CN112367841B - 用于制备水凝胶的功能化试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种试剂盒，其适于制备持续释放的组合物，特别是适于制备包含包埋在藻酸盐基质中的精子的持续释放组合物。

Description

用于制备水凝胶的功能化试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，其适于制备持续释放组合物，特别是适于制备包含包埋在藻酸盐基质中的精子的持续释放组合物。
背景技术
人工授精(AI)是一种通过人工方式而非通过自然交配将精子放入动物子宫或宫颈的技术。该技术自二十世纪四十年代开始使用，现在被广泛用作动物交配和繁殖的方法，以繁殖特别是诸如牛、猪、绵羊、家禽和马的农场动物的想要的特征，以及诸如血统犬的宠物、水生动物和濒危物种的想要的特征。
R.H.Foote(2002)，American Society of Animal Science(http：//www.asas.org/symposia/esupp2/Footehist.pdf)和由B.Hafez，E.S.E.Hafez.编辑的“Reproduction in farm animals”-第7版，Philadelphia，Lippincott Williams&Wilkins，2000.-XIII，ISBN 0-683-30577-8(ib.)中公开了现代AI的发展以及育种者在使用人工授精和精子保存方面的挑战的综述。
精子通常被收集、补充稀释然后保存，例如通过低温保存。使用低温保存技术的前提是，来自特定动物物种的精子对这种处理耐受，而不会导致精子质量、存活力和受精能力的下降太多。然后，无论是低温保存或新鲜储存的，无论哪个是合适的，精子通常被输送到雌性的位置。至关重要的是，精子保持活力直至授精时间，并且在授精后在雌性动物体内足够长的时间内保持活力直到卵细胞到达受精位置。
保存方法引起了广泛的关注和研究，所述保存方法旨在提供确保精子在收集后较长时间内保持受精能力且直至授精点的储存方法和手段，特别是旨在提供确保精子在授精后较长时间内保持受精能力的方法和手段。
WO2008/004890公开了其中将精子包埋在藻酸盐中的保存系统。据说该保存系统通过以下方式提供有益效果：在授精后较长时间内赋予精子受精能力。
PCT/EP2017/081128教导了一种保存系统，其中将精子包埋在改进的藻酸盐基质中。据说改进的藻酸盐基质为确保具有高受精潜力的精子在长的时期内释放，从而使与排卵有关的授精时间不再那么关键。
即使上述保存系统使育种者较少依赖于满足与排卵时间有关的最优选的授精时间点，制备仍需要训练有素的人员。因此，需要简化上述保存系统的制备步骤的手段。
据我们所知，没有大量的研究集中在用于简化这种保存系统制备步骤的手段上。然而，先前已经公开了用于制备其他保存系统以及与之相关的系统的手段。
“Alginate 3d Cell Culture Kit”，2012年12月16日，第1-10页公开了一种试剂盒，其包含至少第一和第二容器。第一容器包含藻酸钠溶液，第二容器包含氯化钙(活性交联剂)溶液。氯化钙在藻酸钠溶液中解离。游离钙离子与藻酸钠相互作用，从而形成交联的藻酸盐。
WO2015/181496教导了一种制备适用于动物的人工授精的藻酸盐-精子系统的方法。藻酸盐-精子系统包含授精吸管。该吸管通常由细管和插入细管的塞子形成。在填充状态下，塞子靠近管的第一端布置，并且将一定剂量的基于液体的物质、特别是溶解在藻酸盐中的精子布置在吸管中的塞子与管的第二端之间。为了填充吸管，将靠近塞子的管的第一端与真空源连通，而将第二端与含有待引入吸管中的物质的容器连通。最初包含在塞子和第二端之间的空气通过塞子吸入，同时物质向前移动到管中，直到到达塞子，而由于塞子变得不透液所以它无法通过。为了避免精子被塞子吸收，建议塞子用钙盐或钡盐浸透。要求钙盐和钡盐是水溶性的(活性交联剂)。当藻酸盐溶液与钙盐或钡盐接触时，藻酸盐立即转化为凝胶。藻酸盐塞确保精子不被塞子吸收。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，该试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含活化剂组合物和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物、惰性交联剂以及任选地待释放的材料；其中
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的活化剂组合物涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；活化剂组合物和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，该中间层包含活化剂组合物；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)活化剂组合物、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活化剂组合物或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)活化剂组合物、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活化剂组合物或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，该内表面层包含活化剂组合物；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
本发明的第二方面涉及一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，该试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含惰性交联剂和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物、活化剂组合物和任选地待释放的材料；其中
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的惰性交联剂涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；惰性交联剂和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，该中间层包含惰性交联剂；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)惰性交联剂，ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的惰性交联剂，或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)惰性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的惰性交联剂或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，该内表面层包含惰性交联剂；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
本发明的第三方面涉及一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，该试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含活性交联剂和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物以及任选地待释放的材料；其中
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的活性交联剂涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；活性交联剂和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，该中间层包含活性交联剂；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)活性交联剂，ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活性交联剂，或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)活性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活性交联剂或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，该内表面层包含活性交联剂；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
在本发明的第一、第二或第三方面的一个实施方案中，离子可交联的生物相容性聚合物为二价阳离子可交联的生物相容性聚合物。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，离子可交联的生物相容性聚合物为离子可交联的藻酸盐。优选地，藻酸盐的古洛糖醛酸残基(guluronic acidresidue)比甘露糖醛酸残基更多。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，待释放的材料选自生物材料(如细胞，特别是干细胞)、治疗剂、诊断剂或其任意混合物。在一个特别优选的实施方案中，待释放的材料为精子。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一容器是用于授精剂量的容器，如授精吸管或授精管，更优选授精吸管。图1示出了授精吸管的一个实例。典型的授精吸管的尺寸示于实施例4。
在一个实施方案中，第一容器和/或第二容器具有管的形状，其内径小于10cm，如小于5cm、小于3cm、小于2cm、小于1cm、小于8mm、小于5mm或小于4mm。
在一个实施方案中，第一容器和/或第二容器具有管的形状，其内径在0.1至10cm的范围内，如0.1至5cm、0.1至3cm、0.1至1cm或0.1至0.5cm。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一容器是授精吸管，并且该授精吸管包含管(1)，管(1)在第一端(2)和第二端(3)之间延伸，并包含可透气且不透液的塞子(4)，所述塞子布置在管的第一端附近的管中，并在朝向管的第一端(2)的第一端与朝向管的第二端(3)的第二端之间延伸。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一容器和/或第二容器优选具有一定的尺寸和形态，其允许离子可交联的生物相容性聚合物与活性交联剂接触遍及第一容器和/或第二容器，从而确保存在遍及第一容器和/或第二容器的交联的生物相容性聚合物。优选的是，可在合理量的时间内使离子可交联的生物相容性聚合物交联遍及第一容器和/或第二容器。在一个实施方案中，合理量的时间为小于48小时、小于24小时、小于12小时、小于6小时、小于4小时、小于2小时或小于1小时。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一容器和/或第二容器适于制备持续释放组合物。在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一容器和/或第二容器适于制备持续释放组合物，该持续释放组合物适于动物的繁殖和/或适于将生物材料植入人或动物体内。在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一容器和/或第二容器具有合适的尺寸和/或形态用于制备持续释放组合物。该持续释放组合物适于动物的繁殖、适于将生物材料植入人或动物体内、适于培养细胞、适于生物材料的保存和/或用于生物材料的低温保存。
生物材料的保存可为例如这样的一种方法，其中通过冷却至低的温度来保存易受由不受调控的化学动力学导致的损害的细胞器、细胞、组织、细胞外基质、器官或任何其他生物构造；通常温度≤0℃，如温度≤-5℃，例如温度≤-10℃、温度≤-20℃、温度≤-30℃、温度≤-40℃、温度≤-50℃、温度≤-60℃或温度≤-70℃。
低温保存或低温保藏是一种通过冷却至非常低的温度来保存易受由不受调控的化学动力学导致的损害的细胞器、细胞、组织、细胞外基质、器官或任何其他生物构造的方法；通常使用例如固态二氧化碳冷却至-80℃或使用例如液氮冷却至-196℃。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层为可水合的扩散阻挡层。优选地，第一聚合物材料不是可水合的扩散阻挡层。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是成膜聚合物。优选地，第一聚合物材料不是成膜聚合物。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层允许活化剂组合物和惰性交联剂以延迟的速率彼此接触，从而确保活性交联剂的延迟释放和持续释放。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层允许活性交联剂的延迟释放和持续释放。
在本发明的第一、第二或第三方面的一个实施方案中，第一扩散阻挡层选自：i)天然聚合物，如藻酸盐、其他多糖(如右旋糖酐、淀粉和琼脂糖)、纤维素衍生物(如CMC(羧甲基纤维素)、甲基纤维素和乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素)，蛋白质(如明胶、胶原蛋白、酪蛋白、虫胶)；ii)合成聚合物或共聚物，如PVA(聚乙烯醇)、水溶性聚酰胺、聚丙烯酸和聚丙烯酸酐、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酐、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚-正-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮；或iii)其任意混合物。优选第一扩散阻挡层是亲水的。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，活化剂组合物与惰性交联剂的混合物导致活性交联剂的形成，该活性交联剂适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。
在本发明的第三方面的另一个实施方案中，活性交联剂适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，惰性交联剂是不溶于水的二价阳离子盐，如二价阳离子碳酸盐，更优选CaCO3、BaCO3或其任意混合物。
在本发明的第三方面的另一个实施方案中，活性交联剂是可溶于水的二价阳离子盐，如二价阳离子氯化物、二价阳离子乙酸盐、二价阳离子柠檬酸盐，优选CaCl2、BaCl2、Ca(CH3COO)2、Ba(CH3COO)2、柠檬酸钙、柠檬酸钡或其任意混合物，且更优选CaCl2、Ca(CH3COO)2、柠檬酸钙或其任意混合物。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，活化剂组合物包含至少一种能够使惰性交联剂转化为活性交联剂的化合物；该活性交联剂适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，活化剂组合物包含质子供体如酸，并且惰性交联剂是与质子供体接触后释放适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子的化合物。在一个优选的实施方案中，质子供体是可溶于水的。在另一个优选的实施方案中，质子供体选自：i)有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸或其任意混合物；ii)无机酸，如磷酸、盐酸或其任意混合物；或iii)有机酸和无机酸的混合物。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，活化剂组合物包含与水接触后转化为质子供体(如酸)的化合物。在一个优选的实施方案中，与水接触后转化为质子供体的化合物选自无机酸酐、有机酸酐(如琥珀酸酐)以及内酯(如葡糖酸δ-内酯)或其任意混合物；优选有机酸酐和葡糖酸δ-内酯；更优选葡糖酸δ-内酯和/或琥珀酸酐。
在其中i)活化剂组合物包含质子供体或与水接触后转化为质子供体的化合物；和ii)第一和/或第二扩散阻挡层与强酸不相容的那些实施方案中，质子供体(包括当给定化合物与水接触时形成的任何质子供体)优选为pKa＞3的质子供体。抗坏血酸或葡萄糖醛酸是pKa＞3的弱酸的实例。纤维素类聚合物(如CMC(羧甲基纤维素)、Benecel MP 812W(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)和Methocel K100(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素-羟丙甲纤维素))是与强酸(如盐酸)不相容的扩散阻挡层的实例。如果这些阻挡层与强酸接触，则存在强酸可与纤维素类聚合物反应并导致聚合物基质降解和/或交联的风险。因此，在一个实施方案中，质子供体的pKa＞3。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，活化剂组合物包含水解酶或可被水解酶水解的底物。如果活化剂组合物包含水解酶，则最初不含水解酶的容器还包含可被水解酶水解的底物。如果活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物，则最初不含可被水解酶水解的底物的容器还包含水解酶。
在本发明的第一或第二方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是活化剂组合物。在一个优选的实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层为质子供体(如酸)，或与水接触后转化成质子供体。在一个更优选的实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层选自聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酐、聚甲基丙烯酸酐或其任意混合物。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一聚合物材料选自聚丙烯(优选医用级)、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二酯、乙缩醛、丙烯酸类树脂、聚碳酸酯、EVA(乙烯-乙酸乙烯酯)、聚氨酯、热塑性弹性体、聚丙烯与聚烯烃弹性体的共混物(如EOC(乙烯辛烯级)、EPR(乙丙橡胶))，或这些聚合物的共混物。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第二扩散阻挡层应与挤出相容。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一和第二扩散阻挡层是相同或不同的；条件是第二扩散阻挡层与挤出相容。
在本发明的第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，第一、第二和第三聚合物材料可相同或不同；条件是第二和第三聚合物材料与挤出相容。应理解，对于其中使第一聚合物材料经受挤出的那些实施方案，第一聚合物材料也应与挤出相容。
本发明的第四方面涉及本发明的第一、第二或第三方面中任一项所述的试剂盒用于制备持续释放组合物的用途。
在本发明的第四方面的一个实施方案中，持续释放组合物待用于动物的繁殖。
附图简要说明
图1示出了授精吸管(1)，其包含在第一端(2)和第二端(3)之间延伸的管，并包含透气、不透液的塞子(4)，所述塞子布置在管的第一端附近的管中，并在朝向管的第一端(2)的第一端与朝向管的第二端(3)的第二端之间延伸。固体形式的CaCO3和GDL的混合物(6)置于透气、不透液的塞子(4)面向管的第二端(3)的一端附近。将包含精子和藻酸盐的混合物引入吸管(5)中，从而形成具有包埋精子的离子交联的聚合物。
图2示出了本发明的各种实施方案。上面的图示显示了授精吸管内部的聚合物膜(即扩散阻挡层)中的活化剂组合物。中间图显示了活化剂组合物被挤出至授精吸管的聚合物材料中，该聚合物材料用作扩散阻挡层。下面的图显示了在制备第一容器期间聚合物2中的活化剂组合物与聚合物1共挤出从而形成两层结构的情形。
定义
术语“活化剂组合物”是指包含一种或多种能够活化惰性交联剂的化合物的组合物。当惰性交联剂被活化时，适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子将从活化的交联剂中释放出来。
术语“活性交联剂”是指适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的化合物。换言之，如果将“活性交联剂”与藻酸钠溶液在中性pH下混合，则形成离子交联的藻酸盐。活性交联剂通常为与水接触时释放离子的化合物；所述离子适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。因此，根据本文提供的定义，CaCl2和BaCl2是活性交联剂的实例，而CaCO3和BaCO3是惰性交联剂的实例。
术语“生物相容性聚合物”是指具有与活组织或生物体共存而不引起伤害的能力的聚合物，即，可引入宿主而不对宿主产生负面影响、优选不以任何方式对宿主产生负面影响的聚合物。
如本文所用，术语“涂覆”是指施加到基材的表面——例如授精吸管或授精管的内表面——的覆盖物，例如扩散阻挡层。涂层本身可为完全覆盖基材的全涂层，或可仅覆盖基材的一部分。
如本文所用，术语“共挤出”通常是指同时挤出多层材料。这种类型的挤出利用两个或多个挤出机将稳定体积通量的不同粘性塑料进行熔融并输送到单个挤出头(冲模)，该挤出头将以所需的形式挤出材料。层厚度通常由输送材料的个体挤出机的相对速度和尺寸控制。
术语“与挤出相容”是指即使在经受较高温度后仍保持其性能的能力。
如本文所用，术语“扩散阻挡层”是指活性交联剂、惰性交联剂和/或活化剂组合物可渗透的阻挡层；特别是与液体溶液如含水溶液接触时。扩散阻挡层对所述化合物是可渗透的，但是穿过阻挡层的运动速率低于通过自由流动所实现的运动速率，从而提供了穿过阻挡层的延迟的运动速率。在许多实际场景中，单一聚合物无法满足所有的应用需求。复合挤出允许挤出共混的材料，但共挤出可将单独的材料保留为挤出产品中不同的层，从而允许适当放置具有不同性能(如透氧性、强度、刚度和耐磨性)的材料。
如本文所用，术语“包埋”意指防止包埋的材料具有其自然运动的可能性，即防止材料如果储存在液体(如胶囊的液芯)中原本会具有的自然运动的可能性。固定程度依赖于基质的特性(例如机械强度)而变化。包埋的材料可为例如包埋在离子交联的聚合物(如离子交联的藻酸盐)中的精子；包埋在第二聚合物材料中的活化剂组合物；包埋在第二聚合物材料中的活性交联剂；和/或包埋在第二聚合物材料中的惰性交联剂。
如本文所用，术语“包封”是指被包封的材料保持其自然运动的可能性，即，材料储存在胶囊的液芯中。
如本文所用，术语“挤出”通常是指用于通过将材料推过具有期望横截面的冲模而制备固定横截面轮廓(例如授精吸管或授精管的轮廓)的物体的方法。如果待挤出的材料是某种聚合物树脂，则通常通过加热元件和来自挤出螺杆的剪切加热的组合将聚合物树脂加热至熔融状态。一个或多个螺杆(双螺杆挤出的情形下)推动树脂通过冲模，将树脂成型为期望的形状。当将挤出物拉过冲模或水箱时，挤出物冷却并固化。挤出可为连续的(理论上制备无限长的材料)或半连续的(制备多件)。通常挤出的材料包括金属、聚合物、陶瓷、混凝土、模用粘土和食品。挤出产品通常称为“挤出物”。
如本文所用，术语“水解酶”意指涵盖当包含可被水解酶水解的底物的溶液与包含水解酶的另一溶液混合时能够产生H3O+的水解酶。根据本发明的一个实施方案，水解酶为脂肪酶。根据本发明的另一个实施方案，脂肪酶是酰基水解酶，更优选三酰基甘油脂肪酶，例如从酵母皱褶假丝酵母(Candida rugosa)分离出的三酰基甘油脂肪酶。合适的脂肪酶可从Sigma-Aldrich Co.LLC(L1754-VII型或L3001 I型，CAS编号9001-62-1)获得。
术语“惰性交联剂”是指需要通过活化剂组合物活化以能够释放离子的化合物，所述离子适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。如果惰性交联剂未被活化剂组合物活化，则惰性交联剂不能释放适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子。换言之，如果“惰性交联剂”例如在不存在活化剂组合物的情况下在中性pH下与藻酸钠溶液混合，则不形成离子交联的藻酸盐。然而，如果“惰性交联剂”例如在活化剂组合物的存在下与藻酸钠溶液混合，则形成离子交联的藻酸盐。惰性交联剂通常为与25℃、pH＞8的水接触时不释放离子的化合物；所述离子适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。因此，根据本文提供的定义，CaCl2和BaCl2不是惰性交联剂，而CaCO3和BaCO3是惰性交联剂的实例。
术语“离子可交联的生物相容性聚合物”是指其直链或支链的大分子可通过离子键彼此连接以形成三维聚合物网络的聚合物。一旦离子可交联的生物相容性聚合物通过离子键彼此连接，则该聚合物称为离子交联的生物相容性聚合物。
如本文所用，术语“基质”是指包埋有待释放材料的基质。基质降低了运动的可能性，并且固定程度通常依赖于基质的特性(例如机械强度)而变化。然而，不仅基质的固定程度而且基质的溶解速率通常将依赖于基质的特性而变化。具有高交联度的基质通常将具有比具有低交联度的基质更高的机械强度，因此具有更低的溶解速率。因此，通过组合具有不同机械强度的两种基质，组合的基质将具有不同机械强度的两个部分。由于高机械强度与低溶解速率相关，而低机械强度与高溶解速率相关，因此这两个部分将具有不同的溶解速率。
如本文所用，术语“机械强度”根据实施例2中所述的方法测量。如果通过实施例2中所述方法测得的一个部分的机械强度与另一部分的机械强度明显不同，则认为两个部分具有不同的机械强度。在一个实施方案中，如果第一部分的机械强度与第二部分的机械强度的比率不等于1，则认为两个部分具有不同的机械强度。
如本文所用，术语“精子”包括精子本身以及精液中所含有的精子。即精液可在形成持续释放组合物时直接使用。然而，从精液中分离的精子、任选地包含在其他合适的储存溶液中的精子也可用于形成持续释放组合物。
术语“持续释放”涵盖控制释放、延时释放、定时释放、延滞释放、延长释放和延迟释放。
具体实施方式
除非本文特别定义，否则所用的所有技术和科学术语具有与聚合物工程、生物化学、分子生物学和动物繁殖领域的技术人员通常理解的相同的含义。
在本文所述的数值极限或范围中，包括端点。同样，数值极限或范围内的所有值和子范围都明确包括在内，如同已明确写出。
与本文描述的类似或等同的所有方法和材料都可用于本发明的实践或测试中，其中本文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体纳入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
先前已经表明，将精子包埋在藻酸盐基质中可通过在授精后较长时间内赋予精子受精能力而提供有益效果(WO2008/004890)。已经假定，包埋使得精子固定在藻酸盐基质中，并且受限的运动使得精子的能量消耗减少，这对于保存期限和受精能力是有益的。
基于上述，可合理地假设固定程度会影响精子的能量消耗，从而影响它们的保存期限和受精能力。由于固定程度通常依赖于基质的特性(例如机械强度)而变化，预期所述特性会直接影响保存期限和受精能力。
与具有高交联度的离子交联的聚合物相比，具有低交联度的交联聚合物、如离子交联的聚合物以及特别是离子交联的藻酸盐具有降低的机械强度。这样的基质会在基质内具有较少的约束并且允许更高程度的运动，鉴于上述原因，预期这对于保存期限和受精能力会是不利的。
PCT/EP2017/081128的作者出乎意料地表明，基质的机械强度可显著降低，而不会不利地影响包埋的精子的保存期限和受精能力。由于机械强度与基质的溶解速率直接相关，因此该发现使得可调节基质的溶解曲线，而不会不利地影响包埋的精子的保存期限和受精能力。
通过能够在不会不利地影响保存期限和受精能力的情况下调节溶解曲线，可设计一种系统，其中精子在授精后一段长的时期内从聚合物基质中连续释放出来。由于包埋在聚合物基质中的同时保持了保存期限和受精能力，因此连续释放确保了存在在授精后一段长的时期内可用于受精的高质量精子，从而使与排卵有关的授精时间不那么关键。
然而，尽管上述两种保存系统都使育种者较少依赖于满足与排卵时间有关的最优选的授精时间，但用于制备保存系统的步骤是复杂的，并且经常需要训练有素的人员以便实现期望的结果。因此，需要简化上述保存系统的制备步骤的手段。
上述需求通过提供适于制备持续释放组合物的试剂盒得以解决。该试剂盒易于使用，不需要训练有素的人员，确保聚合物基质(特别是藻酸盐)的可控凝胶化，并提供了一种持续释放组合物，其中精子均匀地分布遍及聚合物基质。
应理解，即使本发明设计用于旨在用于人工授精(即用于动物的繁殖)的持续释放组合物的简化制备，本发明构思还可找到其他应用领域。其他应用领域的实例可旨在用于给予治疗剂、给予诊断剂或给予生物材料(如细胞，特别是干细胞)的持续释放组合物的简化制备。
因此，本发明的第一方面涉及一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，该试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含活化剂组合物和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物、惰性交联剂以及任选地待释放的材料；其中
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的活化剂组合物涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；活化剂组合物和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，该中间层包含活化剂组合物；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)活化剂组合物、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活化剂组合物或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)活化剂组合物、ii)包埋或包封于第二种聚合物材料中的活化剂组合物或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，该内表面层包含活化剂组合物；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
本发明的第二方面涉及一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，该试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含惰性交联剂和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物、活化剂组合物和任选地待释放的材料；其中
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的惰性交联剂涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；惰性交联剂和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，该中间层包含惰性交联剂；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)惰性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的惰性交联剂或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)惰性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的惰性交联剂或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，该内表面层包含惰性交联剂；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
本发明的第三方面涉及一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，该试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含活性交联剂和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物以及任选地待释放的材料；其中
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的活性交联剂涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；活性交联剂和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，该中间层包含活性交联剂；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)活性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活性交联剂或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)活性交联剂、ii)包埋或包封于第二种聚合物材料中的活性交联剂或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，该内表面层包含活性交联剂；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
上文列出的方面的主题代表对同一问题的替代解决方案，因为它们都提供了活性交联剂的延迟释放和持续释放。该问题通过使扩散阻挡层与交联剂组合得以解决，交联剂为活性交联剂或惰性交联剂。扩散阻挡层确保活性交联剂的延迟释放和持续释放。
持续释放组合物
可通过本发明的试剂盒制备的持续释放组合物通常设计成以预定速率释放材料，以确保在特定时间内连续供应材料，同时确保未释放的材料在释放点之前仍保存在基质内。
在一个实施方案中，待释放的材料在授精后至少2小时的时期内释放，如在授精后至少4小时、在授精后至少8小时、在授精后至少16小时、在授精后至少32小时或在授精后至少144小时。在另一个实施方案中，待释放的材料在授精后2-144小时的时期内释放，如授精后4-120小时、授精后8-96小时、授精后16-72小时、授精后24-96小时、授精后24-120小时或授精后24-144小时。
此外，持续释放组合物包含包埋在离子交联的生物相容性聚合物(如离子交联的藻酸盐)中的待释放材料。
在一个实施方案中，离子交联的生物相容性聚合物至少具有不同机械强度的第一和第二部分。离子交联的生物相容性聚合物的机械强度可根据实施例2中所述的方法测量。
如果离子交联的生物相容性聚合物的各部分具有不同的机械强度，则可认为离子交联的生物相容性聚合物代表异质的交联的生物相容性聚合物，即在机械强度方面是异质的。
如果各部分之间的机械强度差异较小，则实际上离子交联的藻酸盐一部分一部分地逐渐溶解。然而，如果各部分之间的机械强度差异较大，则离子交联的藻酸盐通常会遵循时间交错的溶解曲线。
持续释放组合物可分成预先确定数量的部分。每个部分代表持续释放组合物的一部分。这些部分可以具有相等或不同的体积尺寸。
具有不同机械强度的第一和第二部分可具有相近或相等的体积尺寸。具有不同机械强度的第一和第二部分在持续释放组合物中可彼此相邻地放置，或在持续释放组合物中可彼此不相邻地放置。
此外，持续释放组合物原则上可呈任何三维形状，如球形、圆环形、圆柱形、圆锥形、立方体形、长方体形、三棱锥形、正方棱锥形、三棱柱形或其任意组合。
在本发明的另一个实施方案中，离子交联的生物相容性聚合物具有相近或相等的机械强度的至少第一和第二部分。离子交联的生物相容性聚合物的机械强度可根据实施例2中所述的方法测量。
如果离子交联的生物相容性聚合物的各部分具有相等的机械强度，则可认为离子交联的生物相容性聚合物代表均质的交联的生物相容性聚合物，即在机械强度方面是均质的。
在本发明的一个实施方案中，离子交联的生物相容性聚合物在机械强度方面是均质的。
在本发明的另一个实施方案中，离子交联的生物相容性聚合物在机械强度方面是异质的。
持续释放组合物通过使用本发明的试剂盒而不需要训练有素的人员即可更容易地制备。该试剂盒包含第一容器和第二容器。
离子可变联的生物相容性聚合物
第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物，如离子可交联的藻酸盐。然而，应理解，第二容器还可含有其他可交联的生物相容性聚合物，无论是天然存在的或合成的，无论是均聚物或共聚物。在本发明的一个实施方案中，第二容器不包含除离子可交联的藻酸盐以外的其他可交联的生物相容性聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，离子可交联的生物相容性聚合物是二价阳离子可交联的聚合物，如二价阳离子可交联的藻酸盐。
藻酸盐是1，4-连接-β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的阴离子共聚物。各种形式的藻酸盐商购可得。所述形式通常是60％的1，4-连接-β-D-甘露糖醛酸和40％的α-L-古洛糖醛酸；或30％的1，4-连接-β-D-甘露糖醛酸和70％的a-L-古洛糖醛酸。在本发明的一个实施方案中，离子交联的聚合物是具有古洛糖醛酸残基比甘露糖醛酸残基更多的藻酸盐。在具体的实施方案中，离子交联的聚合物是藻酸盐，其由＞50％的古洛糖醛酸残基组成，如＞60％的古洛糖醛酸残基、＞70％的古洛糖醛酸残基或＞80％的古洛糖醛酸残基。百分比是基于藻酸盐聚合物中残基的总数计算的。具有100个古洛糖醛酸残基和400个甘露糖醛酸残基的离子交联的聚合物由20％的古洛糖醛酸残基和80％的甘露糖醛酸残基组成。
在本发明的一个实施方案中，藻酸盐的古洛糖醛酸残基比甘露糖醛酸残基更多。
藻酸盐被广泛使用，例如在食品行业作为例如稳定剂以及用于控制粘度、在制药和化妆品行业中作为例如崩解剂。为了各种目的，可获得分别富含古洛糖醛酸或甘露糖醛酸的两种藻酸盐(Mancini et al.，(1999)，Journal of Food Engineering 39，369-378)，并且用于制备富含古洛糖醛酸的藻酸盐的各种方法是已知的，参见WO 8603781、US 4,990,601、US 5,639,467。
第一容器
第一容器通常用于生物材料的低温保存或低温保藏——一种其中通过冷却至非常低的温度(通常使用固态二氧化碳冷却至-80℃或使用液氮冷却至-196℃)来保存易受由不受调控的化学动力学导致的损害的生物材料(例如精子)的方法。在足够低的温度下，可有效地阻止可对所述生物材料造成损害的任何酶或化学活动。低温保存方法力求达到低的温度，而不会在冷冻期间因形成冰晶而造成其他损害。
因此，在本发明的第一、第二或第三方面的一个实施方案中，第一容器由这样的材料制成，所述材料与经受非常低的温度，如低于-20℃的温度、低于-80℃的温度或低于-196℃的温度相容。所述温度的实例为使用固态二氧化碳的-80℃或使用液氮的-196℃。为了使材料与经受非常低的温度相容，材料在这种低的温度下长期存储期间必须保持羞耻形状、结构和功能。同样重要的是，第一容器不与待储存在第一容器内的生物材料反应或以其他方式不利地影响所述生物材料。
即使第一容器可用于生物材料的低温保存或低温保藏，也应理解，第一容器也可用于精子的新鲜制剂。如果第一容器用于精子的新鲜制剂，并且不需要低温保存或低温保藏，则第一容器不需要由与经受非常低的温度相容的材料制成，而是可由不与待储存在第一容器内的生物材料反应或以其他方式不利地影响所述生物材料的任何材料制成。
在本发明的一个优选实施方案中，第一容器是用于授精剂量的容器，如授精吸管或授精管。图1中示出了授精吸管。这些吸管通常由例如内径为1.6或2.5mm的细管以及插入细管内的塞子(4)形成。
在填充状态下，塞子靠近管的第一端(2)布置，并且在第二容器中最初含有的内容物布置在吸管中的塞子和管的第二端(3)之间。为了填充吸管，通常将靠近塞子(4)的管的第一端(2)与真空源连通，而将第二端(3)与含有待引入吸管中的物质的第二容器相通。最初包含在塞子和第二端(3)之间的空气通过塞子(4)吸入，同时物质向前移动到管中，直到到达塞子(4)，而由于塞子(4)变得不透液所以它无法通过。如果需要，在填充后，将吸管焊接在靠近其一端或两端的位置，并且吸管通常在低温下保存，如低于-80℃的温度，或更优选约-196℃的温度。
为了清空吸管，如果需要，在切割焊接端部并解冻之后，将一根棒经由最靠近塞子(4)的一端插入管中，直到它抵靠塞子(4)。使用该棒将塞子以活塞的方式朝向距塞子(4)最远的一端滑动，从而使在最初包含在吸管中的物质的剂量通过该端排出。
第二容器
第二容器不是必需用于生物材料的低温保存或低温保藏，即不是必需经受如-80℃或-196℃的低温，因此可由与第一容器相同或不同的材料制成。然而，重要的是第二容器也由不与在内容物转移到第一容器之前可包含在第二容器中的生物材料反应或以其他方式不利地影响所述生物材料的材料制成。
待释放的材料
在本发明的一个实施方案中，第二容器还包含待释放的材料。
在本发明的一个实施方案中，待释放的材料选自生物材料(如细胞，特别是干细胞)、治疗剂、诊断剂或其任意混合物。在本发明的一个特别优选的实施方案中，待释放的材料是精子。
扩散阻挡层
当使用本发明的试剂盒制备持续释放组合物时，通常将待释放的材料例如精子加入到第二容器的内容物中，然后将第二容器的内容物转移至第一容器中。该步骤的结果是第一容器的一个或多个扩散阻挡层暴露于水，从而将可水合的扩散阻挡层转化为水合的扩散阻挡层。水合的扩散阻挡层优选对活化剂组合物、惰性交联剂和/或活性交联剂是可渗透的。
因此，在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是可水合的扩散阻挡层，即，与水接触时，扩散阻挡层变为水合的。在另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是可水合的扩散阻挡层，条件是第一聚合物材料不是可水合的扩散阻挡层。
在本发明的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是成膜聚合物。成膜聚合物为这样的一组化学物质，它们在基材(如容器的内表面)上留下柔韧、粘结且连续的覆盖物。成膜聚合物的实例是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸酯、丙烯酰胺，以及多种共聚物。
在本发明的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是成膜聚合物，条件是第一聚合物材料不是成膜聚合物。
在本发明的另一个实施方案中，第一扩散阻挡层选自：i)天然聚合物，如藻酸盐、其他多糖(如葡聚糖、淀粉和琼脂糖)、纤维素衍生物(如CMC(羧甲基纤维素)、甲基纤维素和乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素)、蛋白质(如明胶、胶原蛋白、酪蛋白、虫胶)；ii)合成聚合物或共聚物，如PVA(聚乙烯醇)、水溶性聚酰胺、聚丙烯酸和聚丙烯酸酐、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酐、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚-正-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮；或iii)其任意混合物。优选第一扩散阻挡层是亲水的。
在本发明的一个实施方案中，第一扩散阻挡层的厚度在50nm至100μm的范围内，更优选在100nm至10μm的范围内。此外，第一扩散阻挡层应优选是均匀的并且尽可能薄。
为了获得成功的结果，优选控制离子可交联的生物相容性聚合物的凝胶化，即不过快地形成凝胶，并且待释放的材料均匀地分布遍及持续释放组合物，即离子交联的生物相容性聚合物中。
在本发明的第一、第二和第三方面，通过活性交联剂的延迟释放和持续释放来实现离子可交联的生物相容性聚合物的可控凝胶化。
在本发明的第一和第二方面，在第二容器的内容物已经转移至第一容器之后，通过确保将惰性交联剂通过至少一个扩散阻挡层与活化剂组合物分离来实现活性交联剂的延迟释放和持续释放。当活化剂组合物与惰性交联剂接触时，惰性交联剂转化为活性交联剂。然后，活性交联剂与离子可交联的生物相容性聚合物一起形成离子交联的生物相容性聚合物。胶凝速率可通过调节可用于离子可交联的生物相容性聚合物的活性交联剂的量来控制。
在本发明的第三方面，通过确保将活性交联剂通过至少一个扩散阻挡层与离子可交联的生物相容性聚合物分离来实现活性交联剂的延迟释放和持续释放。当活性交联剂通过扩散阻挡层并与离子可交联的生物相容性聚合物接触时，形成离子交联的生物相容性聚合物。胶凝速率可通过调节可用于离子交联的生物相容性聚合物的活性交联剂的量，即通过调节穿过扩散阻挡层的传输速率来控制。
在本发明的第一和第二方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层允许活化剂组合物和惰性交联剂以延迟的速率彼此接触，从而确保活性交联剂的延迟释放和持续释放。
在本发明的第三方面的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层允许活性交联剂的延迟释放和持续释放。
在本发明的一个实施方案中，活化剂组合物均匀地分布在第一和/或第二扩散阻挡层内。此外，优选在干燥期间不应发生相分离。
在本发明的第一和第二方面的另一个实施方案中，活化剂组合物与惰性交联剂的混合物导致活性交联剂的形成，该活性交联剂适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。
活性交联剂
术语“活性交联剂”是指适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的化合物。活性交联剂通常为与水接触时释放离子的化合物；所述离子适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。与水接触时释放离子的化合物通常是水溶性的，优选在水中的溶解度(25℃，pH＝7)高于1g/L的化合物，如高于10g/L或高于100g/L的化合物。CaCl2和BaCl2在水中的溶解度(25℃，pH＝7)分别为约811g/L和358g/L，因此代表本发明的活性交联剂的典型实例。与之相比，CaCO3和BaCO3在水中的溶解度(25℃，pH＝7)分别为约0.013g/L和0.024g/L，因此不应视为如本文定义的活性交联剂，而应视为惰性交联剂。
在本发明的一个实施方案中，活性交联剂是可溶于水的二价阳离子盐，如二价阳离子氯化物、二价阳离子乙酸盐、二价阳离子柠檬酸盐，优选CaCl2、BaCl2、Ca(CH3COO)2、Ba(CH3COO)2、柠檬酸钙、柠檬酸钡或其任意混合物，更优选CaCl2、Ca(CH3COO)2、柠檬酸钙或其任意混合物。
在本发明的另一个实施方案中，将第二容器的内容物与第一容器的内容物混合之前，第一容器和第二容器均不含有任何活性交联剂。
惰性交联剂-活化剂组合物
术语“惰性交联剂”是指需要通过活化剂组合物活化以便能够释放离子的化合物，所述离子适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。如果惰性交联剂未被活化剂组合物活化，则惰性交联剂不能释放适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子。惰性交联剂通常为与25℃、pH＞8的水接触时不释放离子的化合物；所述离子适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联。
在本发明的一个实施方案中，惰性交联剂是在水中的溶解度(25℃，pH＝7)低于1g/L的化合物，如低于10g/L或低于100g/L的化合物。CaCl2和BaCl2在水中的溶解度(25℃，pH＝7)分别为约811g/L和358g/L，因此不是如本文定义的惰性交联剂。然而，CaCO3和BaCO3在水中的溶解度(25℃，pH＝7)分别为约0.013g/L和0.024g/L，因此应视为如本文定义的惰性交联剂。
在本发明的一个实施方案中，惰性交联剂是不溶于水的二价阳离子盐，如二价阳离子碳酸盐，更优选CaCO3、BaCO3或其任意混合物。
惰性交联剂如CaCO3和BaCO3在酸性pH下释放出适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子。因此，可作为质子供体的任意化合物可为用于所述惰性交联剂的合适的活化剂组合物。
因此，在本发明的一个实施方案中，活化剂组合物包含质子供体如酸，并且惰性交联剂是与质子供体接触后释放适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子的化合物。优选质子供体是水溶性的。
在一个优选的实施方案中，质子供体选自：i)有机酸，如抗坏血酸、柠檬酸或其任意混合物；ii)无机酸，如磷酸、盐酸或其任意混合物；或iii)有机酸和无机酸的混合物。
在本发明的一个替代性实施方案中，活化剂组合物包含与水接触后转化为质子供体(如酸)的化合物。这类化合物的代表性实例是无机酸酐、有机酸酐和内酯(如葡糖酸-δ-内酯)或其任意混合物。在一个更优选的实施方案中，活化剂组合物是有机酸酐、葡糖酸-δ-内酯或其任意混合物；甚至更优选地，活化剂组合物包含葡糖酸-δ-内酯(glucono-δ-lactone)。
葡糖酸-δ-内酯是在溶液中缓慢水解形成葡糖酸的单糖。所述水解导致溶液pH逐渐降低，直至达到例如可由二价阳离子碳酸盐(如CaCO3或BaCO3)形成碳酸的点，释放出活性离子以诱导胶凝。葡糖酸-δ-内酯水解的速率以及因此胶凝的起始可通过例如改变溶液的温度来改变。随着凝胶在活化的交联剂-离子可交联的生物相容性聚合物的接触表面上进行，交联的聚合物大分子的体积减少，这又降低了聚合物溶液中剩余物的有效浓度。
活化剂组合物的另一个实例描述于WO2013/076232，其通过引用整体纳入本文。所述文献中公开的活化系统涉及使用水解酶和可被水解酶水解的底物。
如本文所用，术语“水解酶”意指涵盖当包含底物的溶液与包含水解酶的另一溶液混合时能够产生H3O+的水解酶。根据本发明的一个实施方案，水解酶为脂肪酶。根据本发明的另一个实施方案，脂肪酶是酰基水解酶，更优选三酰基甘油脂肪酶，如从酵母皱褶假丝酵母分离出的三酰基甘油脂肪酶。合适的脂肪酶可从Sigma-Aldrich Co.LLC(L1754-VII型或L3001I型，CAS编号9001-62-1)获得。
应理解，根据本发明，可使用任何在结合至其底物后导致H3O+产生的水解酶。因此可使用的水解酶可选自羧酸酯水解酶、草酰乙酸酶、糖苷酶、醚水解酶和在线性酰胺中作用于除肽键以外的碳氮键上的水解酶，如几丁质脱乙酰酶。
羧酸酯水解酶的非限制性实例是羧酸酯酶、三甘油脂肪酶、乙酰酯酶、固醇酯酶、L-阿拉伯糖醇内酯酶、葡糖酸内酯酶、酰基甘油脂肪酶、g-乙酰葡萄糖脱乙酰基酶、脂蛋白脂肪酶、脂肪酰基乙基酯合酶、聚(3-羟基丁酸酯)解聚酶，以及二酰基甘油酰基水解酶。草酰乙酸酶的非限制性实例是富马酰乙酰乙酸酶、酰基丙酮酸水解酶，以及乙酰丙酮酸水解酶。
糖苷酶的非限制性实例是α-葡糖苷酸酶。醚水解酶的非限制性实例是异分支酸酶。
水解酶的底物是与水解酶结合后导致H3O+产生的底物。因此，底物可依赖于本发明使用的水解酶的类型而变化。
本发明的合适的底物是有机酸(如羧酸)的酯。
根据本发明的一个实施方案，底物是式I的化合物：
Figure BDA0002874785560000231
其中R1、R2和R3独立地为相同或不同的并且代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12烷基羰基链，例如甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十二烷酮等。根据一个实施方案，R1、R2和R3各自为甲酮。根据另一个实施方案，R1、R2和R3各自为乙酮。根据另一个实施方案，R1、R2和R3为丙酮。当使用三酰基甘油脂肪酶作为本发明的水解酶时，式I的底物特别有用。与底物结合后，所述式I的酯被分解为甘油和羧酸，即从而提供H3O+。
烷基羰基链可为支链或无支链的。烷基羰基链还可为取代或未取代的。基于本文的教导，技术人员将认识到，可使用式I涵盖的各种底物，并且可基于本文的教导选择根据本发明待使用的合适的底物。因此，技术人员将认识到，烷基链的长度可变化而不影响酶产生甘油和底物的羧酸从而导致H3O+离子释放的能力。
根据本发明的一个优选实施方案，底物选自下式的三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯：
Figure BDA0002874785560000241
因此，根据一个实施方案，R1、R2和R3代表C1-C4烷基羰基。
根据本发明的另一个实施方案，存在的底物选自三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
根据本发明，上文定义的水解酶和底物的混合导致H3O+的产生。所述H3O+进一步导致离子从惰性交联剂中释放出来。
即使水解酶没有直接活化惰性交联剂，仍可认为它代表活化剂组合物，因为水解酶引发了一系列导致惰性交联剂活化的事件。因此，活化剂组合物可直接活化惰性交联剂(例如通过使用质子供体)，或可间接活化惰性交联剂(例如通过使用水解酶及其底物)。
在本发明的一个优选实施方案中，活化剂组合物通过引发一系列导致惰性交联剂活化的事件而间接活化惰性交联剂。所述活化剂组合物的一个实例是水解酶，所述水解酶使底物水解导致酸的形成，所述酸又与例如CaCO3相互作用，导致从所述碳酸盐中释放游离钙离子。间接活化惰性交联剂的活化剂组合物的另一个实例是葡糖酸-δ-内酯，其需要水解成酸形式，然后能够活化惰性交联剂。
在本发明的一个实施方案中，将第一容器的内容物与第二容器的内容物混合之前，水解酶及其底物包含在单独的容器中。在本发明的另一个实施方案中，水解酶及其底物可包含在同一容器中，条件是两种化合物通过扩散阻挡层(例如第一扩散阻挡层、第二扩散阻挡层或其任意混合物)分开。
在本发明的一个实施方案中，活化剂组合物包含水解酶。为了使水解酶发挥其作用，可被水解酶水解的底物必须存在于第一和/或第二容器中，条件是将第一容器的内容物与第二容器的内容物混合之前，底物不与水解酶接触。
在本发明的另一个实施方案中，活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物。为了使底物发挥其作用，水解酶必须存在于第一和/或第二容器中，条件是将第一容器的内容物与第二容器的内容物混合之前，底物不与水解酶接触。
在本发明的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层可同时充当扩散阻挡层和活化剂组合物。这可例如通过选择为质子供体(如酸)的扩散阻挡层，或通过选择与液体(如水)接触后转化为质子供体的扩散阻挡层实现。
因此，在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是活化剂组合物。
在本发明的另一个实施方案中，第一和/或第二扩散阻挡层是质子供体(如酸)，或与水接触后转化为质子供体。具有该性能的扩散阻挡层可选自聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酐、聚甲基丙烯酸酐或其任意混合物。
已概括性地描述了本发明，可通过参考实施例来获得进一步的理解，这些实施例在本文中仅出于说明的目的而提供，并且除非另有说明，否则不旨在进行限制。
实施例
实施例1：制备在授精吸管内藻酸盐凝胶中的牛精子
材料
使用了以下化学品：来自Sigma-Aldrich(St.Luis，USA)的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、EDTA、NaHCO3、NaCl、NaOH、甘油(＞99％)果糖、抗坏血酸和柠檬酸钠、羧甲基纤维素(CMC)，来自Sekisui Specialty Chemicals Europe S.L(Tarragona Spain)的聚乙烯醇(PVA)、Selvol523/Selvol 325。来自Apro(Oslo，Norway)的无水葡萄糖。来自BrenntagSpecialties(South Plainfield，USA)的ViCality AlbaFil碳酸钙和来自Novamatrix A/S(Drammen，Norway)的藻酸钠(UP-LVG)。
精子的来源
牛精子在挪威Trondheim的
Figure BDA0002874785560000261
和Stange的Store Ree的Geno设备中收集。
缓冲液
使用了以下补充剂溶液：
·用于精子第一次稀释的补充剂：1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐葡萄糖、0.4g l-1柠檬酸钠、1g l-1果糖，以及200ml l-1卵黄。通过加入NaOH将溶液的pH调节至6.4。
·用于精子第二次稀释的补充剂溶液：1g l-1ViCality Albafil碳酸钙、54g l-1果糖、170g l-1甘油和10g l-1UP-LVG藻酸钠。两种补充剂均含有标准抗生素混合物，得到至少EU目录88/407中要求的最终浓度。
授精吸管的涂覆：
通过用13.6μmol/mL的抗坏血酸水溶液和3％PVA水溶液的混合物或13.6μmol/mL的抗坏血酸水溶液和1.5％CMC水溶液的混合物冲洗来涂覆授精吸管(型号“中”)。用涂覆溶液冲洗后，将吸管在室温下于真空室中干燥。
稀释和固定牛精子
在Geno设备上收获牛精子。收获后，立即将精子在补充剂溶液中进行第一次稀释，稀释至每毫升133x 106个细胞的浓度。然后将所得的含有精子的溶液冷却至4℃。冷却至4℃后，将溶液与等体积的补充剂溶液混合以进行第二次稀释。
然后将含有精子的溶液转移至如上所述的涂覆有抗坏血酸和PVA或抗坏血酸和CMC的授精吸管中。将授精吸管保持在4℃，并在1、3、5和24小时后检查内容物的凝胶化和pH。
评估凝胶化和凝胶强度以及精子的运动性
对于两种类型的涂覆，在1小时后都观察到吸管中液体的粘度增加。3小时后，在吸管内形成凝胶，并且24小时后，在吸管内观察到坚固的凝胶。
使用显微镜评估来评价精子的运动性。在测量运动性之前，将藻酸盐凝胶在改性IVT溶液(3gl-1葡萄糖、20gl-1柠檬酸钠、2.1g l-1NaHCO3、1.16g l-1NaCl、3g l-1EDTA，pH7.35)中液化，所述液化通过将授精吸管的内容物加入至微量离心管(Eppendorf tube)中0.9ml改性IVT溶液中，并在试管杯中小心摇动该管约10分钟进行。在显微镜评估运动性之前，将试管在37℃的加热块中预热最少15分钟。将约3μl的溶液加入到预热的显微镜载玻片上，并立即使用光学显微镜进行检查。每个样品中运动精子的数量估算至最接近的5％区间。
填充具有两种涂覆类型的吸管1小时后进行评估时，约85％的精子是运动的，5小时后两种类型的吸管中约70％的精子是运动的。24小时后评估时，涂覆有抗坏血酸和PVA的吸管中约50％的精子是运动的，而涂覆有抗坏血酸和CMC的吸管中60％的精子是运动的。
实施例2：测定具有固定的精子细胞的不同藻酸盐凝胶的机械强度
材料
使用了以下化学品：来自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、EDTA、D-(+)-葡糖酸δ-内酯、NaHCO3、NaCl、甘油(＞99％)、果糖和柠檬酸钠。来自Apro(Oslo，Norway)的无水葡萄糖。来自KSL staubtechnik GmbH(Lauingen，Germany)的Eskal500碳酸钙和来自NovaMatrix，FMC BioPolymer AS(Sandvika，Norway)的藻酸钠(UPLVG和UP VLVG)。0.25ml标准授精吸管(法国微型吸管(IMV，L’Aigle，France))。
精子的来源
牛精子在挪威Trondheim的
Figure BDA0002874785560000281
和Stange的Store Ree的Geno设备中收集。
缓冲液
使用了以下补充剂溶液：
用于精子第一次稀释的补充剂：1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐葡萄糖、0.4gl-1柠檬酸钠、1g l-1果糖，以及200ml l-1卵黄。通过加入NaOH将溶液的pH调节至6.4。
用于精子第二次稀释的补充剂溶液：0.5g l-1Eskal500碳酸钙、54g l-1果糖、170gl-1甘油和12g l-1藻酸钠(UP LVG和UP VLVG的混合物)。两种补充剂均含有标准抗生素混合物，得到至少EU目录88/407中要求的最终浓度。
牛精子的稀释、固定和低温保藏
在Geno设备上收获牛精子。收获后，立即将精子在补充剂溶液中进行第一次稀释，稀释至每毫升133x 106个细胞的浓度。然后将所得的含有精子的溶液冷却至4℃。冷却至4℃后，将溶液与等体积的补充剂溶液混合以进行第二次稀释。向混合物中加入D-(+)-葡糖酸δ-内酯至终浓度为55mM以初始化胶凝，并填充在精液吸管中。根据低温保藏的标准步骤，将吸管在4℃储存约4.5小时，并在液N2中冷冻。改变用于第二次稀释的溶液中UP LVG和UPVLVG的比例，以制备具有改变的机械强度的藻酸盐凝胶。
机械强度评估
每个加工过程中，将10个冷冻精液吸管在37℃解冻1分钟，随后平行排列紧密接触，并以金属板为中心。使用配备有P/35探针(35mm DIA CYLINDER ALUMINIUM)的质构分析仪TA XT Plus(Stable micro systems，Godalming，Surrey，UK)来量化精液吸管中凝胶的机械强度。使用1kg负载传感器以0.1mm/s的测试速度至80％的应变进行测量(测试模式压缩)。将机械强度量化为抵抗凝胶变形的力的初始线性倾斜(0.05至0.1mm)。如实施例1所述，通过人工评估表征为弱或软的吸管凝胶的机械强度测得为43g/mm。通过人工评估表征为强的吸管凝胶的机械强度测得为90g/mm。
实施例3：涂覆的授精吸管
制备涂覆的授精吸管
材料：来自Sekesui Specialty Chemicals Europe S.L.(Tarragonia，Spain)的聚乙烯醇Selvol 523和Selvol 325，来自CP Kelco的羧甲基纤维素(CMC)：CEKOL、纤维素胶、羧甲基纤维素钠E466，来自Ashland Wilmington(Delaware USA)的甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素的混合物Benecel MP 812W，来自Dow Chemical Company的羟丙甲纤维素Methocel K100，来自Sigma Aldrich的抗坏血酸，来自VWR的盐酸AnalaR
Figure BDA0002874785560000291
1)通过用13.6μmol/mL的抗坏血酸水溶液和3％PVA(聚乙烯醇)水溶液或5％PVA(聚乙烯醇)的混合物冲洗来涂覆授精吸管。
2)通过用13.6μmol/mL的抗坏血酸水溶液和1.5％CMC(羧甲基纤维素)水溶液的混合物(涂覆溶液)冲洗来涂覆授精吸管。用涂覆溶液冲洗后，将吸管在室温下于真空中进行运动干燥。
3)通过用13.6μmol/mL的抗坏血酸水溶液和1.5％Benecel MP 812W(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)水溶液的混合物或13.6μmol/mL的抗坏血酸水溶液和1.5％MethocelK100(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素-羟丙甲纤维素)水溶液的混合物(涂覆溶液)冲洗来涂覆授精吸管。用涂覆溶液冲洗后，将吸管在室温下于真空中进行运动干燥。
4)通过用35μmol/mL的盐酸水溶液和3％PVA(聚乙烯醇)水溶液或5％PVA(聚乙烯醇)水溶液的混合物(涂覆溶液)冲洗来涂覆授精吸管。用涂覆溶液冲洗后，将吸管在室温下于真空中进行运动干燥。
纤维素类聚合物(如CMC(羧甲基纤维素)、Benecel MP 812W(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)和Methocel K100(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素-羟丙甲纤维素))与强酸(如盐酸)不相容。对于这类聚合物，pKa＞3的弱酸(如抗坏血酸或葡萄糖醛酸)是合适的。强酸与纤维素类聚合物反应，导致聚合物基质降解或交联。
精子的来源
牛精子在挪威Stange的Store Ree的Geno设备中收集。
缓冲液
使用了以下补充剂溶液：
-用于精子第一次稀释的补充剂：1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐葡萄糖、0.4gl-1柠檬酸钠、1g l-1果糖，以及200ml l-1卵黄。
通过加入NaOH将溶液的pH调节至6.4。
-用于精子第二次稀释的补充剂溶液：5g l-1ViCality Extra Light碳酸钙(Speciality Minerals inc，Bethlehem，PA)、54g l-1果糖、170g l-1甘油和10g l-1UP-LVG藻酸钠(NovaMatrix，Sandvika，Norway)。两种补充剂均含有标准抗生素混合物，得到至少EU目录88/407中要求的最终浓度。
牛精子的稀释和固定
在Geno设备上收获牛精子。收获后，立即将精子在补充剂溶液中进行第一次稀释，稀释至每毫升133x 106个细胞的浓度。然后将所得的含有精子的溶液冷却至4℃。冷却至4℃后，将溶液与等体积的补充剂溶液混合以进行第二次稀释。
然后将含有精子的溶液转移至如上文所述的在制备涂覆的授精吸管，要点1-4中的涂覆的授精吸管。将授精吸管在4℃储存用于凝胶形成。
评估凝胶化和凝胶强度以及精子的运动性
在4℃储存3和24小时后，检查吸管中的凝胶形成，并评估经固定的精子的活力。结果总结于表1.1中。填充后3小时，在所有吸管中形成凝胶。在3至24小时之间，观察到吸管内的凝胶强度仅有一些变化或较小的变化。
使用显微镜评估来评价精子的运动性。在测量运动性之前，将藻酸盐凝胶在改性IVT溶液(3g l-1葡萄糖、20g l-1柠檬酸钠、2.1g l-1NaHCO3、1.16g l-1NaCl、3g l-1EDTA，pH7.35)中液化，所述液化通过将授精吸管的内容物加入至微量离心管中0.9ml改性IVT溶液中，并在试管杯中小心摇动该管约10分钟进行。在显微镜评估运动性之前，将试管在37℃的加热块中预热最少15分钟。将约3μl的溶液加入到预热的显微镜载玻片上，并立即使用光学显微镜进行检查。每个样品中运动精子的数量估算至最接近的5％区间。
结果总结于表1中。在填充吸管3小时后进行评估时，所有测试吸管中60至80％的精子是运动的。24小时后评估时，测试吸管中约40至65％的精子是运动的。
表1：涂覆的吸管的结果总结
Figure BDA0002874785560000311
实施例4：从PVC吸管中释放活化剂组合物
制备涂覆的授精吸管
材料：来自瑞典INEOS Compounds的医用级聚氯乙烯(PVC)干混料(NORVINYLHA.97.00.PJ.19020.1)、来自Sigma Aldrich的琥珀酸酐。
使用实验室混合器KETSE 20/40EC挤出机制备挤出的PVC吸管。用于制造吸管的管模头的内径为2mm，外径为2.5mm。与管模头连接的挤出机有6个加热区。筒全长为800mm，但为了防止PVC降解，加工长度减少至400mm。
琥珀酸酐分别以1和1.5重量％的量加入到PVC中。将所有成分在室温下预混合，然后进料至挤出机的进料器中。将共混物在190℃下熔融并混合。将挤出的吸管冷却并收集在水浴中。
将挤出的吸管用另外的水简短地洗涤以除去授精吸管表面上的琥珀酸酐，并且在使用前将授精吸管干燥。
精子的来源
牛精子在挪威Stange的Store Ree的Geno设备中收集。
缓冲液
使用了以下补充剂溶液：
-用于精子第一次稀释的补充剂：1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐葡萄糖、0.4gl-1柠檬酸钠、1g l-1果糖，以及200ml l-1卵黄。通过加入NaOH将溶液的pH调节至6.4。
-用于精子第二次稀释的补充剂溶液：5g l-1ViCality Extra Light碳酸钙(Speciality Minerals inc，Bethlehem，PA)、54g l-1果糖、170g l-1甘油和10g l-1UP-LVG藻酸钠(NovaMatrix，Sandvika，Norway)。两种补充剂均含有标准抗生素混合物，得到至少EU目录88/407中要求的最终浓度。
牛精子的稀释和固定
在Geno设备上收获牛精子。收获后，立即将精子在补充剂溶液中进行第一次稀释，稀释至每毫升133x 106个细胞的浓度。然后将所得的含有精子的溶液冷却至4℃。冷却至4℃后，将溶液与等体积的补充剂溶液混合以进行第二次稀释。
然后将含有精子的溶液转移至分别具有1和1.5重量％的琥珀酸酐的授精吸管。将授精吸管在4℃下储存用于凝胶形成。
评估凝胶化和凝胶强度以及精子的运动性
在4℃储存3和24小时后，检查吸管中的凝胶形成，并评估经固定的精子的活力。结果总结于表2中。填充后3小时，两类测试吸管中均形成了凝胶。在4℃下培育3至24小时，观察到吸管内的凝胶强度仅有较小的变化。
使用显微镜评估来评价精子的运动性。在测量运动性之前，将藻酸盐凝胶在改性IVT溶液(3g l-1葡萄糖、20g l-1柠檬酸钠、2.1g l-1NaHCO3、1.16g l-1NaCl、3g l-1EDTA，pH7.35)中液化，所述液化通过将授精吸管的内容物加入至微量离心管中0.9ml改性IVT溶液中，并在试管杯中小心摇动该管约10分钟。在显微镜评估运动性之前，将试管在37℃的加热块中预热最少15分钟。将约3μl的溶液加入到预热的显微镜载玻片上，并立即使用光学显微镜进行检查。每个样品中运动精子的数量估算至最接近的5％区间。
结果总结于表2中。在填充吸管3小时后进行评估时，所有测试吸管中60至70％的精子是运动的。24小时后评估时，测试吸管中约50至60％的精子是运动的。
表2：PVC吸管的结果总结
Figure BDA0002874785560000331
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Claims (13)

1.一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，所述试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含活化剂组合物和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物、惰性交联剂以及任选地待释放的材料；第一和/或第二扩散阻挡层允许活化剂组合物和惰性交联剂以延迟的速率彼此接触，从而确保活性交联剂的延迟释放和持续释放；
其中
第一容器和/或第二容器具有一定的尺寸和形态，其允许离子可交联的生物相容性聚合物与活性交联剂接触遍及第一容器和/或第二容器，从而确保存在遍及第一容器和/或第二容器的交联的生物相容性聚合物；
离子可交联的生物相容性聚合物为离子可交联的藻酸盐；
待释放的材料选自生物材料、治疗剂、诊断剂或其任意混合物；
活化剂组合物包含质子供体或与水接触后转化为质子供体的化合物或当结合至其底物时能够产生H3O+的水解酶；
活化剂组合物与惰性交联剂的混合物导致活性交联剂的形成，术语“活性交联剂”是指适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的化合物；
术语“惰性交联剂”是需要通过活化剂组合物活化以便能够释放适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子的化合物，其中惰性交联剂是不溶于水的二价阳离子盐；
并且
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的活化剂组合物涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；活化剂组合物和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，所述中间层包含活化剂组合物；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)活化剂组合物、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活化剂组合物或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；
或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)活化剂组合物、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活化剂组合物或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，所述内表面层包含活化剂组合物；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
2.一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，所述试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含惰性交联剂和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物、活化剂组合物和任选地待释放的材料；第一和/或第二扩散阻挡层允许活化剂组合物和惰性交联剂以延迟的速率彼此接触，从而确保活性交联剂的延迟释放和持续释放；
其中
第一容器和/或第二容器具有一定的尺寸和形态，其允许离子可交联的生物相容性聚合物与活性交联剂接触遍及第一容器和/或第二容器，从而确保存在遍及第一容器和/或第二容器的交联的生物相容性聚合物；
离子可交联的生物相容性聚合物为离子可交联的藻酸盐；
待释放的材料选自生物材料、治疗剂、诊断剂或其任意混合物；
活化剂组合物包含质子供体或与水接触后转化为质子供体的化合物或当结合至其底物时能够产生H3O+的水解酶；
活化剂组合物与惰性交联剂的混合物导致活性交联剂的形成，术语“活性交联剂”是指适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的化合物；
术语“惰性交联剂”是需要通过活化剂组合物活化以便能够释放适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的离子的化合物，其中惰性交联剂是不溶于水的二价阳离子盐；
并且
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的惰性交联剂涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；惰性交联剂和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，所述中间层包含惰性交联剂；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)惰性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的惰性交联剂，或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)惰性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的惰性交联剂或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，所述内表面层包含惰性交联剂；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
3.一种适于制备持续释放组合物的试剂盒，所述试剂盒包含第一容器和第二容器；第一容器包含活性交联剂和第一扩散阻挡层或第二扩散阻挡层；第二容器包含离子可交联的生物相容性聚合物以及任选地待释放的材料；第一和/或第二扩散阻挡层允许活性交联剂的延迟释放和持续释放；
其中
第一容器和/或第二容器具有一定的尺寸和形态，其允许离子可交联的生物相容性聚合物与活性交联剂接触遍及第一容器和/或第二容器，从而确保存在遍及第一容器和/或第二容器的交联的生物相容性聚合物；
离子可交联的生物相容性聚合物为离子可交联的藻酸盐；
待释放的材料选自生物材料、治疗剂、诊断剂或其任意混合物；
术语“活性交联剂”是指适于使离子可交联的生物相容性聚合物交联的化合物；
并且
-第一容器包含第一扩散阻挡层；与第一扩散阻挡层混合的活性交联剂涂覆在第一容器的内表面上；或
-第一容器包含第一扩散阻挡层；活性交联剂和第一扩散阻挡层以单独的层涂覆在第一容器的内表面上，从而形成内表面层和中间层，所述中间层包含活性交联剂；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；将i)活性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活性交联剂或iii)i)和ii)的混合物在制备第一容器期间挤出到第一聚合物材料中；第二扩散阻挡层为第一聚合物、第二聚合物或其组合；或
-第一容器包含第二扩散阻挡层，并由第一聚合物材料制成；第三聚合物与以下混合：i)活性交联剂、ii)包埋或包封于第二聚合物材料中的活性交联剂或iii)i)和ii)的混合物，在制备第一容器期间与第一聚合物材料一起共挤出，从而形成内表面层和外表面层，所述内表面层包含活性交联剂；第二扩散阻挡层为第二聚合物、第三聚合物或其组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中藻酸盐的古洛糖醛酸残基比甘露糖醛酸残基更多。
5.根据权利要求1或权利要求3所述的试剂盒，其中待释放的材料为精子。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其中待释放的材料为精子，并且其中活化剂组合物包含当结合至其底物时能够产生H3O+的水解酶，其中底物是有机酸的酯。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中第一容器是用于授精剂量的容器。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中第一扩散阻挡层选自：i)天然聚合物；ii)合成聚合物或共聚物；或iii)其任意混合物。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其中与水接触后转化为质子供体的化合物选自无机酸酐、有机酸酐以及内酯或其任意混合物。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中第一和第二扩散阻挡层是相同或不同的；条件是第二扩散阻挡层与挤出相容。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其中第一容器和/或第二容器具有管的形状，其内径小于1cm。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的试剂盒用于制备持续释放组合物的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中持续释放组合物待用于动物的繁殖。
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