 따라서, 재수초화는 감소된 축삭 미토콘드리아 함량에 의해 관찰될 수 있는 증가된 에너지 요구를 부분적으로 해결한다. 추가로, 재수초화는 탈수초화에 의해 야기된 기능 결손을 회복시킨다. 증거는 탈수초화된 축삭이 재수초화될 때 후속 손상으로부터 더 잘 보호된다는 것도 암시한다. 이러한 재수초화는 희소돌기아교세포와 축삭 사이의 적절한 성장인자 신호전달을 회복시킬 수 있다. 축삭과 희소돌기아교세포 사이의 공생 관계가 활발하고 수초의 역할이 단순히 전기 절연 하나가 아니라는 증거도 있다. 구체적으로, 임의의 관찰가능한 탈수초화의 부재 하에서조차도 희소돌기아교세포 세포체가 절제를 위해 표적화될 때 축삭은 광범위하게 손상될 수 있다. 이러한 과정은 수초형성부전 또는 기능장애를 초래할 수 있다.

탈수초화 또는 수초형성부전은 많은 수의 중추신경계 및 말초신경계의 후천성 장애 및 유전 질환 둘다와 관련되어 있다.

인간 질환의 원인이 되거나 인간 질환과 관련된 기작들/결과들 중 적어도 일부와 상호관련되어 있거나 유사한 결과를 동물에서 수득하기 위해 질환 세트를 생성하는 실험 시스템들은 잘 공지되어 있다. 이 시스템들 중 하나는 쿠프리존(Cuprizone) 동물 모델로서 공지되어 있다¹⁵. 이 "독성 탈수초화 모델"은 미토콘드리아 형태의 변경을 초래하고, 이 구리-킬레이트화 화합물의 신경독성 성질은 세포 호흡의 장애에 기인한다⁹. 쿠프리존에 의해 유도된 탈수초화는 수초에 대한 직접적인 공격보다는 오히려 지지 희소돌기아교세포의 변성으로부터 발생된다^10,11,12.

더욱이, MS 병변에서 희소돌기아교세포 사멸의 원인이 되는 기작이 명확하지 않다. 유사한 발병기작이 다발성 경화증("MS") 병변 및 쿠프리존 모델에서 희소돌기아교세포 상실의 원인이 되는지가 의심스럽다⁹. MS는 현재 많은 상이한 양상 및 특징을 갖는 장애로서 간주된다. 당업자들은 쿠프리존에 의해 유도된 탈수초화가 인간 MS 환자에서 수초의 상실을 모델링하는지에 대해 의문을 제기한다⁹. MS의 구체적인 발병기전은 공지되어 있지 않은 상태로 남아있다.

추가로, 독성 탈수초화 모델, 예컨대, 쿠프리존 동물 모델과 관련될 수 있는 탈수초화를 포함하는 장애 및 질환은 진행성 핵상마비, 알렉산더병(Alexander's Disease), 크라베병(Krabbe Disease), 이염성 백질이영양증, 칸반병(Canvan Disease), 백질이영양증, 뇌척수염, 중심성 뇌교 수초용해증(CPM), 항-MAG 질환, 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher Disease), 레프숨병(Refsum Disease), 코케인(Cockayne) 증후군, 젤베거(Zellweger) 증후군, 귈랭-바레(Guillain-Barre) 증후군(GBS), 반 데르 크나프(Van der Knapp) 증후군, 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 다초점 운동 신경병증(MMN), 시신경 척수염(NMO), 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 왈러(Wallerian) 변성 및 일부 유전 질환, 예컨대, 부신백질이영양증, 알렉산더병, 연령 관련 인지 감퇴로서도 공지된 경미한 인지 손상(MCI) 및 펠리체우스 메르츠바허병(PMZ)을 포함한다. 상기 언급된 이들 장애들 중 대다수 장애들의 경우, 존재하더라도 치유가 거의 내지 전혀 존재하지 않고 효과적인 요법이 거의 존재하지 않는다.

시신경 척수염(NMO)은 종종 데빅병(Devic's disease)으로서도 지칭된다. NMO는 환자의 시신경 및 척수에 주로 영향을 미치는 중추신경계(CNS)의 장애이다. NMO는 아시아에서 주요 신경면역학적 질환들 중 하나이다.

마우스 뇌 내의 혈액-뇌 장벽에서 또는 이 장벽 근처에서 결합하는 NMO-면역글로불린 G(IgG)는 NMO 환자의 혈청에서 발견되었다. NMO-IgG의 에피토프는 혈액-뇌 장벽에서 성상세포 세포발(foot processes)에서 조밀하게 발현된 물 채널인 아쿠아포린(aquaporin)-4(AQP4)로서 확인되었다.

NMO는 종종 동시에 발생하고 종종 순차적으로 발생하는, 주로 세로 확장 횡단 척수염(LETM)으로서 관찰되는 중증 시신경염 및 척수염의 발생을 특징으로 한다. 대다수의 NMO 환자들은 그들의 혈청에서 AQP4에 대한 자가항체를 갖는다. 따라서, NMO 진단 기준은 시신경염 및 척수염 둘다의 존재, 및 3개의 지지 기준들 중 2개 이상의 기준의 충족을 요구한다: 3개 이상의 척추 박편들에 걸쳐 확장되어 있는 연속 척수 병변의 MRI 증거; 발병 시 수행된 뇌 MRI34 상에서의 MS에 대한 진단 기준에 대한 음성 결과; 및 NMO-IgG(또는 항-AQP4 항체) 혈청양성.

따라서, NMO는 현재 항-AQP4 항체 매개 성상세포병증으로서 간주되고, 탈수초화 장애, 예컨대, MS와 상이하다. 그러나, NMO를 갖는 포유동물은 탈수초화 또는 수초형성부전의 병리학적 결과를 분명히 보여준다.

PNS 및 CNS에서 재생의 비교

역사적으로, 신경 재생은 CNS보다 PNS에서 훨씬 더 효과적이라고 생각되어 왔다. 연구자들은 한때 CNS 뉴런이 단순히 보다 낮은 고유 재생 능력을 갖는다고 생각했지만, 이 패러다임은 CNS 뉴런이 말초 신경 이식을 통해 성장할 수 있었다는 발견에 의해 반박되었다. 이들 2개의 신경계들의 비교는 CNS의 억제 환경이 CNS 축삭의 재생을 위한 가장 큰 도전과제라는 것을 확립하였고, PNS에서 성장을 촉구하거나 CNS에서 성장을 억제하는 여러 인자들의 발견을 이끌어내었다. 예를 들면, 희소돌기아교세포 수초 및 슈반 세포 수초 둘다가 억제 분자를 함유한다. CNS에서, 축삭 과다성장도 반응성 성상세포 및 미세아교세포로 구성된 신경아교 흉터에 의해 손상 부위에서 차단된다. 대조적으로, 신경아교 흉터는 PNS에서 형성되지 않고, 슈반 세포에 의해 형성된 번그너(Bungner) 밴드는 실제로 축삭 유도 및 재생을 보조한다. CNS 및 PNS 재생에서의 이들 중요한 차이점들의 이해는 비-허용 환경, 즉 CNS 및 만성적으로 신경 제거된 PNS에서 재생을 개선하기 위한 전략을 구체화하는 것을 보조할 수 있다.

탈수초화 또는 수초형성부전을 중단하거나 지연시키고/시키거나, 재수초화를 촉진하고/하거나 수초 및/또는 축삭 기능을 회복시키는 것을 보조하는 물질 및/또는 치료에 대한 상당한 필요성이 남아있다.

정의

본 명세서 및 특허청구범위 전체에서, 용어 "포함한다" 또는 이의 어미변화, 예컨대, "포함하고" 또는 "포함하는"은 임의의 언급된 정수 또는 정수 군의 포함을 표시하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 군의 배제를 표시하지는 않는다. 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 한정되지 않고, 언급되지 않은 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 어구 "본질적으로 구성된"은 특정된 물질 또는 단계의 포함뿐만 아니라 청구된 발명의 기본 특성 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계의 포함도 표시한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구성된"은 표시된 물질 또는 방법 단계만을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료 유효량"은 필요한 기간 및/또는 투약 기간 동안 원하는 치료 결과를 달성하기에 효과적인 금 나노결정의 양 또는 농도 및 현탁액의 부피를 지칭한다. 원하는 치료 결과는 증상의 완화, 연장된 생존, 개선된 운동성 또는 기능, 재발의 감소된 중증도, 관해의 연장된 기간 등을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. "치료 유효량"은 원하는 치료 결과들 중 어느 하나 또는 다수의 원하는 치료 결과들의 임의의 조합을 달성할 수 있다. 치료 결과는 "치유"일 필요가 없다. 치료 결과는 수초 손상의 양에서의 측정된 차이, 수초 탈수초화의 감소 및/또는 재수초화의 증가도 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "예방 유효량"은 필요한 기간 및/또는 투약 기간 동안 원하는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 금 나노결정의 양 또는 농도 및 현탁액의 부피를 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량이 질환 전에 또는 질환의 초기에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 더 낮을 수 있다. 예방 결과는 수초 손상의 양에서의 측정된 차이, 수초 탈수초화의 감소 및/또는 재수초화의 증가도 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 증상을 완화시키거나 경감시키기 위해 원소 금-기제 나노현탁액, 바람직한 실시양태에서 본원에서 "CNM-Au8"로서 언급된 신규 금-기제 나노결정 현탁액을 포유동물에게 투여하는 것을 지칭한다. 추가로, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 진행을 예방하기 위해 상기 언급된 금-기제 나노현탁액을 포유동물에게 투여하는 것을 지칭한다. 질환의 진행의 예방은 수초 손상의 양에서의 측정된 차이, 수초 탈수초화의 감소 및/또는 재수초화의 증가도 포함한다.

"대상자", "개체", "동물", "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 치료 및/또는 예방이 요구되는 임의의 대상자, 특히 포유동물 대상자를 의미한다. 포유동물 대상자는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소; 영장류, 예컨대, 유인원, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지; 갯과 동물, 예컨대, 개 및 늑대; 고양잇과 동물, 예컨대, 고양이, 사자 및 호랑이; 말과 동물, 예컨대, 말, 당나귀 및 얼룩말; 식품 동물, 예컨대, 소, 돼지 및 양; 유제류, 예컨대, 사슴 및 기린; 설치류, 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간 대상자가다.

발명의 요약

바람직한 실시양태에서, 신규 금 나노결정은 고순도 물에 현탁되고, 상기 금 나노결정은 유기 또는 다른 불순물 또는 필름을 (본원에 정의된 바와 같이) 실질적으로 갖지 않는 나노결정성 표면을 갖지만 물에 안정적으로 현탁된 상태를 유지한다.

구체적으로, 표면은 용액에서 금 이온으로부터 금 나노입자를 성장시키기 위해 화학적 환원제 및/또는 계면활성제를 요구하는 화학적 환원 공정을 이용하여 제조한 표면에 비해 "깨끗"하다. 성장된 금 나노결정들 중 대다수의 금 나노결정들은 독특하고 확인가능한 표면 특성, 예컨대, 공간적으로 확장된 낮은 지수 결정 평면{111}, {110} 및/또는 {100}, 및 이러한 평면의 군(및 이들의 등가물)을 갖는다. 생성된 금 나노결정 현탁액 또는 콜로이드는 바람직한 pH 범위, 예컨대, 4.0 내지 9.5, 더 전형적으로 5.0 내지 9.5의 pH 범위, 및 관심있는 pH 범위에 대한 -20 mV 이상, 더 전형적으로 -40 mV 이상, 훨씬 더 전형적으로 -50 mV 이상의 제타 전위 값을 갖는다.

후술된 제조 공정에 따라 제조된 이들 금 나노결정들의 형태 및 형태 분포는 삼각형(예를 들면, 사면체), 오각형(예를 들면, 오방 양뿔 또는 십면체), 육각형(예를 들면, 육방 양뿔, 이십면체, 팔면체), 마름모(예를 들면, 팔면체, 다양한 연장된 양뿔, 융합된 사면체, 양뿔의 측면관) 및 "기타"를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 언급된 공간적으로 확장된 낮은 지수 결정 평면(상기 언급된 형태를 형성함)을 함유하고 "깨끗한" 표면을 갖는 나노결정의 형태 분포(들)는 독특하다.

100 nm 미만의 임의의 원하는 평균 크기의 금 나노결정이 제공될 수 있다. 가장 바람직한 금 나노결정 크기 범위는 주로 100 nm 미만, 더 전형적으로 50 nm 미만, 훨씬 더 전형적으로 30 nm 미만인 평균 결정 크기 또는 "모드"(본원에 상세히 개시된 특정 기법에 의해 측정되고 결정되며 "TEM 평균 직경"으로서 보고됨)를 갖는 크기 범위를 포함하고, 본원에 개시된 바람직한 실시양태들 중 많은 실시양태들에서 나노결정 크기 분포에 대한 모드는 21 nm 미만이고 8 내지 18 nm의 훨씬 더 바람직한 범위 내에 있다.

임의의 농도의 금 나노입자(들)가 치료 유효량 또는 예방 유효량을 달성하기 위해 본 발명에 따라 제공될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 물에 안정하게 현탁된 이 독특한 깨끗한 표면의 금 나노결정을 제조하는 신규 공정이 제공된다. 이 공정은 물에서 금 나노결정을 성장시키는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 물은 형성된 나노결정에 유의하게 결합하지 않으나 오히려 전기화학적으로 자극된 성장 공정 동안 핵형성(nucleation)/결정 성장을 용이하게 하는 첨가된 "공정 향상제(enhancer)"를 함유한다. 공정 향상제는 전기화학적 용액 중의 하전된 이온을 제공하여 결정이 성장되게 하는 단계를 포함하는 공정에서 중요한 역할을 수행한다. 이 신규 전기화학적 공정은 회분식, 반연속식 또는 연속식 공정으로 일어날 수 있다. 이 공정은 금 나노결정 농도를 조절하고, 나노결정 크기를 조절하고 나노결정 크기 범위를 조절할뿐만 아니라, 나노결정 형태를 조절하고 나노결정 형태 분포도 조절한다. 이 금 나노결정을 제조하는 신규 제조 조립체가 제공된다. 신규 접선 유동 여과("TFF") 기법을 이용하여 최대 3,000 ppm(즉, 3,000 ㎍/㎖)의 농도에서 보다 높은 금 ppm 및 안정성(즉, 관심있는 pH 범위에 대한 -20 mV 이상, 더 전형적으로 -40 mV 이상, 훨씬 더 전형적으로 -50 mV 이상의 제타 전위 값을 갖는 현탁액)을 수득한다.

본원에 더 기재된 바와 같이 경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 협측, 흡입, 에어로졸, 추진제 또는 다른 적절한 액체 등을 포함하는, 전신 사용에 적합한 약학 조성물이 제공된다.

본원에 기재된 의학적/병리학적 질환들 중 임의의 질환을 치료하거나, 완화시키거나 예방하기 위한 치료 유효량 또는 예방 유효량의 금 나노결정을 포함하는 약학 조성물도 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 금 나노결정은 농축될 수 있거나 재구성될 수 있지만 바람직하게는 금 나노결정의 표면이 완전히 건조되거나 그의 본래의 제조 상태로부터 달리 변경된 표면을 갖는 정도까지 건조되지 않는 경구 전달 액체로 투여되고, 이때 금 나노결정은 제조용수에 남아있다.

약품에서의 목적은 효능을 달성하기 위해 필요한 최소 용량을 확립하여 독성 또는 합병증에 대한 잠재력을 최소화하는 것임을 인식하는 것이 중요하다. 유의하게 더 큰 효능을 갖는 새로 경구 투여된 제품은 종래 제품의 용량 수준 미만의 용량 수준에서 효능을 달성할 수 있고/있거나 동등한 용량 수준에서 실질적으로 더 큰 효능을 달성할 수 있다. 임상 시험은 예를 들면, 치료 유효량을 확인하기 위해 요구된다. 그러나, 임상 효과까지의 적정은 예를 들면, 농도, 부피, 시간 및/또는 투약 빈도를 변경시킴으로써 달성될 수 있다.

본원에 더 기재된 바와 같이 경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 협측, 흡입, 에어로졸, 추진제 또는 다른 적절한 액체 등을 포함하는, 전신 사용에 적합한 약학 조성물이 제공된다.

적합한 용량 및 투약 요법은 주치의 또는 수의사에 의해 결정될 수 있고, 활성을 억제하고/하거나 변형시키는 원하는 수준, 치료되는 구체적인 질환, 질환의 중증도, 용량이 치료 유효량인지 아니면 예방 유효량인지 여부뿐만 아니라 대상자의 일반적인 연령, 건강 및 체중에도 의존할 수 있다.

수성 매질에 함유된 금 나노결정은 단회 용량 또는 일련의 용량으로 투여될 수 있다. 금속-기제 나노결정을 함유하는 수성 매질을 예를 들면, 콜로이드 형태로 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, 다른 조성물 및/또는 요법과 함께 활성 성분 혼합물을 포함시키는 것도 허용될 수 있다. 추가로, 다양한 약학 조성물이 활성 성분(들)/현탁액(들)/콜로이드(들)에 첨가될 수 있다.

따라서, 바람직한 실시양태에서, (예를 들면, 수성 금-기제 금속을 포함하는) 본 발명의 금 나노결정 현탁액 또는 콜로이드는 제2 치료제와 함께 투여될 수 있다. 제2 치료제는 글루코코르티코이드를 포함할 수 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명에 따른 금 나노결정 현탁액은 전형적으로 물 중의 안정한 용액, 콜로이드 또는 부분적으로 안정한 현탁액으로서 제공된다. 그러나, 이러한 금 나노결정은 예를 들면, 예정된 양의 금 나노결정 활성 성분을 각각 함유하는 별개의 유닛, 예컨대, 액체 캡슐, 사세(sachet) 또는 심지어 정제(예를 들면, 활성 성분 금-기제 나노결정을 생성하기 위한 현탁액 또는 콜로이드의 건조(단, 이러한 프로세싱이 본래의 금 나노결정 표면의 기능성에 불리한 영향을 미치지 않음))로서; 산제 또는 과립제로서; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액, 콜로이드 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 비-수성 액체에 포함될 수도 있다. 금 나노결정 활성 성분은 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트(paste)로 조합될 수도 있다. 상이한 원소 금 나노현탁액들이 본원에서 논의된 치료를 위한 물질로서 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

구강 내로의 경구 투여에 적합한 조성물은 방향 기제, 예컨대, 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸쓰 검 중에 하나 이상의 활성 성분(들) 금 나노결정을 함유하는 현탁액 또는 콜로이드를 포함하는 로젠지; 불활성 기제, 예컨대, 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 검 중에 금 나노결정 활성 성분을 포함하는 향정(pastilles); 및 적합한 액체 담체 중에 금 나노결정 활성 성분을 포함하는 구강세척제를 포함한다.

금 나노결정 현탁액 또는 콜로이드는 예를 들면, 용액 또는 콜로이드 중의 하나 이상의 성분(예를 들면, 금 나노결정)이 예를 들면, 운무 또는 분무 내에 함유되게 하는 분사기, 에어로졸 또는 분무기 수단에 의해 코내로 또는 흡입을 통해 투여될 수도 있다.

직장 투여용 조성물은 예를 들면, 코코아 버터, 젤라틴, 글리세린 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 적합한 담체 기제를 갖는 좌제로서 제공될 수 있다.

질 투여에 적합한 조성물은 활성 성분 이외에 당분야에서 적합한 담체로서 공지된 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체(foam) 또는 분무 제제로서 제공될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은 항산화제, 완충제, 살균제, 및 조성물이 의도된 수용자의 혈액에 대한 등장성을 갖게 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 등장성 멸균 주사 현탁액 또는 콜로이드; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 조성물은 유닛 용량 또는 멀티 용량 밀봉 용기, 예를 들면, 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들면, 주사용수의 첨가만을 요구하는 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액, 콜로이드 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균 산제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다.

바람직한 유닛 용량 조성물은 본원에 전술된 바와 같이 활성 성분의 1일 용량 또는 유닛, 1일 하위용량(sub-dose) 또는 이의 적절한 분획을 함유하는 조성물이다.

본 발명의 조성물은 상기 구체적으로 언급된 금 나노결정 활성 성분 이외에 해당 조성물의 유형을 고려할 때 당분야에서 통상적인 다른 물질을 포함할 수 있다는 것을 이해해야 하고, 예를 들면, 경구 투여에 적합한 물질은 결합제, 감미제, 증점제, 풍미제, 붕해제, 코팅제, 보존제, 활택제, 시간 지연제 및/또는 위치 방출제와 같은 추가 물질을 포함할 수 있다. 적합한 감미제는 수크로스, 락토스, 글루코스, 아스파르탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕해제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 잔탄 검, 벤토나이트, 알긴산 또는 한천을 포함한다. 적합한 풍미제는 페퍼민트 오일, 노루발풀의 오일, 체리, 오렌지 또는 라즈베리 풍미제를 포함한다. 적합한 코팅제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 이들의 에스테르의 중합체 또는 공중합체, 왁스, 지방 알코올, 제인(zein), 쉘락(shellac) 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 보존제는 벤조산나트륨, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 중아황산나트륨을 포함한다. 적합한 활택제는 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 올레산나트륨, 염화나트륨 또는 탈크를 포함한다. 적합한 시간 지연제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.

이 원소 금 나노현탁액, 및 바람직한 실시양태에서 고순도 물에 현탁된 실질적으로 표면-청정 또는 표면-순수 금 나노결정은 상기 본 발명의 배경기술에서 제공된 임의의 장애를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 추가로, 어구 "원소 금 나노현탁액" 또는 "원소 금 결정 나노현탁액" 등은 본원에 명확히 개시된 CNM-Au8 나노현탁액을 의미하는 것으로서 이해되어야 하지만, 나노입자 크기, 농도(들), pH 등을 포함하는 일반적인 물성이 본원에 상세히 개시된 CNM-Au8 나노현탁액의 물성과 동일한 범위 내에 있는 한, 완전히 상이한 기법에 의해 제조된 다른 원소 금 나노현탁액(비록 이러한 나노현탁액이 그와 관련된 일부 결점을 가질지라도)도 포함하는 것으로서 이해되어야 한다.

도 1은 1개의 플라스마(4a)가 생성되는 제1 트로프(trough) 부재(30a')를 보여준다. 이 제1 트로프 부재(30a')의 유출물은 제2 트로프 부재(30b') 내로 유동한다.
도 2a 내지 2c는 트로프 부재(30b')의 대안적 디자인을 보여주는데, 이때 트로프 부재 위치(30a' 및 30b')는 인접한다.
도 3은 본원의 도 2a 내지 2c 및 실시예 1과 관련하여 사용된 트로프 부재(30b')를 보여준다.
도 4a 및 4b는 2개의 트로프 부재들(30)의 횡단면도를 보여준다.
도 5a는 실시예 1에서 논의된 나노결정 현탁액을 제조하는 데에 사용된 플라스마(4)의 제조에 사용될 AC 변압기 전기 배선 도면을 보여준다. 도 5b는 변압기(60)의 개략도를 보여주고, 도 5c 및 5d는 같은 위상(in phase) 및 다른 위상(out of phase)의 2개의 사인파(sine waves)의 개략도를 보여준다.
도 6은 전극(1)에 대한 형상 중 하나의 대표적인 실시양태를 보여준다.
도 7은 본원의 실시예 1에서 사용된 금 와이어(5a 및 5b)를 보여준다.
도 8은 실시예 1에서 논의된 금 나노결정 현탁액을 생성하는 데에 사용된 전력 공급 전기 셋업의 개략도이다.
도 9는 트로프 부재(30) 상에 위치하는 제어 장치(20) 세트의 개략적인 횡단면도를 보여주는데, 이때 액체(3)는 상기 트로프 부재를 관통하여 저장 용기(41) 내로 유동한다.
도 10a는 실시예 1과 관련하여 형성된 건조된 금 나노결정의 대표적인 TEM 현미경사진을 보여준다.
도 10b는 실시예 1과 관련하여 형성된 건조된 금 나노결정에 대한 TEM 측정으로부터의 입자 크기 분포 막대그래프를 보여준다.
도 10c는 실시예 1에 따라 제조된 금 현탁액의 UV-가시광선 스펙트럼 패턴을 보여준다.
도 11은 금 나노현탁액을 농축하는 데에 사용된 TFF 장치의 개략도이다.
도 12는 실시예 2에서 논의된 두정 뇌 박편을 제조하는 데에 사용된 장치 및 공정의 투시도를 보여준다.
도 13은 실시예 2의 마우스 군 1 내지 4에서 존재하는 수초 염색의 상대적인 양을 보여주는 막대 차트이다.
도 14a 내지 14d는 각각 실시예 2로부터의 마우스 군 1 내지 4 각각으로부터의 단일 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분들의 TEM 영상을 보여준다.
도 15는 각각 실시예 2로부터의 군 1 내지 4 각각으로부터의 1마리 마우스로부터의 각각의 뇌들보 TEM 영상 세트에서 약 100개의 축삭을 관찰하는 것으로부터 측정된/보정된 G-비의 막대 차트를 보여준다.
도 16은 각각 실시예 2로부터의 군 1 내지 4 각각으로부터의 1마리 마우스로부터의 G-비 계산과 관련된 데이터 분산 패턴을 보여준다.
도 17a 내지 17d는 각각 실시예 2로부터의 마우스 군 1 내지 4 각각으로부터의 1마리 마우스에 대해 생성된 종(bell) 형태의 곡선과 비교된 실제 G-비 데이터의 막대그래프를 보여준다.
도 18은 연구 전체에서 실시예 2로부터의 마우스 군 1 내지 4 각각에 의해 소비된 평균 액체 양에 상응하는 일련의 선을 보여준다.
도 19는 연구 전체에서 측정된, 실시예 2로부터의 마우스 군 1 내지 4 각각의 평균 체중에 상응하는 일련의 선을 보여준다.
도 20a 내지 20f는 실시예 3에서 논의된 샘플 제조 기법에 따라 처리된 뇌의 부분의 여러 개략도를 보여준다.
도 21a 및 21b는 실시예 3에서 논의된 TEM 영상을 위한 얇은 박편을 수득하기 위해 사용된 뇌 슬라이스를 붙잡고 절단하기 위한 장치를 보여준다.
도 22는 실시예 3에서 논의된 바와 같이, 8주령에서 시작하는, 군 1 내지 7 내의 각각의 마우스의 평균 체중 획득에 상응하는 일련의 선을 보여준다.
도 23a 내지 23c는 실시예 3의 군 1로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다.
도 24a 내지 24e는 실시예 3의 군 2로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다.
도 25a 내지 25g는 실시예 3의 군 3으로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다.
도 26a 내지 26e는 실시예 3의 군 4로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201)로 표시되어 있다.
도 27a 내지 27d는 실시예 3의 군 5로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201)로 표시되어 있다.
도 28a 내지 28g는 실시예 3의 군 6으로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201)로 표시되어 있다.
도 29a 내지 29d는 실시예 3의 군 7로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분의 TEM 영상(처음에 4,000배에서 촬영됨)에 상응한다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201)로 표시되어 있다.
도 30a 내지 30c는 실시예 3의 군 1로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 도 30a에서 흑색 상자 및 화살표(202S)(및 도 30b 및 30c에서 단지 화살표(202))로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 31a 및 31b는 실시예 3의 군 2로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 화살표(202)로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 32a 및 32b는 실시예 3의 군 3으로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 화살표(202)로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 33a 및 33b는 실시예 3의 군 4로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 화살표(202)로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 34a 및 34b는 실시예 3의 군 5로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 화살표(202)로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 35a 및 35b는 실시예 3의 군 6으로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 화살표(202)로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 36a 및 36b는 실시예 3의 군 7로부터의 마우스에 대한 뇌들보의 대표적인 부분을 보여주는 대표적인 TEM 영상(처음에 약 16,000배에서 촬영됨)을 보여주는데, 이때 축삭은 별모양(203)으로 표시된 기준 축삭에 비해 화살표(202)로 손상된 축삭, 탈수초화된 축삭 및/또는 수초형성부전 축삭으로서 표시되어 있다.
도 37a 내지 37k는 군 4의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 영상(처음에 16,000배 또는 40,000배에서 촬영됨)을 보여준다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201M)로 표시되어 있다.
도 38a 내지 38l은 군 5의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 영상(처음에 16,000배 또는 40,000배에서 촬영됨)을 보여준다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201M)로 표시되어 있다.
도 39a 내지 39j는 군 6의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 영상(처음에 16,000배 또는 40,000배에서 촬영됨)을 보여준다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201M)로 표시되어 있다.
도 40a 내지 40g는 군 7의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 영상(처음에 16,000배 또는 40,000배에서 촬영됨)을 보여준다. 관찰된 재수초화의 영역은 화살표(201M)로 표시되어 있다.
도 41a 내지 41c는 실시예 3의 군 1의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레(204I) 및 외부 둘레(204O)가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 42a 내지 42d는 실시예 3의 군 2의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레(204I) 및 외부 둘레(204O)가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 43a 내지 43c는 실시예 3의 군 3의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 44a 및 44b는 실시예 3의 군 4의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 45a 내지 45c는 실시예 3의 군 5의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 46a 및 46b는 실시예 3의 군 6의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 47a 내지 47e는 실시예 3의 군 7의 마우스의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있다는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.
도 48a, 48b 및 48c는 각각 군 1(양성 대조군), 군 2(2주 음성 대조군) 및 군 3(5주 음성 대조군)의 마우스들에 상응하는, G-비 데이터를 보고하는 변형된 막대 차트 막대그래프를 함유한다. 이들 3개의 변형된 막대 차트 막대그래프들은 비교 목적으로 함께 배치되어 있다.
도 49a, 49b 및 49c는 각각 군 3(5주 음성 대조군), 군 5 및 군 7의 마우스들에 상응하는, G-비 데이터를 보고하는 변형된 막대 차트 막대그래프를 함유한다. 이들 3개의 변형된 막대 차트 막대그래프들은 비교 목적으로 함께 배치되어 있다.
도 50a, 50b 및 50c도 각각 군 3(5주 음성 대조군), 군 4 및 군 6의 마우스들에 상응하는, G-비 데이터를 보고하는 변형된 막대 차트 막대그래프를 함유한다. 이들 3개의 변형된 막대 차트 막대그래프들은 비교 목적으로 함께 배치되어 있다.
도 51은 군 1 내지 7 전부에 대한 마우스들에 상응하는, G-비 데이터를 보고하는 변형된 막대 차트 막대그래프를 함유한다.

금(CNM-Au8) 나노현탁액의 제조

바람직한 실시양태에서, 원소 금 나노결정은 고순도 물에 현탁되고, 상기 금 나노결정은 유기 또는 다른 불순물 또는 필름을 (본원에 정의된 바와 같이) 실질적으로 갖지 않는 나노결정성 표면을 갖는다. 구체적으로, 상기 표면은 용액에서 금 이온으로부터 금 나노입자를 형성하기 위해 화학적 환원제 및/또는 계면활성제를 요구하는 화학적 환원 공정을 이용하여 제조한 표면에 비해 "깨끗"하다. 바람직한 금 나노결정은 본원에 상세히 기재된 신규 제조 절차를 통해 생성된다. 상기 제조 절차는 전형적으로 입자 내에서 또는 상에서 함께 운반되거나 화학적으로 환원된 입자의 표면 상에 코팅되어 있는 첨가된 화학적 환원제 및/또는 계면활성제(예를 들면, 유기 화합물) 또는 다른 물질; 또는 그 자체가 입자에 영향을 미치는 바람직하지 않은 공정을 이용함으로써 후속적으로 스트립핑되거나 제거되는 환원제의 종래 사용을 피한다.

바람직한 실시양태에서, 공정은 형성된 나노결정에 유의하게 결합하지 않으나 오히려 전기화학적으로 자극된 성장 공정 동안 핵형성/성장을 용이하게 하는 "공정 향상제" 또는 "프로세싱 향상제"(전형적으로 무기 물질 또는 탄산염 등)를 함유하는 물에서 원소 금 나노결정의 핵형성 및 성장을 수행하는 단계를 포함한다. 공정 향상제는 결정이 성장되도록 전기화학적 용액 중의 하전된 이온을 제공하는 단계를 포함하는 공정에서 중요한 역할을 수행한다. 공정 향상제는 엄밀하게는 용액에 남아있고/있거나, 코팅(예를 들면, 유기 코팅)을 형성하지 않고/않거나, 형성된 나노결정 또는 형성된 현탁액(들)에 불리한 영향을 미치지 않고/않거나, 전기화학적 공정 동안 파괴되거나, 증발되거나 다른 방식으로 상실되지 않는 화합물(들)이다. 바람직한 공정 향상제는 중탄산나트륨이다. 다른 공정 향상제의 예는 탄산나트륨, 중탄산칼륨, 탄산칼륨, 인산삼나트륨, 인산이나트륨, 인산일나트륨, 인산칼륨 또는 탄산의 다른 염 등이다. 추가 공정 향상제는 중아황산나트륨 또는 중아황산칼륨, 또는 아황산나트륨 또는 아황산칼륨을 포함하는 염일 수 있다. 금 나노결정이 의학 치료제로서 사용될 수 있게 하는 다른 공정 향상제는 금 나노결정의 표면 내로 또는 상으로 실질적으로 도입되지 않고 바람직하지 않은 독성을 나노결정 또는 나노결정 함유 현탁액 매질에 부여하지 않는, 나트륨 또는 칼륨을 포함하는 다른 염, 또는 본원에 기재된 전기화학적 성장 공정을 보조하는 임의의 물질일 수 있다.

프로세싱 향상제에 대한 바람직한 농도 범위는 전형적으로 0.01 내지 20 g/갤론(0.0026 내지 2.1730 mg/㎖), 더 전형적으로 0.1 내지 7.5 g/갤론(0.0264 내지 1.9813 mg/㎖), 가장 전형적으로 0.5 내지 2.04 g/갤론(0.13210 내지 0.54 mg/㎖)을 포함한다.

성장된 금 나노결정이 (예를 들면, 제로 산화 상태에서) 금 금속의 "텅 빈(bare)" 또는 "깨끗한(clear)" 표면을 갖기 때문에, 상기 표면은 고도 반응성 또는 고도 생체촉매활성(뿐만 아니라 고도 생체이용효율성)을 갖는다. 상기 나노결정은 본질적으로 물 재킷(jacket)에 의해 둘러싸여 있다. 이들 특징들은 예를 들면, 환원 화학 공정으로부터 존재하는 유기 물질을 함유하는 나노입자 표면에 비해 생체내에서 증가된 효능을 제공한다. 또한 또는 대안적으로,"깨끗한" 표면은 코팅된 또는 "피복된(dressed)" 표면을 함유하는 나노입자에 비해 나노결정의 원치 않는 독성을 감소시킬 수 있다. 이들 "깨끗한" 금 나노결정의 증가된 효능은 대상자에서 원하는 치료 유효량 또는 원하는 예방 유효량을 달성하기 위해 필요한 보다 낮은 용량을 통해 증가된 치료 지수를 제공할 수 있다.

대상자에서의 상대적인 독성 및/또는 이익 발생의 상대적인 속도를 포함하는, 대상자의 치료를 위한 신규 나노결정 사용의 다른 중요한 장점들이 있다.

본원의 공정에 따라, 바람직한 금 나노결정은 독특하고 확인가능한 표면 특성, 예컨대, 공간적으로 확장된 낮은 지수 결정 평면{111}, {110} 및/또는 {100}, 및 이러한 평면의 군(및 이들의 등가물)을 제공하는 방식으로 성장될 수 있다. 본원에 기재된 공정에 따라 제조된 금 나노결정의 형태는 삼각형(예를 들면, 사면체), 오각형(예를 들면, 오방 양뿔 또는 십면체), 육각형(예를 들면, 육방 양뿔, 이십면체, 팔면체), 마름모(예를 들면, 팔면체, 다양한 연장된 양뿔, 융합된 사면체, 양뿔의 측면관) 및 "기타"를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 언급된 공간적으로 확장된 낮은 지수 결정 평면을 함유하고 "깨끗한" 표면을 갖는 (즉, 본원에 기재된 다양한 실시양태들에 의해 성장된) 나노결정의 퍼센트는 본 발명의 또 다른 신규 특징이다. 나아가, 나노결정 현탁액에서 형성된 또는 존재하는 사면체 및/또는 오각형 양뿔의 퍼센트도 독특하다.

100 nm 미만의 임의의 원하는 평균 크기의 금 나노결정이 제공될 수 있다. 치료를 위한 가장 바람직한 결정 크기 범위는 주로 100 nm 미만, 더 전형적으로 50 nm 미만, 훨씬 더 전형적으로 30 nm 미만인 평균 결정 크기 또는 "모드"(본원에 상세히 개시된 특정 기법에 의해 측정되고 결정되며 "TEM 평균 직경"으로서 보고됨)를 갖는 크기 범위를 포함하고, 본원에 개시된 바람직한 실시양태들 중 많은 실시양태들에서 나노결정 크기 분포에 대한 모드는 21 nm 미만이고 8 내지 18 nm의 훨씬 더 바람직한 범위 내에 있다.

표적 pH 범위를 갖거나 갖도록 조절되는, 치료를 위한 생성된 금 나노결정 현탁액이 제공될 수 있다. 본원에 상세히 개시된 양으로 예를 들면, 중탄산나트륨 공정 향상제를 사용하여 제조할 때, pH 범위는 전형적으로 8 내지 9이고, 이 범위는 원하는 경우 조절될 수 있다.

형성된 나노입자 또는 나노결정 상에서의 표면 전하(즉, 양성 또는 음성)의 성질 및/또는 양은 나노입자/현탁액 또는 콜로이드의 거동 및/또는 효과에 큰 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 대상자의 생체내에서 형성된 단백질 코로나, 예컨대, 알부민 코로나는 나노입자의 표면 전하 또는 표면 특성에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 표면 전하는 통상적으로 "제타 전위"로서 지칭된다. 제타 전위(양성 또는 음성)가 클수록 용액에서의 나노입자의 안정성이 커진다(즉, 현탁액이 더 안정하다)는 것으로 공지되어 있다. 형성된 나노입자 또는 나노결정의 표면 전하의 성질 및/또는 양을 조절함으로써 이러한 나노입자 현탁액의 성능을 조절할 수 있다.

제타 전위는 콜로이드 시스템에서의 전기-동력학적 전위의 척도로서 공지되어 있고 입자 상에서의 표면 전하로서도 지칭된다. 제타 전위는 유체의 정지 층과 입자가 분산되어 있는 유체 사이에 존재하는 전위 차이이다. 제타 전위는 종종 밀리볼트(즉, mV)로 측정된다. 대략 20 내지 25 mV의 제타 전위 값은 분산된 입자가 분산 매질에서 안정한지 아니면 안정하지 않은지를 확인하기 위해 선택된 임의 값이다. 따라서, 본원에서 "제타 전위"가 언급될 때, 언급된 제타 전위가 이중 층에 존재하는 전기 전하의 크기의 설명 또는 정량이라는 것을 이해해야 한다.

제타 전위는 헨리 방정식에 의해 전기영동 이동성으로부터 계산된다:

상기 식에서,

z는 제타 전위이고, U _E 는 전기영동 이동성이고, ε는 유전 상수이고, η는 점도이고, f(ka)는 헨리 함수이다. 스몰루호프스키(Smoluchowski) 근사법의 경우 f(ka)는 1.5이다.

본원의 방법에 따라 제조된 금 나노결정에 대한 제타 전위("ZP")는 전형적으로 -20 mV 이상, 더 전형적으로 약 -30 mV 이상, 훨씬 더 전형적으로 약 -40 mV 이상, 훨씬 더 전형적으로 약 -50 mV 이상의 ZP를 갖는다.

현탁액은 본원의 실시예 1에서 논의된 TFF 기법을 이용함으로써 보다 높은 ppm 수준(예를 들면, 최대 5,000 ppm, 그러나 더 전형적으로 최대 3,000 ppm)까지 농축될 수 있다.

실시예 1

대상자의 치료를 위해 사용될 금 나노현탁액 "CNM-Au8"의 제조

일반적으로, 실시예 2 및 3에서 치료 목적으로 사용되는 CNM-Au8 나노현탁액은 일반적으로 도 1, 2c 및 3에 표시된 장치와 관련된 본 발명의 일부 실시양태들을 이용함으로써 제조된 순수한 생성물인 농축된 CNM-Au8 "순수" 나노현탁액이다. 상기 도면들에서 모든 트로프 부재들(30a' 및 30b')을 각각 1/8"(약 3 mm) 두께 플렉시글라스(plexiglass) 및 1/4"(약 6 mm) 두께 폴리카보네이트로부터 제조하였다. 지지 구조물(34)(상기 도면들 중 다수의 도면들에서 표시되어 있지 않으나, 도 1에는 표시되어 있음)도 약 ¼" 두께(약 6 내지 7 mm 두께)의 플렉시글라스로부터 제조하였다. 각각의 트로프 부재(30a')는 트로프 부재(30b')와 일체로 존재하였다. 본원에 기재된 트로프 부재(30a')의 횡단면 형태는 도 4b에 표시된 형태에 상응하였다(즉, 사다리꼴 형태의 횡단면이었다). 30a'에 대한 적절한 치수는 약 1.5"(약 3.81 cm)로 측정된 "S,S'", 약 2.5"(약 6.35 cm)로 측정된 "M", 약 3/4"(약 1.9 cm)로 측정된 "R" 및 약 ½"(약 1.3 cm)로 측정된 "d'"이었다.

각각의 트로프 부재 부분(30b')은 도 4a에 상응하는 횡단면 형태를 가졌다. 트로프 부재 부분(30b')에 대한 적절한 치수는 "M"(즉, 트로프 부재(30b')의 입구 및 정확한 부분에서 트로프의 내부 폭), "L_T"(즉, 트로프 부재(30b')의 횡단 길이 또는 유동 길이), "S"(즉, 트로프 부재(30b')의 높이) 및 "d""(즉, 트로프 부재(30b') 내의 액체(3")의 깊이)로서 표 1에 보고되어 있다. 트로프(30b')의 각각의 측벽 부분의 두께도 약 1/4"(약 6 mm) 두께로서 측정되었다.

트로프 부재(30a') 내로의 유입물(즉, 프로세싱 향상제 NaHCO₃과 함께 사용된) 물(3)을 탈이온화 공정으로 생성하였다(본원에서 탈이온수로서 지칭됨). 혼합된 층 탈이온화 필터를 사용하였다. 탈이온화 처리 후 총 용해된 용매("TDS")는 아큐메트(Accumet)^® AR20 pH/전도성 측정기에 의해 측정되었을 때 약 0.2 ppm이었다.

표 1은 정제수에 첨가된 프로세싱 향상제(PE)(NaHCO₃)의 양이 약 0.54 mg/㎖이었다는 것을 보여준다. 이 프로세싱 향상제의 다른 양도 본 발명의 바람직한 실시양태의 범위 내에서 작용한다는 것을 이해해야 한다. 정제수/NaHCO₃ 혼합물을 트로프 부재(30a') 내로 유입되는 액체(3)으로서 사용하였다. 트로프 부재(30a')에서 액체(3')의 깊이 "d'"(즉, 플라스마(들)(4)이 형성되는 경우)는 트로프 부재(30a')를 따라 다양한 지점에서 약 7/16" 내지 약 ½"(약 11 mm 내지 약 13 mm)이었다. 깊이 "d'"는 (도 1에 표시된) 댐(dam)(80)의 사용을 통해 부분적으로 조절되었다. 구체적으로, 댐(80)은 트로프 부재(30a')의 유출 단부(32) 근처에서 제공되었고, 깊이에서 약 7/6" 내지 1/2"(약 11 내지 13 mm)인 (도 4b에서 "d"로서 표시된) 깊이 "d'"를 생성하는 것을 보조하였다. 댐(80)의 높이는 약 ¼"(약 6 mm)인 것으로 측정되었고, 세로 길이는 약 ½"(약 13 mm)인 것으로 측정되었다. 폭은 트로프 부재(30a')의 바닥 치수 "R"을 완전히 횡단하였다. 따라서, 그의 작동 동안 트로프 부재(30a')에서의 액체(3')의 총 부피는 약 2.14 in³(약 35 ㎖) 내지 약 0.89 in³(약 14.58 ㎖)이었다.

트로프 부재(30a') 및 트로프 부재(30b') 내로 들어가는 액체(3')의 유속은 약 215 ㎖/분이었고, 지점(32)에서 트로프 부재(30b')를 빠져나가는 유속은 약 215 ㎖/분이었다. 다른 허용가능한 유속이 바람직한 금 나노결정 현탁액을 제조하는 방법의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.

0.1 마력 및 10 내지 600 rpm에서 평가된 마스터플렉스(Masterflex)^® L/S 펌프 드라이브(40)를 이용함으로써 액체(3')의 이러한 유동을 수득하였다. 마스터플렉스^® 펌프(40)의 모델 번호는 7523-80이었다. 펌프 드라이브는 이지-로드(Easy-Load) 모델 번호 77201-60으로서 공지된, 마찬가지로 마스터플렉스^®에 의해 제조된 펌프 헤드를 가졌다. 펌프(40)에 대한 헤드는 일반적인 용어로 연동 헤드로서 공지되어 있다. 상기 펌프에 대한 정확한 셋팅은 분 당 215 ㎖이었다. 1/4"의 직경(즉, 크기 06419-25)을 갖는 타이곤(Tygon)^® 튜빙을 연동 헤드 내로 배치하였다. 마스터플렉스^®에 대한 튜빙은 세인트 고바인(Saint Gobain)에 의해 제조되었다. 튜빙의 한 단부는 트로프 부재(30a')의 제1 단부(31)로 전달되었다.

표 1은 단일 전극 세트(1a/5a)가 있었다는 것을 보여준다. 각각의 전극 세트(1/5)에 대한 전원은 AC 변압기(60)이었다. 구체적으로, 도 5a는 변압기(60)에 연결된 AC 전원(62)을 보여준다. 추가로, 예를 들면, 회로에서의 손실률이 조절될 수 있도록 축전기(61)를 제공하였다. 변압기(60)의 출력 장치는 제어 장치(20)를 통해 전극(들)(1/5)에 연결되었다. 실시예 1의 장치와 함께 사용되기에 바람직한 변압기는 교류 자속을 용이하게 전도하는 코어(602)에서 상기 교류 자속을 확립하기 위해 일차 코일(601) 내로 유동하는 교류 전류를 사용하는 변압기이다.

이차 코일(603)이 일차 코일(601) 및 코어(602) 근처에 위치할 때, 이 자속은 이차 코일(603)을 일차 코일(601)과 연결한다. 이차 코일(603)의 이 연결은 이차 단부를 횡단하는 전압을 유도한다. 이차 단부에서의 전압의 크기는 이차 코일 회전(turn) 대 일차 코일 회전의 비와 직접적으로 관련되어 있다. 일차 코일(601)보다 이차 코일(603) 상에서의 보다 많은 회전은 전압을 단계적으로 올리는 반면, 보다 적은 회전은 전압을 단계적으로 낮춘다.

본원에 기재된 절차에서 사용될 바람직한 변압기(들)(60)는 변압기(60)에서의 자기 분로(shunt)의 사용에 의해 가능해지는 의도적으로 약한 출력 전압 조절을 갖는다. 이들 변압기(60)는 네온 사인 변압기로서 공지되어 있다. 이 형상은 전극(들)(1/5) 내로의 전류 유동을 한정한다. 변압기(60)는 출력 부하 전압에서의 큰 변화를 이용하여 상대적으로 좁은 범위 내에서 출력 부하 전류를 유지한다.

변압기(60)는 그의 이차 개방 회로 전압 및 이차 짧은 회로 전류에 대해 평가된다. 개방 회로 전압(OCV)은 전기 연결이 존재하지 않을 때에만 변압기(60)의 출력 단부에서 나타난다. 마찬가지로, 짧은 회로 전류는 짧은 회로가 단부에 걸쳐 배치되어 있는 경우(출력 전압이 0과 동등한 경우) 출력 단부로부터만 나온다. 그러나, 부하가 이들 동일한 단부들을 횡단하여 연결될 때, 변압기(60)의 출력 전압은 0과 정격 OCV 사이의 범위 내에 속해야 한다. 사실상, 변압기(60)가 적절하게 부하되는 경우, 그 전압은 정격 OCV의 약 절반일 것이다.

변압기(60)는 평형 중간점 기준 디자인(Balanced Mid-Point Referenced Design)(예를 들면, 접지된 평형 중간점으로서도 종래 공지되어 있음)으로서 공지되어 있다. 이것은 중간 내지 높은 전압 정격 변압기 및 대다수의 60 mA 변압기들에서 가장 흔히 발견된다. 이것은 "중간점 귀선" 시스템에서 허용가능한 유일한 유형의 변압기이다. "평형" 변압기(60)는 (도 5b에서 일반적으로 개략도로 표시된 바와 같이) 2개의 이차 코일(603)(일차 코일(601)의 각각의 측면 상에서 1개씩)과 함께 1개의 일차 코일(601)을 갖는다. 이 변압기(60)는 2개의 변압기들처럼 다수의 방식으로 수행할 수 있다. 비평형 중간점 기준 코어 및 코일처럼, 각각의 이차 코일(603)의 한 단부는 코어(602)에 부착된 후 변압기 밀폐구조에 부착되고, 각각의 이차 코일(603)의 다른 단부는 출력 리드(lead) 또는 단부에 부착된다. 따라서, 연결제가 존재하지 않을 때, 이 유형의 비부하 15,000 볼트 변압기는 각각의 이차 단부부터 변압기 밀폐구조까지 약 7,500 볼트를 측정할 것이지만 2개의 출력 단부들 사이에서 약 1,500 볼트를 측정할 것이다.

1(또는 100%)의 선 역률을 보유하는 교류(AC) 회로에서 전압 및 전류 각각은 0에서 시작하고 최대치까지 상승하고 0으로 떨어지고 음의 최대치까지 하강하고 다시 0까지 상승한다. 이것은 전형적인 사인파의 한 주기를 완결한다. 이것은 전형적인 미국 응용제품에서 초 당 60회 일어난다. 따라서, 이러한 전압 또는 전류는 초 당 60 주기(또는 60 헤르츠)의 특징적인 "주파수" 전력을 갖는다. 역률은 전류 파형에 대한 상대적인 전압 파형의 위치와 관련된다. 상기 두 파형들이 함께 0을 통과하고 이들의 최대치가 함께 존재할 때, 이들은 같은 위상으로 존재하고, 역률은 1 또는 100%이다. 도 5c는 서로 같은 위상으로 존재하고 1 또는 100%의 역률을 갖는 2개의 파형 "V"(전압) 및 "C"(전류)를 보여주는 반면, 도 5d는 서로 다른 위상으로 존재하고 약 60%의 역률을 갖는 2개의 파형 "V"(전압) 및 "C"(전류)를 보여주는데; 상기 두 파형들은 동일한 시간에 0을 통과하지 않는다. 상기 파형들은 다른 위상으로 존재하고, 이들의 역률은 100% 미만이다.

대다수의 이러한 변압기들(60)의 정상 역률은 유도자(inductor)를 변압기(60)의 회로의 출력물 내로 효과적으로 첨가하여 전류를 전극(1/5)으로 한정하는, 자기 분로(604) 및 이차 코일(603)의 효과에 주로 기인한다. 역률은 입력 전압 및 전류파를 위상 내로 보다 많이 이동시키는, 변압기(60)의 일차 코일(601)을 횡단하여 배치된 축전기(들)(61)의 이용에 의해 보다 높은 역률까지 증가될 수 있다.

본 발명에서 사용될 임의의 변압기(60)의 비부하 전압뿐만 아니라 이의 내부 구조도 중요하다. 본 발명에서 사용될 바람직한 비부하 변압기는 약 9,000 볼트, 10,000 볼트, 12,000 볼트 및 15,000 볼트인 변압기를 포함한다. 그러나, 이들 특정 비부하 볼트 변압기 측정은 추가 실시양태로서 허용가능한 전원의 범위를 한정하는 것으로서 간주되어서는 안 된다. 본원의 절차에서 사용되는 특정 바람직한 변압기는 프랑스포머(Franceformer)에 의해 제조된다(일차적으로 120 볼트 및 60 Hz에서 작동하고 이차적으로 9,000 볼트 및 60 mA에서 작동하는 카탈로그 번호 9060-P-E).

따라서, 변압기(60)는 동일한 변압기일 수 있거나 상이한 변입기(뿐만 아니라 상이한 극성)일 수 있다. 변압기의 선택, 역률, 축전기(들)(61), 극성, 전극 디자인, 전극 위치, 전극 조성, 트로프 부재(30a')의 횡단면 형태(들), 국소적 또는 전반적 전극 조성, 대기(들), 국소적 또는 전반적 액체(3) 유속(들), 액체(3') 국소 성분, 트로프 부재(30a')에서 다양한 장들(fields)에 국소적으로 노출된 액체(3')의 부피, 인접(예를 들면, 상류 및 하류 둘다) 전극 세트, 국소 장 농도, 트로프 부재에서 사용된 임의의 막의 용도 및/또는 위치 및/또는 조성 등은 프로세싱 조건뿐만 아니라 본원에 개시된 다양한 실시양태들에 따라 제조된 액체(3'), 나노결정 및 나노결정/현탁액 또는 콜로이드에서 생성된 성분들의 조성 및/또는 부피에도 영향을 미치는 모든 인자들이다. 따라서, 다수의 실시양태들이 본원에 제시된 상세한 개시내용에 따라 실시될 수 있다.

플라스마(4)는 도 6에 표시된 전극과 형태 면에서 유사한 전극(1)에 의해 생성되었고 약 9.2 g의 중량을 가졌다. 이 전극은 99.995%(4N5)의 순수한 금이었다. 다른 전극(5a)은 약 1 mm 두께의 금 와이어(99.995%)를 갖고 액체(3')에 잠긴 약 9 mm 길이를 갖는 것으로 측정되었다.

도 2a 및 2c에 표시된 바와 같이, 트로프 부재(30a')로부터의 유출물은 컨디셔닝된 액체(3')이었고, 이 컨디셔닝된 액체(3')는 제2 트로프 부재(30b') 내로 직접적으로 유동되었다. 도 2a, 2c 및 3에 표시된 이차 트로프 부재(30b')는 표 1에 보고된 측정치를 가졌다. 이 트로프 부재(30b')는 약 885 ㎖의 액체(3")를 함유하였다. 표 1은 (도 7에 표시된) 7개의 전극 세트(5/5')가 도 3에 표시된 바와 같이(즉, 액체(3")의 유동 방향에 수직인 방향으로) 위치한다는 것을 의미하는, 도 7 및 3에 표시된 전극 형상을 보고한다. 각각의 전극 세트(5/5')는 표 1에 보고된 바와 같이 직경에서 약 1.0 mm를 갖는 것으로 측정되는 99.99%의 순수한 금 와이어를 포함하였다. 액체(3")와 접촉한 각각의 와이어 전극(5)의 길이(표 1에서 "W_L"로서 보고됨)는 약 1"(약 25.4 mm)인 것으로 측정되었다. 다른 배향은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.

도 8에 예시된 AC 전원(또는 변압기)(501 AC)을 전력 공급원으로서 사용하였다. 이 변압기(501 AC)는 0 내지 300 V의 AC 전압 범위, 15 내지 1000 Hz의 주파수 범위 및 약 2 kVA의 최대 정격 전력을 갖는 AC 전원(크로마(Chroma) 61604)이었다. 도 2a, 2c 및 3과 관련하여, 각각의 별개의 전극 세트(5/5')(예를 들면, 세트 2, 세트 3 내지 세트 8 또는 세트 9)를 도 2a에 표시된 바와 같이 전원(501 AC)에 전기적으로 연결하였다. 구체적으로, 전원(501 AC)을 도 2a에 표시된 배선도에 따라 각각의 전극 세트에 전기적으로 연결하였다.

표 1은 각각의 전극 세트를 "세트 #"(예를 들면, "세트 1" 내지 "세트 8")로 지칭한다. 1/5 또는 5/5 전극 세트의 각각의 전극을 특정 전압에서 작동하도록 설정하였다. 표 1에 나열된 전압은 각각의 전극 세트에 대해 사용된 전압이다. (도 9와 관련하여) 각각의 전극 세트의 중심선부터 인접 전극 세트까지의 거리 "c-c"도 보고되어 있다. 추가로, 사용된 각각의 전극(1)과 관련된 거리 "x"도 보고되어 있다. 전극(5)의 경우, 거리 "x"가 보고되어 있지 않다. 다른 관련 파라미터들도 표 1에 보고되어 있다. 전극(1/5)에 대한 모든 물질들은 캐나다 온타리오 엘2에이 2피6 포트 에리 루이스 스트리트 23에 소재하는 Hi-Rel로부터 입수되었다. 도 2a, 2c 및 3과 관련하여, 각각의 전극(5/5')을 먼저 암수용기 튜브(o5) 내로 들어가도록 액체(3")와 접촉한 상태로 배치하였다. 일정한 양의 공정 시간 후, 금 금속을 각각의 와이어 전극(5)으로부터 제거하여 전극(5)이 얇아지게(즉, 직경에서 더 작아지게) 하였고, 이것은 예를 들면, 전류 밀도 및/또는 금 나노입자가 형성되는 속도를 변화시켰다. 따라서, 전극(5)은 암수용기 튜브(o5)를 향하여 이동하여, 그의 상부 표면 부분에서 액체(3") 내로 들어가는 새로운 보다 두꺼운 전극(5)을 생성하였다. 본질적으로, 일정한 양의 프로세싱 시간이 경과한 후 전극(5) 상에서 부식 프로파일 또는 테이퍼링(tapering) 효과가 형성되었고(즉, 액체(3")의 표면 근처의 와이어 부분은 전형적으로 암수용기 튜브(o5) 근처의 부분보다 더 두꺼웠고), 이러한 와이어 전극 프로파일 또는 테이퍼링은 생산 공정 전체에서 본질적으로 일정하게 유지될 수 있고, 이로써 원하는 경우 생산 작업 동안 초기 예비평형상 후 임의의 시점에서 본질적으로 동일한 생성물이 생성되어, 예를 들면, 공정이 현재의 FDA 지침 하에서 cGMP이고/이거나 ISO 9000도 준수하게 할 수 있다.

전극(5/5)을 8시간 당 약 1 인치의 속도로 작동시켰거나 이동시켰다. 샘플을 평형상으로부터만 수집하였다. 예비평형상은 예를 들면, 액체(3")에서 생성된 나노결정의 농도가 본원에 개시된 제어 공정으로 인해 프로세싱의 나머지 전체에서 실질적으로 일정하게 유지되는 평형 상태(예를 들면, 장치 내에서의 실질적으로 일정한 핵형성 및 성장 조건)에 도달할 때까지 시간의 함수로서 증가하기 때문에 발생한다. 예비평형상은 약 30분 동안 지속되고 약 1.7 갤런을 생성한다.

8개의 전극 세트(1/5 및 5/5)를, 각각의 전극 세트에서 예를 들면, 각각의 전극(1/5 또는 5/5)의 높이를 자동적으로 조절하는 제어 장치(20 내지 20g)에 모두 연결하였다. 원할 때 및 원하는 경우 각각의 전극 세트에서의 전극(5/5)이 각각의 암수용기 튜브(o5) 내로 제거가능하게 삽입될 수 있도록 2개의 암수용기 튜브(o5a/o5a' 내지 o5g/o5g')를 트로프 부재(30b')의 바닥 부분에 연결하였다. 각각의 암수용기 튜브(o5)는 폴리카보네이트로 만들어졌고 약 1/8 인치(약 3.2 mm)의 내부 직경을 가졌고 용매 접착제에 의해 제자리에서 트로프 부재(30b')의 바닥 부분에 고정되었다. 상기 튜브(o5)의 한 단부가 상기 트로프(30b')의 바닥 부분의 표면과 동일 평면이 되도록 트로프 부재(30b')의 바닥 내의 홀은 각각의 튜브(o5)의 외부 직경이 그 내부에 고정되게 하였다. 상기 튜브(o5)의 바닥 부분을 밀봉한다. 상기 튜브(o5)의 내부 직경은 임의의 상당한 양의 액체(3")가 암수용기 튜브(o5) 내로 들어가는 것을 효과적으로 방지하였다. 그러나, 일부 액체는 암수용기 튜브들(o5) 중 하나 이상의 튜브 내부 내로 유동할 수 있다. 각각의 암수용기 튜브(o5)의 길이 또는 수직 높이는 약 6 인치(약 15.24 cm)이었으나, 보다 짧은 또는 보다 긴 길이가 본 개시내용의 범위 내에 속한다. 추가로, 암수용기 튜브들(o5)은 나중에 직선인 것으로서 표시되지만, 이러한 튜브들은 원하는 경우 트로프 부재(30b')로부터 떨어져 있는 그들의 개구가 액체(3")의 상부 표면 상에 존재할 수 있도록 J-형태 또는 U-형태 방식으로 굽어질 수 있다.

본원에 기재된 작업은 하기 프로세싱 향상제를 사용하였다. 구체적으로, NaHCO₃의 화학식을 갖는 약 2.04 g/갤론(즉, 약 0.54 g/리터)의 탄산수소나트륨("소다")을 첨가하고 물(3)과 혼합하였다. 상기 소다는 알파 애사르(Alfa Aesar)로부터 입수되었고, 상기 소다는 84.01의 화학식량 및 약 2.159 g/cm³의 밀도를 가졌다.

구체적으로, 60 Hz의 사인파 AC 주파수를 이용하여 본원의 교시에 따라 금 나노결정 현탁액을 제조하였다. AC 전원(501 AC)은 크로마 61604 프로그램가능한 AC 전원을 이용하였다. 적용된 전압은 약 220 볼트이었다. 적용된 전류는 약 6 암페어 내지 약 6.5 암페어이었다.

표 1은 도 1, 2a 및 2c와 관련하여 사용된 핵심 프로세싱 파라미터를 요약한다. 또한, 표 1은 1) "제조된 Au PPM"(예를 들면, 금 나노결정 농도); 2) TEM 분석에 의해 측정된, 가장 빈번하게 발생하는 금 나노결정 직경에 상응하는 모드인 "TEM 평균 직경"; 및 3) 제타사이저(Zetasizer) ZS-90에 의해 측정된 "수력학적 반경"을 개시한다. 이 물리적 특징규명을 본원의 다른 부분에서 논의된 바와 같이 수행하였다.

투과 전자 현미경법

구체적으로, 200의 메쉬 크기를 갖는 탄소로 안정화된 포름바르(Formvar) 코팅된 격자를 이용하여 TEM 샘플을 제조하였다. 상기 격자를 먼저 진공 하에서 플라스마 처리로 전처리하였다. 상기 격자를 직사각형 필터지 조각으로 안감을 댄 현미경 슬라이드 상에 배치한 후, 필요한 플라스마 발생기 부속품이 설치된 덴톤(Denton) 진공 장치 내로 배치하였다. 진공을 75 mTorr에서 유지하였고, 플라스마를 시작하고 약 30초 동안 작동시켰다. 완료하였을 때, 시스템을 배기시키고 격자를 제거하였다. 상기 격자는 습도 조건에 따라 최대 7일 내지 10일까지 안정하였지만, 모든 경우에서 12시간 이내에 사용되었다.

대략 1 ㎕의 CNM-Au8 나노결정 현탁액을 격자 상에 배치하고 20분 내지 30분 동안 또는 소적이 증발될 때까지 실온에서 공기 건조하였다. 증발을 완료하였을 때, TEM 분석을 수행할 때까지 격자를 홀더 플레이트 상에 배치하였다.

필립스(Philips)/FEI 테크나이(Tecnai) 12 투과 전자 현미경을 이용하여 모든 준비된 샘플들을 조사하였다. 상기 기계를 100 keV의 가속 전압에서 작동시켰다. 광선의 정렬 후, 샘플을 최대 630,000배까지 포함하는 다양한 배율에서 조사하였다. 각각 카메라 및 TEM 기계에 대한 제어 둘다를 제공하는 iTEM 및 테크나이 사용자 접속 소프트웨어를 갖춘 PC에게 영상을 직접적으로 전달하는 부착된 올림푸스 메가뷰(Olympus Megaview) III 측면-장착된 카메라를 통해 영상을 수집하였다.

도 10a는 본원의 상기 절차에 따라 제조된 건조된 CNM-Au8 현탁액에 상응하는 금 나노결정의 대표적인 TEM 현미경사진을 보여준다. 도 10b는 TEM 평균 직경을 계산하는 데에 사용되고 표 1에서 언급된 측정된 TEM 크기 분포에 상응한다.

pH 측정

pH 프로브가 관심있는 샘플을 함유하는 50 ㎖ 바이알 내에 배치되어 있고 안정화된 아큐멧(Accumet)^® AR20 pH/전도성 측정기를 이용하여 pH 측정을 수행하였다. 그 다음, 3회 별개의 pH 측정을 수행하고 샘플 당 평균을 계산하였다. CNM-Au8 나노현탁액은 약 9.08의 측정된 pH를 가졌다.

UV-가시광선 분광법

UV-가시광선 분광법을 이용하여 샘플에 대한 에너지 흡수 스펙트럼을 수득하였다. 이중 광선 체르니-터너(Czerny-Turner) 모노크로메이터(monochromator) 시스템 및 이중 규소 광다이오드를 갖춘 써모피셔 에볼루션(Thermofisher Evolution) 201 UV-가시광선 분광계를 이용하여 이 정보를 획득하였다. 다수의 융합된 석영 샘플 홀더들 또는 "큐벳들" 중 하나를 사용하여 저농도 액체 샘플의 측정을 뒷받침하기 위한 기계를 제공하였다. 하기 파라미터들을 사용하여 약 300 내지 900 nm의 파장 범위에 걸쳐 데이터를 획득하였다: 1 nm의 밴드폭, 0.5 nm의 데이터 피치(pitch). 제논 플래쉬 램프가 일차 에너지원이었다. 분광계의 광학 경로는 에너지 광선이 각각의 샘플 큐벳의 중심을 통과할 수 있도록 정렬되었다. 샘플 준비는 분광계의 전체적으로 밀폐된 샘플 구획 내에서 큐벳을 충전시키고 캡핑한 후 샘플을 큐벳 홀더 내에 물리적으로 배치하는 것으로 한정되었다. 각각의 샘플의 에너지의 광학 흡수를 측정하였다. 데이터 출력을 측정하고 (비어-램버트(Beer-Lambert) 법칙에 따라) 파장에 대한 흡광도 유닛으로서 표시하였다.

도 10c는 약 350 nm 내지 900 nm의 파장 범위에 대한 CNM-Au8 현탁액에 대한 UV-가시광선 스펙트럼 패턴을 보여준다.

동적 광 산란 제타사이저(Zetasizer)

CNM-Au8 현탁액의 동적 광 산란(DLS) 측정을 제타사이저 나노 ZS-90 DLS 기계 상에서 수행하였다. DLS에서, 레이저 광이 (파장보다 더 작은) 나노결정 주변의 작은 입자 및/또는 조직화된 물 구조와 충돌하기 때문에, 광은 모든 방향으로 산란하여 산란 강도에서의 시간 의존적 변동을 초래한다. 강도 변동은 산란 입자의 브라운(Brownian) 운동/물 구조 조합에 기인하고 결정 크기 분포에 대한 정보를 함유한다.

기계를 실험 전에 30분 이상 동안 가온하였다. 1 cm 경로 길이를 갖는 정사각형 유리 셀인 PCS8501을 사용하여 측정을 수행하였다. 하기 절차를 이용하였다:

1. 먼저, 1 ㎖ 마이크로피펫을 이용하여 1 ㎖의 DI 물을 셀 내에 첨가한 후, 물을 셀로부터 폐기물 비이커 내로 따라내고 셀 측정 캐비티(cavity)로부터 나머지 물을 털어내었다. 이 단계를 2회 이상 반복하여 셀을 철저히 세정하였다.

2. 1 ㎖ 마이크로피펫을 이용하여 1 ㎖의 샘플을 셀 내에 첨가하였다. 그 후, 동일한 피펫 팁을 이용하는 동일한 피펫으로 모든 액체를 셀로부터 제거하고 폐기물 비이커 내로 버렸다. 동일한 팁을 이용하여 1 ㎖의 샘플을 다시 첨가하였다.

3. 샘플을 갖는 셀을, 정면을 향하는 조각된 문자를 갖는 제타사이저 기계의 온도 조절된 셀 블록 내에 배치하였다. 제타사이저 소프트웨어에서 새로운 실험을 열었다. 온도가 평형화되고 레이저 전력이 적절한 값까지 약화된지 1분 후 측정을 시작하였다. 모든 작동이 종결된 후 결과를 저장하였다.

4. 셀을 기계로부터 꺼내고, 단계 2에서 사용된 동일한 피펫 및 팁을 사용하여 셀로부터 샘플을 제거하였다.

5. 단계 2 내지 4를 각각의 샘플에 대해 2회 이상 반복하였다.

6. 새로운 샘플의 경우, 이전 샘플에 의한 오염을 피하기 위해 1 ㎖ 피펫에 대한 새로운 피펫 팁을 사용하고 단계 1 내지 5를 반복하였다.

제타사이저 소프트웨어 버전 6.20을 이용하여 데이터 수집 및 프로세싱을 수행하였다. 모든 실험을 위해 하기 파라미터들을 사용하였다: 작동 지속 - 2o; 실험 - 10; 용매 - 물, 0 mmol; 점도 - 0.8872 cP; 굴절 지수 - 1.333; 블록 온도 - +25℃. 각각의 실험에 대한 데이터를 저장한 후, 결과를 상기 소프트웨어의 "Records View" 페이지 상에서 가시화하였다. 입자 크기 분포(즉, 수력학적 반경)를 "강도 PSD" 그래프에서 분석하였다. 이 절차에 따라 생성된 결정 크기(예를 들면, 수력학적 반경)의 표시를 수득하기 위해 동적 광 산란 기법을 이용하였다. 수력학적 반경은 표 1에서 19.43 nm로서 보고되어 있다. 추가로, 순수한 CNM-Au8 나노현탁액에 대한 측정된 제타 전위는 -42.9 mV이었다.

원자 흡수 분광법

퍼킨 엘머 어날리스트(Perkin Elmer AAnalyst) 400 분광계 시스템으로부터 AAS 값을 수득하였다. 원자 흡수 분광법을 이용하여 "ppm"(백만분율)으로 보고된 종의 농도를 측정한다.

I) 원리

불꽃 원자 흡수 분광법(flame atomic absorption spectroscopy)의 기법은 액체 샘플이 흡입되고 에어로졸화되고 연소가능한 기체, 예컨대, 아세틸렌 및 대기와 혼합될 것을 요구한다. 혼합물을 약 2100℃ 내지 약 2400℃의 온도 범위를 갖는 불꽃에서 연소시킨다. 연소 동안, 샘플 중의 관심있는 원소의 원자는 특징적인 파장에서 광을 흡수하는 자유 비여기된 기저 상태 원자로 환원된다. 특징적인 파장은 원소 특이적이고 0.01 내지 0.1 nm까지 정확하다. 원소 특이적 파장을 제공하기 위해, 확인되는 원소로 만들어진 캐쏘드를 갖는 중공(hollow) 캐쏘드 램프(HCL)로부터의 광선을 불꽃에 통과시킨다. 광검출기는 분석물에 의한 흡수로 인한 광 강도의 감소의 양을 검출한다. 배경 주위 광을 감소시키고 검출을 위해 요구된 HCL로부터 특정 파장을 선택하기 위해 광검출기의 앞에서 모노크로메이터를 사용한다. 추가로, 중수소 아크 램프는 원자 구름 중의 비-원자 종에 의해 야기된 배경 흡광도에 대해 보정한다.

II) 샘플 준비

10 ㎖의 샘플, 0.6 ㎖의 36%(부피/부피) 염산 및 0.15 ㎖의 50%(부피/부피) 질산을 유리 바이알 내에서 함께 혼합하고 70℃ 수조에서 약 10분 동안 항온처리한다. 현탁액 중의 금 농도가 10 ppm보다 더 높을 것으로 예상되는 경우, 최종 금 농도가 1 내지 10 ppm이 되도록 산의 첨가 전에 샘플을 DI 물로 희석한다. 예를 들면, 약 100 ppm의 금 농도를 위해 산의 첨가 전에 0.5 ㎖의 샘플을 9.5 ㎖의 DI 물로 희석한다. 조절가능한 마이크로피펫으로 분취를 수행하고,샘플, DI 물 및 산의 정확한 양을 오하우스(Ohaus) PA313 미량천칭으로 측정한다. 성분의 중량을 이용하여 측정된 농도를 DI 물 및 산에 의한 희석에 대해 보정한다.

각각의 샘플을 삼중으로 준비하고 수조에서의 항온처리 후 측정을 수행하기 전에 실온까지 냉각시킨다.

III) 기계 셋업

퍼킨 엘머 어날리스트 400 분광계 시스템에 대해 하기 셋팅을 이용한다:

a) 버너 헤드: 2 ppm Cu 표준물로 최대 흡광도를 수득하기 위해 제조 절차에 따라 3개의 축으로 정렬된 10 cm 단일-슬롯(slot) 유형.

b) 분무기: 충돌 비드의 앞에서 스페이서를 갖는 플라스틱.

c) 기체 유동: 약 12 ℓ/분의 산화제(대기) 유속, 약 1.9 ㎖/분의 연료(아세틸렌) 유속.

d) 램프/모노크로메이터: 중공 캐쏘드 램프, 10 mA 작동 전류, 1.8/1.35 mm 슬릿, 242.8 nm 파장, 배경 보정(중수소 램프) 실행.

IV) 분석 절차

a) 시스템을 가온하기 위해 대략 30분 동안 Au 램프 및 불꽃을 작동시킨다.

b) 3.7%(부피/부피) 염산의 매트릭스 중의 1 ppm, 4 ppm 및 10 ppm Au 표준물을 사용하여 기계를 보정한다. 3.7%(부피/부피) 염산을 블랭크로서 사용한다.

c) 4 ppm 표준물을 샘플로서 측정함으로써 보정 스케일을 검증한다. 측정된 농도는 3.88 ppm과 4.12 ppm 사이에 있어야 한다. 그 범위를 벗어난 경우 단계 b)를 반복한다.

d) 샘플의 3개 복제물을 측정한다. 복제물들 사이의 표준편차가 5%보다 더 높은 경우, 측정을 반복하고, 그렇지 않으면 다음 샘플로 진행한다.

e) 6개의 샘플들 또는 종종 보다 많은 샘플들을 측정한 후 검증 단계 c)를 수행한다. 검증이 실패한 경우, 단계 b) 및 c)를 수행하고 마지막 성공적인 검증 후 측정된 모든 샘플들을 재측정한다.

V) 데이터 분석

실제 샘플 농도를 계산하기 위해 각각의 복제물에 대한 측정된 농도 값을 물 및 산에 의한 희석에 대해 보정한다. 보고된 Au ppm 값은 개별 복제물에 대한 3개의 보정된 값들의 평균이다.

표 1은 약 7.2 ppm의 상응하는 값으로 AAS 농도 결과를 "생성된 Au PPM"으로서 언급한다.

접선 유동 여과법(TFF)

실시예 2 및 3에서 사용될 순수한 CNM-Au8 나노현탁액에서 생성된 금 나노결정의 농도를 증가시키기 위해, 접선 유동 여과(TFF) 공정을 이용하였다. TFF 공정에서의 농축은 현탁액 중의 나노결정으로부터 현탁액을 포함하는 액체를 우선적으로 제거하기 위해 막을 사용하는 압력 구동된 분리 공정이다. 따라서, TFF 공정은 액체 중의 금 나노결정의 농도가 막의 한 면 상에서 상대적으로 더 높게 한다. TFF 공정에서, CNM-Au8 현탁액은 막의 표면을 따라 접선으로 펌핑된다. 단순한 TFF 시스템의 개략도는 도 11에 표시되어 있다.

공급원료 탱크(1001)는 CNM-Au8 현탁액을 공급원료 펌프(1002) 및 여과 모듈(1003) 내로 공급하였다. 여과액 스트림(1004)을 따라버렸다. 체류물 밸브(1005)를 통해 체류물을 방향전환시키고 공급물 탱크(1001) 내로 1006으로서 돌려보냈다. 상기 현탁액이 여과 모듈(1003) 내의 막의 표면을 매회 통과하는 동안, 적용된 압력은 현탁액을 포함하는 액체의 부분이 막을 통해 여과액 스트림(1004) 내로 들어가게 하였다. 금 나노결정은 막을 통과하기에는 너무 크므로, 상부 스트림 상에서 보유되고 접선 유동을 따라 체류물(1006) 내로 내몰린다. 보다 높은 농도의 금 나노결정을 갖는 체류물은 공급원료 탱크(1001)로 다시 돌려보내졌다. 공급원료 탱크에 첨가된 정용여과 완충제가 없는 경우, 공급원료 탱크(1001) 내의 액체 부피는 제거된 여과액(즉, 액체)의 양만큼 감소되었고, 금 나노결정은 현탁액에서 농축되었다.

이 실시예에서, 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) XL 카세트를 5 kDa 및 10 kDa MWCO 셀룰로스 막과 함께 사용하였다. 체류물 밸브(1005)로 체류물 압력을 40 PSI로 설정하였다. 10 kDa 막은 동일한 경막 압력 하에서 5 kDa 막에 비해 대략 4배 더 높은 여과액 유속을 허용하였는데, 이것은 보다 큰 공극 크기의 경우 예상된다. 동시에, 10 kDa 막의 공극은 모든 형성된 금 나노결정들을 체류물에서 보유할 정도로 충분히 작으므로, CNM-Au8 현탁액에서 금 나노결정을 농축시킨다. CNM-Au8 현탁액을 TFF 시스템에 통과시킨 후, CNM-Au8 현탁액 중의 현탁된 금 나노결정의 원하는 농도가 달성되었고 (실시예 2의 경우) 약 7.2 ppm부터 약 51 ppm까지 증가되었고; CNM-Au8 현탁액 중의 현탁된 금 나노결정의 농도는 (실시예 3에서 사용된 2개의 상이한 나노현탁액들의 경우) 약 7.2 ppm부터 약 50 ppm 및 1000 ppm까지 증가되었다.

농축 단계가 수력학적 반경 및 제타 전위 중 어느 한 값에 영향을 미쳤는지를 확인하기 위해 농축된 CNM-Au8 나노결정 현탁액을 수력학적 반경 및 제타 전위 둘다에 대해 특징규명하였다. 실시예 2 현탁액의 경우, 농축된 CNM-Au8(51 ppm) 나노현탁액의 측정된 제타 전위는 약 -45.5 mV이었고, 측정된 수력학적 반경은 약 18 nm이었다. 실시예 3의 현탁액의 경우, 농축된 CNM-Au8(50 ppm) 나노현탁액의 측정된 제타 전위는 약 -43.6 mV이었고, 측정된 수력학적 반경은 약 18.6 nm이었고, 농축된 CNM-Au8(1000 ppm) 나노현탁액의 측정된 제타 전위는 약 -47.2 mV이었고, 측정된 수력학적 반경은 약 20.1 nm이었다. 따라서, 농축 단계는 이들 중요한 물리적 특징규명 파라미터들 중 어느 하나에 불리한 영향을 미치지 않았다.

순수한 CNM-Au8 현탁액의 상세한 제조 방법 및 상세한 물리적 특징규명은 2013년 10월 3일자로 공개된 국제 특허출원 제PCT/US2010/041427호(발명의 명칭: Novel Gold-Based Nanocrystals for Medical Treatments and Electrochemical Manufacturing Processes Therefor)(이의 전체 보호대상은 본원에 명확히 참고로 도입됨)에서 발견될 수 있다.

금(바람직하게는 CNM-Au8) 나노현탁액을 치료제로서 사용하는 방법

본 발명의 한 실시양태는 탈수초화 또는 수초형성부전을 예방하고/하거나 CNS 뉴런 및/또는 PNS 뉴런을 포함하는 뉴런의 수초화 또는 재수초화를 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법의 목적을 위해, 원소 금 결정 나노현탁액은 CNS 수초화의 억제를 경감시킬 수 있고/있거나, CNS 뉴런 세포 생존을 촉진할 수 있고/있거나 일부 길항제의 발현을 감소시킬 수 있거나 억제할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액은 이러한 방법과 함께 사용된다.

본 발명의 추가 실시양태는 포유동물에서 (CNS 뉴런을 포함하는) 뉴런의 수초화을 촉진하는 방법으로서, (치료 또는 예방) 유효량의 원소 금 결정 나노현탁액을 포함하는 조성물을 상기 촉진을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액은 이러한 방법과 함께 사용된다.

본 발명의 추가 실시양태는 수초형성부전 또는 탈수초화와 관련된 질환, 장애, 병리학적 상태 및/또는 손상을 앓고 있는 동물(예를 들면, 포유동물)에서 이러한 상태를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 금 결정 나노현탁액(바람직한 실시양태에서 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액이 사용됨)을 상기 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이러한 단계로 구성되거나 이러한 단계로 구성된 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시양태는 CNS 뉴런 및/또는 PNS 뉴런의 생존 촉진을 필요로 하는 포유동물에서 이러한 생존을 촉진하는 방법으로서, 유효량의 금 결정 나노현탁액을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액이 이러한 방법과 함께 사용된다.

본 발명의 추가 실시양태는 포유동물에서 희소돌기아교세포 분화를 촉진하는 방법으로서, 유효량의 금 결정 나노현탁액을 포함하는 조성물을 이러한 촉진을 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액이 이러한 방법과 함께 사용된다.

본 발명의 추가 실시양태는 유효량의 금 나노결정 현탁액을 제공하지 않은 경우에 비해 손상된 수초의 발현, 탈수초화 또는 수초형성부전을 감소시키거나 억제하는 방법으로서, (예방 및 치료) 유효량의 금 나노결정 현탁액을 포함하는 조성물로 뉴런(CNS 및/또는 PNS)의 수초화을 변형시키는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액이 이러한 방법과 함께 사용된다.

본 발명의 추가 실시양태는 유효량의 실시예 1의 CNM-Au8 나노결정 현탁액이 제공되지 않은 경우 수초 손상과 관련된 바람직하지 않은 병리학적 사건을 억제하거나 감소시키는 방법으로서, CNM-Au8 나노현탁액을 포함하는 조성물을 이러한 억제 또는 감소를 필요로 하는 대상자에게 제공하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

본 발명의 치료 방법에서, 나노결정 현탁액, 바람직하게는 CNM-Au8 나노결정 현탁액은 경구 투여, 주사 및/또는 코를 통해 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 볼루스 주사 또는 장기간 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 예를 들면, 경막내 또는 경막외 배치에 의해 중추신경계 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 수초 손상이 발현되는 만성 병변 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 포유동물의 혈류 내로 직접적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 금 나노현탁액, 바람직하게는 CNM-Au8 나노결정 현탁액은 진행성 핵상마비, 알렉산더병, 크라베병, 이염성 백질이영양증, 칸반병, 백질이영양증, 뇌척수염, 뇌교 중심부 수초용해증(CPM), 항-MAG 질환, 펠리체우스-메르츠바허병, 레프숨병, 코케인 증후군, 젤베거 증후군, 귈랭-바레 증후군(GBS), 반 데르 크나프 증후군, 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 다초점 운동 신경병증(MMN), 시신경 척수염(NMO), 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 왈러 변성, 및 일부 유전 질환, 예컨대, 부신백질이영양증, 알렉산더병, 연령 관련 인지 감퇴로서도 공지된 경미한 인지 손상(MCI) 및 펠리체우스 메르츠바허병(PMZ)을 포함하는 질환의 치료제로서 투여된다. 금 나노결정 현탁액은 수초형성부전, 탈수초화, 및/또는 수초화 및/또는 뉴런 생존을 음성적으로 조절하는 사건을 유발하는 손상 사건의 능력을 중단하거나, 감소시키거나, 방지하거나 억제하고/하거나, 우수한 수초의 발현(예를 들면, 재수초화) 또는 우수한 수초/축삭 상호작용을 증가시키는 치료제로서 제조되고 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태는 대상자에서 수초형성부전 또는 탈수초화와 관련된 질환, 장애 또는 손상(예를 들면, 시신경 척수염을 앓고 있는 대상자에서 시신경 척수염)을 치료하는 방법으로서, 농도, 부피 및/또는 투약 빈도를 변경시켜 임상 효과에 대해 적정함으로써 치료 유효량의 금 나노현탁액, 바람직한 실시양태에서 CNM-Au8 나노현탁액을 상기 대상자에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이러한 단계로 구성되거나 이러한 단계로 구성된 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 포유동물에서 뉴런의 수초화(재수초화를 포함함)를 촉진하는 방법으로서, (치료 및 예방) 유효량의 금 나노현탁액, 바람직하게는 CNM-Au8 나노현탁액을 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이러한 단계로 구성되거나 이러한 단계로 구성된 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가 실시양태는 희소돌기아교세포 사멸 또는 분화의 결여와 관련된 질환, 장애 또는 손상, 예를 들면, 시신경 척수염, 펠리체우스 메르츠바허병 또는 구형 세포 백질이영양증(크라베병)을 앓고 있는 동물에서 이러한 질환을 치료하는 방법으로서, 유효량의 금 나노현탁액, 바람직한 실시양태에서 CNM-Au8 나노현탁액을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이러한 단계로 구성되거나 이러 단계로 구성된 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 포유동물에서 희소돌기아교세포의 증식, 분화 및 생존을 촉진하는 방법으로서, 치료 유효량의 금 나노현탁액, 바람직한 실시양태에서 CNM-Au8 나노현탁액을 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 이러한 단계로 구성되거나 이러 단계로 구성된 방법을 포함한다.

본원에 개시된 치료 방법에서 사용되는 금 나노현탁액, 바람직한 실시양태에서 CNM-Au8 나노현탁액은 희소돌기아교세포에 의한 뉴런의 수초화를 음성적으로 조절하는 병리학적 사건의 능력을 중단하거나, 감소시키거나, 방해하거나 억제하는 치료제로서 제조되고 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 치료 방법에서 사용되는 금 나노현탁액, 바람직하게는 CNM-Au8 나노현탁액은 희소돌기아교세포 분화, 증식 및 생존을 음성적으로 조절하는 병리학적 사건의 능력을 중단하거나, 감소시키거나, 방해하거나 억제하는 치료제로서 제조되고 사용될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태는 희소돌기아교세포 또는 수초의 파괴를 수반하는 질환, 장애 또는 손상을 치료하기 위해 희소돌기아교세포 증식 또는 생존을 유도하는 방법으로서, 축삭 연장의 억제를 감소시키고/시키거나, 수초화를 촉진하고/하거나 탈수초화를 완화시키기에 충분한 양으로 CNM-Au8 나노현탁액으로부터 금 나노결정을 상기 질환, 장애 또는 손상 부위에서 또는 이 부위 근처에서 포유동물에게 전달하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

본 발명의 치료 방법에서, 금 나노현탁액은 경구 투여, 주사 및/또는 코를 통해 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 금 나노현탁액, 바람직하게는 CNM-Au8 나노현탁액은 볼루스 주사 또는 장기간 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 예를 들면, 경막내 또는 경막외 배치에 의해 중추신경계 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 수초 손상이 발현되는 만성 병변 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CNM-Au8 나노현탁액은 포유동물의 혈류 내로 직접적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있거나 완화될 수 있는 질환 또는 장애는 포유동물 뉴런의 수초형성부전 또는 탈수초화와 관련된 질환, 장애 또는 손상을 포함한다. 구체적으로, 이러한 질환 및 장애는 뉴런을 둘러싸는 수초가 존재하지 않거나, 불완전하거나, 적절하게 형성되지 않거나 악화되는 질환 및 장애를 포함한다. 이러한 질환은 진행성 핵상마비, 알렉산더병, 크라베병, 이염성 백질이영양증, 칸반병, 백질이영양증, 뇌척수염, 중심성 뇌교 수초용해증(CPM), 항-MAG 질환, 펠리체우스-메르츠바허병, 레프숨병, 코케인 증후군, 젤베거 증후군, 귈랭-바레 증후군(GBS), 반 데르 크나프 증후군, 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 다초점 운동 신경병증(MMN), 시신경 척수염(NMO), 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 연령 관련 인지 감퇴로서도 공지된 경미한 인지 손상(MCI), 왈러 변성, 및 일부 유전 질환, 예컨대, 부신백질이영양증, 알렉산더병 및 펠리체우스 메르츠바허병(PMZ)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있거나 완화될 수 있는 질환 또는 장애는 희소돌기아교세포의 사멸, 또는 증식 또는 분화의 결여와 관련된 질환, 장애 또는 손상을 포함한다. 이러한 질환은 진행성 핵상마비, 알렉산더병, 크라베병, 이염성 백질이영양증, 칸반병, 백질이영양증, 뇌척수염, 중심성 뇌교 수초용해증(CPM), 항-MAG 질환, 펠리체우스-메르츠바허병, 레프숨병, 코케인 증후군, 젤베거 증후군, 귈랭-바레 증후군(GBS), 반 데르 크나프 증후군, 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 다초점 운동 신경병증(MMN), 시신경 척수염(NMO), 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 연령 관련 인지 감퇴로서도 공지된 경미한 인지 손상(MCI), 왈러 변성, 및 일부 유전 질환, 예컨대, 부신백질이영양증, 알렉산더병 및 펠리체우스 메르츠바허병(PMZ)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있거나 완화될 수 있는 질환 또는 장애는 신경퇴행성 질환 또는 장애를 포함한다. 이러한 질환은 진행성 핵상마비, 알렉산더병, 크라베병, 이염성 백질이영양증, 칸반병, 백질이영양증, 뇌척수염, 중심성 뇌교 수초용해증(CPM), 항-MAG 질환, 펠리체우스-메르츠바허병, 레프숨병, 코케인 증후군, 젤베거 증후군, 귈랭-바레 증후군 (GBS), 반 데르 크나프 증후군, 연령 관련 인지 감퇴로서도 공지된 경미한 인지 손상(MCI), 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 다초점 운동 신경병증(MMN), 시신경 척수염(NMO), 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 왈러 변성, 및 일부 유전 질환, 예컨대, 부신백질이영양증, 알렉산더병 및 펠리체우스 메르츠바허병(PMZ)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있거나 완화될 수 있는 추가 질환, 장애 또는 손상의 예는 척수 손상, 만성 골수병증 또는 신경근병증, 외상성 뇌 손상, 운동 신경 질환, 축삭 전단, 타박상, 마비, 방사선 후 손상 또는 화학요법의 다른 신경학적 합병증, 뇌졸중, 큰 열공, 중간 내지 큰 혈관 폐색, 백질병변, 급성 허혈성 시신경병증, 비타민 E 결핍(단독 결핍 증후군, AR, 바센-콤즈베이그(Bassen-Komzweig) 증후군), B12, B6(피리독신-펠라그라), 티아민, 폴레이트, 니코틴산 결핍, 마르키아파바-빅나미(Marchiafava-Bignami) 증후군, 이염성 백질이영양증, 삼차 신경통, 벨(Bell) 마비, 또는 축삭 재생, 재수초화 또는 희소돌기아교세포 생존 또는 분화/증식을 요구할 임의의 신경 손상을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

실시예 2

쿠프리존 탈수초화 모델 - 16 마우스 파일럿 연구

이 파일럿 연구의 목적은 51 ppm까지 농축되고 무제한적으로 소비된 "CNM-Au8" 나노결정 현탁액이 마우스 뇌에서 뉴런의 쿠프리존-유도된 탈수초화 동안 전형적으로 일어나는 수초 손상(또는 복구)의 양 또는 정도에 영향을 미치는지를 확인하는 것이었다. 쿠프리존 마우스 모델은 그 자체가 병리학적으로 탈수초화 또는 수초형성부전을 발현하는 다수의 질환들을 위해 포유동물에서 수초 손상을 시뮬레이션하기 위한 것이다.

총 16마리의 C57BL6 수컷 마우스들을 표 2에 표시된 바와 같이 4개의 군(군 당 4마리)으로 분리하였다. 2마리의 추가 마우스들을 백업으로서 사용하였고 본 연구에서 필요하지 않았다. 상기 마우스들은 본 연구의 시작 시 8주령이었다.

독성 쿠프리존을 도입함으로써 탈수초화를 유도하고 금 나노현탁액으로 치료함으로써 탈수초화의 가능한 감소 및/또는 재수초화의 촉진을 관찰하기 위해, 4개의 군들 중 2개의 군들에게 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급하였다. CNM-Au8 나노현탁액(51 ppm의 금 나노결정 농도)을 표 2에 표시된 바와 같이 군 3 및 4(치료군 및 대조군 둘다)의 모든 마우스들에게 (마우스를 위한 유일한 음용 액체로서) 무제한적으로 제공하였다. 연구 동안 모든 마우스들을 관찰하였고 임의의 비정상적인 행동을 기록하였다.

표 2에 표시된 바와 같이, 5주의 연구 후 모든 마우스들을 안락사시켰다. 4개의 군들 각각에서, 4마리 마우스들 중 3마리 마우스들로부터의 뇌의 예정된 영역을 (예를 들면, 존재하는 수초의 상대적인 양을 측정하기 위한) 면역염색을 위해 고정시켰다. 구체적으로, 브레그마(bregma)-0.82 mm부터 브레그마-1.82 mm까지의 두정 영역이 이 동물 모델에서 관심있는 일차 영역이다^1,2. 각각의 군에서 4마리 마우스들 중 3마리 마우스들에 대한 뇌의 이 부분들을 문헌에서 논의된 바와 같이 수초 단백지질 단백질("PLP")의 존재에 대해 염색하였다³. 염색 결과는 도 13a 내지 13c에 표시되어 있다. 각각의 군에서 4번째 마우스로부터의 뇌를 상이하게 프로세싱하고 투과 전자 현미경관찰("TEM") 연구를 위해 특별히 준비하였다.

축삭은 뇌의 뇌들보 영역에 고도로 밀집되어 있고, 이 영역은 TEM 연구를 위한 초점 영역이었다. 뇌들보 영역으로부터 채취된 축삭/수초의 9개 이상의 대표적인 TEM 영상들이 군 1 내지 4 각각으로부터의 단일 마우스에 대해 각각 도 14a 내지 14d에 표시되어 있다. 각각의 마우스 뇌에 대한 뇌들보 내에서 관찰된 축삭/수초 전형적 변이를 보여주기 위해 9개 이상의 TEM 영상들이 도 14a 내지 14d 각각에서 제공되어 있다. 이 연구로부터 도 13a 내지 13c 및 14a 내지 14d에 표시된 결과는 CNM-Au8 나노결정 현탁액이 마우스 뇌에서 브레그마-0.82 mm와 브레그마-1.82 mm 사이의 관찰된 영역에서 수초 손상 및/또는 수초 복구의 양에 유리한 영향을 미쳤다는 것을 암시하고(예를 들면, 도 14b의 군 2와 도 14d의 군 4를 비교함); CNM-Au8 나노현탁액이 일반 사료와 함께 단독으로 제공되었을 때 존재하는 수초의 양에 불리한 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다는 것은 상당히 중요하다(예를 들면, 도 14c - 군 3 참조).

재료 및 방법

동물 준비 및 탈수초화의 유도

수컷 C57BL6 마우스를 할란 랩스(Harlan Labs)로부터 입수하였다. 5주 연구를 시작하기 전에 모든 마우스들을 7일 내지 11일 동안 관찰하였다. 마우스들을 주 당 1회 정기적으로 우리에서 유지하였고 행동 변화에 대해 모니터링하였고 5주 연구 전 및 동안에 주 당 1회 체중을 측정하였다. 도 19는 군 1 내지 4 각각에 대한 연구 동안 마우스 당 평균 체중 획득을 보여준다. 모든 군들에서 마우스들은 원하는 만큼 많이 또는 적게 먹고 마시는 것이 허용되었다. 구체적으로, 모든 음식, 물 및 CNM-Au8(51 ppm의 금) 처리 현탁액을 무제한적으로 제공하였다. 소비된 물 및 CNM-Au8 처리 현탁액의 양을 매일 기록하였다. 군 1 내지 4 각각에서 마우스들에 대한 매일 소비된 액체의 평균 양이 도 18에 표시되어 있다. 새로운 물 및 새로운 CNM-Au8 나노현탁액을 매일 제공하였다.

할란 랩스(TD 06172)로부터 입수되고 표준 사료 펠렛 내로 미리 혼합된 0.2% 쿠프리존(비스-사이클로헥사논 옥살디하이드라존)을 함유하는 사료 펠렛(본원에서 "쿠프리존 사료"로서 지칭됨)을 8주령의 수컷 C57BL6 마우스에게 공급함으로써 탈수초화를 유도하였다. 대조군 정규식 사료 펠렛은 매주 바뀐 반면, 쿠프리존 사료는 48시간마다 바뀌었다. 표 2에 따라 쿠프리존 사료를 군 2 및 4의 마우스들에게 5주 기간 동안 제공하였다. 4마리 마우스들이라는 군 크기가 4개의 군들 각각을 위해 사용되었는데, 이때 2마리의 마우스들만이 이 수컷 마우스들의 공격적인 성질로 인해 각각의 우리에 수용되었다.

이 파일럿 연구에서, 27 게이지 및 0.5 인치 바늘로 나트륨 펜토바르티탈을 복막 내로 주사함으로써 나트륨 펜토바르티탈(80 mg/kg)을 사용하여 마우스를 마취시켰다. 뇌 허혈을 최소화하기 위해, 각각의 마우스가 의식을 잃은 직후 관주 단계를 시작하였다. 마우스 뇌에 대해 면역염색을 수행할 것인지 아니면 TEM 현미경사진술을 수행할 것인지에 따라 관주 완충제의 2개 상이한 세트를 사용하였다. 면역염색과 관련된 관주는 4℃에서 연동 펌프를 통해 마우스 순환계 내로 순차적으로 통과된, 총 50 ㎖의 냉각된 식염수(dH₂O 중의 0.9% NaCl)에 이어서 총 150 ㎖의 고정제(4% 파라포름알데하이드("PFA"))를 사용하였다. 투과 전자 현미경사진술과 관련된 관주는 유사하게 50 ㎖의 냉각된 식염수에 이어서 총 150 ㎖의 고정제(0.1 M 카코딜레이트 중의 3.5% PFA 및 1.5% 글루타르알데하이드)를 사용하였다. 연동 펌프는 약 8 내지 10 ㎖/분의 속도로 각각의 액체를 전달하였다. 관주 단계 전체 동안 연동 펌프 튜빙에서 임의의 기포의 형성을 피하기 위해 주의를 기울였다.

충분한 관주를 달성하기 위해, 각각의 마우스 심장의 우측 심방을 작은 가위로 절개하여 개방하였다. 그 다음, 각각의 심장의 우측 심실 부분을 핀셋으로 조심스럽게 붙잡으면서 나비 바늘을 좌측 심실의 정점 내로 삽입하였고 펌프는 상기 언급된 액체를 펌핑하기 시작하였다. (면역염색을 위한) 파라핀 블록 마운팅을 위해 각각의 군에서 3마리 마우스들로부터의 뇌를 준비한 반면, TEM 현미경사진술을 위해 각각의 군으로부터의 1마리 마우스 뇌를 준비하였다. 일단 각각의 마우스 뇌가 제거되면, 문헌에 따라 각각의 뇌를 미리 제조된 냉각된(4℃) 완충제에서 각각 후-고정시키고 면역염색을 위해 파라핀-포매시켰거나 TEM 현미경사진술을 위해 수지-포매시켰다⁴.

면역조직화학

PLP의 면역염색을 위해, 도 12a 및 12b에 표시된 바와 같이 주문제작 홀더를 이용하여 브레그마-0.82 mm와 브레그마-1.82 mm 사이에서 7 ㎛ 두께의 일련의 두정 뇌 박편을 제조한 후 분석하였다.

구체적으로, 각각의 마우스 뇌를 먼저 한천 블록 내에 포매시켰다. 약 40 g의 한천 분말(트립틱 대두(Tryptic Soy) 한천, REF 236950, BD)을 약 1 ℓ의 정제수와 철저히 혼합한 후, 혼합물을 빈번히 교반하면서 가열하고 약 1분 동안 끓여 분말을 완전히 용해시켰다. 도 12a에 표시된 바와 같이, 주형(301)을 베이스(302) 내에 장착시켰다. 그 다음, 마우스 뇌를 장착된 주형(301) 내에 배치하였다. 가열된 한천/물 혼합물의 온도가 실온보다 약간 더 높은 온도까지 냉각되었을 때, 장착된 주형(301)을 충전시켰다. 약 2분 내지 3분 후, 주형(301)을 베이스(302)로부터 들어 올리고, 뇌를 함유하는 한천 블록을 형성하였다.

그 다음, 한천 블록을 홀더(303) 내에 배치하고 각각의 마우스의 머리에 상응하는 뇌의 부분이 절단 가장자리(304)를 향하도록 상기 뇌의 부분을 위치시켰다. 그 다음, 도 12b에 표시된 바와 같이, 홀더(303)를 마우스의 꼬리에 상응하는 뇌의 위치 쪽으로 이동시키고 브레그마-0.82에 상응하는 위치에서 위치시켰고, 절단 가장자리(304)를 따라 뇌를 칼날로 박편화하였다. 그 다음, 홀더(303)를 뇌의 꼬리 부분 쪽으로 약 1 mm 이동시킨 후, 절단 가장자리(304)를 브레그마-1.82에 위치시켰다. 그 다음, 뇌 블록을 동일한 칼날로 절단 가장자리(304)에서 다시 절단하여 브레그마-0.82와 브레그마-1.82 사이에서 1 mm 두께 슬라이스를 생성하였다.

앞서 참조된 방법³에 따라, 파라핀-포매된 박편을 탈왁싱하고 재수화하고 유리 용기 내에 수용된 상태에서 10 mM 시트레이트 완충제(pH 6.0)로 부분적으로 충전시킨 후, 완충제가 끓기 시작할 때까지 통상적인 1.65 KW 가정용 마이크로파에서 마이크로파-가열하였다. 그 다음, 뇌 박편을 0.3% H₂O₂로 켄칭하고, 3% 정상 말 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에서 약 1시간 동안 차단하였다. 그 다음, 뇌 박편을 약 1:500의 희석률에서 PLP에 대한 일차 항체, 즉 마우스 IgG(AbD 세로텍(Serotec))와 접촉된 상태로 4℃에서 밤새 항온처리하였다. IgG는 뇌의 경질막 부분을 제외한 마우스 뇌에 거의 존재하지 않기 때문에 일차 항체로서 마우스 IgG를 선택하였다.

세척 완충제(PBS 완충제, pH 7.4)로 세척한 후, 두정 뇌 박편을 바이오티닐화된 항-마우스 IgG 이차 항체(벡터 라보라토리스(Vector Laboratories)로부터 구입됨)와 함께 약 1시간 동안 더 항온처리한 후, 약 30분 동안 퍼록시다제-커플링된 아비딘-바이오틴 복합체(ABC 키트, 벡터 라보라토리스)에 노출시켰다. 그 다음, 각각의 박편이 퍼록시다제-커플링된 아비딘-바이오틴 복합체와 DAB 사이에 일어난 반응의 양에 따라 색채를 대략 밝은 갈색 내지 어두운 갈색으로 변화시키도록 디아미노-3,3' 벤지딘("DAB", 벡터 라보라토리스)으로서 지칭되는, 퍼록시다제-커플링된 아비딘-바이오틴 복합체와 반응하는 것으로서 공지된 물질을 뇌 박편과 접촉시켰다. 보다 어두운 갈색은 존재하는 보다 많은 수초에 상응하였다. 도 13b는 군 1 내지 4 각각의 마우스에 대한 대표적인 수초 염색된 두정 뇌 박편을 보여준다. 관찰된 각각의 뇌 박편의 총 면적 크기(즉, 각각의 슬라이드 상에 존재하는 모든 뇌 물질의 총 횡단면적)를 측정하기 위해, 갈색으로 염색된 박편에 인접하여 위치하는 일련의 추가 뇌 슬라이드 표본들을 (상기 논의된 바와 같이) PLP 항체로 염색하였고 헤마톡실린으로도 염색하였는데, 이것은 뇌 박편이 (이미 존재하는 갈색 이외에) 청색을 띠게 하였다. 도 13c는 군 1 내지 4 각각의 1마리 마우스에 대한 대표적인 수초+ 헤마톡실린 염색된 뇌 박편을 보여준다.

구체적으로, 각각의 마우스 뇌의 두정 부분에서 면역양성 PLP의 양을 정량하기 위해, 두정 박편(즉, 브레그마-0.82 mm와 브레그마-1.82 mm 사이의 박편)을 조사하였다. 가시적으로 관찰된 음영의 정도(즉, 밝은 갈색 내지 어두운 갈색)와 관련된 숫자를 주관적으로 배정하기보다는 오히려 본 발명자들에 의해 개발된 독특한 방법을 이용하였다.

먼저, 특별히 개조된 캐논 스캐너(2400 dpi의 출력 해상)가 도 13b에 표시된 각각의 갈색 염색된 두정 뇌 박편을 스캐닝하였다. 그 다음, 스캔에서 각각의 화소를 평가하고 (포토샵으로) 1 내지 255의 값을 자동으로 배정하였는데, 이때 "255"는 가장 밝은 음영에 상응하고 "1"은 가장 어두운 음영에 상응한다. 그 다음, 데이터를 엑셀로 내보내었다. 그 다음, 1 내지 255의 숫자로 배정된 화소의 총수를 표로 작성하여 막대그래프를 달성하였다. 그 다음, 각각의 막대그래프에 대한 데이터를 분석하였고, 각각의 수초-염색된 두정 슬라이드에서 "색채" 또는 "음영"의 양에 대한 정량적 가중 평균을 측정하였다. (배경 음영에 대해 적절하게 보정된) 이 정량적 수치는 각각의 수초-염색된 두정 슬라이드에서 동등한 영역에 대한 색채의 양을 직접적으로 비교하는 능력을 발생시켰다. 색채 또는 음영 측정 내로의 배경 유입을 해명하기 위해, 인접한 일련의 두정 박편을 음성 대조군으로서 사용하였다. 구체적으로, 일차 항체 IgG를 사용하지 않고 인접한 일련의 두정 박편을 염색하였다.

추가로, 각각의 마우스 군에서 각각의 마우스에 대해 조사된 뇌의 두정 박편에 존재하는 수초의 양(즉, 색채 또는 음영 강도)(탈수초화의 예방 및/또는 재수초화의 촉진이라는 일부 양태와 상관관계를 가질 수 있음)을 유의하게 과학적으로 비교하기 위해, 각각의 두정 박편에 존재하는 뇌 물질의 총량(즉, 횡단면적)을 측정할 필요도 있었다. 따라서, 도 13c에 표시된, 각각의 두정 슬라이드 상의 총 뇌 물질 면적은 색채/뇌 물질 면적의 총량이 정량될 수 있고 표준화하기 위해 결정될 필요가 있었다. 그 다음, 단위 면적 당 색채의 양을 이용하여 존재하는 수초의 상대적인 양을 직접적으로 비교하였다. 따라서, 헤마톡실린을 사용하여 또 다른 바로 인접한 일련의 두정 박편에서 모든 뇌 물질을 염색하였다. 이들 뇌 박편들을 유사하게 정량하였고, 첫 번째 두정 슬라이드에서 측정된 "색채의 총량"(즉, 밝음 또는 어두움)을 병치된 또는 일련의 두정 슬라이드에서 측정된 (최소 역치 양보다 더 높은 청색 및 밝은 또는 어두운 갈색 강도 둘다로 표시되는) 존재하는 뇌 물질의 총 횡단면적과 비교하여 뇌 물질의 단위 면적 당 색채 또는 음영의 총량을 측정하였다.

전술된 바와 같이, 4개의 마우스 군들이 존재하였고, 염색 목적으로 각각의 군은 3마리 마우스들을 가졌다. 염색 강도가 매우 큰 수의 샘플들에 대해 염색 단계를 수행할 때 상이할 수 있는 환경 조건의 함수로서 상이할 수 있기 때문에, 실험 결과가 왜곡되지 않도록 염색 또는 색채 강도 편차를 표준화하는 데에 많은 주의를 기울였다. 잘 공지된 하기 단계들 및 확립된 단계들을 실질적으로 문헌에 따라 수행하였다.

요약하건대, 일단 뇌 물질의 단위 면적 당 색채 또는 음영의 양이 측정되면, 음성 대조군(상기 언급된 일차 항체의 사용 없이 수득된 상응하는 색채 또는 음영 강도)을 각각의 결과로부터 차감하였다.

나아가, 정량을 위해, 3개 별개의 염색 세트를 디자인하고 사용하였다. 각각의 세트는 동일한 염색 특성의 4개 회분(batch)을 함유하였다. 각각의 회분은 각각의 군으로부터의 1개 샘플 및 1개 음성 대조군을 함유하였다. 각각의 샘플의 염색을 4회 반복하여 염색의 4개 회분을 생성하였다. 마지막으로, 군 1로부터의 3개 샘플들 및 음성 대조군을 다섯 번째 회분에서 염색하였다.

각각의 회분에서 색채 또는 음영의 상대적인 밀도를 각각의 회분에서 상응하는 군 1 샘플에 대한 상대적인 백분율로서 먼저 제시하였다. 군 1로부터의 3개 샘플들에서 표준화 계수를 다섯 번째 회분에서의 염색에 따라 샘플 1의 상대적인 비로서 표현하였다.

추가로, 각각의 회분에서 상대적인 밀도를 그들의 상응하는 (계산된) 표준화 계수와 곱함으로써 군 1 - 샘플 1에 대한 상대적인 밀도를 다시 계산하였다.

마지막으로, 각각의 샘플에서 4개의 회분으로부터 군 1 - 샘플 1에 대한 상대적인 밀도의 평균을 계산하였고 막대그래프로서 작도된 "상대적인 PLP 밀도"라는 것을 확인하였다(도 13a 참조). 수초 염색의 모든 결과는 도 13a 내지 13c에 표시되어 있다.

투과 전자 현미경법을 위한 마우스 뇌 박편의 제조

관주 후, 샘플을 4℃에서 4시간 내지 6시간 동안 상기 언급된 고정제에서 후-고정시킨 후, 카코딜레이트 완충제(0.1 M, pH 7.4)로 3회 세척하고 4℃에서 2일 내지 3일 동안 동일한 완충제에서 저장하였다.

도 12에 표시된 주문제작 홀더/절차를 이용하여 브레그마-0.82 mm와 브레그마-1.82 mm 사이의 뇌 박편으로부터 두정 슬라이드를 절단하였다.

구체적으로, 각각의 마우스 뇌를 먼저 한천 블록 내에 포매시켰다. 약 40 g의 한천 분말(트립틱 대두 한천, REF 236950, BD)을 약 1 ℓ의 정제수와 철저히 혼합한 후, 혼합물을 빈번히 교반하면서 가열하고 약 1분 동안 끓여 분말을 완전히 용해시켰다. 도 12a에 표시된 바와 같이, 주형(301)을 베이스(302) 내에 장착시켰다. 그 다음, 마우스 뇌를 장착된 주형(301) 내에 배치하였다. 가열된 한천/물 혼합물의 온도가 실온보다 약간 더 높은 온도까지 냉각되었을 때, 장착된 주형(301)을 충전시켰다. 약 2분 내지 3분 후, 주형(301)을 베이스(302)로부터 들어 올리고, 뇌를 함유하는 한천 블록을 형성하였다.

그 다음, 한천 블록을 홀더(303) 내에 배치하고 각각의 마우스의 머리에 상응하는 뇌의 부분이 절단 가장자리(304)를 향하도록 상기 뇌의 부분을 위치시켰다. 그 다음, 도 12b에 표시된 바와 같이, 홀더(303)를 마우스의 꼬리에 상응하는 뇌의 위치 쪽으로 이동시키고 브레그마-0.82에 상응하는 위치에서 위치시켰고, 절단 가장자리(304)를 따라 뇌를 칼날로 박편화하였다. 그 다음, 홀더(303)를 뇌의 꼬리 부분 쪽으로 약 1 mm 이동시킨 후, 절단 가장자리(304)를 브레그마-1.82에 위치시켰다. 그 다음, 뇌 블록을 동일한 칼날로 절단 가장자리(304)에서 다시 절단하여 브레그마-0.82와 브레그마-1.82 사이에서 1 mm 두께 슬라이스를 생성하였다.

슬라이드 조직을 4℃에서 약 40분 동안 카코딜레이트 완충제 중의 1.5% 칼륨 페로시아나이드 및 1% 오스뮴 테트록사이드에서 후-고정시켰다. 카코딜레이트 완충제로 3회 세척한 후, 조직 블록을 4℃에서 약 1시간 동안 카코딜레이트 완충제 중의 1% 오스뮴 테트록사이드에서 다시 후-고정시킨 후 dH₂O로 3회 세척하였다. 블록을 실온에서 약 40분 동안 dH₂O 중의 1% 우라닐 아세테이트에서 마지막으로 후-고정시켰다. 그 다음, 탈수 단계를 수행한 후, 블록을 약 5분 동안 30% 에탄올에 담구고 약 5분 동안 50% 에탄올에 담구고 약 5분 동안 70% 에탄올에 2회 담구고 약 5분 동안 80% 에탄올에 2회 담구고 약 10분 동안 95% 에탄올에 2회 담구고 각각 약 10분, 20분 및 30분 동안 100% 에탄올에 3회 담구고 약 5분 동안 산화프로필렌에 2회 담구고 약 60분 동안 산화프로필렌 플러스 수지(1:1 비)에 담구고 마지막으로 실온에서 밤새 수지 내에 배치하였다. 그 다음, 샘플을 37℃에서 약 1시간 동안 수지와 함께 항온처리한 후 37℃에서 약 1시간 동안 수지 플러스 DMP 촉매와 함께 항온처리하고 마지막으로 약 60℃에서 약 48시간 동안 수지 플러스 DMP 촉매 내에 포매시켰다.

슬라이드 조직을 뇌의 중간 시상(矢狀) 평면에서 절단하고, 중간 시상 평면이 위치하는 표면을 따라 매우 얇은 박편을 절단하였다. 초박편제작기(레이처트 정 울트라컷, 카포바니 브라더스 인코포레이티드(Reichert Jung Ultracut, Capovani Brothers Inc.); 뉴욕주 스코틱 소재)를 이용하여 약 90 nm 두께로 측정되는 박편을 수득하였고, 투과 전자 현미경(TEM, 제이스 리브라(Zeiss Libra) 120)으로 현미경사진을 수득하였다.

G-비 측정 및 정량

제공된 TEM 소프트웨어(제이스 리브라 120)를 이용하여 4개의 군들 각각에서 두 신경 축삭의 횡단면적 및 무작위적으로 선택된 100개의 축삭의 총 면적(즉, 조합된 축삭 및 수초의 횡단면적)을 측정한 후, 특별히 개조된 소프트웨어를 이용하여 내부 직경 및 외부 직경을 평가하였다(즉, 축삭/수초 코팅의 관찰된 횡단면적이 동심원인 것으로 가정하였다). 계산된 축삭 직경을 합산된 축삭 및 수초의 계산된 총 외부 직경으로 나눔으로써 G-비를 계산하였다. G-비의 분포는 그래프패드 소프트웨어를 이용함으로써 산점도로서 도 16에 표시되어 있다.

데이터를 훨씬 더 명확히 제시하기 위해, G-비의 정규 분포 곡선을 엑셀로 작도하였다. 구체적으로, 도 17a 내지 17d는 군 1 내지 4 각각에 대한 막대그래프를 보여준다. 평균 및 표준편차에 따라 무작위 숫자의 세트를 생성하였고, "무작위 막대그래프-빈도(Histogram-Frequency Random)"로서 명명된 막대그래프를 생성한 후, 실제 데이터를 사용하여 "원래의 막대그래프-빈도(Histogram-Frequency Orignial)"로서 명명된 또 다른 막대그래프를 작도하였다. 그 다음, 무작위 분포 곡선과 원래의 분포 곡선 사이의 차이를 각각의 군에서 비교하였다.

PLP 면역염색의 정량

도 13a 내지 13d에 표시된 바와 같이, 5주의 쿠프리존 공급 후, 군 2 마우스들은 예를 들면, 군 1, 3 및 4에 존재하는 수초에 비해 현저한 수초 상실을 보였으므로, 이것은 군 2에 대한 표 2에 기재된 조건이 두정 축삭의 적어도 일부의 탈수초화를 야기하는 데에 성공적이었다는 것을 암시한다. 군 1 마우스들(물 및 대조군 정규식 사료)에 존재하는 수초의 양과 군 2 마우스들(물 및 쿠프리존 사료)에 존재하는 수초의 양 사이의 구체적인 비교는 통계적으로 유의한 수초 상실을 보여주었다(p<0.01). 추가로, 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 소비하고 상기 5주 중 3주 동안에만 무제한적으로 CNM-Au8(51 ppm)을 사용한 처리를 제공받은 군 4 마우스들은 존재하는 보다 많은 수초를 보여주었는데, 이것은 수초 보존 및/또는 재수초화를 암시한다(군 2와 군 4의 비교, p<0.005). 본원의 다른 부분에서 논의된, 예를 들면, 도 14d의 TEM 영상에 표시된 존재하는 수초의 양도 참조한다.

TEM 현미경사진술 연구로부터의 수초 관찰

도 14a 내지 14d는 4마리 상이한 마우스들에 대한 뇌들보 영역, 즉 군 1 내지 4 각각으로부터의 1마리 마우스로부터의 영역들의 대표적인 부분의 횡단면적의 대표적인 TEM 현미경사진을 보여준다. 표 2에 기재된 군 1, 2, 3 및 4에 대한 매트릭스 조건은 후보 치료제(예컨대, CNM-Au8 금 나노현탁액)가 임의의 유리한 치료 또는 예방 결과, 예컨대, 탈수초화의 예방 또는 지연 및/또는 재수초화의 촉진을 보일 수 있는지를 확인할 수 있게 하는 기간 이내에 쿠프리존 탈수초화 연구에서 기대되는 데이터와 일치하는 데이터, 즉 군 2에서의 측정가능한 수초 상실을 발생시키는 듯하였다.

이들 4마리 마우스들에서 대표적인 뇌들보 뇌 조직 횡단 샘플들을 처음에 약 16,000배 배율에서 TEM으로 관찰하였다(축적 막대가 실제 배율을 나타내는 각각의 현미경사진 상에 존재한다). 각각의 마우스의 뇌들보 내의 수백 개의 영역들을 조사하여 TEM 현미경사진의 대표적인 세트를 수득하였다. 따라서, 4마리 마우스들의 뇌들보로부터 수득된 횡단면적의 대표적인 영상이 도 14a 내지 14d에 표시되어 있다(즉, 9개 또는 10개의 영상이 각각의 도면에 표시되어 있다). 육안만을 이용하였을 때, 수초의 두께 및 축삭의 특성은 대조군 정규식 사료를 제공받은 2개의 군들(즉, 대조군(군 1)과 CNM-Au8만을 사용한 치료군(군 3)) 사이에 매우 유사하였다. 그러나, 대조적으로, 쿠프리존 사료 및 물을 제공받은 마우스 군(군 2)은 뇌들보에서 관찰된 횡단면의 부분에 존재하는 보다 적은 총 수초(예를 들면, 표시된 축삭의 손상 및/또는 탈수초화를 암시함)를 명확히 보여주었다. 문헌과 일치하여, 쿠프리존 사료에 의해 야기된 수초 분해는 가시화된 뇌들보 횡단면적에서 수초/축삭에 대한 균일하지 않은 효과를 갖는다는 것(즉, 균질하지 않다는 것)을 발견하였다. 구체적으로, 이 연구에서 관찰된 뇌들보 횡단면에서 가시화된 횡단면적 중 대략 40% 미만의 횡단면적이 약간의 수초 손상을 나타낸 듯하였지만, 남은 횡단면적은 대조군과 유사(즉, 군 1과 유사)한 듯하다. 이것은 전형적이고 문헌의 다른 부분에서 보고된 쿠프리존 마우스 모델 연구와 일치한다는 것을 인지해야 한다.

군 4 마우스의 뇌들보 횡단면적의 TEM 현미경사진은 큰 관심을 끈다. 이 마우스는 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 제공받았고 연구의 3주 내지 5주 동안 CNM-Au8 현탁액 무제한 치료를 제공받았다. 도 14d의 TEM 현미경사진은 탈수초화된 축삭이 존재하더라도 거의 존재하지 않았고 존재하는 수초의 총량이 대조군(군 1)에 존재하는 수초의 총량과 유사하였다는 것을 보여준다. 이 관찰결과는 도 13a 내지 13d에 기재된 바와 같이 군 1 내지 4 각각의 3마리 마우스들에 대한 염색된 두정 뇌 박편의 면역염색 결과에 의해 포착되었을 때 존재하는 수초의 총량에 상응한다. 구체적으로, 마우스 군 1, 3 및 4 각각의 3마리 마우스들의 두정 박편에 대한 도 13a 내지 13d에 표시된 PLP 염색의 상대적인 양은 쿠프리존 사료 및 물을 소비한 군 2의 3마리 마우스들에 대한 PLP 염색의 상대적인 양보다 더 높다(즉, 존재하는 보다 많은 수초에 상응한다).

G-비 측정 및 G-비의 분포

G-비 측정 및 정량은 축삭 상에 존재하는 수초 코팅(즉, 축삭 수초화)의 상대적인 양의 기능적 및 구조적 지수로서 널리 사용된다. G-비가 높을수록 수초가 축삭 직경에 비해 얇아지고; 반대로, G-비가 낮을수록 수초가 축삭에 비해 두꺼워진다. 따라서, 전형적으로 정상 범위 내에서 보고된 G-비가 낮을수록 더 우수하다. 구체적으로, 뇌의 뇌들보 영역에 대한 수초화된 축삭에 대한 평균 G-비 범위는 0.75 내지 0.81의 범위 내에 있다고 보고되어 있다⁵.

본 연구에서 측정된 G-비는 도 15에 보고되어 있다. 가장 높은 보고된 G-비는 군 2, 즉 쿠프리존 사료 및 물을 소비한 마우스들에서 발생한다. 군 2 마우스들에 대한 보고된 G-비는 다른 군들의 보고된 G-비보다 더 높았다. 가장 낮은 보고된 G-비는 군 1 마우스들, 즉 대조군 정규식 사료 및 물을 공급받은 마우스들에 대한 G-비이다.

흥미롭게도, 군 1 마우스들(물 및 쿠프리존 사료)과 군 3 마우스들(CNM-Au8 현탁액 무제한 및 대조군 정규식 사료) 사이의 G-비 비교는 차이를 거의 보여주지 않았는데, 이 결과는 각각 도 14a 및 14c의 TEM 영상과 일치한다. 이들 추가 데이터는 CNM-Au8 현탁액이 존재하는 수초의 양에 대한 임의의 측정가능한 부정적인 부작용을 갖지 않았다는 것도 암시한다.

보고된 G-비를 더 이해하기 위해, 군 1 내지 4 각각에 대한 데이터 산점도를 생성하였다. 도 16에 표시된 바와 같이, 군 2 마우스들(예를 들면, 덜 건강하거나 부정적으로 변형된 축삭 기능에 상응할 수 있는 보다 높은 G-비)은 3개의 다른 마우스 군들에 비해 가장 높은 데이터 분산을 나타내었다. 남은 3개의 마우스 군들에서의 데이터 분산은 매우 유사하였는데, 이때 군 1과 군 3 사이에 관찰된 효과 차이는 없었다.

G-비 데이터를 훨씬 더 정량하기 위해, 상기 데이터를 도 17a 내지 17d에서 상이하게 표현하였다. 구체적으로, 4개의 마우스 군들 각각에서 G-비 데이터의 연속적 확률 분포를 보여주기 위해 종 형태의 곡선을 생성하고 작도하였다. 도 17a 내지 17d에서 4개의 선은 (내부 대조군으로서 효과적으로 생성된) 그 군에 대한 G-비 데이터 "평균" 및 G-비 데이터의 표준편차로부터 생성된 "무작위 막대그래프-빈도"로 표지된 곡선을 각각 포함한다. 추가로, 도 17a 내지 17d에서 4개의 선은 실제 G-비 데이터로부터 생성된 "원래의 막대그래프-빈도"로 표지된 곡선도 각각 포함한다.

도 17a 내지 17d에 작도된 데이터는 "무작위 막대그래프-빈도" 선 및 "원래의 막대그래프-빈도" 선이 군 1, 3 및 4 각각에 대해 매우 유사하다는 것을 보여준다. 대조적으로, 쿠프리존 사료를 소비한 마우스들(즉, 군 2)은 원래의 G-비 데이터와 관련된 2개의 큰 피크들을 보여준다. 더욱이, "원래의 막대그래프-빈도" 곡선은 "무작위 막대그래프-빈도" 분포 곡선과 꽤 상이하다. 흥미롭게도, 군 4의 마우스들에게 무제한적으로 제공된 CNM-Au8 치료 현탁액은 쿠프리존 사료에 의해 불리한 영향을 받은 마우스들에 비해 곡선의 차이를 최소화하는 듯하였다. 군 4 마우스들과 관련된 데이터의 경우, "원래의" 분포 곡선은 그의 "무작위" 분포 곡선과 기본적으로 유사한데, 이때 매우 작은 피크만이 곡선의 보다 높은 비 한계에서 나타난다.

결론

상기 데이터는 하기 사실들을 암시한다:

1. 5주 동안 쿠프리존 사료 및 물을 제공받은 마우스들은 본 발명자들이 의도한 수초 상실 또는 손상(예를 들면, 탈수초화)를 발생시켰다(즉, 표 2로부터의 군 2).

2. 대조군 정규식 사료 및 CNM-Au8 현탁액을 무제한적으로 제공받은 마우스들(즉, 군 3)은 대조군 정규식 사료 및 물을 제공받은 마우스들(군 1)에 비해 임의의 비정상적인 행동 또는 측정된 수초 차이를 보여주지 않았다.

3. 무제한적으로 제공된 CNM-Au8 치료 현탁액은 모든 5주 동안 쿠프리존 사료에 노출되었고 연구의 마지막 3주 동안 CNM-Au8 현탁액(51 ppm의 금 농도)에 노출된 군 4의 마우스들의 존재하는 수초의 양에 긍정적인 영향을 미쳤다(예를 들면, 수초 손상을 감소시켰고/시켰거나 재수초화를 촉진하였다).

실시예 3

쿠프리존 탈수초화 모델 - 2주/5주 - 105 마우스 연구

요약

이 105 마우스 연구의 목적은 (1) 약 50 ppm의 금 농도에서 물병으로부터 무제한적 치료제로서(연구에서 마지막 3주 또는 모든 5주 동안 마우스를 위한 유일한 음용 액체로서) 마우스에게 제공되었거나, (2) 약 1000 ppm의 금 농도에서 (연구의 마지막 3주 또는 모든 5주 동안) 위관영양 치료에 의해 마우스에게 제공된(마우스 체중 kg 당 약 10 ㎖("10 ㎖/kg")의 CNM-Au8 나노현탁액의 부피로 각각의 마우스의 체중을 기준으로 1일 1회 제공된) "CNM-Au8" 나노현탁액이 치료 유효량 또는 예방 유효량으로서 작용하여 뇌들보에 존재하는 수초 손상의 양에 영향을 미치고/미치거나 뇌들보에서 적어도 일부 축삭의 재수초화를 촉진하는지를 확인하는 것이었다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 수초 손상은 쿠프리존 사료를 섭취하는 마우스에 의해 유도되었다.

표 3에 표시된 바와 같이, 총 105마리의 C57BL6 수컷 마우스들을 7개의 군들(군 당 15마리 마우스들)로 분리하였다. 마우스들은 연구 시작 시 약 8주령이었다.

수초 손상(예를 들면, 수초의 음성 반응 및/또는 탈수초화)를 유도하기 위해, 실시예 2에서 논의된 쿠프리존 사료와 동일한 쿠프리존 사료를 상기 7개의 군들 중 6개의 군들(즉, 군 2 내지 7)에게 공급하였다. 7개의 마우스 군들, 및 7개의 마우스 군들이 노출된 각각의 조건은 간단히 후술되어 있을뿐만 아니라 표 3에도 요약되어 있다.

군 1 . 군 1의 15마리 마우스들은 연구의 모든 5주 동안 정규식을 소비하였고(즉, 쿠프리존 사료를 공급받지 않았고) 연구의 모든 5주 동안 물도 마신 후, 본원에 기재된 바와 같이 프로세싱되었다.

군 2 . 군 2의 15마리 마우스들은 연구의 2주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 동일한 2주 동안 물을 마신 후, 본원에 기재된 바와 같이 2주 후 프로세싱되었다.

군 3 . 군 3의 15마리 마우스들은 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 모든 5주 동안 물을 마신 후, 본원에 기재된 바와 같이 프로세싱되었다.

군 4 . 군 4의 15마리 마우스들은 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 모든 5주 동안 약 1000 ppm의 금 결정 농도로 농축된 CNM-Au8 현탁액을 약 10 ㎖/kg의 치료 부피로 1일 1회 위관영양에 의해 제공받은 후, 제공된 금 나노현탁액이 예방 유효량인지를 확인하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 프로세싱되었다.

군 5 . 군 5의 15마리 마우스들은 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 처음 2주 동안 물을 마신 후, 다음 3주 동안 약 1000 ppm의 결정성 금 농도로 농축된 CNM-Au8 현탁액을 약 10 ㎖/kg의 치료 부피로 1일 1회 위관영양에 의해 제공받은 후, 제공된 금 나노현탁액이 치료 유효량인지를 확인하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 프로세싱되었다.

군 6 . 군 6의 15마리 마우스들은 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 모든 5주 동안 약 50 ppm의 결정성 금 농도로 치료 CNM-Au8 현탁액을 물로부터 무제한적으로 마신 후, 제공된 금 나노현탁액이 효과적인 치료제로서 작용하는지를 확인하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 프로세싱되었다.

군 7 . 군 7의 15마리 마우스들은 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 처음 2주 동안 물을 마신 후, 연구의 다음 3주 동안 약 50 ppm의 금 농도로 치료 CNM-Au8 현탁액을 물로부터 무제한적으로 마신 후, 제공된 금 나노현탁액이 효과적인 치료제로서 작용하는지(예를 들면, 치료 유효량으로서 작용하는지)를 확인하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 프로세싱되었다.

재료 및 방법

동물 준비 및 수초 손상의 유도

수컷 C57BL6 마우스들을 타코닉 팜스(Taconic Farms)로부터 입수하였다. 2/5주 연구를 시작하기 전에 모든 마우스들을 2주 내지 4주 동안 순화시켰다. 마우스들을 정기적으로 우리에서 유지하였고 행동 변화에 대해 모니터링하였다. 마우스들의 체중을 연구 시작 전에 측정한 후 연구 동안 주 당 2회 측정하였다. 도 22는 군 1 내지 7 각각의 마우스들에 대한 마우스 당 평균 체중 획득을 보여준다.

군 1 내지 7 각각의 15마리 마우스들은 원하는 만큼 많이 또는 적게 먹고 마시는 것이 허용되었다. 구체적으로, 모든 음식, 물 및 CNM-Au8(50 ppm의 금 농도) 처리 현탁액을 상기 언급된 바와 같이 무제한적으로 제공하였거나 위관영양(1000 ppm의 금 농도)으로 제공하였다. 새로운 물 및 새로운 CNM-Au8 현탁액을 매일 제공하였다.

27 게이지 및 0.5 인치 바늘을 이용하여 아버틴(Avertin)을 복막 내로 주사함으로써 아버틴(250 내지 400 mg/kg)을 사용하여 모든 마우스들을 마취시켰다. 뇌 허혈을 최소화하기 위해, 각각의 마우스가 의식을 잃은 직후 관주 단계를 시작하였다. 사용된 관주 완충제는 루페(loupe)(확대경)를 이용하여 각각의 마우스를 관찰하였을 때 간이 완전히 깨끗하게 될 때까지 최대 50 ㎖의 냉각된 식염수(dH₂O 중의 0.9% NaCl)에 이어서 총 약 150 내지 180 ㎖의 고정제(0.1 M 카코딜레이트 중의 3.5% PFA 및 1.5% 글루타르알데하이드)를 사용하였다. 연동 펌프는 약 4 내지 6 ㎖/분의 속도로 각각의 액체를 전달하였다. 관주 단계 전체 동안 연동 펌프 튜빙에서 임의의 기포의 형성을 피하기 위해 주의를 기울였다.

충분한 관주를 달성하기 위해, 각각의 마우스 심장의 우측 심방을 작은 가위로 절개하여 개방하였다. 그 다음, 바늘을 좌측 심실의 정점 내로 삽입하였고 펌프는 상기 언급된 액체를 펌핑하기 시작하였다. 150 ㎖ 이상의 PFA(글루타르알데하이드)가 통과한 후, 연동 펌프를 중단하였다. 가위를 이용하여 머리를 제거하고 두개골 내로 작은 절개를 만든 후, 뇌가 용이하게 제거될 수 있을 때까지 조금씩 잘라내었다. 일단 각각의 마우스 뇌가 제거되면, 문헌에 따라 각각의 뇌를 미리 제조된 냉각된(4℃) 완충제에서 각각 후-고정시키고 TEM 현미경사진술을 위해 수지-포매시켰다⁴.

관주를 위한 원재료는 하기 공급원으로부터 입수되었다:

(1) (EM을 위한) 나트륨 카코딜레이트 삼수화물: 시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 카탈로그 #: C0250-100G

(2) 파라포름알데하이드 EM 등급, 프릴(Prill) 정제됨, 1 kg: 테드 펠라(Ted Pella), 카탈로그 #: 18501

(3) 글루타르알데하이드, 50% EM 등급, 10 X 10 ㎖: 테드 펠라, 카탈로그 #: 18431

(4) 멸균 필터 유닛: 피셔 사이언티픽, 카탈로그 #: 09-740-2A

투과 전자 현미경법을 위한 마우스 뇌 박편의 제조

관주 후, 샘플을 4℃에서 4시간 내지 6시간 동안 상기 언급된 고정제에서 후-고정시킨 후, 카코딜레이트 완충제(0.1 M, pH 7.4)로 3회 세척하고 4℃에서 2일 내지 3일 동안 동일한 완충제에서 저장하였다.

카코딜레이트 완충제로부터 뇌를 제거하고 티슈 종이 상에 배치하였다. 면도날을 시상으로 뇌의 중심선 내에 삽입하였다. 상기 중심선 내에 여전히 위치한 면도날을 이용하여 뇌를 도 21a에 표시된 시상 마우스 뇌 매트릭스(109) 내에 배치하고, 면도날을 시상 마우스 뇌 매트릭스(109)의 중심 홈(111) 내로 안내하였다. 시상 마우스 뇌 매트릭스(109)는 1 mm 간격으로 분리된 13개의 홈들로 구성된다. 뇌를 이동시키지 않으면서 제2 칼날을 중심 홈으로부터 우측으로 2 mm 떨어진 홈(110R) 내에 삽입하였고, 제3 칼날을 중심 홈으로부터 좌측으로 2 mm 떨어진 홈(110L) 내에 삽입하였다. 도 20b, 20c 및 20d에 표시된 바와 같이, 뇌 조직의 2개 거울 슬라이드(103a 및 103b)를 만들었다. 그 다음, 도 20c 및 20d에 표시된 바와 같이, 2 mm의 직경을 갖는 원통형 조직 블록(104R 및 104L)을 해리스 유니-코어(Harris Uni-Core)(테드 펠라, 제품 # 15076)로 절단하였다. 뇌들보(105R 및 105L)의 후방 부분(즉, 팽대(splenium) 부분)이 조직 슬라이드(103a 및 103b)를 통해 뻗어 있도록 원통형 조직 블록(104R 및 104L)을 위치시켰다. 뇌의 중심 시상 평면 상에 존재하는 조직 블록 표면을 표지하였고, 이 표면 상에서 EM 박편을 절단할 것이다.

블록 조직을 4℃에서 40분 동안 카코딜레이트 완충제 중의 1.5% 칼륨 페로시아나이드 및 1% 오스뮴 테트록사이드에서 후-고정시켰다. 카코딜레이트 완충제로 3회 세척한 후, 조직 블록을 4℃에서 약 1시간 동안 카코딜레이트 완충제 중의 1% 오스뮴 테트록사이드에서 다시 후-고정시킨 후 dH₂O로 3회 세척하였다. 블록을 실온에서 약 40분 동안 dH₂O 중의 1% 우라닐 아세테이트에서 마지막으로 후-고정시켰다. 그 다음, 탈수 단계를 수행한 후, 블록을 약 5분 동안 30% 에탄올에 담구고 약 5분 동안 50% 에탄올에 담구고 약 5분 동안 70% 에탄올에 2회 담구고 약 5분 동안 80% 에탄올에 2회 담구고 약 10분 동안 95% 에탄올에 2회 담구고 각각 약 10분, 20분 및 30분 동안 100% 에탄올에 3회 담구고 약 5분 동안 산화프로필렌에 2회 담구고 약 60분 동안 산화프로필렌 플러스 수지(1:1 비)에 담구고 마지막으로 실온에서 밤새 수지에 담구었다. 그 다음, 샘플을 37℃에서 약 1시간 동안 수지와 함께 항온처리한 후 37℃에서 약 1시간 동안 수지 플러스 DMP 촉매와 함께 항온처리하고 마지막으로 약 60℃에서 약 48시간 동안 수지 플러스 DMP 촉매 내에 포매시켰다.

초박편제작기(레이처트 정 울트라컷, 카포바니 브라더스 인코포레이티드; 뉴욕주 스코틱 소재)를 이용하여 약 90 nm 두께로 측정되는 박편을 수득하였고, 투과 전자 현미경("TEM", 제이스 리브라 120)으로 현미경사진을 수득하였다.

2주 동안 쿠프리존 사료에 노출시킨 후 뇌들보에서의 축삭 수초 손상의 양 및 유형을 평가하기 위해 군 2의 15마리 마우스들이 2주 동안 쿠프리존 사료를 먹고 물만을 마시게 한 후 이 마우스들을 종결시켰고; 다른 6개의 군들에서 다른 90마리의 마우스들을 표 3에 기재된 바와 같이 5주 후 모두 종결시켰다.

7개의 마우스 군들 각각에서, 각각의 마우스로부터의 뇌의 예정된 영역을 추출을 위해 표적화하였다. 쿠프리존 치료에 민감한 축삭이 뇌의 뇌들보 영역에 고도로 밀집되어 있고, 이 영역은 모든 TEM 연구를 위한 초점 영역이었다. 그 다음, 여러 상이한 정량적 및 정성적 평가 기법들을 이용하여 촬영된 대다수의 TEM 영상들을 관찰하고 정량하였다.

I. 4,000배 및 5,000배에서 촬영된 뇌들보 TEM 영상들 사이의 비교

TEM 영상의 제1 세트는 가장 낮은 배율에서 촬영되었고(처음에 4,000배 내지 5,000배에서 촬영되었고) TEM 세트는 도 23 내지 29로서 나타난다. 이들 영상들 각각은 각각의 마우스 뇌의 전체 뇌들보 영역의 작은 부분을 대표한다. 추가로, 이들 영상들은 무작위적으로 선택되지 않았고, 오히려 이들이 수초에 대한 가장 광범위한 손상을 보여준 뇌들보의 영역(들)에 상응하기 때문에 선택되었다.

독성 쿠프리존 모델은 전체 뇌들보에 걸쳐 균일한 수초 손상을 초래하지 않으므로, 숙련된 작업자가 쿠프리존 사료로 인한 가장 큰 양의 손상을 나타내는 부분들을 선택하기 위해 대단히 주의를 기울였다는 것을 다시 인지한다.

모두 처음에 4,000배에서 촬영된 도 23a, 23b 및 23c는 군 1 마우스들로부터의 마우스 뇌에 상응한다. 도 23의 TEM 현미경사진은 도 24 내지 29의 모든 다른 TEM 현미경사진들에 비해 뇌들보 축삭에 존재하는 수초의 가장 많은 양을 보여준다. 광범위한 탈수초화 또는 수초형성부전의 영역은 이들 군 1 마우스들의 뇌들보 영역 내의 어느 위치에서도 확인될 수 없었다.

모두 처음에 4,000배에서 촬영된, 군 2 마우스들에 상응하는 TEM 현미경사진은 도 24a 내지 24e에 표시되어 있다. 이들 대표적인 TEM 영상들은 도 23a 내지 23c(즉, 대조군인 군 1)에 비해 존재하는 보다 적은 수초의 영역을 보여준다. 뇌들보에 존재하는 보다 적은 수초의 여러 영역들을 보여주는 군 2 마우스 뇌의 영역들이 존재하였고; 이러한 영역들은 도 23a 내지 23c로 표시된 대조군(군 1) 영상에서 관찰되지 않았다는 것을 인지해야 한다.

도 24a 내지 24e의 현미경사진에서 표시된 다수의 축삭들이 대조군인 군 1에서 관찰되고 사진촬영된 임의의 축삭보다 더 큰 직경을 갖는 듯하다는 것도 인지해야 한다. 일부 축삭들 상에서 관찰된 비정상적인 보다 두꺼운 수초는 독성 쿠프리존 사료에 대한 반응일 가능성이 있다. 특히 도 24a, 24d 및 24e를 참조한다.

군 3 마우스들(즉, 5주 동안 쿠프리존 사료를 제공받은 마우스들)의 뇌에 상응하는 TEM 현미경사진은 도 25a 내지 25g에 표시되어 있다. 모두 처음에 4,000배에서 촬영된 이들 대표적인 TEM 영상들은 2주 동안에만 쿠프리존 사료를 소비한 군 2 마우스들에 비해 훨씬 더 적은 수초가 존재하는 뇌들보의 영역을 보여준다. 추가로, 대조군인 군 1로부터의 마우스들에서 관찰되고 현미경사진촬영된 임의의 축삭보다 더 큰 직경 및 더 얇은 수초를 갖는 훨씬 더 많은 축삭들이 존재하는 듯하다. 특히 도 25d, 25e, 25f 및 25g를 참조한다. 수초 손상은 2주 내지 6주의 쿠프리존-유도된 탈수초화 동안의 확립된 발견이고¹³, 축삭 회전타원체, 예컨대, 본원에서 관찰된 축삭 회전타원체는 이미 보고되어 있다¹⁴. 추가로, 큰 관찰된 축삭 팽창은 수초의 상실에 대한 반응일 수 있다.

예방 치료 군으로부터의 마우스의 뇌에 상응하는 TEM 영상들은 도 26a 내지 26e에 표시되어 있고, 모든 영상들은 처음에 4,000배에서 촬영되었다. 군 4의 마우스들은 5주 동안 쿠프리존 사료를 제공받았고 마우스 체중 kg 당 10 ㎖의 나노현탁액의 양(즉, 10 ㎖/kg)으로 CNM-Au8 나노현탁액에 존재하는 1000 ppm(1000 ㎍/㎖) 금 농축물을 1일 1회 위관영양으로 제공받았다. 도 25a 내지 25g(즉, 군 3)에 표시된 영상과 마찬가지로 수초 손상의 영역이 군 4 TEM 영상에서는 발견될 수 없었다. 사실상, 군 4로부터의 TEM 영상은 대조군인 군 1로부터의 TEM 영상과 다소 유사하였다(비교를 위해 도 23a 내지 23c 참조).

추가로, 도 26a 내지 26e 각각에 존재하는 백색 화살표(201)는 문헌에 따라 재수초화와 일치하는 특성을 나타내는 축삭에 상응한다⁸. 구체적으로, 이들 표시된 축삭들(201)은 유사한 또는 보다 큰 횡단면적의 다른 축삭에 비해 얇고 어두운 소형 수초를 보여준다.

군 5 마우스들로부터의 마우스 뇌에 상응하는 TEM 영상들은 도 27a 내지 27d에 표시되어 있다. 이들 TEM 영상들은 TEM 영상에서 축적 막대 상에 표시된 바와 같이 처음에 4,000배 및 5,000배 둘다에서 촬영되었다. 도 26a 내지 26e의 영상들과 마찬가지로 이들 영상들도 군 3 마우스들의 탈수초화된 영역들처럼 광범위한 수초 손상의 임의의 영역을 갖지 않는다(예를 들면, 군 5 마우스들에서 광범위한 수초 손상 또는 탈수초화를 나타내는 현저히 감소된 양의 영역들이 존재한다). 군 5 마우스들은 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 3주 내지 5주 동안 1000 ppm(1000 ㎍/㎖)의 농도 및 10 ㎖/kg의 양으로 1일 1회 위관영양에 의해 CNM-Au8 나노현탁액을 치료제로서 제공받았다. 분명히, 도 27a 내지 27d는 상기 언급된 CNM-Au8 나노현탁액의 위관영양이 군 3의 마우스들에 비해 군 5의 마우스들에 대한 치료 효과(예를 들면, 이익)를 가졌다는 것을 보여준다.

추가로, 도 27a 내지 27d 각각에 존재하는 백색 화살표(201)는 문헌에 따라 재수초화되는 것으로 생각되는 축삭에 상응한다⁸. 구체적으로, 이들 표시된 축삭들(201)은 유사한 또는 보다 큰 횡단면적의 다른 축삭들에 비해 얇고 어두운 소형 수초를 보여준다.

군 6 마우스들로부터의 마우스 뇌에 상응하는 TEM 영상들은 도 28a 내지 28g에 표시되어 있다. 이들 TEM 영상들도 상기 영상에서 축적 막대 상에 표시된 바와 같이 처음에 4,000배에서 촬영되었다. 도 26a 내지 26e의 영상들과 마찬가지로 이들 영상들도 군 3 마우스들에서 관찰된 바람직하지 않은 영역들과 유사하게 광범위한 수초 손상 또는 탈수초화를 나타내는 현저히 감소된 양의 영역들 또는 대역들을 보여준다. 군 6 마우스들은 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 모든 5주 동안 50 ppm 금(50 ㎍/㎖)의 농도로 CNM-Au8 예방 나노현탁액을 치료제로서 무제한적으로 제공받았다. 분명히, 50 ㎍/㎖의 CNM-Au8 나노현탁액의 무제한적 노출은 군 3의 마우스들의 경우 관찰된 수초에 비해 군 6의 마우스들의 경우 수초에 대한 예방 효과 및/또는 치료 효과 중 어느 하나 또는 둘다를 가졌다.

추가로, 도 28a 내지 28g 각각에 존재하는 백색 화살표(201)는 문헌에 따라 재수초화되는 것으로 생각되는 축삭들에 상응한다⁸. 구체적으로, 이들 표시된 축삭들은 유사한 또는 보다 큰 횡단면적의 다른 축삭들에 비해 얇고 어두운 소형 수초를 보여준다.

군 7 마우스들에 상응하는 TEM 영상들은 도 29a 내지 29d에 표시되어 있다. 이들 TEM 영상들은 상기 영상에서 축적 막대 상에 표시된 바와 같이 처음에 4,000배에서 촬영되었다. 도 26a 내지 26e의 영상들과 마찬가지로 이들 영상들도 군 3 마우스들에서의 바람직하지 않은 영역들과 유사하게 광범위한 수초 손상 또는 탈수초화를 나타내는 현저히 감소된 양의 영역들을 보여준다. 군 7 마우스들은 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 3주 내지 5주 동안 50 ppm 금(50 ㎍/㎖)의 농도로 CNM-Au8 치료 나노현탁액을 치료제로서 무제한적으로 제공받았다. 분명히, 50 ㎍/㎖의 CNM-Au8 나노현탁액의 무제한적 노출은 군 3의 마우스들에 비해 군 7의 마우스들에 대한 예방 효과 및/또는 치료 효과 중 어느 하나 또는 둘다를 가졌다.

추가로, 도 29a 내지 29d 각각에 존재하는 백색 화살표(201)는 문헌에 따라 재수초화되는 것으로 생각되는 축삭들에 상응한다⁸. 구체적으로, 이들 표시된 축삭들은 유사한 또는 보다 큰 횡단면적의 다른 축삭들에 비해 얇고 어두운 소형 수초를 보여준다.

이들 데이터는 쿠프리존 사료가 마우스 뇌의 뇌들보 영역에서 일부 탈수초화된 축삭을 초래하였고 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액이 포유동물의 경우 축삭의 탈수초화의 양을 감소시키고/시키거나 축삭의 재수초화를 발생시키는 데에 효과적인 (치유 및 예방) 치료제이었다는 것을 암시한다.

II. 단위 면적 당 탈수초화된 축삭의 수의 정량

쿠프리존 사료로 인한 수초 손상의 양에 대한 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액의 임의의 긍정적인 치료 효과가 존재하는지를 확인하는 또 다른 방법은 축삭에 존재하는 탈수초화된 축삭 및/또는 명확히 손상된 수초의 수를 카운팅하고 마우스 군 1 내지 7 각각에서 탈수초화된 축삭의 수를 비교하는 것이다. 이 방법은 군 1 내지 7 각각에서 마우스들로부터의 마우스 뇌의 뇌들보 영역으로부터 무작위적으로 촬영된 일련의 유사한 배율(즉, 처음에 16,000배에서 촬영된) TEM 영상들을 관찰함으로써 용이해진다. 군 1 내지 7에 대한 연구 세부사항은 이미 논의된 바와 같이 표 3에 기재되어 있다. 이 방법은 탈수초화된 축삭을 수초화되지 않은 축삭으로부터 구별한 후 각각의 마우스 군에서 (단위 면적 당) 탈수초화된 축삭의 수를 비교하고자 한다.

요약하건대, 이 방법에서 가장 작은 전체적으로 수초화된 축삭(즉, 가장 작은 횡단면적을 갖는 전체적으로 수초화된 축삭)이 백색 별모양 번호(203)로 각각의 TEM 영상에서 확인된다. 이 가장 작은 전체적으로 수초화된 축삭(203)은 각각의 개별 TEM 현미경사진에서 출발 "기준 축삭"으로서 작용한다. 그 다음, 모든 수초화되지 않은 축삭, 탈수초화된 축삭, 및/또는 기준 축삭(203)과 거의 동일한 횡단면적 또는 이 기준 축삭보다 더 큰 횡단면적을 갖는 명확히 손상된 수초를 함유하는 축삭은 "탈수초화된" 것으로서 분류된 후, 적절한 표시에 의해 확인된다. 그 다음, 표시된 축삭은 이하에서 더 상세히 논의된 바와 같이 개별적으로 카운팅되고 합산된다.

균질하지 않은 뇌들보의 상이한 부분들이 서로 다소 상이한 듯 보일 수 있기 때문에 기준 축삭(203) 크기는 각각의 TEM 현미경사진에서 다소 변할 수 있다. 일단 대조군인 군 1에 대한 "탈수초화된" 축삭의 평균 수가 측정되면, 그 평균 수는 일종의 "배경 노이즈(noise)"로서 작용하고 그 평균 수는 군 2 내지 7 각각에서 탈수초화된 축삭의 "가중 평균" 수로부터 차감된다. 기준 축삭 방법을 이용함으로써 국소 뇌들보 근처의 보다 정확한 이해를 수득하여 손상된 또는 탈수초화된 축삭을 보다 정확히 카운팅하고 나타낼 수 있다고 생각된다.

구체적으로, 도 30a는 대조군인 군 1로부터의 마우스의 뇌들보 영역으로부터 무작위적으로 촬영된 대표적인 TEM 현미경사진(처음에 16,000배에서 촬영됨)을 보여준다. 이 TEM 현미경사진에서 가장 작은 횡단면적의 전체적으로 수초화된 축삭이 백색 별모양으로 표시되어 있고 203S로 번호 매겨져 있다. 숙련된 작업자에 의해 확인된 이 기준 축삭(203S)은 이 도 30a의 TEM 현미경사진에서 기준 축삭이 된다.

일단 이 가장 작은 전체적으로 수초화된 축삭이 숙련된 작업자에 의해 이 TEM 영상에서 기준 축삭(203S)으로서 선택되면, 동일한 숙련된 작업자가 실제 TEM 영상을 나타내는 터치 스크린 컴퓨터 스크린을 이용하고 스타일러스(stylus)로 상기 스크린을 터치하고, 직사각형 흑색 상자를 기준 축삭(203S)에 상응하는 스크린의 부분에 겹쳐놓는다(이로써 TEM 현미경사진 상에 겹쳐놓는다). 일단, 기준 축삭(203S)이 확인되면, 숙련된 작업자에 의해 (1) 기준 축삭(203S)과 동일한 횡단면적을 갖고 수초화되어 있지 않거나(즉, 명확히 정의된 수초를 결여하거나, 수초가 명확히 손상되어 있거나), (2) 기준 축삭(203S)보다 더 큰 횡단면적을 갖고 수초화되어 있지 않은(즉, 명확히 정의된 수초를 결여하거나, 수초가 명확히 손상되어 있는) 것으로 판단되는 모든 다른 축삭들은 동일한 방식으로 터치 스크린 디스플레이를 터치함으로써 (도 30a에서 흑색 상자로서 표시된) 또 다른 흑색 직사각형 상자로 표시되어 있다. 작업자가 모든 이러한 (1) 및 (2) 축삭을 표시하는 것을 마무리할 때, 소프트웨어 프로그램은 각각의 현미경사진 상에서 모든 직사각형 상자들(즉, 숙련된 작업자에 의해 표시된 모든 축삭 (1) 및 (2)에 상응하고 숙련된 작업자에 의해 손상된 것으로서 판단되는 모든 직사각형 상자들)을 자동적으로 카운팅한다. 도 30a는 각각의 흑색 상자를 가리키는, 그 위에 겹쳐진 백색 화살표 숫자(202S)도 갖는다. 이들 백색 화살표들(202S)은 판독자가 축삭 (1) 및 (2) 중 어느 것이 흑색 상자로 표시되어 있는지(즉, 숙련된 작업자에 의해 손상된 것으로서 확인된 축삭)를 확인하는 것을 보조하기 위해 추가되었다. 그러나, 백색 화살표는 모든 자동 합산(예를 들면, 손상된 또는 탈수초화된 축삭 (1) 및 (2)의 수의 카운팅)이 일어난 후 수동으로 추가된다.

도 30b는 도 30a에 표시된 현미경사진과 동일한 TEM 현미경사진인데, 이때 백색 별모양은 기준 축삭(203)을 확인하고 백색 화살표(202)는 일단 흑색 상자를 함유하는 축삭을 표시하지만, 흑색 상자가 제거되면 백색 화살표(202)만이 남는다. 도 30b 내지 도 36b에 표시된 남은 TEM 현미경사진들 전부에서, 모든 흑색 상자들이 제거되어 있다. 그러나, 나중에 수동으로 추가된 백색 화살표(202)는 각각의 TEM 현미경사진에서 상이한 기준 축삭(203)을 참고함으로써 확인되었을 때 숙련된 작업자에 의해 손상된 것으로 판단된 축삭 (1) 및 (2)에 상응한다.

따라서, 도 30b는 대조군인 군 1의 마우스의 뇌들보의 대표적인 횡단면을 보여준다. 도 30b는 기준 축삭으로 단일 백색 별모양(203), 및 숙련된 작업자에 의해 손상된 것으로서 확인된 탈수초화된 축삭 (1) 및 (2)에 상응하는 12개의 백색 화살표(202)를 보여준다.

유사하게, 도 30c는 대조군인 군 1의 마우스의 뇌들보의 또 다른 대표적인 횡단면에 상응한다. 이 경우, 기준 축삭(203)도 동일한 방식으로 백색 별모양(203)으로 표시되고, 탈수초화된 축삭 (1) 및 (2) 각각도 백색 화살표 숫자(202)로 표시된다. 도 30c는 11개의 탈수초화된 축삭을 보여준다.

마찬가지로, 도 31a 및 31b는 군 2의 대표적인 마우스들로부터 촬영된 2개의 대표적인 TEM 현미경사진(마찬가지로 16,000배에서 촬영됨)을 보여주고, 도 31a의 각각의 TEM 영상에서 백색 별모양으로 유사한 기준 축삭(203) 및 15개의 탈수초화된 축삭(202)도 확인시켜주고, 도 31b에서 17개의 탈수초화된 축삭(202)도 확인시켜준다.

유사한 방식으로, 군 3 내지 7 각각으로부터의 마우스들도 이들 군들 각각에서 마우스들로부터 촬영된 뇌들보의 2개 유사한 대표적인 TEM 현미경사진들로 표시되어 있다.

도 32a 및 32b는 각각 기준 축삭(203) 및 23개의 탈수초화된 축삭(202); 및 20개의 탈수초화된 축삭(202)을 보여주는, 군 3으로부터의 마우스들의 뇌들보의 대표적인 TEM 영상에 상응한다.

도 33a 및 33b는 각각 기준 축삭(203) 및 17개의 탈수초화된 축삭(202); 및 19개의 탈수초화된 축삭(202)을 보여주는, 군 4로부터의 마우스들의 뇌들보의 대표적인 TEM 영상에 상응한다.

도 34a 및 34b는 각각 기준 축삭(203) 및 13개의 탈수초화된 축삭(202); 및 15개의 탈수초화된 축삭(202)을 보여주는, 군 5로부터의 마우스들의 뇌들보의 대표적인 TEM 영상에 상응한다.

도 35a 및 35b는 각각 기준 축삭(203) 및 18개의 탈수초화된 축삭(202); 및 15개의 탈수초화된 축삭(202)을 보여주는, 군 6으로부터의 마우스들의 뇌들보의 대표적인 TEM 영상에 상응한다.

도 36a 및 36b는 각각 기준 축삭(203) 및 15개의 탈수초화된 축삭(202); 및 14개의 탈수초화된 축삭(202)을 보여주는, 군 7로부터의 마우스들의 뇌들보의 대표적인 TEM 영상에 상응한다.

표 4는 유사한 방식으로 조사된, 도 30 내지 36에 표시된 대표적인 현미경사진들과 유사한 TEM 현미경사진들의 총수를 요약 형태로 보여준다. 이와 관련하여, 예를 들면, 45개의 총 TEM 현미경사진들을 군 1의 마우스들에 대해 조사하였다. 추가로, 군 1에 대해 조사된 45개의 TEM 현미경사진들에서 총 419개의 탈수초화된 축삭을 카운팅하였다. 표 4의 네 번째 칸에는 "현미경사진 당 카운팅된 탈수초화된 축삭의 가중 평균"이 기재되어 있고 군 1의 경우 이 평균이 "10"이었다고 기재되어 있다. 가중 평균은 다음과 같이 수득되었다는 것을 인지해야 한다.

군 1 내지 7 각각 내에서, 각각의 마우스로부터의 대표적인 뇌들보 샘플을 다수의 위치에서 사진촬영하였다. 뇌들보의 각각의 샘플에 대해, 모든 현미경사진들에서 "카운팅된 탈수초화된 축삭의 총수"를 합산하였고, 각각의 샘플에 대해 현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 평균 수를 측정하였다(결과는 표시되어 있지 않음). 일부 관주 단계들에서의 가변성으로 인해, 일부 뇌들보 샘플들은 카운팅을 위해 사용될 수 있는 보다 많은 수의 보다 우수한 질의 현미경사진을 가졌다. 따라서, 뇌들보의 각각의 샘플에 대한 탈수초화된 축삭의 평균 수는 그 샘플의 현미경사진 세트의 질에 따라 중량을 배정받았다. 중량은 다음과 같이 측정되었다. 마우스 군으로부터의 뇌들보의 각각의 샘플에 대해, 그 샘플에 대해 확인된 탈수초화된 축삭의 수를 그 군에 대한 확인된 탈수초화된 축삭의 총수로 나누었다. 이것이 샘플 중량이다. 각각의 샘플 중량을 현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 샘플 평균과 곱하였다. 이들 가중 샘플 평균을 각각의 군에 대해 합산하였고 표 4에서 "현미경사진 당 카운팅된 탈수초화된 축삭의 가중 평균"으로서 보고하였다.

표 4의 마지막 칸에는 "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"이 기재되어 있다. 숫자는 이전 칸으로부터 "10"을 차감함으로써 결정되었는데, 이때 "10"은 현미경사진에서 "배경 노이즈"에 효과적으로 상응한다.

따라서, "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"에 대한 최대 숫자는 군 3에서 발생하는 반면, "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"에 대한 최소 숫자는 군 1(즉, 대조군)에서 발생한다.

종합하건대, 뇌들보의 대표적인 부분들의 총 313개의 TEM 현미경사진들을 군 1 내지 7 각각에서 상이한 수의 마우스들에 대해 검토하여, 약 4,200개로 카운팅된 탈수초화된 축삭의 총수를 수득하였다. 표 2는 각각의 마우스 군에 대해 카운팅된 탈수초화된 축삭의 가중 평균을 보고한다.

가능한 객관적이도록 의도된 방식으로 TEM 전자현미경사진 당 "탈수초화된" 축삭의 총수의 측정을 수행하였다는 것을 이해해야 한다. 이와 관련하여, 뇌들보의 무작위적으로 선택된 부분을 별도로 현미경사진촬영하였다. 그 다음, 축삭들 사이의 명확한 충분한 구별을 제공한 현미경사진들(모두 처음에 16,000배에서 촬영됨)은 "탈수초화된" 축삭을 카운팅하기 위한 후보 현미경사진이었다. 마우스 뇌들 중 일부는 샘플 준비 단계 동안 완전한 관주를 받지 않았고, 이로 인해 TEM 영상들 중 일부가 흐리거나 허용불가능한 인공물을 함유하였다는 것을 인지한다. 예를 들면, 판독하기에 너무 흐렸고/흐렸거나 너무 많은 인공물들을 함유하는 무작위적으로 선택된 현미경사진들 전부가 일단 제거되면, 모든 남은 TEM 현미경사진들은 상기 논의된 바와 같이 분석되었고 표 4에 요약되어 있다.

따라서, 군 4 내지 7 각각의 마우스들에 대해 사용된 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액들 각각이 (i) "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"을 군 3의 마우스들의 "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"보다 더 낮추었고; (ii) "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"을 대조군인 군 1의 마우스들의 "현미경사진 당 탈수초화된 축삭의 조절된 가중 평균"보다 더 높였다.

이들 데이터는 쿠프리존 사료가 마우스 뇌의 뇌들보 영역에서 일부 탈수초화된 축삭을 초래하였고 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액이 포유동물의 경우 축삭의 탈수초화의 양을 감소시키는 데에 효과적인 (치유 및 예방) 치료제이었다는 것을 암시한다.

III. 16,000배 및 40,000배에서 촬영된 영상에 표시된 축삭의 재수초화

쿠프리존 사료로 인한 수초 손상의 양에 대한 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액의 임의의 긍정적인 치료 효과가 존재하는지를 확인하는 또 다른 객관적인 방법은 임의의 재수초화가 군 1 내지 7 각각의 마우스들의 뇌의 뇌들보 영역에서 관찰될 수 있는지를 확인하는 것이다. 군 1 내지 7에 대한 연구 세부사항은 상기 논의된 바와 같이 표 3에 기재되어 있다.

이와 관련하여, 도 37 내지 40은 각각의 현미경사진 상에서 축적 막대로 표시된 바와 같이 16,000배 또는 40,000배에서 촬영된, 군 4 내지 7의 마우스들의 뇌들보의 대표적인 영역의 대표적인 TEM 현미경사진을 보여준다. TEM 영상 상에서 "201M"으로 표시된 축삭과 유사한 축삭이 군 1 내지 3의 마우스들의 뇌들보 부분에서 관찰되지 않았기 때문에 대표적인 TEM 영상이 예방 치료군 4 및 6, 및 치유 치료군 5 및 7만을 보여준다는 것을 인지한다. 구체적으로, 화살표(201M)는 문헌에 따라 재수초화된 축삭인 것으로 생각되는 얇고 어두운 소형 수초화된 영역을 가리킨다⁸. 군 1 내지 3의 마우스들에 상응하는 대표적인 현미경사진들에서는 축삭 상의 유사한 얇고 어두운 소형 영역이 발견되지 않았다.

도 37a 내지 37k는 16,000배 및 40,000배 둘다에서 촬영된, 군 4의 마우스들로부터의 TEM 영상에 상응한다. 이들 도면들은 다수의 화살표(201M)를 보여준다. 이들 화살표들(201M)은 문헌이 재수초화된 축삭으로서 간주하는 것을 향하고 있다⁸. 근처 또는 인접 축삭이 기준점으로서 사용될 수 있고 이들 인접 축삭들이 더 어두운 수초 영역을 갖지 않기 때문에 더 어두운 수초 영역은 샘플 준비 또는 TEM 영상화 공정의 인공물이 아니라는 것을 이해해야 한다.

도 38a 내지 38l은 16,000배 및 40,000배 둘다에서 촬영된, 군 5의 마우스들로부터의 TEM 영상에 상응한다. 이들 도면들은 다수의 화살표들(201M)을 보여준다. 이들 화살표들(201M)은 문헌이 재수초화된 축삭으로서 간주하는 것을 향하고 있다⁸. 근처 또는 인접 축삭이 기준점으로서 사용될 수 있고 이들 인접 축삭들이 유사한 더 어두운 수초 영역을 갖지 않기 때문에 더 어두운 수초 영역은 샘플 준비 또는 TEM 영상화 공정의 인공물이 아니라는 것을 이해해야 한다.

도 39a 내지 39j는 16,000배 및 40,000배 둘다에서 촬영된, 군 6으로부터의 TEM 영상에 상응한다. 이들 도면들은 다수의 화살표들(201M)을 보여준다. 이들 화살표들(201M)은 문헌이 재수초화된 축삭으로서 간주하는 것을 향하고 있다⁸. 근처 또는 인접 축삭이 기준점으로서 사용될 수 있고 이들 인접 축삭들이 유사한 더 어두운 수초 영역을 갖지 않기 때문에 더 어두운 수초 영역은 샘플 준비 또는 TEM 영상화 공정의 인공물이 아니라는 것을 이해해야 한다.

도 40a 내지 40g는 16,000배 및 40,000배 둘다에서 촬영된, 군 7로부터의 TEM 영상에 상응한다. 이들 도면들도 다수의 화살표들(201M)을 보여준다. 이들 화살표들(201M)은 문헌이 재수초화된 축삭으로서 간주하는 것을 향하고 있다⁸. 근처 또는 인접 축삭이 기준점으로서 사용될 수 있고 이들 인접 축삭들이 유사한 더 어두운 수초 영역을 갖지 않기 때문에 더 어두운 수초 영역은 샘플 준비 또는 TEM 영상화 공정의 인공물이 아니라는 것을 이해해야 한다.

화살표(201M)로 표시된 재수초화된 축삭의 존재는 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액이 포유동물의 경우 재수초화된 축삭을 달성하는(예를 들면, 군 1 내지 3의 마우스들에서 관찰된 유사한 뇌들보 영역 내의 축삭에 비해 재수초화된 축삭의 양을 증가시키는) 데에 효과적인 (치유 및 예방) 치료제이었다는 것을 암시한다.

IV. 축삭 상의 수초의 G-비 측정 및 정량

쿠프리존 사료로 인한 수초 손상의 양에 대한 CNM-Au8 금 나노결정 현탁액의 임의의 긍정적인 치료 효과가 존재하는지를 확인하는 또 다른 객관적인 방법은 문헌에 따라 군 1 내지 7 각각의 마우스들의 뇌의 뇌들보 영역에서 축삭 상의 수초의 G-비를 계산하고 비교하는 것이다^5,6. G-비 계산은 상이한 병리학적 효과를 평가하는 또 다른 인정된 수단이다.

구체적으로, G-비 측정 및 정량은 축삭 상에 존재하는 수초 코팅(즉, 축삭 수초화)의 상대적인 양의 기능적 및 구조적 지수로서 널리 사용된다. G-비가 높을수록 수초가 축삭 직경에 비해 얇아지고; 반대로, G-비가 낮을수록 수초가 축삭에 비해 두꺼워진다. 따라서, 전형적으로 정상 범위 내에서 보고된 G-비가 낮을수록 더 우수하다. 구체적으로, 뇌의 뇌들보 영역에 대한 수초화된 축삭에 대한 평균 G-비 범위는 0.75 내지 0.81의 범위 내에 있다고 보고되어 있다⁵.

도 41 내지 47은 영상에서 축적 막대 상에 표시된 바와 같이 처음에 40,000배에서 촬영된, 각각 군 1 내지 7 각각의 마우스들로부터의 뇌들보 영역의 대표적인 횡단면적의 대표적인 TEM 현미경사진들을 보여준다. 상기 논의된 바와 같이 군 1 내지 7에 대한 연구 세부사항은 표 3에 기재되어 있다.

요약하건대, 대표적인 TEM 영상으로부터 포착된 대표적인 축삭 상의 내부 및 외부 수초 직경을 트레이싱(tracing)으로 표시한 후, 본원에서 논의된 바와 같이 측정하고 합산하고 평균을 계산하고 사용하여 G-비를 측정하였다.

구체적으로, 7개의 군들 각각의 마우스들에 상응하는 마우스들의 신경 축삭을 함유하는 무작위적으로 선택된 횡단면적을 먼저 선택하였다. 그 다음, 무작위적으로 선택된 영역의 TEM 현미경사진을 처음에 40,000배에서 촬영하였다. 영상 J 소프트웨어를 이용하여 TEM 현미경사진 상에서 표시된 다수의 축삭들의 내부 둘레(204I) 및 외부 둘레(204O)를 먼저 컴퓨터 터치 스크린 상에서 스타일러스로 추적하였다. 그 다음, 스타일러스에 의해 생성된 트레이싱을 이용하여 추적된 축삭의 내부 둘레(204I) 및 외부 둘레(204O)를 측정하였다. 문헌에 따라, 축삭/수초 코팅의 관찰된 횡단면적은 동심원인 것으로 가정되었다.

(수초 내부 둘레에도 상응하고 본원에서 두 방식으로 지칭되는) 측정된 축삭 외부 둘레(204I)를 합산된 축삭 및 수초의 외부 둘레(204O)로 나눔으로써 G-비를 계산하였다.

도 41 내지 47은 내부 수초 둘레(204I) 및 외부 수초 둘레(204O)에 상응하는 트레이싱이 그 위에 겹쳐놓인, 뇌들보 내의 신경 축삭의 횡단면의 무작위적으로 선택된 대표적인 TEM 영상들 중 일부를 보여준다.

도 41a 내지 41c는 실시예 3의 군 1 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레(204I) 및 외부 둘레(204O)가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

도 42a 내지 42d는 실시예 3의 군 2 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레(204I) 및 외부 둘레(204O)가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

도 43a 내지 43c는 실시예 3의 군 3 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

도 44a 및 44b는 실시예 3의 군 4 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

도 45a 내지 45c는 실시예 3의 군 5 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

도 46a 및 46b는 실시예 3의 군 6 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

도 47a 내지 47e는 실시예 3의 군 7 마우스들의 뇌들보의 대표적인 부분에 상응하는 대표적인 TEM 현미경사진 영상을 보여준다. 이들 영상들은 수초의 내부 둘레 및 외부 둘레가 그 위의 각각의 축삭 상에서 표지되어 있는 것을 보여주는 고배율 40,000배 영상이다.

표 5는 상기 언급된 측정으로부터 수득된 결과의 요약을 함유한다. 구체적으로, 표 5는 G-비를 계산하기 위해 표시되고 합산되고 측정된 축삭의 총수를 보여준다. 군 1에서 낮게는 77개의 축삭들에 대한 측정을 수행한 반면, 군 2에서 높게는 374개의 축삭들에 대한 측정을 수행하였다.

표 5의 네 번째 칸에 보고된 "평균의 표준오차"("SEM")는 집단의 샘플-평균 추정치의 표준편차이다. (샘플 평균이 편견없는 추정자이기 때문에, SEM은 실제 평균에 비해 샘플 평균에서의 오차의 표준편차로서 간주될 수도 있다.) SEM은 샘플 크기의 제곱근으로 나누어진 집단 표준편차의 샘플 추정치(샘플 표준편차)에 의해 추정되었다.

본원에서 이미 인지된 바와 같이, 쿠프리존 사료에 의해 야기된 수초 분해는 TEM에 의해 가시화된 뇌들보 횡단면적의 다양한 부분들에서 수초화된 축삭에 대한 균일하지 않은 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다.

이와 관련하여, 도 48 내지 50은 표 5에 요약된 G-비 측정치를 상이하게 표현한다. 이들 도 48 내지 50은 각각의 마우스 군에 대해 Y-축 상에서의 축삭 G-비의 빈도 백분율을 X-축 상에서의 G-비 분포와 비교하여 보여주는 G-비의 막대 차트 막대그래프이다.

이들 도 48 내지 50은 막대그래프에서 다른 막대들에 대한 G-비 계산의 일부가 아니지만 오히려 각각의 마우스 군에서 "탈수초화된" 축삭의 수를 면적-표준화된 방식으로(즉, "단위 면적 당 탈수초화된 축삭의 수의 정량"이라는 단락 명칭을 갖는 본원의 단락 II에서 이미 측정되고 보고된 바와 같이) 나타내는 "NMY"로 표지된 막대도 함유한다. NMY 막대의 존재 때문에, 각각의 차트는 이하 "변형된 막대 차트 막대그래프"로서 지칭된다.

마우스 군 1, 2 및 3에 대한 G-비 데이터를 함유하는 변형된 막대 차트 막대그래프는 각각 도 48a, 48b 및 48c에 나타나 있다.

마우스 군 3, 5 및 7에 대한 G-비 데이터를 함유하는 변형된 막대 차트 막대그래프는 각각 도 49a, 49b 및 49c에 나타나 있다.

마우스 군 3, 4 및 6에 대한 G-비 데이터를 함유하는 변형된 막대 차트 막대그래프는 각각 도 50a, 50b 및 50c에 나타나 있다.

추가로, 도 48a는 마우스 대조군인 군 1에 대한 G-비 데이터를 함유하는 변형된 막대 차트 막대그래프를 보여준다. 각각의 막대의 상부 상의 숫자들을 주목한다. 이들 숫자들은 그 위에 표시된 G-비를 갖는 축삭의 단위 면적 당 퍼센트 발생에 상응한다. 구체적으로, 퍼센트 숫자는 이미 카운팅된, 동일한 단위 면적 당 모든 "탈수초화된" 축삭을 해명하도록 표준화되었다(즉, 퍼센트 숫자는 NMY 값을 포함한다). 변형된 막대 차트 막대그래프에서 두 숫자 세트들을 보고하는 것은 CNM-Au8 나노현탁액의 치료 효과 중 일부의 보다 완전한 이해를 제공할 수 있다고 생각된다.

변형된 막대 차트 막대그래프의 좌측 및 우측 상의 두 음영 영역들도 주목한다. 이들 음영 영역들은 예를 들면, 도 48b 및 48c와 중첩되고 다소 상이한 또는 다소 유사한 데이터를 함유하는 변형된 막대 차트 막대그래프의 부분들을 주목하기 위한 것이다. NMY 막대(210) 상의 평행선무늬도 주목한다. 변형된 막대 차트 막대그래프 각각 상에서 모든 다른 "NMY" 막대들의 경우에도 동일한 평행선무늬가 존재한다. 대조군인 군 1의 마우스들이 정상적이거나 건강한 것으로 간주되어야 하기 때문에, 도 48a의 변형된 막대 차트 막대그래프는 상이한 군들을 비교하기 위한 우수한 출발점(즉, "양성 대조군")으로서 간주될 수 있다.

마찬가지로, 쿠프리존 사료를 제공받은 마우스에 상응하는 변형된 막대 차트 막대그래프는 도 48b 및 48c에 나타나 있다. 따라서, 도 48c의 변형된 막대 차트 막대그래프는 상이한 군들을 비교하기 위한 우수한 출발점(즉, "음성 대조군")으로서 간주될 수도 있다. 예를 들면, 막대(210b)는 도 48a의 막대(210)에 상응하는 동일한 평행선무늬를 함유하지만, 상기 논의된 바와 같이 보다 큰 수의 "탈수초화된" 축삭을 보여주는 짙은 부분도 함유한다.

도 49a, 49b 및 49c는 각각 군 3(음성 대조군), 군 5 및 군 7의 마우스들에 상응하는 변형된 막대 차트 막대그래프들을 함유한다. 이들 3개의 변형된 막대 차트 막대그래프들은 비교 목적으로 함께 배치되어 있다. 상기 변형된 막대 차트 막대그래프들의 특징은 꽤 유사하다.

도 50a, 50b 및 50c도 각각 군 3(음성 대조군), 군 4 및 군 6의 마우스들에 상응하는 변형된 막대 차트 막대그래프들을 함유한다. 이들 3개의 변형된 막대 차트 막대그래프들은 비교 목적으로 함께 배치되어 있다. 도 50b 및 50c에 함유된 특징은 서로 꽤 유사하고, 도 50a에 표시된 음성 대조군과 꽤 상이하다.

용이한 비교를 위해, 동일한 변형된 막대 차트 막대그래프들은 모두 도 51에 나타나 있다.

도 48a, 48b 및 48c에서 0.65의 G-비 크기의 경우 도 48b는 군 2가 0.65의 G-비 크기를 갖는 17%의 그의 축삭을 가졌다는 것을 보여준다는 것을 인지해야 한다. 문헌에서 논의된 바와 같이, 그 축삭의 수초화와 관련된 이익을 능가하도록 축삭 전도 부피의 비한정된 팽창을 허용하지 않는 개별 축삭에 대한 이론적 한계가 존재한다⁵. 최적 효율에서 두정 축삭에 대한 예상된 실험적으로 관찰된 G-비 범위는 대략 0.76 내지 0.80보다 약간 더 높은 값일 것이다. 도 48b에서, 0.65의 G-비 크기를 갖는 작은 축삭 집단은 정상 G-비인 것보다 더 적었고 쿠프리존 사료에 대한 초기 반응인 것으로 간주되었다. 따라서, 이러한 축삭은 정상적으로 또는 잘 작용할 것으로 예상되지 않을 것이다⁵.

도 50b 및 50c에 표시된 유사한 변형된 막대 차트 막대그래프들은 (I) 제공된 금 나노현탁액이 유효 치료량인지를 확인하기 위해 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 약 1000 ppm의 금 결정 농도로 약 10 ㎖/kg의 치료 부피의 농축된 CNM-Au8 현탁액을 모든 5주 동안 1일 1회 위관영양에 의해 제공받은 군 4 ; 및 (2) 제공된 금 나노현탁액이 유효 치료량으로서 작용하는지를 확인하기 위해 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료를 공급받았고 연구의 모든 5주 동안 약 50 ppm의 결정성 금 농도로 물병으로부터 치료제 CNM-Au8 현탁액을 무제한적으로 마신 군 6 으로부터 선택된 마우스들에 상응한다는 것을 인지해야 한다.

도 50b 및 50c는 군 4 마우스들 및 군 6 마우스들 둘다가 0.65의 G-비에서 약 5%의 그들의 축삭을 갖는다는 것을 보여준다. 이 G-비는 탈수초화 질환으로부터 회복 과정을 겪는 축삭/수초를 나타내는 것으로서 문헌에서 논의되어 있고; 이때, CNS 축삭은 회복 동안 과다-재수초화의 초기 기간을 겪고 궁극적으로 정상 G-비로 복귀되기 전에 약간의 시간 동안 증가된 직경을 보여준다⁵. 이들 데이터는 수초 보존이 일어날 수 있다는 것을 의미하는 것으로서 이해되어야 한다.

이 데이터(뿐만 아니라 본원의 모든 다른 데이터)로부터 필요한 농도, 양 및/또는 치료 시간을 결정하는 것이 어렵지만, 상이한 생물학적(병리학적) 사건들이 본원에서 논의된 CNM-Au8 치료제를 제공하는 함수로서 일어난다는 것은 분명하다.

결론

데이터는 하기 사실들을 암시한다:

1. 5주 동안 쿠프리존 사료 및 물을 제공받은 마우스들은 도 48a의 변형된 막대 차트 막대그래프를 도 48b 및 48c의 변형된 막대 차트 막대그래프들 중 하나 또는 둘다와 비교함으로써 입증된 바와 같이 본 발명자들이 의도한 전형적인 탈수초화를 발생시켰다.

2. 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료 및 CNM-Au8 나노현탁액을 (위관영양에 의해 또는 무제한적으로) 제공받은 마우스들은 유사한 변형된 막대 차트 막대그래프들을 가졌고(도 50b 및 50c 참조), 이들 둘다가 음성 대조군보다 더 우수하였다(도 50a 참조).

3. G-비 데이터 단독은 CNM-Au8 나노현탁액이 연구의 모든 5주 동안 쿠프리존 사료 및 CNM-Au8 나노현탁액에 노출된 군 4 및 6의 마우스들에게 긍정적으로 영향을 미쳤다(즉, 탈수초화를 감소시켰거나 재수초화를 야기하였다)는 것을 암시한다.

참조문헌

Claims (4)

1. 뉴런의 재수초화(remyelination)의 촉진을 필요로 하는 포유동물에서 뉴런의 재수초화를 촉진하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은
   a) 약학 등급의 물;
   b) 하나 이상의 프로세싱 향상제(processing enhancer); 및
   c) 상기 물에 현탁되어 현탁액을 형성하는 금 나노결정
   을 포함하고, 상기 금 나노결정은
   i) (1) 표면에 접착되거나 부착된 유기 화학 성분을 갖지 않는 특성, 및/또는 (2) 실질적으로 깨끗하고 물 또는 상기 프로세싱 향상제 이외에 상기 금 나노결정의 기능을 변경시키는, 표면에 접착되거나 부착된 화학 성분을 갖지 않는 특성으로 구성되는 특성들의 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 포함하는 표면을 갖고,
   ii) 약 50 nm 미만의 모드 입자 크기를 가지며,
   iii) 약 2-2000 ppm의 농도로 상기 현탁액에 존재하고,
   d) 상기 현탁액은 약 5 내지 약 9.5의 pH 및 약 -30 mV 이상의 제타 전위를 갖는 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 뉴런은 중추신경계 뉴런을 포함하는 것인 조성물.
3. 중추신경계 뉴런의 재수초화의 촉진을 필요로 하는 포유동물에서 중추신경계 뉴런의 재수초화를 촉진하기 위한 약제로서, 상기 약제는
   a) 약학 등급의 물;
   b) 하나 이상의 프로세싱 향상제; 및
   c) 상기 물에 현탁되어 현탁액을 형성하는 금 나노결정
   을 포함하고, 상기 금 나노결정은
   i) (1) 표면에 접착되거나 부착된 유기 화학 성분을 갖지 않는 특성, 및/또는 (2) 실질적으로 깨끗하고 물 또는 상기 프로세싱 향상제 이외에 상기 금 나노결정의 기능을 변경시키는, 표면에 접착되거나 부착된 화학 성분을 갖지 않는 특성으로 구성되는 특성들의 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 포함하는 표면을 갖고,
   ii) 약 50 nm 미만의 모드 입자 크기를 가지며,
   iii) 약 2-2000 ppm의 농도로 상기 현탁액에 존재하고,
   d) 상기 현탁액은 약 5 내지 약 9.5의 pH 및 약 -30 mV 이상의 제타 전위를 갖는 것인 약제.
4. 제3항에 있어서, 진행성 핵상마비, 알렉산더병(Alexander's Disease), 크라베병(Krabbe Disease), 이염성 백질이영양증, 칸반병(Canvan Disease), 백질이영양증, 뇌척수염, 중심성 뇌교 수초용해증(CPM), 항-MAG 질환, 펠리체우스-메르츠바허병(Pelizaeus-Merzbacher Disease), 레프숨병(Refsum Disease), 코케인(Cockayne) 증후군, 젤베거(Zellweger) 증후군, 귈랭-바레(Guillain-Barre) 증후군(GBS), 반 데르 크나프(Van der Knapp) 증후군, 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 다초점 운동 신경병증(MMN), 시신경 척수염(NMO), 진행성 다초점 백질뇌병증(PML), 왈러(Wallerian) 변성 및 일부 유전 질환, 예컨대, 부신백질이영양증, 알렉산더병, 및 펠리체우스 메르츠바허병(PMZ)으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 치료에 사용하기 위한 것인 약제.

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