KR20200138119A - 조직 유착방지용 필름 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유착방지용 필름의 제조방법에 관한 것으로, 상기 제조방법에 따르면, 유기용매를 사용하지 않고서 단층의 유착방지용 필름을 전기방사법으로 재현성 있게 제조할 수 있으며, 본 발명의 유착방지용 필름은 세포독성이 없으므로, 수술 후 장기간 유착을 방지하기 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

조직 유착방지용 필름 및 그 제조방법{A Film for preventing tissue adhesion and method for manufacturing the same}

본 발명은 나노섬유상 조직 유착방지용 필름 및 그 제조방법에 관한 것이다.

수술 후 복막 유착(postsurgical peritoneal adhesion)은 의학적 수술에서 심각한 임상적 어려움을 야기하는 일반적인 합병증이다. 유착은 자유롭게 움직이는 조직이 섬유상 가교를 통해 부착되도록 하여 조직의 흐름을 어렵게 만든다. 이로 인해 중증의 만성복통, 소장폐쇄 및 여성불임 등 여러 합병증이 발생할 수 있으며, 이 중 일부는 초기 수술 후 몇 년 후에 나타나 반복 수술이 불가피하다. 유착은 심장, 치과 및 흉부를 포함한 신체의 다른 부위에서 발생할 수 있지만, 복부 수술에 따른 복막 유착의 위험은 산부인과 수술의 경우 93%에서 최대 97%로 나타난다.

수술 후 복막 유착으로 인한 여러 가지 합병증을 피하기 위해 다양한 접근법이 개발되고 있는데, 여기에는 조직 사이의 물리적 장벽, 유체젤 장벽 및 유착을 방지하기 위한 의약품 등이 있으며, 수술 후 조직 유착을 감소시키는 항유착 성질을 갖는 다양한 형태의 중합체에 대해 연구가 진행되고 있다.

히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)과 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose)의 혼합물인 Seprafilm^®은 항유착 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나 Seprafilm^®의 사용시 수술 부위의 회복기간이 길고, 필름의 내구성이 제한되며, 박테리아성 복막염이 있는 경우 항유착력이 감소하는 단점이 있다. 항유착 중합체 필름 중 하나인 Interceed™(Gynecare, Somerville, NJ)는 산화된 재생 셀룰로오스로 구성되는데, 쥐 모델에서 면역원성 반응(immunogenic response)을 유도하는 것으로 보고되었다.

이러한 단점을 개선하기 위해, 천연 및 합성 중합체 단독 또는 이들의 조합에 대한 항유착 효과에 관한 연구가 진행되고 있으나, 현재 상용화되고 있는 용액 및 젤 형태의 유착방지막은 체내에서 흘러내려 상처에 정확히 도포되기 어려우며 유착방지 기능을 하기 전에 다른 부위로 흘러들어가거나 너무 일찍 분해되는 단점이 있다. 이를 방지하기 위하여 클로로포름 등의 유기용매를 추가적으로 사용하고 있으나, 유착방지막에 잔존하기 때문에 인체 독성을 나타낼 수 있어 문제가 된다. 또한, 필름 및 멤브레인 형태의 유착방지막은 내부 장기 적용 시 장기 표면에 잘 부착되지 않고 부착되더라도 장기의 운동으로 인해 상처부위에 지속적으로 정확하게 위치하지 못하며 조직 자체에서 이물질로 인식되어 서로 뭉쳐짐으로써 장기 유착 방지 효과가 미흡한 것으로 보고되고 있다. 또한, 적용 부위로부터 유착방지제의 이동을 억제하기 위해 주변조직과의 봉합이 필요하고, 이때 봉합부위에서 조직 유착이 빈번하게 일어나며, 복잡한 혹은 미세한 형태의 상처부위에는 도입이 어렵다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결한 조직 유착방지용 필름의 제조방법을 통해 제조한 필름의 유착방지 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허공개 제10-2017-0091932호

본 발명의 하나의 목적은 유착방지 효과가 뛰어나면서도 전기방사법으로 필름형태로 제조할 수 있는 나노섬유상 조직 유착방지용 필름의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 나노섬유상 조직 유착방지용 필름을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 알지네이트(alginate) 및 비이온성 중합체를 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및 상기 용액을 전기방사(electrospinning) 하는 단계를 포함하는 나노섬유상 조직 유착방지용 필름의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "전기방사(electrospinning)"는 중합체 용액 및/또는 용융물의 젯(jet)을 통하여 나노섬유를 제조하는 공정을 의미한다.

본 발명의 나노섬유는 방사용액 상태의 중합체를 순간적으로 섬유형태로 방사하는 당업계의 일반적인 전기방사 공정으로 제조될 수 있다. 중합체를 용매에 녹여 점성을 가지는 방사용액을 제조하는 공정과 상기 방사용액을 일정 전압과 방사거리에서 전기방사를 실시하는 공정에서, 용매종류, 용매농도, 방사거리, 방사전압, 방사방법 등을 목적에 맞도록 적절하게 조절하거나 다양하게 변형할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "비이온성 중합체"는 이온성 관능기를 갖지 않는 중합체를 의미하며, 비이온성 중합체는 전하를 띠지 않을 수 있다.

고분자 전달, 조직 재생, 세포 배양 시스템 및 다양한 분야에 활용되어 온 갈색 조류 유래 음이온성 다당류인 알지네이트의 경우, 하이드로겔 형태의 친수성 그물형 형태는 세포 외 매트릭스의 구조적 및 기계적 특성과 유사하고, 알지네이트 음이온 및 세포의 반발력으로 인하여 조직의 유착방지 효과가 우수하다. 다만, 하이드로겔 또는 용액은 형태의 가변성으로 인하여 수술 부위에 적용하기 어렵다. 따라서, 전기방사법에 의한 필름 형태의 사용이 바람직하나, 알지네이트 음이온간 내부 반발력으로 인하여 고체 형태의 유지, 특히 전기방사에 의한 필름의 제조에 어려움이 있다.

따라서, 본 발명에서는 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 비이온성 중합체를 적정량 혼합하여 전기방사함으로써, 알지네이트를 포함하는 유착 방지제를 필름 형태로 제조할 수 있다. 구체적으로, 비이온성 중합체를 사용함으로써 조직과 음이온성 알지네이트와의 정전기적 반발력으로 인한 조직 유착방지 효과는 유지되면서도 전기방사를 위한 중합체 용액중의 알지네이트 음이온간 반발력은 감소되어 전기방사가 가능하게 된다.

이와 같이 제조된 나노섬유상 필름은 얇은 두께의 단층구조로도 체내에서 지속적으로 유착방지 효과를 나타내므로, 생분해를 지연시키기 위한 목적으로 사용되는 클로로포름 등의 유기용매를 필요로 하지 않는다. 따라서, 나노섬유에 잔존함으로써 인체에 독성을 일으킬 수 있는 유기용매의 사용을 최소화할 수 있으며, 복수층의 구조를 필요로 하지도 않는다.

본 발명의 제조방법에 사용되는 비이온성 중합체는 예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트(Poly(methyl methacrylate); PMMA), 폴리스티렌(polystyrene; PS), 폴리카프로락톤(Poly-Caprolactone; PCL), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile; PAN), 폴리비닐리덴플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVdF), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP) 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA) 또는 폴리에틸렌옥사이드(polyethyleneoxide; PEO) 등일 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌옥사이드일 수 있다.

비이온성 중합체는 알지네이트의 반발력을 중화시켜 재현성있는 필름을 합성할 수 있도록 하는데, 특히, 폴리에틸렌옥사이드는 알지네이트의 유착방지효과를 저해시키지 않으면서도 전기방사에 따른 나노섬유상 필름의 제조를 용이하게 한다.

본 발명의 전기방사에서 사용하는 용매는 전기방사 공정에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 페놀(phenol), 메타크레졸(M-cresol), 염화메틸렌(methylene chloride), 황산(sulphuric acid), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 포름산(formic acid), 디클로로에탄(dichloroethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF), 물(water), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide; DMAc), Triton™ X-100, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO) 또는 이들의 혼합 용매 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 전기방사하는 단계 후에 전기방사된 결과물을 칼슘 이온 함유 용액에 침지하는 단계를 더 포함할 수 있다.

전기방사된 결과물을 칼슘이온 함유 용액에 침지함으로써 칼슘이온에 의해 가교결합이 형성되어 필름의 형태를 더욱 잘 유지할 수 있으며, 생체에 적용시 생분해 속도를 제어할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 칼슘이온 함유 용액은 염화칼슘의 에탄올 용액일 수 있으며, 상기 염화칼슘의 에탄올 용액은 에탄올 100㎖ 당 염화칼슘 0.5g 내지 1.5g을 포함할 수 있다. 상기 범위 내에 드는 경우 유착방지 효과를 유지하면서도 환부에 적용하기 적합한 형태로 제조가 가능할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 알지네이트 및 상기 비이온성 중합체는 8:1 내지 10:1의 중량비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 9:1의 중량비일 수 있다. 상기 범위 내에 드는 경우 유착 방지 효과를 유지하면서도 전기방사법으로 필름을 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 알지네이트는 알긴산나트륨일 수 있다.

알지네이트는 알긴산의 나트륨염, 칼륨염 및 프로필렌 글리콜(propylene glycol)염 등일 수 있으며, 나트륨염 형태로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 비이온성 중합체는 폴리에틸렌옥사이드일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 방법으로 제조된 나노섬유상 조직 유착방지용 필름을 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 나노섬유상 조직 유착방지용 필름은 알지네이트 및 비이온성 중합체를 포함하여, 뛰어난 생체적합성, 조직 부착성, 체내 지속성 및 항염증 효과를 나타내고, 이를 통하여 궁극적으로 우수한 유착방지 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 나노섬유상 조직 유착방지용 필름은 외과적 수술 등의 수술이나, 기타 어떤 원인으로 염증이 생겨, 유착을 방지할 필요성이 생긴 기관, 조직 표면의 전부 또는 일부에 사용할 수 있다. 기관의 부위나 종류 등에 대해서는 특히 제한은 없으나, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등의 실험동물, 인간을 포함하는 포유동물의 체표(외피) 이외의 기관인 것이 바람직하다. 예컨대, 위, 소장, 대장 등의 소화기관, 자궁, 난소 등의 생식기관, 심장, 폐 등의 호흡기관, 근육, 골, 인대 등의 운동기관, 안구 등의 감각기관 등을 들 수 있으며, 복부수술에 의한 유착을 방지하기 위해 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 나노섬유상 조직 유착방지용 필름을 사용하기 위한 생체 조직의 표면 상태 및 기관의 수술 내용은 특별히 한정되지 않는다. 생체 조직의 표면이 수술의 직접적인 대상일 수 있고, 수술의 직접적인 대상은 아니나 수술의 결과 상처가 난 부분이어도 무방하다. 또한, 유착방지용 필름을 접촉시키는 방법에서, 유착방지용 필름의 형태나 유효성분의 비율은 기관, 조직의 종류, 외상 부분의 상태, 면적 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 유착방지용 필름의 사용량은 수술 부위의 표면을 덮을 정도인 것이 바람직하나, 적용 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 적용 시간, 적용 부위 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 달리 사용할 수 있다.

본 발명의 나노섬유상 조직 유착방지용 필름은 필름의 구조적 특징 및 유착방지 효과를 저해하지 않는 수준에서 당업계에서 통상적으로 사용되는 항염증제, 항생제 및/또는 항암제 등의 약리활성 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 나노섬유상 조직 유착방지용 필름의 제조방법에 따르면, 나노섬유에 잔존함으로써 인체에 독성을 나타낼 수 있는 유기용매를 사용하지 않고서 단층의 유착방지용 필름을 재현성 있게 제조할 수 있으며, 본 발명의 나노섬유상 조직 유착방지용 필름은 세포독성이 없고 얇은 두께의 단층으로도 유착방지 효과가 뛰어나므로, 수술 후 장기간 유착을 방지하기 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO 나노섬유상 필름의 원자현미경(Atomic force microscopy) 이미지를 나타낸 그림이다.
도 2는 각각 알긴산나트륨(Sodium alginate), PEO 및 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO(SA/PEO) 나노섬유상 필름의 FTIR spectroscopy 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2-1에서 수행한 유리(Glass) 표면 및 알긴산나트륨/PEO 나노섬유상 필름(Polymer film) 표면에서 섬유아세포 배양을 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 4는 실험예 2-2에서 수행한 Live/Dead kit assay 후 유리 표면(Glass surface) 및 본 발명의 필름 표면(Film surface)의 NIH-3T3 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. a 및 d는 필름 표면의 세포의 유착을, b 및 e는 살아있는 세포(녹색형광)를, c 및 f는 죽은 세포(적색형광)를 나타내고, 기준자의 경우 a 내지 c에서는 200㎛이며, d 내지 f에서는 100㎛이다.
도 5는 실험예 2-2에서 수행한 유리(Glass) 및 본 발명의 필름(Film) 표면에서, Calcein AM 및 EthD-1 염료로 염색된 세포의 평균 형광을 각각 나타낸 그래프이다.
도 6은 유착을 유도하기 전, 유착 발생 조사 부위인 복벽(abdominal wall), 소장(small bowel), 대장(large bowel) 및 장막(Omentum)의 위치 및 형태를 나타낸 사진이다.
도 7은 유착이 발생한 내장 기관을 모레노 점수를 계산하기 위한 기준에 따라 분류한 사진이다.
도 8은 실험예 3에서 유착을 유도한 맹장샘플의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 따른 현미경적 평가를 나타낸 사진으로, A 및 B는 실험군의 섬유증(Fibrosis) 사진이고, C 및 D는 대조군의 염증(Inflammation) 및 섬유증(Fibrosis) 사진이다. A 및 C는 200배율, B 및 D는 100배율의 사진이다.
도 9는 실험예 3에서 수행한 현미경적 평가에 의한 실험군(Group L) 및 대조군(Group C)의 섬유증(Fibrosis) 및 염증(Inflammation)에 대한 등급(Grade)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실험예 3에서 유착을 유도한 맹장샘플의 염증 정도를 평가하기 위하여, 면역조직화학(immunohistochemical) 염색 방법에 의해 ED1 양성 세포(검은색 박스, red colored cell)를 나타낸 현미경 사진으로, A는 실험군(Group L)의 200배율 사진이고, B는 대조군(Group C)의 200배율 사진이다.
도 11은 ED1 양성 세포의 면역조직화학 검사에 의한 염증(inflammation) 등급(Grade)을 현미경적으로 평가한 그래프이다.
도 12는 실험예 3에서 유착을 유도한 맹장샘플의 신생혈관형성 유도 정도를 평가하기 위하여, 면역조직화학(immunohistochemical) 염색 방법 의해 FGF-2(Fibroblast growth factor-2) 이미지를 나타낸 현미경 사진으로, A는 실험군(Group L)의 100배율 사진이고, B는 대조군(Group C)의 100배율 사진이다.

이하 실시예를 통하여 하나 이상의 구체예를 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 알긴산나트륨/PEO 나노섬유상 조직 유착방지용 필름 제조

알긴산나트륨(Sodium alginate), PEO(점도평균분자량(viscosity-average molecular weight; Mv) 900,000g/mol), triton™ X-100, 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 hybrid-max^®는 시그마알드리치(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 염화칼슘은 조지아켐(Georgiachem, USA)에서 구매하였고, 에탄올은 머크 밀리포어(Merck Millipore, Germany)에서 구매하였다. 생체외(in vitro) 세포 배양을 위한 NIH/3T3 세포는 아메리칸 타입 셀 컬쳐(American Type Cell Culture; ATCC^® CRL1658™)에서 구매하였다. 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium; DMEM) 및 신생 소혈청(newborn bovine calf serum; NBCS)은 Gibco(USA)에서 구매하였다. 인산완충식염수(Phosphate Buffer Saline; PBS)는 웰진(Welgene; Republic of Korea)에서 구매하였고, 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; P/S) 용액은 ATCC^®(USA)에서 구매하였다. FastWells™ reagent barriers는 Grace Bio-Labs™(USA)에서 구매하였다. 포유동물 세포에 대한 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit 는 Invitrogen(영국)에서 구입하였다. 실험 전반에 걸쳐 Milli-Q Plus 시스템(USA)의 2차 증류(double-distilled) 탈염수(deionized water)를 사용하였다.

알긴산나트륨과 PEO를 증류수에 9:1의 질량비로 혼합한 후(총 질량은 증류수에 4%(w/v)), 알긴산나트륨/PEO 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 그 후, 0.5%(v/v) Triton™ X-100 및 5%(v/v) DMSO를 상기 용액에 첨가하고 완전히 혼합되도록 다시 3시간 동안 교반하였다.

High DC 전원공급장치(Ultravolt, USA), 주사기 펌프(PHD 2000, Harvard Apparatus, USA) 및 일회용 주사기로부터 연장된 실리콘 튜브의 끝에 21G blunt-needle을 갖는 일회용 주사기를 포함하는 전기방사 시스템을 사용하여 필름을 제조하였다. 구체적으로, 10㎖ 주사기를 공기가 없도록 알긴산나트륨/PEO 용액으로 채우고, high DC 전원에 연결된 두 전선을 바늘 끝과 스테인리스 강판 수집기(stainless-steel plate collector)에 연결하였다. 수집판을 바늘 끝과 15cm의 거리에 두고 바늘 끝을 수집판 쪽으로 향하게 한 후, 주사기 펌프가 0.02㎖/min의 속도로 용액을 지속적으로 주입하는 동안 high DC 전원공급장치로부터 전압 전하를 18kV~20kV로 유지하며 나노섬유를 합성하였다. 그 후, 수집판으로부터 필름 형태로 제조된 나노섬유를 조심스럽게 벗겨 내고 건조한 상태로 보관하였다.

건조된 알긴산나트륨/PEO 필름은 칼슘 이온을 사용하여 가교결합(cross-linked)시켰다. 구체적으로, 알긴산나트륨/PEO 필름을 95% 에탄올로 5분 동안 세척한 후, 에탄올의 1%(w/v) 염화칼슘 용액에 침지시켰다. 실온에서 1시간 방치한 후, 필름을 꺼내 증류수로 세척하고 1시간 동안 다시 방치하였다 마지막으로, 필름을 무수 에탄올(absolute ethanol)로 10분 동안 세척하고 실온에서 건조시켰다.

제조된 필름은 특성 분석 실험에서는 48시간 동안 동결 건조시킨 후 사용하였고(Christ, Osterode am Harz, Germany), 생물학적 분석 실험에서는 PBS로 세척한 후 사용하였다.

실험예 1: 알긴산나트륨/PEO 필름의 특성 분석

원자현미경(Atomic force microscopy; AFM) NX-10(Park systems, Korea)을 사용하여 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO 필름의 형태적 특성을 분석하였다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO 필름의 원자현미경 이미지를 나타낸 그림이다.

도 1에서 1a의 기준자는 10㎛, 1b의 기준자는 5㎛, 1c의 기준자는 2.5㎛이며, 우측도면은 좌측도면을 3차원적으로 표현한 것이다.

도 1에서 보듯이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 상기 실시예 1의 알긴산나트륨/PEO 필름은 나노섬유상의 구조로 형성되어 있음을 알 수 있다.

알긴산나트륨/PEO 필름의 정성분석을 위해 푸리에 변환 적외선 분광기(Fourier Transform Infrared(FTIR) spectroscopy, Nicolet 6700, Thermo scientific, USA)를 사용하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 동결건조된 알긴산나트륨/PEO 필름을 감쇠전반사(attenuated total reflectance; ATR) 방법을 사용하여 검사하였다.

아연 셀레늄(Zinc Selenide) ATR 결정 위에 필름을 준비하고, ATR 팁을 눌러 필름이 ATR 결정과 틈이 없이 접촉되도록 하였다. 4000~400cm^-1 스펙트럼 범위에서 투과율을 측정하였고, 분석에는 OMNIC™ 소프트웨어를 사용하였다.

도 2는 알긴산나트륨, PEO 및 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO 나노섬유상 필름의 FTIR spectroscopy 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 2에서 보듯이, 알긴산나트륨/PEO 필름의 FTIR 스펙트럼(SA/PEO)은 알긴산나트륨(Sodium alginate) 및 PEO 분말(PEO)과 같음을 확인하였다. 알긴산나트륨, PEO 및 알긴산나트륨/PEO 필름의 특정 IR 밴드 값은 하기의 표 1과 같다.

항목	Wavelength number(cm-1)
	알지네이트	PEO	알긴산나트륨/PEO 필름
-OH stretching	3240	-	3260
Asymmetric -COO stretching	1601	-	1603
Symmetric -COO- stretching	1407	-	1411
Asymmetric C-O-C stretching	-	1098	1030 ~ 1098
C-O-C bending	-	843	820

알긴산나트륨에서는 하이드록시기(-OH)의 특성을 나타내는 3240cm^-1의 IR 밴드, 카복시기(-COO-)의 비대칭 늘임 진동(asymmetric stretching) 및 대칭 늘임 진동(symmetric stretching)을 각각 나타내는 1601cm^-1및 1407cm^-1의 IR 밴드를 확인하였으며, PEO에서는 에테르(C-O-C)의 특성을 나타내는 843cm^-1의 IR 밴드 및 1098cm^-1의 에테르 비대칭 늘임 진동을 나타내는 1098cm^-1의 IR 밴드를 확인하였다.

알긴산나트륨/PEO 필름에서는 -OH IR 밴드(3260cm^-1), -COO-비대칭 늘임 IR 밴드(1603cm^-1)및 대칭늘임 IR 밴드(1411cm^-1)및 C-O-C 비대칭 늘임 IR 밴드(1098cm^-1)를 확인하였으며, 이는 알긴산나트륨 및 PEO의 필수 IR 밴드와 중첩됨을 알 수 있다.

구체적으로, 알긴산나트륨과 PEO가 혼합되면 분자의 상호 작용력이 뚜렷한 진동을 약간 변화시키며 IR 밴드도 약간 변화하는데, C-O-C 비대칭 늘임 IR 밴드는 알지네이트의 하이드록시기와 PEO의 산소가 상호작용한 후에 넓어져 1098cm^-1 및 1029cm^-1 에서 2개의 피크를 형성하였다. 또한, 상기 알긴산나트륨/PEO 필름에서는 알긴산나트륨의 농도가 PEO의 농도보다 훨씬 높기 때문에 알긴산나트륨에 해당하는 피크가 더 강하게 나타났다.

즉, 이를 통하여, 알긴산나트륨/PEO 필름은 PEO와의 상호 작용이 거의 없는 알긴산나트륨으로 주로 구성되어 있으며, 따라서, 필름에 비이온성 중합체인 PEO가 포함되어 있더라도 알긴산나트륨의 음이온 성질이 섬유아세포의 유착을 억제한다는 것을 확인하였다.

실험예 2: 세포 독성 및 유착력 실험

<2-1> In vitro 세포 배양

In vitro 실험을 위하여 NIH-3T3 세포를 사용하였다. 상기 세포를 10% NBCS 및 1% P/S 항생제가 보충된 DMEM으로 100mm 접시에서 배양하였고, 37℃ 및 5% CO₂ 수준의 가습 환경에서 유지시켰다.

도 3에 도식적으로 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO 필름을 커버 유리와 FastWells™ reagent barrier(Grace Bio-Labs™, USA) 사이에 웰의 절반만 덮도록 고리 형태(open circle) 형태로 놓아, 각 웰의 유리 및 필름 표면이 동일한 면적을 갖도록 구성하였으며, 사용 전, 웰을 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 100mm 접시에서 트립신으로 처리한 후, 신선한 배지에 재현탁시켰다. 충분한 양의 배지로 각 웰에 7×10⁴ 세포의 밀도로 세포를 접종하였다. 접종된 세포를 배양기에서 24시간 동안 배양하여 세포가 융합하도록(confluent) 하였다.

<2-2> 세포 독성 및 유착력 평가

세포 생존력 및 세포 유착을 평가하기 위하여 라이브/데드 키트 분석(Live/Dead kit assay, Invitrogen, UK)을 사용하였다. 시약은 키트와 함께 제공된 프로토콜에 따라 4μM 에티디움 호모다이머(ethidium homodimer-1; EthD-1) 및 PBS 용액의 2μM 칼세인 아세톡시메틸(calcein AM)을 사용하였다. EthD-1은 죽은 세포의 핵산과 상호 작용하여 적색 형광을 방출하며, Calcein AM은 살아있는 세포 내에서 에스테라아제(esterase) 활성에 의해 녹색 빛을 방출하는 녹색 형광 염료이다. 각 샘플에 200㎕의 시약을 첨가하여 암실의 실온에서 30분 동안 배양한 후, 494㎚ 및 528㎚의 여기파장(excitation wavelengths)에서 각각 형광을 관찰하였다. Fluoview FV10i 도립 현미경(inverted microscope, Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 형광 이미지를 촬영하고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 형광 강도를 정량화한 후, 각 샘플 영역의 평균 형광 강도를 평가하였다.

도 4는 Live/Dead kit assay 후 NIH-3T3 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다. a 및 d는 필름 표면의 세포의 유착을, b 및 e는 살아있는 세포(녹색형광)를, c 및 f는 죽은 세포(적색형광)를 나타내고, 기준자의 경우 a 내지 c에서는 200㎛이며, d 내지 f에서는 100㎛이다.

도 4a 및 4d에서 보듯이, 필름 표면에는 세포가 부착되지 않은 것으로 관찰되었으며, 세포가 필름 표면 상에 액적 형태로 존재하더라도 유착은 발생하지 않았다.

또한, 정확한 세포 유착, 세포 생존 능력 관찰 및 세포 생존 능력을 분석하기 위해 추가적으로 Live/Dead 분석을 수행한 결과, 도 4b 및 4e에서 보듯이, 유리 표면에서 방출되는 녹색 형광은 높은 강도를 나타내었으나, 필름 표면에서는 녹색 형광이 거의 관찰되지 않았다.

한편, 도 4c 및 4f에서 보듯이, 표면의 양쪽면에서 적색 형광이 거의 관찰되지 않았다는 점에서, 세포가 거의 죽지 않았음을 확인하였으며, 약간 관찰되는 적색 형광은 알긴산나트륨/PEO 필름이 아닌 유리 표면에서 나타났음을 확인하였다.

그 후, 각 영역의 평균 형광을 정량화하고 각 표본의 배경에 대해 보정하여 유리 및 알긴산나트륨/PEO 나노섬유상 필름 표면에 대한 평균 형광을 각각 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보듯이, 필름 표면과 비교할 때 유리 표면에 상당히 많은 양의 녹색 형광이 나타남을 확인하였으며(P <0.01), 형광에 의해 관찰된 필름 표면과 유리 표면 사이의 명확한 경계선을 확인함에 따라, 살아있는 섬유아세포 세포(live fibroblast cells)가 필름 표면에 유착되지 않음을 확인하였다.

즉, 이를 통하여, 유리 표면의 총 세포 형광은 알긴산나트륨/PEO 필름보다 약 9배 더 크며, 살아있는 세포가 알긴산나트륨/PEO 필름을 피하는 경향이 있음을 확인하였다.

실험예 3: 복강 내 유착 쥐 모델에서 in vivo 연구

동물연구: 생체실험보고(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments; ARRIVE)의 지침에 따라 무작위 대조시험 연구를 수행하였다.

중앙대학교 동물관리 및 사용위원회의 승인(제2015-00063호)을 받아 실험하였고, 모든 실험은 실험동물의 관리 및 사용에 대한 국립보건원(National Institute of Health)의 지침에 따라 수행되었다.

성체 수컷 쥐(rats)인 스프라그-돌리(Sprague-Dawley, 250g 내지 300g, Coretec, Seoul, Korea)를 온도제어방(22℃)에서 우리 안에 쌍으로 넣고 표준 실험실식이(standard laboratory diet) 및 수돗물을 먹였다. 12시간의 명암주기(조명은 오전 8시부터 오후 8시까지 켜짐)를 유지하였고, 수술 전 일주일 동안은 주거 시설에 적응시켰으며, 비정상적인 쥐는 제외시켰다.

<3-1> 무작위화(Randomization) 및 그룹 할당(Group Allocation)

Wei's Urn model을 사용하여, 컴퓨터 생성 블록 무작위화 목록(computer-generated block randomization list)(블록 크기 6)에 따라, 60마리의 쥐를 실험군(n=30) 및 대조군(n=30)의 두 그룹 중 하나로 무작위 추출하였다. 본 동물실험에 관여하지 않은 연구자로 하여금 PASS™ 11 소프트웨어(NCSS, Kaysville, UT, USA)를 사용하여 무작위화 목록을 만들도록 하였다. 할당된 그룹은 본 동물실험에 관여하지 않은 연구자에 의해 순차적으로 번호가 매겨진 불투명한 봉투에 봉인되도록 하였다.

<3-2> 외과적 시술

모든 수술 절차는 무균 상태에서 수행되었다. 본 시술에 참여하는 조사관은 분말처리되지 않은 장갑(powderless glove)을 사용하였고, 쥐가 할당된 각 그룹을 알지 못하게 하였다. 복강 내 염산케타민(ketamine hydrochloride)을 50mg/kg의 농도로 투여하여 쥐를 마취시켰다. 복부는 클로르헥시딘(chlorhexidine)으로 면도하여 준비하였고, 4cm 복부 정중선 절개를 실시한 후, 맹장(cecum)을 복막 공간(peritoneal space)에서 밖으로 드러냈다.

맹장의 장간막 반대편(antimesenteric)에서 유착을 유도하였다. 같은 양의 외상을 유발하기 위해, 침식성 출혈(erosive hemorrhage)이 관찰될 때까지 멸균 전기소작기용 팁 세정기(sterile electrocautery tip cleaner, Johnson and Johnson, New Brunswick, NJ)로 압력 없이 표면을 마모시킨 후, 맹장을 원위치시켰다. 그 후, 할당된 그룹을 확인하여 실험 그룹에서는 맹장과 복벽 사이에 3×3㎝의 알지네이트/PEO 필름을 놓았고, 대조 그룹에는 아무것도 넣지 않았다. 마지막으로, 바이크릴(vicryl) 4-0 봉합사로 2개의 층에서 연속법(continuous technique)을 사용하여 복강을 봉합하였다.

<3-3> 거시적 유착 평가

수술 2주 후, 페노바비탈(phenobarbital)을 과다 투여하여 쥐를 안락사시킨 후, 기존의 절개 부위를 제외하고 U형 절개를 하여 모든 유착을 검사하였다.

두 명의 조사관이 이전에 검증된 채점 시스템에 따른 합의(consensus)(표 2)에 의해 샘플을 검사 및 채점하였다. 유착 수, 부위, 두께, 장력 및 혈관 형성을 기록하고, 이를 통하여 모레노 점수(total integration value; Moreno score)를 계산하였다.

항목		점수
유착 수		유착 당 1
부위	골반 지방체(Pelvic fat body)-복벽(abdominal wall)	1
	장막(Omentum)-복벽(abdominal wall)	2
	장(intestine)-복벽(abdominal wall)	3
	골반 지방체-장(bowel) 또는 장막(omentum)-장(bowel)	4
	장(intestine)-장(intestine)	5
두께	< 3㎜	1
	3 ~ 5㎜	2
	> 5㎜	3
장력	Type I (절개(dissection) 없이 풀림)	1
	Type II (무딘 절개(blunt dissection)로 풀림)	2
	Type III (예리한 절개(sharp dissection)로 풀림)	3
혈관형성	혈관 형성 없음	0
	혈관 형성됨	1

유착이 발생하는 부위 및 채점 기준에 따른 분류는 도 6 및 도 7과 같다.

도 6은 유착을 유도하기 전, 유착 발생 조사 부위인 복벽(abdominal wall), 소장(small bowel), 대장(large bowel) 및 장막(Omentum)의 위치 및 형태를 나타낸 사진이다.

도 7은 유착이 발생한 내장 기관을 모레노 점수를 계산하기 위한 기준에 따라 분류하여 채점한 사진이다. 도 7A는 장막과 복벽 사이에 유착이 발생(2점)한 사진이고, 도 7B는 장막과 장 사이에 유착이 발생(4점)한 사진이다. 도 7C는 장과 장 사이에 유착이 발생(5점)하였고, 유착의 두께가 3 내지 5mm(2점)인 사진이다. 도 7D는 장과 장 사이에 유착이 발생(5점)하였고, 유착의 장력이 Type III 에 해당(3점)하는 사진이다.

<3-4> 현미경 및 조직학적 평가

유착력의 모든 평가 후, 유착을 포함하는 맹장 샘플을 일괄적으로 절제하고 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin)에 고정시켰다. 그 후, 표본을 파라핀 블록(paraffin blocks)에 끼운 다음 5μm 두께의 절편으로 절단하였다. 일련의 절편을 제조사의 프로토콜에 따라 아비딘-비오틴 결합법(avidin-biotin complex techique)을 사용하여 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. 본 연구의 목적, 사용된 재료 및 쥐 그룹에 관한 어떠한 정보도 받지 못한 조사자가 모든 표본을 검사하였고, 광학 현미경 하에서 하기의 척도를 사용하여 섬유증(fibrosis) 및 염증(inflammation)을 평가하였다.

섬유화의 정도는 0(섬유 결합 조직 형성 없음), 1(희박 또는 국소 결합 조직 형성), 2(섬유 결합 조직의 얇은 층) 또는 3(섬유 결합 조직의 두꺼운 층)으로 기록하였다. 염증은 0(호중구, 림프구 및 단구와 같은 염증 세포의 침윤 없음), 1(염증 세포의 희박한 침윤), 2(염증 세포의 국소 침윤) 또는 3(염증 세포의 육아 조직(Granulation tissue)의 확산성 침윤)으로 기록하였다.

DAKO(Glostrup, Denmark)로 부터 1:50 마우스 단일클론항체에 의해 동정된 ED1(인간 CD68의 랫트 동족체)을 표적으로 하여 2가지 추가적인 면역조직화학(immunohistochemical) 염색 방법을 수행한 후, 발현 수준을 기록하고, ED1 양성 세포의 수 및 FGF-2(Fibroblast growth factor-2) 이미지를 비교하였다.

<3-5> 통계 분석

본 발명에 필요한 표본 크기는 동물 실험에서 측정한 수술 후 거시적 유착 점수인 모레노 점수(Moreno score)를 기준으로 계산하였으며, 대조군의 평균 및 표준 편차는 11.2±2.6이었다. 검정력(power)을 계산하기 위해 실험 그룹과 대조 그룹에서 동일한 표준 편차를 가정하였다. 0.05의 2-tailed α 및 80%의 검정력을 위하여, 각 그룹당 27마리의 쥐가 필요하므로, 10%의 탈락율을 고려하여 각 그룹에 30마리의 쥐를 할당하였다.

연속 변수(continuous variables)를 위하여, 먼저 ShapiroWilk 테스트를 사용하여 정규 분포에 대한 데이터 분포를 평가하였다. 모레노 점수, 염증 및 교정 된 총 세포 형광은 정규성 검증(normality test)을 통과하였다. 그러나 모레노 점수(유착 수, 부착 부위, 두께, 장력 및 혈관 형성 횟수), 섬유증 및 ED1의 각 구성 요소는 정규성 검증을 통과하지 못하였고, 섬유화 및 ED1에서 직선성의 뚜렷한 편차를 보이지 않는 q-q plot을 추가로 확인하였다.

따라서, 모레노 점수, 염증, 보정된 총 세포 형광 섬유증(corrected total cell fluorescence fibrosis) 및 ED1에서 모수검정(parametric test)에 대한 일반적인 가정을 적용하였다. 한편, 모레노 점수의 각 구성 요소는 비모수적검정(non-parametric test)을 사용하여 분석하였다. 모레노 점수, 염증, 섬유증 및 ED1을 t-검정을 사용하여 분석하였고, 모레노 점수의 각 구성 요소를 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 비교하였다. 보정된 총 세포 형광은 고정된 인자로서 Live/Dead(Calcein AM vs. EthD-1) 및 대조군/실험군(유리 vs. 필름)을 갖는 two-way ANOVA를 사용하여 분석하였다. 0.05의 한계유의수준에서 주요 상호 작용 효과를 분석하였고, SPSS 버전 23.0(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하여 통계분석을 수행하였다.

동물실험 결과, 본 실험에 사용한 모든 쥐에서, 유착 형성의 중요한 기간이 지났고 필름은 이미 흡수되었으며, 유착과 별개로 다른 중대한 합병증은 발견되지 않았다. 또한, 쥐의 창상열개(wound dehiscence), 식욕 부진(anorexia) 또는 죽음과 같은 심각한 수술 후 부작용은 관찰되지 않았다.

한편, 수술 절개부위는 정상적인 치유를 보였다. 거시적인 평가에 기초한 유착점수는 하기 표 3과 같다. 유착 횟수(P=0.001), 유착 부위(P<0.001), 두께(P=0.004) 및 장력(P=0.004)은 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 감소하였으며, 모레노 점수는 대조군보다 실험군에서 유의하게 낮았다(P<0.001).

항목	대조군	실험군	p-value
유착수	3.0±2.4	1.0±1.8	0.001
부위	3.8±2.0	1.8±2.1	< 0.001
두께	1.0±0.6	0.5±0.6	0.004
장력	1.0±0.6	0.5±0.6	0.004
혈관 형성	0.1±0.1	0.0±0.1	0.984
모레노 점수	8.8±5.2	3.8±4.6	< 0.001

현미경적 평가에 기초한 섬유증 및 염증에 대한 조직학적 평가는 도 8 및 도 9와 같다. 도 8은 유착을 유도한 맹장샘플을 나타낸 현미경 사진이다.

도 8A는 유착을 유도한 부위에 상기 실시예 1의 유착방지필름을 적용한 실험군에서 생성된 섬유증(fibrosis)를 보여주는 200배 현미경 사진이고, 도 8B는 도 8A 부위의 100배 현미경 사진이다. 도 8C는 유착을 유도한 부위에 상기 실시예 1의 유착방지필름을 적용하지 않은 대조군의 경우, 염증(inflammation)이 심한 상태에서 섬유화가 진행되었음을 나타내는 이물거대세포(foreign body giant cell) 및 호중구(neutrophil)를 보여주는 200배 현미경 사진이고, 도 8D는 도 8C 부위의 100배 현미경 사진으로, 장과 장 사이에 섬유증(fibrosis)이 심하게 발생함에 따라 형성된 섬유성 띠(fibrotic band)를 나타낸다.

도 8에서 보듯이, 대조군(Group C)에 비해 실험군(Group L)에서 생성된 섬유의 두께가 얇고, 염증반응 역시 현저하게 감소하였다는 점에서, 조직의 유착 정도는 실험군에서 유의하게 감소하였음을 알 수 있다.

도 9는 섬유증(Fibrosis) 및 염증(inflammation) 등급(Grade)을 현미경적으로 평가한 그래프이다.

도 9에서 보듯이, 섬유화는 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 감소하였고(P=0.001), 염증 역시 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 감소하였음을 알 수 있다(P=0.003).

도 9에서 보듯이, 대조군(Group C)에 비해 실험군(Group L)에서 조직의 유착 정도가 감소함을 확인하였다.

현미경적 평가에 기초한 섬유증 및 염증에 대한 면역조직화학적 평가는 도 10 내지 도 12와 같다.

도 10은 유착을 유도한 맹장샘플의 염증 정도를 평가하기 위하여, 면역조직화학(immunohistochemical) 염색 방법에 의해 ED1 양성 세포(검은색 박스, red colored cell)를 나타낸 현미경 사진이다.

도 10A는 실험군(Group L)의 ED1 양성 세포를 나타내는 사진이고, 도 10B는 대조군(Group C)의 ED1 양성 세포를 나타내는 사진이다.

도 10에서 보듯이, 정상적인 장 조직을 나타내는 실험군과 달리, 대조군에서는 염증반응이 현저하게 증가하였다는 점에서, 조직의 유착 정도는 실험군에서 유의하게 감소하였음을 알 수 있다.

도 11은 ED1 양성 세포의 면역조직화학 검사에 의한 염증(inflammation) 등급(Grade)을 현미경적으로 평가한 그래프이다.

도 11에서 보듯이, 대조군(Group C)에 비해 실험군(Group L)에서 조직의 염증 등급이 감소함을 확인하였다.

도 12는 실험예 3에서 유착을 유도한 맹장샘플의 신생혈관형성 유도 정도를 평가하기 위하여, 면역조직화학(immunohistochemical) 염색 방법에 의해 FGF-2(Fibroblast growth factor) 이미지를 나타낸 현미경 사진이다.

도 12A는 실험군(Group L)의 정상적인 조직을 나타내는 사진이고, 도 12B는 대조군(Group C)의 신생혈관이 유도된 조직을 나타내는 사진이다.

도 12에서 보듯이, 정상적인 조직을 나타내는 실험군과 달리, 대조군에서는 다수의 신생혈관(붉은색 점)이 유도되었다는 점에서, 조직의 유착 정도는 실험군에서 유의하게 감소하였음을 알 수 있다.

즉, 이를 통하여 본 발명의 실시예 1에서 제조한 알긴산나트륨/PEO 필름은 유착을 방지하는 물리적 장벽뿐 아니라 염증을 감소시키는 화학적 장벽의 성질을 함께 갖는다는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (1)

1. 나노섬유상 조직 유착 및 염증 방지용 필름에 있어서,
   상기 나노섬유는 알지네이트(alginate), 비이온성 중합체, 계면활성제 및 증류수의 전기방사 결과물이고,
   상기 전기방사 결과물은 염화칼슘의 에탄올 용액에 침지된 것이고
   상기 염화칼슘의 에탄올 용액은 에탄올 100㎖ 당 염화칼슘 0.5g 내지 1.5g을 포함하는 것이고,
   상기 알지네이트 및 상기 비이온성 중합체는 8:1 내지 10:1의 중량비로 혼합되는 것이고,
   상기 비이온성 중합체는 폴리에틸렌옥사이드이고,
   상기 알지네이트는 알긴산나트륨이고,
   상기 계면활성제는 Triton X-100인 것인
   나노섬유상 조직 유착 및 염증 방지용 필름.

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