KR20210015903A - 산 스핑고미엘린분해효소 결핍증을 치료하기 위한 약제학적 조성물 - Google Patents

산 스핑고미엘린분해효소 결핍증을 치료하기 위한 약제학적 조성물 Download PDF

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산지타 벤좔
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Abstract

본 발명은 재조합 인간 산 스핑고미엘린분해효소를 포함하는 조성물, 예컨대, 수성 액체 조성물 및 동결건조 조성물을 제공한다. 또한 산 스핑고미엘린분해효소가 결핍된 환자를 치료하기 위하여 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

산 스핑고미엘린분해효소 결핍증을 치료하기 위한 약제학적 조성물
산 스핑고미엘린분해효소 결핍증(acid sphingomyelinase deficiency: ASMD)은 생명을 위협하는 희귀한 리소좀 축적 장애(lysosomal storage disorder)이다. 이는 리소좀 효소 산 스핑고미엘린분해효소(acid sphingomyelinase: ASM)를 암호화하는 SMPD1 유전자에서의 돌연변이로부터 초래되는 상염색체 열성 유전 질환이다(Schuchman et al., Mol.Genet.Metab. 120(1-2):27-33(2017)). ASMD 환자는 스핑고미엘린을 대사할 수 없는데, 그 결과 다양한 기관에서 리소좀에 축적되어, 심각한 경우에 내장 질환 및 신경퇴행을 야기한다. ASMD 환자는 비장, 간, 폐 및 골수에서 콜레스테롤 및 다른 지질이 증가되었다.
영아 신경내장성 ASMD(A형 니만-피크병(Niemann-Pick disease type A) 또는 NPD A라고도 공지됨)는 가장 심각한 질환 표현형이고, 조기 발병하는 급성 신경병증 형태를 특징으로 한다. NPD A는 발육 부진, 간비종대(hepatosplenomegaly) 및 급진적인 신경퇴행을 야기한다. 환자는 유아일 때 사망한다(문헌[McGovern et al., Neurology 66(2):228-232 (2006)]).
만성 내장 ASMD(NPD B) 및 만성 신경내장 ASMD(NPD A/B)를 가진 환자는 영아에서부터 성인기까지 다양하게 발병한다(문헌[Wasserstein et al., Pediatrics 114(6):e672-677 (2004)]; 문헌[Wasserstein et al., J. Pediatr. 149(4):554-559(2006)]). NPD B 환자는 보통 아동기에, 전형적으로 2세 이후에 진단된다. 대부분의 NPD B 환자는 성인기까지 생존한다. NPD A/B 환자는 신경퇴행성 질환으로서 진행될 수 있는 아동기 신경학적 증상의 징후가 있는 중간 형태를 갖는 것으로 분류된다. 간, 폐 및 혈액 질환으로부터의 이환(morbidity)은 만성 ASMD를 가진 모든 환자에서 발생하고, 간비종대, 간 기능장애, 침윤성 폐 질환 및 혈소판 감소증을 포함한다(문헌[McGovern et al., Genet. Med. 15(8):618-623 (2013)]; 문헌[McGovern et al., Orphanet J. Rare Dis. 12(1):41 (2017)]). 아동기 동안의 성장 제한 및 골장애, 예컨대 낮은 골밀도는 또한 만성 ASMD의 통상적인 특징이다(Wasserstein et al., J. Pediatr. 142(4):424-428(2003)). 폐 및 간질환은 이들 환자에서의 주된 사망 원인이다(문헌[McGovern et al., Pediatrics 122(2):e341-349 (2008)]; 문헌[Cassiman et al., Mol.Genet.Metab. 118(3):206-213(2016)]).
ASMD의 높은 이환율 및 사망률로 인해서, 이러한 유전자 질환의 효과적인 치료를 위한 긴급한 요구가 존재한다.
본 발명은 ASMD를 치료하기 위한 재조합 인간 ASM(recombinant human ASM: rhASM)의 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 rhASM, 인산나트륨, 메티오닌 및 수크로스(또는 트레할로스)를 포함한다. 특정 실시형태에서, rhASM은 올리푸다제 알파(olipudase alfa)(서열번호 2)이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 동결건조된다. 본 발명의 동결건조 조성물은, 예를 들어,
4~7% w/w의 올리푸다제 알파,
3~7% w/w의 인산나트륨,
15~25% w/w의 L-메티오닌 및
65~75% w/w의 수크로스
를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 동결건조 조성물은,
5.5% w/w의 올리푸다제 알파,
2.3% w/w의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
2.6% w/w의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
20.5% w/w의 L-메티오닌 및
68.6% w/w의 수크로스
를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 수성 액체 조성물이다. 수성 액체 조성물은, 예를 들어,
1~10 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
10~50 mM의 인산나트륨,
70~150 mM의 L-메티오닌 및
1~10% w/v의 수크로스
를 포함할 수 있고,
조성물은 5 내지 8의 pH를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 수성 액체 조성물은,
3~5 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
10~30 mM의 인산나트륨,
80~120 mM의 L-메티오닌 및
4~6%의 w/v의 수크로스
를 포함할 수 있고,
조성물은 6~7의 pH를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 수성 액체 조성물은,
4 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
20 mM의 인산나트륨,
100 mM의 L-메티오닌 및
5% w/v의 수크로스
를 포함할 수 있고,
조성물은 6.5의 pH를 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 수성 액체 조성물은 0.005% w/v의 폴리소르베이트 80을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 수성 액체 조성물을 건조(동결건조 또는 분무 건조)시킴으로써 얻어진 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 수성 액체 조성물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 동결건조 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 동결건조 조성물을 함유하는 바이알을 제공한다. 특정 실시형태에서, 바이알 내의 동결건조 조성물은,
21.2 ㎎의 올리푸다제 알파,
9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
79 ㎎의 L-메티오닌 및
265 ㎎의 수크로스
를 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 동결건조 조성물을 5.1 ㎖의 멸균수 중에 재구성하여 수성 액체 조성물을 얻는다.
특정 실시형태에서, 바이알 내의 동결건조 조성물은,
4.8 ㎎의 올리푸다제 알파,
2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
17.9 ㎎의 L-메티오닌 및
60 ㎎의 수크로스
를 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 동결건조 조성물을 1.1 ㎖의 멸균수 중에 재구성하여 수성 액체 조성물을 얻는다.
본 발명은 1) 본 명세서에 기재된 동결건조 조성물을 함유하는 바이알 및 2) 동결건조 조성물을 재구성하기 위한, 예를 들어, 멸균수, 0.9% 염화나트륨 또는 인산염 완충 식염수를 함유하는 바이알을 포함하는 제조 물품을 추가로 제공한다.
본 발명은 환자에게 본 명세서에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 ASMD를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 조성물은 동결건조 조성물인 경우 투여 전에 액체 형태로 재구성된다.
본 발명은 인간 환자에서 ASMD를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 인간 환자에서 ASMD를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ASMD의 치료는 A/B형 또는 B형 니만-피크병 또는 ASMD의 비-신경학적 징후에 대한 것이다.
도 1A는 다양한 pH에서 석신산염, 시트르산염, 시트르산염/인산염 또는 인산염 완충액 중에서 30℃에서 2주 저장 후 특이적(효소) 활성도에 의해서 의해서 측정된 바와 같은 rhASM의 안정성을 도시한 도면.
도 1B는 다양한 pH에서 석신산염, 시트르산염, 시트르산염/인산염 또는 인산염 완충액 중에서 30℃에서 1주 저장 후 고분자량 종 백분율(HMWS(high molecular weight species) %)에 의해서 측정된 바와 같은 rhASM의 안정성을 도시한 도면. HMWS는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC)로 결정되었다.
도 1C는 다양한 pH에서 시트르산염/인산염 또는 인산염 완충액에서 열 안정성에 의해서 측정된 바와 같은 rhASM의 안정성을 도시한 도면. 열 안정성을 시차 주사 열량측정법으로 측정하였다.
도 2A는 30℃에서 6.5의 pH를 갖는 10 mM, 20 mM, 50 mM 또는 100 mM 인산염 완충액에서 시간에 따른 rhASM의 비활성도(specific activity)를 도시한 도면.
도 2B는 30℃에서 6.5의 pH를 갖는 10 mM, 20 mM, 50 mM 또는 100 mM 인산염 완충액에서 HMWS %로 측정된 바와 같은 시간에 따른 rhASM의 물리적 안정성을 도시한 도면.
도 3A는 동결건조 전(액체) 및 동결건조 후(동결건조)에 4 ㎎/㎖의 rhASM의 특이적(효소) 활성도에 대한 5%의 w/v 만니톨, 수크로스 또는 트레할로스의 효과를 도시한 도면.
도 3B는 동결건조 전(액체) 및 동결건조 후(동결건조) HMWS %에 의해서 측정된 바와 같은 4 ㎎/㎖의 rhASM의 물리적 안정성에 대한 5% w/v의 만니톨, 수크로스 및 트레할로스의 효과를 도시한 도면.
도 4A는 5℃에서 시간에 따른 rhASM의 비활성도를 도시한 도면. rhASM은 5%의 만니톨, 5%의 수크로스 또는 3%의 만니톨 및 2%의 수크로스(모두 w/v 농도)를 함유하는 용액으로부터 동결건조되었다.
도 4B는 HMWS %에 의해서 측정된 바와 같은 5℃에서 시간에 따른 rhASM의 물리적 안정성을 도시한다. rhASM은 5%의 만니톨, 5%의 수크로스 또는 3%의 만니톨 및 2%의 수크로스(모두 w/v 농도)를 함유하는 용액으로부터 동결건조되었다.
도 5A는 5℃에서 시간에 따른 rhASM의 비활성도를 도시한 도면. rhASM은 100 mM의 메티오닌(모두 w/v 농도)의 존재 또는 부재 하에서 5%의 수크로스를 함유한 용액으로부터 동결건조되었다.
도 5B는 HMWS %에 의해서 측정된 바와 같은 5℃에서 시간에 따른 rhASM의 물리적 안정성을 도시한 도면. rhASM은100 mM의 메티오닌의 존재 또는 부재 하에서 5% w/v의 수크로스를 함유한 용액으로부터 동결건조되었다.
도 6은 2 내지 8℃에서 액체 rhASM 조성물 중에서 시간에 따른 이량체의 백분율에 대한 pH, 단백질 농도, 메티오닌 농도 및 수크로스 농도의 효과를 도시한 도면.
도 7은 2 내지 8℃에서 액체 조성물 중에서 시간에 따른 rhASM 비활성도에 대한 pH, 단백질 농도, 메티오닌 농도 및 수크로스 농도의 효과를 도시한 도면.
도 8은 다양한 pH, 단백질 농도, 메티오닌 농도 및 수크로스 농도를 갖는 액체 rhASM 조성물 중에서 2 내지 8℃에서 시간에 따른 HMWS %를 도시한 도면. 제형 번호를 그래프의 우측에 나타낸다.
도 9는 다양한 pH, 단백질 농도, 메티오닌 농도 및 수크로스 농도를 갖는 액체 rhASM 조성물 중에서 2 내지 8℃에서 시간에 따른 응집 %를 도시한 도면. 제형 번호를 그래프의 우측에 나타낸다.
도 10은 다양한 pH에서 액체 rhASM 조성물 중의 25℃에서 이량체 %, 응집 % 및 비활성도를 도시한 도면.
본 발명은 재조합 인간 ASM, 예를 들어, 올리푸다제 알파 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용의 조성물은 다른 조성물과 비교할 때 개선된 안정성 및 저장 수명을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 상당히 독성이거나 환자에서 활성 성분과 관련이 없는 원치 않는 부작용을 달리 유발하는 어떠한 추가 성분도 함유하지 않으면서 활성 성분의 생물학적 활성도가 효과적이도록 하는 그러한 형태로 존재하거나 그러한 형태가 되도록 제조될 수 있는 약제학적 조성물, 즉, 조성물이다. "용어 "약제학적 조성물" 및 "약제학적 제제"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하기에 추가로 기재된 바와 같은 ASM 결핍증을 갖는 환자를 치료하는 데 유용하다.
재조합 인간 산 스핑고미엘린분해효소
ASM은 스핑고미엘린의 세라마이드 및 포스포릴콜린으로의 분해를 촉매하는 효소이다. "재조합 인간 ASM"은 재조합 수단에 의해서 제조된, 야생형 서열에 대해서 특정 아미노산 변형을 갖거나 갖지 않는 인간 ASM을 지칭한다. 예를 들어, 재조합 인간 ASM은 배양된 포유동물 숙주 세포(예를 들어, COS, CHO, HeLa, 3T3, 293T, NS0, SP2/0 또는 HuT 78 세포 등) 또는 인간 ASM 암호 서열에 대해서 트랜스제닉인 동물에서 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 인간 ASM은 올리푸다제 알파이다. 올리푸다제 알파는 CHO 세포에서 생산된 인간 ASM(EC-3.1.4.12)의 글로코폼 알파(glycoform alpha)이다. 성숙 올리푸다제 알파는 천연 인간 단백질의 효소 및 리소좀 표적화 활성을 보유하는 570개의 아미노산의 폴리펩타이드이다. 리더 서열(잔기 1 내지 57)을 포함하는 올리푸다제(olipudase) 알파의 아미노산 서열을 서열번호 1로서 하기에 나타내며, 여기서 리더 서열은 이탤릭체이면서 볼드체이다. 성숙 올리푸다제 알파 서열(서열번호 1의 잔기 58 내지 627에 걸쳐 있는 서열번호 2)은 리더 서열을 갖지 않는다.
Figure pct00001
다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 인간 ASM은 올리푸다제 알파와 아미노산 서열이 99%, 98%, 97%, 96% 또는 95% 동일하다. 예를 들어, 조성물 중의 인간 ASM은 개시내용 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제6,541,218호에 제시된 서열을 가질 수 있다. 이러한 서열(서열번호 3)은 이탤릭체이면서 볼드체인 리더 서열(잔기 1 내지 59)과 함께 하기에 제시되어 있으며, 여기서 성숙 단백질(서열번호 3의 잔기 60 내지 629에 걸쳐 있는 서열번호 4)은 리더 서열을 갖지 않는다.
Figure pct00002
조성물 중의 인간 ASM은 또한 서열 P17405-1 또는 이의 다형성 변이체(polymorphic variant)로서 UNIPROT 데이터베이스에 개시된 인간 AMS과 아미노산 서열이 동일할 수 있다. P17405-1 서열은 이탤릭체이면서 볼드체인 리더 서열(잔기 1 내지 59)과 함께 하기에 제시되어 있으며(서열번호 5), 여기서 성숙 단백질(서열번호 5의 잔기 60 내지 629에 걸쳐 있는 서열번호 6)은 리더 서열을 갖지 않는다.
Figure pct00003
재조합 인간 산 스핑고미엘린분해효소 조성물
본 발명의 조성물은 재조합 인간 ASM을 함유하고, 이러한 효소에 비해서 우수한 안정성을 나타낸다. "안정적인" 또는 "안정성"은 저장 동안 그리고/또는 물리적 스트레스 또는 화학적 스트레스에 적용되는 경우 물리적 안정성, 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 보유하는 조성물 중의 활성 성분의 능력을 지칭한다. 안정성은 선택된 시간 지속기간, 예를 들어, 16주, 24주, 36주, 4개월, 6개월, 1년, 2년 동안 3년 또는 더 긴 기간 동안 선택된 온도, 예를 들어, 냉장 조건(예를 들어, 2~8℃) 또는 실온(예를 들어, 23~25℃) 하에서와 관련될 수 있다. 단백질의 안정성은 더 짧은 시간 지속기간 내에 수행되지만, 그 결과가 임상 설정에서 안정성을 나타내는 검정으로 측정될 수 있다. 이러한 검정은 단백질 조성물이 1회 이상의 동결-해동 주기에 적용되는 동결/해동 검정; 또는 단백질 조성물이 미리 결정된 지속기간에 걸쳐서 기계적 교반 처리에 적용되는 교반 검정을 포함한다. 단백질 안정성은 단백질 조성물을 지정된 저장 온도(예컨대, 2~8℃)에서 선택된 시간 지속기간에 걸쳐서 저장하는 단계 및 이의 구조적 및 기능성 속성, 예컨대, 이량체화 정도 또는 응집 정도(예를 들어, 크기 배제 HPLC 또는 단백질 겔에 의해서 측정되는 바와 같음), 단백질 분해(예를 들어, 크기 배제 HPLC 또는 단백질 겔에 의해서 측정되는 바와 같음), 조성물의 색상 변화, 액체 조성물의 투명도, 효소 활성도, 글리칸 함량 및 조성, 수용체 결합 친화도 및 메티오닌 잔기 산화 및 조성물의 생물학적 활성도를 분석함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유한다. "부형제"는 악물의 활성 성분(들)을 위한 희석제, 비히클, 담체, 보존제, 결합제 또는 안정화제로서 사용되는 불활성 물질을 지칭한다. 예를 들어, 조성물은 완충제, 등장제(isotonic agent) 및/또는 안정화제, 예컨대, 항산화제를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 작용제가 이들 목적 중 하나 초과를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 재조합 인간 ASM, 예컨대, 올리푸다제 알파, 완충제, 예컨대, 인산나트륨 또는 시트르산나트륨, 안정화제, 예컨대, L-메티오닌 및 비환원당, 예컨대, 수크로스 또는 트레할로스를 함유한다. 인간 ASM은 조성물의 특정 구성으로 인해서 개선된 안정성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 수성 액체 용액이거나 동결건조 제제일 수 있다.
액체 조성물
일부 실시형태에서, 조성물은 1~10 ㎎/㎖(예를 들어, 3~5 ㎎/㎖) rhASM(예를 들어, 올리푸다제 알파); 10~50 mM(예를 들어, 10~30 mM) 인산나트륨; 70~150 mM(예를 들어, 80~120 mM) 메티오닌(예를 들어, L-메티오닌); 및 1~10%(예를 들어, 4~6%) w/v의 수크로스 또는 트레할로스를 포함하는 수성 액체 조성물이다. 수성 액체 조성물의 pH는 5~8(예를 들어, 6~7)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 가장 널리 사용되는 결정질 부형제인 만니톨을 어떠한 검출 가능한 양으로도 포함하지 않는데, 그 이유는 그것이 본 명세서에 기재된 수성 액체 조성물의 동결건조 중에 또는 그 후에 인간 ASM의 응집을 상당히 증가시킬 수 있기 때문이다.
일부 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 0.004~0.008%, 0.005~0.007% 또는 0.005% w/v의 계면활성제(들)를 포함한다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 세제, 예컨대, 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 80) 및 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 0.005%의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 경우에, 계면활성제(들)의 존재는 액체 조성물에서 탁도(turbidity)를 감소시키는 것을 도울 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 0.05, 0.01 또는 0.005 mM 이하의 킬레이팅제(들), 예컨대, EDTA 및 EGTA를 포함하고; 예시적인 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 어떠한 검출 가능한 양의 킬레이팅제(들)도 포함하지 않는다. 일부 경우에, 예를 들어, 0.05 mM 또는 0.1 mM 초과의 농도의 킬레이팅제의 존재는 인간 ASM의 응집을 증가시켜, 특히 연장된 저장 지속기간 후에, 예를 들어, 12~16주 동안 또는 비-냉장 조건 하에서, 예를 들어, 25℃에서 이의 안정성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 0~50ppm(예를 들어 15~30ppm)의 아연을 함유할 수 있고, 이것은 예를 들어, 제조 공정으로부터 유래되거나 또는 외부에서 첨가될 수 있다.
특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 4 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파, 20 mM의 인산나트륨, 100 mM의 메티오닌 및 5% (w/v)의 수크로스를 포함하거나 이들로 본질적으로 이루어지고, 6.5의 pH를 갖는다. 용어 "본질적으로 이루어진"은, 조성물이 다른 성분을 검출 가능한 양으로 함유하지 않거나, 단백질 제조 공정으로부터 유래된 특정 물질을 단지 미량으로 함유할 수 있다는 것을 의미하며, 여기서 이러한 물질은 효소의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않거나 인간 환자에서 유해하지 않다.
일부 실시형태에서, 조성물은 1~20 ㎎/㎖(예를 들어, 10 ㎎/㎖)의 rhASM(예를 들어, 올리푸다제 알파) 및 10~50 mM(예를 들어, 20 mM)의 인산나트륨을 포함하는 수성 액체 조성물이다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 메티오닌(예를 들어, L-메티오닌) 및 수크로스 또는 트레할로스를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 80~120 mM(예를 들어, 100 mM)의 메티오닌 및 4~6%(예를 들어, 5%) (w/v)의 수크로스를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 6.5의 pH를 갖는다.
일부 실시형태에서, 조성물은 1~50 ㎎/㎖(예를 들어, 3.8, 18 또는 49 ㎎/㎖)의 rhASM(예를 들어, 올리푸다제 알파) 및 10~50 mM(예를 들어, 20 mM)의 인산나트륨을 포함하는 수성 액체 조성물이다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 1~15%(예를 들어 5%, 6%, 7% 또는 8%)의 수크로스 또는 트레할로스를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 80~120 mM(예를 들어, 100 mM)의 메티오닌을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 6.5의 pH를 갖는다. 조성물은 예를 들어, 3.8 ㎎/㎖의 rhASM, 20 mM의 인산나트륨 및 5%의 수크로스; 18 ㎎/㎖의 rhASM, 20 mM의 인산나트륨 및 5%의 수크로스; 또는 49 ㎎/㎖의 rhASM, 20 mM의 포스페이트 및 8%의 수크로스를 포함할 수 있다.
수성 액체 조성물은 재조합 기술에 의해서 생산되고, 그 다음 숙주 세포로부터 정제된 인간 ASM을 물 중에서 본 명세서에 기재된 부형제와 혼합하고, 생성된 혼합물을 목적하는 pH로 조정함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 ASM 및 목적하는 부형제는 목적하는 인산나트륨 농도 및 pH를 갖는 인산나트륨 완충액에 첨가되거나 또는 그 중에서 완충액-교환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성 액체 조성물은 하기에 상세하게 추가로 기재된 본 발명의 동결건조 조성물을 재구성함으로써 제조될 수 있다. 재구성은 약제학적으로 허용 가능한 액체, 예컨대, 멸균수, 염수(예를 들어, 0.9% 염화나트륨) 또는 인산염 완충 식염수를 사용하여 수행될 수 있다.
동결건조 조성물
본 발명은 또한 동결건조 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본 명세서에 기재된 수성 액체 조성물을 동결건조시킴으로써 제조될 수 있다. 동결건조 조성물은 장기간 저장에 적합하다. 동결건조는 당업계에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들어, 액체 조성물을 동결이 가능한 0도(섭씨) 미만의 온도(예를 들어, -5℃ 내지 -80℃)로 냉각시키고, 이어서 승화가 일어나게 하는 저압(부분 진공) 챔버에 넣을 수 있고(1차 건조); 바람직한 경우, 조성물의 온도를 제2 건조 단계(2차 건조)에서 증가시켜 원치 않는 물 분자를 추가로 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 동결건조의 완결 후, 용기를 밀봉하기 전에, 불활성 기체, 예컨대, 질소를 조성물의 용기(예를 들어, 유리 바이알)에 도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 예를 들어, 본 명세서에 기재된 수성 액체 조성물을 분무 건조시킴으로써, 제조될 수 있는 분말 조성물을 제공한다. 분무 건조된 조성물은 장기간 저장에 적합하다. 분무 건조는 당업계에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들어, 액체 조성물을 아토마이저(atomizer) 또는 분무 노즐을 통해서 밀어내어 그것을 제어된 크기의 작은 소적으로서 챔버 내의 고온 기체에 분산시켜, 액체 조성물을 분말로 신속하게 건조시킬 수 있다. 이어서 건조된 분말을 건조 챔버의 바닥에서 수집할 수 있다. 분말 조성물을 제조하는 다른 건조 방법이 또한 고려된다.
본 발명자들은, 본 명세서에 기재된 양으로 존재하는 수크로스(또는 트레할로스) 및 메티오닌이 동결건조 동안 우수한 결과를 제공하고; 동결건조된 생성물은 저장 동안 인간 ASM의 안정성을 보존하면서 매력적인 케이크를 형성한다는 것을 예상치 못하게 발견하였다. 본 발명의 동결건조 조성물에서 인간 ASM은 냉장 조건(예를 들어, 0~10℃, 2~8℃ 또는 4℃에서) 하에서 적어도 4개월(예를 들어, 적어도 6개월 또는 적어도 12개월) 동안 응집이 없고 생물학적으로 활성으로 유지될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 4~50%의 올리푸다제 알파, 3~7%의 인산나트륨 및 45~90%의 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함하는 동결건조된 약제학적 조성물이다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 5.5%의 올리푸다제 알파, 20.6%의 L-메티오닌, 2.3%의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 2.6%의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 69.0%의 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 6.6%의 올리푸다제 알파, 3.0%의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 3.3%의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 87.1%의 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 25.2% 올리푸다제 알파, 2.4% 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 2.6% 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 69.9% 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 47.8%의 올리푸다제 알파, 1.7%의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 1.8%의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 48.8%의 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 4~7%의 올리푸다제 알파, 15~25%의 L-메티오닌, 3~7%의 인산나트륨 및 65~75%의 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함하는 동결건조된 약제학적 조성물이다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 5.5%의 올리푸다제 알파, 20.5%의 L-메티오닌, 2.3%의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 2.6%의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 68.6%의 수크로스(모두 w/w 백분율)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 또한 예를 들어, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1.0%의 수분을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 15~25 ㎎의 올리푸다제 알파, 75~85 ㎎의 L-메티오닌, 15~25 ㎎의 인산나트륨 및 250~300 ㎎의 수크로스를 포함하는 동결건조된 약제학적 조성물을 함유하는 바이알을 제공한다. 사용 전에, 조성물은 4 내지 6 ㎖의 멸균수 중에 재구성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이알은 21.2 ㎎, 20.1 ㎎, 95.4 ㎎ 또는 259.7 ㎎의 올리푸다제 알파; 9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물; 10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물; 및 265 ㎎의 수크로스를 포함하거나 이들로 이루어진 동결건조된 약제학적 조성물을 함유한다. 동결건조 조성물은 79.1 ㎎의 L-메티오닌을 선택적으로 포함할 수 있다. 동결건조된 약제학적 조성물은 예를 들어, 제조 공정으로부터 유래될 수 있거나 외부에서 첨가될 수 있는 0~0.3 ㎎(예를 들어, 0.08~0.16 ㎎)의 아연을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 바이알은 내부에 멸균 질소 충전된 분위기를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 5.1 ㎖의 멸균수 중에 재구성되어 각각 약 4.0 ㎎/㎖, 3.8 ㎎/㎖, 18 ㎎/㎖ 또는 49 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파 농도를 산출할 수 있다. 재구성된 조성물은 투여될 용량을 기준으로 하는 비부피(specific volume)에 대해서 0.9%의 염화나트륨 용액으로 추가로 희석될 수 있다.
특정 실시형태에서, 바이알은 21.2 ㎎의 올리푸다제 알파, 79 ㎎의 L-메티오닌, 9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 265 ㎎의 수크로스를 포함하거나 이들로 이루어진 동결건조된 약제학적 조성물을 함유한다. 동결건조된 약제학적 조성물은 예를 들어, 제조 공정으로부터 유래될 수 있거나 외부에서 첨가될 수 있는 0~0.3 ㎎(예를 들어, 0.08~0.16 ㎎)의 아연을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조된 약제학적 조성물은 케이크 또는 동결건조된 분말의 형태로 존재한다. 특정 실시형태에서, 바이알은 내부에 멸균 질소 충전된 분위기를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 5.1 ㎖의 멸균수 중에 재구성되어 약 4.0 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파 농도를 산출할 수 있다. 재구성된 조성물은 투여될 용량을 기준으로 하는 비부피에 대해서 0.9%의 염화나트륨 용액으로 추가로 희석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 3~5 ㎎의 올리푸다제 알파, 15~17 ㎎의 L-메티오닌, 3~5 ㎎의 인산나트륨 및 50~60 ㎎의 수크로스를 포함하는 동결건조된 약제학적 조성물을 함유하는 바이알을 제공한다. 사용 전에, 조성물은 0.8~1.2 ㎖의 멸균수 중에 재구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 바이알은 4.8 ㎎의 올리푸다제 알파, 17.9 ㎎의 L-메티오닌, 2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 60 ㎎의 수크로스를 포함하거나 이들로 이루어진 동결건조된 약제학적 조성물을 함유한다. 특정 실시형태에서, 동결건조된 약제학적 조성물은 케이크 또는 동결건조된 분말의 형태로 존재한다. 동결건조 조성물은 예를 들어, 제조 공정으로부터 유래될 수 있거나 외부에서 첨가될 수 있는 0~0.06 ㎎의 아연을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 바이알은 내부에 멸균 질소 충전된 분위기를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 동결건조 조성물은 1.1 ㎖의 멸균수 중에 재구성되어 약 4.0 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파 농도를 산출할 수 있다. 재구성된 조성물은 투여될 용량을 기준으로 하는 비부피에 대해서 0.9%의 염화나트륨 용액으로 추가로 희석될 수 있다.
제조 물품
본 발명의 조성물은 사용 설명서 및 선택적으로 ASM 장애를 치료하기 위한 다른 치료제를 포함하는 제조 물품(예를 들어, 키트)으로 공급될 수 있다. 물품 내의 약제학적 활성 성분(예를 들어, rhASM)은 본 명세서에 기재된 투여 요법에 따라서 쉽게 투여될 수 있는 양으로 공급될 수 있다. 예를 들어, "스타터 키트"(starter kit)는 용량 증가 요법에서 사용하기 위해서 다양한 양의 rhASM의 다수의 바이알을 포함할 수 있다.
예를 들어, 제조 물품은 15~25 ㎎의 올리푸다제 알파, 75-85 ㎎의 L-메티오닌, 15~25 ㎎의 인산나트륨 및 250-300 ㎎의 수크로스를 함유하는 바이알을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 물품은 21.2 ㎎의 올리푸다제 알파, 79 ㎎ 메티오닌, 9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 265 ㎎의 수크로스를 포함하는 동결건조 조성물을 제공한다.
또 다른 예의 방식으로, 제조 물품은 3~5 ㎎의 올리푸다제 알파, 15~17 ㎎의 L-메티오닌, 3~5 ㎎의 인산나트륨 및 50~60 ㎎의 수크로스를 함유하는 바이알을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 물품은 4.8 ㎎의 올리푸다제 알파, 17.9 ㎎의 L-메티오닌, 2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물, 2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 60 ㎎의 수크로스를 포함하는 동결건조 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제조 물품은 환자에게 투여하기 전에 동결건조 조성물을 재구성하고/하거나 재구성된 조성물을 추가로 희석시키기 위해서 용액(예를 들어 멸균수, 0.9% 염화나트륨, 및/또는 인산염 완충 식염수)을 추가로 포함할 수 있다.
산 스핑고미엘린분해효소 조성물의 용도
본 발명의 약제학적 조성물은 효소 대체 요법으로서 이를 필요로 하는 환자에게 비경구로 투여될 수 있다. "비경구 투여"는 장관 투여 및 국소 투여 이외의 투여 수단, 보통 주사에 의한 것을 지칭한다. 비경구 투여는 비제한적으로 정맥내 주입 또는 주사 및 근육내, 피부내, 복강내 및 피부하 주사를 포함한다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 주입을 통해서 투여된다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 적절한 투여 수준은 환자의 연령, 체중, 질환 상태, 일반적인 건강 및 병력뿐만 아니라 약물 투여 경로 및 빈도, 약물 중의 ASM 활성 성분의 약력학 및 약동학 및 환자가 함께 복용할 수 있는 임의의 다른 약물을 비롯한 다양한 인자를 기초로 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 예를 들어, 미국 특허 제9,655,954(Schuchman 등)에 기재된 투여 요법에 따라서 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 환자의 연령 및 병태에 따라서, 예를 들어, 0.1 ㎎/kg 또는 그 미만에서 시작하고, 3 ㎎/k(유지 용량) 또는 그 미만에서 종결되는 용량 농도로, 인간 ASM의 증가 용량을 제공받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 용량 또는 제2 용량은 소아 환자의 경우 0.03 ㎎/kg 또는 0.1 ㎎/kg, 또는 성인 환자의 경우 0.1 ㎎/kg의 용량 농도로 제공될 수 있고; 환자는 0.03 및/또는 0.1 ㎎/kg의 1 또는 2회 용량을 제공받은 후, 환자는 그 다음, 0.3 ㎎/kg, 0.3 ㎎/kg, 0.6 ㎎/kg, 0.6 ㎎/kg, 1.0 ㎎/kg, 2.0 ㎎/kg 및 3.0 ㎎/kg의 순차적인 용량을 제공받는다. 특정 실시형태에서, 상기 용량 중 임의의 것은 반복될 수 있다(예를 들어, 1.0 ㎎/kg 및 2.0 ㎎/kg의 용량). 일부 환자의 경우, 3.0 ㎎/kg의 용량 농도가 유지 용량에 적합한 반면, 다른 환자의 경우, 더 낮은 농도가 유지를 위해서 충분할 수 있다. 연속적인 용량 사이의 간격은 의사가 적절하다고 결정하는 경우 2주이거나 또는 2주보다 더 짧거나 더 길 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 사용하여 ASMD의 치료를 필요로 하는 환자에서 ASMD를 치료하는 방법, ASMD의 치료를 필요로 하는 환자에서 ASMD를 치료하는 데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물 및 ASMD의 치료를 필요로 하는 환자에서 ASMD를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 액체, 예컨대, 멸균수, 0.9%의 염화나트륨 용액 또는 인산염 완충 식염수 중에 재구성될 수 있는 동결건조 조성물일 수 있다.
환자는 성인(예를 들어, 65세 이상인 노인 환자를 비롯한 18세 이상의 환자)일 수 있다. 환자는 소아 환자일 수 있다(18세 미만인 환자, 예를 들어, 신생아 내지 6세이거나, 6 내지 12세이거나, 12 내지 18세인 환자). 일부 실시형태에서, 환자는 NPD A/B 또는 NPD B를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 NPD A를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 만성 내장 ASMD(NPD B)를 갖는 성인 환자 또는 소아 환자를 치료하기 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 성인 환자 또는 소아 환자에서 ASMD의 비신경학적 징후를 치료하기 위한 것이다.
예시적인 실시형태
본 발명의 추가의 특정 실시형태는 다음과 같이 기술된다.
1. 재조합 인간 산 스핑고미엘린분해효소, 인산나트륨, 메티오닌 및 수크로스를 포함하는 조성물.
2. 실시형태 1에 있어서, 조성물은,
4~7% w/w의 올리푸다제 알파(서열번호 2),
3~7% w/w의 인산나트륨,
15~25% w/w의 L-메티오닌 및
65~75% w/w의 수크로스
를 포함하는 동결건조 조성물인, 조성물.
3. 실시형태 2에 있어서,
5.5% w/w의 올리푸다제 알파,
2.3% w/w의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
2.6% w/w의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
20.5% w/w의 L-메티오닌 및
68.6% w/w의 수크로스
로 본질적으로 이루어진, 조성물.
4. 실시형태 1에 있어서, 조성물은,
1~10 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
10~50 mM의 인산나트륨,
70~150 mM의 L-메티오닌 및
1~10% w/v의 수크로스
를 포함하는 수성 액체된 조성물이고,
조성물은 5 내지 8의 pH를 갖는, 조성물.
5. 실시형태 4에 있어서, 조성물은,
3~5 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
10~30 mM의 인산나트륨,
80~120 mM의 L-메티오닌 및
4~6%의 w/v의 수크로스
를 포함하는 수성 액체 조성물이고,
조성물은 6~7의 pH를 갖는, 조성물.
6. 실시형태 4에 있어서,
4 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
20 mM의 인산나트륨,
100 mM의 L-메티오닌 및
5% w/v의 수크로스
로 본질적으로 이루어지고,
조성물은 6.5의 pH를 갖는, 조성물.
7. 실시형태 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 0.005% w/v의 폴리소르베이트 80을 더 포함하는, 조성물.
8. 실시형태 4 내지 7 중 어느 하나의 수성 액체 조성물을 동결건조시킴으로써 얻어진 조성물.
9. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 수성 액체 조성물을 얻는 단계; 및
수성 액체 조성물을 동결건조시키는 단계
를 포함하는, 동결건조 조성물의 제조 방법.
10. 21.2 ㎎의 올리푸다제 알파,
9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
79 ㎎의 L-메티오닌 및
265 ㎎의 수크로스
로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 함유하는, 바이알.
11. 5.1 ㎖의 멸균수 중에,
21.2 ㎎의 올리푸다제 알파,
9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
79 ㎎의 L-메티오닌 및
265 ㎎의 수크로스
로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 재구성함으로써 얻어진 수성 액체 조성물.
12. 4.8 ㎎의 올리푸다제 알파,
2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
17.9 ㎎의 L-메티오닌 및
60 ㎎의 수크로스
로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 함유하는, 바이알.
13. 1.1 ㎖의 멸균수 중에,
4.8 ㎎의 올리푸다제 알파,
2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
17.9 ㎎의 L-메티오닌 및
60 ㎎의 수크로스
로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 재구성함으로써 얻어진 수성 액체 조성물.
14. 실시형태 10 또는 12의 바이알 및 동결건조 조성물을 재구성하기 위한 멸균수, 0.9% 염화나트륨 또는 인산염 완충 식염수를 함유하는 바이알을 포함하는, 제조 물품.
15. 인간 환자에서 산 스핑고미엘린분해효소 결핍증(ASMD)의 치료 방법으로서, 환자에게 실시형태 1 내지 8, 11 및 13 중 어느 하나의 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 조성물은 동결건조 조성물인 경우 투여 전에 액체 형태로 재구성되는, 치료 방법.
16. 인간 환자에서 ASMD를 치료하는 데 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 8, 11 및 13 중 어느 하나의 조성물.
17. 인간 환자에서 ASMD를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 실시형태 1 내지 8, 11 및 13 중 어느 하나의 조성물의 용도.
18. 실시형태 15의 방법, 실시형태 16의 사용하기 위한 조성물 또는 실시형태 17의 용도로서, ASMD는 A/B형 또는 B형 니만-피크병인, 방법, 조성물 또는 용도.
19. 실시형태 18에 있어서, ASMD의 비신경학적 징후를 위한 것인, 방법, 조성물 및 용도.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 이의 전문이 참조에 의해 포함된다. 여러 문헌이 본 명세서에 인용되지만, 상기 인용은 임의의 이들 문헌이 당업계의 공통적인 일반 지식을 형성한다는 용인을 구성하지 않는다. 본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 기술되지만, 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화에 관해 사용되는 명명법 및 그 기법은 당분야에 널리 알려지고 통상적으로 사용되는 것이다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 일반적으로 성취되는 바와 같거나 본 명세서에 설명된 바와 같이 제조사의 명세서에 따라 수행된다. 나아가, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 명세서 및 실시형태 전반에 걸쳐, 단어 "가지다" 및 "포함하다", 또는 "갖다", "가지고 있는", "포함한다", 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 정수군을 배제하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명이 더 잘 이해되도록 하기 위해, 하기 실시예를 나타낸다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 재조합 인간 산 스핑고미엘린분해효소 제형
본 실시예는 다양한 올리푸다제 알파 수성 액체 및 동결건조 조성물의 안정성을 평가한 연구를 기재한다.
물질 및 방법
용액 탁도
용액 혼탁도(opalescence)를 분광 탁도 검정으로 평가하였다. 340 내지 360 ㎚ 범위에서의 광학 밀도를 사용하여 특정 NTU 값에서 유럽 약전 참조 현탁액에 기초한 혼탁도의 이미 확립된 카테고리에 대한 범위를 설정하였다. SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 분광광도계(Microplate Spectrophotometer)(몰레큘러 디바이스즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재))에서 분석을 수행하였다.
응집
SEC로 응집 및 이량체 분석을 수행하였다. HPLC 바이알에 로딩하기 전에, 5회의 약한 피펫 주기로 각각의 샘플을 혼합하였다. TSK 겔 G3000SWXL(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 일본 도쿄 소재) 분석 칼럼 및 매칭 가드 칼럼이 장치된 1100/1200 시리즈 HPLC(애질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에서 SEC 분석을 수행하였다. 사용된 이동상은 35분 동안 0.5 ㎖ 분-1의 유량으로 설정된 pH 6의 20 mM의 인산나트륨, 200 mM 염화나트륨이었다. 대략 80 ㎍의 3회 주입을 각각의 샘플에 대해서 수행하였다. 280 ㎚에서 UV 흡광도에 의해서 검출을 수행하였다.
올리푸다제 알파 관련 고분자량종(HMWS)의 수준을 비환원 조건 하에서의 SDS-PAGE, 그 다음 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로의 염색을 사용하여 결정하였다. 올리푸다제 알파 참조 표준품이 각각의 겔에 포함되어 있다. 올리푸다제 알파 샘플을 샘플 완충액과 혼합하고, 분자량 마커와 함께 4~20%의 Tris-Glycine 구배 겔에 로딩하였다. 대략 2시간 동안 125V의 목표에서의 전기영동 후에, 겔을 쿠마시 블루로 염색하고, 메탄올, 아세트산 HPLC 등급 물 중에서 탈색시켰다.  농도계 분석(densitometric analysis)을 수행하여 관찰된 모든 밴드에 대한 HMWS 밴드의 백분율에 대한 정량적인 결과를 제공하였다.
효소 활성도
rhASM 샘플을 1.2 ㎖ 라이브러리 튜브에서 2000:1로 희석시켰다. rhASM에 의해서 촉매된 37℃에서의 2-(N-헥사데카노일아미노)-4-니트로페닐포스포릴콜린(HDA-PC)의 가수분해 속도를 본 절차에서 측정하였다. 방출된 발색단을 SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 415 ㎚에서의 흡광도에 의해서 측정하였다. rhASM 활성도 1 단위는, 명시된 검정 조건 하에서 HDA-PC로부터 분당 1μ㏖의 2-(N-헥사데카노일아미노)-4-니트로페놀을 생성시키는 효소의 양으로서 정의된다.
단백질 농도
rhASM 샘플의 단백질 농도를 280 ㎚에서의 흡광도에 의해서 결정하였다. 샘플을 매칭 완충액을 사용하여 1:10 및 1:20으로 반복하여 희석시켰다. SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 분광광도계에서 280 ㎚에서의 흡광도를 결정하였다.
pH
샘플 pH 분석을 Thermo Electron Microprobe pH 측정기(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 매사추세츠주 베버리 소재)에서 수행하였다. Thermo Orion 8203BN PerHecT 로스 세미 마이크로 글래스 프로브(Ross Semi micro glass probe)(써모 사이언티픽)를 사용하였다.
시차 주사 열량측정법
CAP-VP-DSC 마이크로칼로리미터(microcalorimeter)(마이크로칼-지이 헬쓰케어(Microcal-GE Healthcare), 미국 매사추세츠주 노샘프톤 소재)를 사용하여 시차 주사 열량계(differential scanning calorimeter: DSC) 분석을 수행하였다. 샘플을 매칭 완충액을 사용하여 0.4 ㎎/㎖로 희석시켰다. 샘플을 15에서부터 100℃까지 200℃/시간의 스캔 속도로 이동시켰다. DSC 분석 애드-온(마이크로칼-지이 헬쓰케어)이 장치된 Origin 7.0(오리진랩 코프.(OriginLab Corp.), 미국 매사추세츠주 노샘프톤 소재)에서 데이터 분석을 수행하였다.
결과
완충액 및 pH 평가
다양한 완충액 pH 및 완충액 종을 rhASM 안정성에 대한 이의 효과에 대해서 평가하였다. 20 mM 완충액 중에서 4 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파를 30℃에서 2주 동안 인큐베이션시키고, 효소의 물리적 안정성 및 기능 안정성을 평가함으로써 검정을 수행하였다(도 1A 내지 도 1C).
pH 6.0 미만에서 올리푸다제 알파의 물리적 및 기능성 둘 다에서 상당한 불안정성이 관찰되었다. pH 6.0 미만에서 효소 활성도가 급격히 감소하였지만 pH 6.0 이상에서는 비교적 일정하게 유지되었다(도 1A). 응집 경향은 pH 5.5 내지 6.5에서 최소였다. pH 5.5 미만에서 신속한 응집 증가가 관찰되었고, pH 6.5 초과에서 응집의 점진적인 증가가 관찰되었다(도 1B). 대등한 pH 값에서, 안정성은 시트르산염/인산염 완충액에 비해서 인산염 완충액에서 더 높았다. 이러한 안정성 경향은 냉장 온도에 저장된 샘플로부터 얻은 데이터와 일관되었다. pH 6.5 초과에서 관찰된 점진적으로 증가하는 응집 속도는, 인산염 완충액에서 더 높은 pH에서 감소된 열적 안정성을 나타낸 DSC 분석으로 입증되었다(도 1C). 이러한 데이터에 기초하여, 약 6.5의 pH를 갖는 인산나트륨 완충액은 rhASM 제형에 적합한 완충 시스템으로서 식별되었다.
다음으로, 인산나트륨 농도를 10 mM에서 100 mM까지 변화시킴으로써 이온 강도 또는 완충액 농도 또는 안정성의 효과를 조사하였다. 도 2A 및 도 2B에 도시된 바와 같이, 낮은 완충액 농도(10 mM, 20 mM 또는 50 mM)에서 이온 강도는 올리푸다제 알파의 효소 활성도 및 물리적 안정성에 거의 효과가 없다. 인산나트륨, pH 6.5에서 올리푸다제 알파의 안정성은 50 mM 이하의 완충액 농도에 대해서 비교적 일관적이었다. 그러나, 인산나트륨의 농도가 100 mM로 증가할 때 안정성이 상당히 감소되었다. 이러한 농도는 응집물 종의 신속한 증가 및 동반된 활성도 감소를 야기하였다(도 2A 및 도 2B). 30℃에서의 데이터는, 냉장 조건 하에서 올리푸다제 알파의 저장 동안 관찰된 데이터와 일관되었다. 낮지만 여전히 충분한 완충 능력을 보장하는 20 mM의 인산나트륨 농도를 완충액 농도로 선택하였다.
부형제 평가
다양한 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 액체 및 동결건조 조성물에서 올리푸다제 알파의 안정성에 대한 영향에 대해서 평가하였다. 액체 안정성에 대한 우선적 제외 메커니즘을 통해 작용하는 공지된 안정화제의 영향을 먼저 조사하였다(예를 들어, Timasheff, Proc Nat Acad Sci USA. 99: 9721-9726 (2002); 및 Lee et al., J. Biol. Chem. 256:7193~7201 (1981)]). 수크로스, 트레할로스 및 프로필렌 글리콜을 20 mM의 인산나트륨, 0.005% PS80, pH 6.5의 베이스 제형에 첨가하고, 4 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파의 효소 활성도 및 물리적 안정성에 대한 이의 영향을 평가하였다. 데이터는, 이러한 우선적 제외 안정화제 중 임의의 것의 존재가 5℃ 또는 30℃에서 액체 상태에서 올리푸다제 알파의 안정성을 향상시키지 않았다는 것을 나타내었다(데이터 나타내지 않음). 연구된 모든 조건 하에서 효소 활성도 및 물리적 안정성의 손실이 존재하였지만, 수크로스가 트레할로스 및 프로필렌 글리콜보다 약간 더 바람직해 보였다.
다음으로, 동결-건조 동안 올리푸다제 알파의 안정성에 대한 수크로스 및 트레할로스의 영향을 조사하였다. 만니톨을 또한 조사하였는데, 그 이유는 그것이 동결-건조 시에 일반적으로 사용되는 벌킹제(bulking agent)이기 때문이다(도 3A 및 도 3B). 3종의 폴리올을 액체 조성물 중에 5% w/v로 포함시켰고, 그 다음 동결건조시켰다. 도 3A의 데이터는, 만니톨의 첨가가 동결-건조 후 올리푸다제 알파의 효소 활성도를 감소시켰음을 나타낸다. 도 3B의 데이터는, 만니톨의 첨가가 동결-건조 후 단백질 응집을 상당히 증가시켰음을 나타낸다. 수크로스 및 트레할로스의 존재 하에서 응집의 증가가 최소였다. 수크로스를 액체 조성물 중의 5% w/v의 농도에서 동결보호제(cryoprotectant)로서 선택하였고, 이어서 이것을 동결건조시킬 수 있다.
만니톨의 존재 하에서 시간에 따른 동결건조된 올리푸다제 알파 제형의 안정성을 또한 조사하였다. 올리푸다제 알파를 20 mM의 인산나트륨 완충액(pH 6.5), 0.005%의 PS80 및 (i) 5% w/v의 만니톨, (ii) 5% w/v의 수크로스 또는 (iii) 3%의 만니톨 및 2%의 수크로스를 함유하는 액체 조성물로부터 동결-건조시켰다. 데이터는, 만니톨이 단독으로 사용되는 경우 동결-건조 동안 단백질 응집을 즉시 그리고 연속적으로 증가시키지만, 또한 6개월 지속기간 동안 수크로스와 조합하여 사용될 경우에는 단백질 응집을 증가시키지 않음을 나타낸다(도 3B 및 도 4B). 6개월에 효소 활성도는 또한 만니톨의 부재 하에서보다 만니톨의 존재 하에서 더 낮았다(도 4B). 따라서, 만니톨은 동결건조된 rhASM 제형에 적합하지 않은 벌킹제인 것으로 생각되었다.
만니톨이 동결-건조 동안 rhASM 안정성에 유해한 것으로 증명되었기 때문에, 메티오닌을 잠재적인 벌킹제로서 평가하였다. L-메티오닌의 존재 하에서 올리푸다제 알파의 액체 저장 동안 효소 활성도 및 물리적 안정성을 평가하였고, 100 mM의 L-메티오닌의 첨가는 5℃에서 올리푸다제 알파의 액체 안정성을 개선시키지도 않았고 부정적으로 영향을 미치지도 않았음을 발견하였다. 도 5A 및 도 5B에 도시된 바와 같이, 100 mM의 L-메티오닌을 함유하는 액체 조성물로부터 제조된 동결건조 조성물은 올리푸다제 알파에서 안정적인 동결건조된 구성을 야기하였다. 5℃에서 6개월의 저장 기간에 걸쳐서 활성도 또는 응집에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 추가로, 메티오닌 및 수크로스의 존재 하에서 올리푸다제 알파를 동결-건조시킴으로써 얻어진 케이크는 수크로스 단독과 함께 동결건조된 것보다 개선된 외관을 가졌다.
20 mM의 인산나트륨(pH 6.5), 5% w/v의 수크로스 및 증가하는 양의 L-메티오닌을 함유하는 액체 조성물로부터 동결건조된 올리푸다제 알파 케이크의 X-선 회절(XRD)에 의해서 동결건조를 위한 적절한 양의 메티오닌의 식별을 수행하였다(데이터 나타내지 않음). 메티오닌을 함유하지 않은 샘플은 완전히 비정질이었다. 33 mM의 메티오닌을 함유하는 샘플 그리고 추가로 66 mM 및 100 mM의 메티오닌을 함유하는 샘플에서 결정화의 약간의 증거가 존재하였다. 100 mM 미만(예를 들어, 10 mM 및 33 mM)의 메티오닌 수준에서 올리푸다제 알파의 동결건조는 움푹 들어가고 붕괴되어(쪼그라든) 보이는 바이알을 야기하였다. 따라서, 100 mM의 메티오닌을 동결건조된 rhASM 제형을 위한 벌킹제로서 선택하였다.
실시예 2: 올리푸다제 알파 조성물의 강인성
올리푸다제 알파, 수크로스 및 L-메티오닌을 함유하는 조성물의 강인성을 평가하기 위해서, 이들 성분 각각을 20 mM의 인산나트륨 완충액 중에서 대조군에 대해서 다음의 상이한 5가지의 수준으로 설정하였다 - 낮음, 약간 낮음, 중간(대조군), 약간 높음 및 높음(표 1).
Figure pct00004
총 26종의 제형 변형을 생성시켰다(표 2). 제형 2 및 제형 7은 대조군 제형 또는 중간 지점을 나타낸다. 나머지 24종의 제형 변형은 중간 지점 주변의 다양한 조건을 나타낸다. 26종의 변형 모두를 2 내지 8℃(24주 또는 최대 12개월) 및 25℃(16주)에 저장하여 안정성을 모니터링하였다.
Figure pct00005
시험 지속기간의 마지막에, 하기 파라미터는 조성물의 안정성을 나타낼 것이다: (1) 투명한 무색 외관; (2) pH 6.0~7.0; (3) 3.0% 이하의 응집물; (4) 3.5~4.5 ㎎/㎖의 단백질; (5) 15% 이하의 HMWS; 및 (6) 11~42 U/㎎의 비활성도. 도 6 내지 도 8은, 2~8℃에서 24주 저장한 후 26종의 제형 변형에서 각각 이량체 %, 비활성도 및 HMWS %에 대한 상이한 인자의 효과를 나타낸다. 데이터는, 이러한 변형 중에서 이량체 %, 비활성도 또는 HMWS %와 관련하여 어떠한 유의미한 차이도 존재하지 않았고, 따라서 2종의 대조군 제형과 함께 24종의 변형 모두는 24주 동안 2~8℃에서 안정적이었다는 것을 나타낸다.
36주에 걸쳐서 일부 변형에 대해서 이량체 % 및 비활성도에 대한 pH 및 성분 농도의 변화의 유의미한 효과의 결여가 또한 관찰되었다. 도 9는, 변형 모두가 36주에 대등한 응집을 갖는다는 것을 나타낸다.
25℃의 가속 온도에서, 또한 시험된 범위에서 16주에 걸쳐서 안정성에 대해서 부형제의 효과가 거의 없었다. 상이한 pH를 사용한 변형에서 가장 두드러진 효과가 관찰되었다(도 10). 더 높은 pH(6.8 내지 7.0)에서 올리푸다제 알파에 대해서 더 큰 안정성이 존재하였고, 더 낮은 pH(6.5 이하)에서 더 많은 응집 및 이량체가 존재하였다.
본 연구는 2~8℃에서 변형 제형이 선택된 성분 범위에서 강인하고, 안정적이었다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Genzyme Corporation <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING ACID SPHINGOMYELINASE DEFICIENCY <130> 022548.WO048 <150> 62/676,525 <151> 2018-05-25 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 627 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp 20 25 30 Met Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser Asp Ser 35 40 45 Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro Gln Gly 50 55 60 His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp Val Phe 65 70 75 80 Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe Thr Ala 85 90 95 Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val Gly Ser 100 105 110 Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro Ala Val 115 120 125 Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu Val Trp 130 135 140 Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu Leu Gly 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355 360 365 Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe Cys Ser 370 375 380 Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala Gly Gln 385 390 395 400 Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg Gly Asp 405 410 415 Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu Lys Ser 420 425 430 Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn Thr Leu 435 440 445 Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu Val Phe 450 455 460 Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe Leu Ala 465 470 475 480 Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg Val Tyr 485 490 495 Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val Val Leu Asp His 500 505 510 Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly Ala Ile 515 520 525 Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly Leu Pro 530 535 540 Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met Arg Gly 545 550 555 560 Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys Gly His 565 570 575 Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr Leu Cys 580 585 590 Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg His Leu 595 600 605 Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro Arg Pro 610 615 620 Leu Phe Cys 625 <210> 2 <211> 570 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Pro Leu Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile 20 25 30 Cys Lys Gly Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro 35 40 45 Asn Val Ala Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu 50 55 60 Lys Ile Ala Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu 65 70 75 80 Asp Asp Met Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu 85 90 95 Ala Cys Gly Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe 100 105 110 Ser Ser Trp Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Pro Ser Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe 130 135 140 Leu Thr Asp Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro 145 150 155 160 Asp Cys Ala Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro 165 170 175 Ala Ser Arg Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp 180 185 190 Leu Pro Leu Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala 195 200 205 Gly Pro Phe Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp 210 215 220 Val Trp His Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Ala Leu Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala 245 250 255 Val Gly Asn His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe 260 265 270 Ile Glu Gly Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys 275 280 285 Ala Trp Glu Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile 290 295 300 Gly Gly Phe Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser 305 310 315 320 Leu Asn Met Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn 325 330 335 Ser Thr Asp Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln 340 345 350 Ala Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro 355 360 365 Pro Gly His Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val 370 375 380 Ala Arg Tyr Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His 385 390 395 400 Val Asp Glu Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro 405 410 415 Leu Ala Val Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu 420 425 430 Asn Pro Gly Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser 435 440 445 Ser His Val Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln 450 455 460 Ala Asn Ile Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala 465 470 475 480 Arg Glu Thr Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn 485 490 495 Leu Val Tyr Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp 500 505 510 Phe Leu Tyr His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro 515 520 525 Cys Arg Leu Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser 530 535 540 Pro Ala Leu Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala 545 550 555 560 Gln Ser Leu Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys 565 570 <210> 3 <211> 629 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp 20 25 30 Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser 35 40 45 Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro 50 55 60 Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp 65 70 75 80 Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe 85 90 95 Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val 100 105 110 Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro 115 120 125 Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140 Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu 145 150 155 160 Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile 165 170 175 Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His 195 200 205 Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro 210 215 220 Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly 225 230 235 240 Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr 245 250 255 Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270 Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr 275 280 285 Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg 290 295 300 Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu 305 310 315 320 Ser Ile Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His 325 330 335 Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp 340 345 350 Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365 Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe 370 375 380 Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala 385 390 395 400 Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg 405 410 415 Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu 420 425 430 Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn 435 440 445 Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu 450 455 460 Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe 465 470 475 480 Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg 485 490 495 Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser Ser His Val Val Leu 500 505 510 Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly 515 520 525 Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly 530 535 540 Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met 545 550 555 560 Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys 565 570 575 Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr 580 585 590 Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg 595 600 605 His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro 610 615 620 Arg Pro Leu Phe Cys 625 <210> 4 <211> 570 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Pro Leu Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile 20 25 30 Cys Lys Gly Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro 35 40 45 Asn Val Ala Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu 50 55 60 Lys Ile Ala Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu 65 70 75 80 Asp Asp Met Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu 85 90 95 Ala Cys Gly Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe 100 105 110 Ser Ser Trp Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Pro Ser Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe 130 135 140 Leu Thr Asp Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro 145 150 155 160 Asp Cys Ala Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro 165 170 175 Ala Ser Arg Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp 180 185 190 Leu Pro Leu Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala 195 200 205 Gly Pro Phe Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp 210 215 220 Val Trp His Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Ala Leu Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala 245 250 255 Val Gly Asn His Glu Ser Ile Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe 260 265 270 Ile Glu Gly Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys 275 280 285 Ala Trp Glu Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile 290 295 300 Gly Gly Phe Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser 305 310 315 320 Leu Asn Met Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn 325 330 335 Ser Thr Asp Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln 340 345 350 Ala Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro 355 360 365 Pro Gly His Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val 370 375 380 Ala Arg Tyr Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His 385 390 395 400 Val Asp Glu Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro 405 410 415 Leu Ala Val Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu 420 425 430 Asn Pro Gly Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Arg Ser 435 440 445 Ser His Val Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln 450 455 460 Ala Asn Ile Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala 465 470 475 480 Arg Glu Thr Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn 485 490 495 Leu Val Tyr Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp 500 505 510 Phe Leu Tyr His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro 515 520 525 Cys Arg Leu Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser 530 535 540 Pro Ala Leu Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala 545 550 555 560 Gln Ser Leu Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys 565 570 <210> 5 <211> 629 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Arg Gln Ser Cys Pro Arg Ser Gly 1 5 10 15 Arg Glu Gln Gly Gln Asp Gly Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu Leu Trp 20 25 30 Met Gly Leu Val Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ser 35 40 45 Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu Ser Pro 50 55 60 Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu Arg Asp 65 70 75 80 Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly Leu Phe 85 90 95 Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala Arg Val 100 105 110 Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Pro Pro 115 120 125 Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met Val Glu 130 135 140 Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly Leu Leu 145 150 155 160 Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp Asn Ile 165 170 175 Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro 180 185 190 Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp Leu His 195 200 205 Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala Asp Pro 210 215 220 Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg Pro Gly 225 230 235 240 Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu Arg Thr 245 250 255 Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 260 265 270 Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His Gln Thr 275 280 285 Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu Val Arg 290 295 300 Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn His Glu 305 310 315 320 Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn His 325 330 335 Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu Pro Trp 340 345 350 Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe Tyr Ala 355 360 365 Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met Asn Phe 370 375 380 Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp Pro Ala 385 390 395 400 Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu Asp Arg 405 410 415 Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His Cys Leu 420 425 430 Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr Glu Asn 435 440 445 Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu Phe Glu 450 455 460 Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val Ala Phe 465 470 475 480 Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly Tyr Arg 485 490 495 Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val Val Leu 500 505 510 Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile Pro Gly 515 520 525 Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr Tyr Gly 530 535 540 Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr Arg Met 545 550 555 560 Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr His Lys 565 570 575 Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu Ala Thr 580 585 590 Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu Cys Arg 595 600 605 His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu Trp Pro 610 615 620 Arg Pro Leu Phe Cys 625 <210> 6 <211> 570 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His Pro Leu Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val 1 5 10 15 Pro Arg Leu Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile 20 25 30 Cys Lys Gly Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro 35 40 45 Asn Val Ala Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu 50 55 60 Lys Ile Ala Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu 65 70 75 80 Asp Asp Met Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu 85 90 95 Ala Cys Gly Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe 100 105 110 Ser Ser Trp Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Pro Ser Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe 130 135 140 Leu Thr Asp Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro 145 150 155 160 Asp Cys Ala Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro 165 170 175 Ala Ser Arg Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp 180 185 190 Leu Pro Leu Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala 195 200 205 Gly Pro Phe Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp 210 215 220 Val Trp His Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Ala Leu Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala 245 250 255 Val Gly Asn His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe 260 265 270 Ile Glu Gly Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys 275 280 285 Ala Trp Glu Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile 290 295 300 Gly Gly Phe Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser 305 310 315 320 Leu Asn Met Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn 325 330 335 Ser Thr Asp Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln 340 345 350 Ala Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro 355 360 365 Pro Gly His Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val 370 375 380 Ala Arg Tyr Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His 385 390 395 400 Val Asp Glu Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro 405 410 415 Leu Ala Val Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu 420 425 430 Asn Pro Gly Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser 435 440 445 Ser His Val Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln 450 455 460 Ala Asn Ile Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala 465 470 475 480 Arg Glu Thr Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn 485 490 495 Leu Val Tyr Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp 500 505 510 Phe Leu Tyr His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro 515 520 525 Cys Arg Leu Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser 530 535 540 Pro Ala Leu Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala 545 550 555 560 Gln Ser Leu Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys 565 570

Claims (19)

  1. 재조합 인간 산 스핑고미엘린분해효소(recombinant human acid sphingomyelinase), 인산나트륨, 메티오닌 및 수크로스를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은,
    4~7% w/w의 올리푸다제 알파(olipudase alfa)(서열번호 2),
    3~7% w/w의 인산나트륨,
    15~25% w/w의 L-메티오닌 및
    65~75% w/w의 수크로스
    를 포함하는 동결건조 조성물인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    5.5% w/w의 올리푸다제 알파,
    2.3% w/w의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
    2.6% w/w의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
    20.5% w/w의 L-메티오닌 및
    68.6% w/w의 수크로스
    로 본질적으로 이루어진, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은,
    1~10 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
    10~50 mM의 인산나트륨,
    70~150 mM의 L-메티오닌 및
    1~10% w/v의 수크로스
    를 포함하는 수성 액체 조성물이되,
    상기 조성물은 5 내지 8의 pH를 갖는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은,
    3~5 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
    10~30 mM의 인산나트륨,
    80~120 mM의 L-메티오닌 및
    4~6%의 w/v의 수크로스
    를 포함하는 수성 액체 조성물이되,
    상기 조성물은 6~7의 pH를 갖는, 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    4 ㎎/㎖의 올리푸다제 알파,
    20 mM의 인산나트륨,
    100 mM의 L-메티오닌 및
    5% w/v의 수크로스
    로 본질적으로 이루어지되,
    상기 조성물은 6.5의 pH를 갖는, 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 0.005% w/v의 폴리소르베이트 80을 더 포함하는, 조성물.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 수성 액체 조성물을 동결건조시킴으로써 얻어진, 조성물.
  9. 동결건조 조성물을 제조하는 방법으로서,
    제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 수성 액체 조성물을 얻는 단계 및
    수성 액체 조성물을 동결건조시키는 단계.
    를 포함하는, 방법.
  10. 바이알로서,
    21.2 ㎎의 올리푸다제 알파,
    9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
    10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
    79 ㎎의 L-메티오닌 및
    265 ㎎의 수크로스
    로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 함유하는, 바이알.
  11. 수성 액체 조성물로서,
    5.1 ㎖의 멸균수 중에,
    21.2 ㎎의 올리푸다제 알파,
    9.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
    10.0 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
    79 ㎎의 L-메티오닌 및
    265 ㎎의 수크로스
    로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 재구성함으로써 얻어진, 수성 액체 조성물.
  12. 바이알로서,
    4.8 ㎎의 올리푸다제 알파,
    2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
    2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
    17.9 ㎎의 L-메티오닌 및
    60 ㎎의 수크로스
    로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 함유하는, 바이알.
  13. 수성 액체 조성물로서,
    1.1 ㎖의 멸균수 중에,
    4.8 ㎎의 올리푸다제 알파,
    2.0 ㎎의 인산나트륨 이염기성 칠수화물,
    2.3 ㎎의 인산나트륨 일염기성 일수화물,
    17.9 ㎎의 L-메티오닌 및
    60 ㎎수크로스
    로 본질적으로 이루어진 동결건조 조성물을 재구성함으로써 얻어진, 수성 액체 조성물.
  14. 제10항 또는 제12항의 바이알, 및 동결건조 조성물을 재구성하기 위한 멸균수, 0.9%의 염화나트륨 또는 인산염 완충 식염수를 함유하는 바이알을 포함하는, 제조 물품.
  15. 인간 환자에서 산 스핑고미엘린분해효소 결핍증(acid sphingomyelinase deficiency: ASMD)을 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제8항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 동결건조 조성물인 경우 투여 전에 액체 형태로 재구성되는, 방법.
  16. 인간 환자에서 ASMD를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 조성물.
  17. 인간 환자에서 ASMD를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제8항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASMD는 A/B형 또는 B형 니만-피크병(Niemann-Pick Disease)인, 방법, 조성물 또는 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치료는 ASMD의 비-신경학적 징후를 위한 것인, 방법, 조성물 또는 용도.
KR1020207037328A 2018-05-25 2019-05-24 산 스핑고미엘린분해효소 결핍증을 치료하기 위한 약제학적 조성물 KR20210015903A (ko)

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