KR20210003695A - 신규 핵산과 항원 결정기를 포함하는 나노 복합체를 기반으로 하는 범용 백신 플랫폼 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 범용 백신 신규 플랫폼에 대한 것으로 신규한 아쥬번트, CD4 헬퍼 에피토프, 앵커 펩티드를 포함하는 나노 복합체, 및 백신 조성물로서의 이의 용도에 관한 것으로 특정 항원 또는 항원 특이 에피토프를 임의로 탑재가 가능하게 하였다. 본 발명은 선천성 및 적응성 면역 반응을 효율적으로 활성화시키기 위하여, 아쥬번트에 항원을 용이하게 탑재하기 위한 에피토프의 설계, 도입 및 탑재 플랫폼을 제공한다.

Description

신규 핵산과 항원 결정기를 포함하는 나노 복합체를 기반으로 하는 범용 백신 플랫폼{UNIVERSAL VACCINE PLATFORM BASED ON NANO COMPOSITE COMPRISING NOVEL NUCLEIC ACID AND EPITOPE}
본 발명은 범용 백신 플랫폼으로 사용할 수 있는 신규한 아쥬번트, CD4 헬퍼 에피토프, 임의의 항원 또는 항원 특이 에피토프(항원 결정기)를 수용할 수 있는 앵커 펩티드를 포함하는 나노 복합체, 및 백신 조성물로서의 그의 용도에 관한 것이다.
1) 적절한 적응 면역 반응을 위한 CD4 헬퍼 에피토프
아쥬번트 개발에 있어서 많은 진전에도 불구하고, 대부분은 기존 및 새로운 감염성 질병 또는 악성 종양에서 그 효과가 여전히 만족스럽지 않다. 대부분의 (감염) 예방 백신이 주사시 체액성 면역 반응을 일으켜 감염성 병원체에 대한 중화 항체를 생성하는 반면에 암, 잠복 감염 및 세포내 지속성 감염에 대한 다른 백신은 세포 독성 T 림프구 (CTL)가 매개하는 세포성 면역 반응을 유도한다. CD8 T 세포 반응이 바이러스 제거에 중요하지만 CD4 T 세포 역시 경우에 따라 항 바이러스 반응의 주요 역할을 담당한다.
일단 병원체 또는 항원이 항원 제시 세포내로 삼켜지면, 헬퍼 펩티드가 소화되어 MHC-II에 탑재된 다음에 CD4 T 세포에 제시된다. 이렇게 CD4 T 세포는 B 세포 또는 CD8 T 세포에 다양한 방식으로 방어 면역을 가능하게 하는 필수적인 헬퍼를 제공한다. 이들 CD4 T 세포는 중요한 면역 세포를 이차 림프 기관으로 모집하고, 이펙터 세포 증식과 분화에 헬퍼를 제공하거나, 사이토카인 또는 세포 매개 세포 독성을 통한 직접 작용을 제공하기도 한다. CD4 T 세포는 CD8 T 세포와 이차 림프 조직의 수지상 세포 (Dendritic cells, DC)와의 결합을 촉진하고, 림프절 세포가 배수 림프절로 유입되게 하고, 바이러스 복제 또는 감염 부위로 선천성 또는 항원 특이적 이펙터 세포를 모집한다.
항원에 대한 CD4 T 세포 레퍼토리의 복잡성과 다양성 때문에 CD4 헬퍼 에피토프를 정의하고 평가하는 것은 어려운 일이다. 게다가 방어와 제거에 핵심역할을 제공하는 진정한 CD4 헬퍼 펩티드를 정의하는 것은 더욱 어렵다. 적절한 항체 반응을 위해, 동일한 항원으로부터 B 세포 및 CD4 T 세포에 대해 별개의 에피토프를 제공하는데 항체 반응에 대한 이러한 헬퍼는 주로 폴리큘러 헬퍼 보조세포에 의해 제한된다.
종합하면, CD4 T 세포 헬퍼는 특정 MHC-II상에 탑재된 에피토프 펩티드와 CD4 T 세포상의 CD4 분자 표면 사이의 상호 작용으로 매개된다. 체액성 및 세포성 면역 반응 모두에서 적절한 시간과 공간에서 CD4 에피토프가 제공하는 헬퍼 신호는 T 또는 B 세포를 효율적으로 활성화하는데 매우 중요하다. 종과 항원에 상관없이 헬퍼 신호를 제공하는 비특이적인 CD4 헬퍼 에피토프가 탑재된 범용 백신 기반(플랫폼)이 요구되고 있다.
2) 리보핵산 아쥬번트와 결합하고 항원 특이 에피토프를 수용하는 앵커 펩티드
고유한 양전하로 인해 양이온성 펩티드는 음전하를 띤 핵산(예: DNA, RNA)과 결합하는 경향이 강하고 세포막을 침투하는 잠재력을 가지고 있다. 짧은 염기성 펩티드를 가진 앵커 펩티드는 음전하를 띠는 리보핵산 아쥬번트에 자발적으로 결합하여 자기 조립하여 나노 복합체를 만든다. 이 앵커 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단과 항원 특이 에피토프를 융합하면, 리보핵산 아쥬번트와의 결합이 가능하게 되어, 항원 특이 에피토프를 자기 임의대로 도입할 수 있게 한다.
따라서 본 출원에 기술된 나노 크기의 복합체에 안전하고 강력한 면역 아쥬번트, 보편적인 헬퍼 에피토프, 및 항원 특이 에피토프를 적절히 포함시키는 새로운 방식을 통해, 효율적으로 선천성 면역 반응을 개시하고 적응 면역 반응을 유도 및 유지시킬 수 있다.
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본 발명은 면역원성 에피토프의 표시 및 제시할 때의 비효율 문제점을 해결할 수 있는 신규한 나노 복합체를 제공하고자 한다.
모든 항원이 체액성 및 세포성 반응을 유도하는 면역원성을 갖는 것은 아닌데 이는 부분적으로는 임의의 항원이 적절한 에피토프 서열을 가지고 있지 않기 때문이다. 적절한 예방적 또는 치료적 면역 반응을 위해 백신 항원에 충분한 면역원성을 부여하는 것은 정말 어려운 과제이다. 전체 바이러스 또는 박테리아의 본래 항원은 항원 비의존적 B 세포 수용체에 의해 감지되거나 또는 항원 제시 세포로 도입될 수 있지만, 제대로 표면에 표시되거나 접히지 않은 많은 항원은 효율적으로 항원 제시 세포내로 도입되지 않고, B 또는 T 세포에 효과적으로 제시되지 않는다.
나아가 단일 항원은 면역원성 에피토프 (예를 들어, B 에피토프, CD4 헬퍼 에피토프 또는 CD8 CTL 에피토프) 중 하나를 가지고 있지 않고, 일부 경우에는 면역 억제 에피토프를 가지고 있기도 하다. 인간 유두종 바이러스 (HPV) 주요 캡시드 항원 L1이 자가 조립된 바이러스 유사 파티클 (virus-like particle, VLP)는 바이러스를 모방하는 것으로 강력한 면역원성을 제공하는 좋은 예이지만, VLP상에서 추가 또는 임의의 면역원성 에피토프를 표시하는 것은 새로운 에피토프와 L1 사이의 입체적 방해로 인해 효과적이지 못하고, 여러가지 에피토프를 탑재시에는 더욱더 비효율적이다. 따라서 VLP를 모방하는, 임의의 항원 특이 에피토프를 수용할 수 있는 나노 복합체와 유사한 범용 플랫폼 구축이 필요하다.
본 발명은 또한 에피토프 발견의 어려움을 해결하고자 한다.
모든 항원 에피토프가 효과적인 T 세포 증식을 일으키는 것은 아니므로, 관심 대상의 항원을 표적으로 하는 최선의 에피토프를 확인하는 것이 도전적인 과제이다.
본 발명에서는 또한 백신 항원 확보의 어려움을 해결하고자 한다.
대량으로 백신 항원을 생산하는 것은 어려운 일이고 병원성 미생물의 배양이 요구되는 경우 특히 그렇다. 따라서, 전체 항원이 아닌 지배적인 항원 에피토프가 알려진 경우에는 이러한 에피토프의 사용이 권고된다. 그러나, 에피토프 백신은 효능을 일관되게 나타내지 못하므로, 궁극적인 성공을 가져오지 못하였다. 그 이유는 부분적으로는 에피토프의 잘못된 식별 또는 부적절한 표시 또는 제시, 또는 적절한 면역 반응에 필요한 특정 필수 요소의 부재에 기인한다.
본 발명은 CD4 헬퍼 에피토프가 혼입된 나노 복합체를 제공한다.
면역 에피토프, CD4 헬퍼 펩티드의 존재, 및 적절한 디스플레이가 중요하다는 점을 감안할 때, VLP 모사 나노 복합체 (Nano complex, NC)에 에피토프를 탑재하면 항원 제시 세포로의 적절한 도입 및 B 세포 및 T 세포로의 효율적인 제시가 보장된다. 따라서, 본 발명에서는 바람직하게 리보핵산 기반 아쥬번트, 보편적 또는 항원 특이 CD4 헬퍼 펩티드 복합체를 범용 백신 기반으로 하여, 원하는 짧은 에피토프 (예를 들어 항원 특이 B 세포 또는 T 세포 펩티드)를 임의대로 첨가할 수 있다.
본 발명의 나노 복합체는 전체 항원 또는 도메인을 면역원으로 사용할 수 있다.
CD8 T 또는 B 세포 에피토프의 활성화에 대해 알려진 컨센서스 에피토프가 없는 경우, 에피토프를 찾는 것보다는 전체 항원을 사용하는 것이 합리적이다. 다행스럽게도 본 발명에서 제공하는 긴 길이의 리보핵산으로 사용하면 거의 모든 천연의 항원을 나노 복합체에 혼입할 수 있다. 왜냐하면 어느 정도 이상의 길이를 가지는 모든 천연 항원은 부분적으로 수용성의 양전하 잔기를 가지는 부분이 항상 존재하기, 항원은 이 부위를 통해, 음전하를 띄는 리보핵산 분자와, 비특이적이지만 매우 자발적으로 결합하여, 효율적으로 나노 복합체로 혼입될 수 있다.
본 발명의 나노 복합체는 다중 에피토프를 사용할 수 있다.
어떤 보편적인 백신 플랫폼이 항원이나 에피토프와 결합하여 안정한 복합체로 제조된다면, 항원 제시 세포로 도입되어 항원 특이 매개 면역 반응을 유발할 수 있다. 본 발명에서 제시하는 나노 복합체에서는, 리보핵산 아쥬번트, 헬퍼 펩티드 및 앵커 펩티드의 조성물을 백신에 보통 사용되는 천연 항원 대신 사용할 수 있고, 이에 따라 관심있는 임의의 에피토프가 효과적으로 혼입될 수 있게 한다. 앵커 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단에 임의의 에피토프를 용합시키는 전략으로 에피토프를 나노 복합체 내로 안정하게 탑재하고 효율적으로 혼입시켜 선천 및 적응 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 나노 복합체에 따르면, 항원 또는 CD4 헬퍼 에피토프(펩티드)와 리보핵산의 양을 조절함으로써, 혼입하고자 하는 펩티드의 상대적인 비율을 임의대로 조절할 수 있다. 따라서, 필요에 따라서는 두가지 이상의 펩티드나 항원을 추가 또는 교체할 수 있다는 점에서, 본 발명의 나노 복합체는 기능적 다양성을 갖춘 보편적인 백신 플랫폼으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제시된 리보핵산 중 하나인 VP11(VP10 또는 NA로도 지칭됨)과 양이온성 앵커 펩티드(MR7) 복합체가 제공하는 항원 비의존성 면역 강화 효과를 나타낸다(실시예 1).
도 1a는 리보핵산 VP11에 양이온성 앵커 펩티드(7개의 아르기닌 (R) (MR7))가 착화된 항원 미포함 나노 복합체 VP11/MR7 복합체의 제조를 나타낸 모식도이다.
도 1b는 상기 나노 복합체를 마우스에 비강투여하고 인플루엔자 바이러스를 접종하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 1c는 도 1b에 따라 실험을 진행한 뒤, 0일부터 14일까지 마우스의 상대적인 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 1d는 도 1b에 따라 실험을 진행한 뒤, 0일부터 14일까지 마우스의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 리보핵산 VP11과 양이온성 앵커 펩티드(MR10) 복합체가 제공하는 항원 비의존성 면역 강화 효과를 나타낸다(실시예 2).
도 2a는 리보핵산 VP11에 양이온성 앵커 펩티드 (10개의 아르기닌 (R) (MR10))가 착화된 항원 미포함 나노 복합체 VP11/MR10 복합체의 제조를 나타낸 모식도이다.
도 2b는 실시예 2의 나노 복합체를 마우스에 투여하고 림프구성 맥락수막염바이러스(LCMV)를 접종하여 혈액을 채취하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 2c는 도 2b에 따라 실험을 진행한 뒤, 5일 째에 채혈하여 측정된 혈액내 바이러스 로드를 나타낸 그래프이다.
도 2d는 도 2b에 따라 실험을 진행한 뒤, 8일 째에 채혈하여 측정된 혈액내 바이러스 로드를 나타낸 그래프이다.
도 3은 리보핵산 VP11(NA로도 지칭됨)과 양이온성 앵커 펩티드(MR7, MR10, MR15, MR20 및 MR25)의 복합체가 제공하는 안전성을 나타낸다(실시예 3).
도 3a는 리보핵산 VP11/양이온성 앵커(MR7. MR10, MR15, MR20 및 MR25) 복합체를 마우스에 복강투여하고 혈액 및 비장을 채취하는 과정을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 3b는 혈청내 인터페론 베타 발현 수준을 분석한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 비장 DC 세포에서 표면 CD80, CD86 및 MHC-II 발현의 평균 형광 강도 (MFI)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 리보핵산 NA에 탑재된 M2e 에피토프 백신이 제공하는 능동 방어 면역을 나타낸다(실시예 4).
도 4a는 상기 백신을 마우스에 비강 투여하고 인플루엔자 바이러스를 접종하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 4b는 도 4a에 따라 실험을 진행한 뒤, 0일부터 14일까지 마우스의 상대적인 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4c는 도 4a에 따라 실험을 진행한 뒤, 0일부터 14일까지 마우스의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 리보핵산 NA(NVT로도 지칭됨)에 착화된 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 바이러스 LMY 주(iPRRS) 전바이러스(whole virus) 백신이 제공하는 방어 면역을 나타낸다(실시예 5).
도 5a는 상기 백신을 마우스에 근육 내 투여하고 iPRRS LMY주를 접종하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 5b는 도 5a에 따라 실험을 진행한 뒤 얻어진 항체반응 정도를 나타낸다.
도 5c는 도 5a에 따라 실험을 진행한 뒤 얻어진 중화항체 유도능을 나타낸다.
도 6은 리보핵산 VP11에 탑재된 그룹B 스트렙토코커스 (GBS) 래치(latch) 에피토프 백신이 제공하는 능동 방어 면역을 나타낸다.
도 6a는 상기 백신을 마우스에 복강투여하고 GBS를 접종하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 6b는 각 조성비의 백신에 대해, 도 6a에 따라 실험을 진행한 뒤, 0일 부터 4일까지 마우스의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 리보핵산 VP11 (NA로도 지칭됨) 아쥬번트, 헬퍼 펩티드, M2e 에피토프 및 스쿠알렌으로 구성된 M2e 인플루엔자 펩티드 백신의 조성과 에피토프 특이 IgG 생산에 대한 헬퍼 펩티드의 강화 효과를 나타낸다(실시예 7).
도 7a는 본 발명의 백신 플랫폼을 구성하는 리보핵산 아쥬번트, CD4 헬퍼 펩티드, M2e 특이 B 세포 에피토프 및 스쿠알렌 수중유로 구성된 나노 복합체 (NC)를 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 7b는 상기 나노 복합체를 마우스에 근육내 주사하고 혈액을 채취하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 7c는 도 7b에 따라 실험을 진행한 뒤, Naive 군, 헬퍼 펩티드 비투여군 및 헬퍼 펩티드 투여군에서 항-M2e IgG1 및 IgG2a의 증가를 나타낸 그래프이다.
도 7d는 도 7b에 따라 실험을 진행한 뒤, Naive 군, 헬퍼 펩티드 비투여군 및 헬퍼 펩티드 투여군에서 인터페론 감마 발현 CD4 T cell 분획을 나타낸 그래프이다.
도 8은 리보핵산 VP11이 착화된 오브알부민 (OVA) 백신에 CD4 헬퍼 펩티드의 탑재가 제공하는 면역반응을 나타낸다.
도 8a는 파상풍 (TT) 항원과 디프테리아 (DT) 항원으로부터 유래한 CD4 헬퍼 펩티드에 링커 (G3)와 양이온성 앵커 (R8)를 융합하여, OVA와 함께 리보핵산 VP11에 착화시킨 백신 조성물을 마우스에 근육 주사하고 혈액을 채취하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 8b는 도 8a에 따라 실험을 진행한 뒤, Th2 의존성 항-OVA IgG1 및 Th1- 의존성 항-OVA IgG2a의 수준을 나타낸 그래프이다.
도 8c는 도 8b에 따라 실험을 진행한 뒤, 비장에서 면역 세포의 수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 리보핵산 VP11이 착화된 OVA CD8 에피토프에 백신 CD4 헬퍼 펩티드의 탑재가 제공하는 흑색종 증식 억제 효과를 나타낸다.
도 9a는 상기 조성물을 마우스에 근육 주사하는 것을 포함하는 실험 스케줄을 나타낸다.
도 9b는 상기 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 제시된 나노 백신 복합체 (NVC) 및 수중유 에멀젼의 모식도를 나타낸다. 면역강화제 역할을 하는 리보핵산 아쥬번트는 추가적으로 항원을 복합체에 착화시키는 운반체 역할도 한다.
도 10a는 아쥬번트/헬퍼 펩티드에 착화된 짧은 에피토프 백신 나노 복합체의 모식도이며, 수중유 에멀젼은 필요에 따라 추가된다. 구체적으로는 임의의 짧은 항원결정기 (에피토프)를 나노 백신 복합체에 싣고자 하는 경우에는 양전하를 띄는 앵커 펩티드에 이 에피토프를 융합시켜 이 융합된 앵커가 리보핵산과 복합체를 이루게 하는 식으로 탑재한다.
도 10b는 아쥬번트/헬퍼 펩티드에 착화된 항원 단백질 백신 나노 복합체의 모식도이며, 수중유 에멀젼은 필요에 따라 추가된다. 항원 전체 또는 일부 도메인을 항원으로 나노백신 복합체에 싣고자 하면 이들 항원이 외부에 부분적으로 양이온을 가지는 부분이 충분히 있으면 직접적으로 강한 음전하의 리보핵산과 직접 복합체를 이루게 할 수도 있고, 항원에 양전하가 부족하면 이 항원을 상기한 앵커에 융합하여 상기한 대로 복합체에 탑재를 할 수 있다. 즉 리보핵산 자체가 강한 음전하를 가지기에 항원과 비공유 결합하는 스캐폴드 기능을 담당한다.
각 구성 요소는 리보핵산 아쥬번트 (R), 세포독성 림프구 (CTL) CD8 에피토프, CD4 헬퍼 에피토프, 링커 접합된 앵커 펩티드 (A), 수중유 (OIW) 용액인 스쿠알렌 (S), 부분 또는 전체 항원 (Ag)을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 아쥬번트로서 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA), CD4 헬퍼 에피토프, 및 항원 또는 항원 결정기(에피토프)가 수용된 앵커 펩티드를 포함하며, 상기 혼합구조 리보핵산 (hsRNA)은 특정 가능한 임의의 길이와 특정 서열을 가진 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)이 중간에 위치하고, 역시 특정 가능한 길이와 서열을 가지는 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)이 양쪽 3' 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체를 제공한다. 일 실시태양에서, 상기 나노 복합체는 수중유 에멀젼을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 TLR3 리간드로 작용할 수 있고, 140 내지 1682 base의 염기 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 200 내지 1500 base, 더욱 바람직하게는 300 내지 1000 base, 가장 바람직하게는 400 내지 900 base일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)의 염기 길이는 20% 범위 내에서 증가 또는 감소될 수 있다. 바람직하게는, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 서열번호 30과 서열번호 61의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 533의 염기 길이를 갖는 hsRNA일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 hsRNA는 정해진 일정한 길이의 두가닥의 염기서열의 상보적인 결합을 통해 만들어질 수 있다. 이때 두가닥의 염기서열은 서로 상보적으로 결합하는 서열을 포함하나, 각 염기서열의 3' 말단의 일정한 길이에는 비상보적인 서열이 존재하여 해당 부분은 대응하는 다른 염기서열과 dsRNA를 형성하지 않는다. 구체적 실시태양에서, 서열 번호 1 및 서열번호 32에 포함된 서로 상보적으로 결합하는 서열인 1번 내지 106번 염기는 결합하여 dsRNA를 구성하고, 각 서열의 3' 말단인 107번 내지 123번 염기(17개의 염기)는 비상보적인 서열로서 결합하지 않고 ssRNA 오버행 (overhang)을 구성함으로서, 서열번호 1과 서열번호 32의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 hsRNA인 NA 1001이 될 수 있다. 다른 실시태양에서, 서열번호 2 내지 29는 각각 서열번호 33 내지 60과 각 염기서열의 3' 말단에 존재하는 17개의 염기를 제외하고 상보적으로 결합하여 dsRNA를 구성한다. 다른 일 실시태양에서, 서열번호 30 및 서열번호 61의 결합으로 형성된 NA (동일물질 NVT, VP1, VP10)는 각 염기서열의 3' 말단에 존재하는 비상보적인 서열인 58개 및 51개의 염기를 제외하고 상보적으로 결합하여 형성된 것일 수 있다. 또다른 일 실시태양에서, 서열번호 31 및 서열번호 62의 결합으로 형성된 NVT IV (NVT 4, VP20)는 각 염기서열의 3' 말단에 존재하는 비상보적인 서열인 69개 및 75개의 염기를 제외하고 상보적으로 결합하여 형성된 것일 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 TLR3 리간드로 작용할 수 있고, dsRNA 부분의 염기 길이는 106 내지 1648 bp일 수 있으며, 바람직하게는 200 내지 1500 bp, 더욱 바람직하게는 300 내지 1000 bp, 가장 바람직하게는 400 내지 900 bp일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)의 염기 길이는 20% 범위 내에서 증가 또는 감소될 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 ssRNA는 어떠한 서열이라도 추가 변경 수정이 가능한 임의의 길이와 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 ssRNA는 TLR7 유사 리간드 또는 TLR8 유사 리간드로 작용할 수 있으며, TLR7 리간드로 작용하는 G/U 서열, 바람직하게는 GUU 반복서열을 가질 수 있고, 10 base 이상의 길이, 바람직하게는 15 내지 80 base의 길이, 더욱 바람직하게는 17 내지 75 base의 길이를 가질 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 수지상 세포, 호중구, B 세포, 대식세포, T 세포, 비만세포 및 자연살해세포를 포함하는 면역 세포를 활성화시키는 것일 수 있다.
본 발명은 아쥬번트로서 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA), CD4 헬퍼 에피토프, 및 항원 또는 에피토프 수용된 앵커 펩티드를 포함하며, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)으로부터 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)을 제거하여 제작한 것으로서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 및 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)을 포함하는 것으로, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 상보성을 가지고 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)의 중간에 위치하고, 상기 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)은 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)의 양쪽 3'-말단에 각각 위치하며 임의의 길이와 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체를 제공한다. 즉, 상기 dsRNA는 상기 hsRNA에 RNAse T1을 처리하여 ssRNA를 제거한 형태의 dsRNA일 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 나노 복합체는 수중유 에멀젼을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 서열번호 63 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열 및 이와 상보적으로 결합하는 염기서열을 포함하고, TLR3 리간드로 작용하는 것일 수 있고, 상기 dsRNA의 염기 길이는 106, 156, 206, 306, 319, 397, 406, 424,466, 506, 588, 606, 664, 706, 733, 806, 822, 885, 1032, 1153 또는 1648 bp일 수 있다. 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 수지상 세포, 호중구, B 세포, 대식세포, T 세포, 비만세포 및 자연살해세포를 포함하는 면역 세포를 활성화시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 리보핵산의 명칭과 기본정보는 하기 표 1 및 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 동일한 길이와 서열을 가지나 여러 명칭으로 기재된 것이 있는데 NA, NVT (Next Adjuvant의 약어), VP1, VP10, VP11이 그 한 예이다. 다만 VP11은 VP10 hsRNA를 RNase T1으로 처리한 dsRNA이다. 또한 NVT IV (NVT 4)와 VP20은 동일한 리보핵산을 의미한다.
상기 hsRNA 또는 dsRNA는 하기 표 1에 나타난 서열번호의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다. 하기 표 1은 본 발명의 실시태양을 구성하는 각 hsRNA 또는 dsRNA와 서열의 대응관계를 나타낸 것이다.
명칭 hsRNA를 구성하는 서열번호 dsRNA 부분의 서열번호
NA1001 서열번호 1 및 서열번호 32의 결합 서열번호 63
NA1501 서열번호 2 및 서열번호 33의 결합 서열번호 64
NA2001 서열번호 3 및 서열번호 34의 결합 서열번호 65
NA3001 서열번호 4 및 서열번호 35의 결합 서열번호 66
NA4001 서열번호 5 및 서열번호 36의 결합 서열번호 67
NA5001 서열번호 6 및 서열번호 37의 결합 서열번호 68
NA6001 서열번호 7 및 서열번호 38의 결합 서열번호 69
NA7001 서열번호 8 및 서열번호 39의 결합 서열번호 70
NA8001 서열번호 9 및 서열번호 40의 결합 서열번호 71
NA1002 서열번호 10 및 서열번호 41의 결합 서열번호 72
NA1502 서열번호 11 및 서열번호 42의 결합 서열번호 73
NA2002 서열번호 12 및 서열번호 43의 결합 서열번호 74
NA3002 서열번호 13 및 서열번호 44의 결합 서열번호 75
NA4002 서열번호 14 및 서열번호 45의 결합 서열번호 76
NA5002 서열번호 15 및 서열번호 46의 결합 서열번호 77
NA6002 서열번호 16 및 서열번호 47의 결합 서열번호 78
NA7002 서열번호 17 및 서열번호 48의 결합 서열번호 79
NA8002 서열번호 18 및 서열번호 49의 결합 서열번호 80
R1 서열번호 19 및 서열번호 50의 결합 서열번호 81
R2 서열번호 20 및 서열번호 51의 결합 서열번호 82
R3 서열번호 21 및 서열번호 52의 결합 서열번호 83
R4 서열번호 22 및 서열번호 53의 결합 서열번호 84
R5 서열번호 23 및 서열번호 54의 결합 서열번호 85
R6 서열번호 24 및 서열번호 55의 결합 서열번호 86
R7 서열번호 25 및 서열번호 56의 결합 서열번호 87
R8 서열번호 26 및 서열번호 57의 결합 서열번호 88
R9 서열번호 27 및 서열번호 58의 결합 서열번호 89
R10 서열번호 28 및 서열번호 59의 결합 서열번호 90
R11 서열번호 29 및 서열번호 60의 결합 서열번호 91
NA,NVT,
VP1,
VP10		 서열번호 30 및 서열번호 61의 결합 서열번호 92
NVT IV,NVT 4,
VP20		 서열번호 31 및 서열번호 62의 결합 서열번호 93
본 발명의 4가지 다른 백본의 벡터에서 유래한 hsRNA를 표 2에 열거하였다. 이하 실시예에서는 각 hsRNA를 각 명칭으로 지칭한다.
명칭 hsRNA (base) dsRNA (bp) Upper ssRNA (base) Lower ssRNA (base) hsRNA-20% (base) hsRNA+ 20% (base) dsRNA- 20% (base) dsRNA+ 20% (base) Backbone Group
NA1001 140 106 17 17 112 168 85 127 1
NA1501 190 156 17 17 152 228 125 187 1
NA2001 240 206 17 17 192 288 165 247 1
NA3001 340 306 17 17 272 408 245 367 1
NA4001 440 406 17 17 352 528 325 487 1
NA5001 540 506 17 17 432 648 405 607 1
NA6001 640 606 17 17 512 768 485 727 1
NA7001 740 706 17 17 592 888 565 847 1
NA8001 840 806 17 17 672 1008 645 967 1
NA1002 140 106 17 17 112 168 85 127 2
NA1502 190 156 17 17 152 228 125 187 2
NA2002 240 206 17 17 192 288 165 247 2
NA3002 340 306 17 17 272 408 245 367 2
NA4002 440 406 17 17 352 528 325 487 2
NA5002 540 506 17 17 432 648 405 607 2
NA6002 640 606 17 17 512 768 485 727 2
NA7002 740 706 17 17 592 888 565 847 2
NA8002 840 806 17 17 672 1008 645 967 2
R1 353 319 17 17 282 424 255 383 3
R2 431 397 17 17 345 517 318 476 3
R3 500 466 17 17 400 600 373 559 3
R4 622 588 17 17 498 746 470 706 3
R5 698 664 17 17 558 838 531 797 3
R6 767 733 17 17 614 920 586 880 3
R7 856 822 17 17 685 1027 658 986 3
R8 919 885 17 17 735 1103 708 1062 3
R9 1066 1032 17 17 853 1279 826 1238 3
R10 1187 1153 17 17 950 1424 922 1384 3
R11 1682 1648 17 17 1346 2018 1318 1978 3
NA, NVT, VP1, VP10 533 424 51 58 426 640 339 509 4
NVT IV,
NVT 4,
VP20		 568 424 75 69 454 682 339 509 4
* VP11 is Rnase T1-treated VP10 (VP1)
일 실시태양에서, 상기 CD4 헬퍼 에피토프는 서열번호 94를 갖는 파상풍 에피토프, 서열번호 95를 갖는 디프테리아 에피토프, 및 서열번호 96을 갖는 에피토프로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 앵커 펩티드는 7 내지 25개의 아르기닌을 포함하는 양이온성 펩티드일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 수중유 에멀젼은 스쿠알렌 수중유 에멀젼일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시태양에서, 상기 항원 또는 항원 결정기(에피토프)는 (i) 불활성화 또는 살아있는 약독화 생물체 또는 세포에서 기원한 항원의 전체 또는 일부; (ii) 인공적으로 발현시켜 정제한 항원의 전체 또는 일부; 또는 (iii) 시험관 내에서 합성된 에피토프일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스 M2e 단백질, 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 전바이러스(whole virus), 또는 그룹B 스트렙토코커스 (GBS)의 래치(Latch) 단백질을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 상기 항원 결정기(에피토프)는 B 세포 에피토프, CD8 T 세포 에피토프, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 바람직하게는, 서열번호 97을 갖는 인플루엔자 바이러스 M2e 단백질의 에피토프, 또는 서열번호 98을 갖는 그룹B 스트렙토코커스 (GBS)의 래치(Latch) 단백질의 에피토프를 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 상기 나노 복합체를 포함하는, 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예 중 하나는 양이온성 앵커 펩티드 상에 단일 또는 다중 에피토프를 융합하여 아쥬번트에 용이하게 탑재한 나노 복합체에 관한 것으로, 이러한 복합체를 사용시 항원 세포 내로의 에피토프 전달 효율이 높아진다.
본 발명의 조성물의 구체예는 감염성 질환 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 숙주 면역 반응을 유도하기 위해, 항원 외에도, 항원 특이적 펩티드를 내포하는 앵커 펩티드 및 본 발명의 리보핵산을 포함한다. 본 발명은 또한 에피토프를 리보핵산 아쥬번트(운반체)에 탑재시키는 앵커를 함유하는 약제학적 조성물, 백신 및 생물학적 제제 또는 그의 임의의 성분을 제공한다.
본 발명은 아쥬번트 및 항원 수용체 역할을 하는 리보핵산, 양이온성 앵커 펩티드, 및 보편적 또는 항원 특이적 CD4 헬퍼 에피토프(펩티드)가 혼입된 유니버설 백신 플랫폼에 관한 것으로, 이를 이용하여 항원 에피토프 특이적 T 세포를 증강시킬 수 있다. 구체적으로, 최적의 길이 및 서열을 갖는 고도로 음전하를 띄는 리보핵산은 양이온성 앵커 펩티드와 CD4 헬퍼 펩티드에 착화하여 서브 마이크로미터, 나노 크기의 바이러스 유사 입자(VLP)를 모사하는 나노 복합체를 형성하며, 이의 표면에 에피토프를 제시한다. 본 발명의 VLP 모사 나노 복합체는 이온 결합 또는 대식 작용을 통한 막 융합을 거쳐 항원 제시 세포 (즉, 수지상 세포 및 대식세포) 내로의 용이하게 도입될 수 있고, 표시된 에피토프는 효율적으로 제시될 수 있다.
임의의 모든 항원을 두 가지 방법으로 이 나노 복합체 플랫폼에 탑재할 수 있다. 이들은 1) 항원 전체 또는 부분, 불활성화 또는 살아있는 바이러스 또는 세균 항원을 직접 준비하거나, 또는 2) 항원 특이적인 짧은 에피토프를 주어진 앵커 펩티드의 아미노 또는 카복시 말단에 융합한 후, 이들 각각을 리보핵산과 헬퍼 펩티드와 혼합시키는 방법이다. 이들 나노 복합체 표면에는 CD4 헬퍼 에피토프와 더불어 표적 특이적 에피토프(또는 항원)가 제시되어 최대 면역성을 부여할 수 있다. 상기 나노 복합체는 임의의 항원(전체, 부분, 약독화, 불활성화, 서브 단위, 재조합, 톡소이드 또는 접합된 형태) 또는 항원 특이적인 짧은 B 세포 또는 T 세포 에피토프를 임의로 적재하거나 변경할 수 있다. 또다른 구현 예에서는, 상기 나노 복합체는 주어진 항원 에피토프에 대한 기억 T 세포를 장기간 배양 없이 짧은 시간내에 PBMC에서 실질적으로 증강시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 범용 백신 플랫폼은 바람직하게는 본 발명에서 제시하는 리보핵산 기반 아쥬번트, CD4 헬퍼 에피토프, 및 리보핵산에 자발적으로 결합하는 앵커 펩티드로 구성된 나노 복합체를 기반으로 한다. 여기에 임의의 항원 에피토프 (예: 항원 특이 B 세포 또는 T 세포 펩티드)를 추가하기 위해, 상기 항원 에피토프를 상기 앵커 펩티드에 접합하여 상기의 복합체에 탑재를 할 수 있다. 또한 펩티드가 아닌 항원의 전부 또는 일부를 탑재하기 위해서는 해당 항원의 등전하점 (PI)을 고려하여 적당한 수소이온 농도 (pH)의 버퍼에 용해시킨 후 리보핵산 아쥬번트에 혼입하여 복합체를 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
리보핵산 VP11과 양이온성 앵커 펩티드 복합체가 제공하는 항원 비의존성 면역 강화 효과 확인
본 발명의 리보핵산 VP11이 제공하는 면역강화를 검사하기 위하여, 항원이 없는 조건하에서 VP11에 양이온성 앵커 펩티드(7개의 아르기닌(R) (MR7))가 착화된 항원 미포함 나노 복합체 VP11/MR7를 제조하였다. 이 복합체에 포함된 양이온성 앵커는 면역학적으로 불활성인 것을 선택하였다(도 1a).
7주령의 5 마리의 암컷 Balb/c 마우스를 마취시킨 후, 비강 분무기 (비강 점적 참조)를 통하여 -3, 0, 3, 6, 9 일에 비강내로 나노 복합체 VP11/MR7을 투여하여 총 5회 투여하였다(도 1b). 0일째에는 치사량의 3배수의 생인플루엔자 바이러스(3MLD50 PR8 LIV)를 접종하였다. 대조군으로 PBS 투여군과 PBS 투여/Tamiflu 접종군을 포함하였다.
0일 부터 14일까지의 상대적인 체중 변화 및 생존율을 측정하여 도 1c 및 도 1d에 나타내었다. 그 결과, 항원 비의존적 면역 강화제로서, 리보핵산 복합체는 바이러스 감염 관련 사망으로부터 40 %에 해당하는 마우스를 보호할 수 있는 것으로 나타났다.
리보핵산 VP11과 양이온성 앵커 펩티드 복합체가 제공하는 항원 비의존성 면역 강화 효과 확인
본 발명의 리보핵산 VP11이 제공하는 면역강화를 검사하기 위하여, 항원이 없는 조건하에서 VP11에 양이온성 앵커 펩티드(10개의 아르기닌(R) (MR10))가 착화된 항원 미포함 나노 복합체 VP11/MR10을 제조하였다(도 2a).
7주령의 5 마리의 암컷 Balb/c 마우스를 마취시킨 후, 비강 분무기(비강 점적)를 통하여 -3, 0, 3, 6 일에 비강내로 나노 복합체 VP11/MR10을 투여하여 총 4회 진행하였다(도 2b). 0일째에는 LCMV clone 13을 정맥내로 접종하였다. 대조군으로 PBS 단독군을 포함하였다.
5일과 8일째에 채혈하여 혈액내 바이러스 로드를 측정하였다(도 2c, 도 2d). 그 결과, 항원 비의존적 면역 강화제로서, 리보핵산 복합체는 혈액내 바이러스 로드(LCMV 급성 복제)를 30 퍼센트 정도 감소시켰다.
리보핵산/앵커 펩티드 복합체의 안전성
리보핵산을 양이온성 앵커에 착화시키면 혈청내 리보핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다. 또한, 앵커 말단에 원하는 펩티드를 융합하여 임의의 에피토프를 리보핵산에 추가적으로 혼입할 수 있다.
우선, 앵커에 의한 부작용 또는 면역학적 성질을 알아보기 위해 7 내지 25개의 양이온성 아르기닌 (R)으로 구성된 양이온성 앵커(MR7, MR10, MR15, MR20, MR25)와 리보핵산 VP11의 복합체를 제조하여 이의 초급성 및 급성 효과를 선천성 면역학 프로파일을 통해 조사하였다.
6주령의 3 마리의 암컷 C57BL/6J 마우스 복강내로 리보핵산/앵커 펩티드 복합체를 1회 주사한 후, 4 시간, 8 시간 및 24 시간 후에 혈액 및 비장을 회수하여 혈청 인터페론 베타 (IFN-β)를 ELISA로 분석하였고, 수지상 세포 활성 마커인 표면 CD80, CD86 및 MHC-II 발현 수준을 유세포분석을 통해 평균 형광 강도로서 분석하였다.
회수한 비장은 작은 조각으로 절단하고 상온에서 20 분 동안 콜라게나제를 함유하는 2 % 태아 우혈청 (FCS)으로 절단 소화시켰다. 소화된 세포를 원심 분리하고 펠릿을 1.077 Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5 mL에 재현탁시켰다. 추가의 Histopaque는 아래에 층을 이루고 EDTA-FCS는 세포 현탁액 위에 층을 이루도록 1700g에서 10 분간 원심분리하였다.
수지상 세포 분리를 위해 다음과 같은 FITC-접합 모노클로날 항체 (mAb)들, 항-CD3 (17A2), 항-Thy1.1 (OX-7), 항-CD3, 항-B220 (RA3-6B2), 항-Gr1 (RB68C5), 항-CD49b (DX5) 및 항-TER-119 (TER-119)를 사용하였다. 수지상 세포 분리를 위해 전방 산란 및 측방 산란에 기초한 단핵 세포에 대한 게이팅을 수행한 다음, cDC로 정의된 Lineage-CD11c+ 세포에 추가 게이팅을 실시하여 CD8α+/CD11c+ 및 CD8α-/CD11c+ cDC로 더 나누었다.
비장 수지상 세포 활성화는 공동 자극 인자(CD40, CD86 및 MHCII) FACS Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 결정하였다. 이를 위해 세포를 0.5 % BSA를 함유하는 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 표지되지 않은 이소형 대조군 Ab로 15 분간 예비 배양한 다음, PBS로 세척한 후 30 분 동안 얼음 배양하여 형광물질 접합된 항체로 표지하였다. 전방 및 측면 산란시 게이트를 사용하여 죽은 세포 파편을 제거했다. 생존성 게이트를 위해 7-amino actinomycin D (7AAD) 염색을 사용하였다. 이어서 7AAD 음성 집단을 FACS Aria II를 사용하여 분석하고 FlowJo 8.6 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과 주사 후 초급성(4, 8 시간) 및 급성(24 시간) 시간에서 본 발명의 리보핵산은 생체 내에서 선천성 면역을 활성화시켰으나, 리보핵산과 앵커와의 복합체는 리보핵산 이상의 활성이나 독성을 나타내지는 않았다. 즉, 리보핵산 앵커의 복합체는 본질적으로 선천성 면역반응을 나타내나 이는 리보핵산에 의한 결과이지 앵커를 구성하는 양이온성 펩티드에 의한 것이 아님을 알 수 있었다. 이로부터 양이온성 펩티드는 본질적으로 면역학적으로 비활성이며 안전함을 알 수 있다.
리보핵산 아쥬번트와 착화된 M2e 펩티드 백신의 능동 방어 면역 분석
헬퍼 펩티드와 스쿠알렌이 모두 없는 조건하에서 방어 면역을 제공하는 정도를 시험하기 위하여, 리보핵산 아쥬번트 NA에 M2e 에피토프를 착화시킨 백신 복합체(M2e+NA)를 제조하였다.
6-8주령의 5 마리의 암컷 Balb/c 마우스를 마취시키고, 비강내로(비강 점적) 백신 복합체(M2e+NA)를 -21, -7일에 투여하여 총 2회 진행하였다(도 4a). 0일째에는 치사량의 PR8 (A/H1N1) LIV를 공격 접종하였다. 대조군으로 PBS 단독군과 M2e 펩티드 단독군을 사용하였다.
0일부터 14일까지의 상대적인 체중 변화 및 생존율을 측정하여 도 4b 및 도 4c에 나타내었다. 그 결과, 백신 복합체(M2e+NA)는 모든 마우스에 효과적인 방어 면역을 제공하여, 모든 마우스는 생존한 것으로 확인되었다. 이에 반해 대조군들에서는 8일째 모두 사망하였다. 이로부터 본 발명의 아쥬번트에 기초한 펩티드 백신의 타당성이 입증되었다.
리보핵산 아쥬번트와 착화된 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 바이러스 LMY 주(iPRRS) 전바이러스(whole virus) 백신의 방어 면역 분석
본 실시예에서는 기니피그를 대상으로 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 바이러스 LMY 주(iPRRS) 전바이러스(whole virus)에 대한 방어 면역 생성여부를 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 리보핵산 아쥬번트 NA(도 5a에서는 NVT로 표기됨), 대조군 아쥬번트로서 Incomplete Freund's Adjuvant(IFA), Complete Freund's Adjuvant(CFA)를 사용하여, 이들 아쥬번트에 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 바이러스 LMY 주(iPRRS) 전바이러스(whole virus) 항원(iPRRS LMY strain)을 각각 착화시켜 백신 복합체를 제조하였다. 각 아쥬번트 당 2마리의 기니피그를 사용하였다. 0일 및 14일에 각각의 백신 복합체(iPRRS LMY strain + 아쥬번트)를 근육 주사하고 28일째에 채혈하여 혈청 내 총 a-PRRS 항체를 ELISA로 측정하였다. 또한 PRRS 감염 억제능을 MARC 세포주를 이용하여 결정하였다.
그 결과는 도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, NA(NVT)가 강력한 아쥬번트인 IFA보다 우수한 항체반응 역가를 나타내었고, CFA와 비교하여도 이와 유사한 항체반응 역가를 나타내었다. 또한 NA(NVT)는 기존의 두가지 아쥬번트에 비해 PRRS 바이러스의 감염을 억제하는 중화항체를 더 강력하게 유도하였다.
리보핵산 아쥬번트에 탑재한 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS) 래치(Latch) 펩티드 백신의 능동 방어 면역 분석
실시예 4와 유사하게, 리보핵산 VP11에 탑재한 세균성 에피토프 백신의 방어 면역 효과를 분석하기 위하여, 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS) 래치(Latch) 에피토프 (GSGDSDANAEIKLL)를 앵커 펩티드에 용합시킨 Ac-GSGDSDANAEIKLL (G)4(R)7-amid를 리보핵산 VP11에 착화시켰다.
6-8주령의 5 마리의 암컷 Balb/c 마우스에, 백신 조성물을 복강내로 -21, -7일에 투여하여 총 2회 진행하였다(도 6a). 백신 조성물은 도 6b와 같은 비율로 투여하였다.
0일째에는 병원성 생(live) GBS (2603V/R)를 정맥내로 공격 접종하였다. 감염 후 4일까지의 생존율을 조사하였다. 그 결과, 백신 조성물에서 래치(Latch) 에피토프가 많을수록 치명적인 GBS 감염으로 인한 치사에서 더 많은 마우스를 보호하여 생존시킬 수 있었다.
리보핵산 아쥬번트, 헬퍼 펩티드, M2e 에피토프, 및 스쿠알렌으로 구성된 M2e 인플루엔자 펩티드 백신의 조성 및 에피토프 특이 IgG 생산에 대한 헬퍼 펩티드의 강화 효과
본 발명의 백신 플랫폼을 구성하는 리보핵산 VP11 아쥬번트, CD4 헬퍼 펩티드, M2e 특이 B 세포 에피토프 및 스쿠알렌으로 나노 복합체(NC)를 생성하였다. 먼저 아쥬번트, 헬퍼 펩티드 및 M2e 에피토프를 수용액상에서 현탁한 다음 스쿠알렌을 넣고 유화시켜 제조하였다(도 7a). 나노 복합체는 초음파 처리에 의해 스쿠알렌과 유화되었다.
6주령의 4마리의 암컷 Balb/c 마우스에, 상기 나노 복합체를 0일, 14일째에 근육내로 총 2회 투여하였다(도 7b). 그 다음, 35, 42일에 채혈하여 ELISA와 유세포분석을 수행하였다. 대조군으로 Naive군과 헬퍼 펩티드 비포함군을 포함하였다.
리보핵산에 탑재된 Me2 에피토프와 헬퍼 펩티드의 백신 복합체 접종에 의하여 인터페론 감마 발현 CD4 T 세포 분획과 항-M2e의 총 IgG가 크게 증가함을 확인하였다(도 7c, 7d). 따라서, CD4 헬퍼 펩티드의 탑재가 항원 특이 에피토프에 대한 면역 반응을 증강시킴을 알 수 있다.
리보핵산이 착화된 오브알부민 (OVA) 백신에 CD4 헬퍼 펩티드 포함시의 면역 반응 확인
실시예 7에서 보편적인 CD4 헬퍼 펩티드를 면역 복합체에 혼입하면 헬퍼가 제공하는 면역 증강 효과가 있음을 알 수 있었다. 다만 도 7a에서 나타낸 바와 같이, 두 개의 헬퍼 펩티드를 하나의 선으로 연결해서 (cis) 제공하는 방식을 취했는데, 이번에는 두 개의 헬퍼 펩티드를 각각 독립적으로 (trans) 제조해서 면역 복합체에 혼입하여 효과를 측정하고자 하였다.
CD4 헬퍼 펩티드는 파상풍 (TT) 항원과 디프테리아 (DT) 항원으로부터 유래한 것으로 Ac-ILMQYIKANSKFIGI(G)3(R)8 (TT 헬퍼) 및 Ac-QSIALSSLMVAQAIP(G)3(R)8 (DT 헬퍼)을 포함한다. 각각을 링커 (G3)와 양이온성 앵커 (R8)에 융합하였고 이들과 OVA를 리보핵산 VP11에 착화시킨 백신 조성물을 제조하였다.
상기 백신 조성물을 6주령의 3마리의 암컷 Balb/c 마우스에, 근육내로 0, 14일에 투여하여 총 2회 진행한 다음(도 8a), 항체반응과 유세포 분석을 실시하였다.
Trans CD4 헬퍼 펩티드가 제공하는 효과는 Th1 매개 anti-OVA IgG2a와 CD4 헬퍼 T 세포의 수를 유의하게 증가시켰으나 비장 B 세포 및 CD8 T 세포 수에는 영향을 주지 않았다(도 8b, 8c).
본 발명의 리보핵산이 착화된 OVA CD8 에피토프 백신 CD4 헬퍼 펩티드 탑재가 제공하는 흑색종의 증식 억제 효과 (도 9)
실시예 8은 헬퍼 펩티드가 OVA 전체 항원에 추가적으로 제공하는 일부 면역 증강효과에 관한 것이었으나, 본 실시예에서는 동일한 헬퍼 펩티드가 OVA CD8 에피토프에도 비슷한 면역 증강효과를 제공하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 본 실시예에서는 CD8 에피토프에 대한 헬퍼 에피토프의 필요성을 시험하였고, 이를 위해 실시예 8과 마찬가지로 파상풍 (TT) 및 디프테리아(DT) 항원으로부터 유도된 2 개의 CD4 헬퍼 에피토프를 제조하였다. 잘 알려진 OVA CD8 CTL 에프토프인 SIINFEKL를 기반으로 Ac-G-SIINFEKL-(G)2(R)10-amid 순서로 합성하여 사용하였다.
상기 제조된 백신 조성물을 6주령의 4마리의 암컷 C57BL/6J 마우스에, 근육내로 -21, -7일에 투여하여 총 2회 진행한 다음(도 9a), B6F10-OVA 흑색종 세포를 이식하여 종양의 성장을 모니터링하였다.
그 결과는 도 9b에 나타낸 바와 같이, 상기 리보핵산에 CD8 CTL 에피토프만을 탑재한 백신만으로는 종양 억제 효과가 없었으나, CD4 헬퍼 에피토프를 추가로 탑재한 백신 그룹에서는 상당한 억제 효과를 나타내었다.
<110> NA Vaccine Institute <120> UNIVERSAL VACCINE PLATFORM BASED ON NANO COMPOSITE COMPRISING NOVEL NUCLEIC ACID AND EPITOPE <130> NAVI19P-0002-KR-PRI2 <150> KR 10-2019-0079501 <151> 2019-07-02 <150> KR 10-2019-0123571 <151> 2019-10-07 <160> 98 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 123 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA1001 <400> 1 gggucgcgcg uuucggugau gacggugaaa accucugaca caugcagcuc ccggagacgg 60 ucacagcuug ucuguaagcg gaugccggga gcagacaagc ccgcccuaua gugagucgua 120 uua 123 <210> 2 <211> 173 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA1501 <400> 2 gggucgcgcg uuucggugau gacggugaaa accucugaca caugcagcuc ccggagacgg 60 ucacagcuug ucuguaagcg gaugccggga gcagacaagc ccgucagggc gcgucagcgg 120 guguuggcgg gugucggggc uggcuuaacu augcccuaua gugagucgua uua 173 <210> 3 <211> 223 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA2001 <400> 3 gggucgcgcg uuucggugau gacggugaaa accucugaca caugcagcuc ccggagacgg 60 ucacagcuug ucuguaagcg gaugccggga gcagacaagc ccgucagggc gcgucagcgg 120 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cagcugucuu cuguuucuuc uuucgaacgu uucgaaaucu 540 ucccgaaaga aucuucuugg ccgaaccaca acaccaacgg uguuaccgcu gcuugcucuc 600 acgaagguaa aucuucuuuc uaccguaacc ugcuguggcu gaccgaaaaa gaagguucuu 660 acccgaaacu gaaaaacucu uacguuaaca aaaaagguaa agaaguucug guucuguggg 720 guauccacca cccgccgaac ucuaaagaac agcagaaccu guaccagaac gaaaacgcuu 780 acguuucugu uguuaccucu aacuacaacc gucguuucac cccggaaauc gcugaacguc 840 cgaaaguucg ugaccaggcu ggucguauga acuacuacug gacccugcug aaaccgggug 900 acaccaucau cuucgaagcu aacgguaacc ugaucgcucc gauguacgcu uucgcucugu 960 cucgugguuu cgguucuggu aucaucaccu cuaacgcuuc uaugcacgaa ugcaacacca 1020 aaugccagac cccgcugggu gcuaucaacu cuucucugcc guaccagaac auccacccgg 1080 uuaccaucgg ugaaugcccg aaauacguuc guucugcuaa acugcguaug guuaccgguc 1140 ugcguaacau cccgucuauc cagucucgug gucuguucgg ugcuaucgcu gguuucaucg 1200 aaggugguug gaccgguaug aucgacgguu gguacgguua ccaccaccag aacgaacagg 1260 guucugguua cgcugcugac cagaaaucua cccagaacgc uaucaacggu aucaccaaca 1320 aaguuaacac cguuaucgaa aaaaugaaca 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auucaggcug cgcaacuguu gggaagggcg aucggugcgg gccucuucgc 300 uauuacgcca gcuggcgaaa gggggaugug cugcaaggcg auuaaguugg guaacgccag 360 gguuuuccca gucacgacgu uguaaaacga cggccagugc caaagaagca ugacggcaag 420 uggacgauua ucuccagagg aucgccggga accgaggacg aguucguaau cauggucaua 480 gcuguuuccu gugugaaauu guuauccgcu cacaauucca cacaacauac gagccggaag 540 cauaaagugu aaagccuggg gugccuaaug agugagcuaa cucacauuaa uugcguugcg 600 cucccc 606 <210> 70 <211> 706 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA7001 <400> 70 gggucgcgcg uuucggugau gacggugaaa accucugaca caugcagcuc ccggagacgg 60 ucacagcuug ucuguaagcg gaugccggga gcagacaagc ccgucagggc gcgucagcgg 120 guguuggcgg gugucggggc uggcuuaacu augcggcauc agagcagauu guacugagag 180 ugcaccauau gcggugugaa auaccgcaca gaugcguaag gagaaaauac cgcaucaggc 240 gccauucgcc auucaggcug cgcaacuguu gggaagggcg aucggugcgg gccucuucgc 300 uauuacgcca gcuggcgaaa gggggaugug cugcaaggcg auuaaguugg guaacgccag 360 gguuuuccca gucacgacgu uguaaaacga cggccagugc caaagaagca ugacggcaag 420 uggacgauua ucuccagagg aucgccggga accgaggacg aguucguaau cauggucaua 480 gcuguuuccu gugugaaauu guuauccgcu cacaauucca cacaacauac gagccggaag 540 cauaaagugu aaagccuggg gugccuaaug agugagcuaa cucacauuaa uugcguugcg 600 cucacugccc gcuuuccagu cgggaaaccu gucgugccag cugcauuaau gaaucggcca 660 acgcgcgggg agaggcgguu ugcguauugg gcgcucuucc gcuccc 706 <210> 71 <211> 806 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA8001 <400> 71 gggucgcgcg uuucggugau gacggugaaa accucugaca caugcagcuc ccggagacgg 60 ucacagcuug ucuguaagcg gaugccggga gcagacaagc ccgucagggc gcgucagcgg 120 guguuggcgg gugucggggc uggcuuaacu augcggcauc agagcagauu guacugagag 180 ugcaccauau gcggugugaa auaccgcaca gaugcguaag gagaaaauac cgcaucaggc 240 gccauucgcc auucaggcug cgcaacuguu gggaagggcg aucggugcgg gccucuucgc 300 uauuacgcca gcuggcgaaa gggggaugug cugcaaggcg auuaaguugg guaacgccag 360 gguuuuccca gucacgacgu uguaaaacga cggccagugc caaagaagca ugacggcaag 420 uggacgauua ucuccagagg aucgccggga accgaggacg aguucguaau cauggucaua 480 gcuguuuccu gugugaaauu guuauccgcu cacaauucca cacaacauac gagccggaag 540 cauaaagugu aaagccuggg gugccuaaug agugagcuaa cucacauuaa uugcguugcg 600 cucacugccc gcuuuccagu cgggaaaccu gucgugccag cugcauuaau gaaucggcca 660 acgcgcgggg agaggcgguu ugcguauugg gcgcucuucc gcuuccucgc ucacugacuc 720 gcugcgcucg gucguucggc ugcggcgagc gguaucagcu cacucaaagg cgguaauacg 780 guuauccaca gaaucagggg auaccc 806 <210> 72 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA1002 <400> 72 ggggaauucc gacaaaaggu gguuggugaa gcugacauug gacuccauuc ugcuuaauug 60 ccuaacccca ucucccuuca aucuaccuac cauaaccauu uucccc 106 <210> 73 <211> 156 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA1502 <400> 73 ggggaauucc gacaaaaggu gguuggugaa gcugacauug gacuccauuc ugcuuaauug 60 ccuaacccca ucucccuuca aucuaccuac cauaaccauu uucuucaaaa uuuucucaaa 120 aaaacaauuu ggucuucaaa caacuccaag aacccc 156 <210> 74 <211> 206 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA2002 <400> 74 ggggaauucc gacaaaaggu gguuggugaa gcugacauug gacuccauuc ugcuuaauug 60 ccuaacccca 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cgaaaguucg ugaccaggcu ggucguauga acuacuacug gacccugcug aaaccgggug 900 acaccaucau cuucgaagcu aacgguaacc ugaucgcucc gauguacgcu uucgcucugu 960 cucgugguuu cgguucuggu aucaucaccu cuaacgcuuc uaugcacgaa ugcaacacca 1020 aaugccagac cc 1032 <210> 90 <211> 1153 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R10 <400> 90 gggaccucga caaccugcac gcuugccuaa acaaggcaaa acuaacggua agucggaugg 60 uaacaucacu gcuggagaaa cccagcgugg uggcauaccu agagggaaag gccgguggcg 120 guuccggggg agccgagcuc augaaagcua accugcuggu ucugcugugc gcucuggcug 180 cugcugacgc ugacaccauc ugcaucgguu accacgcuaa caacucuacc gacaccguug 240 acaccguucu ggaaaaaaac guuaccguua cccacucugu uaaccugcug gaagacucuc 300 acaacgguaa acugugccgu cugaaaggua ucgcuccgcu gcagcugggu aaaugcaaca 360 ucgcugguug gcugcugggu aacccggaau gcgacccgcu gcugccgguu cguucuuggu 420 cuuacaucgu ugaaaccccg aacucugaaa acgguaucug cuacccgggu gacuucaucg 480 acuacgaaga acugcgugaa cagcugucuu cuguuucuuc uuucgaacgu uucgaaaucu 540 ucccgaaaga aucuucuugg ccgaaccaca acaccaacgg uguuaccgcu gcuugcucuc 600 acgaagguaa aucuucuuuc uaccguaacc ugcuguggcu gaccgaaaaa gaagguucuu 660 acccgaaacu gaaaaacucu uacguuaaca aaaaagguaa agaaguucug guucuguggg 720 guauccacca cccgccgaac ucuaaagaac agcagaaccu guaccagaac gaaaacgcuu 780 acguuucugu uguuaccucu aacuacaacc gucguuucac cccggaaauc gcugaacguc 840 cgaaaguucg ugaccaggcu ggucguauga acuacuacug gacccugcug aaaccgggug 900 acaccaucau cuucgaagcu aacgguaacc ugaucgcucc gauguacgcu uucgcucugu 960 cucgugguuu cgguucuggu aucaucaccu cuaacgcuuc uaugcacgaa ugcaacacca 1020 aaugccagac cccgcugggu gcuaucaacu cuucucugcc guaccagaac auccacccgg 1080 uuaccaucgg ugaaugcccg aaauacguuc guucugcuaa acugcguaug guuaccgguc 1140 ugcguaacau ccc 1153 <210> 91 <211> 1648 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R11 <400> 91 gggaccucga caaccugcac gcuugccuaa acaaggcaaa acuaacggua agucggaugg 60 uaacaucacu gcuggagaaa cccagcgugg uggcauaccu agagggaaag gccgguggcg 120 guuccggggg agccgagcuc augaaagcua accugcuggu ucugcugugc gcucuggcug 180 cugcugacgc ugacaccauc ugcaucgguu accacgcuaa caacucuacc gacaccguug 240 acaccguucu ggaaaaaaac guuaccguua cccacucugu uaaccugcug gaagacucuc 300 acaacgguaa acugugccgu cugaaaggua ucgcuccgcu gcagcugggu aaaugcaaca 360 ucgcugguug gcugcugggu aacccggaau gcgacccgcu gcugccgguu cguucuuggu 420 cuuacaucgu ugaaaccccg aacucugaaa acgguaucug cuacccgggu gacuucaucg 480 acuacgaaga acugcgugaa cagcugucuu cuguuucuuc uuucgaacgu uucgaaaucu 540 ucccgaaaga aucuucuugg ccgaaccaca acaccaacgg uguuaccgcu gcuugcucuc 600 acgaagguaa aucuucuuuc uaccguaacc ugcuguggcu gaccgaaaaa gaagguucuu 660 acccgaaacu gaaaaacucu uacguuaaca aaaaagguaa agaaguucug guucuguggg 720 guauccacca cccgccgaac ucuaaagaac agcagaaccu guaccagaac gaaaacgcuu 780 acguuucugu uguuaccucu aacuacaacc gucguuucac cccggaaauc gcugaacguc 840 cgaaaguucg ugaccaggcu ggucguauga acuacuacug gacccugcug aaaccgggug 900 acaccaucau cuucgaagcu aacgguaacc ugaucgcucc gauguacgcu uucgcucugu 960 cucgugguuu cgguucuggu aucaucaccu cuaacgcuuc uaugcacgaa ugcaacacca 1020 aaugccagac cccgcugggu gcuaucaacu cuucucugcc guaccagaac auccacccgg 1080 uuaccaucgg ugaaugcccg aaauacguuc guucugcuaa acugcguaug guuaccgguc 1140 ugcguaacau cccgucuauc cagucucgug gucuguucgg ugcuaucgcu gguuucaucg 1200 aaggugguug gaccgguaug aucgacgguu gguacgguua ccaccaccag aacgaacagg 1260 guucugguua cgcugcugac cagaaaucua cccagaacgc uaucaacggu aucaccaaca 1320 aaguuaacac cguuaucgaa aaaaugaaca uccaguucac cgcuguuggu aaagaauuca 1380 acaaacugga aaaacguaug gaaaaccuga acaaaaaagu ugacgacggu uuccuggaca 1440 ucuggaccua caacgcugaa cugcugguuc ugcuggaaaa cgaacguacc cuggacuucc 1500 acgacucuaa cguuaaaaac cuguacgaaa aaguuaaauc ucagcugaaa aacaacgcua 1560 aagaaaucgg uaacgguugc uucgaauucu accacaaaug cgacaacgaa ugcauggaau 1620 cuguucguaa cgguaccuac gacuaccc 1648 <210> 92 <211> 424 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NA,NVT,VP1,VP10 <400> 92 gggcgauaau acaguuuugg acucaggugu gagauuuuau gaucaggacu augaaggaca 60 aauaacccca auggaauaug uaacuggguu guauaacuuu uggucagggc caauagaguu 120 acguuuugau uuuguuucaa augcguuuca cacuggaaca gugauuauau cagcggagua 180 uaaucgauca ucuacuaaua cggaugagug ucagucacac ucaacuuaua cuaaaacguu 240 ccacuuggga gaacaaaaau caguacauuu cacugugccu uauauauaug auacuguuau 300 gcggagaaau acggcuagcg ccuauuuacc gguaacugau uaugauaagg cagauaaugu 360 uaguagggcg caggcuacgg ggauuagagc agaaucuaaa augagaguga aagugagauc 420 gccc 424 <210> 93 <211> 424 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NVT IV, NVT 4, VP20 <400> 93 gggcgauaau acaguuuugg acucaggugu gagauuuuau gaucaggacu augaaggaca 60 aauaacccca auggaauaug uaacuggguu guauaacuuu uggucagggc caauagaguu 120 acguuuugau uuuguuucaa augcguuuca cacuggaaca gugauuauau cagcggagua 180 uaaucgauca ucuacuaaua cggaugagug ucagucacac ucaacuuaua cuaaaacguu 240 ccacuuggga gaacaaaaau caguacauuu cacugugccu uauauauaug auacuguuau 300 gcggagaaau acggcuagcg ccuauuuacc gguaacugau uaugauaagg cagauaaugu 360 uaguagggcg caggcuacgg ggauuagagc agaaucuaaa augagaguga aagugagauc 420 gccc 424 <210> 94 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD4 helper epitope of tetanus <400> 94 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Gly 1 5 10 15 Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 95 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD4 helper epitope of diphtheriae <400> 95 Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 96 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of CD4 helper epitopes of tetanus and diphtheriae <400> 96 Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Pro 1 5 10 15 Met Gly Leu Pro Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln 20 25 30 Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 40 <210> 97 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2e protein epitope of influenza virus A/H1N1 <400> 97 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 98 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> latch epitope of group B streptococcus <400> 98 Gly Ser Gly Asp Ser Asp Ala Asn Ala Glu Ile Lys Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 25

Claims (21)

  1. 아쥬번트로서 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA),
    CD4 헬퍼 에피토프, 및
    항원 또는 에피토프 수용된 앵커 펩티드를 포함하며,
    상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 및 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)을 포함하는 것으로, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 상보성을 가지고 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)의 중간에 위치하고, 상기 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)은 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)의 양쪽 3'-말단에 각각 위치하며 임의의 길이와 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노 복합체는 수중유 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 TLR3 리간드로 작용하는 것을 특징으로 하며, 염기 길이는 140 내지 1682 base 인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)의 염기 길이는 20% 범위 내에서 증가 또는 감소될 수 있는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 TLR3 리간드로 작용하고, 염기 길이는 106 내지 1648 bp인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)의 염기 길이는 20% 범위 내에서 증가 또는 감소될 수 있는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)은 TLR7 유사 리간드 또는 TLR8 유사 리간드로 작용하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 하기에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체:
    (1) 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 32의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (2) 서열번호 2의 염기서열과 서열번호 33의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (3) 서열번호 3의 염기서열과 서열번호 34의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (4) 서열번호 4의 염기서열과 서열번호 35의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (5) 서열번호 5의 염기서열과 서열번호 36의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (6) 서열번호 6의 염기서열과 서열번호 37의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (7) 서열번호 7의 염기서열과 서열번호 38의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (8) 서열번호 8의 염기서열과 서열번호 39의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (9) 서열번호 9의 염기서열과 서열번호 40의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (10) 서열번호 10의 염기서열과 서열번호 41의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (11) 서열번호 11의 염기서열과 서열번호 42의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (12) 서열번호 12의 염기서열과 서열번호 43의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (13) 서열번호 13의 염기서열과 서열번호 44의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (14) 서열번호 14의 염기서열과 서열번호 45의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (15) 서열번호 15의 염기서열과 서열번호 46의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (16) 서열번호 16의 염기서열과 서열번호 47의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (17) 서열번호 17의 염기서열과 서열번호 48의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (18) 서열번호 18의 염기서열과 서열번호 49의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (19) 서열번호 19의 염기서열과 서열번호 50의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (20) 서열번호 20의 염기서열과 서열번호 51의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (21) 서열번호 21의 염기서열과 서열번호 52의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (22) 서열번호 22의 염기서열과 서열번호 53의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (23) 서열번호 23의 염기서열과 서열번호 54의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (24) 서열번호 24의 염기서열과 서열번호 55의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (25) 서열번호 25의 염기서열과 서열번호 56의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (26) 서열번호 26의 염기서열과 서열번호 57의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (27) 서열번호 27의 염기서열과 서열번호 58의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (28) 서열번호 28의 염기서열과 서열번호 59의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (29) 서열번호 29의 염기서열과 서열번호 60의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산;
    (30) 서열번호 30의 염기서열과 서열번호 61의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산; 및
    (31) 서열번호 31의 염기서열과 서열번호 62의 염기서열이 상보적으로 결합한 결과로 형성된 이중 가닥 리보핵산과 단일 가닥 리보핵산을 포함하는 혼합 구조 리보핵산.
  9. 제1항에 있어서, 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 수지상 세포, 호중구, B 세포, 대식세포, T 세포, 비만세포 및 자연살해세포를 포함하는 면역 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  10. 아쥬번트로서 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA),
    CD4 헬퍼 에피토프, 및
    항원 또는 에피토프 수용된 앵커 펩티드를 포함하며,
    상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)으로부터 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)을 제거하여 제작한 것으로서,
    상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)은 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 및 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)을 포함하는 것으로, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 상보성을 가지고 상기 혼합 구조 리보핵산 (hsRNA)의 중간에 위치하고, 상기 단일 가닥 리보핵산 (ssRNA)은 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)의 양쪽 3'-말단에 각각 위치하며 임의의 길이와 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 나노 복합체는 수중유 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 서열번호 63 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열 및 이와 상보적으로 결합하는 염기서열을 포함하고, TLR3 리간드로 작용하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA)은 수지상 세포, 호중구, B 세포, 대식세포, T 세포, 비만세포 및 자연살해세포를 포함하는 면역 세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  14. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 CD4 헬퍼 에피토프는 서열번호 94를 갖는 파상풍 에피토프, 서열번호 95를 갖는 디프테리아 에피토프, 및 서열번호 96을 갖는 에피토프로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  15. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 앵커 펩티드는 7 내지 25개의 아르기닌을 포함하는 양이온성 펩티드인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  16. 제2항 또는 제11항에 있어서, 상기 수중유 에멀젼은 스쿠알렌 수중유 에멀젼인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  17. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 항원 또는 에피토프는
    (i) 불활성화 또는 살아있는 약독화 생물체 또는 세포에서 기원한 항원의 전체 또는 일부;
    (ii) 인공적으로 발현시켜 정제한 항원의 전체 또는 일부; 또는
    (iii) 시험관 내에서 합성된 에피토프인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스 M2e 단백질, 불활성화된 돼지생식기호흡기증후군(PRRS) 전바이러스(whole virus), 또는 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS)의 래치(Latch) 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 에피토프는 B 세포 에피토프, CD8 T 세포 에피토프, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 97을 갖는 인플루엔자 바이러스 M2e 단백질의 에피토프, 또는 서열번호 98을 갖는 그룹 B 스트렙토코커스 (GBS)의 래치(Latch) 단백질의 에피토프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 나노 복합체.
  21. 제1항 또는 제10항의 나노 복합체를 포함하는, 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
KR1020200081801A 2019-07-02 2020-07-02 신규 핵산과 항원 결정기를 포함하는 나노 복합체를 기반으로 하는 범용 백신 플랫폼 KR20210003695A (ko)

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