KR20210003776A - 화학적으로-정의된 바큘로바이러스 발현 시스템 및 세포 배양 배지 - Google Patents

화학적으로-정의된 바큘로바이러스 발현 시스템 및 세포 배양 배지 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 일반적으로 곤충 세포에서 바큘로바이러스로부터 재조합 단백질의 고수준 발현을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에서 기재된 방법 및 시스템은 화학적으로 정의된, 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지를 이용하여 곤충 세포에서 높은 수준의 단백질 생성 및/또는 곤충 세포에서 높은 수준의 바큘로바이러스 생성을 허용한다. 본 개시내용은 또한 재조합 단백질을 곤충 세포에서 배양, 트랜스펙션, 및/또는 생성하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

화학적으로-정의된 바큘로바이러스 발현 시스템 및 세포 배양 배지
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 4월 12일자로 출원된 미국 특허 임시출원 제62/656,868호의 우선권을 주장하고, 그 전체내용이 본원에 참고로 포함된다.
세포 배양 배지는 제어된, 인위적 시험관 내 환경에서 세포를 유지하고 성장시키는데 필요한 영양소를 제공한다. 세포 배양 배지의 특성 및 제형은 특정 세포 요구사항에 따라 가변적이다. 중요한 매개변수에는 삼투압, pH 및 영양분 조성물이 포함된다.
세포 배양 배지 제형물은 문헌에 잘 문서화되어 있으며 다수의 배지가 시판 중이다. 세포 배양 배지의 전형적인 구성요소에는 아미노산, 유기 및 무기 염, 비타민, 미량의 금속, 당, 지질 및 핵산이 포함되며, 이들의 유형 및 양은 주어진 종, 세포 또는 조직 유형의 특정 요구사항에 따라 달라질 수 있다.
배지 제형물이 동물, 식물 및 박테리아 세포를 포함한 몇 가지의 세포 유형을 재배하는데 사용되고 있다. 재배된 세포는 생리학적 과정 연구 및 유용한 생물학적 물질의 생산을 비롯한 다수의 용도를 지닌다. 이러한 유용한 생산물의 예에는 모노클로날 항체, 호르몬, 성장 인자, 효소 등이 포함된다. 이러한 생산물은 상업적으로 및 치료학적으로 다수 적용되고, 재조합 DNA 기술의 출현으로, 세포를 조작하여 이들 생산물을 다량 생산할 수 있다. 배양된 세포는 또한 벡터 및/또는 백신으로서 사용될 수 있는 바이러스의 단리, 동정 및 성장에 일상적으로도 사용된다. 따라서, 시험관 내 세포 재배 능력은 세포 생리학 연구에 중요할 뿐 아니라 비용 효율적인 수단으로써 달리 얻을 수 없는 유용한 물질의 생산에도 필수적이다.
재조합 단백질 생산에 통상적으로 곤충 세포 배양이 이용된다. 원핵세포와 달리, 곤충 세포는 기초 연구와 대규모 생산 모두를 위해 복잡한 번역 후 개질로 대량의 단백질을 발현할 수 있다. 곤충 세포는 또한 멀티머 단백질, 바이러스-유사 입자, 및 포유류 세포에 독성인 단백질의 발현에 적합한 숙주이다. CERVARIX™, PROVENGE™, GLYBERA™, 및 FLUBLOK™을 포함한, 몇몇의 FDA 승인된 백신 및 치료요법은 곤충 세포에서 바큘로바이러스 발현을 이용한다. 특히, Sf9 세포는 재조합 바큘로바이러스 스톡을 단리 및 번식시키고 재조합 단백질을 생산하는데 통상적으로 이용된다. 본래의 Sf9 세포는 밤나방과나방(fall army worm)인 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 번데기 난소 조직으로부터 유래된 부모 IPLBSF-21 (Sf21) 세포주에서 클로닝되었다.
전형적으로, 세포 배양 배지 제형물에는 소태아혈청(FBS) (5-20% v/v) 또는 동물 배아, 기관 또는 샘(gland)으로부터의 추출물 (0.5-10% v/v)과 같은 한정되지 않은 성분들을 포함한 다양한 첨가제가 보충된다. 곤충 세포 배지는 종종 이스톨레이트(yestolate)로 불리우는 효모 용해물(lysate)로 보충된다. 이스톨레이트는 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cervisiae)를 포함한 양조 효모 또는 빵 효모와 같은 효모 세포의 자가용해 후 수득된 효모 추출물이다. 이스톨레이트는 복합 혼합물이며, 세포 성장 촉진을 담당하는 성분은 확인되어 있지 않다.
이러한 화학적으로 정의되지 않은 보충물은 세포 배양 배지에서 여러 유용한 기능을 제공한다. 예를 들어, 이들 보충물은 불안정하거나 수불용성인 영양소에 대한 담체 또는 킬레이터를 제공하고; 독성 모이어티(moiety)를 결합 및 중화하고; 호르몬 및 성장 인자, 프로테아제 저해제 및 필수, 종종 동정되지 않거나 정의되지 않은 저분자량 영양소를 제공하고; 물리적 스트레스 및 손상으로부터 세포를 보호한다. 따라서, 혈청, 기관/샘 추출물 또는 효모 추출물은 세포 배양을 위한 최적의 배양 배지를 제공하기 위해 비교적 저렴한 보충물로서 통상 이용된다.
불행하게도, 조직 배양 응용에서 혈청, 기관/샘 추출물 또는 효모 추출물의 이용은 몇 가지 단점이 있다. 예를 들면, 이들 보충물 및 혈청의 화학적 조성이 로트(lot)간, 심지어는 단일 제조업체에서도 다르다. 보충물은 또한 배양된 세포의 건강 및 최종 생성물의 품질을 심각하게 약화시킬 수 있는 감염원(예, 마이코플라스마 및 바이러스)으로 오염될 수 있다. 이들 혈청 또는 추출물로부터의 정의되지 않은 성분을 이용하면 배양된 세포의 영양 및 호르몬 요건에 대한 진정한 정의 및 설명이 막힌다. 마지막으로 그리고 가장 중요하게 생물학적 물질의 산업적 생산에서 세포 배양 배지를 이용하는 이들에게, 배양 배지의 혈청, 기관/샘 추출물 또는 효모 추출물 보충은 혈청 또는 추출물 단백질의 비특이적 공동-정제로 인해, 배양 배지에서 원하는 물질의 정제를 복잡하게 만들 수 있고 그 비용을 증가시킬 수 있다.
화학적으로 정의된, 효모 용해물-미함유 무혈청 및 동물성 생성물-미함유 곤충 세포 배지뿐만 아니라 배양된 곤충 세포에서 바큘로바이러스 및/또는 단백질의 개선된 생성을 위한 시스템 및 방법이 여전히 요구된다.
본 개시내용은 특히 바큘로바이러스 발현 시스템, 이의 다양한 성분, 및 바큘로바이러스 또는 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템 및/또는 이의 성분의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 하기를 포함한다:
(a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지; 및
(b) 복수의 Sf9 세포.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 추가로 단백질 발현 인핸서(enhancer)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A 또는 발프로산이다.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현은 트랜스펙션 시약을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 또는 중합체계 트랜스펙션 시약이다.
일부 구현예에서, 배지는 곤충 세포 배지이다.
일부 구현예에서, 복수의 Sf9 세포는 배지에서 현탁 배양으로 성장할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 Sf9 세포는 배지에서 고밀도 성장할 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 밀리리터 당 약 2 x 106 내지 약 2 x 108 세포 (세포/mL)의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 배지는 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기 염을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 토코페롤, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 비타민을 포함한다.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 바큘로바이러스 벡터를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 부분적으로 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기염; 및 비타민을 포함하는 곤충 세포 배양을 위한 배지에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 무기염의 양은 곤충 세포의 성장을 지지하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 배지는 화학적으로 정의되고 효모 가수분해물-미함유 배지이다. 일부 구현예에서, 배지는 단백질을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 배지는 혈청을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 배지는 동물로부터 유래된 성분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 비타민은 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 토코페롤, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비타민의 양은 곤충 세포의 성장을 지지하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 배지는 곤충 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 당을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 당은 말토오스, 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스, 프룩토오스, 만노오스, 락토오스, 갈락토오스, 덱스트로오스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 곤충 세포를 성장시키는 방법은 본원에서 기재된 바와 같은 배지에서 곤충 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 부분적으로 하기를 포함하는 바큘로바이러스 생성 방법에 관한 것이다:
(a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계;
(b) 세포를 박미드(bacmid)로 트랜스펙션시키는 단계; 및
(c) 곤충 세포 배양으로부터 바이러스를 수확하는 단계.
일부 구현예에서, 세포는 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 또는 중합체계 트랜스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션된다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 현탁 배양된다.
일부 구현예에서, 트랜스펙션 단계는 곤충 세포가 밀리리터 당 1 x 106 세포 (세포/mL) 내지 2 x 107 세포/mL의 생존 세포 밀도로 존재할 때 수행된다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션 단계는 곤충 세포가 ≥ 90% 생존가능할 때 수행된다.
일부 구현예에서, 배지는 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기염을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 토코페롤, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 비타민을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 트랜스펙션 단계 후 신선한 배지로 변경, 재충전, 대체, 또는 보충되지 않는다.
일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 밀리리터 당 적어도 5 x 107개의 감염성 바이러스 입자(IVP/mL)의 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 1 x 108 IVP/mL 이상의 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 5 x 107 IVP/mL 내지 1 x 1010 IVP/mL의 역가를 갖는다.
본 개시내용은 부분적으로 하기를 포함하는 바큘로바이러스로부터의 단백질 생성 방법에 관한 것이다:
(a) 화학적으로 정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 단백질을 발현하는 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계.
일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서가 단계 (b) 이전에 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 적어도 감염되기 10시간 전에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 감염되기 12시간 내지 36시간 전에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 감염되기 18시간 내지 24시간 전에 첨가된다.
일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 리코스타틴 A 또는 발프로산이다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 배지에서 고밀도 성장이 가능하다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 밀리리터 당 약 2 x 106 내지 약 2 x 108 세포 (세포/mL)의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 현탁 배양된다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 부착 배양된다.
일부 구현예에서, 감염 단계는 곤충 세포가 밀리리터 당 3 x 106 세포 (세포/mL) 내지 1 x 107 세포/mL의 생존 세포 밀도로 존재할 때 수행된다. 일부 구현예에서, 감염 단계는 곤충 세포가 ≥ 80% 생존가능할 때 수행된다.
일부 구현예에서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스는 1 내지 10의 감염 다중도(MOI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스는 3 내지 7의 MOI를 갖는다. 일부 구현예에서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스는 약 5의 MOI를 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 단백질을 생성하기 위해 일정 시간 동안 감염된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (d) 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a) 내지 (d)는 5일 내지 15일이 걸린다. 일부 구현예에서, 단백질은 감염 후 약 24시간 내지 약 120시간에 수확된다.
일부 구현예에서, 배지는 단백질 생성 동안 신선한 배지로 대체, 재충전 또는 보충되지 않는다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 부착 배양된다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 현탁 배양된다.
본원에서 기재된 양태 및 구현예 각각은 구현예 또는 양태의 맥락에서 명시적으로 또는 명확하게 배제되지 않는 한 함께 사용될 수 있다.
도 1a는 화학적으로 정의된, 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지(굵은 선) 또는 효모 용해물(이스톨레이트; 얇은 선)을 함유하는 곤충 세포 배지에서 성장한 Sf9 세포에 대한 생존 세포 밀도(VCD; 실선) 및 생존력%(점선)를 나타내는 선 그래프이다.
도 1b는 부착 배양 또는 현탁 배양으로서 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 Sf9 세포로부터 단리된 바큘로바이러스의 양을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2a는 단백질 인핸서가 없거나 ((-) 인핸서), 단백질-발현 바큘로바이러스로 감염시키기 16, 20, 24 또는 28시간 전에 첨가된 단백질 인핸서가 함유된 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 Sf9 세포의 단백질 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 2b는 단백질 인핸서를 첨가하거나 첨가하지 않은 효모 용해물을 함유하는 곤충 세포 배지에서 성장된 Sf9 세포의 단백질 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3a는 표시된 크기의 플라스크 내 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포의 단백질 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3b는 표시된 크기의 플라스크에서 성장된 감염되지 않은 세포의 생존 세포 밀도(VCD; 실선) 및 생존력%(점선)을 나타내는 선 그래프이다.
도 3c는 125 mL 플라스크 또는 24 딥 웰 플레이트 내 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포의 단백질 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3d는 표시된 크기의 용기에서 성장된 감염되지 않은 세포의 생존 세포 밀도(VCD; 실선) 및 생존력%(점선)을 나타내는 선 그래프이다.
도 4a는 효모 용해물을 함유하는 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포("전통의 프로토콜"; 굵은 선)와 비교된, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포("강화된 프로토콜"; 얇은 선)의 생존 세포 밀도(VCD; 실선) 및 생존력%(점선)을 나타내는 선 그래프이다. 도 4b는 도 4a로부터의 세포의 감염 후 1, 2, 3 및 4일 후의 단백질 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5a는 표시한 바와 같이, 효모 용해물을 함유하는 4개의 상이한 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포와 비교된, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포("강화된 프로토콜"; 굵은 선)의 생존 세포 밀도(VCD)을 나타내는 선 그래프이다.
도 5b-5d는 도 5a로부터의 효모 용해물을 함유하는 4개의 상이한 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포와 비교된, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포("강화된 프로토콜")로부터 수확된 단백질의 역가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 6a는 효모 용해물을 함유하는 Sf900-II 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포와 비교된, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장되고 GUS-발현 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포("강화된 프로토콜")로부터의 β-글루쿠로니다아제(GUS) 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 6b는 효모 용해물을 함유하는 Sf900-II 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포와 비교된, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장되고 SEAP-발현 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포("강화된 프로토콜")로부터의 분비된 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 활성을 나타내는 막대 그래프이다. 도 6c는 도 6b에 기재된 세포로부터의 SEAP의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 사진이다.
도 6d는 효모 용해물을 함유하는 Sf900-II 곤충 세포 배지에서 성장된 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포와 비교된, 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 곤충 세포 배지에서 성장되고 TNF-α-발현 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 세포("강화된 프로토콜")로부터의 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 단백질 역가를 나타내는 막대 그래프이다. 도 6e는 핵 인자 카파 B (NFκB) 루시퍼라아제 검정에서 측정된 바와 같은 TNF-α 단백질의 활성을 나타낸다.
I. 정의
본원에서 사용되는 바와 같은 부정관사 용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포"는 모든 유형의 진핵 및 원핵 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 진핵 세포, 특히 곤충 세포를 지칭한다. 소정의 예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 용어 "세포"는 스포돕테라 프루기페르다 세포, 예컨대 예를 들어 Sf9 세포 또는 이의 변이체를 지칭하는 것으로 의미된다. Sf9 세포의 변이체는 예를 들어 제한 없이, 효모 용해물(이스톨레이트)-미함유 배지에서 성장할 수 있는 Sf9 세포, 및/또는 현탁 배양에서 성장, 증식 및 트랜스펙션될 수 있는 Sf9 세포를 포함한다. Sf9 세포의 변이체는 예를 들어 제한 없이, 고밀도(예, ≥ 약 2 x 106 세포/mL, ≥ 약 5 x 106 세포/mL, ≥ 약 2 x 107 세포/mL, 이상)로 배양될 수 있는 Sf9 세포를 포함한다.
세포를 배양하고, 트랜스펙션 및 바이러스 생산 작업흐름을 수행하는 맥락에서 사용시 "고밀도 성장 가능한"이란 문구는 일반적으로 여전히 고효율로 트랜스펙션될 수 있는 능력을 유지한 채 ≥ 약 1x106 세포/mL, ≥ 약 2x106 세포/mL, ≥ 약 3x106 세포/mL, 또는 심지어 임의로는 ≥ 약 4x106 세포/mL, 또는 ≥ 약 2x107 세포/mL의 피크 세포 밀도로 적합한 세포 배양 배지에서 성장 또는 배양할 수 있는 공지된 세포주, 또는 공지된 세포주의 변이체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 또한 높은 수준(예, 200 μg/mL 이상 내지 약 1 mg/mL 이하의 수준)에서 표적 단백질을 발현할 수 있다.
"접촉"은 이것의 평범한 의미에 부합되게 사용되고, 적어도 2개의 별개의 종(예, 생체분자 또는 세포를 포함하는 화학적 화합물)이 반응, 상호작용 또는 물리적으로 닿기에 충분히 근접하게 되도록하는 과정을 지칭한다. 그러나, 결과의 반응 생성물은, 직접 첨가된 시약간의 반응으로부터, 또는 반응 혼합물에서 생성될 수 있는 첨가된 시약들 중 하나 이상으로부터의 중간체로부터 생성될 수 있다.
용어 "접촉"은 2개의 종이 반응, 상호작용 또는 물리적으로 닿도록 허용하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 2개의 종은 본원에 기재된 바와 같은 화합물 및 단백질 또는 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 접촉은 본원에 기재된 화합물이 신호전달 경로에 관련된 단백질 또는 효소와 상호작용하도록 하는 것을 포함한다.
용어 "발현"은 전사, 전사후 개질, 번역, 번역후 개질, 및 분비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리펩티드의 생성에 관련된 임의의 단계를 포함한다. 발현은 단백질 검출을 위한 종래의 기술(예, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 유세포분석, 면역형광, 면역조직화학 등)을 이용하여 검출될 수 있다.
용어 "효모 용해물" 또는 "이스톨레이트"는 아미노산, 펩티드, 다당류, 비타민 및 미네랄의 (일반적으로 정의되지 않은) 혼합물을 함유하는 효모(예, 빵 또는 양조 효모)의 수성 추출물을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참조로 포함되어 있는 문헌[Shen 등의 Cytotechnology. 2007 May; 54(1): 25-34]을 참조한다. 이스톨레이트는 한외여과될 수 있거나 한외여과되지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "효모 용해물-미함유" 또는 "이스톨레이트-미함유"란, 효모 용해물이 없거나 또는 실질적으로 없는, 배지, 특히 곤충 세포 배지를 지칭한다. 바람직하게는, 배지는 효모 용해물이 완전히 없다. 본원에서 이용되는 바와 같이, "실질적으로 효모 용해물이 없는"이란, 중량 기준으로 약 1% 미만의 효모 용해물을 함유하거나, 오직 미량의 효모 용해물을 함유하거나, 검출할 수 없는 양의 효모 용해물을 함유하는 배지를 지칭한다.
본원에서 이용되는 바와 같은 용어 "무혈청"이란, 혈청이 없거나, 실질적으로 혈청이 없는 배지를 지칭한다. 본원에서 이용되는 바와 같이, "실질적으로 혈청이 없는"이란, 중량 기준으로 약 1% 미만의 혈청을 함유하거나, 오직 미량의 혈청을 함유하거나, 검출할 수 없는 양의 혈청을 함유하는 배지를 지칭한다.
용어 "화학적으로-정의된 배지"란 모든 화학적 성분 및 이의 농도가 공지된, 세포, 특히 진핵 세포의 시험관 내 배양에 적합한 배지를 지칭한다.
문구 "무단백질" 배양 배지란, 단백질을 함유하지 않는 배양 배지를 지칭한다(예, 혈청 단백질, 예컨대 혈청 알부민 또는 부착 인자, 영양 단백질, 예컨대 성장 인자, 또는 금속 이온 담체 단백질, 예컨대 트랜스페린, 세룰로플라스민, 등이 없음). 바람직하게는, 펩티드가 존재하는 경우, 펩티드는 더 작은 펩티드, 예를 들어 디-펩티드 또는 트리-펩티드이다. 바람직하게는, 데카-펩티드 길이 또는 이것 초과의 펩티드는 단백질 미함유 배지에 존재하는 아미노산의 약 1% 미만, 더 바람직하게는 약 0.1% 미만, 심지어 더 바람직하게는 약 0.01% 미만이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "동물 유래" 재료는 재조합 동물 DNA 또는 재조합 동물 단백질 DNA를 포함하는, 동물 공급원으로부터 전체로 또는 부분적으로 유래한 재료를 의미한다.
용어 "발현 인핸서"는 일반적으로 현재 기재된 구현예에 따른 배양 배지 제형물을 보충하도록 사용되는 하나 이상의 액체(바람직하게는 수성) 첨가제를 의미하고, 상기 첨가제는 현재 기재된 구현예에 따른 일시적 단백질 발현 시스템에서 생성된 발현된 단백질의 수율을 개선하도록 선택된다. 상기 용어는 세포 주기 진행에 영향을 미치고/미치거나, 아폽토시스를 저해하고/저해하거나, 세포 성장을 느리게 하고/하거나, 단백질 생성을 촉진하는, 몇몇 화합물 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 인핸서"는 일반적으로 단백질 발현 시스템에 첨가되는 임의의 하나 이상의 화합물을 의미하고, 이의 존재는 이러한 발현 인핸서(들)의 부재에서 보이는 발현 수준보다 적어도 2배 내지 약 10배의 배수로, 표적 단백질의 발현을 증대시키거나 촉진한다.
본원에서 이용되는 바와 같은 용어 "박미드"는 박테리아에서 복제되지만 곤충 세포 내로 트랜스펙션시 곤충 세포에 의해 바큘로바이러스의 생성을 허용하는 바큘로바이러스 벡터를 지칭한다.
"세포 배양" 또는 "배양"이란 인공 시험관내 환경에서 세포의 유지를 의미한다.
"재배"란 성장 및/또는 분화 및/또는 지속된 생존력을 선호하는 조건 하에 시험관내 세포의 유지를 의미한다. "재배"는 "세포 배양"과 상호교환되어 사용될 수 있다. 재배는 배양 배지의 1㎖당 생존가능 세포의 수에 의해 평가된다. 거대분자의 도입 후 재배는 바람직하게는 생성물, 예를 들어 바이러스 상의 단백질 생성물의 생성을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "배지를 재충전, 대체 또는 보충"은 배양물에 이미 존재하는 배지에 새로운 세포 배양 배지의 용적을 첨가하는 것 및/또는 새로운 배지에 의해 배양물에 이미 존재하는 배지를 대체하는 것 및/또는 새로운 배지에 의해 배양물에 이미 존재하는 배지를 보충하는 것을 의미한다. 새로운 배지는 적어도 하나의 세포로 도입되는 하나 이상의 거대분자 또는 화합물을 함유하지 않는 배지 또는 재배에서 이의 성장을 지지하도록 세포와 접촉하지 않은 배지이다. 숙련자는 당해 분야에 공지된 기법, 예컨대 세포 계수(수동 또는 자동), 트립판 블루 배제, 단백질 또는 다른 물질의 생성, 알라마르 블루 검정(alamar blue assay), 하나 이상의 대사 생성물의 존재 또는 농도, 세포 유착, 형태학적 출현, 소비된 배지의 분석 등에 의해 세포 성장 및/또는 생존력을 모니터링함으로써 배지를 제거하고/하거나 재충전하거나, 대체하거나 보충하는 것으로부터의 이익 또는 이의 필요가 있는지를 결정할 수 있다. 모니터링 기법 중 하나 또는 이의 조합은 적어도 하나의 거대분자의 도입 후 배지가 적어도 하나의 거대분자의 성장, 도입 및/또는 재배를 지지할 필요가 있는지를 결정하도록 이용될 수 있다.
"재조합 단백질"은 숙주 세포로 도입되는 핵산에 의해 코딩된 단백질을 의미한다. 숙주 세포는 핵산을 발현한다. 용어 "핵산을 발현하는"은 "핵산에 의해 코딩된 RNA로부터 단백질을 발현하는"과 동의어이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "단백질"은 광범위하게 중합된 아미노산, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지단백, 당단백질 등을 의미한다.
용어 "단백질 수율"은 배양된 세포에 의해 발현된 단백질의 양을 의미하고, 예를 들어 배지 1㎖당 생성된 단백질의 그램의 면에서 측정될 수 있다. 단백질이 세포에 의해 분비되지 않는 경우, 단백질은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 세포의 내부로부터 단리될 수 있다. 단백질이 세포에 의해 분비되는 경우, 단백질은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 세포에 의해 발현된 단백질의 양은 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 단백질은 재조합 단백질일 수 있다.
"단백질 생성물"은 단백질에 의한 생성 또는 작용과 연관된 생성물이다. 단백질 생성물은 단백질일 수 있다. 단백질 생성물은 또한 생성물을 생성하도록 하나 이상의 다른 물질에 의해 단백질의 작용으로부터 생긴 생성물일 수 있다. 이러한 작용의 예는 단백질에 의한 효소 작용이다.
"현탁 배양"이란 배양 용기 내의 대부분 또는 모든 세포가 현탁액 중에 존재하고, 배양 용기 내의 소수의 세포가 용기 표면 또는 용기 내의 또 다른 표면에 부착되거나 어떤 세포도 부착되지 않는 세포 배양을 의미한다. 바람직하게는, "현탁 배양"은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 있는 배양 용기 내의 75% 초과의 세포를 가진다. 더 바람직하게는, "현탁 배양"은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 85% 초과의 세포를 가진다. 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 95% 초과의 세포를 가지는 "현탁 배양"이 심지어 더 바람직하다.
본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 세포의 단층(부착) 또는 현탁 배양, 트랜스펙션 및 재배, 및 단층 또는 현탁 배양에서의 세포에서의 단백질의 발현에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명의 배지, 방법, 키트 및 조성물은 세포의 현탁 배양, 트랜스펙션 및 재배를 위한, 그리고 현탁 배양에서의 세포에서의 단백질 생성물의 발현을 위한 것이다.
"배양 용기"란 세포를 배양하기 위한 무균 환경을 제공할 수 있는 임의의 용기, 예를 들어 유리, 플라스틱 또는 금속 용기를 의미한다.
문구 "세포 배양 배지", "조직 배양 배지", "배양 배지"(각각의 경우에 복수 "배지들") 및 "배지 제형물"은 세포 또는 조직을 재배하기 위한 영양제공 용액을 의미한다. 이 문구들은 상호교환되어 사용될 수 있다.
용어 "조합하는"은 성분들의 혼합 또는 혼화를 나타낸다.
용어 "미량 원소" 또는 "미량 원소 모이어티"는, 배양 배지에 존재하는 다른 모이어티 또는 성분의 양 또는 농도에 비해, 오직 매우 낮은(즉, "미량") 양 또는 농도로 세포 배양 배지에 존재하는 모이어티를 의미한다. 본 발명에서, 이들 용어는 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Cu1+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, Ge4+, Se4+, Br-, I-, Mn2+, F-, Si4+,V5+,Mo6+,Ni2+, Rb+,Sn2+ 및 Zr4+ 및 이들의 염을 포함한다. 예를 들어, 하기 염은 본 발명의 배양 배지에서 미량 원소로서 사용될 수 있다: AgNO3, AlCl3ㆍ6H2O, Ba(C2H3O2)2, CdSO4ㆍ8H2O, CdCl2, CoCl2ㆍ6H2O, Cr2(SO4)3ㆍ1H2O, CuCl2, FeSO4, GeO2, Na2SeO3, H2SeO3, KBr, KI, MnCl2ㆍ4H2O, NaF, Na2SiO3ㆍ9H2O, NaVO3, (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, NiSO4ㆍ6H2O, RbCl, SnCl2, ZnCl2, 및 ZrOCl2ㆍ8H2O.
용어 "아미노산"은 아미노산 또는 이의 유도체(예를 들어, 아미노산 유사체), 및 이의 D- 및 L-형태를 의미한다. 이러한 아미노산의 예에는 제한 없이 글리신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-리신, L-류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-메티오닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린, N-아세틸 시스테인이 포함된다.
용어 "트랜스펙션"은 핵산, 단백질 또는 다른 거대분자가 세포에서 발현되거나 생물학적 기능을 가지도록, 표적 세포로의 핵산, 단백질 또는 다른 거대분자의 전달을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
"트랜스펙션 시약" 또는 세포 내로의 "거대분자의 도입을 위한 시약"은 세포로의 거대분자의 진입을 촉진하는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 재료, 제형물 또는 조성물이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,279,833호를 참조한다. 몇몇 구현예에서, 시약은 "트랜스펙션 시약"일 수 있고, 하나 이상의 표적 세포로 하나 이상의 핵산의 흡수를 증가시키는 임의의 화합물 및/또는 조성물일 수 있다. 다양한 트랜스펙션 시약은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다.
II. 바큘로바이러스 발현 시스템
본 개시내용은 특히 바큘로바이러스 또는 단백질을 생성하는데 사용될 수 있는 바큘로바이러스 발현 시스템 및 그의 다양한 성분에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 하기를 포함한다:
(a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지; 및
(b) 복수의 Sf9 세포.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 추가로 단백질 발현 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A 또는 발프로산이다.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 트랜스펙션 시약을 추가로 포함한다. 적합한 트랜스펙션 시약은 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민(PEI), 양으로 하전된 아미노산의 중합체, 예컨대 폴리리신 및 폴리아르기닌, 양으로 하전된 덴드리머 및 분절된 덴드리머, 양이온성 B-사이클로덱스트린 함유 중합체(CD-중합체), DEAE-덱스트란 등을 포함하는 하나 이상의 화합물 및/또는 조성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 구현예에서, 세포로의 거대분자의 도입을 위한 시약은 양이온성 지질 및/또는 중성 지질일 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 지질에는 이에 제한되는 것은 아니나, N-[1-(2,3-디올레일옥시) 프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPE), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(4'-트리메틸암모니오) 프로판 (DOTAP), 디히드록실-디미리스틸스퍼민 테트라히드로클로라이드 (DHDMS), 히드록실-디미리스틸스퍼민 테트라히드로클로라이드 (HDMS), 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오) 부타노일-sn-글리세롤 (DOTB), 1,2-디올레오일-3-숙시닐-sn-글리세롤 콜린 에스테르 (DOSC), 콜레스테릴 (4'-트리메틸암모니오)부타노에이트 (ChoTB), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 1,2-디올레오일-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORI), 1,2-디올레일옥시프로필-3 -디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DOME), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), O,O'-디도데실-N-[p(2-트리메틸암모니오에틸옥시)벤조일]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, 하나 이상의 지질에 컨쥬게이션된 스퍼민(예를 들어, 5카르복시스퍼밀글리신 디옥타데실아미드 (DOGS), N,N I ,N II ,N III -테트라메틸-N,N I ,N II ,N III -테트-라팔미틸스퍼민 (TM-TPS) 및 디팔미토일파스파티딜에탄올아민 5카르복시스퍼밀아민데 (DPPES)), 리포폴리리신 (DOPE에 컨쥬게이션된 폴리리신), TRIS (트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 트로메타민) 컨쥬게이션된 지방산 (TFAs) 및/또는 펩티드, 예컨대 트리리실-알라닐-TRIS 모노-, 디-, 및 트리-팔미테이트, (3B-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일] 콜레스테롤 (DCChol), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드 (TMAG), 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB), 2,3-디올레일옥시-N- [2(스퍼민-카르복사미도)에틸] -N,N-디메틸- 1-프로판아민-이니움트리누오로아세테이트(DOSPA) 및 그의 조합이 포함된다.
당해 분야의 숙련자는, 상기 언급된 지질의 소정의 조합이 세포로의 핵산의 도입에 특히 적합한 것으로 나타났다는 것을 인식할 것이고, 예를 들어 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 조합이 상표명 LIPOFECTAMINETM 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corporation)(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 조합이 상표명 LIPOFECTIN® 하에 써모피셔 사이엔티픽(ThermoFisher Scientific)로부터 구입 가능하고, DIVIRIE 및 콜레스테롤의 1:1(M/M) 조합이 상표명 DIVIRIE-C 시약 하에 라이프 테크놀로지스 코포레이션(캘리포니아주 칼스바드)으로부터 구입 가능하고, TM-TPS 및 DOPE의 1:1.5(M/M) 조합이 라이프 테크(Life Tech)로부터 구입 가능하다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 양이온성 지질 트랜스펙션 시약이다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션 시약은 중합체계 트랜스펙션 시약이다. 다른 시판 중인 양이온성 지질 트랜스펙션 시약에는 이에 제한되는 것은 아니나, TRANSFAST™ (프로메가 코포레이션(Promega Corporation)에서 구입 가능); LYOVEC™ (인비보젠(InvivoGen)에서 구입 가능); DOTAP 리포솜 트랜스펙션 시약 (로슈(Roche)에서 구입 가능); TRANSIT® 트랜스펙션 시약(미러스(Mirus)에서 구입 가능); 및 곤충 GENEJUICE® 트랜스펙션 시약 (이엠디 밀리포어(EMD Millipore))이 포함된다. 중합체계 트랜스펙션 시약에는 제한 없이, TURBOFECT™ 트랜스펙션 시약 (써모피셔 사이언티픽에서 구입 가능); Xfect 트랜스펙션 시약 (타카라 바이오 유에스에이(Takara Bio USA)에서 구입 가능); XTREMEGENE™ 트랜스펙션 시약(로슈에서 구입 가능); Sigma Universal 트랜스펙션 시약(시그마-알드리쉬(Sigma-Aldrich)에서 구입 가능); 폴리머 인 비보 트랜스펙션 시약(알토젠 바이오시스템(Altogen Biosystems)에서 구입 가능); 및 폴리에틸렌이민(PEI)이 포함된다. 본원에서 사용될 수 있는 추가의 트랜스펙션 시약에는, 제한 없이 VIAFECT™ 트랜스펙션 시약, FUGENE® 6 트랜스펙션 시약, 및 FUGENE® HD 트랜스펙션 시약 (이들 각각은 프로메가 코퍼레이션으로부터 구입 가능함); 바이오라드 라보라토리, 인코포레이티드(BioRad Laboratories, Inc.)에서 구입 가능한 TRANSFECTIN™ 지질 시약이 포함된다.
일부 구현예에서, 배지는 곤충 세포 배지이다. 구현예에서, 곤충 세포 배지는 써모피셔 사이언티픽으로부터 입수가능한 EXPISF™ CD 배지이다. 구현예에서, 곤충 세포 배지는 각각 써모피셔 사이언티픽으로부터 입수가능한 그레이스(Grace) 곤충 배지, SF-900™ II, 또는 SF-900™ III이다.
본래의 Sf9 세포는 밤나방과나방인 스포돕테라 프루기페르다의 번데기 난소 조직으로부터 유래된 부모 IPLBSF-21 (Sf21) 세포주에서 클로닝되었다. Sf9 세포는 바이러스, 특히 바큘로바이러스의 연구 및 개발에 광범위하게 사용된 바 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 Sf9 세포는 화학적으로 정의된 효모 용해물-미함유 배지에서, 예를 들어 배지에서 일정 기간 동안 (예, 적어도 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20 계대) 세포를 배양/계대배양함으로써 성장을 위해 적합화된 Sf9 세포이다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 써모피셔 사이언티픽으로부터 입수가능한 EXPISF9™ 세포이다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 써모피셔 사이언티픽으로부터 입수가능한 GIBCO® Sf9 세포이다.
일부 구현예에서, 복수의 Sf9 세포는 배지에서 현탁 배양으로 성장할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 Sf9 세포는 배지에서 부착 배양으로 성장할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 Sf9 세포는 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 배지에서 배양시 고밀도 성장이 가능하다. 일부 구현예에서, 복수의 Sf9 세포는 본원에 기재된 바와 같은 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 배지에서 배양시 고밀도 성장에 적합화된다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 밀리리터 당 약 1 x 106 세포(세포/mL) 내지 약 2 x 108 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 2 x 108 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 5 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 5 x 106 세포/mL 내지 약 4 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 5 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 6 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 7 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 8 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 9 x 106 세포/mL 내지 약 3 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 1 x 107 세포/mL 내지 약 3 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 1 x 107 세포/mL 내지 약 2.5 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 2 x 107 세포/mL 내지 약 2.5 x 107 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 2.2 x 107 세포/mL 이하의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Sf9 세포는 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 5 x 106 세포/mL, 약 5 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL, 약 1 x 107 세포/mL 내지 약 5 x 107 세포/mL, 약 5 x 107 세포/mL 내지 약 1 x 108 세포/mL, 또는 약 1 x 108 세포/mL 내지 약 2 x 108 세포/mL의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 현탁 배양으로 성장된다. 이것은 배양 용기 내의 대부분 또는 모든 세포가 현탁액 중에 존재하고, 배양 용기 내의 소수의 세포가 용기 표면 또는 용기 내의 또 다른 표면에 부착되거나 어떤 세포도 부착되지 않는 세포 배양을 포함한다. 일부 구현예에서, 현탁 배양은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 있는 배양 용기 내의 약 75% 초과의 세포를 가진다. 일부 구현예에서, 현탁 배양은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 약 85% 초과의 세포를 가진다. 일부 구현예에서, 현탁 배양은, 배양 용기 내의 또는 상의 표면에 부착되지 않은, 현탁액 중에 존재하는 배양 용기 내의 약 95% 초과의 세포를 가진다.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 바큘로바이러스를 발현하도록 시스템을 이용하는 지침을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 바큘로바이러스로부터 단백질을 발현하도록 시스템을 이용하는 지침을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 바큘로바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바큘로바이러스 벡터는 박미드이다.
일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 재조합 바큘로바이러스 제조를 위한 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다.
III. 곤충 세포 배지
일부 양태에서, 본 개시내용은 곤충 세포의 성장을 위한 배지에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 바큘로바이러스 발현 시스템은 배지를 포함한다. 본 개시내용은 부분적으로 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기염; 및 비타민을 포함하는 곤충 세포 배양을 위한 배지에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 무기염의 양은 곤충 세포의 성장을 지지하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 배지는 화학적으로 정의되고 효모 가수분해물-미함유 배지이다. 일부 구현예에서, 배지는 단백질을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 배지는 혈청을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 배지는 동물로부터 유래된 성분을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 배지는 알루미늄 염, 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유기 또는 무기염을 포함한다. 염은 제한 없이 하기를 포함하는 유기 또는 무기 음이온으로 제조된 것을 포함한다: AgNO3, AlCl3ㆍ6H2O, Ba(C2H3O2)2, CaCl2, CdSO4ㆍ8H2O, CdCl2, CoCl2ㆍ6H2O, Cr2(SO4)3ㆍ1H2O, CuCl2, FeSO4, FeCl2, FeCl3, Fe(NO3)3, GeO2, Na2SeO3, H2SeO3, KBr, KCl, KI, MgCl2, MgSO4, MnCl2ㆍ4H2O, NaF, Na2SiO3ㆍ9H2O, NaVO3, Na3VO4, (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NiSO4ㆍ6H2O, NiCl2, Ni(NO3)2, RbCl, SnCl2, ZnCl2, ZnSO4, ZrOCl2ㆍ8H2O, EDTA 테트라소듐.
구현예에서, 배지는 리터 당 약 1 x 10-5 그램 (g/L) 내지 약 5 x 10-3 g/L 범위의 소듐 바나데이트(NaVO3 또는 Na3VO4)를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 또는 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L 범위의 소듐 바나데이트(NaVO3 또는 Na3VO4)를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 또는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L 범위의 소듐 바나데이트(NaVO3 또는 Na3VO4)를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 또는 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L 범위의 소듐 바나데이트(NaVO3 또는 Na3VO4)를 포함한다.
구현예에서, 배지는 리터 당 약 1 x 10-5 그램 (g/L) 내지 약 5 x 10-3 g/L 범위의 소듐 메타실리케이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 또는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L 범위의 소듐 메타실리케이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 또는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L 범위의 소듐 메타실리케이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 또는 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L 범위의 소듐 메타실리케이트를 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L 범위의 암모늄 몰리브데이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 또는 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 1 x 10-5 g/L 범위의 암모늄 몰리브데이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 또는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L 범위의 암모늄 몰리브데이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 5 x 10-6 g/L 내지 약 1 x 10-5 g/L, 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 또는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L 범위의 암모늄 몰리브데이트를 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L 범위의 카드뮴 클로라이드를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 5 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 또는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L 범위의 카드뮴 클로라이드를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-5 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 또는 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L 범위의 카드뮴 클로라이드를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 5 x 10-6 g/L 내지 약 1 x 10-5 g/L, 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 또는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L 범위의 카드뮴 클로라이드를 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L 범위의 아연 염(ZnCl2 및/또는 ZnSO4)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L, 또는 약 1 x 10-2 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L 범위의 아연 염(ZnCl2 및/또는 ZnSO4)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 또는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L 범위의 아연 염(ZnCl2 및/또는 ZnSO4)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L, 또는 약 1 x 10-2 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L 범위의 아연 염(ZnCl2 및/또는 ZnSO4)을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L 범위의 철 염(예, FeSO4, FeCl2, FeCl3, 및/또는 Fe(NO3)3)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L, 또는 약 1 x 10-2 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L 범위의 철 염(예, FeSO4, FeCl2, FeCl3, 및/또는 Fe(NO3)3)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 또는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L 범위의 철 염(예, FeSO4, FeCl2, FeCl3, 및/또는 Fe(NO3)3)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 5 x 10-3 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L, 또는 1 x 10-2 g/L 내지 약 5 x 10-2 g/L 범위의 철 염(예, FeSO4, FeCl2, FeCl3, 및/또는 Fe(NO3)3)을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 칼륨 염(예, KBr, KCl, 및/또는 KI)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 칼륨 염(예, KBr, KCl, 및/또는 KI)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 또는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 칼륨 염(예, KBr, KCl, 및/또는 KI)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 칼륨 염(예, KBr, KCl, 및/또는 KI)을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 은 염(예, AgNO3)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 은 염(예, AgNO3)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 또는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 은 염(예, AgNO3)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 은 염(예, AgNO3)을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 염화제1주석을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 염화제1주석을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 또는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 염화제1주석을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 염화제1주석을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 니켈 염(예, NiSO4, NiCl2, 및/또는 Ni(NO3)2)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 니켈 염(예, NiSO4, NiCl2, 및/또는 Ni(NO3)2)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 또는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 니켈 염(예, NiSO4, NiCl2, 및/또는 Ni(NO3)2)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 또는 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L 범위의 니켈 염(예, NiSO4, NiCl2, 및/또는 Ni(NO3)2)을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 ZrOCl2을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 또는 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 ZrOCl2을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 ZrOCl2을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 5 x 10-7 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 또는 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 ZrOCl2을 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 소듐 플루오라이드를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 또는 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 소듐 플루오라이드를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 소듐 플루오라이드를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 또는 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 소듐 플루오라이드를 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 바륨 아세테이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L, 또는 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 바륨 아세테이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L 범위의 바륨 아세테이트를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-9 g/L 내지 약 5 x 10-9 g/L, 약 5 x 10-9 g/L 내지 약 1 x 10-8 g/L, 약 1 x 10-8 g/L 내지 약 5 x 10-8 g/L, 약 5 x 10-8 g/L 내지 약 1 x 10-7 g/L, 약 1 x 10-7 g/L 내지 약 5 x 10-7 g/L, 약 5 x 10-7 g/L 내지 약 1 x 10-6 g/L, 또는 약 1 x 10-6 g/L 내지 약 5 x 10-6 g/L 범위의 바륨 아세테이트를 포함한다.
구현예에서, 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 10 g/L 범위의 마그네슘 염(예, MgCl2 및/또는 MgSO4)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.05 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 10 g/L, 또는 약 1 g/L 내지 약 10 g/L 범위의 마그네슘 염(예, MgCl2 및/또는 MgSO4)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 1 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.5 g/L, 또는 약 0.01 g/L 내지 약 0.1 g/L 범위의 마그네슘 염(예, MgCl2 및/또는 MgSO4)을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 또는 약 5 g/L 내지 약 10 g/L 범위의 마그네슘 염(예, MgCl2 및/또는 MgSO4)을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린(예, 콜린 클로라이드), 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 비타민을 포함한다. 각각의 비타민은 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.5 g/L 범위로 배지에 존재할 수 있다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.5 g/L, 또는 약 0.05 g/L 내지 약 0.5 g/L 범위의 비타민을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.01 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 또는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L 범위의 비타민을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 0.01 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.1 g/L, 또는 약 0.1 g/L 내지 약 0.5 g/L 범위의 비타민을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 메틸 메리스테이트, 토코페롤, 메틸 리올레에이트, 메틸 올레에이트, 메틸 아라치도네이트, 메틸 리놀레네이트, 메틸 팔미톨레에이트, 메틸 팔미테이트, 및 이의 조합으로부터 선택된 지방산 (또는 이의 에스테르, 예컨대 이의 지방산 메틸 에스테르)를 포함한다. 각각의 지방산 및/또는 지방산 메틸 에스테르는 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L 범위로 배지에 존재할 수 있다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 또는 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L 범위의 지방산(또는 이의 에스테르)를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 또는 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L 범위의 지방산(또는 이의 에스테르)를 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-5 g/L 내지 약 5 x 10-5 g/L, 5 x 10-5 g/L 내지 약 1 x 10-4 g/L, 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 또는 5 x 10-3 g/L 내지 약 1 x 10-2 g/L 범위의 지방산(또는 이의 에스테르)를 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 글루코오스, 수크로오스, 피루베이트(예, 소듐 피루베이트), 말토오스, 트레할로오스, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 에너지 공급원을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 30 g/L 범위의 에너지 공급원을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.05 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 30 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 1 g/L 내지 약 30 g/L, 약 5 g/L 내지 약 30 g/L, 약 10 g/L 내지 약 30 g/L, 또는 약 20 g/L 내지 약 30 g/L 범위의 에너지 공급원을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 20 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 5 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 1 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.5 g/L, 또는 약 0.01 g/L 내지 약 0.1 g/L 범위의 에너지 공급원을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 0.01 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 또는 약 10 g/L 내지 약 20 g/L 범위의 에너지 공급원을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 에멀젼화제, 계면활성제, 항산화제, 완충제, 폴록사머, 금속 결합 화합물 또는 이들의 조합으로부터 선택된 추가적인 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 폴리소르베이트, 에탄올아민, 푸트레신, 스퍼민, 스퍼이미딘, 히드록시피리딘 유도체(예, 2-히드록시피리딘-N-옥시드, 3-히드록시-4-피론, 3-히드록시피피리드-2-온, 1-메틸-3-히드록시피리드-2-온, 또는 2-히드록시-니코틴산), EDTA, 2-메르캅토에탄올, B-글리세로포스페이트, 및 콜레스테롤로부터 선택된 추가적인 성분을 포함한다. 각 추가적인 성분은 배지에 예를 들어 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 10 g/L의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 구현예에서, 배지는 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1 x 10-2 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5 x 10-2 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 0.5 내지 약 10 g/L, 및 약 1 내지 약 10 g/L 범위의 추가적인 성분을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 1 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 0.01 g/L, 또는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L 범위의 추가적인 성분을 포함한다. 구현예에서, 배지는 약 1 x 10-4 g/L 내지 약 5 x 10-4 g/L, 약 5 x 10-4 g/L 내지 약 1 x 10-3 g/L, 약 1 x 10-3 g/L 내지 약 5 x 10-3 g/L, 약 5 x 10-3 g/L 내지 약 0.01 g/L, 약 0.01 g/L 내지 약 0.05 g/L, 약 0.05 g/L 내지 약 0.1 g/L, 약 0.1 g/L 내지 약 0.5 g/L, 약 0.5 g/L 내지 약 1 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 또는 약 5 g/L 내지 약 10 g/L 범위의 추가적인 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 배지는 L-알라닌, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-리신, L-류신, L-메티오닌, L-아스파라긴, 피롤리신, L-프롤린, L-글루타민, L-아르기닌, L-세린, L-트레오닌, 셀레노시스테인, L-발린, L-트립토판, L-티로신, 카르니틴, 레보티록신, 히드록시프롤린, 셀레노메티오닌, 타우린, 시트룰린, 오르니틴, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 아미노산의 안정한 유사체(예, 써모피셔 사이언티픽으로부터 입수 가능한, GLUTAMAX™)이다. 구현예에서, 각 아미노산은 약 0.1 g/L 및 약 8 g/L 범위의 배지로 존재할 수 있다.
IV. 이용 방법
본 개시내용은 부분적으로 하기를 포함하는 바큘로바이러스 생성 방법에 관한 것이다:
(a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계;
(b) 세포를 박미드로 트랜스펙션시키는 단계; 및
(c) 곤충 세포 배양으로부터 바이러스를 수확하는 단계.
일부 구현예에서, 세포는 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 또는 중합체계 트랜스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션된다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 현탁 배양된다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 부착(단층) 배양된다.
일부 구현예에서, 트랜스펙션 단계는 곤충 세포가 1 x 106 세포/mL 내지 5 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 또는 약 5 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL의 생존 세포 밀도로 존재하는 경우 수행된다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션 단계는 곤충 세포가 ≥ 75% 생존, ≥ 80% 생존, ≥ 85% 생존, ≥ 90% 생존, 또는 ≥ 95% 생존인 경우 수행된다.
일부 구현예에서, 배지는 본원에서 기재된 바와 같은 배지이다.
일부 구현예에서, 배지는 트랜스펙션 단계 후 추가 또는 신선한 배지로 재충전, 대체 또는 보충되지 않는다.
일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 밀리리터 당 적어도 5 x 107개의 감염성 바이러스 입자(IVP/mL)의 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 1 x 108 IVP/mL 이상의 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 약 5 x 107 IVP/mL 내지 약 1 x 1010 IVP/mL, 약 5 x 107 IVP/mL 내지 약 5 x 109 IVP/mL, 약 5 x 107 IVP/mL 내지 약 1 x 109 IVP/mL, 약 1 x 108 IVP/mL 내지 약 1 x 1010 IVP/mL, 약 5 x 108 IVP/mL 내지 약 1 x 1010 IVP/mL, 또는 약 1 x 109 IVP/mL 내지 약 1 x 1010 IVP/mL의 역가를 갖는다. 일부 구현예에서, 수확된 바큘로바이러스는 약 5 x 107 IVP/mL 내지 약 1 x 108 IVP/mL, 약 1 x 108 IVP/mL 내지 약 5 x 108 IVP/mL, 약 5 x 108 IVP/mL 내지 약 1 x 109 IVP/mL, 약 1 x 109 IVP/mL 내지 약 5 x 109 IVP/mL, 및 약 5 x 109 IVP/mL 내지 약 1 x 1010 IVP/mL의 역가를 갖는다.
본 개시내용은 부분적으로 하기를 포함하는 바큘로바이러스로부터의 단백질 생성 방법에 관한 것이다:
(a) 화학적으로 정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 단백질을 발현하는 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (c) 단백질을 생성하기 위해 일정 시간 동안 감염된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (d) 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a) 내지 (d)는 5일 내지 15일이 걸린다. 일부 구현예에서, 단백질은 감염 후 약 24시간 내지 약 120시간에 수확된다.
일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서가 단계 (b) 이전에 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 적어도 감염되기 10시간 전에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 감염 전 적어도 12시간, 적어도 15시간, 적어도 18시간, 적어도 21시간, 적어도 24시간, 적어도 27시간, 적어도 30시간, 적어도 33시간, 또는 적어도 36시간 전에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 감염 전 10 시간 내지 36시간 전에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 감염 전 12시간 내지 36시간, 15시간 내지 36시간, 18시간 내지 36시간, 21시간 내지 36시간, 24시간 내지 36시간, 27시간 내지 36시간, 또는 30시간 내지 36시간 전에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 감염 전 10시간 내지 33시간, 10시간 내지 30시간, 10시간 내지 27시간, 10시간 내지 24시간, 10시간 내지 21시간, 10시간 내지 18시간, 또는 10시간 내지 15시간 전에 첨가된다.
일부 구현예에서, 단백질 발현 인핸서는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제는 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 리코스타틴 A 또는 발프로산이다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9 세포이다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 배지에서 고밀도 성장이 가능하다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 밀리리터 당 약 2 x 106 내지 약 2 x 108 세포 (세포/mL)의 피크 세포 밀도를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 현탁 배양된다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 부착 배양된다.
일부 구현예에서, 감염 단계는 곤충 세포가 1 x 106 세포/mL 내지 5 x 107 세포/mL, 약 1 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL, 또는 약 5 x 106 세포/mL 내지 1 x 107 세포/mL의 생존 세포 밀도로 존재시 수행된다. 일부 구현예에서, 감염 단계는 곤충 세포가 ≥ 75% 생존, ≥ 80% 생존, ≥ 85% 생존, ≥ 90% 생존, 또는 ≥ 95% 생존인 경우 수행된다.
일부 구현예에서, 곤충을 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스는 1 내지 10, 2 내지 10, 3 내지 10, 4 내지 10, 5 내지 10, 6 내지 10, 7 내지 10, 또는 8 내지 10의 감염 다중도(MOI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스는 2 내지 9, 3 내지 8, 또는 4 내지 7의 감염 다중도(MOI)를 갖는다. 일부 구현예에서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스는 약 5의 MOI를 갖는다.
일부 구현예에서, 배지는 단백질 생성 동안 신선한 배지로 대체, 재충전 또는 보충되지 않는다.
일부 구현예에서, 곤충 세포는 부착 배양된다. 일부 구현예에서, 곤충 세포는 현탁 배양된다.
본원에서 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시를 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 본 출원의 정신 및 영역, 및 첨부된 청구 범위의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1:Sf9 세포 배양
Sf9 세포를 쉐이크 플라스크 배양에서 다중 계대를 위한 배지에서의 성장으로써 화학적으로-정의된 효모 용해물-미함유 배지(이하, "효모 용해물-미함유 배지"로 지칭됨)에서 배양되도록 적합화하였다.
적합화된 Sf9 세포를 효모 용해물-미함유 배지에서 27℃ 비(非)가습화된, 공기 조절 비(非)-CO2 분위기에서 오르비탈 쉐이커 플랫폼 상에서 인큐베이션하였다. 세포가 밀리리터 당 5 x 106개 이상의 생존 세포(VCM)의 밀도에 도달하고, 일반적으로 약 10 x 106 VCM 미만에 도달하면, 세포를 계대하였다. 세포 생존력을 트리판 블루 배제법 또는 자동화된 세포 계수기로써 결정하였다.
장기 저장을 위해, 적합화된 Sf9 세포를 표준 극저온 절차를 사용하여 7.5% 디메틸술폭시드(DMSO)가 있는 92.5% 조건화된 효모 용해물-미함유 배지에서 동결하였다.
효모 용해물-미함유 배지 대 효모 용해물을 함유하는 표준 곤충 세포 배지에서 적합화된 Sf9 세포 생존력을 결정하기 위해, 세포를 각 배지에서 성장시키고, 10일의 배양 동안 생존 세포 밀도를 측정하였다. 도 1a에서 나타낸 바와 같이, 효모 용해물-미함유 배지에서 성장된 세포(굵은 선)는 표준 곤충 세포 배지(얇은 선)에서 성장된 세포와 비교시 시간이 경과됨에 따라 더 높은 생존 세포 밀도를 달성하였고(실선), 6-10일 배양 후 더 큰 생존력을 가졌다(점선).
실시예 2: 바큘로바이러스 제조 - Sf9 세포의 트랜스펙션
박미드 DNA를 BAC-TO-BAC™ 바큘로바이러스 발현 시스템(써모피셔 사이언티픽)을 이용하여 생산하였다. 효모-용해물 미함유 배지에서 배양하도록 적합화된 Sf9 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 효모 용해물-미함유 배지에서 배양하였다.
부착-기반 트랜스펙션
적합화된 Sf9 세포가 약 5 x 106 내지 약 10 x 106 VCM의 밀도 및 90% 이상의 생존력에 도달할 때까지 이들을 배양하였다. 세포를 웰 당 3 mL 효모 용해물-미함유 배지의 총 부피로 웰 당 약 1 x 106 개의 생존 세포의 최종 밀도에서 6-웰 플레이트로 시딩하였다. 세포를 27℃ 비-가습화된 공기 조절 비-CO2 분위기 인큐베이터에서 30 내지 60분 동안 부착되게 하였다.
세포를 10 μL 트랜스펙션 시약 당 약 1 μg DNA의 비율로 양이온성 지질 트랜스펙션 시약으로 트랜스펙션하였다. 간략히, 트랜스펙션 시약을 OPTIMEM™ I 환원 혈청 배지(250 μL)로 희석시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 박미드 DNA를 희석된 트랜스펙션 시약에 첨가하고, 혼합하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 용액을 6-웰 플레이트 내 세포에 적하하여 옮겼다. 트랜스펙션된 세포를 72-96시간 동안 인큐베이션하였다.
현탁-기반 트랜스펙션
세포가 약 5 x 106 내지 약 10 x 106 VCM의 밀도 및 90% 이상의 생존력에 도달할 때까지 세포를 배양하였다. 세포를 125-mL 배플이 없는 통기형 쉐이커 플라스크에서 25 mL 효모 용해물-미함유 배지의 총부피로 mL 당 약 2.5 x 106 개의 생존 세포의 최종 밀도로 희석하였다. 세포를 오르비탈 쉐이커 플랫폼 상 27℃ 비-가습화된 공기 조절 비-CO2 분위기 인큐베이터에서 30분 이하 동안 회수되게 하였다.
세포를 30 μL 트랜스펙션 시약 당 약 12.5 μg DNA의 비율로 양이온성 지질 트랜스펙션 시약으로 트랜스펙션하였다. 간략히, 트랜스펙션 시약을 OPTIMEM™ I 환원 혈청 배지(1 mL)로 희석시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 박미드 DNA를 희석된 트랜스펙션 시약에 첨가하고, 혼합하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 용액을 쉐이크 플라스크 내 세포에 적하하여 옮겼다. 트랜스펙션된 세포를 72-96시간 동안 인큐베이션하였다.
실시예 3: 바큘로바이러스 생성 - 바이러스 스톡의 단리
세포가 약 60% 내지 80% 생존력까지 떨어졌을 경우(트랜스펙션 후 72-120시간), 바큘로바이러스를 세포 배양 배지에서 수확하였다. 배양물을 세포에서 제거하고 250 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 및 큰 부스러기를 제거하였다. 청정화된 상청액을 새 원뿔형 튜브로 옮겼다. 이것은 P1 바이러스 스톡이었다. P1 바이러스 스톡을 빛으로부터 보호하면서 4℃에서 보관하였다.
바이러스 역가를 바큘로바이러스 역가 검정에 의해 결정하였다. P1 바이러스 스톡의 10배 계단 희석물(희석 범위: 1 x 10-1 내지 1 x 10-5) 5개를 새 효모 용해물-미함유 배지에서 제조하였다. 적합화된 Sf9 세포를 효모 용해물-미함유 배지에서 1.25 x 106 VCM으로 희석하였다. 반응을 하기와 같이 24-웰 현탁 플레이트에서 설정하였다:
1. 1 mL의 각 계단 희석물(첫 번째 희석 제외, 1 x 10-1)을 적절한 웰 (희석 당 1 웰)에 첨가하였다.
2. 1 mL의 새 효모 용해물-미함유 배지를 음성 대조군(즉, 바이러스 없음) 웰에 첨가하였다.
3. 1.25 x 106 생존 세포/웰에서의 800 μL의 세포를 각 희석물을 함유하는 웰 및 음성 대조군 웰에 첨가하였다. 임의의 사용하지 않은 웰에 1 mL 배지 또는 PBS를 충전하였다.
4. 플레이트를 225 ± 5 rpm로 설정된 쉐이킹 플랫폼 상 비-가습 인큐베이터에서 27℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
하기 시약을 제조하였다:
ㆍ 희석 완충액: 2% 소태아 혈청(FBS)를 함유하는 PBS.
ㆍ 항-바큘로바이러스 외피 gp64 APC 항체: 항체를 0.15 μg/mL의 최종 농도로 희석 완충액 중 희석하였다.
샘플을 유세포 분석에 의한 분석을 위해 준비하였다:
a. 14-16시간의 인큐베이션 후, 24-웰 현탁 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고, 각 웰의 내용물을 분리된 FACS 튜브로 웰 당 하나의 FACS 튜브로 하여 옮겼다.
b. 튜브를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 폐기했다.
c. 각 세포 펠릿을 100 μL 희석된 항체에서 재현탁하고, 3-5초 동안 보르텍싱함으로써 간단히 혼합하였다.
d. 튜브를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
e. 샘플을 1mL PBS 첨가함으로써 세정한 후 10분간 300 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 흡인하고 폐기했다.
f. 각 세포 펠릿을 1 mL 희석 완충액에서 재현탁하였다.
샘플을 유세포 분석기(레드 레이져(Red Laser) - 여기: 633-647 nm; 방출: 660 nm)에서 분석하였다. 각 희석 및 음성 대조군 샘플에 대해 양성 gp64-발현 세포 백분율을 기록하였다.
바이러스 역가를 결정하였다:
a. <10%의 gp64-양성 세포%를 산출한 희석 샘플을 선택하였다.
b. 웰 당 세포수(즉, 1 x 106 세포/mL), 최적의 희석 샘플, 및 각 희석 샘플에서 gp64-양성 세포%를 이용하여, 바이러스 역가를 하기의 방정식을 이용해 계산하였다:
Figure pct00001
c. 감염 다중도(MOI)는 세포 당 바이러스 입자수로서 정의된다. 하기의 공식을 이용해 특정 MOI를 수득하는데 첨가할 바이러스 스톡(접종물)의 양을 계산하였다:
Figure pct00002
결과
도 1b에서 나타낸 바와 같이, 현탁 배양으로 성장된 적합화된 Sf9 세포는 부착 배양으로 성장된 세포보다 트랜스펙션 후 제3일 및 제4일 모두에서 mL 당 더 높은 감염성 입자를 생성하였다.
실시예 4: 적합화된 Sf9 세포에서 단백질 발현
적합화된 Sf9 세포를 대략 5 x 106 - 10 x 106 생존 세포/mL의 밀도 및 90% 이상의 생존력에 도달할 때까지 계대배양 및 확장시켰다. 감염 전날, 세포를 실온으로 예비가온시킨 신선한 효모 용해물-미함유 배지를 이용하여 5 x 106 생존 세포/mL의 최종 밀도로 시딩하였다. 플라스크를 부드럽게 휘저어 세포를 혼합하였다. 시딩 직후, 단백질 인핸서를 쉐이크 플라스크에 첨가하였다(표 1 참조). 세포를 오르비탈 쉐이커 플랫폼 상 27℃ 비-가습화된 공기 조절 비-CO2 분위기 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
Figure pct00003
생존 세포 밀도 및 생존력을 단백질 인핸서 첨가 후 18-24시간 후에 결정하였다. 세포 밀도는 약 5 x 106 - 7 x 106 생존 세포/mL이고, ≥ 80% 생존력이었다. 세포를 5의 MOI에서 고-역가 바이러스 스톡을 이용하여 감염시켰다(표1 참조). 세포를 표 1에 나타낸 속도로 오르비탈 쉐이커 플랫폼 상 27℃ 비-가습화된 공기 조절 비-CO2 분위기 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
단백질을 감염 후 24-120시간 후에 세포(또는, 재조합 단백질이 분비되는 경우 배지)로부터 수확하였다.
결과
단백질 인핸서 첨가의 최적 시점은, 감염 전 지시된 시점에서 단백질 인핸서를 첨가하는 상기 프로토콜을 이용하여 결정하였다. 도 2a는 단백질 인핸서를 바큘로바이러스로의 감염 16시간, 20 시간, 24 시간, 또는 28 시간 전에 첨가할 때 적합화된 Sf9 세포에 의해 생성된 단백질 역가(mg/mL)를 나타낸다. 모든 시점에서 역가는 단백질 인핸서 없이((-)인핸서) 성장한 세포보다 더 컸다. 단백질 인핸서와의 인큐베이션은 효모 용해물을 함유하는 배지에서 성장한 Sf9 세포의 단백질 역가에 영향을 미치지 않았다(도 2b).
플라스크/배양물 크기의 함수로서 단백질 역가는, 배지(배양물), 인핸서, 및 바큘로바이러스 스톡 부피(표 2에 지시됨)을 이용하여, 감염 및 단백질 생성 동안 125 mL, 250 mL, 500 mL, 또는 1 L 플라스크에서 적합화된 Sf9 세포를 성장시킴으로써 평가되었다. 단백질 역가는 도 3a에 표시되어 있다. 이들 결과는 이 단백질 발현 프로토콜이 125 mL에서 1 L 플라스크 규모로 직접 확장가능하다는 것을 나타낸다.
Figure pct00004
도 3c에 나타낸 바와 같이, 단백질 발현 프로토콜은 24 딥 웰 플레이트로 축소(scale down)될 수 있다(최종 배양 부피 약 4 mL, 인핸서 부피 16 μL, 바큘로바이러스 스톡 부피 80 μL, 및 250 rpm 진탕 속도).
배양 2-7일에 걸쳐 각 크기의 용기에서 배양된 감염되지 않은 세포에 대한 생존 세포 밀도(VCD) 및 생존력%은 도3B 및 3D에 나타내어져 있다.
"전통적 프로토콜"(단백질 인핸서 없이, 효모 용해물-함유 곤충 세포 배지에서 성장된 Sf9 세포)를 본원에 기술된 강화된 프로토콜과 비교하여, 다중 단백질에 대해, 세포 생존력 및 단백질 생성 역학을 결정하였다. 도 4a는 전통적(굵은 선) 및 강화된(얇은 선) 프로토콜에 있어서 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 바큘로바이러스로 감염 후 세포 생존력을 나타낸다. 도 4b는 전통적(점 막대) 및 강화된(대각선 막대) 프로토콜에 있어서 감염 후 1 내지 4일째 GFP 역가(mg/L)을 나타낸다.
다중 효모 용해물-함유 배지에서 성장된 Sf9 세포에서 바큘로바이러스-매개 단백질 생성을 본원에 기재된 강화된 프로토콜과 비교하였다. 강화된 프로토콜은 더 나은 세포 생존력(도 5a) 및 다중 단백질-발현 바큘로바이러스 구축물로부터 대략 5 내지 8배 높은 단백질 생성을 제공했다(도 5b-5d).
Sf-900™ II 곤충 세포 배지(써모피셔 사이언티픽)에서 성장된 Sf9 세포에서 바큘로바이러스-매개 단백질 생성을 본원에 기재된 강화된 프로토콜과 비교하였다. GUS 활성에 의해 결정된 β-글루쿠로니다아제(GUS)의 발현(도 6a); 상대 발광(도 6b) 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(도 6c)를 기반으로 한 분비된 알칼리 포스파타아제(SEAP); 및 단백질 역가에 의해 결정된 바와 같은 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)(도 6d)는 강화된 프로토콜을 이용하여 모두 적어도 2-배 더 높았다.
재조합 TNF-α 단백질의 활성을 핵 인자 카파 B(NFκB) 루시퍼라아제 검정에서 측정하였다. 간략히, NFκB 반응 요소에 의해 조절된 통합된 루시퍼라아제 리포터 구축물을 함유하는 리포터 세포를 TNF-α로 처리하고, 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. TNF-α 단백질 활성은 TNF-α 단백질을 생성하는데 사용된 프로토콜과 관계 없이 유사하였다(도 6e).

Claims (58)

  1. 바큘로바이러스 발현 시스템으로서,
    (a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지; 및
    (b) 복수의 Sf9 세포를 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 단백질 발현 인핸서(enhancer)를 추가로 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스펙션 시약을 추가로 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 트랜스펙션 시약이 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 또는 중합체계 트랜스펙션 시약인, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 발현 인핸서가 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  6. 제5항에 있어서, HDAC 저해제가 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택되는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  7. 제5항에 있어서, HDAC 저해제가 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A 또는 발프로산인, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 곤충 세포 배지인, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 Sf9 세포가 배지에서 현탁 배양으로 성장이 가능한, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 Sf9 세포가 배지에서 고밀도 성장이 가능한, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  11. 제10항에 있어서, Sf9 세포가 밀리리터 당 약 2 x 106 내지 약 2 x 108 세포 (세포/mL)의 피크 세포 밀도일 수 있는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기 염을 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 토코페롤, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 비타민을 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 바큘로바이러스 벡터를 추가로 포함하는, 바큘로바이러스 발현 시스템.
  15. 곤충 세포 배양을 위한 배지로서, 상기 배지가 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기 염; 및 비타민을 포함하고; 이때 상기 배지는 화학적으로-정의되고 효모 가수분해물-미함유 배지인, 곤충 세포 배양을 위한 배지.
  16. 제15항에 있어서, 배지가 단백질을 포함하지 않는, 배지.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 배지가 동물로부터 유래된 성분을 포함하지 않는, 배지.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민이 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 토코페롤, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 배지.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 염이 곤충 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양으로 존재하는, 배지.
  20. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 당을 추가로 포함하는, 배지.
  21. 제20항에 있어서, 당이 말토오스, 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스, 프룩토오스, 만노오스, 락토오스, 갈락토오스, 덱스트로오스, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 배지.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계를 포함하는 곤충 세포의 성장 방법.
  23. 바큘로바이러스 생성 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계;
    (b) 세포를 박미드(bacmid)로 트랜스펙션시키는 단계; 및
    (c) 바큘로바이러스를 배지 또는 세포로부터 수확하는 단계를 포함하는, 바큘로바이러스 생성 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 양이온성 지질 트랜스펙션 시약 또는 중합체계 트랜스펙션 시약을 이용하여 트랜스펙션되는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9 세포인, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 현탁 배양되는, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에있어서, 곤충 세포가 밀리리터 당 1 x 106 세포 (세포/mL) 내지 2 x 107 세포/mL의 생존 세포 밀도로 존재할 때 트랜스펙션 단계가 수행되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 곤충 세포가 ≥ 90% 생존가능할 때 트랜스펙션 단계가 수행되는, 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 바륨 염, 카드뮴 염, 구리 염, 마그네슘 염, 망간 염, 니켈 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 은 염, 주석 염, 지르코늄 염, 소듐 염 또는 이들의 조합으로부터 선택된 무기 염을 포함하는, 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 파라-아미노벤조산, 비타민 B12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 니코틴산, 니아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민, 토코페롤, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 비타민을 포함하는, 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 트랜스펙션 단계 후 신선한 배지로 변경, 재충전, 대체 또는 보충되지 않는, 방법.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 바큘로바이러스가 밀리리터 당 5 x 107개 이상의 감염성 바이러스 입자(IVP/mL)의 역가를 갖는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 수확된 바큘로바이러스가 1 x 108 IVP/mL 이상의 역가를 갖는, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 수확된 바큘로바이러스가 5 x 107 IVP/mL 내지 1 x 1010 IVP/mL의 역가를 갖는, 방법.
  35. 바큘로바이러스로부터의 표적 단백질 생성 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 화학적으로-정의된, 효모 가수분해물-미함유 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 표적 단백질을 발현하는 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 (b) 이전에 단백질 발현 인핸서를 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 단백질 발현 인핸서가 감염 전 적어도 10시간 전에 첨가되는, 방법.
  38. 제36항에 있어서, 단백질 발현 인핸서가 감염 전 12 시간 내지 36 시간 전에 첨가되는, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 표적 단백질 발현 인핸서가 감염 전 18 시간 내지 24 시간 전에 첨가되는, 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질 발현 인핸서가 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, HDAC 저해제가 아피시딘, 벨리노스타트, CI-994, CRA-024781, 커큐민, 파노비노스타트, 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 수베로일아닐리드 히드록삼산, 트리코스타틴 A, 및 발프로산으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, HDAC 저해제가 소듐 부티레이트, 소듐 페닐부티레이트, 트리코스타틴 A 또는 발프로산인, 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 Sf9 세포인, 방법.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포는 배지에서 고밀도 성장이 가능한 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, Sf9 세포가 밀리리터 당 약 2 x 106 내지 약 2 x 108 세포 (세포/mL)의 피크 세포 밀도일 수 있는, 방법.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 현탁 배양되는, 방법.
  47. 제35항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 밀리리터 당 3 x 106 세포 (세포/mL) 내지 1 x 107 세포/mL의 생존 세포 밀도로 존재할 때 감염 단계가 수행되는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 곤충 세포가 ≥ 80% 생존가능할 때 감염 단계가 수행되는, 방법.
  49. 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스가 1 내지 10의 감염 다중도(MOI)를 갖는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스가 3 내지 7의 MOI를 갖는, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 곤충 세포를 감염시키는데 사용된 바큘로바이러스가 약 5의 MOI를 갖는, 방법.
  52. 제35항 내지 제51항 중 어느 한 항에있어서,
    (c) 표적 단백질을 생성하기 위해 일정 시간 동안 감염된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제35항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    (d) 표적 단백질을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)가 5일 내지 15일이 소요되는, 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 표적 단백질이 감염 후 약 24시간 내지 약 120시간에 수확되는, 방법.
  56. 제35항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 단백질 생성 동안 신선한 배지로 대체, 재충전, 또는 보충되지 않는, 방법.
  57. 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 부착 배양되는, 방법.
  58. 제15항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포가 현탁 배양되는, 방법.
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