CN108295084A - 清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，提供一种用于清除海马神经元细胞中β‑淀粉样蛋白的组合物，该组合物包括巴佛洛霉素A1，所述海马神经元细胞来自动物模型，所述动物模型为小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100‑150nM。在本发明的组合物基础上，可以进一步开发出有针对性的抑制阿尔茨海默病的上游发病诱因的试剂进而开发出预防阿尔茨海默病的有效药物。

Description

清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以认知功能减退、伴有生活功能下降及精神行为异常为临床表现的神经系统退行性疾病。目前越来越多的研究发现Aβ(amyloidβ-protein，β-淀粉样蛋白)降解功能的异常导致Aβ在脑实质内的沉积是AD病理发生的起始因素和关键环节。Aβ的降解已逐渐被证实是依赖脑内小胶质细胞溶酶体对Aβ的降解作用。脑内Aβ的聚集涉及到Aβ的产生与降解之间的速率平衡。Aβ沉积在疾病发展的早期起到关键性作用，Aβ可以抑制脑中大分子量蛋白酶的活性，从而使Aβ无法降解，这样Aβ就进入了一个沉积的恶性循环。目前研究认为可以降解神经元内异常蛋白的巨自噬(macroautophagy)作用与AD的发病机制最为相关。溶酶体作为Aβ的终末降解细胞器，是降解Aβ的最为重要的细胞器。在细胞内溶酶体内蛋白酶的活性最主要是取决于溶酶体内的pH值，且这些酶的最适pH值一般为3.5～5.5，被称为酸性水解酶。细胞要维持各种重要细胞器维持其内的酸碱度离不开一个重要的蛋白，即Vacuolar-type H+-ATPase(V-ATPase)，V-ATPase属于ATP依赖性质子泵家族成员中的一个，负责多种真核生物细胞腔内的酸化。细胞内的酸性环境对于细胞的多种功能活动都起到重要的作用。
目前对于阿尔茨海默病通常在动物模型中进行病理相关的研究，而如何高效利用动物模型来研究阿尔茨海默病发病机理也是很多科研工作者经常遇到的问题。
发明内容
为了更好地利用动物模型来研究阿尔茨海默病的发病机理以及为治疗药物的开发奠定基础，本发明提供一种用于在动物模型中清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的方法。
本发明实施例是这样实现的，一种用于清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的组合物，该组合物包括巴佛洛霉素A1，所述海马神经元细胞来自动物模型，所述动物模型为小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
本发明实施例的另一目的在于提供巴佛洛霉素A1用于制备清除动物模型中海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的药物的用途，所述动物模型为小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
本发明实施例提供的组合物包括巴佛洛霉素A1，其可以有效诱导海马神经元细胞清除β-淀粉样蛋白，恢复海马神经元细胞的活力。同时本发明的药物组合物对于利用动物模型来研究阿尔茨海默病的发病机理奠定了坚实的基础。在本发明的组合物基础上，可以进一步开发出有针对性的抑制阿尔茨海默病的上游发病诱因的试剂进而开发出预防阿尔茨海默病的有效药物。
附图说明
图1a-1c显示了Aβ25-35诱导HT22细胞产生自噬的检测结果；
图2a-2b显示了不同处理组HT22细胞免疫荧光斑点的检测结果；
图3a-3b显示了本发明实施例中不同处理组中LC3及V-ATPase表达的变化；
图4为两种不同小鼠于胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值的测定结果；
图5为两种不同小鼠于胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值的测定结果比较图；和
图6为两种不同小鼠于胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase表达的差异图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于在动物模型中清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的方法，该方法包括以下步骤：向海马神经元细胞加入巴佛洛霉素A1，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
具体地，巴佛洛霉素A1的英文名称为Bafilomycin A1，且其化学式为：
巴佛洛霉素A1通常被认为是一种危险性刺激物质，有数据表明它是自噬抑制剂，但没有实验数据表明其可用于促进海马神经元细胞清除β-淀粉样蛋白，因为β-淀粉样蛋白的清除需要自噬功能的增强。
优选地，该动物模型为小鼠，且所述海马神经元细胞为小鼠细胞。
进一步优选地，本发明实施例中的海马神经元细胞为经过Aβ25-35处理的海马神经元细胞，Aβ25-35的浓度优选为40-50μM。该Aβ25-35可以为中间代谢产物，也可以为人工合成的序列。该Aβ25-35序列为：NH2-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-COOH，其中第一个G ly代表25号氨基酸，最后一个Met代表35号氨基酸。
Aβ(β-淀粉样蛋白)具有很强的神经毒性，可以迅速引起大量的神经细胞死亡。目前Aβ在脑内的异常形成并堆积而产生的神经毒性作用已经被公认为是AD形成和发展的关键因素。其可能的机制包括破坏细胞内Ca2+稳态、促进自由基的生成、降低K+通道的功能、增加致炎细胞因子引起的炎性反应、激活补体系统、增加脑内兴奋性氨基酸(主要是谷氨酸)的含量等一系列反应，导致突触减少、神经元缺失，同时可以损伤线粒体，使细胞的供能系统障碍，引起细胞功能紊乱，最终造成神经元凋亡。因此在阿尔茨海默病发病过程中因为Aβ的堆积导致神经系统功能失常。Aβ中间代谢产物浓度增加，预示着阿尔茨海默病发病的风险，因此本发明实施例中加入巴佛洛霉素A1提高了海马神经元细胞的活性，表明或许阿尔茨海默病的治疗药物或许可以在此基础上进行开发。
具体地，如图1c所示，在40μmo l·L-1的Aβ25-35处理24小时后，100nM的Bafilomycin A1的作用开始显现，其可以提高HT22细胞活力的影响，也就是说，加入巴佛洛霉素A1可以对抗Aβ25-35对于细胞产生的毒性。
进一步地，本发明实施例的在动物模型中清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的方法中，优选加入抗坏血酸(ascorbic acid)。
本发明提供的用于清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的组合物，该组合物包括巴佛洛霉素A1，所述海马神经元细胞来自动物模型，所述动物模型为小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
本发明实施例还提供一种用于诱导动物模型中小胶质细胞内V-ATPase蛋白表达量增加的组合物，该组合物包括巴佛洛霉素A1，所述小胶质细胞来自小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
本发明实施例选用稳定的AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠和野生型小鼠进行脑内原代小胶质细胞的分离培养，研究其细胞内pH值和溶酶体内pH值与正常功能及其之间的差异，以及V-ATPase蛋白功能的变化。
小胶质细胞(Microglia)是神经胶质细胞的一种，是大脑中常驻的免疫细胞，不断地巡视大脑微环境，对病原体和损伤做出应答，被喻为神经元的保护神。
实施例一检测β-淀粉样蛋白Aβ25-35诱导HT22细胞产生自噬及与V-ATPase变化的关系
本发明实施例中，如无特别强调，则Aβ均指Aβ25-35，而非全长序列。
选用稳定的AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠和野生型小鼠进行脑内原代小胶质细胞的分离培养。
拟采用TgAPPsw(Tg2576)小鼠。该小鼠携带转瑞典突变淀粉样肽前体蛋白基因。生化及遗传学研究已证实:淀粉样前体蛋白瑞典型突变基因(Swedish mutation of amyloidprecursor protein,APPSWE)与早发型家族性AD有关。TgAPPsw(Tg2576)小鼠由美国密州堪萨斯William Z SUO教授实验室提供,亲代基因敲除鼠为C57/BL6种系背景。动物饲养在SPF级动物房,恒温21℃。各组小鼠在层流架中分笼饲养，24h周期明暗交替，动物自由进食及饮水。所有的操作都按美国堪萨斯大学医学中心和深圳大学医学院动物喂养和使用管理委员会制定的条例进行。
本实施例中的Aβ25-35为市场购买所得，可以自己调节使用浓度。
将永生化海马神经元HT22细胞分为对照组、无血清培养组、Aβ处理组和Aβ+Bafilomycin A1组，不同浓度的Aβ25-35作用于HT22细胞24h，用CCK8测定细胞活力变化，免疫细胞荧光检测白噬斑点变化，及Western blot检测LC3、V-ATPase蛋白变化。
实验结果(如图1所示)表明：Aβ25-35可诱导HT22细胞产生自噬，且与小胶质细胞V-ATPase表达的变化有关。图1a显示了Aβ25-35作用24小时对HT22细胞活力的影响，如图所示，细胞活力呈剂量依赖性降低，Aβ浓度越低，对细胞的毒性越小。图1b显示了Aβ25-35(40μM)作用不同时间对HT22细胞活力的影响，如图所示，细胞活力在24小时时才出现下降。图1c显示了Bafilomycin A1(100nM)对HT22细胞活力的影响，如图所示，Aβ加入Baf A1组在40μmol·L-1的情况下会提升细胞活力。
HT22细胞活力测定结果显示，当不同浓度的Aβ25-35作用于HT22细胞后，HT22细胞活力呈剂量依赖性地降低(P≤0.05)，高浓度Aβ25-35对细胞有明显毒性作用，随浓度减低细胞毒性作用减小(图1a)。此外，Aβ25-35对HT22细胞的毒性作用亦具有时间的相关性，当Aβ25-35浓度为40μΜ，细胞活力在24小时才开始出现一定的变化(图1b)。加入100nmol/L质子泵抑制剂Baf A1后细胞活力有所增加(图1c)，提示了其对抗了Aβ25-35对HT22细胞的毒性作用。
进一步的实验结果如下表1所示：
表1Aβ25-35及其与Bafilomycin A1的组合对细胞活性的影响(作用24小时)
根据表1可以获知，100nM的BafA1可以显著抑制Aβ25-35对细胞活力的损害。
另一组实验结果如表2所示：
表2不同浓度BafA1对细胞活力影响
BafA1浓度 细胞活力变化 自噬小体的变化
50nM 无变化 无变化
100nM 增加 增加
150nM 增加 增加
由表2可以获知，100-150nM的BafA1可以增加细胞活力以及自噬小体的数量。
实施例二研究脑的老化、基因突变、脑外伤、氧化在各种应激的状态等情况下作为主要清除Aβ的小胶质细胞胞浆内以及溶酶体内pH值是否出现变化。也就是说分析小胶质细胞胞浆内以及溶酶体内pH值与Aβ清除之间的关系。
本实施例主要进行了以下实验：
1.比较AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞浆内以及溶酶体内pH值的差异；并比较AD鼠模型不同年龄阶段内小胶质细胞溶酶体pH值之间存在的差异。
2.明确AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞溶酶体的V-ATPase存在数量上及功能上的差异，以及这种差异同PH值变化之间的关系。
3.用不同浓度Aβ25-35作用于HT22细胞24小时，用CCK8测定细胞活力变化。具体操作为：将HT22细胞分为对照组、无血清培养组、Aβ处理组和Aβ+BafilomycinA1组，用免疫细胞荧光检测自噬斑点变化，及Western bloting检测LC3、V-ATPase蛋白变化。
图2显示了不同处理组HT22细胞免疫荧光斑点的检测结果。图2a为不同处理组HT22细胞免疫荧光斑点的照片(×1000)，图2b为不同处理组HT22细胞免疫荧光斑点统计图。
图3为本实施例的不同处理组中LC3及V-ATPase表达的变化。图3a显示了Aβ(40μM)组及Aβ+BafA1处理组LC3及V-ATPase表达，图3b为LC3和V-ATPase表达量的柱形图。
图4为APP转基因鼠同WT野生型鼠中胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值的测定结果。
图5为TgAPPsw(Tg2576)小鼠同野生型鼠胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值的测定结果比较图。
在正置荧光显微镜下，细胞的LC3染色结果显示，在Aβ25-35作用下，HT22细胞中可以出现斑点状的自噬体结构，表现为颜色较亮的斑块。高浓度的Aβ25-35(40μmol/L)较低浓度Aβ25-35(10μmol/L)干预后，HT22细胞中斑点增多(图2a)。与此同时，加入100nmol/L的BafA1后，可见的斑点数明显增多。
HT22细胞在40μmol/LAβ25-35作用24小时下，Westernbloting结果显示在阳性对照组，Aβ25-35处理组以及Aβ25-35+BafA1处理组中可见LC3-Ⅱ的表达量以及LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值较空白对照增高(P＜0.05)，尤以Aβ25-35+BafA1处理组增高最为明显。与此同时，V-ATPase表达在上述三组中较空白对照组亦有所增高(P＜0.05)，尤以Aβ25-35+BafA1处理组增高最为明显(图3a\b)。
TgAPPSW(Tg2576)小鼠同WT野生型鼠中胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值得测定。可见两者之间的pH值有明显差异的，同时加入ascorbic acid后，其胞内pH值皆出现明显的下降(图4)。
在AD模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠和野生型(wild type，WT)小鼠脑内分离培养的小胶质细胞中发现两者的细胞内胞浆的pH值以及溶酶体内的pH值均存在显著的差异，APP小鼠脑内分离培养的小胶质细胞不管是胞浆还是溶酶体内的pH值明显高于WT小鼠(图4)，超出了其酸性水解酶所需要的酸性环境。
TgAPPsw(Tg2576)小鼠同野生型鼠胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值的测定。细胞在含有5mg/ml右旋糖酐(带有共轭荧光素及玫瑰精)的完全培养基培养16小时后，用完全培养基充分洗涤，继续培养4小时使右旋糖酐从溶酶体内清除其结果显示各细胞内溶酶体内pH值得分布范围。可见AD模型组pH值曲线明显右移，即pH值范围明显增高。其pH值最接近6(图5)。
APP转基因鼠同WT野生型鼠中胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞胞浆内pH值的测定。左图可见两者之间的pH值是有明显差异的，同时加入ascorbic acid后，其胞内pH值皆出现明显的下降。右图示细胞在含有5mg/ml右旋糖酐(带有共轭荧光素及玫瑰精)的完全培养基培养16小时后，用完全培养基充分洗涤，继续培养4小时使右旋糖酐从溶酶体内清除其结果显示各细胞内溶酶体内pH值得分布范围。可见AD模型组pH值曲线明显右移，即pH值范围明显增高。其pH值最接近6。
实施例三在实施例一及实施例二基础上研究小胶质细胞内V-ATPase蛋白表达变化对溶酶体内pH值的变化和对Aβ斑块沉积的影响
本实施例具体进行了以下实验操作：
1.比较TgAPPsw(Tg2576)小鼠及野生型小鼠分离培养的小胶质细胞内V-ATPase蛋白表达的差异以及和溶酶体pH值之间的关系。
2.进一步比较TgAPPsw(Tg2576)小鼠及野生型小鼠分离培养的小胶质细胞内溶酶体内蛋白酶活性的差异。
3.在体研究不同年龄的TgAPPsw(Tg2576)小鼠分离培养的小胶质细胞内V-ATPase蛋白表达的差异，溶酶体pH值的变化以及其同脑内Aβ斑块沉积的关系。
TgAPPsw(Tg2576)小鼠同正常鼠中胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase表达的差异。结果显示APP小鼠原代培养的小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase表达较野生型明显减低；在使用MSCF原位激活小胶质细胞后，该酶的表达在APP模型和野生型上均有增高，以APP小鼠模型上增高更为明显(图6)。TgAPPsw(Tg2576)小鼠同正常鼠中胎龄18天乳鼠原代培养的小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase表达的差异。图示TgAPPsw(Tg2576)小鼠原代培养的小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase表达较野生型明显减低；在使用MSCF刺激后该酶的表达在APP模型和野生型上均有增高，以APP小鼠模型上增高更为明显。
比较AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞浆内以及溶酶体内pH值的差异，以及小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase的变化。
讨论d i scuss ion
在对TgAPPsw(Tg2576)小鼠的研究中发现，该动物脑内的小胶质细胞对Aβ的降解能力明显减弱。且如前所述，我们也已经发现该细胞内的胞浆pH值、溶酶体内pH值以及V-ATPase蛋白表达均较WT小鼠有明显的不同。细胞的LC3染色结果显示，在Aβ25-35处理后，相比对照组，高浓度Aβ25-35处理过的细胞比低浓度Aβ处理过的细胞出现了更多的斑点状自噬体结构(图2)，这表明高浓度的Aβ25-35比低浓度的Aβ25-35更加能够刺激细胞产生自噬体结构。
在V-ATPase的表达测定结果也表明Aβ可以诱导HT22细胞出现明显的自噬现象，且这种自噬同Aβ的浓度以及作用时间具有一定的相关性。V-ATPase的表达伴随自噬的增多也逐渐增多。BafilomycinA1可以进一步诱导V-ATPase增加，增加细胞内自噬体的聚积。提示了Aβ25-35可诱导HT22细胞产生自噬，且与V-ATPase表达有关。研究同时发现H2O2及Aβ均可以导致海马神经元HT22细胞内自噬小体增多，提示氧化应激可以启动早期自噬。且Aβ作用于HT22细胞后，细胞内V-ATPase的表达随之增加，而自由基清除剂能减轻氧化应激所带来的损伤(图3)。
对于胞浆pH值的测定结果，我们设想可能正是由于细胞内以及溶酶体内酸性环境的改变，导致溶酶体内各种酸性水解酶不能正常发挥作用而导致细胞自噬功能的减低从而导致其对Aβ水解能力的降低(图4)。TgAPPsw(Tg2576)小鼠和野生型小鼠中小胶质细胞溶酶体膜的V-ATPase表达差异提示我们正是由于V-ATPase功能出现异常，而导致了胞浆内以及溶酶体内酸性环境的改变，引起溶酶体功能的异常，导致细胞自噬功能降低，从而不能水解清除Aβ，引起了AD病理的发生与发展。
以上研究结果表明AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞浆内以及溶酶体内pH值具有明显差异，同时AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase的表达量亦明显不同。使用MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)进行脑内原位激活小胶质细胞后可见该酶的表达在APP模型和野生型上均有增高，以APP小鼠模型上增高更为明显。今后需要进一步研究V-ATPase表达量对姿势的影响，我们目前的研究结果发现V-ATPase伴随自噬的增多也逐渐增多，且在加入抑制剂Baf A1后，V-ATPase表达量仍有提高，推测可能是细胞早期代偿性的结果。但是究竟其代偿的能力限度如何，其功能如何影响自噬体与溶酶体的融合等具体机制尚不清楚，仍有待进一步深入研究。另外，V-ATPase通过何种机制参与自噬仍需进一步研究阐明。
仍需进一步研究如何在脑内原位激活小胶质细胞(如使用MCSF进行刺激)，使V-ATPase的表达可以明显增加，而细胞的自噬能力可以得到进一步加强，提高其酸化功能而起到延缓AD的病理发生，为寻找有效延缓AD的方法提供新的手段。我们目前的研究仅使用了MCSF进行刺激，并取得了一定的疗效，但是仍然需要积极探寻更过的行之有效的刺激物质和给药途径，为今后的临床实践打下理论基础。
结论
体外实验发现APP小鼠脑内分离培养的小胶质细胞溶酶体功能出现异常。Aβ可以诱导细胞出现明显的自噬现象，且这种自噬同Aβ的浓度以及作用时间具有一定的相关性。
V-ATPase的表达变化可以影响细胞的自噬能力。AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞浆内以及溶酶体内pH值存在着明显差异，这种差异是由AD动物模型TgAPPsw(Tg2576)小鼠与野生型小鼠脑内小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase的表达量不同所决定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于清除海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的组合物，该组合物包括巴佛洛霉素A1，所述海马神经元细胞来自动物模型，所述动物模型为小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，海马神经元细胞为经过Aβ25-35处理的海马神经元细胞，且所述Aβ25-35的浓度为40-50μM。
3.一种用于诱导动物模型中小胶质细胞内V-ATPase蛋白表达量增加的组合物，该组合物包括巴佛洛霉素A1，所述小胶质细胞来自小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
4.巴佛洛霉素A1用于制备清除动物模型中海马神经元细胞中β-淀粉样蛋白的药物组合物的用途，所述动物模型为小鼠，且所述巴佛洛霉素A1的浓度为100-150nM。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包括抗坏血酸。
6.一种用于增加小鼠脑内小胶质细胞溶酶体膜上V-ATPase的表达量的组合物，所述组合物包括巨噬细胞集落刺激因子。
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