JP4552274B2 - Nucleic acid quantitative analysis method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩基配列を含む標的ＲＮＡを定性又は定量分析方法に関し、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量するのに有用な分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、生体成分の分析には高い特異性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配列を有する核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体を形成する性質が利用される。
【０００３】
特定塩基配列を有する標的核酸の定量には、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を得る手段が重要であり、更に臨床診断等の目的においては、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であることから、該手段は極微量核酸を増幅する工程が必要となる。
【０００４】
ウイルス感染症の診断では、臨床試料中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために信号強度を向上し高感度化する目的から、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法、特に競合ＰＣＲ法が知られている。この方法は、既知濃度のコンペティター（標的核酸と共通のプライマー認識領域を持つ異種核酸配列）を試料に添加してＰＣＲを実施し、コンペティターと標的核酸の増幅程度を比較することによって試料中の標的核酸濃度を推定するものである。より具体的には、末端にプライマーと相補的な配列を有し、しかも電気泳動法等の分離手段によって標的核酸の増幅産物とは識別が可能な（例えば鎖長が異なる等）核酸を用意し、これを各濃度となるように試料中に混合し、それらについて同時にＰＣＲを実施するのである。
【０００５】
また、ＰＣＲを用いた標的核酸の定量方法として、均一系での分析法も提案されている。例えば、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を各ＰＣＲサイクルごとに測定してその変化から標的核酸の初期量を決定する分析法が提案されている（特開平５−２３７０００号公報；医学のあゆみ、１７３（１２）、９５９−９６３（１９９５年）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９、２０７−２１３（１９９５年）参照）。この分析法では、ＰＣＲによる増幅産物が２本鎖ＤＮＡであることから、２本鎖核酸にインターカレーションして蛍光強度が増大する等、その蛍光特性が変化する性質を有するインターカレーター性蛍光色素を用い、これをＰＣＲによる増幅操作前に予め反応溶液に添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定しその立ち上がりサイクル等から標的核酸の初期量を決定するのである。
【０００６】
一方、ＲＮＡの増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法も知られている。この方法は、標的ＲＮＡに対し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及びリボヌクレエースHにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメレースによって標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡが増幅された段階で反応を終了し、電気泳動法または標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法により増幅されたＲＮＡを定量する。
【０００７】
標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法は測定可能な可視光、蛍光、発光等の信号を発生するように標識した核酸プローブと標的核酸との複合体を形成後、未反応の核酸プローブを洗浄又は分解し、標識物質を測定し標的核酸を定量する方法である。一般には特定核酸の異なる部位の特定配列に対して相補結合を形成し得る配列からなる２種類のプローブを用いるサンドイッチアッセイと呼ばれる方法が知られている。この方法では、第１のプローブは不溶性担体に固定化されており、一方第２のプローブはその一部に可視部に色を持つ色素や蛍光物質あるいはそれらを生成し得る酵素で標識されている。そして、試料にこれらのプローブを添加し、試料中の特定核酸を第１及び第２のプローブと相補結合させ、これら３者からなる複合体を不溶性担体上に形成させる。引き続き、試料反応中の上清と不溶性担体とを分離し、上記複合体を形成していない第２のプローブを分離する（Ｂ／Ｆ分離工程）。しかる後、不溶性担体上の複合体中の標識物質を測定することにより、試料中の特定核酸の有無及び量を決定するのである。ここで、可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生成し得る酵素を第２の標識として用いる場合は、上記複合体形成工程後、複合体を形成していない第２のプローブを除去した後に、それらの前駆体である酵素基質を試料反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質を測定することにより、試料中の標的核酸の有無及びその量を決定する。
【０００８】
サンドイッチアッセイでは、反応液中に不溶性担体を利用することから、第２のプローブがこの不溶性担体に非特異的に吸着し、不溶性担体上の非特異的に吸着し、不溶性担体上の複合体中の標識を測定する段階で、この不溶性担体上に非特異的に吸着した第２のプローブの標識の存在により測定結果に誤差が生じ試料中の特定核酸の有無及びその量を決定する際に問題が生じる。特に、ウイルス感染症の診断では、臨床試料中の極微量のウイルス核酸を良好な再現性で高感度に検出することが要求されることから、上記の非特異吸着に由来する問題は解決すべき重要な課題となっている。
【０００９】
この問題を回避する目的で、不溶性担体の表面の親水化処理、蛋白質等による担体表面の吸着点のブロッキング、Ｂ／Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄すること等が試みられている。
【００１０】
しかしながら、担体表面を化学的に親水化処理等することは、その可否が担体の材質に依存するうえ、技術的に必ずしも容易ではない。また担体表面の吸着点を予めブロッキングする目的で担体表面を蛋白質によって被覆する方法では、その蛋白質が第２のプローブの核酸部分又は標識と相互作用し、担体への新たな非特異的吸着を招く可能性もある。更に、Ｂ／Ｆ分離工程においては、不溶性担体の洗浄回数を増やすことは操作上の限界があり、例えば洗浄液に界面活性剤を添加する等した場合、担体に形成されている複合体の分解を促す可能性もある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
競合ＰＣＲ法では、１検体を分析するために想定核酸濃度を含む各濃度のコンペティターを調製し、これを添加した試料についてＰＣＲを実施する必要がある。しかもＰＣＲ終了後には、試料を反応容器から取り出して電気泳動等の分離操作を行わなければならない。このため多数の検体を迅速かつ簡便に処理する必要性の高い臨床検査に適用するには不適当である。また、試料を反応溶液から取り出さなければならないことから、増副産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を解決し得ない。さらに、標的がＲＮＡの場合は、ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素の作用によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲを行う、所謂ＲＴ−ＰＣＲを行うこととなり、実質的には２段階の工程を行わなけばならない。
【００１２】
インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを実施する方法では、２本鎖核酸にインターカレーションすることを原理としているため、試料中に特定核酸以外の２本鎖ＤＮＡ、例えば大量のゲノムＤＮＡ等、が混在する場合には、インターカレーター性蛍光色素がこれらにもインターカレーションして大きなバックグラウンドを生じてしまうという課題がある。また、ＰＣＲ法では特定核酸配列に相補的な一対のオリゴヌクレオチドを伸長反応用プライマーとして用いるが、このプライマーの配列によってはこれらが互いに相補結合し、この結果、互いに他方のプライマーを鋳型としてプライマーダイマーが生産されることがある。インターカレーター性蛍光色素は２本鎖に非特異的にインターカレーションするため、このようなプライマーダイマーの生産に由来してバックグラウンドが増加するという課題もある。
【００１３】
ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等を用いた場合、ＲＮＡが十分検出可能な量まで増幅された後に反応を終了し、電気泳動法あるいは標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法にて増幅された核酸を定量可能であるが、試料中に元来存在した増幅前の標的ＲＮＡの定量は不可能である。また、電気泳動や標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法を行うに当たり、増副産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題がある。
【００１４】
そこで本発明の目的は、試料中に元来存在した特定塩基配列を含む標的ＲＮＡ（１本鎖ＲＮＡ）を定量するための、迅速、簡便で、精度の高い方法であって、特に好適な態様においては密閉した容器内で全操作を完了し得る方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、標的核酸の特定塩基配列に相補的な核酸配列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するようにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを開発した（特開平８−２１１０５０号公報；ＥＰ公開第７１４９８６号公報；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６年）参照）。この核酸プローブは、標的核酸と相補結合を形成することで測定可能な蛍光信号を発するため、相補結合を形成していないプローブを反応系から分離することなしに、相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量を可能とするものである。そこで本発明者らは、この核酸プローブの共存状態で核酸プライマー及び核酸ポリメレースの作用によりＲＮＡを増幅し、経時的な蛍光強度の測定によって得られた蛍光強度と時間の関係より元来試料中に存在した標的ＲＮＡの定量分析を、好適には密閉条件で行い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、ＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、経時的に蛍光強度を測定し、測定された経時的な蛍光強度の変化について、該蛍光強度が所定の基準を満たす時刻を算出し、該算出された時刻より試料中の標的核酸濃度を決定する、標的核酸の分析方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本願請求項の１の発明は、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を分析する方法である。ここで分析とは、試料中に該ＲＮＡが存在するか否かを分析することと、そして、試料中に元来存在した該ＲＮＡの存在量を分析することの両方を含む。
【００１８】
本願発明は、標的ＲＮＡを含むと予想される試料に、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用意し、試料にこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか、又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加することを要しない）と、蛍光信号を経時的に測定する操作を含む。
【００１９】
（Ａ）前記標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｃ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｄ）リボヌクレエースH又は同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素、
（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（G）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｈ）リボヌクレオシド三燐酸、
（Ｉ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチド。
【００２０】
また、上記試薬（Ａ）、試薬（Ｅ）及び試薬（Ｉ）の、第１、第２及び第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる以外に、以下の試薬（Ｊ）〜（Ｌ）の第１〜第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてもよい。
【００２１】
（Ｊ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｋ）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’側末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｌ）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列に相同的（同一）な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチド。
【００２２】
上記において、特定塩基配列とは、上記（Ａ）及び（Ｅ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合、５’末端が（Ｅ）の第２の１本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列で始まり、３’末端が（Ａ）の第１の１本鎖オリゴヌクレオチドと相補的な配列で終わる、標的ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分である。また上記（Ｊ）及び（Ｋ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合には、５’末端が（Ｋ）の第２の１本鎖オリゴヌクレオチドと同一な配列で始まり、３’末端が（Ｊ）の第１の１本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列に相補的な配列で終わる、標的ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分である。特定塩基配列は任意に決定することができるが、標的ＲＮＡを他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を含むようにすることが重要である。
【００２３】
試薬（Ａ）は、特定塩基配列に対し、配列特異的に結合する、相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬は標的ＲＮＡに相補結合し、後述する試薬（Ｂ）及び（Ｃ）の存在下で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる標的ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成が行われる際に、該ｃＤＮＡの５’側末端に特定塩基配列の３’末端と相補的な配列が位置するようにするためのものである。
【００２４】
試薬（Ｂ）はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースであり、試薬（Ｃ）はその基質となるデオキシリボヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ａ）〜（Ｃ）の存在下で、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’末端に相補的な配列を５’末端に持つｃＤＮＡが合成される。このｃＤＮＡは、鋳型となった標的ＲＮＡと、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖を形成した状態である。
【００２５】
試薬（Ｄ）は、上記ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有するリボヌクレエースＨであるが、同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素を用いることもできる。トリ筋芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（以下、ＡＭＶ逆転写酵素）に代表される逆転写酵素は、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有しており、この種の酵素を用いることを例示できる。
【００２６】
試薬（Ｅ）は、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第２のオリゴヌクレオチドにおいて、（３）の部分は試薬（Ａ）〜（Ｄ）が共存することで合成されるｃＤＮＡの３’末端に結合する。従って試薬（Ｃ）と（Ｆ）の共存により、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端から該ｃＤＮＡを鋳型として、また同時に該ｃＤＮＡの３’末端から該第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりそれぞれの相補鎖が合成され、転写可能なプロモーター配列を有する完全な２本鎖ＤＮＡが合成される。
【００２７】
試薬（Ｆ）はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースである。ＡＭＶ逆転写酵素に代表される逆転写酵素には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性を有するものがあり、この種の酵素を用いてもよい。
【００２８】
試薬（Ｇ）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースであり、試薬（Ｈ）はその基質となるリボヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ｃ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の共存により合成される２本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端に有する。このため、試薬（Ｇ）及び（Ｈ）の存在下では該ＤＮＡ合成後、直ちに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成が開始される。試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースとしては、具体的に例えばＴ７ＲＮＡポリメレースやＴ３ ＲＮＡポリメレース、ＳＰ６ ＲＮＡポリメレース等を例示することができる。
【００２９】
試薬（Ｇ）及び（Ｈ）の共存により合成される１本鎖ＲＮＡは特定塩基配列からなるＲＮＡである。従って、これらが合成されて試薬（Ａ）〜（Ｆ）と共存することにより、上述した一連の反応が繰り返し生じることとなる。このように、本発明では試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡをもとにして前記の如きプロモータ領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成源となる。合成された１本鎖ＲＮＡは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与し、結果として時間の経過とともに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大する。
【００３０】
試薬（Ｉ）は、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第３のオリゴヌクレオチドは、例えばインターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡであれば良い。該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列の特異的分析のため、６〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは１０〜３０ヌクレオチドとすることが好ましい。むろん該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列中に存在する配列であって、標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列部分と相補的な配列であることが重要である。
【００３１】
ＤＮＡ部分は合成された特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡと相補結合を形成した場合に、既に添加されている試薬（Ｃ）のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースが作用してその３’末端からの伸長が生じないように、該３’末端が特定塩基配列と非相補的な配列が付加されているか、または、その３’末端が化学的に修飾されていることが好ましい。
【００３２】
インターカレーター性蛍光色素は、ＤＮＡ部分が他の核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものである。この目的のためには、インターカレーター性蛍光色素を、２本鎖部分へのインターカレションを妨げない程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合することが例示できる。かかるリンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖部分にインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特に両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また、例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ，商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を使用することもできる。
【００３３】
インターカレーター性蛍光色素としては、２本鎖にインターカレーションすることで、例えば発する蛍光波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好ましい。より具体的には特に蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体を特に好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。
【００３４】
インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させるＤＮＡの位置は、ＤＮＡの５’末端、３’末端または中央部等、インターカレーター性蛍光色素の２本鎖へのインターカレーションが妨げられず、かつ、ＤＮＡ部分とＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。
【００３５】
プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型として試薬（Ｇ）及び試薬（Ｈ）により合成される１本鎖ＲＮＡ量は経時的に増加する。本反応系において該１本鎖ＲＮＡのある特定の配列に相補的な配列を有する上記の性質を合わせ持つ試薬（Ｉ）を共存させることにより、合成されるＲＮＡ量に比例して蛍光強度が増加することが確認されている。（医学のあゆみ、１８４（３）、２３９−２４４、（１９９８年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６年））
試薬（Ｉ）を、標的ＲＮＡを含むと予想される試料に、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）とともに共存させ、増加する特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを、蛍光信号として測定する。ここで、合成された1本鎖ＲＮＡと試薬（Ｉ）の第３のオリゴヌクレオチドが相補結合を形成し、蛍光信号を発した場合であっても、このＲＮＡは試薬（Ａ）〜（Ｃ）共存下でのＤＮＡ合成の際の鋳型として機能することが明らかとなった。即ち本発明では、各試薬の共存状態においてＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、２本鎖ＤＮＡの合成、２本鎖ＤＮＡからのＲＮＡ合成という一連の現象が、第３のオリゴヌクレオチド共存下で生じ、ＲＮＡの増加に比例して蛍光強度が増加する。
【００３６】
上記試薬（Ａ）、試薬（Ｅ）及び試薬（Ｉ）の第１〜第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる代わりに、上記試薬（Ｊ）〜（Ｌ）の第１〜第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてた場合について説明する。
【００３７】
試薬（Ｊ）は、５’側末端から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬の（３）の部分は特定塩基配列中の３’側末端に相補結合し、試薬（Ａ）を用いた場合と同様に、試薬（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の存在下で、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。
【００３８】
試薬（Ｋ）は、標的ＲＮＡの特定の塩基配列の５’側末端に相同的配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬（Ｋ）が該ｃＤＮＡの特定塩基配列中の３’側末端に相補的結合をした後、試薬（Ｃ）及び試薬（Ｆ）の共存により、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが合成される。
更に該２本鎖ＤＮＡは、試薬（Ｇ）及び試薬（Ｈ）の共存により、特定塩基配列に相補的な第２の１本鎖ＲＮＡが合成される。
【００３９】
更に、該第２のＲＮＡの３’側末端は試薬（Ｋ）と相補結合し、試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で、該第２のＲＮＡの第２のｃＤＮＡが合成される。該第２のｃＤＮＡの３’末端は試薬（Ｊ）の（３）部分と相補結合し、試薬（Ｃ）及び試薬（Ｆ）によりプロモーター配列を含有する２本鎖ＤＮＡが合成され、試薬（Ｇ）及び試薬（Ｈ）により該第２のＲＮＡが合成される。合成された特定塩基配列に相補的な該第２のＲＮＡは、新たな２本鎖ＤＮＡの合成源となり、一連の反応が繰り返し生じることにより、結果として該第２のＲＮＡの量は飛躍的に増大する。
【００４０】
ここで得られた該第２のＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列と相補的な配列を有する。特定塩基配列と同一な配列を有し、かつインターカレーター性蛍光色素で標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチドである試薬（Ｌ）を共存させることにより、合成された該第２のＲＮＡ量に比例して蛍光強度が増加する。
【００４１】
また、本発明では、試料中に元来存在した特定塩基配列を含むＤＮＡを分析することも可能である。即ち、公知の方法により調製した転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを標的核酸とすれば、該２本鎖ＤＮＡは、前記増幅反応の鋳型となり得、ＲＮＡポリメレースにより、ＲＮＡ転写産物を生成することが可能だからである。転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ調製方法には、例えばプロモータープライマーとＤＮＡポリメレースを用い、標的ＤＮＡに対してプロモーター配列を付与する方法、あるいはＤＮＡライゲースを用い、プロモーター配列を有するＤＮＡ鎖を標的ＤＮＡに結合させる方法等を例示できる。
【００４２】
本発明における蛍光信号の測定は、好ましくは試薬（Ａ）〜（Ｉ）の添加直後から、又は、添加後所定時間経過後から経時的に行う。試薬（Ｉ）の第３のＤＮＡは、１本鎖ＲＮＡの合成過程において、合成されたＲＮＡと結合・解離を繰り返すが、結合時に測定される蛍光信号は各測定時における該ＲＮＡの存在量を反映するため、１本鎖ＲＮＡの増加する様子を経時的に追跡することが可能である。なお、測定自体は連続的なものであっても一定時間毎の間欠的なものであっても良い。また、蛍光信号の測定装置は、本発明の一部を構成しないが、１本以上の反応管中の蛍光信号を連続的又は一定時間毎の間欠的に測定できるものであれば如何なる装置を用いても良い。
【００４３】
蛍光信号の測定時間は、一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度が増加する時間が標的ＲＮＡを含まない試験区と有為に差の見られる時間を含み、一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度がほぼ一定になるまでの時間で、概ね４時間、好適条件では１時間である。
【００４４】
上記増幅及び経時的な蛍光強度の測定工程において、増幅反応の経過時間と蛍光強度の増加の関係より、試料中に元来存在した標的ＲＮＡ（初期ＲＮＡ量）が少なくなるに従い、一定の割合で、蛍光強度が増加する時刻が遅れる現象に基づき、所定の基準を満たす時刻を算出し、該算出された時刻より初期ＲＮＡ量を決定する。
【００４５】
ここで用いられる所定の基準を満たす時刻は、標的ＲＮＡを含まないコントロール区又はＲＮＡ増幅工程初期の蛍光強度の有為な増加が観察されない時刻と比較して、一定の蛍光増加率（所定時間の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）に至る時刻が挙げられる。より具体的には、標的ＲＮＡを含まない複数のコントロール区の所定時間における蛍光増加率の標準偏差の３倍を越えた時刻を用いることができる。また、蛍光増加率の常用対数と時刻との関係において、蛍光増加率の常用対数値がコントロール区と比較し有為に増加する時刻を用いることができる。
【００４６】
また、ある基準によって算出した時刻は、上記蛍光増加率において単位時間当たりの蛍光増加率が最大になる時刻を用いても定量分析が可能である。更に本分析法の容易に考えられる応用例として、蛍光増加率および時刻について、微分、対数表示、近似曲線等の数学的処理を行うことによる解析も可能である。更に、算出された時刻について、少なくとも２種類の異なる既知濃度の試料の場合と比較するすることによって、初期ＲＮＡ量を決定しても良い。
【００４７】
【発明の実施形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡについて、試料中に元来存在したＲＮＡ定量のための検量線を作成した。
【００４９】
（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基番号１１３〜２６７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）を標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、以下のＲＮＡ希釈液で１０9、１０8、１０7、１０6、１０5、１０4コピー／４μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区には、希釈液のみを用いた。
【００５０】
ＲＮＡ希釈液の組成
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
（２）以下の組成の反応液２１．２μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル５０μｌを重層した。
【００５１】
反応液の組成 （各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液 （ｐH８．１）
１３．５ｍＭ 酢酸マグネシウム
１２０ｍＭ 酢酸カリウム
１６％ ソルビトール
１０ｍＭ ＤＤＴ
各０．５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．２５ｍＭのＩＴＰ
０．２μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号１）
０．２μＭのＳＰ６プロモータ配列を有するの第２オリゴヌクレオチド
（配列番号２；該配列中、５’端１から１７番目までの塩基はＳＰ６プロモータ配列であり、１８から２５番目までの塩基はエンハンサー配列である。）
０．０２５μＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチド（図１、配列番号３；該配列中、５’端から５番目のＣに色素が結合している）
３０ユニット リボヌクレエース インヒビター
２％ ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
（３）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液４．８μｌを添加した。
【００５２】
酵素液の組成
４２ユニット ＡＭＶ逆転写酵素 （宝酒造製）
１７１ユニット ＳＰ６ ＲＮＡポリメレース （宝酒造製）
３μｇ 牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。
【００５３】
なお上記操作は、各サンプルについて５回ずつ行った。
【００５４】
酵素液添加時の時刻を０分として、各サンプル濃度の蛍光増加率（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）を図２〜図７に示す。
【００５５】
希釈液のみを用いた０コピーサンプルをコントロール区とし、６０分後の蛍光増加率の平均に標準偏差の３倍を加えた値、即ち蛍光増加率１．２の値に達する時刻の平均および最小二乗法による回帰直線を図８に示す。相関係数 −０．９９０の良好な相関を示す直線が得られた。各濃度の変動係数は、１０4コピーで４．４％、１０5コピーで２．１％、１０6コピーで３．１％、１０7コピーで７．４％、１０8コピーで９．１％、１０9コピーで４．２％であり、良好な再現性を示した。
【００５６】
上記蛍光増加率において、単位時間当たりの蛍光増加率、即ち［（蛍光増加率−ひとつ前の測定における蛍光増加率）÷測定間隔（５分）］が最大となる時刻の平均および最小二乗法による回帰直線を図９に示す。相関係数 −０．９５５で、各濃度の変動係数は、１０4コピーで７．８％、１０5コピーで０％、１０6コピーで７．２％、１０7コピーで０％、１０8コピーで０％、１０9コピーで１１．９％であった。
【００５７】
以上のことから、本法により、再現性の良好な検量線が得られることが示された。
【００５８】
実施例２
標準ＲＮＡを含む試料Ａおよび試料Ｂについて、再現性および特異性を検証した。
【００５９】
（１）実施例１の方法に従い、１０4〜１０9コピーの標準ＲＮＡを用い、検量線を作製した。蛍光増加率１．２に達する時刻を基準とした場合の検量線を図１０に、単位時間当たりの蛍光増加率が最大となる時刻を基準とした場合の検量線を図１１に示す。
【００６０】
（２）標準ＲＮＡを含む試料ＡおよびＢの各４μｌについて、各4連で実施例１と同様の方法で反応液および酵素液を添加後、５０℃に保温し、５分間隔で蛍光測定を行った。なお、試料ＡおよびＢは、各々１０5コピー／４μｌおよび１０8コピー／４μｌの標準ＲＮＡを含むように調製した。
【００６１】
（３）定量結果を表１に示す。（初期ＲＮＡ量の常用対数値をインデックス値と表す。）試料ＡおよびＢにおいて、理論値とほぼ一致する定量結果が得られた。
すべての試験区において１桁以内の誤差範囲で定量が可能であり、また、変動係数が５％以内であり、再現性にも優れていた。以上のことから、本法により、簡便かつ迅速に試料中に元来存在した特定ＲＮＡ濃度を、再現性良く定量することが可能であることが示された。
【００６２】
【表１】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、試料中の特定塩基配列を含む標的ＲＮＡ（１本鎖ＲＮＡ）について、概ね一定温度で、反応開始時に行う１段階の手動操作のみで、かつ、迅速に試料中に元来存在した標的ＲＮＡ量を定量分析することが可能となる。
【００６４】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡをもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便かつ、迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。
【００６５】
また本定量分析方法は、第１〜第３のオリゴヌクレオチドの配列を変更するのみで、臨床診断分野におけるウイルス由来のＲＮＡの定量分析以外にも、病原細菌、抗生物質耐性細菌などの定量分析を始め、食品中や土壌中の微生物の定量分析が可能となる。
【００６６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いたインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチドのインターカレーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ1〜Ｂ3は核酸塩基を示す。
【図２】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図３】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図４】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図５】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図６】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図７】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図８】実施例１で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率が１．２に達する時刻の平均から検量線を作製した。エラーバーは、±標準偏差を示す。
【図９】実施例１で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率の最大となる時刻の平均から検量線を作製した。エラーバーは、±標準偏差を示す。
【図１０】実施例２で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率が１．２に達する時刻から検量線を作製した。
【図１１】実施例２で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率の最大となる時刻から検量線を作製した。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for qualitative or quantitative analysis of a target RNA containing a specific base sequence that is expected to be contained in a gene mixture such as DNA or RNA, and is useful for use in clinical diagnostic fields such as genetic diagnosis, Furthermore, the present invention relates to an analytical method useful for qualitative or quantitative determination of microorganisms in food, indoors, soil, rivers, oceans and other environments.
[0002]
[Prior art]
In general, analysis of biological components requires high specificity and sensitivity. Analysis of a nucleic acid containing a specific base sequence (target nucleic acid) utilizes the property that the nucleic acid forms a complex in a sequence-specific manner with a nucleic acid (nucleic acid probe) having a sequence complementary to the specific base sequence.
[0003]
For quantification of a target nucleic acid having a specific base sequence, a means for obtaining a measurable signal related to the amount of the complex formed is important. Further, for the purpose of clinical diagnosis, a target that may be present in a sample Since the amount of nucleic acid is extremely small, the means requires a step of amplifying a very small amount of nucleic acid.
[0004]
In the diagnosis of viral infections, the target nucleic acid (viral nucleic acid) in clinical samples is often very small, so the signal intensity is improved and the sensitivity is increased to achieve highly sensitive and good reproducibility measurement. For the purpose, the polymerase chain reaction (PCR) method, particularly the competitive PCR method is known. In this method, a competitor having a known concentration (a heterologous nucleic acid sequence having a primer recognition region common to the target nucleic acid) is added to the sample, PCR is performed, and the target in the sample is compared by comparing the amplification degree of the competitor and the target nucleic acid. Estimates nucleic acid concentration. More specifically, a nucleic acid having a sequence complementary to the primer at the end and distinguishable from the amplification product of the target nucleic acid by a separation means such as electrophoresis (for example, having a different chain length) is prepared. This is mixed in the sample so as to have each concentration, and PCR is simultaneously performed on them.
[0005]
In addition, a homogeneous analysis method has also been proposed as a method for quantifying a target nucleic acid using PCR. For example, an analysis method has been proposed in which PCR is performed in the presence of an intercalating fluorescent dye, the fluorescence of the reaction solution is measured at each PCR cycle, and the initial amount of the target nucleic acid is determined from the change (Japanese Patent Laid-Open No. 5). No. 237000; History of Medicine, 173 (12), 959-963 (1995); Analytical Biochemistry, 229, 207-213 (1995)). In this analysis method, since the amplification product by PCR is a double-stranded DNA, an intercalating fluorescent dye having a property that its fluorescent property changes, such as intercalation into a double-stranded nucleic acid to increase the fluorescence intensity. This is added to the reaction solution in advance before the amplification operation by PCR, the fluorescence intensity of the reaction solution is measured over time, and the initial amount of the target nucleic acid is determined from its rising cycle or the like.
[0006]
On the other hand, NASBA method and 3SR method are also known as RNA amplification methods. This method synthesizes double-stranded DNA containing a promoter sequence with a primer containing a promoter sequence, reverse transcriptase and ribonuclease H, and RNA containing a specific base sequence of the target RNA by RNA polymerase. The RNA is synthesized and the RNA is subsequently subjected to a chain reaction that serves as a template for the synthesis of double-stranded DNA containing a promoter sequence. Then, the reaction is terminated at the stage where the RNA is amplified, and the amplified RNA is quantified by electrophoresis or a hybridization method using a labeled nucleic acid probe.
[0007]
Hybridization using a labeled nucleic acid probe involves forming a complex of a labeled nucleic acid probe and a target nucleic acid so as to generate a signal such as measurable visible light, fluorescence, or luminescence, and then unreacted nucleic acid probe. In this method, the target nucleic acid is quantified by washing or decomposing and measuring the labeling substance. In general, a method called sandwich assay using two kinds of probes composed of sequences capable of forming a complementary bond with a specific sequence at a different site of a specific nucleic acid is known. In this method, the first probe is immobilized on an insoluble carrier, while the second probe is partially labeled with a dye or a fluorescent substance having a color in the visible region or an enzyme capable of producing them. . Then, these probes are added to the sample, the specific nucleic acid in the sample is complementarily bound to the first and second probes, and a complex consisting of these three members is formed on the insoluble carrier. Subsequently, the supernatant during the sample reaction and the insoluble carrier are separated, and the second probe not forming the complex is separated (B / F separation step). Thereafter, the presence and amount of the specific nucleic acid in the sample is determined by measuring the labeling substance in the complex on the insoluble carrier. Here, when an enzyme capable of generating a dye or a fluorescent substance having a color in the visible part is used as the second label, after the complex forming step, after removing the second probe that has not formed the complex Then, the presence of the target nucleic acid in the sample and the amount thereof are determined by adding the enzyme substrate, which is a precursor thereof, to the sample reaction solution and measuring the dye or fluorescent substance that is the reaction product.
[0008]
In the sandwich assay, since an insoluble carrier is used in the reaction solution, the second probe adsorbs nonspecifically on the insoluble carrier, adsorbs nonspecifically on the insoluble carrier, and in the complex on the insoluble carrier. In the step of measuring the label, the presence of the label of the second probe nonspecifically adsorbed on the insoluble carrier causes an error in the measurement result, and a problem in determining the presence and amount of the specific nucleic acid in the sample. Occurs. In particular, in the diagnosis of viral infections, it is required to detect a very small amount of viral nucleic acid in clinical samples with good reproducibility and high sensitivity, so the above-mentioned problems caused by non-specific adsorption should be solved. It is an important issue.
[0009]
In order to avoid this problem, attempts have been made to hydrophilize the surface of the insoluble carrier, block the adsorption point of the carrier surface with proteins, etc., and thoroughly wash the insoluble carrier following the B / F separation step.
[0010]
However, it is technically not always easy to chemically hydrophilize the surface of the carrier depending on the material of the carrier. In the method of covering the carrier surface with a protein for the purpose of blocking the adsorption point on the carrier surface in advance, the protein interacts with the nucleic acid part or label of the second probe, leading to new nonspecific adsorption to the carrier. There is a possibility. Furthermore, in the B / F separation process, increasing the number of washings of the insoluble carrier has operational limitations. For example, when a surfactant is added to the washing solution, the complex formed on the carrier is decomposed. There is also the possibility of prompting.
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
In the competitive PCR method, it is necessary to prepare competitors at various concentrations including an assumed nucleic acid concentration in order to analyze one specimen, and to perform PCR on a sample to which these competitors are added. Moreover, after the PCR is completed, the sample must be taken out of the reaction vessel and subjected to a separation operation such as electrophoresis. For this reason, it is unsuitable for application to a clinical test where there is a high need to process a large number of specimens quickly and easily. In addition, since the sample must be taken out from the reaction solution, the problem of causing false positives derived from scattering of the by-product cannot be solved. Furthermore, when the target is RNA, so-called RT-PCR is performed in which RNA is used as a template to synthesize cDNA once by the action of reverse transcriptase and then PCR is performed. I must.
[0012]
Since the method of performing PCR in the presence of an intercalating fluorescent dye is based on the principle of intercalating into a double-stranded nucleic acid, double-stranded DNA other than a specific nucleic acid, such as a large amount of genomic DNA, is contained in a sample. When, is mixed, there is a problem that the intercalator fluorescent dye also intercalates with these, resulting in a large background. In the PCR method, a pair of oligonucleotides complementary to a specific nucleic acid sequence is used as an extension reaction primer. Depending on the sequence of this primer, they may complementarily bind to each other, and as a result, primer dimer using the other primer as a template. May be produced. Since the intercalating fluorescent dye intercalates non-specifically into double strands, there is also a problem that the background increases due to the production of such a primer dimer.
[0013]
When the NASBA method or 3SR method is used, the reaction is terminated after the RNA has been amplified to a sufficiently detectable amount, and the nucleic acid amplified by the electrophoresis method or the hybridization method using a labeled nucleic acid probe is used. Although quantification is possible, quantification of the target RNA that was originally present in the sample and before amplification is not possible. In addition, when performing a hybridization method using electrophoresis or a labeled nucleic acid probe, there is a problem of inducing false positives resulting from scattering of by-products.
[0014]
Accordingly, an object of the present invention is a rapid, simple and highly accurate method for quantifying a target RNA (single-stranded RNA) containing a specific base sequence originally present in a sample, and is particularly suitable. It is an object of the present invention to provide a method capable of completing the entire operation in a sealed container.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have developed a nucleic acid probe which has a nucleic acid sequence complementary to a specific base sequence of a target nucleic acid and which is labeled with an intercalating fluorescent dye so as to emit a measurable fluorescent signal when bound to the target nucleic acid. (See Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-211050; EP Publication No. 714986; Nucleic Acids Research, 24 (24), 4992-4997 (1996)). Since this nucleic acid probe emits a measurable fluorescence signal by forming a complementary bond with the target nucleic acid, the presence or absence and formation of complementary bond is formed without separating the probe that has not formed the complementary bond from the reaction system. It is possible to quantify the formed complementary conjugate. Therefore, the present inventors amplified RNA by the action of the nucleic acid primer and nucleic acid polymerase in the coexistence state of the nucleic acid probe, and originally in the sample from the relationship between the fluorescence intensity obtained by measuring the fluorescence intensity over time and the time. The present inventors have found that quantitative analysis of the existing target RNA can be preferably performed under sealed conditions, and the present invention has been completed.
[0016]
That is, the present invention provides a double-stranded DNA having a promoter sequence and capable of transcribing RNA consisting of the specific base sequence or a sequence complementary to the specific base sequence using a target RNA in a sample containing the specific base sequence as a template. An RNA transcript comprising the specific base sequence or a sequence complementary to the specific base sequence by RNA polymerase, and further generating the double-stranded DNA using the RNA transcript as a template. The amplification process is performed in the presence of a probe labeled with an intercalating fluorescent dye having a sequence complementary to the RNA transcript, and the fluorescence intensity is measured over time, and changes in the measured fluorescence intensity over time are measured. The target nucleic acid analysis that calculates a time at which the fluorescence intensity satisfies a predetermined standard and determines a target nucleic acid concentration in the sample from the calculated time It is the law. The present invention will be described in detail below.
[0017]
The invention of claim 1 of the present application is a method for analyzing single-stranded RNA (target RNA) containing a specific base sequence in a sample. Here, the analysis includes both analyzing whether or not the RNA is present in the sample and analyzing the abundance of the RNA originally present in the sample.
[0018]
The present invention prepares at least the following reagents (A) to (I) in a sample expected to contain the target RNA, and sequentially adds these to the sample, or adds two or more of them at once, Or the operation | movement which adds these at once ((A)-(I) does not need to add in this order) and the operation | movement which measures a fluorescence signal with time.
[0019]
(A) a first single-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to the 3 ′ terminal sequence of the specific base sequence in the target RNA;
(B) RNA-dependent DNA polymerase,
(C) deoxyribonucleoside triphosphate,
(D) Ribonuclease H or an enzyme having equivalent RNA degradation activity,
(E) In order from the 5 ′ end side, (1) the promoter sequence of DNA-dependent RNA polymerase, (2) the enhancer sequence of the promoter, and (3) the same base sequence as the 5 ′ end sequence of the specific base sequence in the target RNA A second single-stranded oligonucleotide having
(F) DNA-dependent DNA polymerase,
(G) DNA-dependent RNA polymerase,
(H) ribonucleoside triphosphate,
(I) A third single-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to a specific base sequence and labeled so as to emit a measurable fluorescence signal when bound to a nucleic acid having the sequence.
[0020]
Besides using the combination of the first, second and third single-stranded oligonucleotides of the reagent (A), reagent (E) and reagent (I), the following reagents (J) to (L) A combination of the first to third single-stranded oligonucleotides may be used.
[0021]
(J) In order from the 5 ′ end side, (1) a promoter sequence of DNA-dependent RNA polymerase, (2) an enhancer sequence of the promoter, and (3) a complementary sequence to the 3 ′ end sequence of a specific base sequence in the target RNA A first single-stranded oligonucleotide having a sequence;
(K) a second single-stranded oligonucleotide having the same base sequence as the 5 ′ end sequence of the specific base sequence in the target RNA,
(L) a third single strand having a sequence homologous (identical) to a specific base sequence in the target RNA and labeled so as to emit a measurable fluorescence signal when bound to a nucleic acid having the sequence Oligonucleotide.
[0022]
In the above, when the first and second single-stranded oligonucleotides of (A) and (E) above are used, the specific base sequence is the second single-stranded oligonucleotide whose 5 ′ end is (E) The base sequence portion present in the target RNA starts with the sequence (3) in FIG. 3 and ends with a sequence complementary to the first single-stranded oligonucleotide of (A) at the 3 ′ end. When the first and second single-stranded oligonucleotides of (J) and (K) are used, the 5 ′ end begins with the same sequence as the second single-stranded oligonucleotide of (K). The 3 ′ end is a part of the base sequence present in the target RNA that ends with a sequence complementary to the sequence of (3) in the first single-stranded oligonucleotide of (J). The specific base sequence can be arbitrarily determined, but it is important to include a sequence portion specific enough to distinguish the target RNA from other nucleic acids.
[0023]
The reagent (A) is a first single-stranded oligonucleotide having a complementary sequence that specifically binds to a specific base sequence. The reagent binds complementarily to the target RNA, and when cDNA synthesis is performed using the target RNA as a template by RNA-dependent DNA polymerase in the presence of the reagents (B) and (C) described later, This is intended to locate a sequence complementary to the 3 ′ end of the specific base sequence at the side end.
[0024]
Reagent (B) is an RNA-dependent DNA polymerase, and reagent (C) is deoxyribonucleoside triphosphate that serves as its substrate. In the presence of the reagents (A) to (C), cDNA having a sequence complementary to the 3 ′ end of the specific base sequence in the target RNA at the 5 ′ end is synthesized. This cDNA is in a state where a DNA-RNA duplex is formed with the target RNA as a template.
[0025]
Reagent (D) is ribonuclease H having the activity of cleaving RNA in the DNA-RNA duplex, but an enzyme having equivalent RNA degradation activity can also be used. A reverse transcriptase represented by avian myoblastoma virus reverse transcriptase (hereinafter referred to as AMV reverse transcriptase) has an activity of cleaving RNA in a DNA-RNA duplex, and this kind of enzyme is used. This can be illustrated.
[0026]
The reagent (E) comprises, in order from the 5 ′ end, (1) a promoter sequence of DNA-dependent RNA polymerase, (2) an enhancer sequence of the promoter, and (3) a base sequence identical to the 5 ′ end sequence of the specific base sequence. Having a second single-stranded oligonucleotide. In the second oligonucleotide, the part (3) binds to the 3 ′ end of cDNA synthesized by the coexistence of the reagents (A) to (D). Therefore, due to the coexistence of the reagents (C) and (F), the cDNA is used as a template from the 3 ′ end of the second oligonucleotide, and at the same time, the second oligonucleotide is used as the template from the 3 ′ end of the cDNA. Each complementary strand is synthesized by sex DNA polymerase, and a complete double-stranded DNA having a transcribable promoter sequence is synthesized.
[0027]
Reagent (F) is a DNA-dependent DNA polymerase. Some reverse transcriptases represented by AMV reverse transcriptase have DNA-dependent DNA polymerase activity, and this type of enzyme may be used.
[0028]
The reagent (G) is a DNA-dependent RNA polymerase, and the reagent (H) is a ribonucleoside triphosphate serving as a substrate. The double-stranded DNA synthesized by the coexistence of the reagents (C), (E) and (F) has a promoter region of DNA-dependent RNA polymerase at the end. For this reason, in the presence of the reagents (G) and (H), the synthesis of single-stranded RNA having a specific base sequence is started immediately after the DNA synthesis. Specific examples of the DNA-dependent RNA polymerase in the reagent (G) include T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase and the like.
[0029]
Single-stranded RNA synthesized by the coexistence of the reagents (G) and (H) is RNA having a specific base sequence. Therefore, when these are synthesized and coexist with the reagents (A) to (F), the above-described series of reactions are repeated. As described above, in the present invention, double-stranded DNA having the promoter region at the end as described above is synthesized based on a very small amount of target RNA present in the sample, and this is the single-stranded RNA comprising a specific base sequence. Become a source of synthesis. The synthesized single-stranded RNA contributes to the synthesis of new double-stranded DNA, and as a result, the amount of single-stranded RNA comprising a specific base sequence increases dramatically with the passage of time.
[0030]
Reagent (I) is a third single-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to a specific base sequence and labeled so as to emit a measurable fluorescence signal when bound to a nucleic acid having the sequence. . The third oligonucleotide may be a DNA to which, for example, an intercalating fluorescent dye is bound. The DNA portion is preferably 6 to 100 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides, for specific analysis of a specific base sequence. Of course, it is important that the DNA portion is a sequence that is present in the specific base sequence and is complementary to a sequence portion that is sufficiently distinguishable from nucleic acids other than the target nucleic acid.
[0031]
When a DNA portion forms a complementary bond with a single-stranded RNA having a specific base sequence synthesized, the RNA-dependent DNA polymerase of the already added reagent (C) acts to extend from its 3 ′ end. It is preferable that a sequence that is not complementary to the specific base sequence is added to the 3 ′ end, or that the 3 ′ end is chemically modified.
[0032]
An intercalating fluorescent dye is one in which when a DNA portion forms a complementary bond with another nucleic acid, it is intercalated into a double-stranded portion to change the fluorescence characteristics. For this purpose, it can be exemplified that the intercalating fluorescent dye is bound to the DNA via an appropriate molecular length linker that does not interfere with the intercalation into the double-stranded portion. The linker is not particularly limited as long as it is a molecule that does not prevent the intercalating fluorescent dye from intercalating into the double-stranded part. In particular, a linker molecule selected from bifunctional hydrocarbons having functional groups at both ends is convenient and preferable for modification to oligonucleotides. In addition, for example, a commercially available reagent set (C6-Thiolmodifier, trade name, manufactured by Clontech) or the like can also be used.
[0033]
The intercalating fluorescent dye is not particularly limited as long as its fluorescence characteristics change by intercalating into double strands, for example, the fluorescence wavelength to be emitted fluctuates or the like. From the viewpoint of the above, those having the property of increasing the fluorescence intensity by intercalation are particularly preferable. More specifically, thiazole orange, oxazole yellow or derivatives thereof having particularly remarkable changes in fluorescence intensity can be exemplified as particularly preferred intercalating fluorescent dyes.
[0034]
The position of the DNA to which the intercalating fluorescent dye is bound via the linker is not hindered from intercalating into the double strand of the intercalating fluorescent dye, such as the 5 ′ end, 3 ′ end or the center of the DNA, And there is no restriction | limiting in particular unless the complementary coupling | bonding of a DNA part and RNA is inhibited.
[0035]
The amount of single-stranded RNA synthesized by the reagent (G) and the reagent (H) using double-stranded DNA having a promoter sequence as a template increases with time. In this reaction system, the fluorescence intensity increases in proportion to the amount of RNA synthesized by coexisting the reagent (I) having the above-mentioned properties having a sequence complementary to a specific sequence of the single-stranded RNA. It has been confirmed that (Ayumi of Medicine, 184 (3), 239-244, (1998); Nucleic Acid Research, 24 (24), 4992-4997 (1996))
The reagent (I) is allowed to coexist with a sample expected to contain the target RNA together with at least the reagents (A) to (H), and single-stranded RNA having an increasing specific base sequence is measured as a fluorescence signal. Here, even when the synthesized single-stranded RNA and the third oligonucleotide of the reagent (I) form a complementary bond and emit a fluorescence signal, this RNA is not contained in the reagents (A) to (C). It became clear that it functions as a template for DNA synthesis in the coexistence. That is, in the present invention, in the coexistence state of each reagent, a series of phenomena of cDNA synthesis from RNA, double-stranded DNA synthesis, and RNA synthesis from double-stranded DNA occurs in the presence of the third oligonucleotide. The fluorescence intensity increases in proportion to the increase.
[0036]
Instead of using the combination of the first to third single-stranded oligonucleotides of the reagent (A), the reagent (E) and the reagent (I), the first to third of the reagents (J) to (L) are used. A case where a combination of single-stranded oligonucleotides is used will be described.
[0037]
The reagent (J) is used in order from the 5 ′ end to (1) the promoter sequence of the DNA-dependent RNA polymerase, (2) the enhancer sequence of the promoter, and (3) the 3 ′ end sequence of the specific base sequence in the target RNA. A first single-stranded oligonucleotide having a complementary sequence. The part (3) of the reagent is complementarily bound to the 3 ′ end in the specific base sequence, and in the presence of the reagents (B), (C) and (D), as in the case of using the reagent (A). Thus, cDNA complementary to the target RNA is synthesized.
[0038]
The reagent (K) is a single-stranded oligonucleotide having a homologous sequence at the 5 ′ end of the specific base sequence of the target RNA. Double-stranded DNA having a promoter sequence of RNA polymerase by coexistence of reagent (C) and reagent (F) after complementary binding to the 3 ′ end of the specific base sequence of the cDNA Is synthesized.
Further, in the double-stranded DNA, the second single-stranded RNA complementary to the specific base sequence is synthesized by the coexistence of the reagent (G) and the reagent (H).
[0039]
Further, the 3 ′ end of the second RNA is complementarily bound to the reagent (K), and the second cDNA of the second RNA is synthesized in the presence of the reagents (B) to (D). The 3 ′ end of the second cDNA is complementarily bound to the (3) portion of the reagent (J), and double-stranded DNA containing a promoter sequence is synthesized by the reagent (C) and the reagent (F). ) And reagent (H) to synthesize the second RNA. The second RNA that is complementary to the synthesized specific base sequence becomes a source for the synthesis of new double-stranded DNA, and a series of reactions are repeated, resulting in a dramatic increase in the amount of the second RNA. Increase.
[0040]
The second RNA obtained here has a sequence complementary to a specific base sequence in the target RNA. The amount of the second RNA synthesized by the coexistence of the reagent (L) which is the third single-stranded oligonucleotide having the same sequence as the specific base sequence and labeled with an intercalating fluorescent dye The fluorescence intensity increases in proportion to
[0041]
In the present invention, it is also possible to analyze DNA containing a specific base sequence originally present in a sample. That is, if a double-stranded DNA having a transcribable promoter sequence prepared by a known method is used as a target nucleic acid, the double-stranded DNA can serve as a template for the amplification reaction, and an RNA transcript is generated by RNA polymerase. Because it is possible to do. As a method for preparing a double-stranded DNA having a transcribeable promoter sequence, for example, using a promoter primer and a DNA polymerase, a method for imparting a promoter sequence to a target DNA, or a DNA strand having a promoter sequence using a DNA ligase Examples of the method include binding to target DNA.
[0042]
The measurement of the fluorescence signal in the present invention is preferably carried out over time immediately after the addition of the reagents (A) to (I) or after a predetermined time has elapsed after the addition. The third DNA of reagent (I) repeatedly binds and dissociates with the synthesized RNA during the synthesis process of single-stranded RNA. The fluorescence signal measured at the time of binding indicates the amount of RNA present at each measurement. In order to reflect this, it is possible to track the increase in single-stranded RNA over time. The measurement itself may be continuous or intermittent at regular intervals. The fluorescent signal measuring apparatus does not constitute a part of the present invention, but any apparatus can be used as long as it can continuously or intermittently measure fluorescent signals in one or more reaction tubes. May be.
[0043]
The measurement time of the fluorescence signal includes the time when the fluorescence intensity of the test section containing a certain amount of target RNA increases, and the time when a significant difference is seen from the test section not containing the target RNA. The time until the fluorescence intensity of the included test section becomes substantially constant is approximately 4 hours, and 1 hour under suitable conditions.
[0044]
In the amplification and measurement of fluorescence intensity over time, the target RNA (initial RNA amount) originally present in the sample is reduced at a constant rate due to the relationship between the elapsed time of amplification reaction and the increase in fluorescence intensity. Based on the phenomenon that the time when the fluorescence intensity increases is delayed, a time satisfying a predetermined criterion is calculated, and the initial RNA amount is determined from the calculated time.
[0045]
The time satisfying the predetermined criteria used here is a constant fluorescence increase rate (of a predetermined time) compared to a control zone not containing the target RNA or a time when no significant increase in fluorescence intensity at the initial stage of the RNA amplification process is observed. (Fluorescence intensity value ÷ background fluorescence intensity value). More specifically, a time exceeding three times the standard deviation of the fluorescence increase rate in a predetermined time in a plurality of control sections not containing the target RNA can be used. In addition, in the relationship between the common logarithm of the fluorescence increase rate and the time, the time at which the common logarithmic value of the fluorescence increase rate increases significantly compared to the control section can be used.
[0046]
The time calculated according to a certain standard can be quantitatively analyzed even when the time at which the fluorescence increase rate per unit time is maximized in the fluorescence increase rate is used. Further, as an easily considered application example of the present analysis method, it is possible to analyze the fluorescence increase rate and time by performing mathematical processing such as differentiation, logarithmic display, approximate curve, and the like. Furthermore, the initial RNA amount may be determined by comparing the calculated time with at least two types of samples having different known concentrations.
[0047]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, this invention is not limited by these Examples.
[0048]
Example 1
For human hepatitis C virus RNA, a calibration curve was prepared for quantification of RNA originally present in the sample.
[0049]
(1) Base numbers 113 to 267 of human hepatitis C virus RNA (Kato et al., Proc. Natl. Sci., USA, 1990, 87, 9524 to 9528) are used as standard RNA samples and quantified by absorption at 260 nm in the ultraviolet region. Then, add 10 9 10 8 10 7 10 6 10 Five 10 Four Dilute to copy / 4 μl. Only the diluent was used for the control test group.
[0050]
Composition of RNA dilution
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
0.1 mM EDTA
(2) Dispense 21.2 μl of the reaction solution having the following composition into a 0.5 ml PCR tube (Gene Amp Thin-Walled Reaction Tubes, manufactured by PerkinElmer), add 4 μl of the above RNA sample, and then add mineral oil. 50 μl was overlaid.
[0051]
Composition of the reaction solution (each concentration is the concentration at 30 μl of the final reaction solution)
60 mM Tris-acetate buffer (pH 8.1)
13.5mM magnesium acetate
120 mM potassium acetate
16% sorbitol
10 mM DDT
0.5 mM each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP
1 mM each ATP, CTP, GTP, UTP
1.25 mM ITP
0.2 μM first oligonucleotide (SEQ ID NO: 1)
Second oligonucleotide with 0.2 μM SP6 promoter sequence
(SEQ ID NO: 2; in this sequence, the 5 ′ end from the 1st to the 17th base is the SP6 promoter sequence, and the 18th to 25th base is the enhancer sequence.)
Third oligonucleotide labeled with 0.025 μM intercalating fluorescent dye (FIG. 1, SEQ ID NO: 3; the dye is bound to the fifth C from the 5 ′ end in the sequence)
30 units Ribonuclease inhibitor
2% DMSO
Volumetric distilled water
(3) After the above reaction solution was kept at 50 ° C. for 5 minutes, 4.8 μl of enzyme solution having the following composition was added.
[0052]
Composition of enzyme solution
42 units AMV reverse transcriptase (Takara Shuzo)
171 units SP6 RNA polymerase (Takara Shuzo)
3μg bovine serum albumin
Volumetric distilled water
Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function that can directly measure the PCR tube, keep the temperature at 50 ° C, and measure the fluorescence intensity of the reaction solution in the PCR tube at an excitation wavelength of 490 nm and a fluorescence wavelength of 510 nm at intervals of 5 minutes. did.
[0053]
The above operation was performed 5 times for each sample.
[0054]
2 to 7 show the rate of increase in fluorescence at each sample concentration (fluorescence intensity value at a predetermined time ÷ background fluorescence intensity value) with the time when the enzyme solution was added as 0 minutes.
[0055]
The 0 copy sample using only the diluted solution was used as the control section, and the value obtained by adding 3 times the standard deviation to the average of the fluorescence increase rate after 60 minutes, that is, the average and minimum of the time when the fluorescence increase rate was 1.2 The regression line by the square method is shown in FIG. A straight line showing a good correlation with a correlation coefficient of −0.990 was obtained. The coefficient of variation for each concentration is 10 Four 4.4% in copy, 10 Five 2.1% for copy, 10 6 3.1% by copy, 10 7 7.4% for copy, 10 8 9.1% for copy, 10 9 The copy ratio was 4.2%, indicating good reproducibility.
[0056]
In the above fluorescence increase rate, the fluorescence increase rate per unit time, that is, the average of the time when [(fluorescence increase rate−fluorescence increase rate in the previous measurement) ÷ measurement interval (5 minutes)] is maximum and the least square method The regression line is shown in FIG. The correlation coefficient is −0.955, and the variation coefficient of each concentration is 10 Four 7.8% for copy, 10 Five 0% for copy, 10 6 7.2% by copy, 10 7 0% for copy, 10 8 0% for copy, 10 9 The copy was 11.9%.
[0057]
From the above, it was shown that a calibration curve with good reproducibility can be obtained by this method.
[0058]
Example 2
Reproducibility and specificity were verified for Sample A and Sample B containing standard RNA.
[0059]
(1) According to the method of Example 1, 10 Four -10 9 A standard curve was prepared using a copy of standard RNA. FIG. 10 shows a calibration curve based on the time when the fluorescence increase rate reaches 1.2, and FIG. 11 shows a calibration curve based on the time when the fluorescence increase rate per unit time becomes the maximum.
[0060]
(2) For 4 μl each of samples A and B containing standard RNA, add the reaction solution and enzyme solution in the same manner as in Example 1 in quadruplicate, and then keep the temperature at 50 ° C. and measure the fluorescence at 5-minute intervals. went. Samples A and B are each 10 Five Copy / 4 μl and 10 8 Prepared to contain 4 copies of standard RNA.
[0061]
(3) Table 1 shows the quantitative results. (The common logarithm of the initial RNA amount is expressed as an index value.) In Samples A and B, quantitative results almost identical to the theoretical values were obtained.
Quantification was possible within an error range within one digit in all test sections, and the coefficient of variation was within 5%, and the reproducibility was excellent. From the above, it was shown that the specific RNA concentration originally present in the sample can be quantified with good reproducibility by this method.
[0062]
[Table 1]
【The invention's effect】
As is clear from the above description, according to the present invention, the target RNA (single-stranded RNA) containing a specific base sequence in a sample can be obtained by a one-step manual operation performed at the start of the reaction at a substantially constant temperature. In addition, it is possible to rapidly analyze the amount of target RNA originally present in the sample.
[0064]
In the present invention, a double-stranded DNA having a promoter region of a DNA-dependent RNA polymerase at the terminal is synthesized based on the target RNA in the sample, and this becomes a synthesis source of a large amount of single-stranded RNA. The amount of single stranded RNA increased dramatically, and the fluorescence intensity increased in the process of measuring the increase in fluorescence due to the complementary binding of the probe labeled with the intercalating fluorescent dye to the generated single stranded RNA. By analyzing the process, the initial RNA amount can be determined easily and quickly.
[0065]
Moreover, this quantitative analysis method only changes the sequence of the first to third oligonucleotides, and in addition to quantitative analysis of virus-derived RNA in the clinical diagnosis field, quantitative analysis of pathogenic bacteria, antibiotic-resistant bacteria, etc. First, it enables quantitative analysis of microorganisms in food and soil.
[0066]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
1 is a chemical structure of the intercalator fluorescent dye part of the third oligonucleotide labeled with the intercalator fluorescent dye used in Example 1. FIG. B 1 ~ B Three Indicates a nucleobase.
2 is a graph of reaction time and fluorescence increase rate at each sample concentration (initial RNA amount) performed in Example 1. FIG.
3 is a graph of reaction time and fluorescence increase rate at each sample concentration (initial RNA amount) performed in Example 1. FIG.
4 is a graph of reaction time and fluorescence increase rate at each sample concentration (initial RNA amount) performed in Example 1. FIG.
5 is a graph of reaction time and fluorescence increase rate at each sample concentration (initial RNA amount) performed in Example 1. FIG.
6 is a graph of reaction time and fluorescence increase rate at each sample concentration (initial RNA amount) performed in Example 1. FIG.
7 is a graph of reaction time and fluorescence increase rate at each sample concentration (initial RNA amount) performed in Example 1. FIG.
8 shows a calibration curve prepared from the average of the time when the fluorescence increase rate reaches 1.2 in the relationship between the reaction time and the fluorescence increase rate at each concentration performed in Example 1. FIG. Error bars indicate ± standard deviation.
FIG. 9 is a calibration curve prepared from the average of the time at which the fluorescence increase rate becomes maximum in the relationship between the reaction time and the fluorescence increase rate at each concentration performed in Example 1. Error bars indicate ± standard deviation.
10 shows a calibration curve prepared from the time when the fluorescence increase rate reaches 1.2 in the relationship between the reaction time and the fluorescence increase rate at each concentration performed in Example 2. FIG.
11 shows a calibration curve prepared from the time at which the fluorescence increase rate becomes maximum in the relationship between the reaction time and the fluorescence increase rate at each concentration performed in Example 2. FIG.
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