KR20200133422A

KR20200133422A - 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법

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Publication number: KR20200133422A
Application number: KR1020190058546A
Authority: KR
Inventors: 최준호; 정지안; 박미나; 송봉준; 김옥희; 이강우
Original assignee: 농업회사법인 에스에스바이오팜 주식회사; 원광대학교산학협력단
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2020-11-30
Also published as: KR102211892B1

Abstract

본 발명은 단백질분해효소를 이용하여 50~100 MPa의 고압상태에서 실크피브로인을 가수분해하는 것을 특징으로 하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법을 제공하며, 상기 본 발명에 의하면 실크피브로인에 대한 단백질 분해력이 약한 단일 단백질분해효소 혹은 복합효소도 이용이 가능하며, 이에 의해 실크피브로인으로부터 분자량이 4~10 kD인 저분자 펩타이드/단백질과 1~2.5 kD인 펩타이드, 그리고 실크아미노산을 생산할 수 있고, 단백질 가수분해 효율을 10~40% 증가시킬 수 있는 효과를 제공할 수 있다.

Description

고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법{SILKPEPTIDE PRODUCTION METHOD USING HIGH PRESSURE AND ENZYME TREATMENT}

본 발명은 실크펩타이드의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고압에서 단일 또는 복합효소를 이용한 간단한 공정에 의해, 실크피브로인에 대한 단백질 분해력이 약한 단일 단백질분해효소 혹은 복합효소도 이용이 가능하며, 이에 의해 실크피브로인으로부터 분자량이 4~10 kD인 저분자 펩타이드/단백질과 1~2.5 kD인 펩타이드, 그리고 실크아미노산을 생산할 수 있고, 단백질 가수분해 효율을 10~40% 증가시킬 수 있는 효과를 제공하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법에 관한 것이다.

실크(Cocoon)는 피브로인(75%)과 세리신(25%)로 이루어져 있으며, 정련과정을 거쳐 세리신을 제거한 피브로인(실크단백질)을 이용한 실크펩타이드 또는 실크아미노산을 제조하여 식품소재 및 기능성 화장품 소재로 활용하고 있으며, 실크단백질 자체는 생체적합성을 지닌 생체재료(Biomaterial)로도 많은 연구가 진행되고 있다.

실크단백질(피브로인)은 셀룰로스와 같은 β-시트 형태로 인하여 불용성이면서 일정한 강도를 유지하는 단백질로서 실크펩타이드·아미노산은 전량 산-처리 가수분해방법에 의한 사용화가 이루어지고 있는 실정이다.

하지만 산-처리 가수분해 방법은 고온·강산에서 실크단백질을 분해한 이후 7일 이상의 중화·탈색·탈취·탈염·농축·건조의 복잡한 단계를 거쳐 실크펩타이드와 실크아미노산을 제조하기 때문에 환경오염, 화학약품 및 고온처리에 의한 단백질 변성 및 불규칙적인 분자량, 낮은 생산수율 등의 문제점을 지니고 있다.

이에 실크단백질로부터 저분자량인 실크펩타이드 및 실크아미노산을 환경 친화적인 이면서 고효율 및 고품질의 제품을 생산할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 고압에서 단일 또는 복합효소를 이용한 간단한 공정에 의해, 실크피브로인에 대한 단백질 분해력이 약한 단일 단백질분해효소 혹은 복합효소도 이용이 가능하며, 이에 의해 실크피브로인으로부터 분자량이 4~10 kD인 저분자 펩타이드/단백질과 1~2.5 kD인 펩타이드, 그리고 실크아미노산을 생산할 수 있고, 단백질 가수분해 효율을 10~40% 증가시킬 수 있는 효과를 제공하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 단백질분해효소를 이용하여 50~100 MPa의 고압상태에서 실크피브로인을 가수분해하는 것을 특징으로 하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 단백질분해효소는 알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스, 플라보자임, 펩신, 브로멜라인, 콜루푸린의 군에서 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법.

(3) 상기 (1)에 있어서, 단백질분해효소는 복합효소로써 플라보자임을 포함하는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.

(4) 상기 (1)에 있어서, 단백질분해효소는 상압에서 실크피브로인의 분해활성이 낮은 펩신, 브로멜라인, 및 콜루푸린에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.

(5) 상기 (3)에 있어서, 단백질분해효소는 상압에서 실크피브로인의 분해활성이 낮은 펩신, 브로멜라인, 및 콜루푸린에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.

(6) 상기 (1)에 있어서, 반응에 구연산, 글루콘산, 및 타르타르산에서 선택되는 적어도 1종이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 산-처리 가수분해를 이용한 실크펩타이드의 생산방법.

(7) 상기 (1)에 있어서, 반응에 구연산, 글루콘산, 및 타르타르산이 포함되는 것을 특징으로 하는 산-처리 가수분해를 이용한 실크펩타이드의 생산방법.

상기와 같은 본 발명의 구성에 의하면, 고압에서 단일 또는 복합효소를 이용한 간단한 공정에 의해, 실크피브로인에 대한 단백질 분해력이 약한 단일 단백질분해효소 혹은 복합효소도 이용이 가능하며, 이에 의해 실크피브로인으로부터 분자량이 4~10 kD인 저분자 펩타이드/단백질과 1~2.5 kD인 펩타이드, 그리고 실크아미노산을 생산할 수 있고, 단백질 가수분해 효율을 10~40% 증가시킬 수 있는 효과를 제공한다.

도 1은 가용화시킨 실크피브로인 용액을 이용한 SEC(분자배제크로마토그래피)로부터 실크피브로인 단백질의 분자량 측정결과.
도 2는 가용화시킨 실크피브로인의 SDS-PAGE.
도 3은 단일효소를 이용한 실크피브로인의 효소 가수분해결과.
도 4는 상압에서 단일효소(알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스, 플라보자임)를 이용한 SEC(분자배제크로마토그래피)로부터 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 5는 상압에서 단일효소(브로멜라인, 펩신, 콜루푸린, 프로모드 278, 플라보자임)를 이용한 SEC(분자배제크로마토그래피)로부터 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 6은 상압 대비 고압에서 SEC(분자배제크로마토그래피)로부터 가용화시킨 실크피브로인 용액의 분자량 측정결과.
도 7은 고압에서 단일효소(플라보자임)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 8은 고압에서 단일효소(푸드프로)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 9는 고압에서 단일효소(알팔라아제)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 10은 고압에서 단일효소(프로타멕스)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 11은 고압에서 단일효소(콜루푸린)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 12는 고압에서 단일효소(브로멜라인)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 13은 고압에서 단일효소(펩신)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 14는 상압 대비 고압에서 복합효소를 이용한 실크피브로인의 가수분해 측정결과.
도 15는 상압/고압에서 복합효소(푸드프로+플라보자임)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 16은 상압/고압에서 복합효소(콜루푸린+플라보자임)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 17은 고압에서 단일 효소(푸드프로)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 18은 고압에서 단일 효소(플라보자임)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.
도 19는 고압에서 복합 효소(푸드프로+플라보자임)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량 측정결과.

본 발명은 실크피브로인으로부터 단백질분해효소 및 초고압을 이용하여 실크펩타이드 및 실크아미노산을 단순한 공정에 의해 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 난용성 실크피브로인을 가용화시킬 수 있는 용매조성을 선정하여 실크피브로인의 β-시트 형태를 최대한 무정형 상태로 전환하여 단백질분해효소의 가수분해를 극대화한다. 이를 위해 본 발명에서는 초고압, 바람직하게는 50~100 MPa의 처리로 인하여 β-시트 형태의 단백질 구조를 이완시켜 단백질분해효소의 분해효율을 극대화하여 저분자량의 실크 펩타이드 및 실크아미노산을 제조한다.

상기 본 발명에서 단백질분해효소는 특별한 한정을 요하는 것은 아니며, 실크피브로인에 대한 단백질분해효율이 높은 효소 뿐만 아니라, 낮은 효소(예로, 펩신, 브로멜라인, 콜루푸린 등)도 사용할 수 있는 것이 특징이다. 예로, 알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스, 플라보자임, 펩신, 브로멜라인, 콜루푸린 등의 효소의 단독 혹은 2종 이상의 복합효소를 사용할 수 있다.

상기 본 발명에서 단백질분해효소는 바람직하게는 복합효소로써 플라보자임을 포함한다.

상기 본 발명에서 단백질분해효소는 0.1~10중량% 첨가될 수 있으며, 0.1중량% 미만으로 첨가될 경우 분해효율이 낮게 나올 우려가 있고, 10중량%를 초과하면 비용상승뿐만 아니라 추가적인 효율의 개선이 충분하지 않아 상기 범위가 바람직하다.

본 발명에서는 바람직하게는 상기 가수분해 반응을 촉진하기 위해 구연산, 글루콘산, 및 타르타르산에서 선택되는 적어도 1종이 포함된다. 보다 바람직하게는 구연산, 글루콘산, 및 타르타르산이 중량비로 0.5:1:0.5로 조성된 것을 사용하며, 이들은 각각 혹은 혼합된 상태로 0.1~0.2중량%의 범위내에서 사용된다.

이하, 본 발명을 하기의 실험예로써 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하지만 이는 본 발명의 보다 쉬운 이해를 돕기 위한 것이지, 이들을 통하여 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실험방법]

1. 실크피브로인 및 가수분해산물에 대한 분석방법

(1) 실크피브로인 및 가수분해산물의 단백질 분석

- 효소반응에 의한 단백질 분해를 정량적으로 확인하기 위하여 Lowry 방법(J. Biol. Chem. 1951. 193:265-275)을 사용하였다.

- 효소반응이 이루어진 반응액, 0.2 mL에 2% Na₂CO₃(0.1M NaOH)과 1% CuSO₄, 2% Potassium Sodium tartrate tetrahydrate를 98:1:1로 혼합한 용액을 1 mL 첨가하여 상온에서 15분간 방치한 후 Folin-Ciocalteu's Reagent (Sigma-Aldrich, USA)와 증류수를 1:1로 혼합한 용액을 0.1 mL 첨가하여 상온에서 30분 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질의 농도측정을 위한 표준물질은 BSA(Bovine serum albumin) Protein Standard(Sigma-Aldrich, USA)를 이용하였다.

(2) 실크피브로인 및 가수분해산물의 유리 아미노 그룹 분석

- 효소반응에 의한 분해산물인 유리 아미노 그룹은 Ninhydrin 방법(J. Biol. Chem. 1915. 20:217-230)을 사용하여 정량하였다.

- 효소 반응액, 0.2 mL에 Ninhydrin Reagent(Sigma-Aldrich USA)를 0.1 mL 혼합하여 10분 동안 가열한 이후 실온 냉각시키고 95% 에탄올을 0.5 mL 첨가하여 혼합한 이후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 유리 아미노 그룹의 정량을 위한 표준물질은 0.05% Acetic acid에 용해시킨 Glycine (Samchun, Korea)을 이용하였다.

(3) 실크피브로인 및 효소분해산물의 아미노산 조성 분석

- 식품공전의 방법을 적용하여 한국건강기능식품연구소에서 분석하였다.

- 유리 아미노산 조성 분석

ㅇ HPLC 시스템 (1200 Series, Agilent Technologies)

ㅇ Column: ZORBOX Eclipse XDB C18 column (Agilent Technologies, 4.6 mm ㅧ 150 mm, 5 μm) at 40℃

ㅇ Fluorescence Detector (Excitation 340nm / Emission 435 nm)

ㅇ Mobile: A (40 mM Phosphate buffer, pH 7.8), B (ACN/MeOH/DW, 45/45/10, v/v)

ㅇ Gradient: An initial 1.90 min gradient from 100%→50% A (1.9 min), 50%→14.0 min from 50% A, 18.0 min from 0% A, and a final 22.0 min at 100% A at 2 mL/min

- 구성 아미노산 조성 분석

ㅇ 샘플 전처리(시료 0.2 g에 6N HCl 40 mL 가한 뒤 N₂gas를 충진·밀봉하여110℃에서 24시간 가수분해한 뒤, 감압농축기(EYELA N-1100, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 농축 후 0.2M Sodium citrate buffer로 50 mL 정용하여 0.45 μm syringe filter로 여과

ㅇ 아미노산 자동분석기 (Amino acid analyser L-8900, Hitachi Co., Ltd., Tokyo, Japan)

(4) SEC(Size exclusion chromatography)를 이용한 실크피브로인 및 가수분해물의 분자량 분석

- HPLC 시스템 (Atlus™, PerkinElmer)

- Column : 5Diol-300-II size exclusion column (COSMOSIL, 7.5 mm×300 mm, 300Å Pore size) at 30℃

- Photoarray Detector (A 280 nm)

- Mobile: 0.25M Citrate-Phosphate buffer (pH 6.0) at 1 mL/min

- Molecular weight standards: β-Amylase (200 kD), Alchohol dehydrogenase (150 kD), Albumin (66 kD), Carbonic anhydrase (29 kD), Cytochrome (12.4 kD)

(5) SDS-PAGE를 이용한 실크피브로인 및 가수분해물의 분자량 분석

- 4~20% Gradient Mini-PROTEAN^ㄾ TGX™ Precast protein gel (BIO-RAD)

- Precision Plus Protein Standards (MW: 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 37 kD, 50 kD, 75 kD, 100 kD, 150 kD, 250 kD)

- Stain: Silver Staining Plus Kit (BIO-RAD)

(6) MALDI-TOF/TOF 이용한 실크피브로인 및 가수분해물의 분자량 분석

- 저분자량의 펩타이드/단백질 및 아미노산의 분자량 확인을 위하여 포항테크노파크의 MALDI-TOF/TOF를 이용하여 분석

- MALDI-TOF 시스템 (Autoflex speed MALDI-TOF/TOF, Bruker)

- 샘플 전처리 (Mixed with sinapinic acid in 80% ACN : 0.1% TFA)

- Autoflex speed MALDI-TOF Pro linear mode

- Laser (355 nm, 2 kHz, 200 shots)

- Molecular weight scope : 800 ~ 60,000 Da

2. 효소가수분해 및 고압처리

(1) 식품용 단백질분해 효소의 선발 및 효소가수분해 반응조건

- 반응 pH(akaline, neutral, acidic protease) 및 분해방법(Endo/Exo)에 따라 10종 선발하였다.

- 효소반응을 위한 pH는 0.25M Citrate-phosphate buffer를 이용하여 제공하였다.

- 반응 온도는 water-bath를 이용하여 조절하였다.

- 단백질분해 효소의 효소활성도를 결정하여 12.5 U-효소/g-실크피브로인의 비율로 적용하였다.

(2) 50~100 MPa 고압처리 방법

- 50~100 MPa의 고압처리는 HHP machine (TFS-2L, Toyo-Koatsu Innoway Co. Ltd., Hiroshima, Japan)을 이용하여 진행하였다.

- 고압상태에서의 온도는 50℃를 선택하여 적용하였다.

[실험예]

[실험예 1] 실크피브로인 Fiber 및 가용화시킨 실크피브로인 용액

1. 정제된 실크피브로인의 가용화

- 정련된 실크피브로인(Degummed silk fibroin)은 불용성이기 때문에 식용을 전제로 CaCl₂ 함유한 용액과 열처리를 거쳐 가용화 시키는 방법을 이용하였고 과량의 염은 투석방법을 이용하여 제거하였다.

2. 실크피브로인 Fiber 및 가용화 실크피브로인 용액의 아미노산 조성 (표 1)

- 실크피브로인 Fiber 및 가용화시킨 실크피브로인 용액의 아미노산 조성은 유사한 것으로 나타났다.

- 실크피브로인 용액에 유리 아미노산은 불검출되었고, 모든 아미노산은 단백질 형태로 존재하는 것으로 확인되었다.

ND : Not detected

3. 실크피브로인의 분자량

- 가용화시킨 실크피브로인 용액을 이용한 SEC으로부터 실크피브로인 단백질의 분자량은 광범위하게 분포되어 있으며, retention time이 7~11분대에 걸쳐 있으며 분자량은 약 10 kD ~ 500 kD의 분포를 가지고 있어 분자량을 특정하기 어려웠다.(도 1)

- 4~20% Gradient Gel을 이용한 SDS- PAGE 에서도 가용화시킨 실크피브로인의 분자량은 고분자부터 저분자량까지 전 범위의 분자량을 보이고 있어 분자량을 특정할 수 없었다.(도 2)

- SEC와 SDS-PAGE 결과, 가용화시킨 실크피브로인은 대부분 단백질이 단독 형태로 존재하지 않고 서로 간에 물리화학적으로 엉겨있는 상태로 대부분 20 kD 이상인 것으로 판단되었다.

4. 식품용 단백질분해 효소의 특징

(1) 단백질분해 효소의 분류 (표 2)

- 기원별 세균, 곰팡이, 식물, 동물 및 혼합형 효소를 확보하였다.

- 반응 pH에 따른 알칼리성, 중성, 산성 효소를 확보하였다.

- 반응기작에 따른 endo-type 및 endo/exo 혼합형 효소를 확보하였다.

(2) 단백질분해 효소의 효소활성 (표 2)

- 최적 반응조건(온도 및 pH)에서 카제인을 기질로 이용하여 효소활성을 결정하였다.

NA: Specific enzyme activities were not available because the substrate was precipitated at pH 4.0.

[실험예 2] 단일효소 처리에 의한 실크피브로인의 효소 가수분해

1. 단일효소를 이용한 실크피브로인의 효소 가수분해 (표 3)(도 3)

- 상압과 고압(50/75/100 MPa)에서 pH 7.0, 50℃에서 5시간 반응시킨 결과, 고압처리에 의하여 대부분의 효소가수분해가 증가하는 경향을 확인하였다.

- 10종의 단백질 분해효소 중에서 endo/exo-type이 혼합된 플라보자임의 경우, 고압처리에 의하여 최소 30%(100 MPa)에서 44%(75 MPa)의 유리 아미노그룹이 증가하여 exo-type의 단백질분해효소에 비하여 효과적이었다.

- 고압처리 없는 상압에서 실크피브로인에 대한 분해효율이 높았던 알칼리성 단백질분해 효소인 푸드프로(75 MPa), 알칼라아제(50 MPa), 프로타멕스(75 MPa)에서 고압처리 조건에 따라 최대 9%, 14%, 12%의 유리 아미노 그룹의 생성이 증가하여 고압에 의한 효과가 가장 낮았다.

- 고압처리 없는 상압에서 실크피브로인에 대한 분해효율이 낮았던 브로멜라인(100 MPa)과 콜루푸린(75 MPa)의 경우 고압처리 조건에 따라 최대 42%의 유리 아미노 그룹의 생성이 증가하여 고압에 의한 효과가 가장 좋았다.

- 상압 대비 고압(50~100 MPa)처리에 의하여 효소가수분해에 의한 유리 아미노 그룹의 생성은 대부분 증가하는 경향이었다.

2. 단일효소(FoodPro/Flavourzyme)를 이용한 실크피브로인의 효소 가수분해물의 아미노산 조성

- 상압과 고압(50/75/100 MPa)에서 pH 7.0, 50℃에서 5시간 반응시킨 결과, 고압처리에 의하여 효소가수분해가 효율적인 푸드프로와 플라보자임, 단일효소를 이용한 가수분해산물의 아미노산 조성을 확인하였다.

- 상압에서 단일효소, 푸드프로를 이용한 가수분해결과, 가수분해물에 존재하는 유리(Free) 아미노산은 0.38 mg/g으로 대부분이 저분자량의 펩타이드/단백질 형태로 존재하고 있으며, 효소가수분해에 의하여 전체 아미노산 중 2.4%만이 유리 아미노산 형태로 분해되었다. (표 4)

- 고압(100 MPa)에서 단일효소, 푸드프로를 이용한 가수분해결과, 유리(Free) 아미노산은 0.45 mg/g으로 전체 아미노산 중 2.4%만이 유리 아미노산 형태로 분해되었다. (표 4)

- 상압에서 단일효소, 플라보자임을 이용한 가수분해결과, 가수분해물에 존재하는 유리(Free) 아미노산은 2.90 mg/g으로 endo-type인 푸드프로에 비하여 높은 수준으로 확인되었으며 효소반응이 진행됨에 따라 침전물이 생성되어 유리 아미노산의 비중은 의미가 없었다. (표 5)

- 고압(100 MPa)에서 단일효소, 플라보자임을 이용한 가수분해결과, 유리(Free) 아미노산은 4.0 mg/g으로 고압처리에 의하여 유리 아미노산이 38% 증가하였다. (표 5)

- 고압처리에 의한 실크피브로인의 가수분해는 endo-type인 푸드프로에 비하여 endo/exo 혼합형인 플라보자임에서 효과적이었다.

3. 상압에서 단일효소를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량

- 실크피브로인에 대한 효소 가수분해가 효율적으로 이루어진 endo-type의 단백질분해 효소(알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스, 플라보자임)에 의한 가수분해물에서 브로드한 실크피브로인의 피크는 사라지고, 11분대의 메인 피크와 더불어 11.5~13분대 사이의 마이너 피크들이 생성되었다. (도 4)

- 플라보자임에 의한 효소 가수분해물에서 메인 피크는 11.1분대에 확인되지만 이는 10.3분대의 브로드 피크에 해당하는 단백질 존재로 인하여 리텐션타임이 변화된 것으로 사료되고 exo-type에 의한 유리(Free) 아미노산은 13분대에 나오는 것으로 예측되었다.

- 상압에서 단일 효소를 이용한 가수분해 결과, 실크피브로인의 브로드한 피크는 사라지고, 저분자량의 단백질/펩타이드가 11분대에, 저분자량의 펩타이드가 12~13분대에, 그리고 유리 아미노산이 13분 이후의 peak에 해당하는 것으로 판단되었다.

- 실크피브로인에 대한 효소 가수분해가 상대적으로 저조한 endo-type의 단백질분해 효소(브로멜라인, 펩신, 콜루푸린, 프로모드 278, 플라보자임)에 의한 가수분해물에서 브로드한 실크피브로인의 피크는 사라지지만, 10.3분대의 브로드 피크가 상당량 잔존한 상태에서 10.8분대의 메인 피크와 더불어 11.5~13분대 사이의 브로드한 마이너 피크들이 생성되었다. (도 5)

- 상압에서 단일 효소를 이용한 가수분해 결과, 실크피브로인의 복잡하게 연관되어 있는 β-시트를 분해시켜야 정상적인 효소가수분해가 이루어지는 것으로 판단한다. 효소가수분해가 효율적인 경우, 광범위하게 분포하던 실크피브로인의 피크가 완전하게 해체되고 일정 분자량의 피크가 확인되었다.

4. 고압에서 단일효소를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량

- 실크피브로인을 상압(No Pressure), 50, 75, 100 MPa으로 50℃에서 5시간 처리한 결과, 11분대에 있던 피크가 사라지는 점과 미세하게 리텐션이 짧아져 분자량이 높아지는 경향을 확인하였다. (도 6)

- Exo-type 활성이 활발한 플라보자임을 단독으로 이용한 실크피브로인에 대한 효소 가수분해의 경우, 상압 효소가수분해에서 존재하던 10.3분대와 12.3분대의 피크가 고압 효소가수분해에서 사라지는 것이 확인되었으며, 13분대의 유리 아미노산에 해당하는 피크가 적용 압력이 증가함에 따라 증가하는 경향을 확인하였다. (도 7)

- 단일 단백질분해 효소로 푸드프로를 이용한 실크피브로인 가수분해의 경우, 12분대의 피크가 고압 효소가수분해에서 급격하게 감소하고, 12.5분대의 피크가 적용 압력이 증가함에 따라 증가하는 경향을 확인하였다. (도 8)

- 단일 단백질분해 효소로 알팔라아제(도 9), 프로타멕스(도 10), 알팔라아제를 단독으로 사용하는 실크피브로인에 대한 효소 가수분해의 경우, 푸드프로와 유사한 경향을 확인하였다.

- 콜루푸린을 단독으로 사용하는 실크피브로인에 대한 효소 가수분해의 경우, 상압 효소가수분해에서 존재하던 10.3분대의 피크는 고압 효소가수분해에서 유지된 반면, 상압에서 확인된 11.5분대의 피크가 고압처리에 의하여 사라지고 12.6분과 13.5분에 새로운 피크가 생성되었다. (도 11)

- 브로멜라인을 단독으로 사용하는 실크피브로인에 대한 효소 가수분해의 경우, 상압 효소가수분해에서 존재하던 10.3분대의 피크가 고압 효소가수분해에서 적용 압력이 증가함에 따라 점진적으로 감소하고 있으며, 고압처리에 의하여 11.5~12.5분대의 피크가 사라진 대신 12.9분대 피크가 증가하였다. (도 12)

- 펩신을 단독으로 사용하는 실크피브로인에 대한 효소 가수분해의 경우, 상압 효소가수분해에서 존재하던 10.3분대의 피크가 고압 효소가수분해에서 적용 압력이 증가함에 따라 점진적으로 감소하고 있으며, 고압처리에 의하여 11.5~12.5분대의 피크가 사라졌다. (도 13)

5. 실크피브로인의 효소가수분해 과정에서 단백질분해효소에 의한 자체 분해여부

- 주어진 효소반응조건에서 실크단백질을 효율적으로 가수분해하는 5종의 단백질 분해효소에 대한 자체 분해 여부를 실크단백질의 존재 여부에 따라 확인하였다.

- 실크단백질 분해효율이 높은 5종의 단백질 분해효소는 주어진 반응조건에서 실크단백질을 분해하는 반면 효소자체를 분해하는 자체 분해는 무시할 수준으로 확인되었다. (표 6)

[실험예 3] 복합효소 처리에 의한 실크피브로인의 효소 가수분해

1. 상압에서 실크피브로인의 가수분해 효율을 향상시키기 위한 복합효소를 이용한 반응 공정

- 상압에서 실크피브로인의 가수분해 효율을 위하여 1단계: 푸드프로(pH 8, 60℃) → 2단계: 플라보자임(pH 7, 50℃)으로 2단계 효소반응을 추진한 결과, 실크피브로인으로부터 유리 아미노 그룹이 단계별로 증가하였다.

- 복합효소를 이용한 실크피브로인의 가수분해는 endo-type과 exo-type의 단백질분해효소 활성을 활용하기 위해 플라보자임을 기반으로 다른 효소와 1:1 혼합을 이용하여 상압, pH 7.0, 50℃에서 5시간 효소가수분해를 진행하였다. (표 7)

- 상압에서 실크피브로인에 대한 분해효율이 높았던 알칼리성 단백질분해 효소인 푸드프로, 알팔라아제, 프로타멕스와 플라보자임을 혼합한 복합효소 가수분해에서 모두 6,400 mg/L 수준의 유리 아미노 그룹이 생성되어 복합효소 가수분해에서도 좋은 결과를 확인하였다.

- 상압에서 실크피브로인에 대한 중성 단백질분해 효소인 알팔라아제와 플라보자임의 복합효소에서만 알칼라인 단백질분해 효소와 유사한 수준으로 가수분해가 이루어졌다.

- 상압에서 실크피브로인에 대한 중성 단백질분해 효소인 브로멜라인과 플라보자임의 복합효소는 알칼라인 단백질분해 효소를 이용한 가수분해 결과의 66% 수준으로 낮은 분해효율을 보이고 있지만 개별 효소에 의한 단백질 분해효율 대비 복합효소를 사용함으로서 단백질 분해효율은 증가하였다.

2. 실크피브로인의 가수분해 효율 향상을 위한 고압에서 복합효소를 이용한 반응 공정

- 상압 대비 고압에서 복합효소를 이용한 실크피브로인의 가수분해는 모두 증가 (표 7)(도 14)

- 상압에서 플라보자임과 혼합하여 사용한 복합효소에 의한 실크피브로인의 가수분해 결과가 우수한 알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스의 경우, 고압처리에 의하여 최대 12~16%의 증가한 유리 아미노 그룹이 생성되었다.

- 상대적으로 상압에서 플라보자임과 혼합하여 사용한 복합효소에 의한 실크피브로인의 가수분해 결과가 낮았던 펩신, 브로멜라인, 콜루푸린의 경우, 고압처리에 의하여 31~40% 증가한 유리 아미노 그룹이 생성되었다.

- 실크피브로인의 효소가수분해를 위하여 50~100 MPa의 고압처리는 β-시트 구조를 이루고 있는 분자구조를 느슨하게 하여 단백질분해 효소의 접근이 가능하도록 한 결과라고 해석하였다.

3. 복합효소(푸드프로/플라보자임)를 이용한 실크피브로인의 효소 가수분해물의 아미노산 조성

- 상압 대비 고압(100 MPa)에서 복합효소를 이용한 실크피브로인의 분해산물에 존재하는 유리 아미노산은 4.30 mg/g에서 4.84 mg/g으로 13% 증가하였다. (표 8)

- 상압 대비 고압에서 가수분해산물에 존재하는 유리아미노산의 비중은 25%로 효소가수분해에 의하여 유리 아미노산보다 저분자량의 펩타이드/단백질 형태가 75% 존재하는 것으로 확인되었다.

4. 상압/고압에서 복합효소를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량

- 플라보자임과 혼합한 복합효소를 이용한 고압 효소가수분해에 따른 효소 가수분해산물의 분자량 변화를 SEC로 이용하여 확인하였다.

- 푸드프로 + 플라보자임 복합효소에 의한 실크피브로인의 효소가수분해 결과, 상압/복합효소 가수분해에서 존재하던 12.3분대의 브로드 피크가 고압/복합효소 가수분해에서 적용 압력이 증가함에 따라 감소하고, 고압처리에 따라 13분대의 피크가 증가하였다. (도 15)

- 알팔라아제+플라보자임, 프로타멕스+플라보자임, 알칼라아제+플라보자임, 복합효소에 의한 실크피브로인의 효소가수분해는 푸드프로+플라보자임과 유사한 경향을 보였다.

- 콜루푸린+플라보자임(도 16), 브로멜라인+플라보자임, 펩신+플라보자임, 복합효소에 의한 실크피브로인의 효소 가수분해 결과, 상압/복합효소 가수분해에서 존재하던 10.3분대 및 12.3분대의 피크가 고압/효소가수분해에서 감소하고, 고압처리에 따라 13분대의 피크가 증가한 것으로 나타났다.

[실험예 4] MALDI-TOF/TOF를 이용한 효소 가수분해산물의 분자량 결정

1. 고압에서 단일 효소를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량

- 실크피브로인을 고압(100 Mpa)/단일효소(푸드프로) 가수분해물의 분자량을 MALDI??TOF/TOF를 이용하여 분석한 결과, 실크피브로인의 푸드프로에 의한 가수분해물의 분자량은 3.8~10 kD에 해당하는 저분자량의 펩타이드/단백질과 0.85~2.5 kD에 해당하는 다량의 펩타이드로 구성되어 있었다. (도 17)

- 저분자량 펩타이드(0.85~2.5 kD)의 분자량과 분포로 보아 endo-type 효소분해로 인하여 다양한 아미노산을 구성하는 펩타이드가 생성된 것으로 판단되었다.

- 실크피브로인을 고압(100 Mpa)/단일효소(플라보자임) 가수분해물의 분자량을 MALDI??TOF/ TOF를 이용하여 결정한 결과, 푸드프로에 의한 결과와 유사한 것으로 나타났다. (도 18)

- 플라보자임 단일 효소를 이용한 실크피브로인 가수분해물에 존재하는 저분자량 펩타이드/단백질(3.8~10 kD)과 펩타이드(0.85~2.5 kD)의 함량은 푸드프로에 의한 가수분해물의 대비 각각 80% 및 40% 수준을 보였다.

- 플라보자임 효소의 exo-type으로 인하여 저분자량인 펩타이드는 이미 0.8 kD이하의 아미노산으로 분해되어 상대적으로 저분자량의 펩타이드/단백질의 량이 낮은 것으로 판단되었다.

2. 고압에서 복합효소(푸드프로/플라보자임)를 이용한 실크피브로인 가수분해산물의 분자량

- 실크피브로인을 고압(100 Mpa)/복합효소 가수분해물의 분자량을 MALDI-TOF/TOF를 이용하여 분석한 결과, 실크피브로인 가수분해물의 분자량은 3.8~10 kD에 해당하는 저분자량의 펩타이드/단백질과 0.85~2.5 kD에 해당하는 펩타이드로 단일 효소에 의한 가수분해물의 분자량과 유사한 경향을 보였다. (도 19)

- 복합효소에 의한 실크피브로인 가수분해물에 존재하는 저분자량 펩타이드/단백질(3.8~10 kD)과 펩타이드(0.85~2.5 kD)의 함량은 푸드프로에 의한 가수분해물의 대비 각각 50% 및 40% 수준으로 나타났다.

- 복합효소에 의한 실크피브로인 가수분해물에 존재하는 저분자량 펩타이드/단백질(3.8~10 kD)과 펩타이드(0.85~2.5 kD)의 함량은 플라보자임에 의한 가수분해물의 대비 각각 60% 및 80% 수준을 보였다.

- 복합효소에 의하여 실크피브로인이 가수분해되어 3.8~10 kD에 해당하는 저분자량의 펩타이드/단백질의 량은 감소하고 플라보자임의 exo-type 활성으로 0.85~2.5 kD에 해당하는 저분자량 펩타이드는 최저 수준으로 감소하였다.

[실험예 5]

구연산, 글루콘산, 및 타르타르산이 중량비로 0.5:1:0.5로 조성된 것을 0.1 중량%가 되도록 첨가한 것을 제외하고는 실험예 3의 3에서와 동일한 방법에 의해 효소 반응을 수행하면, 유리아미노산의 함량이 4.976 mg/g으로 증가하는 것이 확인된다[Glycine:1.41, Alanine: 1.20, Serine: 0.532, Tyrosine: 0.574, Valine: 0.324, Aspartic acid: 0.038, Glutamic acid: 0.108, Phenylalanine: 0.176, Threonine: 0.122, Arginine: 0.131, Isoleucine: 0.138, Tryptophan: 0.053, Leucine: 0.067, Lysine: 0.037, Histidine: 0.031, Methionine: 0.035, Proline: 0.033, Cystine: 0.000)]

[실험결과]

1. 산-처리 가수분해를 대체하는 효소가수분해방법을 이용한 실크펩타이드 제조방법

(1) 산-처리 가수분해를 통한 실크아미노산 제조방법의 대체

- 전통적인 산-처리 가수분해는 3M HCl을 이용하여 100℃ 이상에서 장시간(1~2일) 처리함으로서 실크피브로인을 가수분해한 이후 중화 → 탈색 → 탈염 → 농축 → 건조 과정을 거쳐 실크아미노산을 생산하는 것으로, 산-처리 가수분해에 의해 가수분해산물의 70% 이상이 유리 아미노산으로 분해되고, 최종적으로 건조시킨 제품의 경우 유리형태의 아미노산 함량이 90% 수준을 보인다.

(2) 효소가수분해를 통한 실크펩타이드/아미노산 제조방법

- 가용화시킨 실크피브로인 용액을 다양한 단백질 분해효소를 이용하여 50℃, pH 7.0(중성)에서 5시간 가수분해한 이후 추가적인 작업 없이 농축 → 건조 과정을 거쳐 분자량이 4~10 kD인 저분자 펩타이드/단백질과 1~2.5 kD인 펩타이드, 그리고 실크아미노산을 생산하다.

- 알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스 등의 단백질 분해효소를 단일 또는 플라보자임과 혼합한 복합효소를 이용한 효소가수분해 방법을 이용하여 효소 가수분해산물에 존재하는 실크아미노산의 함량을 2~30%로 조절하고, 다양한 기능성을 지닌 저분자량의 실크펩타이드/단백질을 70~98% 함유한 가수분해물을 제조하는 기술을 확보하였다.

- 산-처리 가수분해방법에 비하여 제조공정의 단축과 공정 단계를 최소화한 경쟁력 확보할 수 있다.

2. 고압/효소 가수분해방법을 이용한 실크펩타이드 제조방법

(1) 실크피브로인에 대한 단백질 분해력이 약한 콜루푸린, 브로멜라인, 펩신 등의 단백질분해 효소를 단일 또는 플라보자임과 혼합한 복합효소를 이용하여 50~100 MPa의 고압상태에서 실크피브로인을 가수분해하여 분자량이 4~10 kD인 저분자 펩타이드/단백질과 1~2.5 kD인 펩타이드, 그리고 실크아미노산을 생산하는 기술을 확보하였다.

(2) 고압(50~75 MPa)에서 실크피브로인을 단일 또는 복합효소를 이용하여 단백질 가수분해 효율을 10~40% 증가시키는 기술을 확보하였다.

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

단백질분해효소를 이용하여 50~100 MPa의 고압상태에서 실크피브로인을 가수분해하는 것을 특징으로 하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법.
제 1항에 있어서, 단백질분해효소는 알칼라아제, 알팔라아제, 푸드프로, 프로타멕스, 플라보자임, 펩신, 브로멜라인, 콜루푸린의 군에서 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 고압효소법에 의한 실크펩타이드의 생산방법.
제 1항에 있어서, 단백질분해효소는 복합효소로써 플라보자임을 포함하는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.
제 1항에 있어서, 단백질분해효소는 상압에서 실크피브로인의 분해활성이 낮은 펩신, 브로멜라인, 및 콜루푸린에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.
제 3항에 있어서, 단백질분해효소는 상압에서 실크피브로인의 분해활성이 낮은 펩신, 브로멜라인, 및 콜루푸린에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.
제 1항에 있어서, 반응에 구연산, 글루콘산, 및 타르타르산에서 선택되는 적어도 1종이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.
제 1항에 있어서, 반응에 구연산, 글루콘산, 및 타르타르산이 포함되는 것을 특징으로 하는 실크펩타이드의 생산방법.