KR20210009224A - Method for detecting target nucleic acid and composition for detecting nucleic acid by mirroring binding of nicking enzyme recognition site - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한 표적핵산의 검출 방법 및 핵산 검출용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, (a) 절단효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 표적핵산과 혼합하여, 상기 프라이머가 상기 표적핵산과 상보적으로 결합하여 양 말단부에 상기 절단효소 인식부위를 포함하는 이중나선 구조의 주형을 형성하는 단계; (b) 상기 이중나선 구조의 주형에 상기 절단효소 인식부위에 대응하는 절단효소를 접촉시켜, 상기 절단효소에 의해 상기 절단효소 인식부위를 절단시키는 단계; (c) 상기 절단된 절단효소 인식부위에 중합효소를 첨가하여 중합반응을 통해 단일가닥 절단 생성물을 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 단일가닥 절단 생성물에 포함된 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하여, 결합된 절단효소 인식부위의 염기서열의 3' 말단으로부터 상기 중합효소를 이용하여 절단효소 증폭반응을 통해 상기 표적핵산을 반복적으로 증폭하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법, 및 절단효소 인식부위를 포함하는 1 내지 4 개의 프라이머 및 범퍼 프라이머를 포함하는 핵산 검출용 조성물로서, 상기 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting a target nucleic acid and a composition for detecting a nucleic acid by mirroring binding of a cleavage enzyme recognition site, and more specifically, (a) a primer containing a cleavage enzyme recognition site is mixed with the target nucleic acid, and the primer Forming a template of a double helix structure including the cleavage enzyme recognition site at both ends by binding complementarily to the target nucleic acid; (b) contacting a cleavage enzyme corresponding to the cleavage enzyme recognition site to the double-helix template, and cleaving the cleavage enzyme recognition site by the cleavage enzyme; (c) adding a polymerase to the cleaved cleavage enzyme recognition site to generate a single strand cleavage product through polymerization; And (d) a cleavage enzyme recognition site included in the single-stranded cleavage product is complementarily bound by crossing in a mirrored form, and a cleavage enzyme using the polymerase from the 3'end of the nucleotide sequence of the linked cleavage enzyme recognition site. A method for detecting a target nucleic acid comprising the step of repeatedly amplifying the target nucleic acid through an amplification reaction, and a composition for detecting a nucleic acid comprising 1 to 4 primers and bumper primers including a cleavage enzyme recognition site, wherein the cleavage enzyme It relates to a composition for detecting nucleic acids, characterized in that the recognition sites are complementarily bound by crossing in a mirrored form.
생물체 내의 핵산(DNA 또는 RNA) 분석을 위해 혈액 등의 생체 시료로부터 핵산을 추출하게 되면 일반적으로 추출되는 양은 다양한 분석에 바로 사용되기에는 매우 적기 때문에, 이를 정확히 분석하기 위해서는 추출된 핵산의 증폭이 필요하다. 면역학적 검출 방법을 비롯하여, 현재까지 다양한 방법의 핵산 증폭 기술이 개발되었으며, 특히 DNA를 증폭하는 대표적인 방법인 PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응)은 표적 유전자를 선택적으로 대량 증폭하여 주는 고효율의 증폭기술이기 때문에, 다양한 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 PCR은 각각이 별개의 온도에서 행해지는 3단계로 이루어진 반응을 이용하여 수행되어 온도 구배가 필요하며 반응 용액의 미세한 온도 조절을 해주는 PCR 기기를 필요로 하여 비용이 많이 들고 현장진단 등에 사용하기 어려운 단점이 있다. When nucleic acids are extracted from biological samples such as blood for analysis of nucleic acids (DNA or RNA) in living organisms, the amount of extracted nucleic acids is generally very small to be used directly for various analyses, so it is necessary to amplify the extracted nucleic acids to accurately analyze them. Do. Nucleic acid amplification techniques have been developed in various ways, including immunological detection methods, and in particular, PCR (polymerase chain reaction), a representative method for amplifying DNA, is a highly efficient method that selectively amplifies target genes in large quantities. Because it is an amplifier technique, it is widely used in various fields. However, PCR is performed using a reaction consisting of three steps, each carried out at a separate temperature, and requires a temperature gradient and requires a PCR device that finely controls the temperature of the reaction solution, which is expensive and difficult to use for on-site diagnosis. There are drawbacks.
따라서, 이를 개선하기 위해 핵산의 등온 증폭기술이 개발되어 왔으며, 이 중 대표적인 기술 중 하나인 등온 지수 증폭 반응(EXPAR; exponential isothermal amplification reaction)는 짧은 단일가닥의 표적핵산을 DNA 중합효소와 절단효소를 이용하여, 등온의 반응조건 상에서 표적핵산을 기하급수적으로 증폭하는 기술이다 (J. V. Ness et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100(8), 4504 - 4509). EXPAR는 증폭효율이 좋고 반응시간이 30분 정도로 짧아 표적핵산 분석을 비롯한 다양한 생체분자 분석에 활용되고 있으며, 특히 microRNA 분석 등에 효과적으로 사용되었다 (H. Jia et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 5498 - 5501). Therefore, in order to improve this, isothermal amplification of nucleic acids has been developed, and exponential isothermal amplification reaction (EXPAR), one of the representative technologies, converts short single-stranded target nucleic acids into DNA polymerase and cleavage enzymes. It is a technology that exponentially amplifies a target nucleic acid under isothermal reaction conditions (JV Ness et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100(8), 4504-4509). EXPAR has good amplification efficiency and short reaction time of about 30 minutes, so it is used for various biomolecules analysis including target nucleic acid analysis, and is particularly effectively used for microRNA analysis (H. Jia et al., Angew. Chem. Int. Ed. , 2010, 49, 5498-5501).
이와 관련하여, 일본 특허공개공보 제2013-031463호는 핵산의 등온 증폭 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 특허공개공보 제10-2018-0001893호는 특이적 증폭반응으로부터 얻어지는 표적핵산의 증폭 산물을 질량분석을 이용하여 효과적으로 분석하는 비표지 검출방법에 관한 것으로, 등온 지수 증폭 반응을 이용한 표적핵산의 검출방법을 개시하고 있다.In this regard, Japanese Patent Laid-Open No. 2013-031463 discloses a method for isothermal amplification of nucleic acids, and Korean Patent Laid-Open No. 10-2018-0001893 mass spectrometry for amplification products of target nucleic acids obtained from specific amplification reactions. It relates to a method for detecting a non-labeled effective analysis using the, and discloses a method for detecting a target nucleic acid using an isothermal exponential amplification reaction.
그러나 EXPAR는 표적핵산이 없는 경우에도 증폭반응이 진행되는, 이른바 비특이적 증폭반응이 일어나는 큰 문제점을 가지고 있다. 이러한 EXPAR의 비특이적 증폭반응의 원인은 명확히 밝혀지지는 않았으나, 등온 반응조건 상에서 EXPAR 주형의 2차 구조 형성 및 이와 효소와의 반응으로 인해 일어나는 것으로 여겨지고 있다 (E. Tan et al., Biochemistry,2008, 47, 9987 - 9999). 이러한 비특이적 증폭반응으로 인해 EXPAR의 특이도 및 재현성이 떨어지며, 다중 표적 분석도 어렵다. 따라서 보다 효과적인 핵산의 등온증폭을 위해서는 비특이적 증폭반응이 충분히 억제되어야 한다.However, EXPAR has a big problem that amplification reaction proceeds even in the absence of a target nucleic acid, so-called nonspecific amplification reaction occurs. The cause of this non-specific amplification reaction of EXPAR has not been clearly identified, but it is believed to occur due to the formation of the secondary structure of the EXPAR template and the reaction with the enzyme under isothermal reaction conditions (E. Tan et al., Biochemistry, 2008, 47, 9987-9999). Due to this non-specific amplification reaction, the specificity and reproducibility of EXPAR are poor, and multiple target analysis is difficult. Therefore, for more effective isothermal amplification of nucleic acids, nonspecific amplification reactions must be sufficiently suppressed.
이에, 본 출원의 발명자들은 기존의 방법에 비해 증폭된 표적핵산을 효과적이고 정확하게 증폭할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 절단효소 인식 염기서열(Nicking enzyme recognition sequence) 기반 등온 지수 증폭반응을 통하여 미러링 결합 방식으로 효과적으로 표적핵산을 증폭할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the inventors of the present application made diligent efforts to develop a method that can effectively and accurately amplify the amplified target nucleic acid compared to the existing method. As a result, through an isothermal exponential amplification reaction based on a nicking enzyme recognition sequence. It was confirmed that the target nucleic acid can be effectively amplified by the mirror binding method, and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 (a) 절단효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 표적핵산과 혼합하여, 상기 프라이머가 상기 표적핵산과 상보적으로 결합하여 양 말단부에 상기 절단효소 인식부위를 포함하는 이중나선 구조의 주형을 형성하는 단계; (b) 상기 이중나선 구조의 주형에 상기 절단효소 인식부위에 대응하는 절단효소를 접촉시켜, 상기 절단효소에 의해 상기 절단효소 인식부위를 절단시키는 단계; (c) 상기 절단된 절단효소 인식부위에 중합효소를 첨가하여 중합반응을 통해 단일가닥 절단 생성물을 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 단일가닥 절단 생성물에 포함된 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하여, 결합된 절단효소 인식부위의 염기서열의 3' 말단으로부터 상기 중합효소를 이용하여 절단효소 증폭반응을 통해 상기 표적핵산을 반복적으로 증폭하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is (a) a primer containing a cleavage enzyme recognition site is mixed with a target nucleic acid, and the primer is complementarily bound to the target nucleic acid to form a double helix structure including the cleavage enzyme recognition site at both ends. Forming a mold; (b) contacting a cleavage enzyme corresponding to the cleavage enzyme recognition site to the double-helix template, and cleaving the cleavage enzyme recognition site by the cleavage enzyme; (c) adding a polymerase to the cleaved cleavage enzyme recognition site to generate a single strand cleavage product through polymerization; And (d) a cleavage enzyme recognition site included in the single-stranded cleavage product is complementarily bound by crossing in a mirrored form, and a cleavage enzyme using the polymerase from the 3'end of the nucleotide sequence of the linked cleavage enzyme recognition site. It is to provide a method for detecting a target nucleic acid comprising the step of repeatedly amplifying the target nucleic acid through an amplification reaction.
본 발명의 다른 목적은 절단효소 인식부위를 포함하는 1 내지 4 개의 프라이머 및 범퍼 프라이머를 포함하는 핵산 검출용 조성물로서, 상기 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is a nucleic acid detection composition comprising 1 to 4 primers and bumper primers including a cleavage enzyme recognition site, characterized in that the cleavage enzyme recognition sites are complementarily bound by crossing in a mirrored form. It is to provide a composition for detecting nucleic acids.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은(a) 절단효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 표적핵산과 혼합하여, 상기 프라이머가 상기 표적핵산과 상보적으로 결합하여 양 말단부에 상기 절단효소 인식부위를 포함하는 이중나선 구조의 주형을 형성하는 단계; (b) 상기 이중나선 구조의 주형에 상기 절단효소 인식부위에 대응하는 절단효소를 접촉시켜, 상기 절단효소에 의해 상기 절단효소 인식부위를 절단시키는 단계; (c) 상기 절단된 절단효소 인식부위에 중합효소를 첨가하여 중합반응을 통해 단일가닥 절단 생성물을 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 단일가닥 절단 생성물에 포함된 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하여, 결합된 절단효소 인식부위의 염기서열의 3' 말단으로부터 상기 중합효소를 이용하여 절단효소 증폭반응을 통해 상기 표적핵산을 반복적으로 증폭하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention (a) by mixing a primer containing a cleavage enzyme recognition site with a target nucleic acid, the primer is complementarily bound to the target nucleic acid to include the cleavage enzyme recognition site at both ends. Forming a mold having a double helix structure; (b) contacting a cleavage enzyme corresponding to the cleavage enzyme recognition site to the double-helix template, and cleaving the cleavage enzyme recognition site by the cleavage enzyme; (c) adding a polymerase to the cleaved cleavage enzyme recognition site to generate a single strand cleavage product through polymerization; And (d) a cleavage enzyme recognition site included in the single-stranded cleavage product is complementarily bound by crossing in a mirrored form, and a cleavage enzyme using the polymerase from the 3'end of the nucleotide sequence of the linked cleavage enzyme recognition site. It provides a method for detecting a target nucleic acid comprising the step of repeatedly amplifying the target nucleic acid through an amplification reaction.
본 발명은 또한 절단효소 인식부위를 포함하는 1 내지 4 개의 프라이머 및 범퍼 프라이머를 포함하는 핵산 검출용 조성물로서, 상기 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물을 제공한다.The present invention is also a composition for nucleic acid detection comprising 1 to 4 primers and bumper primers including a cleavage enzyme recognition site, wherein the cleavage enzyme recognition sites are complementarily bound by crossing in a mirrored form. It provides a composition for use.
본 발명은 절단효소 인식부위의 미러링 결합에 의한, LAMP(Loop-mediated isothermal amplification) 기반의 시료 중의 표적핵산의 존재 유무를 신속하게 검출할 수 있는 방법, 장치 및 시스템에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 임의의 짧은 길이의 DNA 등 핵산 단편을 대량으로 증폭하여 표적핵산의 유무를 검출할 수 있는바, 민감도, 특이도 및 재현성이 우수할 뿐만 아니라, 다수의 시료를 대상으로 표적핵산의 유무를 동시에 신속하면서도 정확하게 분석할 수 있어, 환경적 요인에 의한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방, 및 현장진단을 위한 바이오센서 플랫폼으로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a method, apparatus, and system capable of quickly detecting the presence or absence of a target nucleic acid in a sample based on Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) by mirroring binding of a cleavage enzyme recognition site, according to the present invention Since it can detect the presence or absence of target nucleic acid by amplifying a large amount of nucleic acid fragments such as DNA of arbitrary short length, it has excellent sensitivity, specificity, and reproducibility, as well as quickly detecting the presence or absence of target nucleic acid for multiple samples. As it can be accurately analyzed, it can be usefully used as a biosensor platform for prevention of diseases caused by environmental factors, early diagnosis, and development and prescription of personalized medicines, and field diagnosis.
아울러, 본 발명은 분석 방법이 편리하고 정확할 뿐만 아니라 반응 종료점에서의 분석을 이용하기 때문에, 다양한 바이오센서의 플랫폼으로서 유용하게 사용될 수 있으며, 다중 표적핵산 검출이 가능하므로 다양한 표적핵산 분석을 통한 질병의 예방, 조기 진단 및 개인 맞춤 의약품 개발과 처방에 유용하게 사용될 수 있다.In addition, the present invention can be usefully used as a platform for various biosensors because the analysis method is not only convenient and accurate, but also uses analysis at the reaction end point, and it is possible to detect multiple target nucleic acids. It can be usefully used for prevention, early diagnosis, and personalized medicine development and prescription.
도 1은 본 발명의 표적핵산 검출 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 절단서열 및 추가서열을 포함하는, 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는, 절단효소 인식부위의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 절단효소 인식부위를 포함하는 프라이머의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 절단효소 인식부위를 절단효소에 따라 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 표적핵산 검출 방법에 있어서, 이중가닥 증폭 듀플렉스의 형성 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 미러링 결합에 의한 단일가닥 핵산의 증폭반응을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 절단효소에 의해 절단된 표적핵산의 절단효소 인식부위가 미러링 구조로 역 평행하게 결합하고, 결합된 부위의 3' 말단이 상보적인 단일가닥의 염기서열을 연장하며, 상보적인 단일가닥을 생성하는 절단효소 증폭반응을 반복하여 표적핵산을 대량으로 증폭하는 방법을 구체적으로 나타낸 것이다.
도 1 내지 7에 있어서, 빨간색 막대는 절단 부위(nicking site), 노란색 점은 중합효소(polymerase), 파란색 삼각형은 절단효소(nicking enzyme), 검은색 막대는 범퍼 프라이머(bump primer), 하늘색 막대는 안정화 영역(stabilizing region)을 나타낸다.1 schematically shows a method for detecting a target nucleic acid of the present invention.
Figure 2 shows the structure of the cleavage enzyme recognition site, which is complementarily bound by crossing in a mirrored form, including a cleavage sequence and an additional sequence of the present invention.
Figure 3 shows the structure of the primer containing the cleavage enzyme recognition site of the present invention.
Figure 4 shows the cleavage enzyme recognition site complementarily bound by crossing in the mirroring form of the present invention according to the cleavage enzyme.
Figure 5 shows a process of forming a double-stranded amplified duplex in the method for detecting a target nucleic acid of the present invention.
Figure 6 shows the amplification reaction of single-stranded nucleic acids by mirroring binding of the present invention.
FIG. 7 shows the cleavage enzyme recognition site of the target nucleic acid cleaved by the cleavage enzyme of the present invention is bound in a mirroring structure in reverse parallel, and the 3'end of the bound site extends the complementary single-stranded nucleotide sequence, and is complementary. It shows in detail a method of amplifying a large amount of target nucleic acid by repeating the cleavage enzyme amplification reaction that generates a single strand.
In FIGS. 1 to 7, a red bar is a nicking site, a yellow dot is a polymerase, a blue triangle is a nicking enzyme, a black bar is a bump primer, and a light blue bar is It represents a stabilizing region.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by an expert skilled in the art to which the present invention belongs. In general, the nomenclature used in this specification is well known and commonly used in the art.
본 발명은 절단효소에 의해 절단된 표적핵산의 절단효소 인식부위(nicking enzyme recognition site, '절단 부위(nicking site)'라고도 함)가 서로 미러링 구조로 교차하여 평행하게 결합하고, 결합된 부위의 3' 말단이 상보적인 단일가닥의 염기서열을 연장(extension)하며, 상보적인 단일가닥을 생성하는 절단효소 증폭반응(Nicking amplification)을 반복하여 표적핵산을 증폭하는 증폭 방법, 증폭 장치 및 증폭 시스템에 관한 것이다(도 1).In the present invention, the cleavage enzyme recognition site (nicking enzyme recognition site, also referred to as'nicking site') of the target nucleic acid cleaved by the cleavage enzyme crosses each other in a mirroring structure and binds in parallel, and 3 '' Regarding the amplification method, amplification device and amplification system for amplifying target nucleic acids by repeating the nicking amplification reaction that extends the nucleotide sequence of the single strand complementary to the end and generates the complementary single strand Will (Figure 1).
본 발명에 있어서, 절단효소에 의해 생성된 각 DNA 단일 가닥에 포함되어 있는 일정 길이의 절단효소 인식부위(염기서열)가 서로 반대방향으로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 것을 미러링(mirroring) 또는 미러링 결합이라고 한다.In the present invention, the cleavage enzyme recognition site (base sequence) of a certain length included in each single strand of DNA produced by the cleavage enzyme crosses in opposite directions to complementary binding to each other by mirroring or mirroring binding. It is called.
본 발명은 일 관점에서, (a) 절단효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 표적핵산과 혼합하여, 상기 프라이머가 상기 표적핵산과 상보적으로 결합하여 양 말단부에 상기 절단효소 인식부위를 포함하는 이중나선 구조의 주형을 형성하는 단계; (b) 상기 이중나선 구조의 주형에 상기 절단효소 인식부위에 대응하는 절단효소를 접촉시켜, 상기 절단효소에 의해 상기 절단효소 인식부위를 절단시키는 단계; (c) 상기 절단된 절단효소 인식부위에 중합효소를 첨가하여 중합반응을 통해 단일가닥 절단 생성물을 생성시키는 단계; 및 (d) 상기 단일가닥 절단 생성물에 포함된 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하여, 결합된 절단효소 인식부위의 염기서열의 3' 말단으로부터 상기 중합효소를 이용하여 절단효소 증폭반응을 통해 상기 표적핵산을 반복적으로 증폭하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출방법에 관한 것이다.In an aspect of the present invention, (a) a primer containing a cleavage enzyme recognition site is mixed with a target nucleic acid, and the primer is complementarily bound to the target nucleic acid, and a double helix comprising the cleavage enzyme recognition site at both ends Forming a mold of the structure; (b) contacting a cleavage enzyme corresponding to the cleavage enzyme recognition site to the double-helix template, and cleaving the cleavage enzyme recognition site by the cleavage enzyme; (c) adding a polymerase to the cleaved cleavage enzyme recognition site to generate a single strand cleavage product through polymerization; And (d) a cleavage enzyme recognition site included in the single-stranded cleavage product is complementarily bound by crossing in a mirrored form, and a cleavage enzyme using the polymerase from the 3'end of the nucleotide sequence of the linked cleavage enzyme recognition site. It relates to a method for detecting a target nucleic acid comprising the step of repeatedly amplifying the target nucleic acid through an amplification reaction.
본 발명에 있어서, 상기 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 서열에 대하여, 단일가닥 절단 생성물이 다음과 같은 구조로 이중결합하며, 상기 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 서열의 3' 말단부는 상기 절단효소 인식부위를 포함하고, 5' 말단부는 3' 말단부의 절단효소 인식부위의 안티센스 염기서열을 포함하며, 양 말단부 사이에는 역평행한 추가 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:In the present invention, with respect to the sequence complementarily bound by crossing in the mirrored form, the single-stranded cleavage product is double-bonded in the following structure, and the 3'end of the sequence complementarily bound by crossing in the mirrored form Includes the cleavage enzyme recognition site, the 5'end portion includes the antisense nucleotide sequence of the cleavage enzyme recognition site at the 3'end, and antiparallel additional nucleotide sequences between both ends may be characterized:
3'-(N1 N2 ... Nx)(K1 K2 ... Ky K'y ... K'2 K'1)(N'x ... N'2 N'1)-5' 3 '- (N 1 N 2 ... N x) (K 1
5'-(N'1 N'2 ... N'x)(K'1 K'2 ... K'y Ky ... K2 K1)(Nx ... N2 N1)-3'. 5 '- (N' 1 N '2 ... N' x) (K '1 K' 2 ... K 'y K y ... K 2 K 1) (N x ... N 2 N 1 )-3'.
여기서 N은 절단 서열(Nicking sequence)이고, K는 추가 서열(additional sequence)이며, x 및 y는 각각 1 이상의 정수이며, x가 2의 배수가 아닌 경우 임의의 염기서열 1개를 추가할 수 있다.Here, N is a nicking sequence, K is an additional sequence, x and y are each an integer greater than or equal to 1, and if x is not a multiple of 2, one arbitrary base sequence can be added. .
본 발명에 있어서, 일정 길이의 추가 염기서열을 포함하도록 설계함으로써 상보적으로 미러링 결합하는 부위의 길이를 조절 할 수 있다.In the present invention, by designing to include an additional nucleotide sequence of a predetermined length, the length of the complementary mirror-binding portion can be adjusted.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 절단효소 인식부위를 포함하는, 바람직하게는 1 내지 4 개의 프라이머, 및 범퍼 프라이머(Bump primer)를 표적핵산과 혼합하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 3). 본 발명에 있어서, 바람직하게는 2개의 프라이머 및 범퍼 프라이머를 사용할 수 있다. In the present invention, in the step (a), preferably, 1 to 4 primers, including a cleavage enzyme recognition site, and a bumper primer are mixed with the target nucleic acid (FIG. 3 ). In the present invention, preferably, two primers and a bumper primer can be used.
본 발명에 있어서, 범퍼 프라이머는 짧은 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드로서, 앞서 만들어진 단일가닥의 DNA를 떼어주는 역할을 한다.In the present invention, the bumper primer is a short single-stranded DNA oligonucleotide and serves to separate the previously made single-stranded DNA.
본 발명에 있어서, 절단효소는 Nb.BbvCⅠ, Nt.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsⅠ, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBⅠ, Nb.BssSI 및 Nt.AlwⅠ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cleavage enzyme is Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBI, Nb.BssSI and Nt. It may be characterized in that it is selected from the group consisting of Alw I, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the polymerase may be selected from the group consisting of Klenow DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, phi29 DNA polymerase, and Bst DNA polymerase, but is not limited thereto. .
본 발명에 있어서, 표적핵산이 등온증폭을 통해 증폭되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, it may be characterized in that the target nucleic acid is amplified through isothermal amplification.
본 발명에 있어서, 표적핵산의 존재 여부를 확인하여 표적핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 이는 전기영동법 또는 광학측정법에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 다양한 공지의 도구 및/또는 방법을 이용하여 수행될 수 있다.In the present invention, it further includes the step of detecting the target nucleic acid by checking the presence or absence of the target nucleic acid, which may be characterized by being performed by electrophoresis or optical measurement, but is not limited thereto, and various known It can be done using tools and/or methods.
본 발명은 다른 관점에서, 절단효소 인식부위를 포함하는 1 내지 4 개의 프라이머 및 범퍼 프라이머를 포함하는 핵산 검출용 조성물로서, 상기 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention is a composition for detecting nucleic acids comprising 1 to 4 primers and bumper primers including a cleavage enzyme recognition site, wherein the cleavage enzyme recognition sites are complementarily bound by crossing in a mirrored form. It relates to a composition for detecting a nucleic acid.
본 발명에 있어서, 상기 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 서열에 대하여, 단일가닥 절단 생성물이 다음과 같은 구조로 이중결합하며, 상기 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하는 서열의 3' 말단부는 상기 절단효소 인식부위를 포함하고, 5' 말단부는 3' 말단부의 절단효소 인식부위의 안티센스 염기서열을 포함하며, 양 말단부 사이에는 역평행한 추가 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:In the present invention, with respect to the sequence complementarily bound by crossing in the mirrored form, the single-stranded cleavage product is double-bonded in the following structure, and the 3'end of the sequence complementarily bound by crossing in the mirrored form Includes the cleavage enzyme recognition site, the 5'end portion includes the antisense nucleotide sequence of the cleavage enzyme recognition site at the 3'end, and antiparallel additional nucleotide sequences between both ends may be characterized:
3'-(N1 N2 ... Nx)(K1 K2 ... Ky K'y ... K'2 K'1)(N'x ... N'2 N'1)-5' 3 '- (N 1 N 2 ... N x) (K 1
5'-(N'1 N'2 ... N'x)(K'1 K'2 ... K'y Ky ... K2 K1)(Nx ... N2 N1)-3'. 5 '- (N' 1 N '2 ... N' x) (K '1 K' 2 ... K 'y K y ... K 2 K 1) (N x ... N 2 N 1 )-3'.
여기서 N은 절단 서열(Nicking sequence)이고, K는 추가 서열(additional sequence)이며, x 및 y는 각각 1 이상의 정수이며, x가 2의 배수가 아닌 경우 임의의 염기서열 1개를 추가할 수 있다.Here, N is a nicking sequence, K is an additional sequence, x and y are each an integer greater than or equal to 1, and if x is not a multiple of 2, one arbitrary base sequence can be added. .
본 발명에 있어서, 일정 길이의 추가 염기서열을 포함하도록 설계함으로써 상보적으로 미러링 결합하는 부위의 길이를 조절 할 수 있다.In the present invention, by designing to include an additional nucleotide sequence of a predetermined length, the length of the complementary mirror-binding portion can be adjusted.
본 발명에 있어서, 절단효소 및/또는 중합효소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, it may be characterized in that it further comprises a cleavage enzyme and/or a polymerase.
본 발명에 있어서, 절단효소는 Nb.BbvCⅠ, Nt.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsⅠ, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBⅠ, Nb.BssSI 및 Nt.AlwⅠ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the cleavage enzyme is Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBI, Nb.BssSI and Nt. It may be characterized in that it is selected from the group consisting of Alw I, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 중합효소는 Klenow DNA 중합효소, Bsu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소 및 Bst DNA 중합효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the polymerase may be selected from the group consisting of Klenow DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, phi29 DNA polymerase, and Bst DNA polymerase, but is not limited thereto. .
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 표적핵산의 검출 방법을 수행하기 위한 장치 또는 시스템에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an apparatus or system for performing the method of detecting the target nucleic acid.
본 발명에서 용어 '핵산'은 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 중합체 또는 이들의 조합을 의미하며, 천연 뉴클레오티드 및 합성 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 핵산은 원핵세포 핵산, 진핵세포 핵산, 바이러스 핵산, 또는 비로이드 핵산과 같은 천연 유래 핵산 분자, 공지된 핵산 유사체 또는 화학적으로 합성가능한 핵산 분자를 포함할 수 있다.In the present invention, the term'nucleic acid' refers to a single-stranded or double-stranded deoxyribonucleotide, a ribonucleotide polymer, or a combination thereof, and includes natural nucleotides and synthetic nucleotides. Accordingly, in the present invention, the nucleic acid may include a naturally-derived nucleic acid molecule such as a prokaryotic nucleic acid, a eukaryotic nucleic acid, a viral nucleic acid, or a viroid nucleic acid, a known nucleic acid analogue, or a chemically synthesizable nucleic acid molecule.
본 발명에서 용어 '표적핵산'은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미한다.In the present invention, the term'target nucleic acid' means a nucleic acid sequence to be detected.
본 발명에서 용어 '주형'은 표적핵산과 상보적인 서열을 갖는 핵산을 지칭한다.In the present invention, the term'template' refers to a nucleic acid having a sequence complementary to a target nucleic acid.
본 발명에서 용어 '상보적'은 염기쌍 결합 규칙과 관련성이 있는 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)에 대해 사용한다. 예를 들어, 서열 5'-A-G-T-3'은 서열 3'-T-C-A-5'과 상보적이다. 상보성은 '부분적'일 수 있는데, 즉 핵산 염기의 단지 일부만이 염기 쌍 결합 규칙에 따라 부합될 수 있다. 다른 한편으로, 핵산 사이에 '완전한' 또는 '전체' 상보성을 가질 수도 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화 강도 및 효율성에 상당한 영향이 있다. 이는 핵산 사이의 결합에 좌우되는 검출법뿐만 아니라 증폭 반응에서 특히 중요하다.In the present invention, the term'complementary' is used for a polynucleotide (ie, a sequence of nucleotides) related to the base pairing rule. For example,
본 발명에서 용어 '절단효소'는 완전한 또는 부분적 이중가닥의 뉴클레오티드 서열을 인식하고 인식 서열에 대해 특이적 위치에서 하나의 가닥만을 절단시키는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 상기 인식 서열은 절단효소에 따라 상이하며, 예를 들어, Nt.BstNBI는 5'-GAGTCNNNN▼N-3'(N은 임의의 염기, ▼는 절단 위치) 서열을 인식하는 것으로 알려져 있다(표 1 및 도 4).In the present invention, the term'cleavage enzyme' refers to an endonuclease that recognizes a complete or partial double-stranded nucleotide sequence and cuts only one strand at a specific position with respect to the recognition sequence. The recognition sequence differs depending on the cleavage enzyme, for example, Nt.BstNBI is known to recognize 5'-GAGTCNNNN ▼N-3' (N is an arbitrary base, ▼ is a cleavage site) sequence (Table 1). And Fig. 4).
[표 1][Table 1]
구체적으로, 본 발명의 표적핵산 검출 방법은 두 개의 개별적인 절단 부위에서의 단일가닥 핵산의 미러링 결합에 의해 표적핵산 서열을 증폭시킨다. Specifically, the target nucleic acid detection method of the present invention amplifies the target nucleic acid sequence by mirroring binding of single-stranded nucleic acids at two separate cleavage sites.
우선, 표적핵산을 절단효소 인식부위를 포함하는 두 개의 프라이머 및 범퍼 프라이머의 연장에 의해 양 말단에 절단효소 인식부위가 포함된 이중나선 구조의 주형(이중가닥의 증폭 듀플렉스)을 생성한다(도 5).First, a template of a double-helix structure (double-stranded amplification duplex) containing the cleavage enzyme recognition site at both ends is generated by extending the target nucleic acid from the two primers including the cleavage enzyme recognition site and the bumper primer (Fig. 5). ).
상기 이중가닥의 증폭 듀플렉스의 일측 말단부에서 절단효소에 의한 절단이 이루어지고, 절단된 부위에서 중합효소를 이용한 중합반응에 의해 3' 말단부에서 5' 말단부로 연장이 이루어지게 되며, 이에 의해 기존에 존재하던 단일가닥 핵산은 분리된다. 분리되어 나온 단일가닥 핵산은 8 내지 16 bp 정도의 절단효소 인식부위 서열을 포함하게 된다(도 6). 이러한 이중가닥의 증폭 듀플렉스에서의 증폭 과정을 반복하여 단일가닥의 핵산을 기하급수적으로 생성할 수 있다.At one end of the double-stranded amplification duplex, cleavage is performed by a cleavage enzyme, and extension is made from the 3'end to the 5'end by a polymerization reaction using a polymerase at the cleaved site, thereby existing existing The old single-stranded nucleic acid is isolated. The isolated single-stranded nucleic acid contains a cleavage enzyme recognition site sequence of about 8 to 16 bp (Fig. 6). By repeating the amplification process in the double-stranded amplification duplex, a single-stranded nucleic acid can be generated exponentially.
분리되어 나온 단일가닥 핵산에서 일정 길이의 절단효소 인식 부위의 염기서열이 서로 역 평행하게 상보적이므로, 절단효소에 의해 절단된 절단부가 미러링 구조로 결합할 수 있다. 이중결합된 절단부가 각각 3' 말단부로 중합효소에 의해 연장할 수 있다. 이러한 다수의 절단부의 결합 형태를 갖춘 미러링 이중나선 듀플렉스가 생성되고, 결합된 이중가닥의 3' 말단부는 양방향으로 중합효소에 의한 중합반응으로 결합되지 않는 반대의 핵산 가닥을 주형으로 연장하여 각각 이중가닥으로 만들어진다. 상기 결합된 절단부는 절단효소 인식부위를 포함하고 있으므로 절단효소에 의해 다시 절단될 수 있다. 절단효소 및 중합효소에 의한 절단 및 연장의 반복 과정을 통해 다수의 핵산 절편들이 만들어질 수 있다. 이렇게 생성된 핵산 절편들은 서로 상보적인 염기서열을 포함하고 있기 때문에 결합하여 이중나선 구조를 형성한다(도 7).In the isolated single-stranded nucleic acid, since the nucleotide sequences of the cleavage enzyme recognition sites of a certain length are complementary to each other in reverse parallel, the cleavage section cut by the cleavage enzyme can be combined in a mirror structure. Each double-bonded cleavage may be extended to the 3'end by a polymerase. A mirrored double-stranded duplex having the form of binding of a plurality of such cuts is created, and the 3'end of the bonded double strand extends the opposite nucleic acid strand as a template that is not bound by polymerization by a polymerase in both directions. Is made with Since the combined cleavage portion includes a cleavage enzyme recognition site, it can be cut again by a cleavage enzyme. A number of nucleic acid fragments can be made through repeated processes of cleavage and extension by cleavage enzymes and polymerases. Since the nucleic acid fragments thus generated contain base sequences that are complementary to each other, they are combined to form a double helix structure (FIG. 7).
이중나선 구조의 핵산은 형광을 발하는 인터컬레이터 염료 등의 형광물질 등의 표지물질을 이용하여 최종적으로 증폭 여부를 확인할 수 있다.The double-stranded nucleic acid can be finally amplified by using a labeling material such as a fluorescent material such as an intercalator dye that emits fluorescence.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it is obvious that these specific techniques are only preferred embodiments for those of ordinary skill in the art, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Therefore, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (13)
(b) 상기 이중나선 구조의 주형에 상기 절단효소 인식부위에 대응하는 절단효소를 접촉시켜, 상기 절단효소에 의해 상기 절단효소 인식부위를 절단시키는 단계;
(c) 상기 절단된 절단효소 인식부위에 중합효소를 첨가하여 중합반응을 통해 단일가닥 절단 생성물을 생성시키는 단계; 및
(d) 상기 단일가닥 절단 생성물에 포함된 절단효소 인식부위가 미러링 형태로 교차함으로써 상보적으로 결합하여, 결합된 절단효소 인식부위의 염기서열의 3' 말단으로부터 상기 중합효소를 이용하여 절단효소 증폭반응을 통해 상기 표적핵산을 반복적으로 증폭하는 단계를 포함하는 표적핵산의 검출 방법.
(a) mixing a primer containing a cleavage enzyme recognition site with a target nucleic acid, and the primer is complementarily bound to the target nucleic acid to form a template of a double helix structure including the cleavage enzyme recognition site at both ends ;
(b) contacting a cleavage enzyme corresponding to the cleavage enzyme recognition site to the double-helix template and cutting the cleavage enzyme recognition site by the cleavage enzyme;
(c) adding a polymerase to the cleavage enzyme recognition site to produce a single-stranded cleavage product through polymerization; And
(d) the cleavage enzyme recognition site included in the single-stranded cleavage product crosses in a mirrored form to complementarily bind, and amplification of cleavage enzyme using the polymerase from the 3'end of the nucleotide sequence of the linked cleavage enzyme recognition site Target nucleic acid detection method comprising the step of repeatedly amplifying the target nucleic acid through a reaction.
3'-(N1 N2 ... Nx)(K1 K2 ... Ky K'y ... K'2 K'1)(N'x ... N'2 N'1)-5'
5'-(N'1 N'2 ... N'x)(K'1 K'2 ... K'y Ky ... K2 K1)(Nx ... N2 N1)-3',
여기서 N은 절단 서열이고, K는 추가 서열이며, x 및 y는 각각 1 이상의 정수이다.
The method of claim 1, wherein with respect to the sequence complementarily bound by crossing in the mirrored form, the single-stranded cleavage product is double-bonded in the following structure, and 3'of the sequence complementarily bound by crossing in the mirroring form Target nucleic acid, characterized in that the terminal includes the cleavage enzyme recognition site, the 5'end includes the antisense nucleotide sequence of the cleavage enzyme recognition site at the 3'end, and an antiparallel additional nucleotide sequence between both ends Detection method:
3 '- (N 1 N 2 ... N x) (K 1 K 2 ... K y K' y ... K '2 K' 1) (N 'x ... N' 2 N '1 )-5'
5 '- (N' 1 N '2 ... N' x) (K '1 K' 2 ... K 'y K y ... K 2 K 1) (N x ... N 2 N 1 )-3',
Where N is a cleavage sequence, K is an additional sequence, and x and y are each an integer greater than or equal to 1.
The method of claim 1, wherein in step (a), 1 to 4 primers and bumper primers including a cleavage enzyme recognition site are mixed with the target nucleic acid.
The method of claim 1, wherein the cleavage enzyme is Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBI, Nb.BssSI and A method for detecting a target nucleic acid, characterized in that selected from the group consisting of Nt.AlwI.
The method of claim 1, wherein the polymerase is selected from the group consisting of Klenow DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, phi29 DNA polymerase, and Bst DNA polymerase.
The method of claim 1, wherein the target nucleic acid is amplified through isothermal amplification.
The method of claim 1, further comprising the step of detecting the target nucleic acid by checking the presence or absence of the target nucleic acid.
The method of claim 7, wherein the detecting of the target nucleic acid is performed by an electrophoresis method or an optical measurement method.
A composition for detecting a nucleic acid comprising 1 to 4 primers including a cleavage enzyme recognition site and a bumper primer, wherein the cleavage enzyme recognition site is complementarily bound by crossing in a mirrored form.
3'-(N1 N2 ... Nx)(K1 K2 ... Ky K'y ... K'2 K'1)(N'x ... N'2 N'1)-5'
5'-(N'1 N'2 ... N'x)(K'1 K'2 ... K'y Ky ... K2 K1)(Nx ... N2 N1)-3',
여기서 N은 절단 서열이고, K는 추가 서열이며, x 및 y는 각각 1 이상의 정수이다.
The method of claim 9, wherein with respect to the sequence complementarily bound by crossing in the mirrored form, the single-stranded cleavage product is double-bonded in the following structure, and 3'of the sequence complementarily bound by crossing in the mirroring form Nucleic acid detection, characterized in that the terminal includes the cleavage enzyme recognition site, the 5'end includes the antisense nucleotide sequence of the cleavage enzyme recognition site at the 3'end, and an antiparallel additional nucleotide sequence between both ends Dragon composition:
3 '- (N 1 N 2 ... N x) (K 1 K 2 ... K y K' y ... K '2 K' 1) (N 'x ... N' 2 N '1 )-5'
5 '- (N' 1 N '2 ... N' x) (K '1 K' 2 ... K 'y K y ... K 2 K 1) (N x ... N 2 N 1 )-3',
Where N is a cleavage sequence, K is an additional sequence, and x and y are each an integer greater than or equal to 1.
The composition for detecting a nucleic acid according to claim 9, further comprising a cleavage enzyme and/or a polymerase.
The method of claim 11, wherein the cleavage enzyme is Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nt.BstNBI, Nb.BssSI and A composition for detecting nucleic acids, characterized in that selected from the group consisting of Nt.AlwI.
The composition for detecting a nucleic acid according to claim 11, wherein the polymerase is selected from the group consisting of Klenow DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Vent DNA polymerase, phi29 DNA polymerase, and Bst DNA polymerase.
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |