KR20210017775A - 배리어 및 세포 클러스터를 이용하여 개선된 인공피부의 접종 또는 프린팅 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않는 배리어(barrier)를 제조하는 단계; 및 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계를 포함하는 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환부 맞춤형 세포 배양체, 및 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않으며 생체적합성 소재로 제조된 것을 특징으로 하는 인공피부의 수축 방지 및 표피화율을 향상을 위한 배리어에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의할 경우 시험관 내에서 또는 환부 상에 적용될 인공피부를 제조함에 있어 상기 배리어가 세포 배양체의 외부에 존재하는 조직이 내측으로 이동하는 것을 방지하고 세포층의 균일한 프린팅을 가능하게 하며, 개별화된 세포가 아닌 섬유아세포의 클러스터를 사용함으로써 제조된 인공피부의 수축률 및 표피화율을 현저히 개선시키는 효과가 있다.

Description

배리어 및 세포 클러스터를 이용하여 개선된 인공피부의 접종 또는 프린팅 방법 {Method for injecting or printing improved artificial skin using a barrier and cell clusters}

본 발명은 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않는 배리어(barrier)를 제조하는 단계; 및 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계를 포함하는 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 환부 맞춤형 세포 배양체, 및 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않으며 생체적합성 소재로 제조된 것을 특징으로 하는 인공피부의 수축 방지 및 표피화율을 향상을 위한 배리어에 관한 것이다.

피부는 표피(epidermis)와 진피(fibroblast)로 이루어져 있으며, 표피는 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4개의 층으로 이루어져 있다. 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 점차 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화 과정을 거치게 되는데, 이러한 각질형성세포는 초기부터 시험관 내에서 배양이 가능한 특징으로 인해 피부의 성상(性狀)을 연구하고 이를 생체 조직학적으로 활용하기 위해 광범위하게 이용되어 왔다. 초기의 각질형성세포 배양 방법은 각질형성세포를 배양액 속에 침지시킨 상태로 배양한 것이었는데, 이후 세포 배양방법이 점차 발전되어 최근에는 인체 피부의 표피와 유사한 표피 조직을 얻을 수 있는 삼차원적 배양방법, 즉 인공피부 배양이 가능하게 되었다.

현재 사용되는 대표적인 방법은 콜라겐 기질 위에 각질형성세포를 삼차원적으로 배양하는 방법(living skin equivalent, LSE)(Prunieras M, Regnier M, Woodley D. J Invest Dermatol. 1983 Jul;81(1 Suppl):28s-33s; Bell E, Sher S, Hull B, Merrill C, Rosen S, Chamson A, Asselineau D, Dubertret L, Coulomb B, Lapiere C, Nusgens B, Neveux Y. J Invest Dermatol. 1983 Jul; 81(1 Suppl): 2s-10s) 등이 알려져 있으며, 이러한 배양 기술이 개선됨에 따라 제조된 인공피부는 형태학적으로 매우 유사할 뿐만 아니라 생화학적, 기능적으로도 인체 피부의 표피와 상당히 유사해지고 있다.

그러나 현재까지 개발된 인공피부가 인체 피부와 완벽하게 동일하다고 할 수는 없으며, 여전히 학문적인 연구나 의학적인 치료용으로 적합한 인공피부 배양 또는 제조방법의 개발 필요성이 여전히 존재하고 있는 실정이다. 특히, 시험관 내에서 인공피부를 제조하거나 또는 제조된 인공피부를 실제 환부에 이식함에 있어서, 제조된 인공피부가 배양 과정에서 수축하거나 환부에 이식할 경우 환부의 외부에 존재하는 피부 조직이 인공피부가 이식된 내측으로 이동함에 따라 수축하는 문제는 인공피부 제조 및 활용시 여전히 큰 문제점으로 남아있다. 또한, 기존에 3D 프린팅 등 방법에 의해 인공피부를 제조할 경우 진피층 또는 표피층을 구성하는 세포로 개별화된 수개의 섬유모세포 또는 각질형성세포를 사용하였으나, 이러한 방법으로 제조된 인공피부도 수축률이나 표피화율(표피 생착률) 면에서 기대하는 효과를 달성하기에는 부족하였다. 한편, 실제 환부의 면적과 깊이, 표면 등이 균일하게 형성되어 있지 않기 때문에 인공피부 제조시 세포층을 균일하게 프린팅하는 것이 창상의 치유 및 흉터 방지에 중요한데, 기존의 제조방법으로는 형태학적, 기능적으로 이를 구현하는데 한계가 존재하였다.

이에, 본 발명의 발명자들은 이러한 기존의 문제점 및 한계를 해결하고 인공피부의 제조 및 이식의 성공률을 높이는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 시험관 내(In-vitro)에서 또는 환부 상에 적용될 인공피부를 3D 바이오 프린팅을 통해 제조함에 있어 내부 격벽을 갖는 배리어가 환부 외부에 존재하는 조직이 내측으로 이동하는 것을 방지하고 세포층의 균일한 프린팅을 가능하게 하며, 개별화된 세포가 아닌 섬유아세포의 클러스터를 사용함으로써 인공피부의 수축률 및 표피화율을 현저히 개선시키는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않는 배리어(barrier)를 제조하는 단계; 및 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계를 포함하는 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의해 제조된 환부 맞춤형 세포 배양체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않으며 생체적합성 소재로 제조된 것을 특징으로 하는 인공피부의 수축 방지 및 표피화율을 향상을 위한 배리어를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 하나의 목적은 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않는 배리어(barrier)를 제조하는 단계; 및 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계를 포함하는 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법은 시험관 내(In-vitro)에서 또는 환부 상에 적용될 인공피부를 3D 바이오 프린팅을 통해 제조함에 있어 내부 격벽을 갖는 배리어가 환부 외부에 존재하는 조직이 내측으로 이동하는 것을 방지하고 세포층의 균일한 프린팅을 가능하게 하며, 섬유아세포의 클러스터를 사용함으로써 인공피부의 수축률 및 표피화율을 현저히 개선시키는 효과가 있으며, 이는 본 발명의 발명자들에 의해 최초로 고안된 것인 점에서 그 의의가 크다.

본 발명에서 용어 "배리어(barrier)"는 제조된 인공피부 또는 환부의 수축을 방지하기 위한 가이드 역할을 하는 것으로, 내부에 하나 이상의 격벽을 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 본 명세서 내에서 용어 "격자(grid)"와 혼용될 수 있다.

상기 배리어는 당업계에 통상적으로 사용되는 생체 적합성 소재로 제조된 것일 수 있으며, 상기 생체 적합성 소재는 생체에 직접 접촉하는 생체 재료로서 생체 기능을 회복 또는 보강하는데 사용되거나 의료용 기구 등에 적용되어 생체적합성을 향상시키는 모든 물질을 제한없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 생체 적합성 소재는 금속 생체재료, 세라믹 생체재료, 복합 생체재료 및/또는 고분자 생체재료를 의미할 수 있으며, 보다 구체적으로는 생분해성 (Biodegradable) 세라믹 또는 생분해성 고분자 등 생체에 접촉, 적용시 독성이 없고 거부반응이나 이상반응을 유발하지 않으며, 생체 내에서 자연히 분해됨으로써 인공피부의 제조 및 이식에 적합한 모든 물질을 의미할 수 있다. 보다 더 구체적으로는 키틴(chitin), 셀룰로오스(cellulose), PHA(Polyhydroxyalkanoates), PLA(Poly Latic Acid), PBS(Poly Butylene Succinate), PCL(Polycaprolactone), PVA(Polyvinyl Alcohol), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLLA(poly-L-lactide) 또는 PGA(Polyglycolic Acid)일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 배리어는 인공피부가 이식될 환부를 3D 스캐닝하여 측정된 단면적, 깊이를 기초로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명의 배리어는 In-situ 3D 스캐닝 기술을 이용하여 화상, 창상 등에 의해 손상된 개체의 피부 형상을 측정하고 이를 3차원 영역의 데이터로 변환하여 환부에 적합한 면적과 깊이를 갖는 형태로 제조될 수 있는바, 환부 맞춤형 세포 배양체를 제공하는데 적합할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 배리어는 "융합형 세포배양지지체 제조장치 및 이를 이용하여 제조된 세포배양지지체"에 관한 한국 특허출원 제10-2012-0086126호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 배리어는 내부에 하나 이상의 "격벽"을 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 하나 이상의 내부 격벽이 서로 교차되는 경우 일정 간격의 격자 형태를 구성할 수 있고, 내부 격벽의 개수 및 두께는 특별히 제한되지 않는다. 또한, 배리어 내부에 포함되는 하나 이상의 격벽 간 간격은 환부의 면적에 따라 1 mm 내지 10 cm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 mm 내지 10 mm, 보다 더 바람직하게는 5 mm 내지 10 mm일 수 있다. 배리어 및 격벽의 두께는 0.1 mm 내지 5 mm, 바람직하게는 0.5 mm 내지 2mm, 보다 바람직하게는 0.5 mm 내지 1mm 이하일 수 있다. 배리어 및 격벽의 두께가 상기 범위 미만일 경우 강도가 낮아 그 형태를 유지하기가 어렵고, 상기 범위를 초과할 경우 그 두께만큼 바이오 잉크 또는 각질형성세포 등의 결손이 초래되어 인공피부 제조에 적합하지 않다.

또한, 상기 배리어는 제조되는 세포 배양체, 즉 인공피부의 수축을 방지하고 표피화율을 향상시킬 수 있으며, 구체적으로 시험관 내(In-vitro)에서 또는 환부 상에 적용될 인공피부를 제조함에 있어 환부 외부에 존재하는 조직이 내측으로 이동하는 것을 방지하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 돼지 피부에 인공피부의 3D 바이오 프린팅을 수행함에 있어 창상 부위에 격자를 적용한 경우 그렇지 않은 경우와 비교하여 약 16% 내지 20%의 매우 낮은 수축률을 나타냈으며, 표피화율(표피 생착률) 또한 그렇지 않은 경우 대비 현저한 수준으로 높아짐을 확인하였다.

본 발명에서 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계는, 상기 구분된 공간 사이에 섬유모세포를 포함하는 조성물을 충전하여 진피층을 제조하는 단계 및 상기 진피층 상에 각질형성세포를 접종 또는 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계는 상기 한국 특허출원 제10-2012-0086126호 및 "단일 입자 디스펜싱 장치 및 방법"에 관한 한국 특허출원 제10-2018-0086971호에 기재된 장치 또는 방법에 따른 3D 바이오 프린팅으로 수행될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계에 있어서 프린팅되는 세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 환부의 위치 및 상태 등에 따라 당업자가 세포의 종류를 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

상기 세포는 체세포, 지방세포 유래 줄기세포, 골수 유래 줄기세포, 유도만능줄기세포 및 배아줄기세포 등의 줄기 세포, 간세포(progenitor cells) 및 분화된 세포(differentiated cells)를 포함하는, 쥐, 래트(rat), 개, 고양이, 원숭이, 돼지 또는 인간을 비롯한 포유류의 세포를 제한없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 일반적으로 포유류의 피부에서 발견되는 피부 세포들을 포함할 수 있으며, 케라틴 세포, 멜라닌 세포, 랑게르한스 세포 등 상피 세포 및/또는 이들의 조합과 섬유모세포(fibroblast), 지방세포(adipocytes), 비만세포(mast cells), 대식세포(macrophages) 등 진피 세포 및/또는 이들의 조합을 제한없이 포함할 수 있다. 보다 더 구체적으로, 상기 세포는 인공 피부를 제조하기 위한 인간 유래의 "섬유모세포"(또는 섬유아세포) 또는 "각질형성세포"를 의미할 수 있으며, 상기 섬유모세포를 포함하는 조성물을 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 충전함으로써 진피층을 제조할 수 있다. 이후 제조된 진피층 위에 준비된 각질형성세포를 추가로 접종 또는 배양하는 단계를 수행하여 인공피부를 제조할 수 있다. 구체적으로, 제조된 진피층 위에 각질형성세포를 접종 또는 배양하는 단계는 진피층 위에 피펫을 사용하여 각질형성세포를 얇고 균일한 간격으로 점적하거나 프린팅하여 접종 또는 배양하는 것을 의미할 수 있다.

또한, 상기 섬유모세포는 섬유모세포의 클러스터(cluster)를 의미할 수 있으며, 본 명세서 내에서 상기 섬유모세포 클러스터는 용어 세포 클러스터, 세포 스페로이드(spheroid) 또는 스피어(sphere)와 혼용될 수 있다. 본 발명의 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법은 개별화된 세포가 아닌 섬유아세포의 클러스터를 사용함으로써 인공피부의 수축률 및 표피화율을 현저히 개선시키는 효과가 있음을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 섬유모세포 클러스터 또는 이를 포함하는 조성물을 사용할 경우 제조된 인공피부의 수축률 개선에 보다 효과적임을 확인하였다.

상기 섬유모세포를 포함하는 조성물은 섬유모세포, 겔화 고분자, 성장 인자, 항생제 또는 이들의 조합을 포함하는 바이오 잉크를 의미할 수 있다. 상기 "바이오 잉크"는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며 3D 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 통칭하는 것으로, 본 발명의 목적상 인공피부의 제조에 적합한 것으로 당업자가 선택할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 프린팅되는 조직에 적합한 임의의 천연/합성된 화합물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 화합물은 수용성 또는 생체 적합성 물질로서 엘라스틴, 케라틴, 피브로넥틴, 글리코프로틴, 폴리락타이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리아크릴레이트, 폴리술폰, 올리고펩타이드, 단백질 및 그 유도체, 피브린, 피브리노겐, 라미닌, 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리아미노산, 탄수화물, 다당류 및 변형된 다당류 및 그 유도체일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 겔화 고분자는 콜라겐, 젤라틴, 마트리겔, 알지네이트, 아가로스, 히알루론산 및 피브린겔로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 의미할 수 있고, 상기 성장 인자는 섬유모세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 상피 성장 인자(EGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 의미할 수 있으며, 상기 항생제는 페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 암포테리신 B(Amphotericin B) 또는 겐타마이신(Gentamycin)일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 배리어를 제조하는 단계 및 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계는 시험관 내(In-vitro) 또는 환부 상에서 동시에 또는 순차로 수행될 수 있다. 상기 배리어를 제조하는 단계 및 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계는 In-vitro에서 수행될 경우 multi well plate 또는 petri dish 상에서 환부 크기에 적합한 크기 및 형상을 갖는 인공피부를 3D 바이오 프린팅하여 제조할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법에 의해 제조된 환부 맞춤형 세포 배양체를 제공한다. 상기 세포 배양체는 특별히 제한되지 않으나, 섬유아세포를 포함하는 진피층, 또는 진피층과 각질형성세포를 포함하는 표피층을 포함하는 2층 구조일 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 목적상 창상의 치유 및 흉터 방지를 위한 인공피부를 의미한다.

상기 방법에 의해 제조된 환부 맞춤형 세포 배양체 또는 인공피부는 기존에 격자를 적용하지 않은 방법, 또는 개별화된 단일 섬유모세포를 적용하여 진피층을 프린팅하는 방법 등에 의해 제조된 인공피부와 비교하여 인공피부의 수축률이 개선되고 표피화율(생착률) 또한 현저히 향상되는 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않으며, 생체적합성 소재로 제조된 것을 특징으로 하는 인공피부의 수축 방지 및 표피화율을 향상을 위한 배리어를 제공한다. 상기 용어 격벽, 생체적합성 소재 및 배리어는 전술한 바와 같다.

본 발명의 방법에 의할 경우 시험관 내에서 또는 환부 상에 적용될 인공피부를 제조함에 있어 상기 배리어가 세포 배양체의 외부에 존재하는 조직이 내측으로 이동하는 것을 방지하고 세포층의 균일한 프린팅을 가능하게 하며, 개별화된 세포가 아닌 섬유아세포의 클러스터를 사용함으로써 제조된 인공피부의 수축률 및 표피화율을 현저히 개선시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 방법을 이용할 경우 보다 균질하게 인공피부 프린팅이 가능함을 표현한 것이다.
도 2는 돼지의 피부 창상에 대해 인공피부를 프린팅함에 있어 각각 격자(Grid) 및 세포 클러스터(Sphere)를 적용한 경우, 세포 클러스터만 적용한 경우(Sphere), 단일 세포만 적용한 경우(Single cells) 및 격자와 세포 어느 것도 적용하지 않은 무처리군(none) 수축율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 돼지의 피부 창상에 대해 인공피부를 프린팅함에 있어 피부의 표피화율(생착률)을 비교한 것으로, 도 2의 A는 격자 및 세포 클러스터를 적용한 경우(Grid + sphere), 도 2의 B는 격자 및 단일 세포를 적용한 경우(Grid + single cells), 도 2의 C는 세포 클러스터만 적용한 경우(Sphere), 도 2의 D는 단일 세포만 적용한 경우(Single cells), 도 2의 E는 격자와 세포 어느 것도 적용하지 않은 무처리군(None)를 나타낸다.
도 4는 인공피부 프린팅에 단일 세포를 적용한 기존의 방법과 세포 클러스터를 적용한 방법에 있어서 수축률을 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 돼지의 피부 창상에 대해 인공피부를 프린팅한 후 조직화학염색을 실시하여 염증 세포의 분포를 관찰한 결과를 나타낸 것으로, 각각 격자 및 세포 클러스터를 적용한 경우(Grid + Sphere), 단일 세포만 적용한 경우(Single cells), 격자와 세포 어느 것도 적용하지 않은 무처리군(None)를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 배양체를 나타낸 것으로, 도 6의 A는 배리어 내부에 격벽을 포함하는 환부 맞춤형 세포 배양체(임의형상 - 환부 모양, 좌: 배리어, 우: 배리어 내부 공간 사이에 바이오 잉크 및 각질형성세포 프린팅 직후)이고, 도 6의 B는 배리어 내부에 격벽을 포함하는 세포 배양체(정사각형 - 돼지 창상 실험에 사용, 좌: 배리어, 우: 배리어 내부 공간 사이에 바이오 잉크 및 각질형성세포 프린팅 직후)이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 개체의 피부(창상)에 격자 및 세포 클러스터를 이용하여 인공피부를 프린팅하는 방법의 수축율 및 표피화율 분석

환부 맞춤형 인공피부를 프린팅함에 있어서 격자 및 세포 클러스터를 적용할 경우 창상의 외부 조직이 내부로 이동함으로써 발생하는 피부 수축의 문제를 해결하고 새로이 프린팅된 인공피부의 표피화율(생착률)을 높이고자 실제 동물(돼지) 모델의 피부를 대상으로 본 발명에 따른 인공피부 프린팅 방법을 수행하였다.

이를 위해 돼지의 창상 부위에 격자를 고정하고 섬유모세포 클러스터를 포함하는 바이오 잉크를 프린팅한 그룹(실시예)과 비교하여, 각각 창상 부위에 고정시킨 격자가 없는 그룹, 바이오 잉크 내에 섬유모세포 클러스터가 아닌 수 개의 단일 섬유모세포를 포함하는 그룹, 및 격자 및 섬유모세포 클러스터를 모두 적용하지 않은 그룹을 비교예로 환부에 생성된 피부의 수축률 및 표피화율을 평가하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 인공피부의 프린팅을 위해 돼지 피부에 9 cm² 면적의 창상을 준비하고, 동일한 사이즈의 격자를 창상에 삽입하여 고정하였다. 이후 여기에 섬유모세포(또는 섬유모세포 클러스터)를 포함하는 바이오 잉크를 프린팅하고, 프린팅이 완료된 섬유모세포 층 위에 배양이 완료된 각질형성세포를 접종하였다. 돼지 창상 모델에 대한 인공피부 프린팅 과정은 아래의 각 단계를 통해 수행되었다.

1) 세포 배양 및 세포 준비단계 - 섬유모세포 및 각질형성세포를 피부 조직에서 분리 및 배양하는 단계

본 발명에서 사용된 섬유모세포 및 각질형성세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하였다. 포피의 피부 조직에서 잔여 피하지방을 제거한 후, 이를 잘게 절개하여 500 ㎍/m] thermolysin 용액에서 37℃에서 40분간 반응시켰다. 반응시킨 조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하여 각각을 트립신 용액에 담아 37℃에서 15분 반응시킨 후 이를 단일 세포로 분리되도록 진탕하였다.

섬유모세포 및 각질형성세포의 배양은 ‘Rheinwald and Green (Cell, 1975)’의 방법을 따라 수행하였다. 분리된 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(KGM, Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 배양하였고, 섬유모세포는 10% 소의 혈청이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, WelGene, Gyeongsan-si, South Korea)에서 배양하였다. 각질형성세포 및 섬유모세포의 배양 온도는 37℃, 배양 기간은 각각 각질형성세포의 경우 5일 이내 섬유모세포의 경우 7일 내지 10일로 하여 배양하였다.

2) 바이오 잉크 제조 단계 - 섬유모세포가 포함된 바이오 잉크를 준비하는 단계

본 발명에서 사용한 바이오 잉크는 임상 적용 가능한 소재인 콜라겐, 히알루론산 및 피브리노겐이 복합된 소재를 사용하였다. 제조된 바이오 잉크는 가로 3 cm와 세로 3 cm 면적의 창상 당 3 ml의 섬유모세포 클러스터(Sphere) 93개(9×10⁵개, 약 9,677개/Sphere)(SpheroDish, ISF-361-5, Incyto, Cheonan-si, South Korea)의 비율로 첨가하여 혼합하였다(실험군). 한편 상기와 동일한 방법으로 각 창상 당 단일 섬유모세포 9×10⁵개를 첨가하여 혼합한 바이오 잉크(대조군)를 준비하였다.

3) 격자를 준비하는 단계

격자(Grid)는 한국 특허출원 제10-2012-0086126호에 기재된 장치 또는 방법을 참고하여 제조하였으며, 구체적으로 환부를 3D 스캐닝하여 측정된 단면적 및 깊이 등 격자의 크기와 형상에 관한 정보를 수집하고, 상기 정보에 기초하여 외곽의 배리어 및 내부 격벽을 한층 씩 적층하여 격자(Grid)를 제조하였다. 배리어 및 격벽의 소재로는 PCL(Polycaprolactone)을 사용하였고, 상기 배리어 및 격벽의 두께는 1 mm이며, 격벽 간 간격은 10 mm가 되도록 제작하였다.

4) 창상을 준비하고 격자를 고정하는 단계

돼지의 등에 가로 3 cm, 세로 3 cm의 피부 결손을 근육층 바로 위까지 만든 후, 크기가 맞는 격자(Grid)를 끼워넣고 네 모서리를 수술용 실로 피부와 함께 꿰매어 고정하였다.

5) 고정된 격자 위에 바이오 잉크를 접종 또는 프린팅하여 진피층을 제조하는 단계

상기 2)에서 제조된, 단일 섬유아세포 또는 제조된 섬유아세포의 클러스터를 포함하는 바이오 잉크를 환부 상에 고정된 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 충전하여 진피층을 제조하였다. 구체적으로, 상기 4)에서 준비된 돼지 피부 상 9 cm² 면적의 창상에 약 3 ml의 부피, 동일한 수의 섬유모세포 또는 섬유모세포 클러스터(Sphere) 93개(9×10⁵개, 약 9,677개/Sphere)(SpheroDish, ISF-361-5, Incyto, Cheonan-si, South Korea)를 포함하는 바이오 잉크를 프린팅하였고, 이는 한국 특허출원 제10-2012-0086126호 및 제10-2018-0086971호에 기재된 장치 또는 방법을 참고하여 수행하였다.

6) 각질형성세포 접종단계 - 상기 진피층 위에 각질형성세포를 접종 또는 프린팅하는 단계

상기 1)에서 배양된 각질형성세포를 5)에서 제조된 진피층 상에 균일한 두께로 접종하였다. 구체적으로, 창상에 고정된 배리어의 내부 격벽에 의한 구분된 공간 사이에 제조된 진피층 상에 피펫을 사용하여 각질형성세포를 균일한 간격으로 점적하였으며, 내부 격벽을 포함하지 않는 경우에도 마찬가지로 각질형성세포를 균일한 간격으로 점적하여 진피층 상에 각질형성세포 층이 고루 퍼지도록 하였다.

7) 창상을 바세린 거즈로 드레싱하여 프린팅된 피부를 고정하는 단계

바이오 잉크와 각질형성세포를 접종하거나 프린팅한 위에 바세린 거즈를 덮어주고, 바이오 잉크와 각질형성세포가 잘 유지되도록 마른 거즈들을 덮어준 후 반창고를 붙여 3주 동안 유지하였다. 이후, 창상 부위를 포함한 주변 약 5 mm까지를 포함하는 조직을 채취하여 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하여 블록을 만들었다. 4-6 ㎛로 section하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색 및 Masson's trichrome 염색을 실시하였고 조직학적 분석을 통해 비교하였다.

1-1. 프린팅된 인공피부의 수축률 비교

실험예 1의 과정에 따라 돼지 피부의 창상 부위에 인공피부의 프린팅을 수행한 결과, 격자 및 섬유모세포 클러스터를 사용한 실시예의 경우 각각 20%, 16%의 매우 낮은 수축률을 보인데 반하여, 격자 및 개별화된 섬유모세포를 사용한 경우에는 비교적 높은 31%, 28%의 수축률을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 섬유모세포 클러스터만 사용한 경우 각각 40%, 40%의 수축률을 나타냈고, 개별화된 섬유모세포를 사용한 경우에는 무려 55%, 57%의 수축률을 나타내었으며, 격자 및 세포 어느 것도 사용하지 않은 무처리군의 경우에는 각각 57%, 60%의 수축율을 나타내는 것을 확인하였다(도 2).

즉, 개별화된 섬유모세포가 포함된 바이오 잉크만을 적용한 경우 제조된 인공피부의 수축률 개선 효과가 거의 나타나지 않은 반면, 섬유모세포 클러스터를 사용한 경우 유의한 수준의 수축률 개선 효과가 있음을 확인하였다. 한편, 개별화된 섬유모세포가 포함된 바이오 잉크를 사용하는 경우라도 창상 부위에 격자를 적용하여 프린팅한 경우 수축률 면에서 현저히 개선되는 효과를 확인하였다. 결론적으로는 격자와 섬유모세포 클러스터를 포함하는 바이오 잉크를 모두 적용시킨 경우 인공피부의 수축률 개선 효과가 가장 우수하였고, 이는 특히 세포 클러스터뿐 아니라 창상 부위에 격자를 적용함으로써 환부의 외부 조직이 내측으로 이동하는 것을 방지함이 중요함을 나타낸다.

1-2. 조직학적 분석을 통한 프린팅된 인공피부의 표피화율 비교

실험예 1의 과정에 따라 돼지 피부의 창상 부위에 인공피부의 프린팅을 수행한 결과, 격자 및 섬유모세포 클러스터를 사용한 실시예의 경우 100%의 표피화율을 보였으며, 격자 및 개별화된 섬유모세포를 사용한 경우에는 약 70%의 표피화율, 섬유모세포 클러스터만 사용한 경우는 64%의 표피화율, 개별화된 섬유모세포만 사용한 경우 약 16%의 표피화율을 나타내었다. 한편, 격자 및 세포 어느 것도 사용하지 않은 무처리군의 경우에는 23%의 표피화율을 보여주었다. 이는 격자 또는 섬유모세포 클러스터 중 어느 하나라도 사용하지 않은 경우 모두 유사한 수준으로 인공피부의 표피화를 달성할 수 없음을 의미한다.

즉, 개별화된 섬유모세포가 포함된 바이오 잉크만 사용한 경우 대비 창상 부위에 격자를 추가로 적용한 경우 표피화율이 크게 증가하고, 특히 격자와 섬유모세포 클러스터를 포함하는 바이오 잉크를 병용한 경우 표피화율이 현저히 증가함을 확인하였는바, 이는 상기 과정에 따른 프린팅 방법을 통해 제조된 인공피부의 생착률이 크게 증가하였음을 나타낸다(도 3).

실험예 2: 섬유모세포 클러스터를 사용함에 따른 인공피부의 수축률 개선 여부 비교 분석

세포 클러스터를 사용하는 방법이 기존에 개별화된 세포를 사용하는 방법과 비교하여 제조된 인공피부의 수축을 감소시킬 수 있는지 여부를 확인하고자, 웰에 세포 클러스터 또는 개별화된 세포를 포함하는 콜라겐 겔을 넣어 굳힌 후 그 위에 각질형성세포를 뿌려 각각 배양하였다. 약 10일 후 최초 면적(100%)으로부터 수축률을 계산하였다. 세포 클러스터는 SpheroDish (ISF-361-5, Incyto, Cheonan-si, South Korea)을 이용하여 제조하였으며, 특별히 제작된 용기(SpheroDish)에 섬유모세포를 뿌려 배양시킨 후, 여기에 실험예 1의 바이오잉크를 혼합하여 최종적으로 제조를 완료하였다. 개별화된 세포와 세포 클러스터 간의 효과 차이를 비교하기 위해 동일한 수의 섬유모세포를 사용하였다. 즉, 기존의 방법으로는 웰당 500,000개의 개별화된 섬유모세포를 사용하였으며, 세포 클러스터만 넣은 경우 500,000개의 세포로 만들어지는 2개의 세포클러스터를 사용하였다.

그 결과, 기존에 개별화된 세포를 사용하는 경우 최종면적이 최초 대비 47%로 약 53%의 수축률을 보인 반면, 세포 클러스터를 적용한 경우는 최종면적이 최초 대비 69%로 약 31%의 수축률을 보임을 확인하였다(도 4). 이는 인공피부를 프린팅하여 제조함에 있어 섬유모세포 클러스터 또는 이를 포함하는 바이오 잉크를 사용하는 것이 제조된 인공피부의 수축률 개선에 보다 효과적임을 나타낸다.

실험예 3: 돼지의 피부 창상에 대해 인공피부 프린팅 후 진피 염증에 대한 조직학적 분석 결과

hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하여 염증세포의 침윤 정도를 관찰하였다. 격자 및 섬유모세포 클러스터를 사용한 경우(좌)에 염증 세포의 수가 확연히 적었던 것에 비해 개별화된 섬유모세포만 사용한 경우(중)에 염증 세포의 수가 더 많은 것을 확인하였으며, 격자 및 세포 어느 것도 사용하지 않은 무처리군의 경우(우)에 앞의 두 조건에 비하여 염증 세포의 수가 현저하게 많음을 확인하였다(도 5). 창상 발생 시 염증 세포의 침윤이 불가피하게 수반되나 그 수가 과도하게 되면 비생리적인 상황으로서 정상적인 치유 과정이 원할하게 진행되지 않으므로, 이로부터 인공피부 제조 시 격자 및 섬유모세포 클러스터를 사용하면 창상 치유에 훨씬 유리한 조건이 형성됨을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않는 배리어(barrier)를 제조하는 단계; 및 상기 배리어 또는 상기 배리어의 내부 격벽에 의해 구분된 공간 사이에 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계를 포함하는, 환부 맞춤형 세포 배양체를 제조하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 배리어는 생체적합성 소재인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 배리어는 환부를 3D 스캐닝하여 측정된 단면적 및 깊이를 기초로 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 내부 격벽은 서로 교차되어 일정 간격의 격자 형태를 구성하는 것인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 격벽 간 간격은 1 mm 내지 10 cm, 1 mm 내지 10 mm 또는 5 mm 내지 10 mm인 것인, 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 배리어는 상기 세포 배양체의 수축을 방지하고 표피화율을 향상시키며 세포층의 균일한 프린팅을 가능하게 하는 것인, 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 배리어는 환부 외부에 존재하는 조직이 제조된 세포 배양체의 내측으로 이동하는 것을 방지하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계는 섬유모세포를 포함하는 조성물을 충전하여 진피층을 제조하는 단계; 및 상기 진피층 상에 각질형성세포를 접종 또는 배양하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 섬유모세포는 섬유모세포의 클러스터(cluster)인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 섬유모세포의 클러스터는 제조된 세포 배양체의 수축을 방지하고 표피화율을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
11. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐, 젤라틴, 마트리겔, 알지네이트, 아가로스, 히알루론산 및 피브린겔로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 겔화 고분자; 섬유모세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 상피 성장 인자(EGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 성장 인자; 및 항생제를 추가로 포함하는 것인, 방법.
    
12. 제1항에 있어서, 상기 배리어를 제조하는 단계 및 세포층을 접종하거나 프린팅하는 단계는 시험관 내(In-vitro) 또는 환부 상에서 동시에 또는 순차로 수행되는 것인, 방법.
    
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 환부 맞춤형 세포 배양체.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 세포 배양체는 인공피부인 것인, 환부 맞춤형 세포 배양체.
    
15. 하나 이상의 내부 격벽을 포함하거나 포함하지 않고, 생체적합성 소재로 제조된 것을 특징으로 하는, 인공피부의 수축 방지 및 표피화율을 향상을 위한 배리어.

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