KR20210011713A - 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210011713A
KR20210011713A KR1020190088949A KR20190088949A KR20210011713A KR 20210011713 A KR20210011713 A KR 20210011713A KR 1020190088949 A KR1020190088949 A KR 1020190088949A KR 20190088949 A KR20190088949 A KR 20190088949A KR 20210011713 A KR20210011713 A KR 20210011713A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
piper
extract
retropractum
composition
periodontal disease
Prior art date
Application number
KR1020190088949A
Other languages
English (en)
Inventor
황재관
김창희
이재옥
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to KR1020190088949A priority Critical patent/KR20210011713A/ko
Publication of KR20210011713A publication Critical patent/KR20210011713A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/67—Piperaceae (Pepper family), e.g. Jamaican pepper or kava
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/453—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with oxygen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4973—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/312—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on dental health
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/30—Other Organic compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

본 발명은 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 이로부터 분리된 파이퍼노날린은 교원질 분해효소 및 골흡수효소의 생성을 억제함으로서 치주질환 및 구강 관리에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING, IMPROVING OR TREATING PERIODONTAL DISEASE COMPRISING PIPER RETROFRACTUM OR PIPERNONALINE}
본 발명은 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치주질환은 충치와 함께 가장 대표적으로 알려진 구강질환으로 (Narang R. et al., Bangladesh Journal of Medical Science, 2013, 12, 244-249), 임상적으로 치은의 염증 및 출혈, 치은 퇴축, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 인하여 치아의 소실을 야기한다 (Preshaw P. M. et al., Diabetologia, 2012, 55, 21-31). 구체적으로, 치주질환은 세균의 집락 형성 및 세균의 치주조직 침투, 치주조직의 파괴로 이루어지는 일련의 과정으로 진행된다. 먼저, 구강 내 타액에 존재하는 타액 단백질이 치아 표면에 흡착되면서 피막을 형성한다. 이러한 피막표면에 주로 스트렙토코커스 (Streptococcus)와 같은 그람 양성균이 성장하면서 프라그 (plaque)를 형성한다 (Taubman M. A. et al., Nature Reviews Immunology, 2006, 6, 555-563). 시간이 경과함에 따라, 프라그가 치근단 방향으로 이동함과 동시에 포피로모나스 (Porphyromonas)와 악티노바실러스 (Actinobacillus)와 같은 혐기성 그람 음성균이 성장하여, 이러한 세균, 세균 성분, 세균 산물들이 치은열구상피를 통해 치주조직 내로 침투하여 치주낭이 형성된다 (Wolf H. F. et al., Periodontology, Stuttgart, New York: Thieme, 2006). 최종적으로는 세균들의 세포벽 구성분인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide)이 면역계를 자극함으로 인해 분비된 활성산소, 프로스타글란딘 (prostaglandin), 류코트리엔 (leukotrien), 히스타민 (histamine), 인터루킨 (interleukin) 등의 사이토킨 (cytokine)에 의하여 잇몸 염증이 유발되고, 콜라게나제 (collagenase)와 같은 효소에 의해 치주조직의 기질인 콜라겐 (collagen)이 분해되어, 잇몸 퇴축 (retraction)이 일어난다. 이러한 과정이 계속 진행되게 되면 치조골 (alveolar bone)의 소실을 포함한 치주조직 전체의 파괴로 진행된다 (Madianos P. N. et al., J Clin Periodontol, 2005, 32, 57-71; Mayank H. et al., Journal of Oral Science, 2011, 53, 263-271).
치주질환의 치료요법으로 치주질환균을 사멸시키는 클로르헥시딘 (chlorhexidine), 상귀나린 (sanguinarine) 및 트리클로산 (triclosan)과 같은 항균제와 과산화수소와 같은 소염제가 치약, 양치액과 같은 구강제품에 적용되어 왔으나, 치주질환의 발생은 근본적으로 예방하지 못하고 있는 실정이다 (Leszczyʼnska A. et al., Advances in Medical Sciences, 2011, 56, 123-131). 치주질환은 미생물의 자극에 의한 염증 발생과 교원질 분해효소 (MMP; matrix metalloproteinase)에 의한 콜라겐의 감소 및 골의 소실 등이 복합적으로 동반되는 질환이기 때문에, 기존에 사용되어온 방법을 통해서는 치주질환을 효과적으로 예방하기에 어려움이 있다 (Craig S. M. et al., Biomark Med., 2010, 4, 171-189).
교원질 분해효소의 일종인 MMP-8은 치주조직의 주요 구성요소인 콜라겐 타입 1 (collagen type 1)과 콜라겐 타입 3 및 세포외 기질 (extracellular substances)을 분해하는 것으로 알려져 있다 (Gursoy U. K. et al., J Clin Periodontol., 2010, 37, 487-493; Adina B. B., et al., Annals of RSCB, 2012, 17, 251-257). MMP-8은 다른 교원질 분해효소들과는 달리 염증이 발생하는 치주조직에서 특이적으로 과발현이 되며, 타액에서 발견되는 MMP-8의 양을 통해 치주염 및 치주질환의 시작과 그 정도를 확인할 수 있다 (Gursoy U. K. et al., J Clin Periodontol., 2010, 37, 487-493; Sorsa T. et al., Annals of Medicine, 2006, 38, 306-321; Killi M. et al., J Clin Periodontol., 2002, 29, 224-232).
골흡수효소 (Osteoclastic Enzyme)의 일종인 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase)는 파골세포전구세포 (pre-osteoclast)가 파골세포 (osteoclast)로 분화 (differentiation)할 때, 특이적으로 발생하는 것으로 알려져 있다 (Zupan J. et al., Biochemia Mediea, 2013, 23, 43-63; Asagiri M. et al., Bone, 2007, 40, 251-264; Baud' huin M. et al., Cell Mol Life Sci., 2007, 64, 2334-2350). TRAP은 뼈 기질 (bone matrix)과 콜라겐의 흡수 및 분해에 관여하며, 파골세포의 분화, 다핵화, 성숙 및 활성화에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Wei W., Wan Y., PPAR Res., 2011, 867810; Matsuo K., Irie N., Arch Biochem Biophys., 2008, 473, 201-209; Lacey D. L. et al., Nat Rev Drug Discov., 2011, 11, 401-419; Wang X. et al., Curr Opin Biotechnol., 2012, 23, 570-578).
파이퍼 레트로프락텀 추출물과 관련하여, 지금까지 이의 항산화 (Jadid N. et al., AIP Conf Proc, 2017, 1854, 020019), 항광노화 (Yun J. et al., Evid Based Complement Alternat Med., 2018, 2018, 6172954), 항비만 (Kim K J. et al., Biochem Biophys Res Commun., 2011, 411, 219-225) 등의 활성이 보고되어 있다.
그러나, 본 발명 이전에는 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린의 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과에 관해서는 알려진 바 없었다.
본 발명은 부작용 없이 교원질 분해효소 및 골흡수효소 생성 억제 활성을 가짐으로써 치주질환을 예방, 개선 또는 치료 할 수 있는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 파이퍼 레트로프락텀 (Piper retrofractum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 파이퍼노날린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 파이퍼 레트로프락텀 (Piper retrofractum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 파이퍼노날린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 골 손실 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 천연물질을 개발하고자 노력한 결과, 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 이로부터 분리된 파이퍼노날린이 골형성 또는 골손실에 관여하는 유전자의 발현 및 활성을 억제함으로써 골 손실 질환 중에서 특히 치주질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 규명하였다.
본 발명의 조성물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 '파이퍼 레트로프락텀 (Piper retrofractum)'은 후추과(piperaceae family)에 속하며, 이의 아종, 변종을 포함함은 물론이다. 또한, 본 발명의 파이퍼 레트로프락텀은 당업계에서 자명하고 본 발명의 예방 및 치료 목적과 동일 또는 유사한 용도로 사용할 수 있는 동속생약을 포함한다.
본 명세서에서, '추출물'은 어떤 물질을 용매에 녹여 그 활성성분 또는 특성 성분을 분리한 것을 의미한다. 구체적으로 식물에 추출용매를 가하여 추출한 추출물 및 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획한 분획물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 파이퍼 레트로프락텀 추출물은 파이퍼 레트로프락텀에 용매를 가하여 추출한 추출물과 이에 다시 분획용매를 가하여 분획한 분획물을 모두 포함하는 의미이다.
상기 파이퍼 레트로프락텀 추출물은 파이퍼 레트로프락텀을 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매 또는 이들의 혼합물, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌 클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.
본 발명은, 상기 파이퍼 레트로프락텀 추출물의 추출방법 및 상기 추출방법으로부터 추출된 파이퍼 레트로프락텀 추출물을 포함한다.
파이퍼 레트로프락텀의 추출물을 제조하는 방법에는 특별한 제한은 없으며, 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 C1-C6의 알코올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산 및 석유에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 C1-C6의 유기용매 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있다. 이때, 추출용매는 파이퍼 레트로프락텀의 건조중량의 2~20배로 하는 것이 바람직하다. 일 예로, 파이퍼 레트로프락텀 열매 건조물을 분쇄한 후 추출용기에 넣은 다음 70% 에탄올을 넣고 60℃에서 4시간 교반시켜, 여과하여 에탄올 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 파이퍼 레트로프락텀 추출물은 건조시킨 파이퍼 레트로프락텀 열매를 초고압 추출 장치를 이용하여 추출, 정제하여 얻을 수 있거나, 파이퍼 레트로프락텀 열매를 직접 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 얻을 수도 있다. 필요한 경우, 이후에 당업자에게 공지된 방법에 따라, 여과, 농축 또는 동결건조 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 용매 분획, 실리카 겔 크로마토그라피 (silica gel chromatography), prep-HPLC 등의 공지된 기술을 이용하여, 활성물질이 농축된 특정 분획을 제조할 수 있다.
본 발명에서는 일 예로 파이퍼 레트로프락텀 열매의 건조 분말을 이용하여 파이퍼 레트로프락텀 열매 에탄올 추출물을 제조하였다 (실시예 1).
또한, 본 발명의 조성물은 유효성분으로 파이퍼노날린(pipernonaline)을 포함한다.
상기"파이퍼노날린(pipernonaline)"은 천연물로부터 추출 및 정제되거나, 합성된 화합물로서, 하기 화학식 1로 표시된다:
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 파이퍼노날린은 파이퍼 레트로프락텀으로부터 유래한 것일 수 있다. 이때, 상기 파이퍼 레트로프락텀 추출물에 용매를 가하여 층분리하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 파이퍼노날린의 분리 및 정제는 실리카겔 (silica gel)이나 활성 알루미나 (alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있으나, 추출 및 분리정제 방법이 반드시 상기 방법에 한정되는 것은 아니다.
일 예로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 파이퍼 레트로프락텀으로부터 분리하기 위한 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다.
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 (5.75 g)을 에틸아세테이트 (4.53 g)로 층분리 한 후 실리카겔을 충진한 컬럼에 적재하고, n-헥세인 및 에틸아세테이트를 2:1 (v/v)의 비율로 혼합한 용매로 분리하여 분리 순서에 따라 총 5개의 분획으로 분리하고, 상기 5개의 분획 중 5번째 분획 (0.24 g)을 다시 Rp-18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여, 80% 메탄올로 분리하여 분리 순서에 따라 총 4개의 분획으로 분리하고, 상기 4개 분획 중 4번째 분획 (0.077 g)을 prep-HPLC를 이용하여, 80% 메탄올로 분리하여 분리 순서에 따라 총 3개의 분획으로 분리하고, 상기 3개의 분획 3번째 분획 (0.027 g)을 농축 건조시켜 제조할 수 있다(실시예 2 참조).
본 발명의 파이퍼노날린은 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 수화물, 유도체 등을 포함할 수 있고, 이의 용매 화합물이나 입체 이성질체 또한 포함할 수 있다.
상기 파이퍼노날린의 수득방법은 특별히 한정되지 않으며, 공지된 제법을 사용하여 화학적으로 합성하거나 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 본 발명에 따른 유효성분인 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린이 인간 치주섬유아세포(HGF-1)에서 MMP-8을 비롯한 염증 표지자의 발현을 유의하게 억제하고, 파골 세포 분화와 관련된 마커를 감소시키며, 조골 세포 형성을 활성화시키는 능력이 우수한 것을 확인하였다.
따라서, 이러한 측면에서 본 발명의 조성물은 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물 일 수 있다.
본 발명에서, "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "개선" 또는 "치료"는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은, 치은 염증, 치조골 손실 또는 파괴로 인한 치주질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 치주질환은 흔히 풍치라고도 하며, 병의 정도에 따라 치은염 (gingivitis)과 치주염 (periodontitis)으로 나뉘며, 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다.
본 발명에서 치주질환은 이에 제한되는 것은 아니나, 치은염(gingivitis), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭 (periodontal pocket) 형성, 치조골(alveolar bone) 파괴와 같은 질환 또는 증상을 모두 포함하며, 이러한 질환으로 인해 자연적 회복이 어려운 다양한 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 파이퍼노날린 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “약학적으로 허용 가능한”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 또는 메탄술폰산을 포함한다. 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 또는 붕산을 포함한다. 산 부가염은 바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.
상기 언급된 산 부가염은 a) 파이퍼노날린을 직접 혼합하거나, b) 이를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시키고 혼합시키거나, 또는 c) 파이퍼노날린을 용매 또는 수하 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염 제조방법으로 제조된다.
위와는 별도로 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염 또는 아스파르트산염 등이 있다.
또한, 본 발명의 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제를 수득할 수 있다.
단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 '경피 투여'는 약학 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 유효량으로 포함 할 때 바람직한 치주질환 예방 및 치료 효과를 제공할 수 있다. 본 명세서에서, '유효량'이라 함은 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말한다. 본 발명의 약학 조성물에 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린이 0.01 내지 99.99% 포함될 수 있으며, 잔량은 약학적으로 허용 가능한 담체가 차지할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태 등에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 비경구 투여시는 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여시는 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.01 내지 10 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린의 용량은 약학 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 치주질환 예방 및 치료를 위한 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 단독으로 함유할 수 있다. 추가적인 성분을 포함하게 되면 본 발명의 조성물의 치주질환 치료 효과가 더욱 증진될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 약학 조성물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 유효성분으로 포함하는 외용제의 제형으로 제공할 수 있다.
본 발명의 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 치주질환 예방 및 치료용 약학 조성물이 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 치주질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 치주질환 예방 및 개선용이 식품 조성물인 경우, 치은 염증, 치조골의 손실 또는 파괴로 인한 치주질환의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket) 형성, 치조골(alveolar bone) 파괴와 같은 질환 또는 증상을 모두 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 파이퍼 레트로프락텀 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐, 타블렛, 환 등에 파이퍼 레트로프락텀 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 파이퍼 레트로프락텀 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용(건강음료)할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 파이퍼 레트로프락텀 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한, 파이퍼 레트로프락텀 추출물과 치주질환 예방 및 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 치주질환 예방 및 개선용 조성물이 건강음료 조성물로 이용되는 경우, 상기 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.
파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린은 치주질환 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 치주질환 예방 또는 개선용 작용을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물과 함께 치주질환 예방 또는 개선용 조성물에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 치주질환 예방 또는 개선을 목적으로 사료첨가제 또는 사료 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "사료첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 A D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "사료"는, 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 본 발명에 따른 치주질환 예방 또는 개선용 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계에 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 바람직하게는 농후 사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류가 있으나 이에 제한되지 않는다.
조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 특수사료에는 굴껍데기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제가 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 첨가하여 제조 가능하다.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 치주질환의 개선을 목적으로 하는 개체이면 제한 없이 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 개체에도 적용이 가능하다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 치주질환 예방 또는 개선용 조성물은 또한 구강 관리용 조성물일 수 있다. 본 발명의 구강 관리용 조성물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린을 유효성분으로 함유한다.
본 발명의 구강 관리 조성물을 포함하는 구강 관리 제품에는 치약, 양치액, 마우스 스프레이, 식이성 필름 등의 형태가 모두 포함되며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 대상으로 하는 제품을 포함한다. 상기 유형의 구강 관리 제품은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 구강 관리 조성물에 함유되는 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5중량%인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 파이퍼노날린은 교원질 분해효소 및 골흡수효소의 생성을 억제시키는데 우수한 효과를 나타내므로, 치주질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있고, 구강 관리에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 천연물이므로 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있어 의약품, 의약외품 또는 식품 소재로 사용될 수 있다.
도 1은 치은세포인 HGF에서 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물의 처리에 따른 교원질 분해효소 MMP-8의 mRNA 발현량 감소 결과를 보여준다.
도 2는 치은세포인 HGF에서 파이퍼노날린에 의한 MMP-8의 mRNA 발현량 감소결과를 보여준다.
도 3은 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물에 의한 골흡수효소인 TRAP의 mRNA 발현량 감소 결과를 보여준다.
도 4는 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 파이퍼노날린에 의한 TRAP mRNA 발현량의 감소 결과를 보여준다.
도 5는 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 파이퍼노날린이 TRAP활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6는 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 파이퍼노날린이 파골세포 분화에 미치는 영향을 현미경 분석을 통해 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물의 제조
건조시킨 파이퍼 레트로프락텀 열매를 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 파이퍼 레트로프락텀 시료 100 g을 70% 에탄올 1 L에 넣고 60℃에서 4시간 교반하면서 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (whatman) 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거함으로써 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물을 얻었다.
[실시예 2]
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물로부터 파이퍼노날린의 분리
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 (5.75 g)을 에틸아세테이트 (4.53 g)로 층분리 한 후 실리카겔을 충진한 컬럼에 적재하고, n-헥세인 및 에틸아세테이트를 2:1 (v/v)의 비율로 혼합한 용매로 분리하여 분리 순서에 따라 총 5개의 분획으로 분리하고, 상기 5개의 분획 중 5번째 분획 (0.24 g)을 다시 Rp-18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여, 80% 메탄올로 분리하여 분리 순서에 따라 총 4개의 분획으로 분리하고, 상기 4개 분획 중 4번째 분획 (0.077 g)을 prep-HPLC를 이용하여, 80% 메탄올로 분리하여 분리 순서에 따라 총 3개의 분획으로 분리하고, 상기 3개의 분획 3번째 분획 (0.027 g)을 농축 건조시켜 제조하였다.
[실험예 1]
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물의 교원질 분해효소 생성억제 효과 확인
HGF 치은세포 (ATCC; Manassas, VA, USA) 를 10%의 송아지 혈청이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 후, 6-웰 평판배양기 (6-well microtiter plate)에 1,00,000 세포/웰 (well)이 되도록 넣었다. 90%까지 자란 후, 1 μg/ml 농도의 리포폴리사카라이드가 들어있는 배양액에서 1일간 처리하였다. 이후 배양액에 녹여진 실시예 1의 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물을 1 μg/ml 및 10 μg/ml의 농도로 각각 치은세포에 처리하였다. 1일 경과 후, 교원질 분해효소인 MMP-8의 발현 양상을 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 측정하였다. GAPDH로 mRNA 양이 일정함을 나타내었다.
그 결과, [도 1]에 나타낸 바와 같이 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물이 HGF 치은세포에서 MMP-8 mRNA의 생성을 크게 억제시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
파이퍼노날린의 교원질 분해효소 생성억제 효과 확인
실시예 2에서 분리한 파이퍼노날린을 1 μM 및 10 μM 농도로 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 치은세포에 처리하였다.
그 결과, [도 2]에 나타낸 바와 같이 파이퍼노날린이 HGF 치은세포에서 MMP-8 mRNA의 생성을 크게 억제시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 3]
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물의 골흡수효소 생성억제 효과 확인
Raw 264.7 세포 (ATCC; Manassas, VA, USA)를 10%의 송아지 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후, 6-웰 평판배양기에 160,000 세포/웰이 되도록 넣었다. 90%까지 자란 후, 100 ng/ml 농도의 핵산인자-κB 리간드 수용체 촉진제 (receptor activator of NF-κB ligand)가 들어있는 배양액에서 4일간 처리하였다. 이후 배양액에 녹여진 실시예 1의 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물을 1 μg/ml 및 10 μg/ml의 농도로 각각 Raw 264.7 세포에 처리하였다. 1일 경과 후, 골흡수효소인 TRAP의 발현 양상을 역전사 중합효소 연쇄반응 방법을 이용하여 측정하였다. β-Actin으로 mRNA 양이 일정함을 나타내었다.
그 결과, [도 3]에 나타낸 바와 같이 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물이 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 골흡수효소 TRAP mRNA 발현을 매우 억제시킴을 확인할 수 있었다.
[실험예 4]
파이퍼노날린의 골흡수효소 생성억제 효과 확인
실시예 2에서 분리된 파이퍼노날린을 1 μM 및 10 μM의 농도로 각각 상기 실험예 3에서와 동일한 방법으로 Raw 264.7 세포에 처리하였다.
그 결과, [도 4]에 나타낸 바와 같이 파이퍼노날린이 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 골흡수효소 TRAP mRNA 발현을 매우 억제시킴을 확인할 수 있었다.
[실험예 5]
파이퍼노날린의 골흡수효소 활성억제 효과 확인
실시예 2에서 분리된 파이퍼노날린을 1 μM 및 10 μM의 농도로 각각 상기 실험예 3에서와 동일한 방법으로 Raw 264.7 세포에 처리하였다. 그 후 상등액을 모두 제거한 뒤, 0.1% Triton X-100 (Oriental chemical industries, Seoul, Korea)으로 세포들을 용해시켰다. 완층용액에 용해된 세포를 1.5 ml 튜브로 옮겨 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하고, 상등액만을 취하였다. TRAP을 포함하는 이 상등액은 백혈구 산성 인산화효소 키트 (Leukocyte acid phosphatase kit, Sigma-Aldrich, St. Loius, MO, USA)를 이용하여 제조사의 가이드라인에 따라 분석하였다.
그 결과, [도 5]에 나타낸 바와 같이 파이퍼노날린이 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 골흡수효소 TRAP의 활성을 매우 억제시킴을 확인할 수 있었다 (##p < 0.01, **p < 0.01).
[실험예 6]
염색을 통한 파이퍼노날린의 파골세포 분화억제 효과 확인
실시예 2에서 분리된 파이퍼노날린을 1 μM 및 10 μM의 농도로 각각 상기 실험예 3에서와 동일한 방법으로 Raw 264.7 세포에 처리하였다. 그 후 상등액을 모두 제거한 뒤, 2% 포름알데히드 (Junsei chemical, Tokyo, Japan)으로 세포들을 고정하였다. 그 후 백혈수 산성 인산화효소 키트 (Leukocyte acid phosphatase kit, Sigma-Aldrich)의 제조사의 가이드라인에 따라 TRAP 염색을 진행하였다.
그 결과, [도 6]에 나타낸 바와 같이 파이퍼노날린이 파골세포 분화과정을 거친 Raw 264.7 세포에서 파골세포 분화를 매우 억제시킴을 확인할 수 있었다.
제조예 1: 식품 제조
제조예 1-1: 건강식품
실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 1000 mg, 비타민 A 아세테이트 70 μg, 비타민 E 1.0 mg, 비타민 B1 0.13 mg, 비타민 B2 0.15 mg, 비타민 B6 0.5 mg, 비타민 B12 0.2 μg, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 μg, 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 μg, 판토텐산 칼슘 0.5 mg, 황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg을 혼합하고, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 형성하여 건강식품을 제조하였다. 상기에서, 배합비는 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제조예 1-2: 건강음료
실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 1000 mg, 구연산 1000 mg, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g에 정제수를 가한 후 (총 900 ml), 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열시킨 후, 제조된 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 후 냉장 보관하여 건강음료를 제조하였다. 상기에서, 배합비는 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제조예 1-3: 츄잉껌
껌 베이스 20중량%, 설탕 76.9중량%, 향료 1중량%, 및 물 2중량%와 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.
제조예 1-4: 캔디
설탕 60중량%, 물엿 39.8중량%, 및 향료 0.1중량%와 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 0.1중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.
제조예 1-5: 비스켓
박력 1급 25.59중량%, 중력 1급 22.22중량%, 정백당 4.80중량%, 식염 0.73중량%, 포도당 0.78중량%, 팜쇼트닝 11.78중량%, 암모늄 1.54중량%, 중조 0.17중량%, 중아황산나트륨 0.16중량%, 쌀가루 1.45중량%, 비타민 B 0.0001중량%, 밀크향 0.04중량%, 물 20.6998중량%, 전지분유 1.16중량%, 대용분유 0.29중량%, 제1인산칼슘 0.03중량%, 살포염 0.29중량%, 및 분무유 7.27중량%와 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 1.0중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.
제조예 2: 의약품
제조예 2-1: 산제
실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀의 에탄올 추출물, 파이퍼노날린 각각 50 mg과 결정셀룰로오즈 2 g을 혼합한 후 통상의 산제 제조방법에 따라 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예 2-2: 정제
실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀의 에탄올 추출물, 파이퍼노날린 각각 50 mg과 결정셀룰로오즈 400 mg, 스테아린산 마그네슘 5 mg을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예 2-3: 캡슐제
실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀의 에탄올 추출물, 파이퍼노날린 각각 30 mg과 유청단백질 100 mg, 결정셀룰로오즈 400 mg, 스테아린산 마그네슘 6 mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 2-4: 주사제
통상의 주사제 제조방법에 따라, 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀의 에탄올 추출물, 파이퍼노날린 각각 100 mg과 주사용 증류수, pH 조절제를 혼합하여 2 ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜 주사제를 제조하였다.
제조예 3: 구강 관리 제품
제조예 3-1: 치약
하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물과 실시예 2의 파이퍼노날린을 함유하는 치약을 제조하였다.
구분 성분명 제조예
3-1-1 3-1-2
약효성분 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 0.1 -
파이퍼노날린 - 0.05
연마제 탄산칼슘 40.0 40.0
습윤제 솔비톨액 25.0 25.0
불소 일불소인산나트륨 0.1 0.1
기포제 라우릴황산나트륨 2.0 2.0
결합제 카르복시메틸셀룰로즈 1.0 1.0
감미제 삭카린나트륨 0.2 0.2
방부제 메틸파라벤 0.1 0.1
향료 조합향료 1.0 1.0
용매 정제수 나머지 나머지
제조예 3-2: 양치액
하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물과 실시예 2의 파이퍼노날린을 함유하는 양치액을 제조하였다.
성분명 제조예
3-2-1 3-2-2
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 0.1 -
파이퍼노날린 - 0.05
글리세린 5.0 5.0
폴록사머 1.0 1.0
불화나트륨 0.1 0.1
구연산나트륨 0.2 0.2
삭카린나트륨 0.01 0.01
조합향료 0.15 0.15
에탄올 6.0 6.0
정제수 나머지 나머지
제조예 3-3: 마우스 스프레이
하기 [표 3]에 나타낸 바와 같이 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물과 실시예 2의 파이퍼노날린을 함유하는 마우스 스프레이를 제조하였다.
성분명 제조예
3-3-1 3-3-2
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 0.1 -
파이퍼노날린 - 0.05
글리세린 7.0 7.0
구연산나트륨 0.4 0.4
불화나트륨 0.02 0.02
삭카린나트륨 0.011 0.011
폴록사머 1.0 1.0
메틸파라벤 0.1 0.1
프로필파라벤 0.05 0.05
조합향료 0.12 0.12
에탄올 60.0 60.0
정제수 나머지 나머지
제조예 3-4: 식이성 필름
하기 [표 4]에 나타낸 바와 같이 실시예 1에서 제조한 파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물과 실시예 2의 파이퍼노날린을 함유하는 식이성 필름을 제조하였다.
원료명 제조예
3-4-1 3-4-2
파이퍼 레트로프락텀 에탄올 추출물 0.1 -
파이퍼노날린 - 0.05
플루란 20.0 20.0
트윈80 0.1 0.1
카라기난 0.1 0.1
로코스트 빈 0.1 0.1
잔탄검 1.0 1.0
향 1.0 1.0
정제수 나머지 나머지

Claims (11)

  1. 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    파이퍼레트로 프락텀 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 유기용매, 아임계 유체 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    탄소수 1 내지 6의 유기용매는 탄소수 1 내지 6의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 분획물은 파이퍼 레트로프락텀 추출물에 대한 헥산 및 에틸아세테이트를 포함하는 용매에 의한 분획물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 추출물 또는 이의 분획물은 하기 화학식 1의 파이퍼노날린 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00003

  6. 제1항에 있어서,
    치주질환은 치은염 (gingivitis), 치은출혈 (gingival bleeding), 치은퇴축 (gingival retraction), 치주낭 (periodontal pocket) 형성 또는 치조골 (alveolar bone) 파괴인 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 파이퍼 레트로프락텀 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 구강 관리용 조성물.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 파이퍼노날린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00004

  10. 하기 화학식 1로 표시되는 파이퍼노날린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00005

  11. 하기 화학식 1로 표시되는 파이퍼노날린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 구강 관리용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00006
KR1020190088949A 2019-07-23 2019-07-23 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR20210011713A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190088949A KR20210011713A (ko) 2019-07-23 2019-07-23 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190088949A KR20210011713A (ko) 2019-07-23 2019-07-23 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210011713A true KR20210011713A (ko) 2021-02-02

Family

ID=74559774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190088949A KR20210011713A (ko) 2019-07-23 2019-07-23 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210011713A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101982326B1 (ko) 근육 질환 예방, 개선 또는 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물
KR100835899B1 (ko) 생강 추출물 또는 이로부터 분리된 진저롤을 포함하는치주질환의 예방 또는 치료용 조성물
US20090306208A1 (en) Prophylactic or therapeutic composition for hemoglobinuria or myoglobinuria
US8067537B2 (en) Composition and method for treatment of stomatitis
KR20210014231A (ko) 해조류 추출물을 함유하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물
KR101902932B1 (ko) 엉겅퀴 및 흰민들레의 꽃과 뿌리를 제거한 전초 추출물을 함유하는 알코올성 위염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20210020988A (ko) 잔소리졸을 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물
KR20200140749A (ko) 꾸지뽕나무를 유효성분으로 함유하는 근육 질환 개선, 치료 또는 예방용, 또는 근 기능 개선용 조성물
KR101647495B1 (ko) 플라본계 화합물 또는 캠페리아 파비플로라 추출물을 함유하는 치주질환 개선 조성물
EP4321166A1 (en) Composition for inhibiting biofilm comprising lactobacillus rhamnosus as active ingredient
KR102158134B1 (ko) 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물
JP6021005B2 (ja) 抗菌組成物およびその利用
KR20210011713A (ko) 파이퍼 레트로프락텀 또는 파이퍼노날린을 함유하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR101685671B1 (ko) 네로올리돌을 포함하는 강진향 추출물을 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR101280868B1 (ko) 야콘 추출물을 유효성분으로 함유하는 충치와 치주질환 예방 또는 치료용 약학조성물 및 식품 조성물
KR102633488B1 (ko) 배초향 추출물 또는 틸리아닌를 유효성분으로 함유하는 근육 질환 개선, 치료 또는 예방용, 또는 근 기능 개선용 조성물
KR102352636B1 (ko) 팔각회향 추출물 또는 시킴산을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물
KR102517662B1 (ko) 차가버섯을 유효성분으로 함유하는 근육 질환 개선, 치료 또는 예방용, 또는 근 기능 개선용 조성물
KR102546196B1 (ko) 치주염 치료 효과를 가진 락토바실러스 루테리 균주 및 이의 용도
US20220088106A1 (en) Composition comprising cudrania tricuspidate as effective component for alleviating, treating, or preventing muscular diseases, or improving muscule functions
KR20210158444A (ko) 자바투메릭 또는 잔소리졸을 유효성분으로 함유하는 근육 질환 개선, 치료 또는 예방용, 또는 근 기능 개선용 조성물
KR20240029547A (ko) 퀸산을 유효성분으로 함유하는 근육 질환 개선, 치료 또는 예방용, 또는 근 기능 개선용 조성물
KR20230119590A (ko) 속미 추출물을 유효성분으로 함유하는 구강 항균용 조성물
KR20240007731A (ko) 침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 타액 분비 증강용 및 구강건조증 예방, 개선 혹은 치료용 조성물
KR20220157645A (ko) 페로스타틴-1을 유효성분으로 포함하는 구강건조증 예방 또는 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E601 Decision to refuse application