KR20200133696A - pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 이용한 약물 운반체 및 그것과 약물의 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 이용한 약물 운반체 및 그것과 약물의 복합체를 제공한다. 본 발명의 약물 운반체는 특정 표적세포에만 선택적으로(또는 특이적으로) 작용함으로써 약물 부작용은 경감되고 약물의 약효는 증대시킬 수 있는 효과를 가지며 항암제, 면역 억제제, 조영제 등의 약물 운반체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 이용한 약물 운반체 및 그것과 약물의 복합체{Drug Delivery System Using pH-dependent Membrane Penetrating Peptide and Drug Conjugate Thereof}
본 발명은 pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 이용한 약물 운반체 및 그것과 약물의 복합체에 관한 것이다.
특정 장기, 조직, 세포로 다양한　약물(저분자 세포독성 항암제, 재조합 단백질, 유전자, 조영제 등)를 전달하기 위한 효과적인 약물 전달 시스템(Drug Delivery System) 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 일반적으로 이런 시스템은 특정 세포에 특이적으로 존재하는 분자에 특이적으로 강력하게 결합하는 물질을 사용하여 이루어진다. 전통적인 제형과 다르게, 표적 특이적　치료제는 표적 부위에 전달된 치료제의 생물학적 이용가능성(bioavailability)을 최대화하도록 고안되어 왔고,　낮은 부작용으로 질병을 치료하면서 치료 효과를 높일 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 약물 전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.
최근에는 다양한 약물(예: DNA, siRNA, 펩타이드, 단백질)을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위해 막투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP), 글리코실화 트리터페노이드(glycosylated triterpenoids) 등을 이용하려는 시도들이 있다(Morris et al., Nat. Biotechnol. 19(2001) 1173-1176; Jarver et al., Drug Discov.Today 9(2004) 395-402; Pharmaceuticals 2012, 5, 1177-1209). 그 동안 비침투성 약물전달에 있어 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 펩타이드, 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 체내 전달 효율을 높일 수 있기 때문에 CPP 펩타이드를 이용한 약물전달이 매우 큰　관심을 불러일으키고 있다.
한편 나노 입자 약물 전달 시스템 (Nanoparticle drug delivery system; NDD)은 지난 수십 년 동안 광범위하게 연구되어 왔으며 암 표적 치료제 개발에 주요 관심이 되었다. NDD는 부작용을 개선하고 치료 효과를 향상시키기 위해 약물의 생체 분포 및 약물 동태 특성을 변경시킨다. 이러한 긍정적인 효과는 종양 또는 혈관 세포에 특이적인 결합, 향상된 투과성 및 보유 (EPR) 효과, 종양의 고유한 병태생리 및 미세환경(예 : pH, 산화 환원, 효소, 또는 다른 자극 등에 민감한 나노 입자)을 사용할 수 있는 NDD의 성질에서 기인한다.
본 발명은 약물은 특정 표적세포로 특이적으로 약물을 운반할 수 있는 약물 운반체와 그것의 약물과의 복합체를 개시한다.
본 발명의 목적은 표적세포에만 선택적으로(또는 특이적으로) 작용함으로써 약물 부작용은 경감되고 약물의 효과는 증대시킬 수 있는 약물 운반체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약물 운반체와 약물의 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 기타의 목적은 이하에서 제시될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 약물 운반체는 특정 표적세포의 표면에 발현되는 표적 분자를 특이적으로 인식하여 결합하는 세포 표적화 영역(cell targeting domain)과 세포 외부에서 세포 내부로 또는 세포 내 엔도좀에서 세포질로 약물의 방출 효율(또는 약물의 전달 효율)을 높일 수 있는 막 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)가 결합된 구성을 가진다.
본 발명자들은 아래 실시예에서 확인되는 바와 같이, 이러한 구성의 약물 운반체가 의도한 효과 즉 특정 표적세포에만 선택적으로(또는 특이적으로) 작용함으로써 약물 부작용은 경감되고 약물 방출 효율을 높여 약물의 유효성은 증대시키는 효과를 가지는가를 평가하기 위하여, 세포 표적화 영역을, 표적인 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 특이적으로 인식하여 결합하는 압타머 또는 항체로 구성하고, 막 투과성 펩타이드를, pH 비의존적 막 투과 활성을 갖는 펩타이드(pH 비의존적 막 투과성 펩타이드)인 멜리틴(Melittin), LP, 하이린 에이1(Hylin a1)과 pH 의존적 막 투과 활성을 갖는 펩타이드(pH 의존적 막 투과성 펩타이드)인 LPE3-1, pHD24 각각으로 구성하여 약물 운반체를 제조하고, 더불어 이 약물 운반체를, 세포사멸 효과를 가지는 약물인 PLK1 siRNA 또는 파클리탁셀(Paclitaxel)에 결합시킨 약물 운반체의 약물과의 복합체를 제조하여, 다양한 pH 조건에서 HER2를 과발현하는 BT-474 세포와 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포에 처리하여 약물의 선택적 작용성과 약물 효과의 증대 정도를 평가하였다.
여기서 HER2는 인간 상피세포 성장인자 수용체(HER/EGFR/ErbB) 계열의 구성원으로 유방암 환자에서 중요한 바이오마커이면서 또한 치료 표적으로 알려져 있고(Nature Clinical Practice Oncology, 2006, 3:269-280; World J Clin Oncol. 2017, 8(2):120-134), PLK1은 세포분열에서 중심적 역할을 하는 조절자로서(Cell Rep. 2013, 3(6):2021-32), 다양한 인간 종양세포에서 과발현되기 때문에 항암 치료의 중요한 표적이 되고 있는 인자이며(Transl Oncol. 2017, 10(1):22-32), 파클리탁셀은 유방암, 자궁암 등의 항암 치료제로 널리 사용되고 있는 디테르페노이드(Diterpenoid)계 항암제이다.
상기 평가 결과, 막 투과성 펩타이드로 pH 비의존적 막 투과성 펩타이드인 멜리틴(Melittin), LP, 하이린 에이1(Hylin a1)를 사용한 약물 운반체는, 세포질이나 혈액 등 생체 주요 조직 그리고 세포외 환경의 pH에 가까운 pH 7.0에서 HER2를 과발현하는 BT-474 세포와 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포 모두에서 약물이 작용하여 세포사멸 효과를 유도함으로써 표적인 HER2의 발현 유무에 따른 약물의 선택적 작용성을 보이지 않았으나, 막 투과성 펩타이드로 pH 의존적 막 투과성 펩타이드인 LPE3-1, pHD24를 사용한 약물 운반체는, HER2를 과발현하는 BT-474 세포에만 선택적으로 작용하여 세포사멸 효과를 유도하고 HER2를 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포에서는 세포사멸 효과를 거의 유도하지 못하였다.
한편 대조군으로서 pH 의존적 막 투과성 펩타이드(LPE3-1)를 제외하고 단지 HER2 특이적 압타머또는 항체를, 약물인 PLK1 siRNA 또는 파클리탁셀(Paclitaxel)에 결합시켜 구성한 약물운반체와 약물의 복합체도 HER2를 과발현하는 BT-474 세포에만 선택적으로 작용하여 세포사멸 효과를 유도하였지만, 그 세포사멸 효과에 있어서는 pH 의존적 막 투과성 펩타이드(LPE3-1)까지 포함하고 있는 상기 약물 운반체와 약물의 복합체 비하여 뚜렷하게 낮았다. 반면 아래의 실시예가 보여주듯이, pH 의존적 막 투과성 펩타이드와 약물인 PLK1 siRNA 또는 파클리탁셀의 복합체는 pH 7에서 약물의 선택적 작용성도 없었고 또 약물의 세포사멸 효과도 거의 나타내지 못하였다.
전술한 바의 실험 결과는, 세포 표적화 영역(cell targeting domain)과 pH 비의존적 막 투과성 펩타이드로 구성된 약물 운반체는 pH 7에서 그 펩타이드가 세포막에 작용하여 약물을 세포 내로 직접 전달하는 반면, 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드로 구성된 약물 운반체는 그 펩타이드가 pH 7에서는 세포막에 작용하지 못하고 대신에 세포 표적화 영역이 표적세포의 표적분자와 결합하여 엔도좀으로 세포 내부로 내재화된 후에 낮은 pH을 갖는(약 pH 4~6) 엔도좀이나 리소좀에서 활성화되어 약물을 세포질로 방출하는 것임을 보여주는 것이라 할 수 있다. 이는 아래의 실시예에서 확인되듯이, pH 5.5에서는 pH 의존적 막 투과성 펩타이드나 pH 비의존적 막 투과성 펩타이드 모두, 이 펩타이드와 세포 표적화 영역을 포함하는 약물 운반체를, 약물과의 복합체 형태로 표적세포에 처리될 때, 표적분자인 HER2의 과발현 유무를 불문하고 BT-474 세포와 MDA-MB-231 세포 모두에서 유사한 정도의 세포사멸 효과를 보이는 점에 의해 뒷받침된다.
본 발명은 전술한 바를 종합할 때, 일 측면에 있어서, 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드가 결합된 약물 운반체로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 상기 약물 운반체가 약물과 결합된 약물 운반체와 약물의 복합체로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 약 pH 7에서는 막 투과성을 나타내지 못하지만 산성 조건 구체적으로 구체적으로는 pH 4~6.5 사이에서 막 투과성을 나타내는 펩타이드를 의미한다. 달리 정의하면 약 pH 7인 세포외 환경 조건에서는 세포막 투과 활성을 나타내지 못하지만 산성 조건인 엔도좀이나 리소좀에서는 막 투과 활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다.
또 본 발명에서, 세포 표적화 영역이 선택적으로 인식하여 결합하는 표적세포의 표적분자는 특정 표적세포 표면에 존재하는 임의의 항원 또는 임의의 수용체이다.
상기 특정 세포는 약물이 그 세포 내부로 전달될 필요가 있는 임의의 표적세포를 의미한다. 이 표적세포는 통상은 암세포(또는 암 줄기세포)이다. 암세포라면 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁 경부암, 자궁 내막체암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종혈액암 등 암종을 불문한다. 또 암세포 이외에도 약물이 표적세포 내부로 전달될 필요가 있는 임의의 비정상세포도 표적세포가 될 수 있다. 그러한 비정상세포로서는 전립선 비대증 세포, 과면역 활성을 가진 갑상선 세포, 자가면역 질환과 관련된 세포(예컨대 류마티스 관절염, 루푸스, 중증 근무력증 등에서 수반되어 항체를 생산하는 B 세포) 등을 들 수 있다. 또한 표적세포는 정상세포일 수도 있다. 예컨대 수지상 세포, 혈관의 내피세포, 폐 세포, 유방 세포, 골수 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 간 세포, 난소 세포 등 임의의 정상세포가 표적세포가 될 수 있다. 이러한 정상세포가 표적세포로 사용될 경우 암세포나 비정상세포에서의 약물 효과 유무의 판단이나 확인을 위한 대조군으로서 유용하게 사용될 수 있다. 표적세포는 살아있는 동물이나 인간의 조직을 구성하는 체내 세포이거나 배양된 동물 세포, 배양된 인간 세포, 미생물 등 체외 세포일 수 있다.
세포 표적화 영역이 선택적으로 인식하여 결합하는 표적분자는 표적세포 표면에 존재하는 임의의 항원 또는 임의의 수용체이다. 이 항원은 바람직하게는 표적세포에서 비표적세포에 비해 과발현되는 항원을 의미하며, 특히 정상세포에 비해 암세포에서 과발현되는 임의의 세포 표면 수용체를 포함하는 의미이다. 역형성 갑상선암이나 유방암, 폐암 등에 과발현되는 표피 성장 인자 수용체(EGFR, Epidermal growth factor receptor), 유두성 갑상선 암(papillary thyroid cancer)에서 과발현 메타스틴(metastin) 수용체(Metastin receptor), 유방암에서 과발현되는 ErbB 계열의 수용체 타이로신 카이나제(Receptor tyrosine kinases), 유방암에서 과발현되는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER2), 육두성 신암종에서 과발현되는 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit), 식도 선암에 과발현되는 HGF 수용체 c-Met, 유방암 등에서 과발현되는 CXCR4 또는 CCR7, 전림선암에서 과발현되는 엔도테린-A 수용체, 직장암에서 과발현되는 PPAR-δ(peroxisome proliferator activated receptor δ), 난소암에서 과발현되는 PDGFR-α(Platelet-derived growth factor receptor α) 등이 표적분자일 수 있다. 또한 암 줄기세포의 표면 항원인 CD44, CD133, CD166 등이 표적 분자일 수 있으며(Cancer Res, 2005, 65(23):10946-51; Cancer Res, 2007, 67(3): 1030-7), 그 이외에도 CEA(carcinoembryonic antigen), PSMA(prostatespecific membrane antigen), TAG-72(tumor-associated glycoprotein 72), GD2 ganglisoside, GD3 ganglisoside, HLA-DR10(human leukocyte antigen-DR), TAL6(tumor-associated antigen L6), TRAILR2(tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2), HGFR(hepatocyte growth factor receptor) 등이 또한 표적분자일 수 있다.
본 발명에서, 세포 표적화 영역은 표적세포에 선택적인 결합을 가능하게 함으로써 표적 기능을 제공한다. 이 세포 표적화 영역은 표적세포의 표면에 존재하는 항원 또는 수용체와 특이적으로 결합하여 엔도시토시스(endocytosis)를 유도함으로써, 이와 결합하는 약물의 세포 내로의 이동을 가능하게 한다.
항체, 압타머, 특정 세포에서 분비되어 표적세포인 다른 세포의 표면 수용체에 작용함으로써 세포 사이에서의 신호 전달의 역할을 하는 호르몬(예컨대 erythropoietin hormone), 사이토카인이나 케모카인(예컨대 IL13), 표적세포 표면 수용체 결합하는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) 등의 생체 분자인 리간드, 수용체와의 특이적 결합 능력을 보유한 이들 인자의 일부 영역인 펩타이드 등이 이러한 세포 표적화 영역으로 이용될 수 있다.
대표적으로 본 발명의 약물 운반체에서 세포 표적화 영역은 항체 또는 압타머이다.
세포 표적화 영역으로서의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체뿐만 아니라 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프를 인식하는 항체로서 이특이적 항체 등을 말함)이거나, 표적 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 한, 항체의 단편, 화학적으로 수식된 항체, 키메릭 항체(인간과 마우스의 키메릭 항체, 인간과 원숭이 키메릭 항체 등), 면원원성을 낮춘 인간화 항체나 인간 항체 등 임의의 항체일 수 있다. 또한 항체 단편, 화학적 수식된 항체의 다양한 형태들이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Fab, F(ab')2, scFv(중쇄 및 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc 를 가지는 항체) 등이나 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편 등을 들 수 있다.
세포 표적화 영역으로서의 항체는 기존에 개발되어 판매되고 있는 항체 예컨대 세툭시맙(Cetuximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 오레고보맙(Oregovomab), 에드레콜로맙(Edrecolomab),　알렘투주맙(Alemtuzumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 이브리투모맙(Ibritumomab), 오파투무맙(Ofatumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab), 이필리무맙(Ipilimumab), 겜투주맙(Gemtuzumab), 브렌투시맙(Brentuximab), 베다스툭시맙(Vadastuximab), 글렙바투무맙(Glembatumumab), 데파투시주맙(Depatuxizumab), 폴라투주맙(Polatuzumab), 데닌투주맙(Denintuzumab) 등을 사용할 수도 있다.
항체의 제조 방법, 천연 항체에 인위적 변형을 가하여 표적 항원에 대한 특이성을 항상시키거나 면역원성을 개선시킨 항체 등과 관련해서는 당업계에 공지된 다양한 문헌 예컨대 미국 특허 4,444,887, 미국 특허 4,716,111, 미국 특허 5,545,806, 미국 특허 5,814,318, 국제 공개특허 WO 98/46645, 국제 공개특허 WO 98/50433, 국제 공개특허 WO 98/24893, 국제 공개특허 WO 98/16654, 국제 공개특허 WO 96/34096, 국제 공개특허 WO 96/33735, 문헌[Protein Eng 1994, 7(6):805-814], 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91:969-973] 등을 참조할 수 있다.
세포 표적화 영역으로서의 압타머는 단일가닥 DNA 압타머 또는 단일가닥 RNA 압타머일 수 있다. 압타머는 항체와 마찬가지로 표적 항원 등 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 리간드를 의미하는데, 표적분자와 특이적으로 결합할 수 있다면, 압타머는 이중가닥 DNA 또는 RNA 압타머일 수도 있다. 이러한 표적분자와의 특이적 결합할 수 있는 압타머의 제조, 선별 방법 등은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 특히 SELEX 기술을 이용할 수 있다. 이 SELEX 기술은 "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment"의 준말로 이름 붙여진 기술로, 해당 기술에 대해서는 문헌[Science 249 (4968):505-510, 1990], 미국 등록특허 제
5,475,096, 미국 특허등록 제5,270,163호, 국제특허공개 WO 91/19813 등을 참조할 수 있으며, 압타머의 선별을 위한 구체적인 방법이나 적절한 시약, 재료 등의 사용에 대해서는 문헌[Methods Enzymol 267:275-301, 1996], 문헌[Methods Enzymol 318:193-214, 2000] 등을 참조할 수 있다. 압타머는 생체 내 반감기 향상을 위하여 당,포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 것일 수 있다. 이러한 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드는 당업계에 그 제조방법을 포함하여 구체적으로 공지되어 있다. 예컨대 당에서 변형된 뉴클레오티드는, 그 당의 하이드록실 기(OH group)가 할로겐 기, 지방족 기, 에테르 기, 아민 기 등으로 수식된 것, 당인 리보스 또는 디옥시 리보오스 자체가 이를 대신할 수 있는 당 유사체 α-아노머 당(α-anomeric sugars), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xyloses) 또는 릭소오스(lyxoses)와 같은 에피머 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars) 등으로 치환된 것을 들수 있다. 또한 예컨대 포스페이트에서의 변형은 포스페이트가 P(O)S(thioate), P(S)S(dithioate), P(O)NR2(amidate), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(formacetal)로의 변형된 것 등을 들수 있다. 여기서 상기 R 또는 R'는 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 등이며, 포스페이트에서 변형될 경우 그 연결기는 -O-, -N-, -S- 또는 -C-가 되어, 이러한 연결기를 통해 인접 뉴클레오티드가 서로 결합하게 된다.
본 발명의 약물 운반체에서, 세포 표적화 영역은 pH 의존적 막 투과성 펩타이드와 연결되어 있다. 이 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 약 pH 7 조건의 세포막에는 막 투과 활성을 나타내지 못하고 세포 표적화 영역이 표적세포의 표적분자와 결합하여 엔도좀으로 세포로 내재화된 후에 낮은 pH을 갖는(pH 4~6) 엔도좀이나 리소좀에서 활성화되어 막 투과 활성을 나타냄으로써 약물을 세포질로 방출하는 기능을 수행한다. 그럼으로써 pH 의존적 막 투과성 펩타이드를 갖는 본 발명의 약물 운반체는, pH 비의존적 막 투과성 펩타이드를 갖는 약물 운반체에서 표적분자를 발현하지 않는 비표적세포에 대해서도 그 펩타이드의 막 투과 활성에 의하여 약물 효과가 비선택적으로 나타나는 부작용이 없이, 표적분자가 발현되는 표적세포에 대해서만 선택적으로 약물 효과가 나타내는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 약물 운반체에서, 세포 표적화 도메인과 결합할 수 있는 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 당업계에 몇 가지가 공지되어 있다. 예컨대 GALA 펩타이드, MelP5 펩타이드의 변이체인 pHD15, pHD24, pHD108와, LP 펩타이드 변이체인 LPE3-1, LPH4 그리고 ATRAM 펩타이드 등이 그러한 펩타이드들이다.
GALA 펩타이드와 관련해서는 문헌[J. Am. Chem. Soc., 2015, 137:12199-12202, 2015]을 참조할 수 있고, MelP5 펩타이드의 변이체인 pHD15, pHD24, pHD108와 관련해서는 문헌[J Am Chem Soc 2017, 139(2): 937-945 ]을 참조할 수 있으며, LP 펩타이드 변이체인 LPE3-1, LPH4와 관련해서는 문헌[Org Biomol Chem. 2016, 14(26):6281-8]을 참조할 수 있다. 또 ATRAM 펩타이드와 관련해서는 문헌[Biochemistry 2015, 54:6567-6575]을 참조할 수 있다. 이들 문헌은 모두 본 명세서에 인용된 다른 모든 문헌들과 마찬가지로 본 명세서의 일부로서 간주된다.
문헌[J. Am. Chem. Soc., 2015, 137:12199-12202, 2015]는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 HA-2 서브유닛의 N-말단 영역에서 유래한 펩타이드로서, Glu-Ala-Leu-Ala의 반복 서열로 구성되어 있는 GALA 펩타이드가 산성 pH에서는 α-헬릭스 구조를 형성하여 세포막을 투과하지만 중성 pH에서는 세포막을 투과하지 못함을 보여준다.
문헌[J Am Chem Soc 2017, 139(2): 937-945 ]은 MelP5 펩타이드의 변이체인 pHD15, pHD24, pHD108은 산성 조건 즉 pH 5 전후에서 높은 막 투과 활성을 나타내지만, 중성 조건 즉 pH 7 전후에서는 막 투과 활성을 나타내지 못함을 보여주며, 문헌[Org Biomol Chem. 2016, 14(26):6281-8]은 LP 펩타이드 변이체인 LPE3-1, LPH4가 pH 5 전후에서 높은 막 투과 활성을 나타내지만 pH 7.4에서는 막 투과 활성을 거의 나타내지 못함을 보여준다.
문헌[Biochemistry 2015, 54:6567-6575]은 ATRAM 펩타이드가 고형암의 세포외 환경의 pH와 유사한 약산성 pH에서만 막 투과성을 나타냄을 보여준다.
상기 예시된 pH 의존적 세포 투과성 펩타이드들의 아미노산 서열은 아래에서 확인할 수 있다.
LPE3-1: H2N-GWWLALAEAEAEALALASWIKRKRQQ-COOH(서열번호 1)
LPH4: GWWLALALALALALALASWIHHHHQQ-COOH(서열번호 2)
pHD15: H2H-GIGEVLHELADDLPDLQEWIHAAQQL-COOH(서열번호 3)
pHD24: H2N-GIGDVLHELAADLPELQEWIHAAQQL-COOH(서열번호 4)
pHD108:H2N-GIGEVLHELAEGLPELQEWIHAAQQL-COOH(서열번호 5)
ATRAM: GLAGLAGLLGLEGLLGLPLGLLEGLWLGLELEGN-COOH(서열번호 6)
본 발명의 약물 운반체에서, 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 링커의 매개 없이 직접 서로 공유적으로 결합하거나 링커를 매개로 공유적으로 결합할 수 있다.
세포 표적화 영역이 항체, 리간드, 펩타이드, 사이토카인 등 단백질인 경우, pH 의존적 막 투과성 펩타이드와의 직접적인 공유 결합은, 단백질인 세포 표적화 영역의 말단 아미노산의 카르복시기(또는 아미노기)와 pH 의존적 펩타이드 말단 아미노산의 아미노기(또는 카르복시기)를 당업계에 공지된 방식으로 화학적으로 결합시켜 의하여 이루어질 수 있다. 또 이러한 결합은 이들 결합체를 암호화하는 재조합 핵산을, 적절한 발현벡터에 삽입하고 그 발현벡터를 적절한 숙주 미생물(대장균이나 HO 세포, NSO 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포 등의 동물세포 등)에 형질전환시켜 융합 단백질의 형태로 발현시키고 분리, 정제하여 이루어질 수 있다. 당업계에는 재조합 핵산 기술, 발현벡터의 구성, 선별 마커 유전자, 형질전환 방법, 숙주 미생물, 숙주 미생물의 배양을 배양 배지의 조성, 배양 방법 , 고수율의 배양 방법, 목적 단백질의 분리 방법 등은 모두 공지되어 있으며, 상당한 양의 문헌의 축적되어 있어 이들 문헌을 참조할 수 있다. 예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)], 문헌[F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley amp; Sons, Inc. (1994)], 문헌 [Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques] 등을 참조할 수 있다.
세포 표적화 영역이 단백질로서, pH 의존적 펩타이드와의 직접적인 공유 결합을 형성할 경우, 세포 표적화 영역의 표적과의 특이적 결합성이나 pH 의존적 펩타이드의 세포 투과성에 영향을 미치지 않도록 수개 또는 수십개의 아미노산으로 구성된 스페이서(spacer)를 게재시킬 수 있다. 이러한 스페이서가 게재된 본 발명의 약물 운반체는 화학적 반응으로, 또는 전술한 바의 재조합 융합 단백질의 제조 방법과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
세포 표적화 영역이 항체, 리간드, 펩타이드, 사이토카인 등 단백질인 경우, 그 단백질은 pH 의존적 막 투과성 펩타이드와, 링커의 매개 없이 직접 수소결합 등 정전기적 상호작용(charge interaction), 소수성 상호작용 등을 통해 비공유적으로 결합할 수 있다. 예컨대 단백질인 세포 표적화 영역이 음전하를 띠는 표면을 갖는 경우, 양이온성을 띠는 pH 의존적 막 투과성 펩타이드와 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합할 수 있다. 마찬가지로 단백질인 세포 표적화 영역이 소수성 영역을 포함할 경우, 소수성을 띠는 pH 의존적 막 투과성 펩타이드와 정전기적 상호작용을 통해 결합할 수 있다.
세포 표적화 영역이 압타머인 경우도 pH 의존적 막 투과성 펩타이드와, 링커의 매개 없이, 정전기적 상호작용(charge interaction), 소수성 상호작용 등을 통해 비공유적으로 결합할 수 있다. 핵산인 압타머는 음전하를 띠기 때문에 예컨대 양이온성을 띠는 pH 의존적 펩타이드와 정전기적 상호작용을 통해 결합한다.
본 발명의 약물 운반체에서 세포 표적화 영역과 pH 의존적 펩타이드는 링커를 매개로 공유적으로 결합할 수도 있다.
본 발명에서 링커는 펩타이드나 리간드, 항체, 항체 단편 등의 단백질의 아민기(amine group), 카르복시기(carboxyl group) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl group)나 압타머 등의 핵산의 인산기(phosphate group, 히드록시기(hydroxyl group)를 통해 결합할 수 있는 작용기를 가진 임의의 링커를 사용할 수 있다.
이러한 링커의 작용기는 아이소티오시아네이트(isothiocyanate), 아이소시아네이트(isocyanates), 아실 아자이드(acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 알데하이드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭사이드(epoxide), 옥시레인(oxirane), 칼보네이트(carbonate), 아릴 할라이드(aryl halide), 이미도에스터(imidoester), 카보이미드(carbodiimide), 안하이드라이드(anhydride), 플루오로페닐 에스터(fluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 또는 비닐술폰(vinylsulfone) 등일 수 있다.
링커는 프로테아제에 의해서 절단 가능하거나, 산이나 염기 조건에서 절단 가능하거나, 고온이나 광조사에 의해서 절단 가능하거나 또는 환원 또는 산화 조건에서 절단 가능한 링커일 수 있고, 또는 이러한 조건들에서 절단 가능하지 않은 링커일 수도 있다.
절단 가능한 링커로서는 예컨대 산성 조건에서 절단되는 히드라존(hydrazone) 링커, 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 링커, 환원 조건에서 절단되는 디설파이드(disulfide) 작용기를 갖는 링커 등을 들 수 있고, 절단 가능하지 않은 링커로서는 MCC(Maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate) 링커, MC(maleimidocaproyl) 링커, 또는 그 유도체로서 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC) 링커나 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-sMCC)를 들 수 있다.
또한 링커는 자가 희생 링커(self-immolative linker) 또는 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커(traceless linker)일 수 있다. 자가 희생 링커는 예컨대 발명의 명칭이 "Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof "인 미국 특허 제9,089,614호에 개시된 링커, 명칭이 "SELF-IMMOLATIVE LINKERS CONTAINING MANDELIC ACID DERIVATIVES, DRUG-LIGAND CONJUGATES FOR TARGETED THERAPIES AND USES THEREOF"인 국제공개 제WO2015038426호에 개시된 링커를 들 수 있으며, 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커로서는 페닐하이드라지드 링커, 아릴-트리아젠 링커, 문헌[Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)]에 개시된 링커 등일 수 있다.
또한 링커는 동종 이작용성 링커(둘 이상의 동일한 반응성 작용기를 갖는 링커) 또는 이종 이작용성 링커(둘 이상의 서로 다른 반응성 작용기를 갖는 링커)일 수도 있다.
동종 이작용성 링커는 예컨대 3'3'-디티오비스(설포석신이미딜 프로피오네이트(DTSSP), 디석신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS), 디석신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포석신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디석신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할로겐화물 함유 화합물(DFDNB), 비스말레이미도헥산(BMH), 아릴 할로겐화물 함유 화합물(DFDNB), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카르보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디아이오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(아이오도아세트아미드), N,N'-헥사메틸렌-비스(아이오도아세트아미드) 등을 들 수 있다.
이종 이작용성 링커는 아민 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차-링커, 카르보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차 링커, 아민 반응성 및 광반응성 교차 링커, 설프하이드릴 반응성 및 광반응성 교차 링커 등을 들 수 있는데, 아민 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차-링커로서는 예컨대 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 석신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포석신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC), 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBs), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석신이미드 에스테르(설포-MBs), N-석신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB) 등을 들 수 있고, 카르보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 교차 링커로서는 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH) 등을 들 수 있고, 아민-반응성 및 광반응성 교차-링커로서는, 예컨대 N-하이드록시석신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포석신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포석신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포석신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시석신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-석신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포석신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시석신이미드(ANB-NOs) 등을 들 수 있으며, 설프하이드릴 반응성 및 광반응성 교차 링커로서는 예컨대, 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(아이오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-아이오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 등을 들 수 있다.
일부 양태에 있어서, 링커는 수지 유형(dendritic type)의 링커이다. 수지 유형 링커는 분지형, 다기능성 연결부를 가지며, 그러한 링커로서는 예컨대 PAMAM 덴드리머를 들 수 있다.
당업계에서는 상기 예시한 바의 링커 이외에도 본 발명에 적용 가능한 수많은 링커가 상당한 수의 문헌을 통해 공지되어 있다. 그러한 문헌으로서 구체적으로 문헌[Castaneda, et al, "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibodydrug conjugation," Chem Commun. 49: 8187-8189 (2013)], 문헌[Lyon, et al, "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)], 문헌[Dawson, et al "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779], 문헌[Dawson, et al "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J Am Chem Soc. 1997, 119, 4325-4329] 문헌[Hackeng, et al "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 10068-10073], 문헌[Wu, et al "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew Chem Int Ed 2006, 45, 4116-4125], 문헌[Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R Liss, Inc, 1988, pp 199-218], 문헌[Fields, G and Noble, R (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int J Peptide Protein Res 35:161-214] 등이나, 미국 특허 제6,884,869호, 미국 특허 제7,498,298호, 미국 특허 제8,288,352호, 미국 특허 제8,609,105호, 미국 특허 제8,697,688호, 미국 특허공개 제2014/0127239호, 미국 특허공개 제2013/028919호, 미국 특허공개 제2014/286970호, 미국 특허공개 제2013/0309256호, 미국 특허공개 제2015/037360호, 미국 특허공개 제2014/0294851호, 국제 특허공개 WO2015057699, 국제 특허공개 WO2014080251, 국제 특허공개 제WO2014197854, 국제 특허공개 WO2014145090, 국제 특허공개 WO2014177042 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 약물 운반체는 다른 양태에 있어서, 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드가, 생체 적합성 고분자를 매개로 또는 캐리어로 하여 결합될 수도 있다.
생체적합성 고분자는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지고 있는 고분자를 의미한다.
바람직하게는 본 발명에 적합한 생체적합성 고분자 케리어는 합성 중합체 또는 천연 중합체이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자로서의 합성 중합체는 폴리에스테르, 폴리하이드록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴산-co-말레산 또는 폴리아미노아민이다.
바람직하게, 상기 생체 적합성 중합체로서의 천연 중합체는 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐이다. 또 바람직하게, 본 발명에 적합한 생체적합성 고분자는 덴드리머 구조를 가지는 중합체이다. 예를 들어, 폴리아미노아민의 덴드리머가 본 발명에서 생체적합성 고분자로 이용될 수 있다.
생체 적합성 고분자를, 본 발명에서처럼 약물 등의 캐리어로 사용하는 것과 관련해서는 당업계에 상당한 문헌이 공지되어 있고 더 구체적인 것은 이들 문헌을 참조할 수 있다. 이들 문헌으로서는 문헌[Kiran Dhaliwal, "Biodegradable Polymers and their Role in Drug Delivery Systems" Biomedical Journal of Scientific & Technical Research, 2018, 11(1):8315-8320], 문헌[Avnesh Kumari, et al., "Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems" Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010, 75(1):1-18], 문헌[Kumaresh S Soppimath, et al., "Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices" Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2001, 70(1):1-20] 등이 예시될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 전술한 바의 약물 운반체와 약물이 결합된, 약물 운반체와 약물의 복합체에 관한 것이다. 본 발명의 약물 운반체와 약물의 복합체에서 약물은 약물 운반체의 세포 표적화 영역이나 pH 의존적 세포 투과성 펩타이드와 링커를 매개로 공유적으로 결합하거나 링커의 매개없이 매개없이 비공유적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 약물 운반체와 약물의 복합체는 구체적으로 도 1에 도시된 바와 같이 약물-세포 표적화 영역-pH 의존적 세포 투과성 펩타이드 순으로 연결되거나 또는 세포 표적화 영역-약물-pH 의존적 세포 투과성 펩타이드 순으로 연결되거나 또는 세포 표적화 영역-pH 의존적 세포 투과성 펩타이드-약물 순으로 연결된 형태일 수 있다. 또 도 1에 도시된 바와 같이, 생체 적합성 고분자를 매개로 약물, 세포 표적화 영역 그리고 pH 의존적 세포 투과성 펩타이드가 임의의 순으로 결합될 수도 있다.
본 발명의 약물 운반체와 약물의 복합체에서, 약물을 약물 운반체에 결합시키기 위한 링커는 상기 본 발명의 약물 운반체와 관련하여 예시한 바의 링커를, 약물에 따라 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 약물에, 알데하이드 반응기를 가지는 링커를 연결하고 약물 운반체의 항체(세포 표적화 영역)의 N 말단의 아미노기에 결합시킬 수 있다.
약물 운반체와 약물의 결합에 사용되는 링커는 표적세포 밖에서 안정적이어서 절단되지 않고, 표적세포 내 산성 조건인 엔도좀이나 리조솜에서도 절단되지 않는 링커인 것이 바람직할 것이다. 이러한 링커는 표적세포 밖에서 안정적이어서 절단되지 않음으로서 약물이 세포 내로 이동되도록 하고, 산성 조건인 엔도좀이나 리조좀에서 절단되지 않으로써 엔도좀이나 리조솜에서 세포질로 이동될 수 있도록 한다.
본 발명의 약물 운반체와 약물의 복합체에서, 약물은 약물 운반체에 비공유적으로 결합할 수도 있다. 예컨대 핵산에 인터컬레이션(intercalation)되어 효과를 발휘하는, 항암제 일종인 독소루비신과 같은 인터컬레이터제(intercalator agents)는 약물 운반체의 세포 표적화 영역으로서 압타머를 사용할 경우에 압타머에 비공유적으로 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 결합될 수 있다. 압타머는 올리고뉴클레오타이드 분자이기 때문에, 뉴클레오타이드 염기들의 염기 스태킹(base stacking)이 있으며, 이 염기 스태킹 사이에 약물이 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 결합할 수 있게 된다.
본 발명의 약물 운반체와 약물의 복합체에서, 약물은 그것이 세포 내로 이동하여 효과를 발휘할 수 있는 약물이면 특별한 제한이 없다. 그러한 약물은 세포독성 항암제 등의 임의의 저분자 화합물로 된 약물, 재조합 단백질, siRNA 등의 임의의 바이오의약품일 수 있다. 또한 약물은 효능 면에서 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스 질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 혈관신생억제제, 면역억제제, 면역촉진제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환치료제, 조영제 등의 진단제 등일 수 있다.
본 발명에서 약물은 바람직하게는 세포독성 항암제이이다. 세포독성 항암제는 대사길항제(Antimetabolites), 미세관(microtubulin) 표적화제(Tubulin polymerase inhibitor 및 Tubulin depolymerisation), 알킬화제(Alkylating agents), 유사분열 억제제(Antimitotic Agents), DNA 절단제(DNA cleavage agent), DNA 가교제(DNA cross-linker agent), DNA 인터컬레이터제(DNA intercalator agents), DNA 토포아이소머라아제 억제제(DNA topoisomerase inhibitor) 등으로 대별될 수 있는데, 대사길항제로서는 메토트렉세이트(Methotrexate) 등의 폴산(Folic acid) 유도체, 클라드리빈(Cladribine) 등의 퓨린(Purine) 유도체, 아자시티딘(Azacitidine) 등의 피리미딘(pyrimidine) 유도체, 독시플루리딘(Doxifluridine), 플루오로우라실(Fluorouracil) 등이 당업계에 공지되어 있고, 미세관 표적화제로서는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 돌라스타틴 등의 아우리스타틴 계열의 약물, 메이탄신(Maytansines) 등이 당업계에 공지되어 있으며, 알킬화제로서는 부설판(Busulfan), 트레오설판(Treosulfan) 등의 알킬 설포네이트(Alkyl Sulfonate) 제제, 벤다머스틴(Bendamustine) 등의 니트로젠 머스타드(Nitrogen Mustard) 유도체, 시스플라틴(Cisplatin), 헵타플라틴(Heptaplatin) 등의 플라티늄(Platinum) 제제 등이 당업계에 공지되어 있다. 또 유사분열 억제제(Antimitotic Agents)로서는 도세탁셀(Docetaxel), 파크리탁셀(Paclitaxel) 등의 탁산(Taxane) 제제, 빈플루닌(Vinflunine) 등의 빈카 알칼리드(Vinca alkalids), 에토포시드(Etoposide) 등의 포도필로톡신(Podophyllotoxin) 유도체 등이 당업계에 공지되어 있고, DNA 절단제(DNA cleavage agent)로서는 칼리채미신(Calicheamicins) 등이 공지되어 있으며, DNA 가교제(DNA cross-linker agent)로서는 PBD 이중체 등이 공지되어 있다. 또 DNA 인터컬레이터제로서는 독소루비신 등이 당업계에 공지되어 있으며 DNA 토포아이소머라아제 억제제로서는 SN-28 등이 당업계에 공지되어 있다.
또한 약물은 유전자, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 펩티드, 리보자임, 바이러스 입자, 면역조절제, 단백질, 조영제 등일 수도 있다. 보다 구체적으로 약물은 망막모세포종 종양 서프레서 유전자의 변이체인 Rb94를 코딩하는 유전자, 종양 세포에서만 세포자멸을 유도하는 아폽틴을 코딩하는 유전자일 수 있고, 치료 표적이 되는 HER-2 등에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열: 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3')수 있으며, MRI 조영제인 Gd-DTPA 물질 등의 진단 조영제일 수도 있다.
본 발명의 약물 운반체와 약물의 복합체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형의 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 펩타이드 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산 (ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이팅 물질 (chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 특정 표적세포에만 선택적으로(또는 특이적으로) 작용함으로써 약물 부작용은 경감되고 약물의 약효는 증대시킬 수 있는 약물 운반체와 그것과 약물의 복합체를 제공할 수 있다. 본 발명의 약물 운반체는 항암제, 면역 억제제, 조영제 등의 약물 운반체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 의해 제조되는 약물운반체와 약물의 복합체의 구성을 도식화하여 나타낸 것이다. CTD는 세포 표적화 도메인, DRD는 막 투과성 펩타이드로서 약물 방출 도메인이고 Drug은 약물을 의미한다.
도 2는 LPE3-1 펩타이드를 사용하였을 때의 HPLC 분석 결과와 폴리아크릴아미드겔(PAGE) 전기영동 이미지이다.
도 3은 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체, 그리고 그 결합체의 폴리아크릴아미드겔(PAGE) 전기영동 이미지이다.
도 4는 HER2가 과발현하는 BT-474와 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에, 약물운반체와 약물의 복합체로서 HER2 Ap, PLK1 siRNA 및 LPE3-1로 이루어진 복합체를 처리한 결과 이미지이다.
도 5는 HER2가 과발현하는 BT-474와 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에, 5가지 약물운반체와 약물의 복합체 처리에 따른 세포사멸을 조사한 결과이다.
도 6 및 도 7은 각각 HER2가 과발현하는 BT-474와 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에, HER2 Ap, PLK1 siRNA 및 LPE3-1로 이루어진 약물운반체와 약물의 복합체의 처리 시간(도 6) 및 처리 농도(도 7)에 따른 세포사멸 유도 효과를 나타낸 결과이다.
도 8 및 도 9는 각각 pH 7.0(도 8) 및 pH 5.5(도 9) 조건에서, HER2가 과발현하는 BT-474와 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에, 5가지 약물운반체와 약물의 복합체 처리에 따른 세포사멸 정도를 미토콘드리아 막 전위 변화 측정에 의해 얻은 결과이다.
도 10은 HER2가 과발현하는 BT-474와 HER2가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주에, 다양한 대조군 약물 운반체를 처리하였을 때 세포사멸 정도를 보여주는 결과이다.
도 11 및 도 12는 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에 시험군 약물 운반체를 처리하였을 때 처리 시간별 세포사멸 정도를 보여주는 결과이다.
도 13 및 도 14는 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에 시험군 약물 운반체를 처리하였을 때 처리 농도별 세포사멸 정도를 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 약물 방출성이 우수한 펩타이드 선정을 위한 약물 운반체 제조
<실시예 1-1> 약물 운반체 제조를 위한 재료의 준비
본 실시예에서 제조되는 약물 운반체는 세포 표적화 도메인(cell targeting domain, CTD)과 약물(drug)과 약물 방출 유도성을 갖는 펩타이드(drug release domain, DRD)가 결합된 구조(CTD/약물/DRD)를 가진다.
CTD는 HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 특이적 압타머(HER2_Ap)를 사용하였고, 약물은 PLK1(Polo-like kinase 1)에 특이적인 siRNA를 사용하였으며, 약물 방출 유도성을 갖는 펩타이드는 아래 표 1의 5가지의 펩타이드를 사용하였다.
펩타이드의 종류 및 아미노산 서열
종류 아미노산서열 서열번호 비고
Melittin GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 7 넓은 pH 범위에서 막 활성화
LP GWWLALALALALALALASWIKRKRQQ 8
Hylin a1 IFGAILPLALGALKNLIK 9
LPE3-1 GWWLALAEAEAEALALASWIKRKRQQ 1 산성 pH에서
막 활성
pHD24 GIGAVLKVLATGLPALISWIKAAQQL 4
상기 HER2는 인간 상피세포 성장인자 수용체(HER/EGFR/ErbB) 계열의 구성원으로 유방암 환자에서 중요한 바이오마커이면서 또한 치료 표적으로 알려져 있다(Nature Clinical Practice Oncology, 2006, 3:269-280; World J Clin Oncol. 2017, 8(2):120-134). 본 실시예에서는 HER2를 표적분자로 하여 제작된 HER2에 특이적인 압타머(Varmira K. et al., Nucl Med Biol. 2013, 40(8):980-6)를 CTD로 사용하였다.
또 상기 PLK1은 세포분열에서 중심적 역할을 하는 조절자로서(Cell Rep. 2013, 3(6):2021-32), 다양한 인간 종양세포에서 과발현되기 때문에 항암 치료의 중요한 표적이 되고 있는 인자이다(Transl Oncol. 2017, 10(1):22-32) 본 실시예에서는 PLK1을 치료의 표적으로 하는 PLK1 siRNA(Song WJ. et al.,Small, 2010, 6(2):239-246)를 약물로 사용하였다.
본 실시예의 약물 운반체를 제조하기 위해, 먼저 HER2 특이적 압타머(HER2-specific aptamer, HER2 Ap) 서열과 스페이서(spacer) 서열(아래의 서열번호 10에서 밑줄이 있는 염기서열) 그리고 PLK1 siRNA의 센스 가닥(PLK1 siRNA SS)을 지시하는 서열을 가진, 아래 서열번호 10의 단일가닥핵산 DNA(HER2 Ap/PLK1 siRNA SS; 한국, 바이오니아사), 또 PLK1 siRNA의 센스 가닥(PLK1 siRNA SS)을 지시하는 아래 서열번호 11의 단일가닥핵산 DNA(한국, 바이오니아사)를 각각 주문 제작하는 한편, 또 PLK1 siRNA의 안티센스 가닥(PLK1 siRNA AS)을 지시하는 아래 서열번호 12의 단일가닥핵산 DNA(미국, BioSynhesis사)와 상기 표 1의 펩타이드(미국, Biocompare사)을 각각 주문 제작하였다.
HER2 Ap-스페이서-PLK1 siRNA SS: AGC CGC GAG GGG AGG GAA GGG TAG GGC GCG GCT-TTTT-TGA AGA AGA TCA CCC TCC TTA TT (서열번호 10)
PLK1_siRNA_SS: TGA AGA AGA TCA CCC TCC TTA TT (서열번호 11)
PLK1_siRNA_AS: TAA GGA GGG TGA TCT TTC TTC A (서열번호 12)
<실시예 1-2> HER2 특이적 압타머와 PLK1 siRNA 센스 가닥의 접합체의 제조
HER2 특이적 압타머와 PLK1 siRNA 센스 가닥의 접합체인 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS의 제조를 위해서, 먼저 상기 주문 제작한 서열번호 10의 DNA 단일가닥핵산을 주형으로 하여, T7 프로모터 서열(아래 서열번호 13에서 밑줄이 있는 염기서열)이 있는 아래 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 사용하여 PCR를 수행하여 PCR 산물을 얻고, 다음 이를 주형으로 사용하고 2'-F-치환 피리미딘을 사용하여 DuraScribe®T7 Transcription Kit(미국, Lucigen사)로 체외 전사를 수행하여, HER2 Ap-스페이서-PLK1 siRNA SS 접합체를 제조하였다. 상기 접합체는 2'-F-치환 피리미딘을 포함하고 있는 RNA 전사체로 자연상태의 RNA보다 생체내 안정성이 높다.
T7 프로모터가 있는 정방향 프라이머: TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA AGC CGC GAG GGG AGG GAA(서열번호 13)
역방향 프라이머: AAT AAG GAG GGT GAT CTT(서열번호 14)
상기에서 PCR은 1,000 pmoles 단일가닥핵산 DNA(서열번호 10), 2,500 pmoles PCR의 프라이머 쌍, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl(pH 8.3), 3 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP), 0.1 U Taq DNA Polymerase(미국, Perkin-Elmer)를 사용하여 수행하였으며, PCR 증폭물을 QIAquick-spin PCR 정제 칼럼(미국, QIAGEN Inc.)으로 정제하였다.
또 상기에서 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 제조는, DuraScribe®T7 Transcription Kit(미국, Lucigen사)를 이용하여 체외 전사로 합성하고 정제하여 준비하였다. 구체적으로 200 pmoles 이중가닥 DNA PCR 증폭물, 40 mM Tris-Cl (pH 8.0), 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM spermidine, 0.002% Triton X-100, 4% PEG 8000, 5 U T7 RNA Polymerase 그리고 뉴클레오타이드인 1 mM ATP, 1 mM GTP, 3 mM 2'F-CTP, 3 mM 2'F-UTP를 37℃ 에서 6 ~ 12시간 반응시켜 수행하였으며, 결과물을 Bio-Spin 6 크로마토그래피 칼럼(미국, Bio-Rad Laboratories)으로 정제하였다.
<실시예 1-3> PLK1 siRNA의 안티센스 가닥과 펩타이드 접합체(PLK1 siRNA AS/펩타이드)의 제조
본 실시예에서 올리고뉴클레오타이드인 PLK1 siRNA의 안티센스 가닥과 표 1의 5 가지 각 펩타이드를 접합시켜 PLK1 siRNA의 안티센스 가닥과 펩타이드 접합체인 PLK1 siRNA AS/펩타이드를 제조하였으며, 이를 위하여 아미노 작용기를 반응성이 높은 알데히드 작용기로 전환시키는 시약인, 화학식 1의 S-4FB 링커 또는 화학식 2의 S-SS-4FB 링커를 포함하는 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit; 미국, Solulink 사)를 사용하였다.
[화학식1]
Figure pat00001
[화학식2]
Figure pat00002
먼저 PLK1 siRNA의 안티센스 가닥(PLK1 siRNA AS)을 지시하는 상기 서열번호 12의 단일가닥핵산 DNA를 주형으로 이용하여, 5' 말단에 아미노기가 부착되고 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 PLK1 siRNA의 안티센스 가닥(PLK1 siRNA AS)을 주문 제작하였다(한국, 바이오니아사).
다음 상기 PLK1 siRNA AS의 동결 건조물에 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(미국, Solulink 사)의 100㎕ OligoResuspension Solution을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ PLK1 siRNA AS 용액을 준비하였다. 이 PLK1 siRNA AS 용액에 대해서, 올리고 탈염용 스핀 컬럼으로 탈염공정을 수행하였다. 이 탈염된 PLK1_siRNA_AS 용액에 DMF에 용해된 S-4FB 용액을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ PLK1 siRNA AS 용액이 되도록 하여 실온에서 2시간 동안 반응시켜 PLK1 siRNA AS의 아미노 작용기에, 알데히드 작용기를 가진 S-4FB 링커가 연결되도록 유도하였다. 이 반응이 종결되면 상기와 같이 탈염공정을 수행하고 결과물을 수집하였다.
그 다음 상기 표 1의 펩타이드(미국, Biocompare 사)를, 100mM 인산칼륨(pH 5.49) 완충 용액을 이용하여 7.1mg/ml로 농축하였다. 또 상기 S-4FB 링커로 변형된 PLK1 siRNA AS를 50% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용매에 녹여 2.5mg/ml이 되도록 하였다. 그리고 나서, 상기 두 용액을, 펩타이드와 S-4FB 링커로 변형된 PLK1_ siRNA AS의 몰비가 1:9 되도록 혼합하였다.
상기 혼합 반응 용액에 NaCNBH3(Sigma사, 미국)를 최종 20mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 반응하지 않은 펩타이드, S-4FB 링커와 변형된 PLK1 siRNA AS를 분리하기 위하여 세파덱스 G-25 컬럼(미국, GE Healthcare사) 또는 리소스페닐 컬럼(미국, GE헬스케어 사)을 사용하였다. 이러한 과정으로 PLK1 siRNA AS가 LPE3-1 등의 펩타이드의 아미노 말단에 선택적으로 결합된 형태를 제조하였다. 이렇게 제조된 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체를, HPLC 분석하고, 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드겔(PAGE) 전기영동법과 SYBR Gold 염색에 의하여 확인하였다(도 2). 참고로 도 2는 펩타이드로 LPE3-1 펩타이드를 사용하였을 때의 결과로 도 2의 A는 PLK1 siRNA AS와 LPE3-1 펩타이드의 반응 혼합물의 HPLC 분석 결과이고 도 2의 B는 정제된 접합체의 HPLC의 분석 결과이며, 도 2의 C는 PLK1 siRNA의 AS(1), PLK1 siRNA의 AS와 LPE3-1 펩타이드의 반응 혼합물(2) 그리고 정제된 접합체(3)의 폴리아크릴아미드겔(PAGE) 전기영동 이미지이다.
<실시예 1-4> 약물 운반체의 제조
HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체 사이에 이중가닥을 형성시켜 본 발명의 약물 운반체를 제조하였다.
HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체 사이에 이중가닥 결합체를 형성하기 위해, 어닐링 완충액(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산)으로 상기 제조한 50 μM HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 50 μM PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체를 95℃에서 3분 동안 열 변성시키고 20℃로 서서히 냉각시켜 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체의 결합체 형성을 유도하였다.
이렇게 형성된 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체의 결합체를, 상기와 같이 올리고 탈염용 스핀 컬럼로 탈염시키고 0.22 μm 멸균 여과막으로 Millipore 원심 분리를 수행하여 정제한 다음, 상기 결합체의 형성을, 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다(도 3).
도 3에서 첫 번째 칼럼은 분자량 마커이고, 두 번째 컬럼은 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체 시료, 세 번째 컬럼은 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체의 미정제 반응 혼합물로 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체를 포함하는 시료, 그리고 네 번째 컬럼은 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체의 반응 혼합물을 정제하여 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체가 제거된 시료를 분석한 결과이다.
<실시예 2> 약물 방출성이 우수한 펩타이드 선정
<실시예 2-1> 세포사멸의 측정
상기 실시예 1에서 상기 표 1의 5 종류의 펩타이드를 사용하여 제조된 약물 운반체들의 세포사멸 효능은, PI(Propidium Iodide) 염색법, phospho-H2AX 분석법 및 Annexin V FITC Apoptosis detection kit(미국, BD 사)를 사용하여 조사하였다.
HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포와 발현하지 않는 MDA-MB-231세포를, 12-웰 플레이트에 웰당 105 개로 접종하고 배양하여 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후 세포 사멸을 유도하기 위하여 실시예 1에서 제조한 5종류의 약물 운반체들을 첨가하여 배양하였다. 72 시간 배양이 끝나기 40분 전, PI와 Hoechst를 각각 1 ㎍/mL의 최종 농도로 세포에 처리하였다. 샘플 플레이트는 HCS(High-Content Screening) 시스템(미국, ThermoFisher Scientific 사)으로 실시간으로 분석하였다. 세포 사멸의 초기 지표인 phospho-H2AX에 대해, 처리된 세포를 2% paraformaldehyde와 Hoechst 염료로 30 분간 고정시킨 후 Triton X-100으로 투과성으로 만들고 소 혈청 알부민(미국, Sigma-Aldrich)과 마우스 항-인간 phospho-H2AX (미국, Abcom; 1 : 100 희석)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 토끼 항 마우스 Alexa Fluor 488 항체 (미국, Invitrogen; 1 : 100 희석)를 첨가하였다. 각 과정 후에 세포를 PBS로 부드럽게 씻어 주었다. 마지막으로 샘플 플레이트를 분석하고 이미지를 HCS 시스템으로 분석하였다.
정상적으로 살아있는 세포는 phospho-H2AX와 PI에 음성이지만, 초기 사멸 과정의 세포는 phospho-H2AX에는 양성이고 PI에는 음성이다. 후기 사멸 과정의 세포는 PI에 양성 반응을 보인다(도 4 참조).
도 4는 HER2가 과발현하는 세포 BT-474와 발현하지 않은 MDA-MB-231 세포 배양용액에 상기 제조한 HER2 표적화 약물운반체를 처리하여 확인한 결과로, HER2 표적화 약물 운반체를 처리한 경우 HER2가 과발현되는 세포주인 BT-474는 PI에 양성 반응으로 후기 사멸과정이며, HER2가 발현하지 않은 세포주인 MDA-MB-231은 phospho-H2AX에는 양성으로 사멸 초기 단계임을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 HER2 표적화 약물운반체가 HER2 음성세포주인 MDA-MB-231 세포보다는 HER2 양성 세포주 BT-474에 더 많이 유입되어 세포사멸을 유도할 것임을 보여준다.
한편 Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit를 이용한 분석을 위해, HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포와 발현하지 않는 MDA-MB-231세포를 96 well 배양용기에 준비한 후 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후에 72시간 동안 실시예 1에서 제조한 5종류의 약물 운반체를 50nM를 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 상기 처리한 세포를 차가운 PBS로 2회 세척 한 후, 1 ×106 세포/ml의 농도로 1X 결합 완충액에 현탁한 후, 100㎕의 용액(1 ×105 세포/ml)을 5 ml 배양 튜브에 옮기고, 5㎕의 FITC Annexin V와 5μl의 PI(Propidium Iodide)를 첨가하였다. 용액을 부드럽게 볼텍싱(vortexing)하고 실온(25 ℃)의 어두운 곳에서 15분 동안 배양하였다. 그런 다음 400㎕의 1X Binding Buffer를 각 튜브에 첨가하고 1시간 이내에 유세포 분석으로 분석하였다. 세포의 이중 형광 신호는 마이크로 모세관 유세포 계측기(미국, BD 사)를 사용하여 분석하였다.
이렇게 50nM 처리 농도와 pH 7.0에서 5종류의 약물 운반체들의 항종양 능력(세포사멸 효과)을 조사하여 도 5에 나타내었다. 도 5를 참조하여 보면, 5종류의 약물 운반체들 중 pH 비의존적 막 투과성 펩타이드인 멜리틴, LP 또는 Hylin a1로 구성된 약물 운반체들은 HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231세포와 과발현하는 BT-474 세포 모두에서 높은 세포사멸 효과를 유도하였고, pH 의존적 막 투과성 펩타이드인 LPE3-1과 pHD24로 구성된 약물 운반체들은 모두, HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231세포에 대해서는 거의 세포사멸 효과를 유도하지 못하는 반면 과발현하는 BT-474 세포에서는 높은 세포사멸 효과를 유도하였다.
pH 7.0에서 HER2 Ap, PLK1 siRNA 및 LPE3-1로 이루어진 약물 운반체의 처리 시간 및 처리 농도에 따른 세포사멸 유도 효과를 도 6 및 도 7에 나타내었는데, HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포의 세포사멸에는 거의 영향이 없으나 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에는 처리 시간 및 처리 농도에 따라 증가함을 관찰할 수 있었다.
상기 결과들은 특정 세포의 표적에 특이적인 압타머 등의 도메인을, pH 의존적 막 투과 활성을 갖는 pHD24, LPE3-1 등의 펩타이드와 함께 약물 운반체로 사용할 경우, 생체 환경인 약 pH 7에서 표적분자를 발현하는 세포에 대해서만 약물이 특이적으로 효과를 나타냄으로써, 약물 부작용을 경감시키는 효과를 낼 수 있음을 보여준다고 할 수 있다.
<실시예 2-2> 미토콘드리아 막 전위 변화 측정
Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit(미국, BD 사)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위 변화를 감지하는 데 사용하였다. 세포 샘플의 준비는 상기 세포사멸 분석에서와 동일하다. 1 ml 세포 용액 (1 x 106 cells/ml)을 15 ml의 배양 튜브에 옮기고, 800 rpm에서 5 분간 원심 분리하고, 상층액을 제거한 후, 0.5 ml의 JC-1 용액을 첨가 하고 실온(25℃)의 어두운 곳에서 15분 동안 배양하였다. 침전물을 1ml의 1x Assay Buffer로 800 rpm에서 5분 동안 세척한 다음 재원심 분리했다. 이 과정을 두 번 반복한 다음, 0.5 ml의 1x Assay Buffer를 가하여 침전물을 재현탁했다. 마지막으로, 0.5 mL용액의 이중 형광 신호는 마이크로 모세관 유동 세포 계측기(micro capillary flow cytometer)(미국, BD사)를 사용하여 분석하였다. 또한, 세포 배양 배지의 pH는 필요할 경우 산이나 알칼리 용액으로 조정하였다.
Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit는 세포의 미토콘드리아 막 전위 변화를 측정하여 그 결과를 세포사멸로 표시하며, 세포사멸은 종종 Δψ의 탈분극과 관련되어 FL-2 채널에서 JC-1 형광이 감소된 세포 수가 증가한다. 즉, 아폽토시스 집단은 종종 음성 대조군보다 낮은 적색 형광 신호 강도 (FL-2 축)를 나타낸다. 일부 apoptotic 시스템에서, FL-1에서 측정된 녹색 형광의 수준의 변화가 또한 관찰되었다.
pH 의존적 방출을 확인하기 위해 5종류의 약물 운반체들을 처리 후, HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포와 세포발현하지 않는 MDA-MB-231 세포의 미토콘드리아 막 전위 변화 측정에 의해 얻어진 세포사멸 정도를 조사한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
50nM 처리 농도와 pH 7.0에서 24 시간 동안, 멜리틴, LP, Hylin a1, LPE3-1 및 pHD24를 이용한 약물 운반체의 처리로, HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포에서 미토콘드리아 막 전위 변화를 통해 살펴본 세포사멸 효과는 멜리틴, Hylin a1와 LP 운반체는 평균 22.0%이고, LPE3-1와 pHD24 운반체는 평균 6.0%로 나타났다(도 8 참조). HER2 유전자를 과발현하는 BT-474 세포에서 멜리틴, Hylin a1와 LP운반체는 평균 23.0%이고 LPE3-1와 pHD24 운반체는 평균 28.0%로 나타났다(도 8 참조).
50nM 처리 농도와 pH 5.5에서 HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포의 미토콘드리아 막 전위 변화를 통해 살펴본 세포사멸 효과는 멜리틴, Hylin a1와 LP 운반체는 평균 25.0%이고 LPE3-1 와 pHD24 운반체는 평균 27.0%이고, HER2 유전자를 과발현하는 BT-474 세포에서는 멜리틴, Hylin a1와 LP 운반체는 평균 25.0%이고 LPE3-1 와 pHD24 운반체는 평균 28.0%로 나타났다(도 9 참조).
이러한 Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit에 의한 세포사멸 분석 결과는 상기 상기 실시예 2-1의 Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit로 분석한 결과와 유사한 양상임을 알 수 있었다.
상기 실시예들의 결과은, pH 의존적 막 투과 활성을 가지는 펩타이드를, 특정 세포의 표적을 인식하는 도메인과 함께 사용할 경우 표적을 발현하는 세포에만 작용함으로써 표적을 발현하지 않는 세포에 작용함에 따른 부작용 경감 등의 효과를 낼 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.
<실시예 3> 파크리탁셀 등을 포함하는 약물 운반체의 제조
<실시예 3-1> 시험군 약물 운반체 제조
본 실시예에서 제조된 약물 운반체는 (1) HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1, (2) HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1, (3) HER2 Ap/PAX/LPE3-1 및 (4) HER2 Ab/PAX/LPE3-1이다.
여기서 HER2 Ab는 HER2에 특이적인 항체를 의미하며, PAX는 파클리탁셀(Paclitaxel)을 의미한다. 파클리탁셀은 유방암, 자궁암 등의 항암 치료제로 널리 사용되고 있는 디텔페노이드(Diterpenoid)계 항암제이다.
3.1.1 HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1의 제조
HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1 약물 운반체는 CTD인, HER2에 대한 특이적 결합력을 가지고 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 압타머, 약물인 PLK1 siRNA 그리고 DRD인 LPE3-1 펩타이드로 구성된 약물 운반체이며, 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조하였다.
3.1.2 HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1의 제조
HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1는 CTD인, HER2에 대한 특이적 항체(미국, ABCAM 사), 약물인 PLK1 siRNA 그리고 DRD인 LPE3-1 펩타이드로 구성된 약물 운반체이다.
먼저 HER2 Ab와 PLK1 siRNA SS 접합체를 제작하기 위하여, 2'-F-치환 피리미딘을 포함하고 5' 말단에 아미노기를 도입된, 아래 서열번호 15의 서열을 갖는 PLK1 siRNA SS을 주문 제작하였다(미국, BioSynhesis사).
UGA AGA AGA UCA CCC UCC UUA UU (서열번호 15)
다음 동결건조시킨 상기 PLK1 siRNA SS에, 항체 올리고뉴클레오타이드 올인원 접합 키트(Antibody-Oligonucleotide All-in-One Conjugation Kit; 미국, Solulink 사)의 Oligo Resuspension Solution을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ 용액을 준비하였다. 상기 제조한 PLK1 siRNA SS 용액을, 올리고 탈염용 스핀 컬럼(적색 캡)으로 탈염 공정을 수행하였다. 상기 탈염된 PLK1 siRNA SS 용액에 DMF에 용해된 S-SS-4FB 용액을 첨가하여 0.5 OD260/㎕ 올리고 용액이 되도록 하여 실온에서 2시간 동안 반응시켜 PLK1 siRNA SS의 아미노 작용기에 S-SS-4FB 링커가 연결되도록 유도하였다. 이 변형 반응이 종결되면 탈염 공정을 수행하고 수집하였다.
그 다음 HER2 Ab를 100mM 인산칼륨 완충 용액(pH 5.49)으로 약 7.1mg/ml로 농축하였다. 상기 S-SS-4FB 링커로 변형된 PLK1_siRNA_SS를 50% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용매에 녹여 2.5mg/ml이 되도록 하였다.
그리고 나서 상기 두 용액을, HER2 Ab와 S-SS-4FB 링커로 변형된 PLK1 siRNA SS의 몰비가 1:9가 되도록 혼합하였다.
상기 반응 용액에 NaCNBH3(Sigma사, 미국)를 최종 20mM이 되도록 첨가한 후, 4℃에서 12시간 동안 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 반응하지 않은 HER2_Ab, S-SS-4FB 링커와 변형된 PLK1 siRNA SS을 분리하기 위하여 세파덱스 G-25 컬럼(미국, GE Healthcare사) 또는 리소스페닐 컬럼(미국, GE Healthcare사)을 사용하였다. 이러한 과정으로 PLK1 siRNA SS이 HER2 Ab의 아미노 말단에 선택적으로 결합된 형태를 제조하였다.
PLK1 siRNA AS/LPE3-1의 접합체는 상기 실시예 1에 기재된 방법으로 제조하였다.
HER2 Ab/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/LPE3-1의 접합체를 결합시켜 이중가닥 결합체를 생성하기 위하여 어닐링 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산)으로 상기 제조한 50 μM HER2 Ab/PLK1 siRNA SS 접합체와 50 μM PLK1 siRNA AS/LPE3-1의 접합체를 95℃에서 3분 동안 열 변성시키고 20℃로 서서히 냉각시켜 HER2 Ab/PLK1 siRNA_SS 접합체와 PLK1 siRNA AS/LPE3-1의 접합체의 결합체를 형성을 유도하였다.
이렇게 얻어진 이중가닥 결합체를 탈염시키고, 0.22 μm 멸균 여과막으로 Millipore 원심 분리를수행하여 정제한 다음, 상기 결합체의 형성을, 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인하였다(결과 도면 미제시). 이중가닥 결합체의 양은 λ=260 ㎚에서 계산된 몰 흡수 계수를 근거로 분광광도계로 측정하였고, RPHPLC에 의한 HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1 구조인 약물 운반체의 순도 분석을 수행하였다.
3.1.3 HER2 Ap/PAX/LPE3-1의 제조
HER2 Ap/PAX/LPE3-1 약물 운반체는, CTD인, HER2에 대한 특이적 결합력을 가지고 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 RNA 압타머(HER2 Ap), 파크리탁셀(PAX)(Sigma-Aldrich Inc., USA St Louis) 그리고 DRD인 LPE3-1 펩타이드로 구성된 약물 운반체이다.
본 실시예에서는 먼저 HER2 Ap와 LPE3-1 펩타이드를 접합시키고 여기에 PAX를 결합시켜 제조하였다.
① HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드 접합체의 제조
먼저 HER2 Ap는 스페이서(밑줄이 있는 염기서열)와 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 서열번호 16의 RNA로서 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.
AGC CGC GAG GGG AGG GAA GGG UAG GGC GCG GCU-UUUU (염기서열 16)
다음 HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드 접합체는 실시예 1의 PLK1 siRNA AS/LPE3-1 펩타이드의 접합체의 제조방법과 같은 제조방법으로 제조하되, PLK1 siRNA AS 대신에 HER2 Ap를 사용하여 제조하였다.
다음 아래 PAX에 도입되는 말레이미드(Maleimide)와 반응성을 가진 티올(thiol) 작용기를 HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드 접합체에 도입하기 위하여 먼저 2mg SPDP(미국, Pierce Biotechnology사)을 320μL DMSO에 녹여 20mM SPDP 시약 용액을 준비하였다. 1.0mL PBS-EDTA 에 용해 된 2-5mg의 Ap-P에 25μL의 20mM SPDP 용액을 첨가하여 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. 탈염 칼럼을 PBS-EDTA로 평형화하고, 완충액을 교환하여 반응 부산물 및 과량의 비반응 SPDP시약을 제거하였다.
23mg DTT를 PBS-EDTA에 용해시켜 150mM DTT 용액을 만들었다. SPDP로 개질된 단백질 1 mL 당 0.5 mL DTT 용액을 첨가하여(최종 농도 50 mM DTT) 30분 동안 반응시켰다. 탈염 컬럼을 PBS-EDTA로 평형화하고 DTT를 제거하기 위해 단백질을 탈염하였다.
② 말레이미드(Maleimide)가 도입된 PAX의 합성
HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드 접합체와 PAX의 접합(conjugation)을 위해, 링커(4-Maleimidobutyric acid)를 사용하여 티올(Thiol) 작용기와 반응성이 있는(reactive) 말레이미드 작용기를 PAX에 도입하였다.
PAX 1g (1.17mmol, 1eq), 4-Maleimidobutyric acid 210 mg (1.17mmol, 1eq), 디메칠아미노피리딘(DMAP) 140mg(2.34mmol, 2eq), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 480mg(1.17mmol, 1eq)을 100ml 둥근 플라스크(Round flask)에 담고, 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride) 50ml를 넣은 후, 상온에서 교반하여 반응시켰다.
반응의 진행은 TLC(Thin Layer Chromatography)법을 이용하여 관찰하고 반응이 끝나면, 증류수(DW) 50ml를 넣어 흔들어 섞었다(Work up). (Rf Value = 0.43, Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1)
유기용매 층을 모아 마그네슘 설파이드(Magnesium sulfide)로 수분을 제거한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 이용하여 분리하였다. Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 물질을 농축하여 말레이미드가 도입된 PAX의 화합물 620mg을 얻었다.
③ 말레이미드가 도입된 PAX과 티올(Thiol) 작용기가 도입된 HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드 접합체의 결합체 제조
상기 합성한 말레이미드가 도입된 PAX 100mg(98mol, 1eq)과 상기 합성한 티올(Thiol) 작용기가 도입된 HER2 Ap/LPE3-1 펩타이드 접합체 100mg(48mol, 2eq)을 각각 1ml DMSO에 녹인 후, 두 용액을 혼합하였다. 여기에 DIPEA(Diisopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에서 5분간 반응시켰다. 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다. Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다.
3.1.4 HER2 Ab/PAX/LPE3-1의 제조
HER2 Ab/PAX/LPE3-1 약물 운반체는, CTD인, HER2에 특이적인 항체(HER2 Ab), 약물인 파크리탁셀(PAX) 그리고 DRD인 LPE3-1 펩타이드로 구성된 약물 운반체이다.
본 실시예에서도 먼저 HER2 Ab와 LPE3-1 펩타이드를 접합시키고 여기에 PAX를 결합시켜 제조하였다.
HER2 Ab와 LPE3-1 펩타이드를 접합시키기 위하여, 10mg/ml의 HER2 Ab와 10mg/ml LPE3-1 펩타이드를 0.1M MES(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충액(pH 5)에 각각 녹였다. 또 EDAC(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 10mg/ml로 증류수에 녹였다. 상기 LPE3-1 펩타이드 용액과 상기 HER2 Ab 용액을 혼합하고 여기에 상기 EDAC 용액을 첨가하였다. 다음 실내 온도에서 2-3 시간 동안 반응시켜 HER2 Ab와 LPE3-1 펩타이드 접합을 유도하였다. 탈염(즉 Cellu Sep 투석을 사용) 및 적절한 완충액의 교환 (일반적으로 PBS # UP30715)을 하여 저장하였다.
HER2 Ab/LPE3-1 접합체의 티올(thiol) 작용기화는 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 SPDP 시약 등을 사용하여 수행하였다.
다음 상기 상기 실시예 3.1.3에서 제조한 말레이미드(Maleimide)가 도입된 PAX와 상기 티올 작용기가 도입된 HER2 Ab/LPE3-1 접합체를 상기 실시예 3.1.3에서와 같이 반응시켜 최종적으로 HER2_Ab/PAX/LPE3-1 약물 운반체를 제조하였다.
<실시예 3-2> 대조군 약물 운반체의 제조
본 실시예에서 제조된 약물 운반체는 상기 실시예 3-1에서 제조된 시험군 약물 운반체의 대조군 약물 운반체로 제조된 것이며, 구체적으로 (1) HER2 Ap/LPE3-1, (2) HER2 Ab/LPE3-1, (3) HER2 Ap/PLK1 siRNA, (4) HER2 Ap/PAX, (5) HER2 Ab/PLK1_siRNA, (6) HER2 Ab/PAX, (7) LPE3-1/PLK1 siRNA, 및 (8) LPE3-1/PAX를 제조하였다.
(1) HER2 Ap/LPE3-1의 제조
상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 제조하였다.
(2) HER2 Ab/LPE3-1의 제조
상기 실시예 3.1.4에서와 같은 방법으로 제조하였다.
(3) HER2 Ap/PLK1 siRNA의 제조
HER2 Ap/PLK1 siRNA는 HER2 Ap/PLK1 siRNA SS와 PLK1 siRNA AS의 이중가닥 결합체로 상기 실시예 1에서 같은 방법으로 제조하되, 다만 이중가닥 결합체의 형성 반응에서 PLK1 siRNA AS/펩타이드 접합체 대신에 PLK1 siRNA AS를 사용하였다.
(4) HER2 Ap/PAX의 제조
티올 작용기가 도입되고 HER2에 대한 2'-F-치환 피리미딘을 포함하는 SH-HER2 Ap를 주문 제작하였다(미국, BioSynhesis사).
말레이미드 작용기를 도입된 PAX의 제조는 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 수행하였다.
상기 말레이미드 작용기가 도입된 PAX와 상기 SH-HER2_Ap 접합은 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 수행하였다.
(5) HER2 Ab/PLK1 siRNA의 제조
HER2 Ab/PLK1 siRNA는 HER2 Ab/PLK1 siRNA SS 접합체와 PLK1 siRNA AS의 이중가닥 결합체로, 상기 실시예 3.1.2에서와 같은 방법으로 제조하되, 다만 이중가닥 결합체의 형성 반응에서 PLK1 siRNA AS/LPE3-1 접합체 대신에 PLK1 siRNA AS를 사용하였다.
(6) HER2 Ab/PAX의 제조
HER2 Ab의 티올 작용기 도입은 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 수행하되, 다만 HER2 Ap/LPE3-1 접합체 대신에 HER2_Ab를 사용하여 수행하였다.
다음 말레이미드 작용기가 도입된 PAX와 상기 티올 작용기가 도입된 HER2 Ab 접합은 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 수행하였다.
(7) LPE3-1/PLK1 siRNA의 제조
LPE3-1/PLK1 siRNA는 LPE3-1/PLK2_siRNA_SS 접합체와 PLK1 siRNA_AS의 이중가닥 결합체로, 먼저 LPE3-1/PLK2 siRNA_SS의 접합체는 구입한 LPE3-1 펩타이드와 주문 제작한 5'에 아미노기가 있는 PLK1 siRNA SS(미국, BioSynhesis사)을 사용하여 실시예 3.1.3에서 제시한 HER2-Ap/LPE3-1 접합체의 제조방법과 같은 방법으로 수행하였다. 그런 다음 PLK1 siRNA AS와 상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 이중가닥 결합체를 형성시켰다.
(8) LPE3-1/PAX의 제조
LPE3-1의 티올 작용기 도입은 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 수행하되, 다만 HER2 Ap/LPE3-1 접합체 대신에 LPE3-1 펩타이드를 사용하여 수행하였다. 그런 다음 상기 실시예 3.1.3에서와 같은 방법으로 말레이미드 작용기가 도입된 PAX와 상기 티올 작용기가 도입된 LPE3-1 펩타이드를 접합시켰다.
<실시예 4> 파크리탁셀을 포함하는 약물 운반체의 항암 활성
항암 활성 확인을 위한 세포주는 상기 실시예 2에서와 같이 BT-474와 MDA-MB-231 세포주를 사용하였다.
항암 활성 확인에 사용된 약물 운반체는 상기 실시예 3-1에서 제조된 4가지 시험군 약물 운반체인 (1) HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1, (2) HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1, (3) HER2 Ap/PAX/LPE3-1 및 (4) HER2 Ab/PAX/LPE3-1와, 상기 실시예 3-2에서 제조한 8 가지의 대조군 약물 운반체인 (1) HER2 Ap/LPE3-1, (2) HER2 Ab/LPE3-1, (3) HER2 Ap/PLK1 siRNA, (4) HER2 Ap/PAX, (5) HER2 Ab/PLK1 siRNA, (6) HER2 Ab/PAX, (7) LPE3-1/PLK1 siRNA, 및 (8) LPE3-1/PAX이다.
항암 활성 확인은 상기 약물 운반체의 처리 농도에 따른 암세포주에서의 세포 사멸 정도를, Annexin V FITC Apoptosis detection kit(미국, BD 사)로 측정하여 확인하였다.
BT-474 세포주와 MDA-MB-231세포주를, 96 well 배양용기에 준비한 후 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후에, 72시간 동안 시험군 약물 운반체와 대조군 약물 운반체를 농도별로 처리하고 실시예 2와 같은 방법으로 세포사멸 정도를 측정하였다.
50nM 처리 농도와 pH 7.0에서 ? 72시간 배양시 대조군 약물 운반체의 BT-474 세포주와 MDA-MB-231세포주에 대한 세포사멸 정도를 무처리군 대비 백분율로 도 10에 나타내었고, 50nM 또는 1uM 처리 농도와 pH 7.0에서 ? 시험군 약물 운반체의 처리 시간별 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에 대한 세포사멸 정도를 무처리군 대비 백분율로 도 11 및 도 12에 나타내었으며, pH 7에서 ? 72시간 배양시 시험군 약물 운반체의 처리 농도별 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에 대한 세포사멸 정도를 무처리군 대비 백분율로 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 10을 참조하여 보면, 대조군 약물 운반체 중 HER2 Ap/LPE3-1, HER2 Ab/LPE3-1는 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주와 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포주 모두에서 항암효과가 없었으며, HER2 Ap/PLK1 siRNA,, HER2 Ap/PAX, HER2 Ab/PLK1 siRNA, HER2 Ab/PAX는 모두가 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에서만 항암효과가 있었다. 또 LPE3-1/PLK1 siRNA, LPE3-1/PAX는 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474와 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포 모두에 항암효과가 없었다. 이런 대조군 약물 운반체의 세포사멸에 대한 결과는 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474 세포주에 HER2에 특이적인 압타머 또는 항체가 결합하여 엔도좀으로 세포로 내재화되고 엔도좀이 산화되면서 일부의 약물 운반체가 세포질로 방출되어 45~62%의 세포사멸을 보임을 시사한다.
또 도 11 내지 도 14에서 확인되듯이, 4가지 시험군 약물 운반체 모두는 HER2 유전자가 발현하지 않는 MDA-MB-231세포주에는 항암효능이 거의 없었으며(자료 미제시), BT-474 세포주에 4가지 시험군 약물 운반체에 대한 항암 활성 확인한 결과, 약물이 PLK1 siRNA로 구성된 HER2 Ap/PLK1 siRNA/LPE3-1과 HER2 Ab/PLK1 siRNA/LPE3-1 약물 운반체는 배양 시간에 비례하여 암세포 사멸 효과가 높아졌고(도 11), 또 EC50(50% 사멸에 해당하는 농도)가 10nM 이상 투여 구간에서는 최대 78% 세포사멸을 관찰하였다(도 13). 약물이 PAX로 구성된 HER2 Ap/PAX/LPE3-1과 HER2 Ab/PAX/LPE3-1 약물 운반체도 배양 시간에 비례하여 암세포 사멸 효과가 높아졌고(도 12), EC50이 100nM 이상 투여 구간에서 나타났으며 최대 77%, 75% 세포사멸을 관찰하였다(도 14).
상기 실시예들에서 제시된 항암 활성 확인 실험 결과들은 세포 표적화 도메인이 있는 시험군 약물 운반체들이 HER2 유전자가 과발현하는 BT-474에 큰 항암 효과가 있으며 발현하지 않는 MDA-MB-231세포주에 항암효과가 거의 없어 적은 양의 항암제(PLK1 siRNA, 파클리탁셀)로 특정 표적분자가 있는 세포에 제한적으로 큰 항암 효과를 낼 수 있음을 의미하고, 이를 통해 항암치료의 부작용 경감 및 항암제의 효과 증대를 달성할 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.
또 상기 결과들은 세포 표적화 도메인(CTD), 약물과 약물방출 도메인(DRD)으로 구성된 시험군 약물 운반체들의 투여는 대조군 약물 운반체들의 투여와 비교할 때 적은 농도의 투여로도 약물의 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다고 할 수 있다.
본 발명은 그의 일부 특별한 구체예들을 참고하여 설명 및 예시되며, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 방법 또는 프로토콜의 다양한 개조(adaption), 변화, 변형, 치환, 삭제 또는 부가가 이루어질 수 있는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항들의 범위에 의해 정의되며, 그와 같은 청구항들은 합리적인 범위에서 넓게 해석되어야 하는 것으로 의도된다.

Claims (20)

  1. (a) 표적세포의 표적분자와 특이적으로 결합하는 영역인 세포 표적화 영역과 (b) pH 의존적 막 투과성 펩타이드가 상기 세포 표적화 영역과 결합되어 구성되는 약물 운반체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자는 상기 표적세포 표면에 존재하는 항원 또는 수용체인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 표적세포는 암세포, 비정상세포 또는 정상세포인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표적화 영역은 상기 표적분자와 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유한, 항체, 항체 단편, 압타머, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 리간드, 사이토카인의 일부 영역인 펩타이드 또는 리간드의 일부 영역인 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 GALA 펩타이드, MelP5 펩타이드의 변이체인 pHD15 펩타이드, MelP5 펩타이드의 변이체인 pHD24 펩타이드, MelP5 펩타이드의 변이체인 pHD108 펩타이드, LP 펩타이드 변이체인 LPE3-1, LP 펩타이드 변이체인 LPH4 펩타이드 또는 ATRAM 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 (i) 직접 서로 공유적으로 결합하거나, (ii) 비공유적으로 결합하거나, (iii) 링커를 매개로 결합하거나, (iv) 생체 적합성 고분자를 매개로 결합하는 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 링커를 매개로 결합하고,
    상기 링커는 아이소티오시아네이트(isothiocyanate), 아이소시아네이트(isocyanates), 아실 아자이드(acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 알데하이드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭사이드(epoxide), 옥시레인(oxirane), 칼보네이트(carbonate), 아릴 할라이드(aryl halide), 이미도에스터(imidoester), 카보이미드(carbodiimide), 안하이드라이드(anhydride), 플루오로페닐 에스터(fluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 또는 비닐술폰(vinylsulfone)의 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 링커를 매개로 결합하고,
    링커는 절단 가능한 링커 또는 절단 가능하지 않은 링커인 약물 운반체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 절단 가능한 링커는 프로테아제에 의해서 절단 가능한 링커, 산 또는 염기 조건에서 절단 가능한 링커, 또는 환원 또는 산화 조건에서 절단 가능한 링커이고,
    상기 절단 가능하지 않은 링커는 MCC(Maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate)와 MC(maleimidocaproyl)를 포함하는 링커인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 링커를 매개로 결합하고,
    상기 링커는 2개 이상의 작용기를 갖는 링커인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 2개 이상의 작용기를 갖는 링커는 동종 이작용성 링커, 이종 이작용성 링커 또는 수지 유형의 링커인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표적화 영역과 pH 의존적 막 투과성 펩타이드는 생체 적합성 고분자를 매개로 결합하는 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 고분자는 합성 고분자 또는 천연 고분자인 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항 기재의 약물 운반체에 약물이 결합한 약물 운반체와 약물의 복합체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 약물 운반체의 세포 표적화 영역 또는 pH 의존적 막 투과성 펩타이드와 (i) 직접 서로 공유적으로 결합하거나, (ii) 비공유적으로 결합하거나, 또는 (iii) 링커를 매개로 결합하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 약물 운반체에, (i) 약물, 세포 표적화 영역, pH 의존적 세포 투과성 펩타이드 순으로 연결되거나, (ii) 세포 표적화 영역, 약물, pH 의존적 세포 투과성 펩타이드 순으로 연결되거나 또는 (iii) 세포 표적화 영역-pH 의존적 세포 투과성 펩타이드-약물 순으로 연결되는 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 생체 적합성 고분자를 매개로 약물 운반체와 결합하는 것을 특징으로 하는 약물 운반체.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 세포 내의 세포질로 이동하여 약효를 발휘하는 약물인 것을 특징으로 하는 복합체.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 저분자 화합물로 된 약물, 유전자, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 펩티드, 리보자임, 바이러스 입자, 면역조절제, 단백질 또는 조영제인 것을 특징으로 하는 복합체.
  20. 제14항에 있어서,
    상기 약물은 세포독성 항암제이고,
    상기 세포독성 항암제는 대사길항제(Antimetabolites), 미세관(microtubulin) 표적화제(Tubulin polymerase inhibitor 및 Tubulin depolymerisation), 알킬화제(Alkylating agents), 유사분열 억제제(Antimitotic Agents), DNA 절단제(DNA cleavage agent), DNA 가교제(DNA cross-linker agent), DNA 인터컬레이터제(DNA intercalator agents) 또는 DNA 토포아이소머라아제 억제제(DNA topoisomerase inhibitor)인 것을 특징으로 하는 복합체.
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