KR20210018869A - 하이드로겔을 제조하기 위한 기능화 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서방성 조성물을 제조하기에, 특히 알기네이트 매트릭스 내에 임베딩된 정자를 포함하는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 서방성 조성물(sustained release composition)의 제조, 특히 알기네이트 매트릭스 내에 임베딩된 정자(spermatozoa)를 포함하는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트(kit)에 관한 것이다.
인공 수정(AI)은 자연적인 교미가 아닌 인공적인 방법으로 동물의 자궁 또는 자궁 경부에 정자를 배치하는 기술이다. 이 기술은 1940년대부터 사용되어 왔으며, 현재는 특히 농장 동물, 예컨대 소, 돼지, 양, 가금류 및 말의 경우 뿐만 아니라, 애완 동물, 예컨대 혈통 개, 수생 동물 및 멸종 위기에 처한 종의 경우에, 특히 바람직한 특성을 전파하기 위해 동물의 교배 및 번식 방법으로 널리 사용되고 있다.
인공 수정의 사용 및 정자의 보존과 관련하여 현대 AI의 개발 및 육종가의 과제에 대한 개요는 문헌(RH Foote (2002), American Society of Animal Science (http://www.asas.org/symposia/esupp2/Footehist.pdf) and in "Reproduction in farm animals", edited by B. Hafez, E.S.E. Hafez. - 7th ed., Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. - XIII, ISBN 0-683-30577-8 (ib.))에 개시되어 있다.
정자는 일반적으로 수집, 익스텐딩된(extended) 후, 예를 들어, 냉동 보존에 의해 보존된다. 냉동 보존 기술의 사용은 특정 동물 종의 정자가, 정자 품질, 생존력 및 수정 능력을 너무 많이 저하시키지 않으면서 이러한 처리를 견디는 것을 전제로 한다. 이후, 냉동 보존되거나 갓 보관된(어느쪽이든 적합함), 정자는 전형적으로 암컷의 위치로 이송된다. 정자는 수정될 때까지 그리고 수정 후 난자(들)가 수정의 위치에 도달할 때까지 암컷 동물 내에서 충분한 기간 동안 생존 가능한 상태를 유지하는 것이 중요하다.
정자가 채취 후 수정 시점까지 더 오랜 시간 동안 수정 능력을 유지하도록 하는 저장 방법 및 수단을 제공하는 것을 목표로 하는 보존 방법, 및 특히 수정 후 정자가 더 오랜 기간 동안 수정 능력을 유지하도록 하는 방법 및 수단을 제공하는 것을 목표로 하는 보존 방법에 대한 많은 초점이 맞추어졌고 연구가 있었다.
WO2008/004890은 정자가 알기네이트에 임베딩된 보존 시스템을 개시한다. 상기 보존 시스템은 수정 후 더 오랜 기간 동안 정자 수정 능력을 부여함으로써 일반적으로 이점을 제공한다고 언급되어 있다.
PCT/EP2017/081128은 정자가 개선된 알기네이트 매트릭스에 임베딩된 보존 시스템을 교시한다. 개선된 알기네이트 매트릭스는 일반적으로 수정 가능성이 높은 정자가 장기간 방출되도록 하여 배란과 관련된 수정 시간을 훨씬 덜 중요하게 만든다고 언급되어 있다.
상기 보존 시스템으로 인해 육종가가 배란과 관련하여 가장 바람직한 수정 시점을 충족하는 데 덜 의존하게 되지만 생산에는 숙련된 인력이 필요하다. 따라서, 상기 보존 시스템의 생산 절차를 단순화하는 수단이 필요하다.
본 발명자들이 아는 한, 그러한 보존 시스템의 생산 절차를 단순화하기 위한 수단에 초점을 맞춘 연구는 많지 않았다. 그러나, 다른 보존 시스템 및 이와 관련된 시스템을 생산하기 위한 수단은 이전에 개시되었다.
문헌(Alginate 3d Cell Culture Kit", 16 December 2012, pages 1-10)은 적어도 제1 및 제2 용기를 포함하는 키트를 개시하고 있다. 제1 용기는 소듐 알기네이트 용액을 포함하고, 제2 용기는 염화칼슘(활성 가교제) 용액을 포함한다. 염화칼슘은 소듐 알기네이트 용액에서 해리될 것이다. 유리 칼슘 이온이 소듐 알기네이트와 상호 작용하여 가교된 알기네이트를 형성할 것이다.
WO2015/181496은 동물의 인공 수정에 사용하기에 적합한 알기네이트-정자 시스템을 생산하는 방법을 교시한다. 알기네이트-정자 시스템은 수정 스트로우(insemination straw)를 포함한다. 이 스트로우는 통상적으로 얇은 튜브 및 얇은 튜브에 삽입된 마개로 형성된다. 채워진 상태에서, 마개는 튜브의 제1 단부 가까이에 배치되고, 액체 기반 물질, 특히 알기네이트에 용해된 정자의 투여량이 마개와 튜브의 제2 단부 사이의 스트로우에 배열된다. 스트로우를 채우기 위해, 마개에 가까운 튜브의 제1 단부는 진공 소스와 연통되게 배치되고, 제2 단부는 스트로우에 도입될 물질을 함유하는 용기와 연통되게 배치된다. 초기에 마개와 제2 단부 사이에 함유된 공기는 물질이 마개에 도달할 때까지 튜브 내로 전진 이동하는 동안 마개를 통해 흡입되고, 그것은 마개가 액밀되어 통과할 수 없다. 정자가 마개에 흡수되는 것을 방지하기 위해 마개에 칼슘 또는 바륨 염을 함침시키는 것이 제안된다. 칼슘 및 바륨 염은 수용성이어야 한다(활성 가교제). 알기네이트 용액이 칼슘 또는 바륨 염과 접촉하면 알기네이트는 즉시 겔로 변환된다. 알기네이트 플러그는 정자가 마개에 흡수되지 않도록 한다.
발명의 요약
본 발명의 제1 양태는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것으로, 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 제1 용기는 활성화제 조성물 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 비활성 가교제 및 임의로 방출될 물질을 포함하고;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 제1 확산 배리어와 혼합하여 활성화제 조성물은 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 활성화제 조성물 및 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 중간층은 활성화제 조성물을 포함하거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성화제 조성물, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성화제 조성물, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질로 압출되고; 제2 확산 배리어는 제1 폴리머, 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성화제 조성물, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성화제 조성물, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 내부 표면층은 활성화제 조성물을 포함하고; 제2 확산 배리어는 제2 폴리머, 제3 폴리머 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 제2 양태는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것으로, 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 제1 용기는 비활성 가교제 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 활성화제 조성물 및 임의로 방출될 물질을 포함하고;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 제1 확산 배리어와 혼합하여 비활성 가교제는 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 비활성 가교제 및 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 중간층은 비활성 가교제를 포함하거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 비활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 비활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질로 압출되고; 제2 확산 배리어는 제1 폴리머, 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 비활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 비활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 내부 표면층은 비활성 가교제를 포함하고; 제2 확산 배리어는 제2 폴리머, 제3 폴리머 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 제3 양태는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것으로, 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 제1 용기는 활성 가교제 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머 및 임의로 방출될 물질을 포함하고;
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- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 내부 표면층은 활성 가교제를 포함하고; 제2 확산 배리어는 제2 폴리머, 제3 폴리머 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 일 구체예에서, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머는 2가 양이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머이다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 다른 구체예에서, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머는 이온 가교 가능한 알기네이트이다. 알기네이트는 바람직하게는 만누론산 잔기보다 더 많은 굴루론산 잔기를 갖는다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 추가의 구체예에서, 방출될 물질은 생물학적 물질, 예컨대 세포 및 특히 줄기 세포, 치료제, 진단제 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 방출될 물질은 정자이다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 용기는 수정 용량(insemination dose)을 위한 용기, 예컨대 수정 스트로우 또는 수정 튜브, 더욱 바람직하게는 수정 스트로우이다. 수정 스트로우의 일례가 도 1에 도시되어 있다. 일반적인 수정 스트로우의 치수는 실시예 4에 기재되어 있다.
일 구체예에서, 제1 용기 및/또는 제2 용기는 10cm 미만, 예컨대 5cm 미만, 3cm 미만, 2cm 미만, 1cm 미만, 8mm 미만, 5mm 미만 또는 4mm 미만의 내경을 갖는 튜브 모양을 갖는다.
일 구체예에서, 제1 용기 및/또는 제2 용기는 0.1 내지 10 cm, 예컨대 0.1 내지 5 cm, 0.1 내지 3 cm, 0.1 내지 1 cm 또는 0.1 내지 0.5 cm 범위의 내경을 갖는 튜브 모양을 갖는다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 추가의 구체예에서, 제1 용기는 수정 스트로우이고, 수정 스트로우는 제1 단부(2)와 제2 단부(3) 사이에서 연장되고 기체 투과성 액체 기밀 플러그(4)를 포함하는 튜브(1)를 포함하며, 상기 플러그는 이의 제1 단부 부근에서, 그리고 튜브의 제1 단부 쪽을 향한 제1 단부(2)와 튜브의 제2 단부 쪽을 향한 제2 단부(3) 사이에서 연장되는 튜브에 배열된다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 용기 및/또는 제2 용기는 바람직하게는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머가 제1 용기 및/또는 제2 용기 전체에 걸쳐 활성 가교제와 접촉하게 함으로써 제1 용기 및/또는 제2 용기 전체에 걸쳐 가교된 생체적합성 폴리머가 존재하도록 하는 크기 및 형태를 갖는다. 합리적인 시간 내에 제1 용기 및/또는 제2 용기 전체에 걸쳐 이온 가교가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 합리적인 시간은 48시간 미만, 24시간 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 4시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만이다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 용기 및/또는 제2 용기는 서방성 조성물을 제조하기에 적합하다. 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 용기 및/또는 제2 용기는 서방성 조성물을 제조하기에 적합하고, 상기 서방성 조성물은 동물 번식에 사용하기에 및/또는 생물학적 물질을 인체 또는 동물 신체에 이식하기에 적합하다. 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 용기 및/또는 제2 용기는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 크기 및/또는 형태이다. 서방성 조성물은 동물 번식, 인체 또는 동물 신체에 생물학적 물질 이식, 세포 배양, 생물학적 물질의 보존 및/또는 생물학적 물질의 냉동 보존에 사용하기에 적합하다.
생물학적 물질의 보존은 예를 들어, 조절되지 않는 화학 반응속도로 인해 손상되기 쉬운, 세포 기관, 세포, 조직, 세포 외 기질, 기관 또는 임의의 그 밖의 생물학적 구조물이 저온, 전형적으로, ≤ 0℃의 온도, 예컨대 ≤ -5℃의 온도, ≤ -10℃의 온도, ≤ -20℃의 온도, ≤ -30℃의 온도, ≤ -40℃의 온도, ≤ -50℃의 온도, ≤ -60℃의 온도, 또는 ≤ -70℃의 온도로 냉각시킴으로써 보존되는 공정일 수 있다.
냉동 보존(Cryo-preservation) 또는 냉동 저장(cryo-conservation)은 조절되지 않는 화학 반응속도로 인해 손상되기 쉬운, 세포 기관, 세포, 조직, 세포 외 기질, 기관 또는 임의의 그 밖의 생물학적 구조물이 매우 낮은 온도, 전형적으로, 예를 들어 고체 이산화탄소를 사용하여 -80℃, 또는 예를 들어 액체 질소를 사용하여 -196℃의 온도로 냉각시킴으로써 보존되는 공정이다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 수화 가능한 확산 배리어이다. 바람직하게는, 제1 폴리머 물질은 수화 가능한 확산 배리어가 아니다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 필름 형성 폴리머이다. 바람직하게는, 제1 폴리머 물질은 필름 형성 폴리머가 아니다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 추가 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성화제 조성물 및 비활성 가교제가 지연된 속도로 서로 접촉하게 하여, 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 보장한다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 추가 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 가능하게 한다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 일 구체예에서, 제1 확산 배리어는 i) 알기네이트와 같은 천연 폴리머, 덱스트란, 전분 및 아가로스와 같은 그 밖의 다당류, 셀룰로스 유도체, 예컨대 CMC(카복시 메틸 셀룰로스), 메틸셀룰로스 및 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 셸락과 같은 단백질; ii) PVA(폴리비닐 알코올), 수용성 폴리아미드, 폴리아크릴산 및 폴리아크릴산 무수물, 폴리 메타크릴산, 폴리메타크릴산 무수물, 폴리 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-n-이소프로필아크릴 아미드, 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 폴리머 또는 코폴리머; 또는 iii) 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제1 확산 배리어는 친수성인 것이 바람직하다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 추가의 구체예에서, 활성화제 조성물과 비활성 가교제의 혼합물은 활성 가교제의 형성을 초래하고, 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다.
본 발명의 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 추가의 구체예에서, 비활성 가교제는 수불용성인 2가 양이온 염, 예컨대 2가 양이온 카보네이트, 더욱 바람직하게는 CaCO3, BaCO3 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
본 발명의 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 활성 가교제는 수용성인 2가 양이온 염, 예컨대 2가 양이온 클로라이드, 2가 양이온 아세테이트, 2가 양이온 시트레이트, 바람직하게는 CaCl2, BaCl2, Ca(CH3COO)2, Ba(CH3COO)2, 칼슘 시트레이트, 바륨 시트레이트 또는 이들의 임의의 혼합물, 및 더욱 바람직하게는 CaCl2, Ca(CH3COO)2, 칼슘 시트레이트 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 추가의 구체예에서, 활성화제 조성물은 비활성 가교제를 활성 가교제로 변환시킬 수 있는 적어도 하나의 화합물을 포함하고; 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 활성화제 조성물은 산과 같은 양성자 공여체를 포함하고, 비활성 가교제는 양성자 공여체와 접촉시 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온을 방출하는 화합물이다. 바람직한 구체예에서, 양성자 공여체는 수용성이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 양성자 공여체는 i) 유기산, 예를 들어 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 임의의 혼합물; ii) 무기산, 예컨대 인산, 염산 또는 이들의 혼합물; 또는 iii) 유기산과 무기산의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 활성화제 조성물은 물과 접촉시 산과 같은 양성자 공여체로 변환되는 화합물을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 물과 접촉시 양성자 공여체로 변환되는 화합물은 무기산 무수물, 유기산 무수물, 예컨대 석신산 무수물, 및 락톤, 예컨대 글루코노 델탈락톤 또는 이들의 임의의 혼합물; 바람직하게는 유기산 무수물 및 글루코노 델탈락톤; 및 더욱 바람직하게는 글루코노 델탈락톤 및/또는 석신산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
i) 활성화제 조성물이 양성자 공여체 또는 물과 접촉시 양성자 공여체로 변환되는 화합물을 포함하고; 및 ii) 제1 및/또는 제2 확산 배리어가 강산과 양립 가능하지 않은 구체예에서, 제시된 화합물이 물과 접촉하게 될 때 형성되는 임의의 양성자 공여체를 포함하는 양성자 공여체는 바람직하게는 pKa > 3인 양성자 공여체이다. 아스코르브산 또는 글루쿠론산은 pKa > 3인 약산의 예이다. 셀룰로스 타입의 폴리머, 예컨대 CMC(카복시 메틸 셀룰로스), Benecel MP 812 W(메틸셀룰로스 및 하이드 록시프로필메틸셀룰로스) 및 Methocel K100(메틸 셀룰로스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스-하이프로멜로스)는 염산과 같은 강산과 양립 가능하지 않은 확산 배리어의 예이다. 이러한 배리어가 강산과 접촉하면 강산이 셀룰로스 유형 폴리머와 반응하여 폴리머 매트릭스의 분해 및/또는 가교를 일으킬 수 있는 위험이 있다. 따라서, 일 구체예에서 양성자 공여체는 pKa > 3이다.
본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 활성화제 조성물은 가수 분해 효소 또는 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질을 포함한다. 활성화제 조성물이 가수 분해 효소를 포함하는 경우, 원래 가수 분해 효소를 포함하지 않는 용기는 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질을 추가로 포함한다. 활성화제 조성물이 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질을 포함하는 경우, 원래 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질을 포함하지 않는 용기는 가수 분해 효소를 추가로 포함한다. 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 추가 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성화제 조성물이다. 바람직한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 산과 같은 양성자 공여체이거나 물과 접촉시 양성자 공여체로 변환된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 폴리알킬 시아노아크릴레이트, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리 아크릴산 무수물, 폴리메타크릴산 무수물 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 폴리머 물질은 폴리프로필렌, 바람직하게는 의료용, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, ABS(아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌), 폴리아미드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 아세탈, 아크릴, 폴리카보네이트, EVA(에틸렌-비닐 아세테이트), 폴리우레탄, 열가소성 엘라스토머, 폴리프로필렌과 폴리올레핀 엘라스토머의 블렌드, 예컨대 EOC(에틸렌 옥텐 등급), EPR(에틸렌 프로필렌 고무), 또는 그러한 폴리머의 블렌드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제2 확산 배리어는 압출과 양립 가능해야 한다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 확산 배리어는 동일하거나 상이하나; 단, 제2 확산 배리어는 압출과 양립 가능하다.
본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 폴리머 물질은 동일하거나 상이할 수 있으나; 단, 제2 및 제3 폴리머 물질은 압출과 양립 가능하다. 제1 폴리머 물질이 압출에 주어지는 구체예의 경우, 제1 폴리머 물질 또한 압출과 양립 가능해야 한다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 제4 양태는 서방성 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태 중 어느 하나에 따른 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제4 양태에 따른 일 구체예에서, 서방성 조성물은 동물의 번식에 사용된다.
도 1은 제1 단부(2)와 제2 단부(3) 사이에서 연장되는 튜브를 포함하고, 기체 투과성 액체 기밀 플러그(4)를 포함하는 수정 스트로우(1)를 도시한 것이며, 상기 플러그는 이의 제1 단부 부근에서, 그리고 튜브의 제1 단부 쪽을 향한 제1 단부(2)와 튜브의 제2 단부 쪽을 향한 제2 단부(3) 사이에서 연장되는 튜브에 배열된다. 고체 형태의 CaCO3와 GDL의 혼합물(6)은 튜브의 제2 단부(3)를 향하는 기체 투과성 액체 기밀 플러그(4)의 끝 부근에 위치한다. 정자와 알기네이트를 포함하는 혼합물이 스트로우(5)에 도입됨으로써 정자가 임베딩된 이온 가교된 폴리머를 형성한다.
도 2는 본 발명의 다양한 구체예를 도시한 것이다. 위쪽 도면은 수정 스트로우 내부에 있는 폴리머 필름, 즉 확산 배리어의 활성화제 조성물을 보여준다. 중간 도면은 확산 배리어 역할을 하는 폴리머 물질인, 수정 스트로우 내 폴리머 물질로 압출되는 활성화제 조성물을 보여준다. 아래 도면은 폴리머 2의 활성화제 조성물이 제1 용기의 제조 동안 폴리머 1과 공압출되어 2층 구조를 형성하는 상황을 보여준다.
도 2는 본 발명의 다양한 구체예를 도시한 것이다. 위쪽 도면은 수정 스트로우 내부에 있는 폴리머 필름, 즉 확산 배리어의 활성화제 조성물을 보여준다. 중간 도면은 확산 배리어 역할을 하는 폴리머 물질인, 수정 스트로우 내 폴리머 물질로 압출되는 활성화제 조성물을 보여준다. 아래 도면은 폴리머 2의 활성화제 조성물이 제1 용기의 제조 동안 폴리머 1과 공압출되어 2층 구조를 형성하는 상황을 보여준다.
정의
용어 "활성화제 조성물"은 비활성 가교제를 활성화할 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 지칭한다. 비활성 가교제가 활성화되면, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온이 활성화된 가교제로부터 방출될 것이다.
용어 "활성 가교제"는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 화합물을 지칭한다. 바꿔 말하면, "활성 가교제"가 중성 pH에서 소듐 알기네이트 용액과 혼합되면, 이온 가교된 알기네이트가 형성된다. 활성 가교제는 전형적으로 물과 접촉할 때 이온을 방출하는 화합물이며; 상기 이온은 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다. 따라서, CaCl2 및 BaCl2는 본원에 제공된 정의에 따른 활성 가교제의 예이고, CaCO3 및 BaCO3는 비활성 가교제의 예이다.
용어 "생체적합성 폴리머"는 해를 일으키지 않고, 살아있는 조직 또는 유기체와 공존할 수 있는 능력을 갖는 폴리머, 즉 숙주에 부정적인 영향을 주지 않고, 바람직하게는 어떤 방식으로든 숙주에 부정적인 영향을 미치지 않고, 숙주에 도입될 수 있는 폴리머를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "코팅된"은 외피, 예를 들어, 기재의 표면, 예를 들어, 수정 스트로우 또는 수정 튜브의 내부 표면에 적용되는 확산 배리어를 지칭한다. 코팅 자체는 기재를 완전히 덮는 전면 코팅일 수도 있고 기재의 일부만 덮을 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "공압출"은 일반적으로 재료의 다중 층을 동시에 압출하는 것을 의미한다. 이러한 유형의 압출은 두 개 이상의 압출기를 사용하여 다양한 점성 플라스틱의 일정한 용적 처리량을 요망하는 형태로 재료를 압출하는 단일 압출 헤드(다이)로 용융 및 전달한다. 층 두께는 일반적으로 재료를 전달하는 개별 압출기의 상대적인 속도와 크기에 의해 제어된다.
용어 "압출과 양립 가능한"은 보다 높은 온도를 거친 후에도 그 성질을 유지하는 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "확산 배리어"는 특히 물 함유 용액과 같은 액체 용액과 접촉할 때, 활성 가교제, 비활성 가교제 및/또는 활성화제 조성물에 대해 투과성인 배리어를 지칭한다. 확산 배리어는 상기 화합물에 대해 투과성이지만 배리어를 가로지르는 이동 속도는 자유 흐름에 의해 달성되었을 것보다 낮음으로써 배리어를 가로지르는 이동 속도를 지연시킨다. 많은 실제 시나리오에서, 단일 폴리머는 적용 분야의 모든 요구 사항을 충족할 수 없다. 컴파운드 압출(compound extrusion)은 블렌딩된 물질이 압출되게 할 수 있지만, 공압출은 별도의 물질을 압출된 생성물에서 다른 층으로 유지하므로, 산소 투과성, 강도, 강성 및 내마모성과 같은 성질이 다른 재료를 적절하게 배치할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "임베딩된"은 임베딩된 물질이 자연스러운 이동 가능성을 갖지 못하는 것, 즉, 물질이 달리 캡슐의 액체 코어에서와 같이 액체에 저장되어 있을 경우에 가질 수 있는 자연스러운 이동 가능성을 갖지 못하는 것을 의미한다. 부동화 정도는 예를 들어 기계적 강도와 같은 매트릭스의 특성에 따라 달라질 것이다. 임베딩된 물질은 예를 들어 이온 가교된 폴리머, 예컨대 이온 가교된 알기네이트 내에 임베딩된 정자; 제2 폴리머 물질 내에 임베딩된 활성화제 조성물; 제2 폴리머 물질 내에 임베딩된 활성 가교제; 및/또는 제2 폴리머 물질 내에 임베딩된 비활성 가교제일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "캡슐화된"은 캡슐화된 물질이 자연스러운 이동 가능성을 보유하는 것, 즉, 물질이 캡슐의 액체 코어에 저장된다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "압출된"은 전형적으로 예를 들어, 요망하는 단면의 다이를 통해 물질을 밀어서 고정된 단면 프로파일, 예를 들어, 수정 스트로우 또는 수정 튜브의 프로파일의 대상을 생성하는 데 사용되는 공정을 지칭한다. 압출될 물질이 일종의 폴리머 수지인 경우, 폴리머 수지는 전형적으로 압출 스크류에서 가열 요소와 전단 가열의 조합에 의해 용융 상태로 가열된다. 스크류 또는 스크류들은 트윈 스크류 압출이 있는 케이스로서 수지를 다이를 통해 밀어 넣어 수지를 요망하는 모양으로 형성시킨다. 압출물은 다이 또는 물 탱크를 통해 당겨짐에 따라 냉각되고 응고된다. 압출은 연속적(이론적으로 무한의 긴 물질 생산) 또는 반연속적(많은 조각 생산)일 수 있다. 일반적으로 압출되는 물질은 금속, 폴리머, 세라믹, 콘크리트, 모델링 점토 및 식료품을 포함한다. 압출 생성물은 일반적으로 "압출물"로 불린다.
본원에서 사용되는 용어 "가수 분해 효소"는 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질(들)을 포함하는 용액을 가수 분해 효소를 포함하는 다른 용액과 혼합할 때 H3O+의 생성을 가능하게 하는 가수 분해 효소를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 가수 분해 효소는 리파아제이다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 리파아제는 아실 가수 분해 효소, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제, 예컨대, 이를테면 효모 칸디다 루고사(Candida rugosa)로부터 분리된 트리아실글리세롤 리파아제이다. 적합한 리파아제는 Sigma-Aldrich Co. LLC(L1754 - Type VII 또는 L3001 Type I, CAS 번호 9001-62-1)로부터 입수 가능하다.
용어 "비활성 가교제"는 이온을 방출할 수 있도록 활성화제 조성물에 의해 활성화를 필요로 하는 화합물을 지칭하며, 상기 이온은 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다. 비활성 가교제가 활성화제 조성물에 의해 활성화되지 않으면, 비활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온을 방출할 수 없다. 다시 말해, 예를 들어 "비활성 가교제"가 활성화제 조성물의 부재 하에 중성 pH에서 소듐 알기네이트 용액과 혼합되면 이온 가교된 알기네이트가 형성되지 않는다. 그러나, 예를 들어 "비활성 가교제"가 활성화제 조성물의 존재 하에 소듐 알기네이트 용액과 혼합되면 이온 가교된 알기네이트가 형성될 것이다. 비활성 가교제는 전형적으로 25℃, pH> 8에서 물과 접촉할 때, 이온을 방출하지 않는 화합물이며; 상기 이온은 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다. 따라서, CaCl2 및 BaCl2는 본원에서 제공되는 정의에 따른 비활성 가교제가 아니고, CaCO3 및 BaCO3가 비활성 가교제의 예이다.
용어 "이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머"는 선형 또는 분지형 거대 분자가 이온 결합을 통해 서로 연결되어 3차원 폴리머 네트워크를 형성할 수 있는 폴리머를 지칭한다. 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머가 이온 결합을 통해 서로 연결되면, 폴리머는 이온 가교된 생체적합성 폴리머로서 지칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "매트릭스"는 방출될 물질이 임베딩되는 매트릭스를 지칭한다. 매트릭스는 이동 가능성을 줄이고, 부동화 정도는 일반적으로 예를 들어 기계적 강도와 같은 매트릭스의 특성에 따라 달라진다. 그러나, 부동화 정도뿐만 아니라 매트릭스의 용해 속도도 일반적으로 매트릭스의 특성에 따라 달라진다. 높은 가교도를 갖는 매트릭스는 전형적으로 낮은 가교도를 갖는 매트릭스보다 기계적 강도가 더 높으므로 용해 속도가 더 낮다. 따라서, 서로 다른 기계적 강도를 가진 두 개의 매트릭스를 결합하면 결합된 매트릭스는 서로 다른 기계적 강도를 가진 두 개의 섹션을 갖게 된다. 높은 기계적 강도는 낮은 용해 속도와 관련이 있고, 낮은 기계적 강도는 높은 용해 속도와 관련이 있기 때문에, 두 섹션은 별개의 용해 속도를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "기계적 강도"는 실시예 2에 기술된 방법에 따라 측정된다. 실시예 2에 기술된 방법에 의해 측정되는 바와 같이 섹션 중 하나의 기계적 강도가 다른 섹션의 기계적 강도와 상당히 다른 경우, 두 섹션은 별개의 기계적 강도를 갖는 것으로 간주된다. 일 구체예에서, 제1 섹션의 기계적 강도:제2 섹션의기계적 강도의 비율이 1이 아닌 경우, 두 섹션은 별개의 기계적 강도를 갖는 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 용어 "정자"는 정자 자체 및 또한 정액에 함유된 정자를 포함한다. 즉, 서방성 조성물을 형성할 때 정액이 직접 사용될 수 있다. 그러나, 임의로 다른 적절한 저장 용액에 함유된 정액으로부터 분리된 정자를 사용하여 서방성 조성물을 형성할 수도 있다.
용어 "지속 방출"은 제어 방출, 연장 방출, 정기 방출, 지체 방출, 연장 방출 및 지연 방출을 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 상세한 설명
본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 고분자 공학, 생화학, 분자 생물학 및 동물 육종 분야의 숙련가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 수치 제한 또는 범위가 명시되어 있는 경우 종점이 포함된다. 또한, 수치 제한 또는 범위 내의 모든 값과 하위 범위는 명시적으로 작성된 것처럼 구체적으로 포함된다.
본원에서 기술되는 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으며, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다.
알기네이트 매트릭스에 정자를 임베딩하면 수정 후 더 오랜 기간 동안 정자 수정 능력을 부여함으로써 이점을 제공한다는 사실이 이전에 밝혀졌다(WO2008/004890). 임베딩이 알기네이트 매트릭스 내에서 정자의 부동화를 야기하고, 제한된 이동이 저장 수명 및 수정 능력과 관련하여 유리한 정자에 의한 에너지 소비 감소를 야기하는 것으로 가정되었다.
상기 내용에 기초하면, 부동화 정도가 정자의 에너지 소비에 영향을 미치고 이에 따라 저장 수명 및 수정 능력에 영향을 미칠 것이라고 가정하는 것이 합리적으로 보인다. 부동화 정도는 전형적으로 예를 들어, 기계적 강도와 같은 매트릭스의 특성에 따라 달라지기 때문에, 이러한 특성은 저장 수명 및 수정 능력에 직접적인 영향을 미칠 것으로 예상된다.
특히 낮은 가교도를 갖는 이온 가교 폴리머 및 이온 가교 알기네이트와 같은 가교 폴리머는 높은 가교도를 갖는 이온 가교 폴리머에 비해 감소된 기계적 강도를 가질 것이다. 이러한 매트릭스는 매트릭스 내에서 더 적은 제약을 갖고, 더 높은 이동도를 허용할 것이며, 이는 상기의 관점에서 저장 수명 및 수정 능력과 관련하여 바람직하지 않을 것으로 예상된다.
PCT/EP2017/081128의 저자는 놀랍게도 임베딩된 정자의 저장 수명 및 수정 능력에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 매트릭스의 기계적 강도가 크게 감소될 수 있음을 보여주었다. 기계적 강도는 매트릭스의 용해 속도와 직접 관련이 있기 때문에, 이 발견은 임베딩된 정자의 저장 수명 및 수정 능력에 부정적인 영향을 미치지 않고 매트릭스의 용해 프로파일을 조정할 수 있게 하였다.
저장 수명 및 수정 능력에 부정적인 영향을 미치지 않고 용해 프로파일을 조정할 수 있으므로 수정 후 장기간 동안 정자가 폴리머 매트릭스에서 지속적으로 방출되는 시스템이 설계될 수 있다. 저장 수명 및 수정 능력은 고분자 매트릭스에 임베딩된 상태로 유지되기 때문에, 연속 방출이 수정 후 장기간 동안 수정에 사용할 수 있는 고품질 정자가 있음을 보장하여 배란에 비해 수정 시간이 덜 중요하게 한다.
그러나, 상기 두 보존 시스템 모두로 인해 육종가가 배란과 관련하여 가장 바람직한 수정 시점을 충족하는 데 덜 의존하게 되지만, 보존 시스템을 제조하는 절차는 복잡하고, 요망하는 결과를 얻기 위해 숙련된 인력을 필요로 하는 경우가 흔하다. 따라서, 상기 보존 시스템의 생산 절차를 단순화하는 수단이 필요하다.
서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트를 제공함으로써 상기의 필요성이 해결되었다. 이 키트는 사용하기 쉽고 숙련된 인력이 필요하지 않으며 폴리머 매트릭스, 특히 알기네이트의 제어된 겔화를 보장하고, 정자가 폴리머 매트릭스 전체에 고르게 분포되는 서방성 조성물을 제공한다.
본 발명이 인공 수정, 즉 동물 번식에 사용되도록 의도된 서방성 조성물의 단순화된 제조를 위해 설계되었지만, 본 발명의 개념은 또한 다른 활용 분야를 찾을 수 있음을 이해해야 한다. 다른 활용 분야의 예는 치료제의 투여, 진단제의 투여, 또는 생물학적 물질, 예컨대 세포 및 특히 줄기 세포의 투여에 사용되는 서방성 조성물의 단순화된 제조일 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양태는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것으로, 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 제1 용기는 활성화제 조성물 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 비활성 가교제 및 임의로 방출될 물질을 포함하고;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 제1 확산 배리어와 혼합하여 활성화제 조성물은 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 활성화제 조성물 및 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 중간층은 활성화제 조성물을 포함하거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성화제 조성물, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성화제 조성물, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질로 압출되고; 제2 확산 배리어는 제1 폴리머, 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성화제 조성물, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성화제 조성물, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 내부 표면층은 활성화제 조성물을 포함하고; 제2 확산 배리어는 제2 폴리머, 제3 폴리머 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 제2 양태는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것으로, 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 제1 용기는 비활성 가교제 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 활성화제 조성물 및 임의로 방출될 물질을 포함하고;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 제1 확산 배리어와 혼합하여 비활성 가교제는 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 비활성 가교제 및 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 중간층은 비활성 가교제를 포함하거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 비활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 비활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질로 압출되고; 제2 확산 배리어는 제1 폴리머, 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 비활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 비활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 내부 표면층은 비활성 가교제를 포함하고; 제2 확산 배리어는 제2 폴리머, 제3 폴리머 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 제3 양태는 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트에 관한 것으로, 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 제1 용기는 활성 가교제 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머 및 임의로 방출될 물질을 포함하고;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 제1 확산 배리어와 혼합하여 활성 가교제는 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 제1 용기는 제1 확산 배리어를 포함하고; 활성 가교제 및 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 중간층은 활성 가교제를 포함하거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질로 압출되고; 제2 확산 배리어는 제1 폴리머, 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 제1 용기는 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 제1 용기의 제조 동안 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 내부 표면층은 활성 가교제를 포함하고; 제2 확산 배리어는 제2 폴리머, 제3 폴리머 또는 이들의 조합이다.
위에 열거된 양태의 주제는 모두 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 제공한다는 점에서 동일한 문제에 대한 대안 해결안을 나타낸다. 문제는 가교제와 결합된 확산 배리어를 가지게 함으로써 해결되며, 가교제는 활성 가교제 또는 비활성 가교제이다. 확산 배리어는 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 보장한다.
서방성 조성물
본 발명에 따른 키트에 의해 제조될 수 있는 서방성 조성물은 전형적으로 특정 기간 동안 물질의 지속적인 공급을 보장하고 동시에 방출되지 않은 물질은 방출 시점까지 매트릭스 내에 보존되어 남아 있도록 보장하기 위해 소정 속도로 물질을 방출하도록 설계된다.
일 구체예에서, 방출될 물질은 수정 후 적어도 2 시간 동안, 예컨대 수정 후 적어도 4 시간, 수정 후 적어도 8 시간, 수정 후 적어도 16 시간, 수정 후 적어도 32 시간 또는 수정 후 적어도 144 시간의 기간 동안 방출된다. 다른 구체예에서, 방출될 물질은 수정 후 2-144 시간, 예를 들어 수정 후 4-120 시간, 수정 후 8-96 시간, 수정 후 16-72 시간, 수정 후 24-96 시간, 수정 후 24-120 시간 또는 수정 후 24-144 시간 범위의 기간 동안 방출된다.
추가로, 서방성 조성물은 이온 가교된 생체적합성 폴리머, 예컨대 이온 가교된 알기네이트에 임베딩된 방출될 물질을 포함한다.
일 구체예에서, 이온 가교된 생체적합성 폴리머는 별개의 기계적 강도를 갖는 적어도 제1 및 제2 섹션을 갖는다. 이온 가교된 생체적합성 폴리머의 기계적 강도는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다.
이온 가교된 생체적합성 폴리머의 섹션들이 별개의 기계적 강도를 갖는 경우, 이온 가교된 생체적합성 폴리머는 불균질한 가교된 생체적합성 폴리머를 나타내는 것으로, 즉 기계적 강도와 관련하여 불균질한 것으로 간주될 수 있다.
섹션들 간의 기계적 강도 차이가 작으면 이온 가교된 알기네이트는 실제로 섹션 별로 점차적으로 용해될 것이다. 그러나, 섹션들 간의 기계적 강도 차이가 크면, 이온 가교된 알기네이트는 전형적으로 시간차 용해 프로파일(time-staggered dissolution profile)을 따른다.
서방성 조성물은 소정 수의 섹션으로 분할될 수 있다. 각각의 섹션은 서방성 조성물의 일부를 나타낸다. 섹션은 용적 크기가 같거나 다를 수 있다.
별개의 기계적 강도를 갖는 제1 및 제2 섹션은 용적 크기가 유사하거나 같을 수 있다. 별개의 기계적 강도를 갖는 제1 및 제2 섹션은 서방성 조성물에서 서로 인접하게 위치할 수 있거나, 서방성 조성물에서 서로 인접하여 위치하지 않을 수 있다.
추가로, 서방성 조성물은 원칙적으로 임의의 3차원 형상, 예컨대 구형, 원환체(torus), 원통, 원뿔, 정육면체, 직육면체, 삼각뿔, 사각뿔, 삼각 기둥 또는 이들의 조합을 취할 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 이온 가교된 생체적합성 폴리머는 유사하거나 동일한 기계적 강도를 갖는 적어도 제1 및 제2 섹션을 갖는다. 이온 가교된 생체적합성 폴리머의 기계적 강도는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다.
이온 가교된 생체적합성 폴리머의 섹션들이 동일한 기계적 강도를 갖는 경우, 이온 가교된 생체적합성 폴리머는 균질한 가교된 생체적합성 폴리머를 나타내는 것으로, 즉 기계적 강도와 관련하여 균질한 것으로 간주될 수 있다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 이온 가교된 생체적합성 폴리머는 기계적 강도와 관련하여 균질하다.
본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 이온 가교된 생체적합성 폴리머는 기계적 강도와 관련하여 불균질하다.
서방성 조성물은 본 발명에 따른 키트를 사용하여 숙련된 인력 없이도 보다 용이하게 제조될 수 있다. 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함한다.
이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머
제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 예컨대 이온 가교 가능한 알기네이트를 포함한다. 그러나, 제2 용기는 또한 천연 발생이든 합성이든, 그리고 호모폴리머이든 코폴리머이든 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 추가로 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명에 따른 일 구체예에서, 제2 용기는 이온 가교 가능한 알기네이트 이외의 다른 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 추가의 구체예에서, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머는 2가 양이온 가교 가능한 폴리머, 예컨대 2가 양이온 가교 가능한 알기네이트이다.
알기네이트는 1,4-결합된-β-D-만누론산과 α-L-굴루론산의 음이온성 코폴리머이다. 다양한 형태의 알기네이트가 상업적으로 입수 가능하다. 이러한 형태는 전형적으로 60% 1,4-결합된-β-D-만누론산 및 40% α-L-굴루론산이거나; 30% 1,4-결합된-β-D-만누론산 및 70% α-L-굴루론산이다. 본 발명에 따른 일 구체예에서, 이온 가교된 폴리머는 만누론산 잔기보다 더 많은 굴루론산 잔기를 갖는 알기네이트이다. 특정 구체예에서, 이온 가교된 폴리머는 > 50% 굴루론산 잔기, 예컨대 > 60% 굴루론산 잔기, > 70% 굴루론산 잔기 또는 > 80% 굴루론산 잔기를 포함하는 알기네이트이다. 상기 비율은 알기네이트 폴리머의 총 잔기 수를 기준으로 하여 계산된다. 100개의 굴루론산 잔기와 400개의 만누론산 잔기를 갖는 이온 가교된 폴리머는 20%의 굴루론산 잔기 및 80%의 만누론산 잔기를 포함한다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 알기네이트는 만누론산 잔기보다 더 많은 굴루론산 잔기를 갖는다.
알기네이트는 예를 들어, 식품 산업에서, 예를 들어, 안정화제로서 및 점도 조절용으로, 제약 및 화장품 산업에서, 예를 들어 붕해제로서 널리 사용된다. 다양한 목적을 위해, 굴루론산 또는 만누론산이 풍부한 알기네이트 둘 모두는 각각 이용 가능하며(Mancini et al., (1999), Journal of Food Engineering 39, 369-378), 굴루론산이 풍부한 알기네이트를 제조하는 다양한 방법이 공지되어 있다(참조: WO 8603781, US 4,990,601, US 5,639,467).
제1 용기
제1 용기는 전형적으로 생물학적 물질의 냉동 보존 또는 냉동 저장 공정에 사용되며, 이 공정은 조절되지 않은 화학반응속도에 의해 손상되기 쉬운 생물학적 물질(예를 들어, 정자)이 매우 낮은 온도(전형적으로, 고체 이산화탄소를 사용하는 -80℃, 또는 액체 질소를 사용하는 -196℃)로 냉각시킴으로써 보존되는 공정이다. 충분히 낮은 온도에서는, 해당 생물학적 물질에 손상을 줄 수 있는 임의의 효소적 또는 화학적 활동이 효과적으로 중단된다. 냉동 보존 방법은 동결 동안 얼음 결정의 형성으로 인한 추가 손상 없이 저온에 도달하는 것을 추구한다.
따라서, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태에 따른 일 구체예에서, 제1 용기는 매우 낮은 온도, 예컨대 -20℃ 미만의 온도, -80℃ 미만의 온도, 또는 -196℃ 미만의 온도에 주어지는 것과 양립 가능한 물질로 제조된다. 이러한 온도의 예는 고체 이산화탄소를 사용하는 -80℃, 또는 액체 질소를 사용하는 -196℃이다. 물질이 매우 낮은 온도에 주어지는 것과 양립 가능하기 위해서는, 물질이 그러한 낮은 온도에서 장기간 보관하는 동안 동일한 모양, 구조 및 기능을 유지해야 한다. 또한, 제1 용기가 제1 용기 내에 저장될 생물학적 물질에 반응하지 않거나, 달리 부정적인 영향을 미치지 않는 것이 중요하다.
제1 용기는 생물학적 물질의 냉동 보존 또는 냉동 저장에 사용될 수 있지만, 제1 용기는 또한 새로운 정자 제제에도 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 제1 용기가 새로운 정자 제제에 사용되어 냉동 보존 또는 냉동 보존이 필요하지 않은 경우, 제1 용기는 매우 낮은 온도에 주어지는 것에 양립 가능한 물질로 제조될 필요가 없지만, 제1 용기에 저장될 생물학적 물질과 반응하지 않거나, 달리 이에 부정적인 영향을 미치지 않는 임의의 물질로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 일 구체예에서, 제1 용기는 수정 스트로우 또는 수정 튜브와 같은 수정 용량을 위한 용기이다. 수정 스트로우가 도 1에 도시되어 있다. 이러한 스트로우는 통상적으로 예를 들어 1.6 또는 2.5 mm의 내경을 갖는 얇은 튜브, 및 얇은 튜브 내에 삽입된 플러그(4)로 형성된다.
채워진 상태에서, 플러그는 튜브의 제1 단부(2)에 가깝게 배열되고, 제2 용기에 원래 포함된 내용물은 플러그와 튜브의 제2 단부(3) 사이의 스트로우에 배열된다. 스트로우를 채우기 위해, 플러그(4)에 가까운 튜브의 제1 단부(2)는 전형적으로 진공 소스와 연통하도록 배치되고, 제2 단부(3)는 스트로우에 도입될 물질을 함유하는 제2 용기와 연통하도록 배치된다. 플러그와 제2 단부(3) 사이에 초기에 포함된 공기는 플러그(4)를 통해 흡입되고, 물질은 플러그(4)에 도달할 때까지 튜브 내로 전진 이동하는데, 플러그(4)가 액밀되기 때문에 그것이 통과할 수는 없다. 필요에 따라, 충전 후, 스트로우는 단부 한쪽 또는 둘 모두 가까이에 용접되고, 전형적으로 -80℃ 미만의 온도, 또는 더욱 바람직하게는 대략 -196℃의 온도에서와 같이 냉동 보관된다.
스트로우를 비우기 위해, 필요에 따라, 용접된 단부 부분을 절단하고, 해동한 후 플러그(4)에 닿을 때까지 플러그(4)에 가장 가까운 단부를 통해 튜브에 막대를 삽입한다. 이 막대를 사용하여, 플러그는 플러그(4)에서 가장 먼 단부를 향해 피스톤 방식으로 활주하도록 제조됨으로써 초기에 스트로우에 함유된 물질의 용량이 그 단부를 통해 배출된다.
제2 용기
제2 용기는 생물학적 물질의 냉동 보존 또는 냉동 저장에 반드시 사용되는 것은 아니다. 즉, -80℃ 또는 -196℃와 같은 저온에 반드시 노출되는 것은 아니므로, 제1 용기와 동일하거나 다른 물질로 제조될 수 있다. 그러나, 제2 용기는 또한 내용물이 제1 용기로 전달되기 전에 제2 용기 내에 포함될 수 있는 생물학적 물질에 반응하지 않거나, 그렇지 않으면 부정적인 영향을 미치는 물질로 제조되는 것이 중요하다.
방출될 물질
본 발명에 따른 일 구체예에서, 제2 용기는 방출될 물질을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 방출될 물질은 생물학적 물질, 예컨대 세포 및 특히 줄기 세포, 치료제, 진단제 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 특히 바람직한 일 구체예에서, 방출될 물질은 정자이다.
확산 배리어(들)
본 발명에 따른 키트를 사용하여 서방성 조성물을 제조할 때, 방출될 물질, 예를 들어. 정자는 전형적으로 제2 용기의 내용물에 첨가되고, 그 후 제2 용기의 내용물이 제1 용기로 옮겨진다. 그 절차의 결과는 제1 용기의 확산 배리어 중 하나 이상이 물에 노출되어 수화 가능한 확산 배리어(들)를 수화된 확산 배리어(들)로 변환시키는 것이다. 수화된 확산 배리어(들)은 바람직하게는 활성화제 조성물, 비활성 가교제 및/또는 활성 가교제에 대해 투과성이다.
따라서, 본 발명에 따른 일 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 수화 가능한 확산 배리어이다. 즉, 확산 배리어가 물과 접촉할 때 수화된다. 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 제1 폴리머 물질이 수화 가능한 확산 배리어가 아니라는 조건 하에 수화 가능한 확산 배리어이다.
본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 필름 형성 폴리머이다. 필름 형성 폴리머는 용기의 내부 표면과 같은 기재 위에 유연하고, 응집력 있고 연속적인 외피를 남기는 화학물질의 군이다. 필름 형성 폴리머의 예는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 아크릴레이트, 아크릴아미드 및 다양한 코폴리머이다.
본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 제1 폴리머 물질이 필름 형성 폴리머가 아니라는 조건 하에 필름 형성 폴리머이다.
본 발명에 따른 추가 구체예에서, 제1 확산 배리어는 i) 알기네이트와 같은 천연 폴리머, 덱스트란, 전분 및 아가로스와 같은 그 밖의 다당류, 셀룰로스 유도체, 예컨대 CMC(카복시 메틸 셀룰로스), 메틸셀룰로스 및 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 셸락과 같은 단백질; ii) PVA(폴리비닐 알코올), 수용성 폴리아미드, 폴리아크릴산 및 폴리아크릴산 무수물, 폴리 메타크릴산, 폴리메타크릴산 무수물, 폴리 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-n-이소프로필아크릴 아미드, 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 폴리머 또는 코폴리머; 또는 iii) 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제1 확산 배리어는 친수성인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 제1 확산 배리어의 두께는 50 nm 내지 100 ㎛ 범위, 더욱 바람직하게는 100 nm 내지 10 ㎛ 범위이다. 또한, 제1 확산 배리어는 바람직하게는 균일하고 가능한 한 얇아야 한다.
성공적인 결과를 얻기 위해서는, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머의 겔화가 제어되는 것이 바람직하다. 즉, 너무 빨리 겔을 형성하지 않고 방출될 물질이 서방성 조성물, 즉, 이온 가교된 생체적합성 폴리머 전체에 고르게 분포되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제1, 제2 및 제3 양태에서, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머의 제어된 겔화는 활성 가교제의 지연 및 지속 방출에 의해 달성된다.
본 발명의 제1 및 제2 양태에서, 활성 가교제의 지연 및 지속 방출은 제2 용기의 내용물이 제1 용기로 옮겨진 후 적어도 하나의 확산 배리어에 의해 비활성 가교제가 활성화제 조성물로부터 분리되도록 함으로써 달성된다. 활성화제 조성물이 비활성 가교제와 접촉할 때, 비활성 가교제는 활성 가교제로 변환된다. 이후, 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머와 함께 이온 가교된 생체적합성 폴리머를 형성할 것이다. 겔화 속도는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머에 사용할 수 있는 활성 가교제의 양을 조절하여 제어될 수 있다.
본 발명의 제3 양태에서, 활성 가교제의 지연 및 지속 방출은 활성 가교제가 적어도 하나의 확산 배리어에 의해 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머로부터 분리되도록 함으로써 달성된다. 활성 가교제가 확산 배리어(들)를 통과하고 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머와 접촉하면, 이온 가교된 생체적합성 폴리머가 형성된다. 겔화 속도는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머에 사용할 수 있는 활성 가교제의 양을 조절함으로써, 즉 확산 배리어(들)를 가로지르는 수송 속도를 조절함으로써 제어될 수 있다.
본 발명의 제1 및 제2 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성화제 조성물 및 비활성 가교제가 서로 지연된 속도로 접촉하게 하여, 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 보장한다.
본 발명의 제3 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 허용한다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 활성화제 조성물은 제1 및/또는 제2 확산 배리어 내에 균일하게 분포된다. 또한, 바람직하게는, 건조 중에 상 분리가 발생하지 않아야 한다.
본 발명의 제1 및 제2 양태에 따른 또 다른 구체예에서, 활성화제 조성물과 비활성 가교제의 혼합물은 활성 가교제의 형성을 초래하고, 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다.
활성 가교제
용어 "활성 가교제"는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 화합물을 지칭한다. 활성 가교제는 전형적으로 물과 접촉할 때 이온을 방출하는 화합물이고; 상기 이온은 이온 가교성 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다. 물과 접촉하였을 때 이온을 방출하는 화합물은 전형적으로 수용성이며, 바람직하게는 물에 대한 용해도(25℃, pH = 7)가 1 g/L 초과, 예컨대 10 g/L 초과 또는 100 g/L 초과인 화합물이다. CaCl2 및 BaCl2는 각각 약 811 g/L 및 358 g/L의 물에 대한 용해도(25℃, pH = 7)를 가지며, 따라서 본 발명에 따른 활성 가교제의 전형적인 예를 나타낸다. 대조적으로, CaCO3 및 BaCO3는 각각 약 0.013 g/L 및 0.024 g/L의 물에 대한 용해도(25℃, pH = 7)를 가지며, 따라서 본원에 정의된 활성 가교제로 간주되지 않고, 오히려 비활성 가교제로 간주되어야 한다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 활성 가교제는 수용성인 2가 양이온 염, 예컨대 2가 양이온 클로라이드, 2가 양이온 아세테이트, 2가 양이온 시트레이트, 바람직하게는 CaCl2, BaCl2, Ca(CH3COO)2, Ba(CH3COO)2, 칼슘 시트레이트, 바륨 시트레이트 또는 이들의 임의의 혼합물, 및 더욱 바람직하게는 CaCl2, Ca(CH3COO)2, 칼슘 시트레이트 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 제1 용기 및 제2 용기는 제2 용기의 내용물과 제1 용기의 내용물을 혼합하기 전에 임의의 활성 가교제를 함유하지 않는다.
비활성 가교제 - 활성화제 조성물
용어 "비활성 가교제"는 이온을 방출할 수 있도록 활성화제 조성물에 의해 활성화를 필요로 하는 화합물을 지칭하며; 상기 이온은 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다. 비활성 가교제가 활성화제 조성물에 의해 활성화되지 않으면, 비활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온을 방출할 수 없다. 비활성 가교제는 일반적으로 25℃, pH> 8에서 물과 접촉할 때 이온을 방출하지 않는 화합물이고; 상기 이온은 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합하다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 비활성 가교제는 물에 대한 용해도(25℃, pH = 7)가 1 g/L 미만, 예컨대 10 g/L 미만 또는 100 g/L 미만인 화합물이다. CaCl2 및 BaCl2는 각각 약 811 g/L 및 358 g/L의 물에 대한 용해도(25 ℃, pH = 7)를 가지며, 따라서 본원에 정의된 바와 같이 비활성 가교제가 아니다. 그러나, CaCO3 및 BaCO3는 각각 약 0.013 g/L 및 0.024 g/L의 물에 대한 용해도(25℃, pH = 7)를 가지므로, 본원에 정의된 비활성 가교제로 간주되어야 한다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 비활성 가교제는 수불용성인 2가 양이온 염, 예컨대 2가 양이온 카보네이트, 더욱 바람직하게는 CaCO3, BaCO3 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
CaCO3 및 BaCO3와 같은 비활성 가교제는 산성 pH에서 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온을 방출한다. 따라서, 양성자 공여체로 작용할 수 있는 임의의 화합물은 이러한 비활성 가교제에 적합한 활성화제 조성물일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 일 구체예에서, 활성화제 조성물은 산과 같은 양성자 공여체를 포함하고, 비활성 가교제는 양성자 공여체와 접촉시 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온을 방출하는 화합물이다. 양성자 공여체는 수용성인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 양성자 공여체는 i) 유기산, 예컨대 아스코르브산, 시트르산 또는 이들의 임의의 혼합물; ii) 무기산, 예컨대 인산, 염산 또는 이들의 혼합물; 또는 iii) 유기산과 무기산의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 대안적인 구체예에서, 활성화제 조성물은 물과 접촉시 산과 같은 양성자 공여체로 변환되는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물의 대표적인 예는 무기산 무수물, 유기산 무수물 및 락톤, 예컨대 글루코노 델탈락톤 또는 이들의 임의의 혼합물이다. 보다 바람직한 구체예에서, 활성화제 조성물은 유기산 무수물, 글루코노 델탈락톤 또는 이들의 임의의 혼합물이고; 더욱 더 바람직하게는 활성화제 조성물은 글루코노 델탈락톤(글루코노-δ-락톤)을 포함한다.
글루코노-δ-락톤은 용액에서 서서히 가수 분해되어 글루콘산을 형성하는 단순 당이다. 이 가수 분해는 예를 들어 탄산이 2가 양이온 카보네이트, 예컨대 CaCO3 또는 BaCO3로부터 형성되어 활성 이온을 방출하여 겔화를 유도할 수 있는 시점까지 용액의 pH가 점차적으로 감소되게 한다. 글루코노-δ-락톤 가수 분해의 속도 및 이에 따른 겔화의 개시는 예를 들어 용액의 온도를 변경함으로써 변경될 수 있다. 겔화가 활성화된 가교제 - 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머 접촉 표면에서 진행됨에 따라, 가교된 폴리머 거대 분자의 부피가 감소하여 이것이 또한 나머지 폴리머 용액의 유효 농도를 감소시킨다.
활성화제 조성물의 또 다른 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2013/076232에 기재되어 있다. 상기 문헌에 개시된 활성화 시스템은 가수 분해 효소 및 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질의 사용을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "가수 분해 효소"는 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질(들)을 포함하는 용액을 가수 분해 효소를 포함하는 다른 용액과 혼합할 때 H3O+의 생성을 가능하게 하는 가수 분해 효소를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 가수 분해 효소는 리파아제이다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 리파아제는 아실 가수 분해 효소, 더욱 바람직하게는 트리아실글리세롤 리파아제, 예컨대, 이를테면 효모 칸디다 루고사(Candida rugosa)로부터 분리된 트리아실글리세롤 리파아제이다. 적합한 리파아제는 Sigma-Aldrich Co. LLC(L1754 - Type VII 또는 L3001 Type I, CAS 번호 9001-62-1)로부터 입수 가능하다.
기질에 결합할 때 H3O+의 생성을 초래하는 임의의 가수 분해 효소가 본 발명에 따라 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 사용될 수 있는 가수 분해 효소는 카복실산 에스테르 가수 분해 효소, 옥살로아세타아제, 글리코시다아제, 에테르 가수 분해 효소 및 선형 아미드의 펩타이드 결합 이외의 탄소-질소 결합에 작용하는 가수 분해 효소, 예컨대 키틴 데아세틸라아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
카복실산 에스테르 가수 분해 효소의 비제한적인 예는 카복실에스테라아제, 트리글리세롤 리파아제, 아세틸 에스테라아제, 스테롤 에스테라아제, L-아라비노놀락토나아제, 글루코노락토나아제, 아실글리세롤 리파아제, g-아세틸글루코스 데아세틸라아제, 지단백질 리파아제, 지방 아실 에틸 에스테르 합성 효소, 폴리(3-하이드록시부티레이트)탈중합 효소, 및 디아실글리세롤 아실가수분해효소이다. 옥살로아세타아제의 비제한적인 예는 푸마릴아세토아세타아제, 아실피루베이트 가수 분해 효소 및 아세틸피루베이트 가수 분해 효소이다.
글리코시다아제의 비제한적인 예는 α-글루쿠로니다아제이다. 에테르 가수 분해 효소의 비제한적인 예는 이소코리스마타아제이다.
가수 분해 효소의 기질은 가수 분해 효소에 결합할 때 H3O+의 생성을 야기하는 기질이다. 따라서, 기질은 본 발명에 따라 사용되는 가수 분해 효소의 유형에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 적합한 기질은 유기산, 예컨대 카복실산의 에스테르이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 기질은 하기 화학식 I의 화합물이다:
상기 식에서, R1, R2 및 R3은 독립적으로 동일하거나 상이하며 직쇄 또는 분 지형의, 치환 또는 비치환된 C1-C12 알킬 카보닐 사슬, 예컨대, 이를테면 메타논, 에타논, 아세톤, 부타논, 펜타논, 헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논, 데카논, 도데카논 등을 나타낸다. 일 구체예에 따르면, R1, R2 및 R3은 각각 메타논이다. 다른 구체예에 따르면, R1, R2 및 R3은 각각 에타논이다. 또 다른 구체예에 따르면, R1, R2 및 R3은 아세톤이다. 화학식 I의 기질은 본 발명에 따른 가수 분해 효소로서 트리아실글리세롤 리파아제를 사용할 때 특히 유용하다. 기질에 결합할 때, 상기 화학식 I의 에스테르는 글리세롤 및 카복실산으로 분리된다. 즉, 따라서, H3O+를 제공한다.
알킬 카보닐 사슬은 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 알킬 카보닐 사슬은 또한 치환되거나 비치환될 수 있다. 당업자는 본원의 교시에 기초하여 화학식 I에 의해 포함되는 다양한 기질이 사용될 수 있고, 본원의 교시에 기초하여 본 발명에 따라 사용될 적절한 기질을 선택할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 당업자는 기질의 글리세롤 및 카복실산을 생성하는 효소의 능력에 영향을 미치지 않으면서 알킬 사슬 길이가 달라질 수 있고, 이에 따라 H3O+ 이온의 방출을 야기할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 기질은 하기 화학식의 트리아세틴, 트리프로피오닌 및 트리부티린의 군으로부터 선택된다:
트리아세틴 트리프로피오닌 트리부티린
따라서, 일 구체예에 따르면, R1, R2 및 R3은 C1-C4 알킬 카보닐을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 존재하는 기질은 트리프로피오닌 및 트리부티린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 상기 정의된 가수 분해 효소 및 기질의 혼합은 H3O+ 생성을 야기한다. 또한, 상기 H3O+는 비활성 가교제로부터 이온 방출을 야기한다.
가수 분해 효소가 비활성 가교제를 직접 활성화하지 않더라도, 가수 분해 효소가 일련의 이벤트를 개시하여 비활성 가교제의 활성화를 야기하기 때문에 활성화제 조성물을 나타내는 것으로 여전히 간주될 수 있다. 따라서, 활성화제 조성물은 비활성 가교제를 직접(예를 들어, 양성자 공여체를 사용하여) 활성화하거나, 비활성 가교제를 간접적으로(예를 들어, 가수 분해 효소 및 이의 기질을 사용하여) 활성화할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 구체예에서, 활성화제 조성물은 일련의 이벤트를 개시함으로써 비활성 가교제를 활성화시켜 비활성 가교제를 간접적으로 활성화시킨다. 이러한 활성화제 조성물의 일례는 기질을 가수 분해하여 산의 형성을 초래하는 가수 분해 효소이며, 이는 또한 예를 들어 CaCO3와 상호작용하여 상기 카보네이트 염으로부터 유리 칼슘 이온을 방출시킨다. 비활성 가교제를 간접적으로 활성화시키는 활성화제 조성물의 또 다른 예는 비활성 가교제를 활성화할 수 있기 전에 산 형태로 가수 분해되어야 하는 글루코노-δ-락톤이다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 가수 분해 효소 및 그의 기질은 제1 용기의 내용물과 제2 용기의 내용물을 혼합하기 전에 별도의 용기에 포함된다. 본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 가수 분해 효소 및 그의 기질은 두 화합물이 예를 들어 제1 확산 배리어, 제2 확산 배리어 또는 이들의 임의의 혼합과 같은 확산 배리어에 의해 분리된다는 조건 하에 동일한 용기에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 일 구체예에서, 활성화제 조성물은 가수 분해 효소를 포함한다. 가수 분해 효소가 목적을 달성하기 위해, 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질은 제1 용기의 내용물이 제2 용기의 내용물과 혼합되기 전에 기질이 가수 분해 효소와 접촉하지 않아야 한다는 조건 하에 제1 및/또는 제2 용기에 존재해야 한다.
본 발명에 따른 또 다른 구체예에서, 활성화제 조성물은 가수 분해 효소에 의해 가수 분해 가능한 기질을 포함한다. 기질이 그 목적을 달성하기 위해, 가수 분해 효소는 제1 용기의 내용물이 제2 용기의 내용물과 혼합되기 전에 기질이 가수 분해 효소와 접촉하지 않아야 한다는 조건 하에 제1 및/또는 제2 용기에 존재해야 한다.
본 발명에 따른 추가 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 확산 배리어 및 활성화제 조성물 모두로서 작용할 수 있다. 이는 예를 들어 산과 같은 양성자 공여체인 확산 배리어를 선택함으로써, 또는 물과 같은 액체와 접촉할 때 양성자 공여체로 변환되는 확산 배리어를 선택함으로써 달성될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 일 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성화제 조성물이다.
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 산과 같은 양성자 공여체이거나 물과 접촉시 양성자 공여체로 변환된다. 이러한 성질을 갖는 확산 배리어는 폴리알킬 시아노아크릴레이트, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴산 무수물, 폴리메타크릴산 무수물 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 실시예를 참조하여 추가 이해를 얻을 수 있으며, 이는 예시의 목적으로만 본원에 제공되며 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
실시예 1: 수정 스트로우 내 알기네이트 겔에서의 소 정자 준비
물질
다음 화학 물질을 사용하였다: 트리즈마 하이드로클로라이드, EDTA, NaHCO3, NaCl, NaOH, 글리세롤(> 99%), 프룩토스, 아스코르브산 및 소듐 시트레이트 카복시 메틸 셀룰로스(CMC)(Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)로부터), 폴리 비닐 알코올(PVA), Selvol 523/Selvol 325(Sekisui Specialty Chemicals Europe SL(Tarragona Spain)로부터). 글루코스 무수물(Apro(Oslo, Norway)로부터). ViCality AlbaFil 칼슘 카보네이트(Brenntag Specialties(South Plainfield, USA)로부터) 및 소듐 알기네이트(UP-LVG)(Novamatrix A/S(Drammen, Norway)로부터).
정자의 공급원
소 정자는 Geno 시설(Geno facilities)(Hallsteing
rd, Trondheim 및 Store Ree, Stange, Norway)에서 수집되었다.
완충 용액
다음 익스텐더 용액(extender solution)이 사용되었다:
● 정자의 일차 희석을 위한 익스텐더: 1.45 g l-1 트리즈마 하이드로클로라이드 글루코스, 0.4 g l-1 소듐 시트레이트, 1 g l-1 프룩토스 및 200 ml l-1 난황. NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 6.4로 조정하였다.
● 정자의 이차 희석을 위한 익스텐더 용액: 1 g l-1 ViCality Albafil 칼슘 카보네이트, 54 g l-1 프룩토스, 170 g l-1 글리세롤 및 10 g l-1 UP-LVG 소듐 알기네이트. 두 익스텐더 모두 적어도 EU dir 88/407에서 요구하는 최종 농도를 제공하는 표준 항생제 칵테일을 포함한다.
수정 스트로우의 코팅:
수정 스트로우(유형 "미디엄")를 13.6 μmol/mL의 아스코르브산 수용액과 수중 3% PVA의 혼합물 또는 13.6 μmol/mL의 아스코르브산 수용액과 수중 1.5% CMC의 혼합물로 플러싱(flushing)함으로써 코팅하였다. 스트로우를, 코팅 용액으로 플러싱한 후 실온의 진공 챔버에서 건조시켰다.
황소 정자의 희석 및 부동화
Geno 시설에서 소 정자를 채취하였다. 채취 직후, 일차 희석을 위해 익스텐더 용액에서 ml 당 133 x 106 세포의 농도로 정자를 희석시켰다. 이후, 정자를 함유한 생성된 용액을 4℃로 냉각시켰다. 4℃로 냉각시킨 후, 용액을 이차 희석을 위해 동일한 부피의 익스텐더 용액과 혼합하였다.
이후, 정자를 함유한 용액을 상기 기술된 바와 같이 아스코르브산과 PVA 또는 아스코르브산과 CMC로 코팅된 수정 스트로우로 옮겼다. 수정 스트로우는 4℃에서 보관하고 1, 3, 5 및 24시간 후에 겔화 및 pH에 대해 내용물을 확인하였다.
겔화 및 겔 강도 및 정자의 운동성 평가
두 가지 유형의 코팅에 대해 1시간 후 스트로우 내 액체의 점도 증가가 관찰되었다. 3시간 후 스트로우 내에 겔이 형성되었고, 24시간 후에 스트로우 내에 단단한 겔이 관찰되었다.
정자의 운동성을 현미경 평가를 사용하여 평가하였다. 운동성을 측정하기 전에, 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 있는 0.9 ml의 개질된 IVT 용액에 수정 스트로우의 내용물을 첨가하고, 튜브 텀블러에서 약 10분 동안 튜브를 조심스럽게 쉐이킹함으로써 알기네이트 겔을 개질된 IVT 용액(3 g l-1 글루코스, 20 g l-1 소듐 시트레이트, 2.1 g l-1 NaHCO3, 1.16 g l-1 NaCl, 3 g l-1 EDTA, pH 7.35)에 액화시켰다. 운동성을 현미경으로 평가하기 전에 튜브를 최소 15분 동안 열 블록에서 37℃로 예열하였다. 약 3 ㎕의 용액을 예열된 현미경 슬라이드에 첨가하고 광학 현미경을 사용하여 즉시 검사하였다. 각 샘플에서 운동성 정자의 수는 가장 가까운 5% 간격으로 추정되었다.
두 가지 유형의 코팅으로 스트로우를 채운 후 1시간 동안 평가하였을 때 정자의 약 85%가 운동성이 있었고, 5시간 후 두 가지 유형의 스트로우에 대해 정자의 약 70%가 운동성이 있었다. 24시간 후에 평가했을 때, 정자의 약 50%는 아스코르브산과 PVA로 코팅된 스트로우에서 운동성이 있었고, 정자의 60%는 아스코르브산과 CMC로 코팅된 스트로우에서 운동성이 있었다.
실시예 2: 부동화된 정자 세포를 갖는 다양한 알기네이트 겔의 기계적 강도 측정
물질
다음 화학 물질을 사용하였다: 트리즈마 하이드로클로라이드, EDTA, D-(+)-글루콘산 δ-락톤, NaHCO3, NaCl, 글리세롤(> 99%), 프룩토스 및 소듐 시트레이트(Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)로부터). 글루코스 무수물(Apro(Oslo, Norway)로부터). Eskal500 칼슘 카보네이트(KSL staubtechnik gmbh(Lauingen, Germany)로부터) 및 소듐 알기네이트(UP LVG 및 UP VLVG)(NovaMatrix, FMC BioPolymer AS(Sandvika, Norway)로부터). 표준 정자 스트로우 0.25 ml(프렌치 미니 스트로우(French mini straws)(IMV, L'Aigle, France)).
정자의 공급원
소 정자는 Geno 시설(Hallsteing
rd, Trondheim 및 Store Ree, Stange, Norway)에서 수집되었다.
완충 용액
다음 익스텐더 용액이 사용되었다:
정자의 일차 희석을 위한 익스텐더: 1.45 g l-1 트리즈마 하이드로클로라이드 글루코스, 0.4 g l-1 소듐 시트레이트, 1 g l-1 프룩토스 및 200 ml l-1 난황. NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 6.4로 조정하였다.
정자의 이차 희석을 위한 익스텐더 용액: 0.5 g l-1 Eskal500 칼슘 카보네이트, 54 g l-1 프룩토스, 170 g l-1 글리세롤 및 12 g l-1 소듐 알기네이트(UP LVG 와 UP VLVG의 혼합물). 두 익스텐더 모두 적어도 EU dir 88/407에서 요구하는 최종 농도를 제공하는 표준 항생제 칵테일을 포함한다.
황소 정자의 희석, 부동화 및 냉동저장
Geno 시설에서 소 정자를 채취하였다. 채취 직후, 일차 희석을 위해 익스텐더 용액에서 ml 당 133 x 106 세포의 농도로 정자를 희석시켰다. 이후, 정자를 함유한 생성된 용액을 4℃로 냉각시켰다. 4℃로 냉각시킨 후, 용액을 이차 희석을 위해 동일한 부피의 익스텐더 용액과 혼합하였다. 겔화를 개시시키기 위해 혼합물에 D-(+)-글루콘산 δ-락톤을 최종 농도 55 mM이 되도록 첨가하고, 정액 스트로우에 채웠다. 스트로우를 4℃에서 약 4.5 시간 동안 보관하고 냉동 저장을 위한 표준 절차에 따라 액체 N2에서 냉동시켰다. 다양한 기계적 강도를 갖는 알기네이트 겔을 생성하기 위해 이차 희석 용액에서 UP LVG 및 UP VLVG의 비율을 다양하게 변경하였다.
기계적 강도 평가
처리 당 10개의 냉동 정액 스트로우를 37℃에서 1분 동안 해동하고, 이어서 평행하게 밀착하여 정렬하고 금속판 중앙에 배치하였다. 정액 스트로우에서 겔의 기계적 강도를 정량화하기 위해 P/35 프로브(35mm DIA CYLINDER ALUMINIUM)가 장착된 텍스처 분석기 TA XT 플러스(Texture analyzer TA XT Plus)(Stable micro systems, Godalming, Surrey, UK)를 사용하였다. 측정(테스트 모드 압축)은 1 kg 로드 셀을 사용하여 테스트 속도 0.1 mm/s에서 80% 변형까지 실행되었다. 기계적 강도는 겔 변형에 대한 힘의 초기 선형 기울기(0.05 mm와 0.1 mm 사이)로 정량화되었다. 실시예 1에서와 같이 수동 평가에 의해 약하거나 부드러움을 특징으로 하는 스트로우로부터의 겔의 기계적 강도는 43 g/mm로 측정되었다. 수동 평가에 의해 강한 것으로 특징되는 스트로우로부터의 겔의 기계적 강도는 90 g/mm로 측정되었다.
실시예 3: 코팅된 수정 스트로우
코팅된 수정 스트로우의 제조
물질: 폴리비닐 알코올 Selvol 523 및 Selvol 325(Sekesui Specialty Chemicals Europe S.L.(Tarragonia, Spain)로부터), 카복시 메틸 셀룰로스(CMC): CEKOL, 셀룰로스 검, 소듐 카복시메틸 셀룰로스 E466(CP Kelco로부터), 메틸셀룰로스와 하이드록시프로필메틸셀룰로스의 혼합물 Benecel MP 812W(Ashland Wilmington(Delaware USA)로부터), 메틸셀룰로스와 하이드록시프로필 메틸셀룰로스의 혼합물, 하이프로멜로스 Methocel K100(Dow Chemical Company로부터), 아스코르브산(Sigma Aldrich로부터), 염산 AnalaR NORMAPUR®(VWR로부터).
1) 13.6 μmol/mL의 아스코르브산 수용액과 수중 3% PVA(폴리 비닐 알코올) 또는 5% PVA(폴리 비닐 알코올)의 혼합물로 플러싱함으로써 수정 스트로우를 코팅하였다.
2) 13.6 μmol/mL의 아스코르브산 수용액과 수중 1.5% CMC(카복시 메틸 셀룰로스)의 혼합물(코팅 용액)로 플러싱함으로써 수정 스트로우를 코팅하였다. 스트로우를, 코팅 용액으로 플러싱한 후 실온 하의 진공 상태에서 이동 건조시켰다.
3) 13.6 μmol/mL의 아스코르브산 수용액과 수중 1.5% Benecel MP 812 W(메틸 셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스)의 혼합물 또는 13.6 μmol/mL의 아스코르브산 수용액과 수중 1.5% Methocel K100(메틸 셀룰로스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스-하이프로멜로스)의 혼합물(코팅 용액)로 플러싱함으로써 수정 스트로우를 코팅하였다. 스트로우를, 코팅 용액으로 플러싱한 후 실온 하의 진공 상태에서 이동 건조시켰다.
4) 35 μmol/mL의 염산 수용액과 수중 3% PVA(폴리 비닐 알코올) 또는 수중 5% PVA(폴리 비닐 알코올)의 혼합물(코팅 용액)로 플러싱함으로써 수정 스트로우를 코팅하였다. 스트로우를, 코팅 용액으로 플러싱한 후 실온 하의 진공 상태에서 이동 건조시켰다.
폴리머의 셀룰로스 유형, 예컨대 CMC(카복시 메틸 셀룰로스), Benecel MP 812 W(메틸셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스) 및 Methocel K100(메틸 셀룰로스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스-하이프로멜로스)는 염산과 같은 강산과 양립 가능하지 않다. 이러한 유형의 폴리머의 경우, pKa > 3인 아스코르브산 또는 글루쿠론산과 같은 약산이 적합하다. 강산은 셀룰로스 유형 폴리머와 반응하여 폴리머 매트릭스의 분해 또는 가교를 유발한다.
정자의 공급원
소 정자는 Geno 시설(Store Ree, Stange, Norway)에서 수집되었다.
완충 용액
다음 익스텐더 용액이 사용되었다:
- 정자의 일차 희석을 위한 익스텐더: 1.45 g l-1 트리즈마 하이드로클로라이드 글루코스, 0.4 g l-1 소듐 시트레이트, 1 g l-1 프룩토스 및 200 ml l-1 난황. NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 6.4로 조정하였다.
- 정자의 이차 희석을 위한 익스텐더 용액: 5 g l-1 ViCality Extra Light 칼슘 카보네이트(Speciality Minerals inc, Bethlehem, PA), 54 g l-1 프룩토스, 170 g l-1 글리세롤 및 10 g l-1 UP-LVG 소듐 알기네이트(NovaMatrix, Sandvika, Norway). 두 익스텐더 모두 적어도 EU dir 88/407에서 요구하는 최종 농도를 제공하는 표준 항생제 칵테일을 포함한다.
황소 정자의 희석 및 부동화
Geno 시설에서 소 정자를 채취하였다. 채취 직후, 일차 희석을 위해 익스텐더 용액에서 ml 당 133 x 106 세포의 농도로 정자를 희석시켰다. 이후, 정자를 함유한 생성된 용액을 4℃로 냉각시켰다. 4℃로 냉각시킨 후, 용액을 이차 희석을 위해 동일한 부피의 익스텐더 용액과 혼합하였다.
이후, 정자를 함유한 용액을 코팅된 수정 스트로우, 포인트 1-4의 제조 하에 상기 기술된 바와 같이 코팅된 수정 스트로우로 옮겼다. 수정 스트로우를 겔 형성을 위해 4℃에서 보관하였다.
겔화 및 겔 강도 및 정자의 운동성 평가
스트로우를 겔 형성에 대해 조사하고, 부동화된 정자의 생존력을 4℃에서 3시간 및 24시간 보관 후 평가하였다. 결과는 표 1.1에 요약되어 있다. 채우기 3시간 후 모든 스트로우 내에 겔이 형성되었다. 3시간 내지 24 시간 사이에 스트로우 내 겔 강도의 일부 또는 사소한 변화 만 관찰되었다.
정자의 운동성을 현미경 평가를 사용하여 평가하였다. 운동성을 측정하기 전에, 에펜도르프 튜브에 있는 0.9 ml의 개질된 IVT 용액에 수정 스트로우의 내용물을 첨가하고, 튜브 텀블러에서 약 10분 동안 튜브를 조심스럽게 쉐이킹함으로써 알기네이트 겔을 개질된 IVT 용액(3 g l-1 글루코스, 20 g l-1 소듐 시트레이트, 2.1 g l-1 NaHCO3, 1.16 g l-1 NaCl, 3 g l-1 EDTA, pH 7.35)에 액화시켰다. 운동성을 현미경으로 평가하기 전에 튜브를 최소 15분 동안 열 블록에서 37℃로 예열하였다. 약 3 ㎕의 용액을 예열된 현미경 슬라이드에 첨가하고 광학 현미경을 사용하여 즉시 검사하였다. 각 샘플에서 운동성 정자의 수는 가장 가까운 5% 간격으로 추정되었다.
결과가 표 1에 요약되어 있다. 스트로우를 채우고 3시간 후 테스트된 모든 스트로우로 평가하였을 때 정자의 60 내지 80%가 운동성이 있었다. 24시간 후 평가하였을 때 테스트된 스트로우에서 정자의 약 40 내지 65%가 운동성이 있었다.
표 1: 코팅된 스트로우로의 결과 요약
실시예 4: PVC 스트로우에서 활성제 조성물의 방출
코팅된 수정 스트로우의 제조
물질: 의료용 폴리비닐 클로라이드(PVC) 건식 블렌드(NORVINYL HA.97.00.PJ.19020.1)(INEOS Compounds, Sweden로부터) 및 석신산 무수물(Sigma Aldrich로부터).
실험실 컴파운더 KETSE 20/40 EC 압출기를 사용하여 압출 PVC 스트로우를 제조하였다. 스트로우를 제조하기 위한 튜브 다이 헤드는 내경 2mm, 및 외경 2.5mm였다. 튜브 다이 헤드와 연결되는 압출기는 6개의 가열 구역을 갖는다. 전체 배럴 길이는 800 mm이지만, PVC의 열화를 방지하기 위해 가공 길이를 400 mm로 줄였다.
PVC에 각각 1 및 1.5 중량%의 양으로 석신산 무수물을 첨가하였다. 모든 성분은 실온에서 미리 혼합되어 압출기의 공급기에 공급되었다. 블렌드를 용융시키고 190℃에서 혼합하였다. 압출된 스트로우를 냉각시키고 수조에 모았다.
압출된 스트로우를 추가 물로 잠시 세척하여 수정 스트로우의 표면에 있는 석신산 무수물을 제거하고, 사용 전에 수정 스트로우를 건조시켰다.
정자의 공급원
소 정자는 Geno 시설(Store Ree, Stange, Norway)에서 수집되었다.
완충 용액
다음 익스텐더 용액이 사용되었다:
- 정자의 일차 희석을 위한 익스텐더: 1.45 g l-1 트리즈마 하이드로클로라이드 글루코스, 0.4 g l-1 소듐 시트레이트, 1 g l-1 프룩토스 및 200 ml l-1 난황. NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 6.4로 조정하였다.
- 정자의 이차 희석을 위한 익스텐더 용액: 5 g l-1 ViCality Extra Light 칼슘 카보네이트(Speciality Minerals inc, Bethlehem, PA), 54 g l-1 프룩토스, 170 g l-1 글리세롤 및 10 g l-1 UP-LVG 소듐 알기네이트(NovaMatrix, Sandvika, Norway). 두 익스텐더 모두 적어도 EU dir 88/407에서 요구하는 최종 농도를 제공하는 표준 항생제 칵테일을 포함한다.
황소 정자의 희석 및 부동화
Geno 시설에서 소 정자를 채취하였다. 채취 직후, 일차 희석을 위해 익스텐더 용액에서 ml 당 133 x 106 세포의 농도로 정자를 희석시켰다. 이후, 정자를 함유한 생성된 용액을 4℃로 냉각시켰다. 4℃로 냉각시킨 후, 용액을 이차 희석을 위해 동일한 부피의 익스텐더 용액과 혼합하였다.
이후, 정자를 함유한 용액을 각각 1 및 1.5 wt% 석신산 무수물을 지닌 수정 스트로우로 옮겼다. 수정 스트로우를 겔 형성을 위해 4℃에서 보관하였다.
겔화 및 겔 강도 및 정자의 운동성 평가
스트로우를 겔 형성에 대해 조사하고, 부동화된 정자의 생존력을 4℃에서 3시간 및 24시간 보관 후 평가하였다. 결과는 표 2에 요약되어 있다. 채우기 3시간 후 테스트된 두 가지 유형의 스트로우 내에 겔이 형성되었다. 4℃에서 3시간 내지 24 시간 인큐베이션 사이에 스트로우 내 겔 강도의 사소한 변화 만 관찰되었다.
정자의 운동성을 현미경 평가를 사용하여 평가하였다. 운동성을 측정하기 전에, 에펜도르프 튜브에 있는 0.9 ml의 개질된 IVT 용액에 수정 스트로우의 내용물을 첨가하고, 튜브 텀블러에서 약 10분 동안 튜브를 조심스럽게 쉐이킹함으로써 알기네이트 겔을 개질된 IVT 용액(3 g l-1 글루코스, 20 g l-1 소듐 시트레이트, 2.1 g l-1 NaHCO3, 1.16 g l-1 NaCl, 3 g l-1 EDTA, pH 7.35)에 액화시켰다. 운동성을 현미경으로 평가하기 전에 튜브를 최소 15분 동안 열 블록에서 37℃로 예열하였다. 약 3 ㎕의 용액을 예열된 현미경 슬라이드에 첨가하고 광학 현미경을 사용하여 즉시 검사하였다. 각 샘플에서 운동성 정자의 수는 가장 가까운 5% 간격으로 추정되었다.
결과가 표 2에 요약되어 있다. 스트로우를 채우고 3시간 후 테스트된 모든 스트로우로 평가하였을 때 정자의 60 내지 70%가 운동성이 있었다. 24시간 후 평가하였을 때, 테스트된 스트로우에서 정자의 약 50 내지 60%가 운동성이 있었다.
표 2: PVC 스트로우로의 결과 요약
Claims (20)
- 서방성 조성물(sustained release composition)을 제조하기에 적합한 키트(kit)로서, 상기 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 상기 제1 용기는 활성화제 조성물 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 상기 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 비활성 가교제 및 임의로 방출될 물질을 포함하고; 상기 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 상기 활성화제 조성물 및 상기 비활성 가교제가 지연된 속도로 서로 접촉되게 함으로써 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 보장하고,
- 상기 제1 용기는 상기 제1 확산 배리어를 포함하고; 상기 제1 확산 배리어와 혼합하여 상기 활성화제 조성물은 상기 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제1 확산 배리어를 포함하고; 상기 활성화제 조성물 및 상기 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 상기 제1 용기의 상기 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 상기 중간층은 상기 활성화제 조성물을 포함하거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 상기 활성화제 조성물, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 상기 활성화제 조성물, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 상기 제1 용기의 제조 동안 상기 제1 폴리머 물질로 압출되고; 상기 제2 확산 배리어는 상기 제1 폴리머, 상기 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 상기 활성화제 조성물, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 상기 활성화제 조성물, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 상기 제1 용기의 제조 동안 상기 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 상기 내부 표면층은 상기 활성화제 조성물을 포함하고; 상기 제2 확산 배리어는 상기 제2 폴리머, 상기 제3 폴리머 또는 이들의 조합인 키드. - 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트로서, 상기 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 상기 제1 용기는 비활성 가교제 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 상기 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머, 활성화제 조성물 및 임의로 방출될 물질을 포함하고; 상기 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 상기 활성화제 조성물 및 상기 비활성 가교제가 지연된 속도로 서로 접촉되게 함으로써 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 보장하고,
- 상기 제1 용기는 상기 제1 확산 배리어를 포함하고; 상기 제1 확산 배리어와 혼합하여 상기 비활성 가교제는 상기 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제1 확산 배리어를 포함하고; 상기 비활성 가교제 및 상기 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 상기 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 상기 중간층은 상기 비활성 가교제를 포함하거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 상기 비활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 상기 비활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 상기 제1 용기의 제조 동안 상기 제1 폴리머 물질로 압출되고; 상기 제2 확산 배리어는 상기 제1 폴리머, 상기 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 상기 비활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 상기 비활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 상기 제1 용기의 제조 동안 상기 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 상기 내부 표면층은 비활성 가교제를 포함하고; 상기 제2 확산 배리어는 상기 제2 폴리머, 상기 제3 폴리머 또는 이들의 조합인 키트. - 서방성 조성물을 제조하기에 적합한 키트로서, 상기 키트는 제1 용기 및 제2 용기를 포함하고; 상기 제1 용기는 활성 가교제 및 제1 확산 배리어 또는 제2 확산 배리어를 포함하고; 상기 제2 용기는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머 및 임의로 방출될 물질을 포함하고; 상기 제1 및/또는 제2 확산 배리어는 활성 가교제의 지연 및 지속 방출을 가능하게 하고,
- 상기 제1 용기는 상기 제1 확산 배리어를 포함하고; 상기 제1 확산 배리어와 혼합하여 상기 활성 가교제는 상기 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제1 확산 배리어를 포함하고; 상기 활성 가교제 및 상기 제1 확산 배리어는 별도의 층으로 상기 제1 용기의 내부 표면 상에 코팅되어 내부 표면층 및 중간층을 형성하고, 상기 중간층은 상기 활성 가교제를 포함하거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 상기 활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 상기 활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물은 상기 제1 용기의 제조 동안 상기 제1 폴리머 물질로 압출되고; 상기 제2 확산 배리어는 상기 제1 폴리머, 상기 제2 폴리머 또는 이들의 조합이거나;
- 상기 제1 용기는 상기 제2 확산 배리어를 포함하고, 제1 폴리머 물질로 제조되고; i) 상기 활성 가교제, ii) 제2 폴리머 물질 내에 임베딩되거나 캡슐화된 활성 가교제, 또는 iii) i)과 ii)의 혼합물과 혼합하여 제3 폴리머 물질은 상기 제1 용기의 제조 동안 상기 제1 폴리머 물질과 공압출되어 내부 표면층 및 외부 표면층을 형성하고, 상기 내부 표면층은 상기 활성 가교제를 포함하고; 상기 제2 확산 배리어는 상기 제2 폴리머, 상기 제3 폴리머 또는 이들의 조합인 키트. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머가 2가 양이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머인 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머가 이온 가교 가능한 알기네이트인 키트.
- 제5항에 있어서, 알기네이트가 만누론산 잔기보다 더 많은 굴루론산 잔기를 갖는 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 방출될 물질이 생물학적 물질, 예컨대 세포 및 특히 줄기 세포, 치료제, 진단제 또는 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 방출될 물질이 정자인 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기가 수정 용량(insemination dose)을 위한 용기, 예컨대 수정 스트로우(insemination straw) 또는 수정 튜브인 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 확산 배리어가 i) 알기네이트와 같은 천연 폴리머, 덱스트란, 전분 및 아가로스와 같은 그 밖의 다당류, CMC(카르복시 메틸 셀룰로스)로서 셀룰로스 유도체, 메틸셀룰로스 및 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 젤라틴, 콜라겐, 카제인, 셸락과 같은 단백질; ii) PVA(폴리비닐 알코올), 수용성 폴리아미드, 폴리아크릴산 및 폴리아크릴산 무수물, 폴리 메타크릴산, 폴리메타크릴산 무수물, 폴리 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-n-이소프로필아크릴 아미드, 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 폴리머 또는 코폴리머; 또는 iii) 이들의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화제 조성물과 비활성 가교제의 혼합물이 활성 가교제의 형성을 초래하고, 상기 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 비활성 가교제가 수불용성인 2가 양이온 염, 예컨대 2가 양이온 카보네이트, 더욱 바람직하게는 CaCO3, BaCO3 또는 이들의 임의의 혼합물인 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화제 조성물이 비활성 가교제를 활성 가교제로 변환시킬 수 있는 적어도 하나의 화합물을 포함하고; 상기 활성 가교제는 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화제 조성물이 양성자 공여체, 예컨대 산을 포함하고, 비활성 가교제가 상기 양성자 공여체와 접촉시 이온 가교 가능한 생체적합성 폴리머를 가교시키는 데 적합한 이온을 방출하는 화합물인 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 활성화제 조성물이 물과 접촉시 양성자 공여체, 예컨대 산으로 변환되는 화합물을 포함하는 키트.
- 제15항에 있어서, 물과 접촉시 양성자 공여체로 변환되는 화합물이 무기산 무수물, 유기산 무수물, 예컨대 석신산 무수물 및 락톤, 예컨대 글루코노 델탈락톤 또는 이들의 임의의 혼합물; 바람직하게는 유기산 무수물 및 글루코노 델탈락톤; 및 더욱 바람직하게는 글루코노 델탈락톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 확산 배리어는 동일하거나 상이하나, 단, 제2 확산 배리어는 압출과 양립 가능한 키트.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
- 이온 가교 가능한 생체적합한 폴리머가 이온 가교 가능한 알기네이트이고, 상기 알기네이트는 만누론산 잔기보다 더 많은 굴루론산 잔기를 갖고;
- 방출될 물질이 정자이고;
- 제1 용기가 수정 용량을 위한 용기인 키트. - 서방성 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
- 제19항에 있어서, 서방성 조성물이 동물의 번식에 사용되는 용도.
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