KR100455457B1 - Process for sequencing of oligonucleotide and the anchor used for the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 길이가 짧은 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 효과적으로 분석하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프라이머 기능을 갖는 앵커를 올리고뉴클레오티드에 연결하여 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석함으로써, 별도의 시퀸싱용 프라이머를 사용하지 아니하면서 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 결정하는 방법에 대한 것이다.The present invention relates to a method for effectively analyzing the nucleotide sequence of a short oligonucleotide, and more particularly, by connecting the anchor having a primer function to the oligonucleotide to analyze the nucleotide sequence of the oligonucleotide, thereby preparing a separate sequencing primer It is about a method for determining the nucleotide sequence of the oligonucleotide without using.
Description
본 발명은 길이가 짧은 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 효과적으로 분석하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프라이머 기능을 하는 앵커를 올리고뉴클레오티드에 연결하여 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석함으로써, 별도의 시퀸싱용 프라이머를 사용하지 아니하고 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 결정하는 방법에 대한 것이다.The present invention relates to a method for effectively analyzing the nucleotide sequence of a short oligonucleotide, and more particularly, by linking an anchor serving as a primer to an oligonucleotide and analyzing the nucleotide sequence of the oligonucleotide, a separate primer for sequencing It is about a method of determining the nucleotide sequence of the oligonucleotide without using.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)본 DNA 중합효소를 사용하여 적은 양의 유전자를 대량으로 증폭하는 방법(Arnheim et al, Science 230, 1350 (1985))으로서, 분자생물학, 유전학, 생화학, 미생물학, 의학, 임상병리학 등에서 자주 사용되고 있다. 이러한 중합효소 연쇄 반응을 진행하기 위해서, 올리고뉴클레오티드가 프라이머로서 사용된다.Polymerase chain reaction (PCR) A method for amplifying large quantities of small genes using this DNA polymerase (Arnheim et al, Science 230, 1350 (1985)), which includes molecular biology, genetics, biochemistry, It is frequently used in microbiology, medicine and clinical pathology. To proceed with this polymerase chain reaction, oligonucleotides are used as primers.
또한, 중합효소 연쇄 반응 뿐만 아니라 뉴클레오티드의 염기 서열을 분석하기 위한 소위 "생거"반응을 수행하기 위해서는 이러한 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머가 사용된다.In addition, primers composed of such oligonucleotides are used to perform polymerase chain reactions as well as so-called "sanger" reactions for analyzing the nucleotide sequence of nucleotides.
현재까지는, 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드 합성을 위해서 β -시아노에틸포스포라미디트(β-cyanoethylphosphoramidite) 단량체를 이용한 방법(Kostor et al, Nucleic Acids Res 12 4539 (1984))이 사용되고 있다.To date, a method using β-cyanoethylphosphoramidite monomer (Kostor et al, Nucleic Acids Res 12 4539 (1984)) has been used for synthesizing oligonucleotides used as primers.
그러나, PCR이나 생거 반응에 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 비교적 길이가 짧기 때문에 목적하는 염기서열로 합성되었는지 여부를 확인하는 것이 길이가 긴 핵산의 경우에 비하여 용이하지 아니하였다.However, since oligonucleotides used as primers in PCR or Sanger reactions are relatively short in length, it was not easy to check whether the oligonucleotides were synthesized in the desired nucleotide sequence compared to the case of long nucleic acids.
이러한 점은, 생거법에 의한 염기서열 분석에 있어서, 뉴클레오티드의 양 말단의 염기에 대응하는 절편들이 상대적으로 적게 생성되고 뉴클레오티드의 중간 부위의 염기에 대응하는 절편들이 상대적으로 많이 생성되므로, 이들 절편들을 분자량 순서로 분리시키는 경우에 양 말단 부분의 염기들을 표지하는 밴드들의 해상도가 낮기 때문이다.This is because in biosequence analysis, relatively few fragments corresponding to bases at both ends of the nucleotides are generated and relatively many fragments corresponding to bases in the middle region of the nucleotides are generated. This is because the resolution of the bands that label the bases of both terminal portions when the molecular weight is separated in order is low.
프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열 확인을 위해 지금까지 개발된 방법으로는, 이차원 종이전기영동법(Brownleer, G.G. and Sanger, F. Eur., J. Biochem, 11, 395-399(1969))과 고속원자충돌(fast atom bombardment, FAB) 질량 분석법(Blocker et al, Nucleic Acids Res 10(15), 4671)과 같은 방법이 알려져있다.The methods developed so far to identify the nucleotide sequence of the oligonucleotide used as a primer include two-dimensional paper electrophoresis (Brownleer, GG and Sanger, F. Eur., J. Biochem, 11, 395-399 (1969)) and Methods such as fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry (Blocker et al, Nucleic Acids Res 10 (15), 4671) are known.
이차원 종이전기영동법은 방사성 등위원소로 표지된 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 분해시킨 다음, 그 분해산물을 이차원 종이를 매질로하여 고압의 전위차를 가하여 전기영동하여 염기서열을 결정하는 방법이다. 이때 종이상 매질의 pH를 3.5로 조정하여, 각 올리고뉴클레오티드 절편들의 이온화도를 서로 다르게 함으로써 전기영동시에 이동상이 각 뉴클레오티드 절편마다 서로 달라지게 하는 것이다.Two-dimensional paper electrophoresis is a method of partially lysing an oligonucleotide labeled with radioisotopes and then electrophoresing the resulting product by using a two-dimensional paper as a medium and adding a high-potential potential difference to determine the base sequence. At this time, by adjusting the pH of the paper medium to 3.5, the degree of ionization of each oligonucleotide fragment is different so that the mobile phase is different for each nucleotide fragment during electrophoresis.
그러나, 상기 종이 전기영동법에 의한 염기서열 결정 방법은 각 뉴클레오티드의 이동상이 항상 일정하지 아니하고 각 올리고뉴클레오티드 절편마다 달라지므로 각 올리고뉴클레오티드 절편의 이동상의 각도에 의해 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 추정할 수 밖에 없다는 단점이 있다.However, in the method of determining the sequence by the paper electrophoresis method, since the mobile phase of each nucleotide is not always constant and varies for each oligonucleotide fragment, the base sequence of the oligonucleotide cannot be estimated by the angle of the mobile phase of each oligonucleotide fragment. There are disadvantages.
고속원자충돌(fast atom bombardment, FAB) 질량분석법은 종이 전기영동법보다 개선된 방법으로서, 올리고뉴클레오티드에 크세논(xenon)을 이용한 원자총(atom gun)을 사용하여 중성자(neutral atom) 빔을 조사하여 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 결합을 파괴시켜 여러 종류의 분해물을 생성시키고, 이 들 분해물들을 이용하여 질량을 확인하여 염기서열을 유추해내는 방법이다.Fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry is an improvement over paper electrophoresis, which involves irradiating a neutron beam with an atom gun using xenon on an oligonucleotide. It breaks down the phosphodiester bonds of nucleotides to produce various kinds of degradation products, and uses these degradation products to check the mass to infer the sequence.
그러나, 상기 FAB 질량분석법을 이용한 염기서열 결정방법은 10개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 결정할 수 없으며, 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다.However, the nucleotide sequence determination method using the FAB mass spectrometry cannot determine the nucleotide sequence of the oligonucleotide consisting of 10 or more nucleotides, and has the disadvantage of requiring expensive equipment.
따라서, 당 업계에서는 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 보다 정확하고 간편한 방법으로 확인할 수 있는 방법의 개발이 요구되어 왔다.Therefore, there is a need in the art for the development of a method that can identify the nucleotide sequence of the oligonucleotide in a more accurate and simple way.
따라서, 본 발명의 목적은 짧은 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 별도의 시퀸싱용 프라이머를 사용하지 아니하면서 분석할 수 있는 방법으로서, 프라이머 역할을 수행할 수 있는 형상의 앵커를 올리고뉴클레오티드에 연결하여 염기서열을 분석함으로써, 종래의 서열분석방법으로는 용이하지 아니하였던 짧은 길이의 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to analyze the nucleotide sequence of the oligonucleotide having a short length without using a separate sequencing primer, by connecting the anchor of the shape capable of acting as a primer to the oligonucleotide By analyzing the nucleotide sequence, it is to provide a method for analyzing the nucleotide sequence of the oligonucleotide of short length, which was not easy by the conventional sequencing method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발명에 사용되는 앵커로서, 염기서열분석 반응시에 프라이머 역할을 수행할 수 있는 말단부를 갖는 앵커를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an anchor having an end portion capable of acting as a primer in a sequencing reaction as an anchor used in the present invention.
도 1은 단일가닥 핵산의 염기서열 결정에 사용되는 본 발명의 프라이머형 앵커 중, 헤어핀 프라이머의 구조를 나타낸다.1 shows the structure of a hairpin primer in the primer-type anchor of the present invention used for determining the nucleotide sequence of a single-stranded nucleic acid.
도 2는 본 발명의 프라이머형 앵커 중, 헤어핀 프라이머형 앵커를 이용한 단일가닥 핵산의 염기서열 결정에 대한 결과를 나타낸다.Figure 2 shows the results of the base sequence determination of the single-stranded nucleic acid using the hairpin primer-type anchor of the primer-type anchor of the present invention.
본 발명의 목적을 달성하기 위한, 프라이머 기능을 갖는 앵커는 이중가닥, 부분 이중가닥, 헤어핀 구조등 다양한 형태로 제조될 수 있으나, 바람직하게는 헤어핀 구조를 갖는 부분 이중가닥 앵커이다.In order to achieve the object of the present invention, the anchor having a primer function may be prepared in various forms such as double strand, partial double strand, hairpin structure, but is preferably a partial double strand anchor having a hairpin structure.
본 발명에서, "앵커"라 함은 염기서열을 분석하고자 하는 올리고뉴클레오티드의 한 쪽 말단에 연결시키는 뉴클레오티드로서, 염기서열이 이미 알려진 뉴클레오티드를 의미한다.In the present invention, the term "anchor" refers to a nucleotide linking a nucleotide sequence to one end of an oligonucleotide to be analyzed, and refers to a nucleotide whose base sequence is known.
본 발명에서 "헤어핀(Hair pin)" 구조라 함은 파보바이러스(Pavovirus)등 여러 종류의 단일가닥 유전자(Fabisch et al, J Virol 1979 Jun; 30(3): 946-950), 리보자임(ribozyme)등에서 발견되며(Kool et al Nucleic Acid Res 26 3235 (1988)), 스스로 이중가닥을 형성할 수 있는 뉴클레오티드의 구조를 의미한다(도1).In the present invention, the term "hair pin" refers to various types of single-stranded genes such as Pavovirus (Fabisch et al, J Virol 1979 Jun; 30 (3): 946-950), ribozyme (Kool et al Nucleic Acid Res 26 3235 (1988)), etc., and refers to the structure of nucleotides that can form a double strand by themselves (Fig. 1).
본 발명의 "프라이머 기능을 갖는 앵커"라 함은, 상기 앵커로서의 역할과 중합효소 연쇄반응시에 프라이머로서의 역할을 동시에 수행할 수 있는 뉴클레오티드를 의미한다.As used herein, the term "anchor having a primer function" means a nucleotide capable of simultaneously acting as an anchor and as a primer in a polymerase chain reaction.
본 발명의 "프라이머 기능을 갖는 앵커"의 5' 말단은 염기서열을 분석하고자 하는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킨다. 이렇게 제작된 주형(template)뉴클레오티드에서는, 염기서열 미지의 올리고뉴클레오티드의 3' 말단부는 전체 주형 중에서 중간 부분에 위치하게 되어, 염기서열 분석 반응시에 이들 부위에 대응하는 말단 염기를 갖는 절편이 상대적으로 많이 생성되므로 올리고뉴클레오티드의 염기서열 표지 신호의 해상도가 향상된다.The 5 'end of the "anchor with primer function" of the present invention is linked to the 3' end of the oligonucleotide to be analyzed. In the template nucleotide thus prepared, the 3 'terminal portion of the unknown nucleotide sequence is located in the middle portion of the entire template, so that fragments having terminal bases corresponding to these sites are relatively relatively present in the sequencing reaction. Since a large number is generated, the resolution of the nucleotide sequence labeling signal of the oligonucleotide is improved.
본 발명의 "프라이머 기능을 갖는 앵커"의 형태는 5' 말단에 서열 분석 대상 올리고뉴클레오티드가 연결될 수 있고, 앵커의 3' 말단 부분이 프라이머 역할을 수행 할 수 있는 모든 형태를 포함한다.The form of the "anchor having a primer function" of the present invention includes all forms in which the oligonucleotide to be sequenced can be linked to the 5 'end, and the 3' end portion of the anchor can serve as a primer.
본 발명의 "프라이머 기능을 갖는 앵커"는 부분 이중가닥의 앵커일 수 있으며, 이는 길이가 상이한 두 가닥의 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 길이가 긴 가닥의 5' 말단에는 올리고뉴클레오티드가 연결되고, 길이가 짧은 가닥의 3' 말단은 프라이머로서 작용한다.The "anchor with primer function" of the present invention may be an anchor of a partial double strand, which consists of two oligonucleotides of different lengths. Oligonucleotides are linked to the 5 'end of the long strand, and the 3' end of the short strand acts as a primer.
또한, 본 발명의 "프라이머 기능을 갖는 앵커"는 단일가닥의 뉴클레오티드로서, 3' 말단 부위의 염기서열에 역 반복구간(inverted repeat)이 존재하여 하나의 단일가닥 뉴클레오티드가 접어진 채 일부분이 이중가닥 핵산의 형태를 나타내는 형태일 수 있으며, 이는 헤어핀 구조를 갖는 형태일 수 있다.In addition, the "anchor having a primer function" of the present invention is a single-stranded nucleotide, and an inverted repeat exists in the nucleotide sequence of the 3 'terminal portion, so that one single-stranded nucleotide is folded and a portion is double-stranded. It may be a form representing the form of the nucleic acid, it may be a form having a hairpin structure.
본 발명의 헤어핀 구조의 앵커는 별도의 프라이머를 첨가할 필요가 없이 올리고뉴클레오티드와 헤어핀 구조 앵커의 5' 말단을 연결시키면 앵커의 3' 말단 부위가 프라이머로서의 기능을 수행한다.In the anchor of the hairpin structure of the present invention, when the oligonucleotide is connected to the 5 'end of the hairpin structure anchor without the need for adding a separate primer, the 3' end portion of the anchor performs a function as a primer.
본 발명의 헤어핀 구조의 앵커는 낮은 온도에서는 부분 이중가닥으로 존재하지만 온도를 높이거나, 변성화 물질을 처리해 줄 경우 단일가닥으로 변형이 가능하다. 염기서열 결정 반응에 효율적으로 사용될 수 있으며, 생성된 각 절편들을 겔상에서 분자랑 순서대로 분리하는 경우에도 변성화 물질로 인하여, 헤어핀 구조의 이중가닥 부분이 단일가닥으로 변화되어 전기영동 겔 상에서의 분리가 용이하다.The anchor of the hairpin structure of the present invention exists as a partial double strand at a low temperature, but can be transformed into a single strand when increasing the temperature or treating the denatured material. It can be used efficiently for sequencing reactions, and even when the resulting fragments are separated from the gel in the order of molecules, due to the denatured material, the double-stranded portion of the hairpin structure is changed to a single strand and separated on the electrophoretic gel. Is easy.
또한, 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 헤어핀 구조를 갖는 앵커에 연결시킨 다음, 공지의 생거(Sanger) 서열결정법으로 서열결정 반응을 수행할 수 있으며, 생성된 절편들을 겔 상에서 분리시킬때 서로 결합되지 아니한 본 발명의 앵커와 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 짧기 때문에, 서열결정 반응에 의해 생성된 절편들과는 확연히 구분되므로, 올리고뉴클레오티드의 염기서열 결정에 방해가 되지는 아니한다.In addition, the oligonucleotide can be linked to the anchor having the hairpin structure of the present invention, and then a sequencing reaction can be performed by a known Sanger sequencing method, and the resulting fragments are not bound to each other when separated from the gel. Since the anchor and oligonucleotide of the present invention are short in length, they are clearly distinguished from fragments generated by the sequencing reaction, and thus do not interfere with the determination of the nucleotide sequence of the oligonucleotide.
따라서, 본 발명의 프라이머형 기능을 갖는 앵커를 이용하여 서열 미지의 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석하는 경우, 별도의 프라이머의 첨가가 요구되지 아니하며, 올리고뉴클레오티드와 앵커의 연결에 의해 생성되는 비교적 긴 길이의 뉴클레오티드의 염기서열을 분석하게되어 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 보다 정확하게 알 수 있다.Therefore, when analyzing the nucleotide sequence of the unknown oligonucleotide using the anchor having the primer function of the present invention, the addition of a separate primer is not required, and a relatively long length generated by linkage of the oligonucleotide and the anchor By analyzing the nucleotide sequence of the oligonucleotide can be found more precisely the nucleotide sequence of the oligonucleotide.
본 발명의 "올리고뉴클레오티드"는 통상 4 내지 100, 바람직하게는 4 내지 80, 보다 바람직하게는 5 내지 30의 염기쌍으로 이루어진 단일가닥 뉴클레오티드를 의미한다. 이들 단일가닥 뉴클레오티드는 비교적 짧은 길이의 올리고뉴클레오티드로서 PCR이나 각종 염기서열 결정 방법에 사용되는 프라이머이거나, DNA Chip등에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 의미한다."Oligonucleotide" of the present invention means a single stranded nucleotide consisting of 4 to 100 base pairs, preferably 4 to 80 bases, more preferably 5 to 30 base pairs. These single-stranded nucleotides are oligonucleotides of relatively short length, and are primers used for PCR or various nucleotide sequence determination methods, or oligonucleotides used for DNA chips and the like.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명의 프라이머 기능을 갖는 앵커들 중에서 선택하는 어느 하나의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드를 연결하는 단계, 올리고뉴클레오티드에 연결된 상기 프라이머 기능을 갖는 앵커의 3' 말단으로부터 핵산 중합 효소를 사용하여 중합반응을 진행시키는 단계, 상기 중합반응의 결과로 얻어진 절편들을 겔 상에서 전기영동시키는 단계 및 겔 상에 분리된 핵산 단편들을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드의 염기서열 결정방법을 제공함으로써 달성된다.Another object of the present invention is to connect an oligonucleotide to any 5 'end selected from the anchors having a primer function of the present invention, and nucleic acid from the 3' end of the anchor having the primer function linked to the oligonucleotide. A base of the oligonucleotide comprising the step of proceeding the polymerization using a polymerase, electrophoresis of the fragments resulting from the polymerization and detecting the nucleic acid fragments separated on the gel. By providing a method of sequencing.
프라이머 기능을 갖는 앵커의 5' 말단을 인산화시킴으로써 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 수산기와 연결시킬 수 있으며, 앵커와 올리고뉴클레오티드를 연결시키기 위해 핵산 리가아제, 바람직하게는 T4 RNA 리가아제가 사용될 수 있다.Phosphorylation of the 5 'end of the anchor with primer function can be linked to the hydroxyl group of the 3' end of the oligonucleotide, and nucleic acid ligase, preferably T4 RNA ligase, can be used to link the anchor with the oligonucleotide.
본 발명의 상기 중합반응 단계에 있어서, 여러가지의 핵산 중합효소가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 짧은 올리고뉴클레오티드 절편들을 다수 생성시키기 위해서 Taq 폴리머라제가 사용될 수 있다. 이는 Taq 폴리머라제에 의한 중합과정에서는 주형의 5' 말단에 도달하게 되면 아데노신-트리포스페이트를 연결시키기 때문에(Nucleic Acids Res 16, 9677 (1988)), 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 마지막염기 서열까지 결정할 수 있기 때문이다.In the polymerization step of the present invention, various nucleic acid polymerases may be used, but preferably, Taq polymerase may be used to generate a plurality of short oligonucleotide fragments. In the polymerization process by Taq polymerase, when the 5 'end of the template is reached, the adenosine-triphosphate is connected (Nucleic Acids Res 16, 9677 (1988)), and thus the final base sequence of the 5' end of the oligonucleotide is determined. Because it can.
본 발명의 전기 영동 단계에 있어서는, 아크릴아미드 겔이 바람직하게 사용된다.In the electrophoresis step of the present invention, acrylamide gel is preferably used.
본 발명의 상기 검출 단계에 있어서, 검출을 위해서 기존의 공지된 방사성 동위원소, 형광물질을 사용하는 등 여러 가지 방법들이 이용될 수 있으나 은염색법이 바람직하게 사용된다.In the detection step of the present invention, various methods such as using a conventionally known radioisotope, fluorescent material, etc. may be used for the detection, but silver dyeing is preferably used.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 이하에 기재된 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the protection scope of the present invention is not limited to the Examples described below.
실시예 1 : 프라이머 기능을 갖는 헤어핀 구조의 앵커의 제작Example 1 Preparation of Anchor of Hairpin Structure Having Primer Function
도 1에 도시된 바와 같이, 5' 말단부분은 단일가닥을 이루고, 나머지 부분이 상보적인 염기서열로서 이중가닥을 형성하는 헤어핀 구조를 갖는 프라이머형 앵커를 디자인한 후, 자동합성기(퍼셉티브 바이오시스템즈 모델 8909/8909)로 합성하였다. 프라이머형 앵커는 뉴클레오티드 38개가 연결된 올리고뉴클레오티드이며, 이중가닥을 이루는 부위의 Tm값은 49℃로 나타났다.As shown in FIG. 1, after designing a primer-type anchor having a hairpin structure in which the 5 'terminal portion forms a single strand and the remaining portion forms a double strand as a complementary base sequence, an automatic synthesizer (Perceptive Biosystems) Model 8909/8909). The primer-type anchor is an oligonucleotide to which 38 nucleotides are linked, and the Tm value of the double stranded site is 49 ° C.
실시예 2 : 실시예 1의 헤어핀 구조를 갖는 앵커를 이용한 올리고뉴클레오티드 염기서열 결정Example 2 Oligonucleotide Sequence Determination Using Anchor Having a Hairpin Structure of Example 1
실시예 1에서 합성된 프라이머형 앵커의 5' 말단을 인산화시킨 후, 서열결정하고자 하는 미지의 올리고뉴클레오티드 혼합물에 첨가하였다. 그 후, 헤어핀 구조의 프라이머형 앵커의 인산화된 5' 말단과 서열결정하고자 하는 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 수산기(-OH group)를 T4 RNA 리가아제를 사용하여 결합시켰다. 결합반응은 20℃에서 약 16시간을 반응시켰다.The 5 'end of the primer-type anchor synthesized in Example 1 was phosphorylated and then added to the unknown oligonucleotide mixture to be sequenced. Thereafter, the phosphorylated 5 'end of the hairpin structured primer anchor and the 3' end of the oligonucleotide to be sequenced (-OH group) were bound using T4 RNA ligase. The coupling reaction was reacted at 20 ° C. for about 16 hours.
그 후, 반응액을 서열결정 반응에 첨가하여 서열결정을 수행하였다. 서열결정 반응은 생거 등이 개발한 디데옥시뉴클레오티드를 이용한 DNA 폴리머라제 사슬 종결법을 이용하였는데, 올리고뉴클레오티드를 증폭시키기 위해서 DNA 폴리머라제로서는 Taq 폴리머라제를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응후, 그 반응물을 아크릴아미드 겔상에서 한 염기차이로 분리되도록 전개한 후, 은 염색을 하여 서열을 확인하였다. 그 결과 미지의 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 도 2에 도시된 바와 이 정확하게 확인할 수 있었다.Thereafter, the reaction solution was added to the sequencing reaction to perform sequencing. The sequencing reaction was performed by DNA polymerase chain termination using dideoxynucleotide developed by Sanger et al. In order to amplify the oligonucleotide, PCR was performed using Taq polymerase as the DNA polymerase. After the reaction, the reaction was developed to be separated by one base difference on acrylamide gel, and then stained with silver to confirm the sequence. As a result, the nucleotide sequence of the unknown oligonucleotide could be confirmed exactly as shown in FIG.
본 발명의 프라이머 기능을 갖는 앵커를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석하는 경우, 종래의 올리고뉴클레오티드 염기서열 결정 방법에 비해 별도의 프라이머를 첨가하는 공정을 생략할 수 있으므로 보다 간편한 방법으로 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 분석할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 통하여는 종래의 생거법으로 용이하게 분석할 수 없었던 비교적 짧은 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 보다 정확하게 분석할 수 있으므로, PCR 및 DNA Chip, 각종 검출 키트등에 프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위해 제작되는 올리고뉴클레오티드의 염기서열을 간편하고 정확하게 분석하면서 바이오테크놀로지 관련 산업에 기여할 수 있다.When analyzing the nucleotide sequence of the oligonucleotide using an anchor having a primer function of the present invention, since the step of adding a separate primer can be omitted as compared to the conventional method for determining oligonucleotide sequencing, The sequence can be analyzed. In addition, the method of the present invention can more accurately analyze the nucleotide sequence of a relatively short oligonucleotide that could not be easily analyzed by a conventional living method. Simple and accurate analysis of nucleotide sequences of oligonucleotides produced in order to contribute to the biotechnology industry.
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| KR10-1998-0040087A KR100455457B1 (en) | 1998-09-26 | 1998-09-26 | Process for sequencing of oligonucleotide and the anchor used for the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20000021138A KR20000021138A (en) | 2000-04-15 |
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Family
ID=19552050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-1998-0040087A KR100455457B1 (en) | 1998-09-26 | 1998-09-26 | Process for sequencing of oligonucleotide and the anchor used for the same |
Country Status (1)
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR870000429A (en) * | 1985-06-17 | 1987-02-18 | 일리노이즈 주립대학 이사회 | Method for sequencing oligonucleotides using reversed phase chromatography |
| WO1998029567A1 (en) * | 1996-12-31 | 1998-07-09 | Bioneer Corporation | A method for high-sensitive silver staining |
| US5798210A (en) * | 1993-03-26 | 1998-08-25 | Institut Pasteur | Derivatives utilizable in nucleic acid sequencing |
-
1998
- 1998-09-26 KR KR10-1998-0040087A patent/KR100455457B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR870000429A (en) * | 1985-06-17 | 1987-02-18 | 일리노이즈 주립대학 이사회 | Method for sequencing oligonucleotides using reversed phase chromatography |
| US5798210A (en) * | 1993-03-26 | 1998-08-25 | Institut Pasteur | Derivatives utilizable in nucleic acid sequencing |
| WO1998029567A1 (en) * | 1996-12-31 | 1998-07-09 | Bioneer Corporation | A method for high-sensitive silver staining |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chromatography of 32P-labelled oligonucleotides on thin layers of DEAE-cellulose. Eur J Biochem. 1969 Dec;11(2):395-9 * |
| Ultrafast sequencing of oligodeoxyribonucleotides by FAB-mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1982 Aug 11;10(15):4671-8 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20000021138A (en) | 2000-04-15 |
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