KR20200121824A - 센서 시스템 - Google Patents

센서 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20200121824A
KR20200121824A KR1020207025821A KR20207025821A KR20200121824A KR 20200121824 A KR20200121824 A KR 20200121824A KR 1020207025821 A KR1020207025821 A KR 1020207025821A KR 20207025821 A KR20207025821 A KR 20207025821A KR 20200121824 A KR20200121824 A KR 20200121824A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
engineered
producer cells
population
producer
sensor
Prior art date
Application number
KR1020207025821A
Other languages
English (en)
Inventor
매튜 알. 던
크리스틴 제이. 아돌프센
노아 디. 테일러
제임스 이. 스푸나모어
제이 에이치. 코니츠카
케이틀린 디. 알렌
린동 웽
Original Assignee
에네볼브 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에네볼브 인코포레이티드 filed Critical 에네볼브 인코포레이티드
Publication of KR20200121824A publication Critical patent/KR20200121824A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
    • B01F23/41—Emulsifying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
    • G01N15/1492—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties within droplets
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1481—Optical analysis of particles within droplets

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 기술은, 예를 들어, 생명공학에서 표적 분자의 개선된 검출을 제공하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

센서 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 2월 15일자로 출원된 미국 가출원 제62/631,090호 및 2018년 9월 12일자로 출원된 미국 가출원 제62/730,355호의 유익을 주장하며, 이로써 이들의 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
기술분야
본 기술은 조작된 단백질 센서를 이용해서 세포를 생산하는 조작된 산물을 검출하고 풍부화(즉, 농축(enriching))시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
정부의 이해관계
본 발명은 미국 방위고등연구계획국(Defense Advanced Research Projects Agency: DARPA)에 의해 수여된 보조금 제D16PC00132호하에 정부지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
박테리아 알로스테릭 전사 인자(allosteric transcription factor: aTF) - 소분자의 인식을 전사 출력에 직접 결합시키는 단일 단백질 - 의 사용은 효소적 생물생산 및 검출을 개선시키기 위하여 대사 조작 전략에서 사용하기 위해 제안되었다(Taylor, et al. Nat. Methods 13(2): 177). 효과기 결합에 의해 초래된 단백질의 입체형태 변화는 특정 작동자 DNA 서열에 대한 이의 친화도를 조절하여, 유전자 발현을 최대 5000-배까지 변화시킨다. 이것은 aTF 센서를 합성 생물학의 많은 응용 분야에서 핵심적인 감지-및-반응 문제를 해결하는 흥미로운 패러다임으로 만든다.
aTF는 리간드를 신속하게 감지하고, 리포터(reporter)(예컨대, 형광 단백질 또는 선택 마커)의 유도된 발현과 같은 표적화된 전사 변화를 유도한다. 이것은 (예컨대, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS) 또는 성장에 의해) 높은 세포내 농도의 동족 리간드를 갖는 세포의 농축을 허용한다. 대사 공학의 맥락에서, 이것은 조작된 균주가 스크리닝될 수 있는 처리량을 크게 증가시킨다.
그러나, 소정의 게놈 조작 상황에 있어서(예컨대, 핵심 대사 과정을 표적으로 하는 대규모 게놈 조작을 행하는 경우), 조작된 센서는 센서 성능 변화로 인해 신뢰성 있게 효율적으로 활용될 수 없다. 예컨대, 플라스미드-기반 라이신 센서 시스템으로 스크리닝된 이콜라이(E. coli) 돌연변이체의 화학적으로 돌연변이를 일으킨 라이브러리와 같이 돌연변이체를 통한 센서 반응 변화가 제시되었다(Binder et al., Genome Biology, 13(R40), 1-12, 2012).
센서 성능은 생산 및 감지 기능을 분리시킴으로써 복원될 수 있다. 예를 들어, 하나의 균주가 생산 전용이고 다른 하나가 감지용인 경우 두 균주를 함께 공배양하면, 게놈 변이가 생산 수준을 변경시킬 수 있는 한편 각 비변형된 센서 균주는 생산자에 의해 생성된 수준을 생산시키는 강인한 반응을 제공한다. 그러나, 이것을 행하기 위해서는, 스크리닝되고 있는 조작된 생산자 균주의 각각은 고유한 성장 용기에서 센서 균주로 성장되어야 하며, 이는 106개 초과의 고유한 구성원을 가진 생산자 균주 라이브러리를 이용할 경우 문제가 된다.
다른 상황에서(예컨대, 보급 가능하거나 또는 활발하게 수출되는 제품으로 작업할 경우에), 조작된 생산자 균주는 집단에서 더 양호한 생산자와 비생산자의 혼선을 회피하기 위하여 격리된 상태에서 성장되고 스크리닝되어야 한다. 예를 들어, 높은 양 또는 낮은 양의 나린게닌(naringenin)을 생산하고 GFP-기반 나린게닌 센서 시스템으로 형질전환된(transformed) 생산자의 두 균주를 공배양하는 것은 생산 단계 후에 높은 그리고 낮은 GFP-기반 형광을 입증하는 두 하위집단을 생산해야 한다. 그러나, 생산 후에, 단지 하나의 중간 형광 집단만이 보이는데, 이는 각 세포의 개별적인 생산 총계보다 오히려 전체 집단을 통해 확산된 산물의 벌크 수준에 대한 반응을 시사한다(실시예 2, 도 3). 실제 선택 시에, 이 집단의 평균화 또는 혼선은 더 높은 생산을 갖는 조작된 균주를 나머지 집단으로부터 식별하는 연구원의 능력을 방해할 것이다. 이 문제를 극복하기 위해서는 그 자체 성장 용기 내에서 각 조작된 균주의 고유한 구획화를 추가로 필요로 한다.
따라서, 조작된 산물 생산 세포를 검출하고 농축시키기 위한 개선된 방법 및 시스템이 필요하다.
본 기술은 조작된 센서 기술을 이용해서 벌크-혼합되거나 또는 미세유체 방식으로-생성된 액적(bulk-mixed or microfluidically-generated droplet) 내에 조작된 생산자 균주(즉, 세포)의 개선된 성장 및 선택을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 미세유체 방식으로 생성된 액적은 대규모로 조작된 균주에 대해서 균일한 격리된 성장 용기를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 20㎑ 미만(예컨대, 약 20㎑ 미만, 또는 약 15㎑ 미만, 또는 약 10㎑ 미만, 또는 약 5㎑ 미만)에서 생성되어, 매초 2,000 내지 5,000(예컨대, 약 2,000, 또는 약 2,500, 또는 약 3,000, 또는 약 3,500, 또는 약 4,000, 또는 약 4,500, 또는 약 5,000)개의 고유한 생산자 균주의 캡슐화를 허용하며, 이는 5천억개의 고유한 생산자 균주/미세유체 디바이스/일(day)의 스크리닝을 가능하게 한다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여, 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독(readout)을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수(recovering)하는 단계를 포함하되, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단이다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계; 생산자 세포를 함유하는 각 액적을 조작된-단백질 기반 센서 세포(engineered-protein based sensor cell)를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 병합된 액적을 분류(sorting)하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 각각의 액적은 플루오린화계(fluorinated-based) 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 각각의 액적은, (a) 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 그리고 (b) 조작된 센서 세포를 포함하고, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 생산자 세포를 함유하는 각 액적을 조작된-단백질 기반 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 조작된 생산자 세포를 함유하는 각각의 액적을 조작된 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자에 대한 수준에 대해서 병합된 액적을 검증하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 검증하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하고; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포로부터의 풀로부터 각각의 조작된 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성하는 단계로서, 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하고; 각각의 액적은 (a) 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 그리고 (b) 조작된 센서 세포를 포함하며, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 상기 액적을 형성하는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하고; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 조작된 생산자 세포를 함유하는 각각의 액적을 조작된 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자에 대한 수준에 대해서 병합된 액적을 검증하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 검증하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 조성물 및 방법에 관한 것으로, 여기서 각각의 조작된 생산자 세포는 또한 표적 분자의 생산을 보고하고 검정하기 위한 조작된 센서 시스템을 함유하고, 센서 시스템은 게놈 내에 또는 플라스미드 상에 체류할 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은, 조작된 생산자 균주에 의한 표적 분자의 생산에 대해 보고하는 별도의 조작된 센서 균주(즉, 세포)의 존재하에 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검증하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 각종 실시형태에 있어서, 조작된 센서 균주는 표적 분자를 검출할 수 있는 센서 시스템을 잠복시킨다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적을 조작된 센서 시스템(예컨대, 세포-기반 센서 시스템 또는 시험관내 센서 시스템)을 함유하는 제2 보고 액적과 병합함으로써 생산 수준을 검정하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 각종 실시형태에 있어서, 조작된 센서 균주는 표적 분자를 검출할 수 있는 aTF 센서를 잠복시킨다.
다른 양상에 있어서, 본 기술은 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 방법에 관한 것으로, 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 각각의 조작된 생산자 세포는 표적 분자의 생산을 보고하고 인터로게이팅(interrogating)하기 위한 조작된 센서 플라스미드를 추가로 함유한다. 각종 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 유기 오일, 플루오린화 오일, 플루오린화 중합체, 플루오로카본 중 물 에멀션(water-in fluorocarbon emulsion), 퍼플루오로카본 중 물 에멀션(water-in perfluorocarbon emulsion), 또는 이들의 조합물이다. 각종 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 입자에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 변형된 실리카 나노입자(예컨대, 부분 플루오린화 나노입자, 또는 부분 소수성 나노입자)이다. 각종 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다. 각종 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 실리카-기반 나노입자이다. 각종 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다.
다른 양상에 있어서, 본 기술은 조작된 생산자 균주에 의해 표적 분자의 생산에 대해 보고하는 별도의 조작된 센서 균주의 존재하에 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 방법에 관한 것으로, 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 각각의 액적은 조작된 센서 세포를 포함한다. 각종 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 유기 오일, 플루오린화 오일, 플루오린화 중합체, 플루오로카본 중 물 에멀션, 퍼플루오로카본 중 물 에멀션, 또는 이들의 조합물이다. 각종 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 입자에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 변형된 실리카 나노입자(예컨대, 부분 플루오린화 나노입자, 또는 부분 소수성 나노입자)이다. 각종 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다. 각종 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 실리카-기반 나노입자이다. 각종 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 액적내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고(여기서 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸여 있음), 이어서, 조작된 센서 시스템을 함유하는 제2 보고 액적과 병합함으로써 산물 생산 수준을 검정하는 방법에 관한 것이다. 각종 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 유기 오일, 플루오린화 오일, 플루오린화 중합체, 플루오로카본 중 물 에멀션, 퍼플루오로카본 중 물 에멀션, 또는 이들의 조합물이다. 각종 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 입자에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 변형된 실리카 나노입자(예컨대, 부분 플루오린화 나노입자, 또는 부분 소수성 나노입자)이다. 각종 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다. 각종 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 실리카-기반 나노입자이다. 각종 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 양상 또는 실시형태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양상 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
도 1A 내지 도 1D는 내인성으로 적용된 나린게닌에 반응해서 3개의 MAGE-조작된 이콜라이 MG1655 돌연변이체에 대한 TtgR 센서 반응 변동을 도시한 그래프이다.
도 2a 내지 도 2d는 이들 각각의 동족 리간드에 반응해서 4개의 상이한 알로스테릭 전사 인자(TtgR(도 2a), TetR(도 2b), PcaV(도 2c) 또는 QacR(도 2d))에 의해 조절된 gfp를 잠복시키는 3가지 MAGE-조작된 이콜라이 MG1655 돌연변이체에 대한 센서 반응 변동을 도시한 그래프이다.
도 3은 생산 균주에 대한 확산에 의한 간섭을 나타낸 그래프이다. 높은 나린게닌-생산 균주(적색) 및 낮은 나린게닌-생산 균주(청색)는 함께 배양된 경우(오렌지색) 평균화된 센서 반응을 도시한다.
도 4A 및 도 4B는 스크리닝에 대한 실행 가능한 전략으로서 생산자 세포와 센서 세포의 공배양을 도시한 그래프이다. 도 4A: 센서 세포는 공배양된 생산 세포에 의해 생산된 나린게닌에 반응하여 나린게닌-의존적 성장 및 gfp 생산을 도시한다(적색: 비-생산자 + 센서 세포, 청색: 낮은-생산자 + 센서 세포, 오렌지색: 높은-생산자 + 센서 세포). 도 4B: 액적에서 공배양된 센서 세포 및 비-생산자 세포(적색) 또는 높은-생산자 세포(오렌지색)는 용이하게 구별 가능한 분포를 도시한다.
도 5a 내지 도 5d는 나린게닌 생산을 위한 액적 공배양 시험을 도시한 이미지이다. 각종 센서 및 생산자 세포와 공배양액에서의 GFP 생산의 형광 현미경 분석. 도 5a: 센서 세포 및 비-생산자 세포. 도 5b: 센서 세포 및 낮은-생산자 세포. 도 5c: 센서 세포 및 높은-생산자 세포. 도 5d: 500μM 나린게닌에 캡슐화된, TtgR-기반 센서 시스템을 이용해서 나린게린에 반응하여 GFP를 생산하는, 플라스미드를 잠복시키는 K12 센서 세포. 각각의 형광 화소는 나린게닌에 반응하여 생산된 GFP를 갖는 액적 내의 박테리아이다.
도 6은 24시간 동안 공동-인큐베이팅된 두 세트의 액적의 형광을 나타낸 이미지이다. 제1 세트의 액적은 500μM 나린게닌을 함유하였고 제2 세트의 액적은 나린게닌 센서 세포를 함유하였다. 확산이 액적 간에 일어난다면, 센서 세포는 24시간 기간에 걸쳐서 형광성으로 될 것이다.
도 7은 생산자 또는 비-생산자 세포와 센서 균주와의 혼합물로 인큐베이션 후의 이중 에멀션을 도시한 현미경 이미지를 나타낸다.
도 8A 내지 도 8C는 센서 및 비 생산자 세포(도 8A); 센서 및 생산자 세포(도 8B); 또는 비-생산자 세포 또는 생산자 세포를 가진 센서 세포(도 8C)로 제조된 이중 에멀션 액적의 FACS 분석을 도시한 그래프이다.
도 9A 내지 도 9C는 액적 내에 생산자 세포를 성장시키는 집단 내 확산의 저지를 도시한 그래프이다. 도 9A: 액적에서 성장될 경우 낮은 나린게닌 생산자 균주로부터 생성된 형광의 FACS 분포. 도 9B: 액적에서 성장될 경우 높은 나린게닌 생산 균주로부터 생성된 형광의 FACS 분포. 도 9C: 액적에서 성장될 경우 낮은 생산자 균주들의 혼합물의 형광의 FACS 분포. 각 액적은 단지 두 생산자 균주에 의한 단일 액적의 점유를 방지하기 위하여 성장 및 생산의 시작 시에 단일 생산자 세포를 함유한다.
도 10은, 확산을 없애기 위하여 액적 내 인큐베이션 후의, 경로 음성 대조군 2E6 pNARnull　pSENSORGFP로부터 높은 나린게닌-생산 균주 2E6 pNARhigh pSENSORGFP의 농축을 입증하는 그래프를 도시한다.
도 11은 "세포 내 센서"를 가진 낮은- 대 높은-생산자의 액적 캡슐화를 도시한 이미지이고, 여기서 동일 세포는 리간드와 센서 생산 둘 다를 전담하며, 형광(녹색) 판독 강도(높 생산자 세포에서, 우측)는 생산된 리간드의 농도와 연관된다.
도 12는 액적 시스템에서 낮은- 또는 높은-생산자로 캡슐화된 "공배양 센서 세포"의 시스템을 나타낸 이미지이다. 여기서, 단지 비-생산 세포는 센서 판독에 기여하여, 세포 생산에 대한 부담을 저감시키며, 여기서 형광(녹색) 판독 강도(높은 생산자 세포에서, 좌측)는 생산된 리간드의 농도와 연관된다.
도 13은 Δptsi::kanR pSENSORGFP-Ptsi 센서 균주에 의한 액적 공배양 전략을 이용해서 낮은 경로 대조군 2E6 pNARlow로부터 높은 나린게닌-생산 균주 2E6 pNARhigh의 농축을 도시한 이미지이다.
도 14A, 도 14B, 도 14C, 도 14D 및 도 14E는 FACS를 이용해서 유리 이콜라이를 오염시키는 회피하도록 이중 에멀션 WOW 액적을 분류하는 데이터를 나타낸다.
도 15는 이중 에멀션 액적을 만들어 FACS를 이용해서 밝은 생산자와 어두운 비-생산자 간에 구별하는 데이터를 나타낸다.
도 16은 현미경을 이용해서 피커링 에멀션(Pickering emulsion) 내에 형광 이콜라이의 성장 및 검출을 나타낸 이미지이다.
일 양상에 있어서, 본 기술은 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 방법에 관한 것으로, 여기서 각각의 조작된 생산자 세포는 표적 분자의 생산을 보고하고 인터로게이팅하기 위한 조작된 센서 시스템을 추가로 함유한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는, 제한되지 않지만, 다중 자동화 게놈-공학(Multiplexed Automated Genome Engineering: MAGE)과 같은 게놈 다양화 기법(genomic diversifying technology)을 통해서, 또는 플라스미드-기반 생산 변이(예컨대, 효소 동족체의 생물탐색, 프로모터 변이 등)에 의해, 또는 비-GMO 방법, 또는 생산 다양성을 생성하는 임의의 기타 메커니즘에 의해 생성된다. 국제 특허 공개 번호 WO 2015/017866 및 WO 2008/052101(이들의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)을 참조한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 적어도 하나의 조작된 센서 플라스미드 또는 센서 시스템으로 형질전환된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 라이브러리로부터의 조작된 생산자 균주의 풀은 아라비노스, 안하이드로테트라사이클린, 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드, 열, 광, 또는 표 1에서 발견되는 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 필요한 유도제 및 성장 배지를 함유하는 액적에서 유화된다(emulsified). 몇몇 실시형태에 있어서, 유화된 균주는 성장되고, 목적하는 산물의 생산은 고정된 시간 기간 동안 일어나 표적 분자의 생산을 가능하게 하게 균주의 산물의 축적을 초래한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 1 내지 24시간, 약 4 내지 20시간, 약 8 내지 16시간, 또는 약 10 내지 14시간이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 24 내지 72시간, 약 28 내지 68시간, 약 32 내지 64시간, 약 36 내지 60시간, 약 40 내지 56시간, 또는 약 44 내지 52시간이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 1주 또는 약 2주이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 유화된 균주는 리포터를 이용한 산물 수준의 직접 판독을 제공하는 조작된 센서 시스템을 이용한 반응을 생성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 1 ㎍/ℓ 내지 100 ㎍/ℓ, 약 10 ㎍/ℓ 내지 90 ㎍/ℓ, 약 20 ㎍/ℓ 내지 80 ㎍/ℓ, 약 30 ㎍/ℓ 내지 70 ㎍/ℓ, 약 40 ㎍/ℓ 내지 60 ㎍/ℓ 또는 약 45 ㎍/ℓ 내지 55 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 100 ㎍/ℓ 내지 1000 ㎍/ℓ, 약 200 ㎍/ℓ 내지 900 ㎍/ℓ, 약 300 ㎍/ℓ 내지 800 ㎍/ℓ, 약 400 ㎍/ℓ 내지 700 ㎍/ℓ 또는 약 500 ㎍/ℓ 내지 600 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 180 g/ℓ, 약 40 g/ℓ 내지 160 g/ℓ, 약 60 g/ℓ 내지 140 g/ℓ, 약 80 g/ℓ 내지 120 g/ℓ 또는 약 90 g/ℓ 내지 100 g/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 100 g/ℓ 내지 500 g/ℓ, 약 150 g/ℓ 내지 450 g/ℓ, 약 200 g/ℓ 내지 400 g/ℓ 또는 약 250 g/ℓ 내지 350 g/ℓ이다.
제한으로서가 아니라 예로서, 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 GFP, 또는 이하에 기재된 기타 예시적인 리포터 시스템 중 어느 하나이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 파괴되고, 세포는 FACS와 같은 적절한 분류 기술을 이용해서 분류된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 전용 액적-분류 기기를 사용해서 또는 제2 벌크수(bulk water) 에멀션의 형성을 통해, 이어서 FACS 상에서 이중 에멀션을 분류함으로써 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 생산된 산물의 수준에 따라서 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준에 따라서 분류된다. 일단 액적이 분류되면, 액적은 파괴되어 농축된 조작된 생산자 세포를 방출한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 분류된 액적으로부터의 조작된 생산자 세포의 게놈에 차세대 서열 분석을 시행한다. 다른 실시형태에 있어서, 생산자 세포의 플라스미드는 (예컨대, 플라스미드-기반 경로 생물탐색의 경우에) 서열 분석된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 생산자 균주의 성장 또는 생존능은 생성된 산물의 양에 직접 좌우되고 비례한다. 비제한적인 예로써, 일 실시형태에 있어서: 조작된 생산자 균주 라이브러리가 생성되고 조작된 센서 플라스미드로 형질전환되며; 형질전환된 조작된 생산자 균주의 풀이 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 함유하는 액적에 유화되고; 형질전환된 조작된 생산자 세포가 성장되고, 산물의 생산이 고정된 시간 기간 동안 일어나 표적 분자를 생산 가능한 세포에 대해서 산물의 축적을 초래하고; 형질전환된 조작된 생산자 세포는 증가된 속도로 성장함으로써 또는 독소에 대항하는 제제를 생산함으로써 산물의 축적에 반응하고; 이어서 성장된 살아있는 형질전환된 조작된 생산자 세포는 이어서 액적으로부터 방출되어 조작된 생산자 세포의 농축된 집단을 형성한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주는 센서 시스템을 함유한다. 비제한적인 예로써, 일 실시형태에 있어서: 조작된 생산자 균주 라이브러리가 생성되고 조작된 센서 플라스미드 상의 조작된 센서 시스템으로 형질전환되며; 형질전환된 조작된 생산자 균주의 풀이 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 함유하는 액적에 유화되고; 형질전환된 조작된 생산자 세포가 성장되고 산물의 생산이 고정된 시간 기간 동안 일어나 표적 분자를 생산 가능한 세포에 대해서 산물의 축적을 초래하고; 형질전환된 조작된 생산자 세포 내 센서 시스템은 리포터, 예컨대, GFP의 발현을 통해서 산물의 축적에 반응하고; 이어서, 조작된 생산자 세포는 액적으로부터 방출되어 FACS 상에서 분류된다.
다른 양상에 있어서, 본 기술은 조작된 생산자 균주에 의해 표적 분자의 생산에 대해 보고하는 별도의 조작된 센서 균주의 존재하에 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산 균주 라이브러리는 게놈 다양화 기법(예컨대, 제한되지 않고, CRISPR/Cas 방법, MAGE, 문헌[Farzadfard F, Lu TK. Genomically Encoded Analog Memory with Precise In vivo DNA Writing in Living 세포 집단s. Science (New York, NY). 2014; 346(6211): 1256272. doi: 10.1126/science.1256272]에 기재된 SCRIBE 방법에 관한 레트론-기반 리컴비니어링(Retron-based Recombineering) 방법(이의 내용은 전문이 참조에 의해 편입됨))을 통해서, 또는 플라스미드-기반 생산 변이(예컨대, 효소 동족체의 생물탐색, 프로모터 변이 등), 또는 생산 다양성을 생성하는 임의의 기타 메커니즘, 예컨대, 비-GMO 방법에 의해 생성된다. 예로써, 몇몇 실시형태에 있어서, 비-GMO 방법은 화학적 돌연변이유발, 방사선 조사 및 전위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 라이브러리로부터의 조작된 생산자 균주의 풀은 성장 배지, 임의의 필요한 유도제, 및 1종 이상의 조작된 센서 세포를 함유하는 액적에 유화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포가 성장되고, 산물의 생산이 고정된 시간 기간 동안 일어나 표적 분자를 생산 가능한 균주에 대해서 산물의 축적을 초래한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 센서 세포는 리포터를 이용한 산물 수준의 직접 판독을 제공하는 조작된 센서 시스템을 이용한 반응을 생성한다. 제한으로서가 아니라 예로서, 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 GFP이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 전용 액적-분류 기기의 사용을 통해서 또는 제2 벌크수 에멀션을 형성하고 나서 FACS 상에서 이중 에멀션을 분류함으로써 분류된다. 일단 액적이 분류되면, 액적은 파괴되어 농축된 조작된 생산자 세포를 방출한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 분류된 액적으로부터의 조작된 생산자 세포의 게놈에 차세대 서열 분석을 시행한다. 다른 실시형태에 있어서, 생산자 세포의 플라스미드는 (예컨대, 플라스미드-기반 경로 생물탐색의 경우에) 서열 분석된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적 내 조작된 센서 세포의 성장은 공동-캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준에 의존한다. 예로써, 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 센서는 성장에 필요한 주된 단백질의 발현을 제어한다. 이것은 생산자 세포가 표적 분자를 만드는 시간을 갖기 전에 센서 세포가 생산 영양소를 이용하는 것을 방지할 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 센서 세포는 해당 센서 세포가 생산에 필요한 영양소를 소비하는 것을 방지하기 위하여 조작된 생산자 세포 이외에 별개의 탄소 공급원을 이용하도록 조작된다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고, 이어서, 조작된 생산자 세포를 조작된 센서 시스템을 함유하는 제2 보고 액적과 병합함으로써 산물 생산 수준을 검정하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 게놈 다양화 기법(예컨대, 제한되지 않지만, MAGE)을 통해서, 또는 플라스미드-기반 생산 변이(예컨대, 효소 동족체의 생물탐색, 프로모터 변이 등)에 의해, 또는 비-GMO 방법 또는 생산 다양성을 생성하는 임의의 기타 메커니즘에 의해 생성된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 라이브러리로부터 조작된 생산자 균주의 풀은 액적에 에멀션화되고, 여기서 액적은 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 함유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 성장되고 산물 생산은 고정된 시간 기간 동안 일어나, 표적 분자를 생산할 수 있는 조작된 생산자 세포에서의 산물의 축적을 초래한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적은 리포터를 생산하는 센서 시스템(예컨대, 세포-기반 센서 시스템 또는 시험관내 센서 시스템)을 함유하는 제2 세트의 액적과 병합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 양에 비례해서 생산되고, 병합된 액적은 리포터 수준에 대해서 검정된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병합된 액적은 리포터의 그들의 발현 수준에 의해 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병합된 액적은 제2 벌크수 에멀션을 형성하고 이어서 FACS 상에서 이중 에멀션을 분류함으로써 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병합된 액적은 전용 액적-분류 기기를 사용해서 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적이 분류된 후에, 액적을 파괴하여 농축된 생산자 세포를 방출한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 분류된 액적으로부터의 조작된 생산자 세포의 게놈에 차세대 서열 분석을 시행한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 생산된 산물의 수준에 따라서 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준에 따라서 분류된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 1 ㎍/ℓ 내지 100 ㎍/ℓ, 약 10 ㎍/ℓ 내지 90 ㎍/ℓ, 약 20 ㎍/ℓ 내지 80 ㎍/ℓ, 약 30 ㎍/ℓ 내지 70 ㎍/ℓ, 약 40 ㎍/ℓ 내지 60 ㎍/ℓ 또는 약 45 ㎍/ℓ 내지 55 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 100 ㎍/ℓ 내지 1000 ㎍/ℓ, 약 200 ㎍/ℓ 내지 900 ㎍/ℓ, 약 300 ㎍/ℓ 내지 800 ㎍/ℓ, 약 400 ㎍/ℓ 내지 700 ㎍/ℓ 또는 약 500 ㎍/ℓ 내지 600 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 180 g/ℓ, 약 40 g/ℓ 내지 160 g/ℓ, 약 60 g/ℓ 내지 140 g/ℓ, 약 80 g/ℓ 내지 120 g/ℓ 또는 약 90 g/ℓ 내지 100 g/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 100 g/ℓ 내지 500 g/ℓ, 약 150 g/ℓ 내지 450 g/ℓ, 약 200 g/ℓ 내지 400 g/ℓ 또는 약 250 g/ℓ 내지 350 g/ℓ이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포는 생성된 산물의 양에 직접 비례하여 항독소를 생산하고, 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적은 생산 단계 후에 고정된 양의 독소를 갖는 액적과 개별적으로 병합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 목적하는 수준의 산물을 생산한 조작된 생산자 세포는 제2 유화를 견녀내기에 충분한 항독소를 생산할 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 짧은 인큐베이션 후에, 병합된 액적이 파괴되어, 농축된, 살아 있는, 조작된 생산자 세포 집단이 회수된다.
다른 양상에 있어서, 본 기술은 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 방법에 관한 것으로, 각각의 액적은 유기 오일, 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 각각의 조작된 생산자 세포는 표적 분자의 생산을 보고하고 인터로게이팅하기 위한 조작된 센서 플라스미드를 추가로 함유한다.
다른 양상에 있어서, 본 기술은 조작된 생산자 균주에 의한 표적 분자의 생산을 보고하는 개별의 조작된 센서 균주의 존재하에 액적내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하는 방법에 관한 것으로, 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 각각의 액적은 조작된 센서 세포를 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은, 액적 내 조작된 생산자 균주 라이브러리의 클론 구성원을 성장시키고 검정하고(여기서 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸임), 이어서, 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적을 조작된 센서 시스템을 함유하는 제2 보고 액적과 병합함으로써 산물 생산 수준을 검정하는 방법에 관한 것이다.
본 기술의 몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 유기 오일, 플루오린화 오일, 플루오린화 중합체, 플루오로카본 중 물 에멀션, 퍼플루오로카본 중 물 에멀션, 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 입자에 의해 선택적으로 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 변형된 실리카 나노입자(예컨대, 부분 플루오린화 나노입자, 또는 부분 소수성 나노입자)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 실리카-기반 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 수성상에 분산된 수-비혼화성 액체를 포함하는 피커링 에멀션(예컨대, 수중유(o/w) 에멀션)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 유기 오일을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수-비혼화성 액체는 오일, 또는 유기 오일(예컨대, 미네랄 오일, 옥수수유 또는 피마자유)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 연속 오일 상에 분산된 수성 액적을 포함하는 피커링 에멀션(예컨대, 유중수(water-in-oil: w/o) 에멀션)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 유기 오일을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수-비혼화성 액체는 오일, 또는 유기 오일(예컨대, 미네랄 오일, 옥수수유 또는 피마자유)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 오일 또는 유기 오일의 사슬 길이를 감소시킴으로써 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 오일 또는 유기 오일의 사슬 길이는 적어도 1개의 탄소 원자, 적어도 2개의 탄소 원자, 적어도 3개의 탄소 원자, 적어도 4개의 탄소 원자, 적어도 5개의 탄소 원자, 적어도 6개의 탄소 원자, 적어도 7개의 탄소 원자, 적어도 8개의 탄소 원자, 적어도 9개의 탄소 원자, 적어도 10개의 탄소 원자, 적어도 11개의 탄소 원자, 적어도 12개의 탄소 원자, 적어도 13개의 탄소 원자, 적어도 14개의 탄소 원자, 적어도 15개의 탄소 원자, 적어도 16개의 탄소 원자, 적어도 17개의 탄소 원자, 적어도 18개의 탄소 원자, 적어도 19개의 탄소 원자, 또는 적어도 20개의 탄소 원자만큼 감소된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 탄화수소에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 예를 들어, 에멀션은 헥사데칸, 도데칸, 데칸, 옥탄, 헵탄 및 헥산에 의해 안정화될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 예를 들어, 에멀션은 유기 오일, 예컨대, 미네랄 오일, 옥수수유 또는 피마자유에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 Tween(예컨대, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 61, Tween 65, Tween 80, Tween 81, Tween 85), Triton X-100, Triton X-114, SPAN(예컨대, SPAN 20, SPAN 40, SPAN 60, SPAN 65, SPAN 80, SPAN 85), Arlacel(예컨대, Arlacel™ P135), Atlox(예컨대, Atlox™ 4912), 비이온성 유화제, 예컨대, ABIL(예컨대, ABIL® EM 90), 세정제(detergent)(예컨대, ABIL-기반 세정제), 또는 이들의 조합물과 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 예를 들어, 에멀션은 유기 오일, 예컨대, 미네랄 오일, 옥수수유 또는 피마자유에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 단백질 안정제(예컨대, 소혈청 알부민(BSA), β-락토글로불린, β-카세인(BCN))와 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 비이온성 세정제 또는 당(sugar)(예컨대, 글루코스, 프럭토스, 락토스)과 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단백질 안정제, 비이온성 세정제 또는 당은 제2 상(예컨대, 수성, 유기 또는 액적 상)으로부터 제1 상(예컨대, 오일-기반 상)으로 유기물의 확산을 저감시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 Tween(예컨대, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 61, Tween 65, Tween 80, Tween 81, Tween 85), Triton X-100, Triton X-114, SPAN(예컨대, SPAN 20, SPAN 40, SPAN 60, SPAN 65, SPAN 80, SPAN 85), Arlacel(예컨대, Arlacel™ P135), Atlox(예컨대, Atlox™ 4912), 비이온성 유화제, 예컨대, ABIL(예컨대, ABIL® EM 90), 세정제(예컨대, ABIL-기반 세정제), 또는 이들의 조합물에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 단백질 안정제(예컨대, 소혈청 알부민(BSA), β-락토글로불린, β-카세인(BCN))에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 비이온성 세정제 또는 당(예컨대, 글루코스, 프럭토스, 락토스)에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단백질 안정제, 비이온성 세정제 또는 당은 제2 상(예컨대, 수성, 유기 또는 액적 상)으로부터 제1 상(예컨대, 오일-기반 상)으로 유기물의 확산을 저감시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 고체 입자에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고체 입자는 무기 또는 유기 입자이다. 예를 들어, 피커링 에멀션은 실리카, 탄산칼슘, 점토, 금 및 카본블랙 입자, 유기 라텍스, 전분, 하이드로겔 및 공중합체 입자에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 단백질, 박테리아 및 포자 입자에 의해 안정화된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 고체 입자에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 변형된 실리카 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 실리카 나노입자는 부분 플루오린화 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 실리카 나노입자는 부분 소수성 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 실리카-기반 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 두 비혼화성 간의 계면에 축적된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상은 연속상이고 제2 상은 분산상이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 에멀션은 오일-기반 제1 상, 예컨대, 플루오로카본 상 또는 유기 오일, 및 제2 상(예컨대, 유기물, 수성, 액적, 탄화수소 또는 가스 상)을 포함한다. 예를 들어, 제1 상은 적어도 1종의 플루오린화된 용매를 갖는 플루오로카본 상일 수 있고, 제2 상은 플루오린화된 용매, 예컨대, 유기물, 수성, 액적, 탄화수소, 또는 가스 상일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제2 상은 수성상이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제2 상은 탄화수소 상이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상은 적어도 1종의 플루오린화된 용매를 포함하는 플루오로 상(fluorous phase)이되, 부분 플루오린화 나노입자는 플루오린화된 용매에 분산된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상은 용매에 분산된 부분 소수성 나노입자를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상(즉, 플루오로 상)은 CxFyFIzXm으로 표시되는 적어도 1종의 플루오로카본을 포함하되, 여기서 X는 임의의 원소(N 및 O를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)일 수 있고, x, y, z 및 m은 양의 정수이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상은 플루오로 상이고 HFE-7500(C9H5OF15), HFE-7600(C8H6OF12), FC-40(C21F48N2), 퍼플루오로헥산(C6F14) 및/또는 퍼플루오로메틸데칼린(PFMD 또는 C11F20)을 플루오린화된 용매로서 포함한다. 플루오린화된 용매는 특별히 제한되지 않지만, 뚜렷한 물성을 갖는 다양한 범위의 플루오린화된 화합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화된 용매는 저점도를 갖는 극성, 부분 플루오린화 용매, 예컨대, HFE-7500 및 HFE-7600과 같은 하이드로플루오로에터를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화된 용매는 고점도를 갖는 극성, 퍼플루오린화된 용매, 예컨대, FC-40을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 플루오린화된 용매는 저점도를 갖는 비극성, 퍼플루오린화된 용매, 예컨대, C6F14를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화된 용매는 고점도를 갖는 비극성 퍼플루오린화된 용매, 예컨대, PFMD를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 적어도 1종의 플루오린화된 용매를 포함하는 플루오로카본 상, 및 플루오린화된 용매와 비혼화성인 유체를 포함하는 제2 상을 포함하고, 부분 플루오린화 나노입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자)는 플루오로카본 상과 제2 상의 계면에 흡착된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 제1 상과 비혼화성인 유체를 포함하는 제1 및 제2 상을 포함하고, 부분 소수성 나노입자(예컨대, 실리카-기반 소수성 나노입자)는 제1 상과 제2 상의 계면에 흡착된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 연속 플루오로카본 상, 및 연속 플루오로카본 상에 분산된 적어도 1종의 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상 액적, 또는 적어도 하나의 가스 상 버블을 포함하는 제2 상을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 연속 플루오로카본 상 및 수성상을 포함하고, 또는 에멀션은 연속 플루오로카본 상 및 유기 상을 포함하거나, 또는 에멀션은 연속 플루오로카본 상 및 탄화수소 상을 포함하거나, 또는 에멀션은 연속 플루오로카본 상 및 가스 상을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 연속 탄화수소 상, 및 연속 탄화수소 상에 분산된 적어도 하나의 플루오로카본 상 액적을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자)는 제1 상, 예컨대, 플루오로카본 상과, 수성 또는 유기 유체, 또는 탄화수소 상일 수 있는 제2 상의 계면에서 흡착된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부분 소수성 나노입자(예컨대, 실리카-기반 소수성 나노입자)는 제1 상과, 수성 또는 유기 유체, 또는 액적, 또는 탄화수소 상일 수 있는 제2 상의 계면에서 흡착된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 여러 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 피커링 에멀션은, 친수성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 분산 상에 도입하는 한편, F-SiO2 나노입자(NP)를 연속상에 사전 분산시킴으로써 변형될 수 있다. 액적이 발생됨에 따라서, F-SiO2 NP는 물-오일 계면에 흡착되고, 친수성 중합체는 액적 내로부터 F-SiO2 NP의 표면 상에 흡착된다. 예를 들어, PEG가 흡착된 부분 플루오린화 실리카 나노입자는 본 명세서에서 "PEGads-F-SiO2NP"라 지칭된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 친수성 중합체가 공유 접합된 입자는 연속상에 분산될 수 있다. 예를 들어, PEG가 공유 접합된 부분 플루오린화 실리카 나노입자는 본 명세서에서 "PEG공유-F-SiO2NP"라 지칭된다. 피커링 에멀션의 다른 변형은 부분 플루오린화 입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자) 상에 친수성 중합체가 공유 접합되는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 친수성 중합체는 부분 플루오린화 입자 상에 공유 접합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 친수성 중합체는 부분 플루오린화 입자에 공유 접합되지 않는다.
본 개시내용의 몇몇 실시형태에 있어서, 친수성 중합체는 PEG이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 친수성 중합체는 고분자 전해질 및 비이온성 중합체, 예컨대, 동종중합체(예컨대, 폴리에터, 폴리아크릴아마이드(PAM), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리(아크릴산), 폴리메타크릴레이트 및 기타 아크릴 중합체, 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(비닐피롤리돈)(PVP)) 및 블록 공중합체를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 연속 플루오로카본 상, 및 수성상을 포함하는 제2 상을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수성상은 계면에서 부분 플루오린화 입자에 흡착된 적어도 1종의 친수성 중합체를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수성상 액적은 계면에서 부분 플루오린화 나노입자에 흡착된 적어도 1종의 친수성 중합체, 예컨대, PEGads-F-SiO2NP 또는 PEG공유-F-SiO2NP를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제2 상(예컨대, 수성상)은 약 0.01 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 0.02 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 0.05 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 0.1 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 0.2 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 0.5 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 1 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 2 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 5 ㎎/㎖ 이상, 또는 약 10 ㎎/㎖ 이상의 친수성 중합체(예컨대, PEG)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수성상은 액적 계면에 단백질 및 효소의 비특이적 흡착을 방지하고 이들의 활성을 유지하는 유효량의 친수성 중합체(예컨대, PEG)를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 (a) 연속 플루오로 상, (b) 연속 플루오로 상에 분산된 적어도 하나의 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상 액적, 또는 가스 버블, 및 (c) 제1 상(예컨대, 플루오로 상)과 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상의 계면에 흡착된 적어도 하나의 부분 플루오린화 입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자) 또는 부분 소수성 실리카 나노입자를 포함하되, 여기서 실리카 나노입자는 부분 플루오린화되거나 또는 부분 소수성이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자)는 우선 플루오로 상과 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상의 계면에 흡착되기 전에 플루오로 상에 분산된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 입자는 우선 플루오로 상과 수성 또는 유기 상의 계면에 흡착되기 전에 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상에 분산된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상(예컨대, 수성상)은 추가의 성분, 예컨대, 완충제, 염, 영양소, 치료제, 약물, 호르몬, 항체, 진통제, 항응고제, 항염증성 화합물, 항균성 조성물, 사이토카인, 성장 인자, 인터페론, 지질, 올리고뉴클레오타이드, 중합체, 다당류, 폴리펩타이드, 프로테아제 저해제, 세포, 핵산, RNA, DNA, 혈관수축제 또는 혈관확장제, 비타민, 미네랄 또는 안정제를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 화학적 및/또는 생물학적 반응은 수성상에서 수행된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션(예컨대, 피커링 에멀션)은 입자, 예컨대, 나노입자에 의해 캡슈화된 액체상을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 부분 플루오린화 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부분 소수성 나노입자는 실리카-기반 나노입자이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용에 기재된 나노입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자) 및 이들의 조합물은 액적 내에서 수행될 수 있는 과정을 간섭하지 않고 액적의 유착에 대해서 안정화를 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용에 기재된 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 분산 상으로부터 연속상으로 형광단 및 형광원 기재(fluorogenic substrate)(예컨대, 레조루핀(resorufin), 플루오레세인(fluorescein), 레자주린(resazurin), 4-메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone) 등)의 누설을 효과적으로 방지한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 후에 누설로부터 형광단 및 형광원 기재(예컨대, 레조루핀, 플루오레세인, 레자주린, 4-메틸움벨리페론 등)의 누설을 효과적으로 방지한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 에멀션은 미세유체에 의해 만들어진다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 에멀션은 균질화기에 의해 또는 진탕에 의해 만들어질 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 미세유체 제어는 미세유체 채널을 가진 미세유체 디바이스에 의한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자)는 미세유체 채널에 존재한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 약 50%(예컨대, 수 또는 중량에 의한), 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 나노입자는 부분 플루오린화 실리카 나노입자이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 실리카 나노입자는 나노입자의 표면 상에 공유 결합된 플루오린화 기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양친매성 입자는 입자의 표면 상에 결합된 플루오린화 탄화수소기, 예컨대, 입자의 표면에 결합된 플루오린화 알킬기를 포함한다. 예를 들어, 플루오린화 탄화수소기는 탄화수소기당 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 또는 13개 이상의 플루오린 원자로 치환된 C1-C20, C2-C20, C5-C20, C10-C20, C1-C15, C2-C15, C5-C15, C10-C15, C1-C10, C2-C10, C5-C10 및 C5-C8 탄화수소기를 포함한다. 기타 유형의 할로겐화 탄화수소기는 또한 입자의 표면에 결합될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양친매성 입자는 적어도 하나의 부분 플루오린화 또는 퍼플루오린화 알킬-실란으로 부분 유도체환된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양친매성 입자는 선형 탄소 사슬을 포함하는 적어도 하나의 부분 플루오린화 또는 퍼플루오린화 알킬-실란으로 부분 유도체화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양친매성 입자는 표면 상에 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸트라이에톡시실란(FAS)으로 부분 유도체화된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 실리카 나노입자는 입자의 표면 상에 공유 결합된 플루오린화 기에 부가해서 또는 이를 대신해서 친수성 기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양친매성 입자는 입자의 표면 상에 공유 결합된 아민기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 실리카 나노입자는 -OH, -COOH, -NH2, -CxHy, -SO3H, 형광단, 예컨대, 플루오레세인, 로다민, 매크로분자, 예컨대, 바이오틴, 스트렙타비딘 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 입자의 표면 상에 공유 결합된 기타 화학기를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 부분 플루오린화 또는 부분 소수성 실리카 나노입자에 부가해서, 작용성 표면을 갖고 양친매성을 부여할 수 있는 기타 입자는 또한 본 명세서에 개시된 기술의 실시형태와 양립 가능하며, 예를 들어, 이러한 입자는 귀금속, 반도체 또는 유기 중합체로 만들어진 것들을 포함한다. 실리카는 하나의 바람직한 선택지인데, 그 이유는 이것이 다목적 표면 기능을 갖고 경제적, 생체적합성 및 광학적으로 불활성이기 때문이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는, 게놈 다양화 기법, 예컨대, 제한 없이, CRISPR/Cas 방법, 다중 자동화 게놈-공학(MAGE)을 통해, 또는 플라스미드-기반 생산 변이(예컨대, 효소 동족체의 생물탐색, 프로모터 변이 등)에 의해, 또는 비-GMO 방법에 의해, 또는 생산 다양성을 생성하는 임의의 기타 메커니즘, 제안 없이, 화학적 돌연변이유발, 방사선 조사 및 전위에 의해 발생된다. See 국제 특허 공개 번호 WO 2015/017866 및 WO 2008/052101을 참조하며, 이들의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 편입된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는, 적어도 하나의 조작된 센서 시스템으로, 예컨대, 플라스미드 상에 형질전환되거나, 또는 게놈에 통합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 라이브러리로부터의 조작된 생산자 균주의 풀은 성장 배지, 및 아라비노스, 안하이드로테트라사이클린, 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드, 열, 광, 또는 표 1에서 발견되는 화합물(표적 분자 특성)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 필요한 유도제를 함유하는 액적에서 유화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 유화된 균주는 성장되고, 목적하는 산물이 고정된 시간 기간 동안 일어나, 표적 분자를 생산 가능한 균주에 대해서 산물의 축적을 초래한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 1 내지 24시간, 약 4 내지 20시간, 약 8 내지 16시간, 또는 약 10 내지 14시간. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 24 내지 72시간, 약 28 내지 68시간, 약 32 내지 64시간, 약 36 내지 60시간, 약 40 내지 56시간, 또는 약 44 내지 52시간이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 고정된 시간 기간은 약 1주 또는 약 2주이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적 내 조작된 센서 세포의 성장은 공동-캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준에 따라 좌우된다. 예로써, 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 센서는 성장에 필요한 주된 단백질의 발현을 제어한다. 이것은 생산자 세포가 표적 분자를 만드는 시간을 갖기 전에 센서 세포가 생산 영양소를 이용하는 것을 방지할 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 센서 세포는 해당 센서 세포가 생산에 필요한 영양소를 소비하는 것을 방지하기 위하여 조작된 생산자 세포 이외에 별개의 탄소 공급원을 이용하도록 조작된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 센서 세포는 리포터를 이용한 산물 수준의 직접 판독을 제공하는 조작된 센서 시스템을 이용한 반응을 생성한다. 제한으로서가 아니라 예로서, 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 GFP이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포는, 생산자 균주 라이브러리가 생산되기 전 또는 후에, 플라스미드 상에 또는 게놈 내에 체류하는 리포터를 생산하는 센서 시스템으로 형질전환되었다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은, 몇몇 기타 화학물질에 의한 유도에 의해 또는 유도 없이 본 명세서에 기재된 바와 같은 고정된 시간 기간 후에 파괴되고, 생산자 세포는 목적하는 표적 분자의 더 높은 생산자에 대해서 단리되거나 풍부하도록 FACS 상에 분류된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 전용 액적-분류 기기의 사용을 통해서 또는 제2 벌크수 에멀션을 형성하고 나서 FACS 상에서 이중 에멀션을 분류함으로써 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 생산된 산물의 수준에 따라서 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준에 따라서 분류된다. 일단 액적이 분류되면, 액적은 파괴되어 농축된 조작된 생산자 세포를 방출한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 분류된 액적으로부터의 조작된 생산자 세포의 게놈에 차세대 서열 분석을 시행한다. 다른 실시형태에 있어서, 생산자 세포의 플라스미드는 (예컨대, 플라스미드-기반 경로 생물탐색의 경우에) 서열 분석된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적은 리포터를 생산하는 센서 시스템(예컨대, 세포-기반 센서 시스템 또는 시험관내 센서 시스템)을 함유하는 제2 세트의 액적과 병합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 양에 비례해서 생산되고, 병합된 액적은 리포터 수준에 대해서 검정된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병합된 액적은 리포터의 그들의 발현 수준에 의해 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병합된 액적은 제2 벌크수 에멀션을 형성하고 이어서 FACS 상에서 이중 에멀션을 분류함으로써 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병합된 액적은 전용 액적-분류 기기를 사용해서 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적이 분류된 후에, 액적을 파괴하여 농축된 생산자 세포를 방출한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 분류된 액적으로부터의 조작된 생산자 세포의 게놈에 차세대 서열 분석을 시행한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 생산된 산물의 수준에 따라서 분류된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준에 따라서 분류된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 1 ㎍/ℓ 내지 100 ㎍/ℓ, 약 10 ㎍/ℓ 내지 90 ㎍/ℓ, 약 20 ㎍/ℓ 내지 80 ㎍/ℓ, 약 30 ㎍/ℓ 내지 70 ㎍/ℓ, 약 40 ㎍/ℓ 내지 60 ㎍/ℓ 또는 약 45 ㎍/ℓ 내지 55 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 100 ㎍/ℓ 내지 1000 ㎍/ℓ, 약 200 ㎍/ℓ 내지 900 ㎍/ℓ, 약 300 ㎍/ℓ 내지 800 ㎍/ℓ, 약 400 ㎍/ℓ 내지 700 ㎍/ℓ 또는 약 500 ㎍/ℓ 내지 600 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 180 g/ℓ, 약 40 g/ℓ 내지 160 g/ℓ, 약 60 g/ℓ 내지 140 g/ℓ, 약 80 g/ℓ 내지 120 g/ℓ 또는 약 90 g/ℓ 내지 100 g/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 캡슐화된 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 산물의 목적하는 수준은 약 100 g/ℓ 내지 500 g/ℓ, 약 150 g/ℓ 내지 450 g/ℓ, 약 200 g/ℓ 내지 400 g/ℓ 또는 약 250 g/ℓ 내지 350 g/ℓ이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 유화된 균주는 리포터를 이용한 산물 수준의 직접 판독을 제공하는 조작된 센서 시스템을 이용한 반응을 생성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 1 ㎍/ℓ 내지 100 ㎍/ℓ, 약 10 ㎍/ℓ 내지 90 ㎍/ℓ, 약 20 ㎍/ℓ 내지 80 ㎍/ℓ, 약 30 ㎍/ℓ 내지 70 ㎍/ℓ, 약 40 ㎍/ℓ 내지 60 ㎍/ℓ 또는 약 45 ㎍/ℓ 내지 55 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 100 ㎍/ℓ 내지 1000 ㎍/ℓ, 약 200 ㎍/ℓ 내지 900 ㎍/ℓ, 약 300 ㎍/ℓ 내지 800 ㎍/ℓ, 약 400 ㎍/ℓ 내지 700 ㎍/ℓ 또는 약 500 ㎍/ℓ 내지 600 ㎍/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 1 g/ℓ 내지 200 g/ℓ, 약 20 g/ℓ 내지 180 g/ℓ, 약 40 g/ℓ 내지 160 g/ℓ, 약 60 g/ℓ 내지 140 g/ℓ, 약 80 g/ℓ 내지 120 g/ℓ 또는 약 90 g/ℓ 내지 100 g/ℓ이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 산물 수준의 직접 판독은 약 100 g/ℓ 내지 500 g/ℓ, 약 150 g/ℓ 내지 450 g/ℓ, 약 200 g/ℓ 내지 400 g/ℓ 또는 약 250 g/ℓ 내지 350 g/ℓ이다.
제한으로서가 아니라 예로서, 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 GFP 또는 이하에 기재된 기타 예시적인 리포터 시스템 중 임의의 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적이 파괴되고, 세포는 FACS와 같은 적절한 분류 기술을 이용해서 분류된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포는 생성된 산물의 양에 직접 비례하여 항독소를 생산하고, 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적은 생산 단계 후에 고정된 양의 독소를 갖는 액적과 개별적으로 병합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 목적하는 수준의 산물을 생산한 조작된 생산자 세포는 제2 유화에 견디는데 충분한 항독소를 생산할 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 짧은 인큐베이션 후에, 병합된 액적이 파괴되고, 농축된, 생존 가능한, 조작된 생산자 세포 집단이 회수된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 생산자 균주의 성장 또는 생존은 생성된 산물의 양에 직접 좌우되고 비례한다. 비제한적인 예로써, 일 실시형태에 있어서: 조작된 생산자 균주 라이브러리가 생성되고 조작된 센서 플라스미드로 형질전환되며; 형질전환된 조작된 생산자 균주의 풀이 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 함유하는 액적에 유화되고; 형질전환된 조작된 생산자 세포가 성장되고 산물의 생산이 고정된 시간 기간 동안 일어나 표적 분자를 생산 가능한 세포에 대해서 산물의 축적을 초래하고; 형질전환된 조작된 생산자 세포는 증가된 속도로 성장함으로써 또는 독소에 대항하는 제제를 생산함으로써 산물의 축적에 반응하고; 이어서 성장된 살아있는 형질전환된 조작된 생산자 세포는 이어서 액적으로부터 방출되어 조작된 생산자 세포의 농축된 집단을 형성한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서가 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 조작된 생산자 세포를 함유하는 각각의 액적을 조작된 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자에 대한 수준에 대해서 병합된 액적을 검증하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 검증하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하고; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하고; 각 액적은 (a) 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 그리고 (b) 조작된 센서 세포를 포함하고, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 조작된 생산자 세포는 단백질 센서에 의해 활성화되거나 또는 억제되는 리포터 및 목적하는 표적 분자를 위한 조작된 단백질-기반 센서를 포함하고; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 조작된 생산자 세포를 함유하는 각각의 액적을 조작된 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자에 대한 수준에 대해서 병합된 액적을 검증하는 단계로서, 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 검증하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 회수는, (a) 액적을 파괴하는 것, (b) 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및 (c) 성장 배지상에서 생산자 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 분류하는 것은 형광 활성화 액적 분류(fluorescence activated droplet sorting: FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 회수는, (a) 상기 액적을 분류하는 것, (b) 분류된 액적을 파괴하는 것, 및 (c) 성장 배지 상에 파괴된 액적을 평판 배양하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 분류하는 것은 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 액적을 파괴하는 것은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 액적을 파괴하여 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키는 단계를 포함하되, 여기서 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 에피솜으로(episomally) 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 플라스미드 상에 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 상기 생산자 세포의 게놈에 통합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서는 생산자 세포 내에 형질주입(transfect), 형질도입(transduce), 형질전환(transform)되거나 또는 되었거나 또는 다르게는 이용 가능하게 만들거나 또는 만들어진 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 센서-기반 단백질에 의해 차례로 활성화되는 검출 가능한 마커를 암호화하는 유전자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 마커는 효소 또는 선택 가능한 마커이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 효소는 lacZ, 루시페라제(luciferase) 또는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 영양요구체, 항생제, 내성 마커(resistance marker), 독소, 또는 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 형광 단백질. 몇몇 실시형태에 있어서, 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물은 분광법 또는 분광측정법에 의해 검출된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터를 암호화하는 유전자는 에피솜으로 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터를 암호화하는 유전자는 플라스미드 상에 에피솜으로 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터를 암호화하는 유전자는 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 유전자와 동일한 플라스미드 상에 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 게놈에 통합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 조작된 생산자 세포의 풀이 취해지는 조작된 생산자 균주 라이브러리를 생산하는 단계를 더 포함하되, 여기서 조작된 생산자 균주 라이브러리는 하나 이상의 표적 분자를 생산하도록 조작된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 조작된 센서 플라스미드로 조작된 생산자 세포의 풀을 형질전환시키기 전에 생산된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 조작된 센서 플라스미드로 조작된 생산자 세포의 풀을 형질전환시킨 후에 생산된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 생산자 세포 내에서 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 공동-캡슐화된 센서 세포 내에서 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 개별의 액적에 캡슐화되는 센서 세포 내에서 암호화되고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 상기 액적과 병합된다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 액적 내 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하여 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 액적에 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계; 생산자 세포를 함유하는 각 액적을 조작된-단백질 기반 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계; 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 각각의 액적은, (a) 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 그리고 (b) 조작된 센서 세포를 포함하고, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 액적을 형성시키는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서; 각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계; 생산자 세포를 함유하는 각 액적을 조작된 단백질-기반 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계; 표적 분자의 수준에 대해서 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계; 병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및 생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 생산자 세포 내에서 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 공동-캡슐화된 센서 세포 내에서 암호화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 개별의 액적에 캡슐화되는 센서 세포 내에서 암호화되고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 액적과 병합된다.
조작된 센서 균주/세포
위에서 기재된 조작된 센서 균주(또는 세포)는 적어도 하나의 조작된 단백질 센서를 발현하도록 형질전환된 균주 또는 세포(예컨대, 박테리아, 효모, 조류(algal), 식물, 곤충, 또는 포유류(인간 또는 비-인간) 균주 또는 세포)를 지칭한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "조작된 단백질 센서"는 표적에 결합하여 표적의 검출을 허용하는 알로스테릭 단백질(예컨대, 센서)를 지칭하며, 여기서 알로스테릭 단백질은 변형된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알로스테릭 단백질은 하나 이상 돌연변이에 의해 변형된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 비-전사 인자(비-TF) 센서이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 균주(또는 세포)는 조작된 단백질 센서(예컨대, 조작된 센서 플라스미드)를 암호화하는 플라스미드에 의해 형질전환된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 전사 인자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 전사 인자는 알로스테릭 전사 인자(aTF)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 세포적으로 또는 무세포적으로 표적 분자의 검출을 허용한다.
조작된 단백질 센서를 설계하고 제조하는 방법은 PCT 출원 번호: PCT/US2017/047009 및 PCT/US2017/047012 및 국제 특허 공개 번호: WO2015/127242 및 WO/2016/168182에 기재되어 있고, 이들의 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 편입된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 aTF, 예를 들어, 진핵생물 aTF이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 원핵생물 전사 조절 패밀리, 예컨대, LysR, AraC/XylS, TetR, LuxR, Lacl, ArsR, MerR, AsnC, MarR, NtrC(EBP), OmpR, DeoR, 저온 충격(Cold shock), GntR, 및 Crp 패밀리의 구성원의 조작된 버전이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 원핵생물 전사 조절 패밀리의 조작된 버전, 예컨대, AbrB, AlpA, AraC, ArgR, ArsR, AsnC, BetR, Bhl, CitT, CodY, ComK, Crl, Crp, CsoR, CtsR, DeoR, DnaA, DtxR, Ecf, FaeA, Fe_dep_repress, FeoC, Fis, FlhC, FlhD, Fur, GntR, GutM, Hns, HrcA, HxIR, IcIR, KorB, Lad, LexA, Lsr2, LuxR, LysR, LytTR, MarR, MerR, MetJ, Mga, Mor, MtIR, NarL, NtrC, OmpR, PadR, Prd, PrrA, PucR, PuR, Rok, Ros_MucR, RpiR, RpoD, RpoN, Rrf2, RtcR, Sarp, SfsA, SinR, SorC, SpoOA, TetR, TrmB, TrpR, WhiB, Xre, YcbB, 및 YesN 패밀리의 구성원이다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 수용체의 TetR 패밀리의 구성원의 조작된 버전, 예컨대, AcrR, ActlI, AmeR AmrR, ArpR, BpeR, EnvR E, EthR, HydR, IfeR, LanK, LfrR, LmrA, MtrR, Pip, PqrA, QacR, RifQ, RmrR, SimReg, SmeT, SrpR, TcmR, TetR, TtgR, TtgW, UrdK, VarR, YdeS, ArpA, Aur1B, BarA, CalR1, CprB, FarA, JadR, JadR2, MphB, NonG, PhlF, TylQ, VanT, TarA, TylP, BM1P1, Bm1P1, Bm3R1, ButR, CampR, CamR, CymR, DhaR, KstR, LexA-유사, AcnR, PaaR, Psbl, ThlR, UidR, YDH1, Betl, McbR, MphR, PhaD, Q9ZF45, TtK, Yhgd 또는 YixD, CasR, IcaR, LitR, LuxR, LuxT, OpaR, Orf2, SmcR, HapR, Ef0113, HlyllR, BarB, ScbR, MmfR, AmtR, PsrA 및 YjdC이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 리간드 및 DNA 둘다에 직접 결합하거나 단백질 캐스케이드를 통해서 작용하는 2-성분 또는 하이브리드 2-성분 시스템의 조작된 버전이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 진핵생물 aTF이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 RovM(예르시니아 슈도투버클로시스(Yersinia pseudotuberculosis)), HcaR(아시네토박터(Acinetobacter)), BlcR(아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)), HetR(아나베나 종(Anabaena spp.)), HetR(아나베나 종), DesR(비. 서브틸리스(B. subtilis)), HylllR(바실러스 세레우스(Bacillus cereus)), PlcR(바실러스 세레우스), CcpA(바실러스 메가테륨(Bacillus megaterium)), YvoA(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), AhrR(바실러스 서브틸리스), MntR(바실러스 서브틸리스), GabR(바실러스 서브틸리스), SinR(바실러스 서브틸리스), CggR(바실러스 서브틸리스), FapR(바실러스 서브틸리스), OhrR(바실러스 서브틸리스), PurR(바실러스 서브틸리스), Rrf2(바실러스 서브틸리스), BmrR(바실러스 서브틸리스), CcpN 억제제(바실러스 서브틸리스), TreR(바실러스 서브틸리스), CodY(바실러스 서브틸리스), yfiR(바실러스 서브틸리스), OhrR(바실러스 서브틸리스), Rex(바실러스 서브틸리스, 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)), NprR(바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)), BtAraR(박테로이데스 써타이오타오미크론(Bacteriodes thetaiotaomicron)), AraR(박테로이데스 써타이오타오미크론 VPI), DntR(부르코홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)), CmeR(캄필로박터 제주니(Camplylobacter jejuni)), CviR(크로모박테륨 비올라세움(Chromobacterium violaceum)), TsaR(코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)), CGL2612(코리네박테륨 글라타미쿰(Corynebacterium glatamicum)), ClgR(코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)), LldR(CGL2915)(코리네박테륨 글루타미쿰), NtcA(코리네박테륨 나바베나(Cyanobacterium Anabaena)), HucR(데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)), Lacl(이콜라이), PrgX(엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)), NikR(헬로박터 필론(Helobacter pylon)), LmrR(락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)), CcpA(락토코커스 락티스), MtbCRP(마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), EthR(마이코박테륨 투베르쿨로시스), MosR(마이코박테륨 투베르쿨로시스), PhoP(마이코박테륨 투베르쿨로시스), Rv1846c(마이코박테륨 투베르쿨로시스), EthR(마이코박테륨 투베르쿨로시스), LysR(네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)), NMB0573/AsnC(네이세리아 메닌기티디스), TetR-클라스 H(파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida)), MexR(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), DNR(슈도모나스 아에루기노사), PA01(슈도모나스 아에루기노사), PA2196(슈도모나스 아에루기노사), ttgR(슈도모나스 푸티다), Cra(슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), QscR(슈도모나스 아에루기노사), ActR(에스. 코엘리칼라(S. coelicolor)), SCO0520(에스. 코엘리칼라), CprB(에스. 코엘리칼라), SlyA(살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) SlyA), FapR(스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)), QacR(스타필로코커스 아우레우스), SarZ(스타필로코커스 아우레우스), IcaR(스타필로코커스 아우레우스), LcaR(스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)), SMET(스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)), PcaV(SCO6704)(스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor)), SCO4008(스트렙토마이세스 코엘리칼라), NdgR(스트렙토마이세스 코엘리칼라), CprB(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO0253(스트렙토마이세스 코엘리칼라), TetR 패밀리(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO0520(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO4942(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO4313(스트렙토마이세스 코엘리칼라), TetR 패밀리(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO7222(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO3205(스트렙토마이세스 코엘리칼라), SCO3201(스트렙토마이세스 코엘리칼라), ST1710(설폴로부스 토코다이(Sulfolobus tokodaii) ST1710), HrcA(써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)), TM1030(써모토가 마리티마), tm1171(써모토가 마리티마), IclR(써모토가 마리티마), CarH(써무스 써모필루스), FadR(비브리오 콜레래(Vibrio cholerae)), SmcR(비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)) 및 RovA(예르시니아 페스티스(Yersinia pestis))의 조작된 버전이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 MphR, AlkS, AlkR, CdaR, BenM, RUNX1, MarR, AphA, Pex, CatM, AtzR, CatR, ClcR, CbbR, CysB, CbnR, OxyR, OccR 및 CrgA의 조작된 버전이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 aN 이콜라이 TF의 조작된 버전, 예를 들어, ArcA, AtoC, BaeR, BasR, CitB, CpxR, CreB, CusR, DcuR, DpiA, EvgA, KdpE, NarL, NarP, OmpR, PhoB, PhoP, QseB, RcsB, RstA, TorR, UhpA, UvrY, YedW, YehT, YfhK, YgiX, YpdB, ZraR, RssB, AgaR, AMR(ybbU), ArsR, AscG, Betl, BglJ, CadC, CaiF, CelD, CueR, CynR, ExuR, FecR, FucR, Fur, GatR, GutM, GutR(SrlR), ModE, MtlR, NagC, NanR(yhcK), NhaR, PhnF, PutA, RbsR, RhaR, RhaS, RpiR(AlsR), SdiA, UidR, XapR, XylR, ZntR, AllS(ybbS), Arac, ArgR, AsnC, CysB, CytR, DsdC, GalR, GalS, GcvA, GcvR, GlcC, GlpR, GntR, IdnR, LctR, Lrp, LysR, MelR, MhpR, TdcA, TdcR, TetR, TreR, TrpR 및 TyrR이다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 식물 전사 조절 패밀리의 조작된 버전, 예를 들어, AP2, C2H2, Dof, GATA, FID-ZIP, M-타입, NF-YA, S1Fa-유사, TCP, YABBY, ARF, C3H, E2F/DP, GRAS, HRT-유사, MIKC, NF-YB, SAP, 삼중나선, ZF-HD, ARR-B, CAMTA, EIL, GRF, HSF, MYB, NF-YC, SBP, VOZ, bHLH, B3, CO-유사, ERF, GeBP, LBD, MYB_관련, NZZ/SPL, SRS, WOX, bZIP, BBR-BPC, CPP, FAR1, HB-PHD, LFY, NAC, Nin-유사, STAT, WRKY, BES1, DBB, G2-유사, HB-기타, LSD, NF-X1, RAV, TALE, 및 월리(Whirly) 패밀리의 구성원이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 효모 TF의 조작된 버전, 예컨대, Abf1p, Abf2p, Aca1p, Ace2p, Adr1p, Aft1p, Aft2p, Arg80p, Arg81p, Aro80p, Arr1p, Asg1p, Ash1p, Azf1p, Bas1p, Cad1p, Cat8p, Cbf1p, Cep3p, Cha4p, Cin5p, Crz1p, Cst6p, Cup2p, Cup9p, Dal80p, Dal81p, Dal82p, Dot6p, Ecm22p, Ecm23p, Eds1p, Ert1p, Fhl1p, Fkh1p, Fkh2p, Flo8p, Fzf1p, Gal4p, Gat1p, Gat3p, Gat4p, Gcn4p, Gcr1p, Gis1p, Gln3p, Gsm1p, Gzf3p, Haa1p, Hac1p, Hal9p, Hap1p, Hap2p, Hap3p, Hap4p, Hap5p, Hcm1p, Hmlalpha2p, Hmra2p, Hsf1p, Ime1p, Ino2p, Ino4p, Ixr1p, Kar4p, Leu3p, Lys14p, Mac1p, Mal63p, Matalpha2p, Mbp1p, Mcm1p, Met31p, Met32p, Met4p, Mga1p, Mig1p, Mig2p, Mig3p, Mot2p, Mot3p, Msn1p, Msn2p, Msn4p, Mss11p, Ndt80p, Nhp10p, Nhp6ap, Nhp6bp, Nrg1p, Nrg2p, Oaf1p, Pdr1p, Pdr3p, Pdr8p, Phd1p, Pho2p, Pho4p, Pip2p, Ppr1p, Put3p, Rap1p, Rdr1p, Rds1p, Rds2p, Reb1p, Rei1p, Rfx1p, Rgm1p, Rgt1p, Rim101p, Rlm1p, Rme1p, Rox1p, Rph1p, Rpn4p, Rsc30p, Rsc3p, Rsf2p, Rtg1p, Rtg3p, Sfl1p, Sfp1p, Sip4p, Skn7p, Sko1p, Smp1p, Sok2p, Spt15p, Srd1p, Stb3p, Stb4p, Stb5p, Ste12p, Stp1p, Stp2p, Stp3p, Stp4p, Sum1p, Sut1p, Sut2p, Swi4p, Swi5p, Tbf1p, Tbs1p, Tea1p, Tec1p, Tod6p, Tos8p, Tye7p, Uga3p, Ume6p, Upc2p, Urc2p, Usv1p, Vhr1p, War1p, Xbp1p, YER064C, YER130C, YER184C, YGR067C, YKL222C, YLL054C, YLR278C, YML081W, YNR063W, YPR013C, YPR015C, YPR022C, YPR196W, Yap1p, Yap3p, Yap5p, Yap6p, Yap7p, Yox1p, Yrm1p, Yrr1p 및 Zap1p이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 선충(nematode) TF의 조작된 버전, 예컨대, ada-2, aha-1, ahr-1, alr-1, ast-1, atf-2, atf-5, atf-6, atf-7, athp-1, blmp-1, bra-2, brc-1, cbp-1, ccr-4, cdk-9, ced-6, ceh-1, ceh-10, ceh-12, ceh-13, ceh-14, ceh-16, ceh-17, ceh-18, ceh-19, ceh-2, ceh-20, ceh-21, ceh-22, ceh-23, ceh-24, ceh-26, ceh-27, ceh-28, ceh-30, ceh-31, ceh-32, ceh-33, ceh-34, ceh-36, ceh-37, ceh-38, ceh-39, ceh-40, ceh-41, ceh-43, ceh-44, ceh-45, ceh-48, ceh-49, ceh-5, ceh-6, ceh-60, ceh-7, ceh-8, ceh-9, cep-1, ces-1, ces-2, cey-1, cey-2, cey-3, cey-4, cfi-1, chd-3, cky-1, cnd-1, cog-1, crh-1, daf-12, daf-14, daf-16, daf-19, daf-3, daf-8, dcp-66, die-1, dlx-1, dmd-3, dmd-4, dmd-5, dmd-6, dnj-11, dpl-1, dpr-1, dpy-20, dpy-22, dpy-26, dro-1, dsc-1, efl-1, efl-2, egl-13, egl-18, egl-27, egl-38, egl-43, egl-44, egl-46, egl-5, ekl-2, ekl-4, elc-1, elt-1, elt-2, elt-3, elt-4, elt-6, elt-7, end-1, end-3, eor-1, ets-4, ets-5, eya-1, fax-1, fkh-10, fkh-2, fkh-3, fkh-4, fkh-5, fkh-6, fkh-7, fkh-8, fkh-9, flt-1, fos-1, fozi-1, gei-11, gei-13, gei-3, gei-8, gfl-1, gla-3, ham-2, hbl-1, hif-1, hlh-1, hlh-10, hlh-11, hlh-12, hlh-13, hlh-14, hlh-15, hlh-16, hlh-17, hlh-19, hlh-2, hlh-25, hlh-26, hlh-27, hlh-28, hlh-29, hlh-3, hlh-30, hlh-4, hlh-6, hlh-8, hmg-1.1, hmg-1.2, hmg-1.2, hmg-11, hmg-12, hmg-3, hmg-4, hmg-5, hnd-1, hsf-1, irx-1, lag-1, let-381, let-418, lfi-1, lim-4, lim-6, lim-7, lin-1, lin-11, lin-22, lin-26, lin-28, lin-31, lin-32, lin-35, lin-39, lin-40, lin-41, lin-48, lin-49, lin-54, lin-59, lin-61, lir-1, lpd-2, lsl-1, lss-4, lst-3, mab-23, mab-3, mab-5, mab-9, mbf-1, mbr-1, mbr-1, mdl-1, mec-3, med-1, med-2, mef-2, mes-2, mes-4, mes-6, mex-1, mex-5, mex-6, mgl-2, mls-1, mls-2,㎜l-1, mua-1, mxl-1, mxl-2, mxl-3, nfi-1, ngn-1, nhr-1, nhr-10, nhr-100, nhr-101, nhr-102, nhr-103, nhr-104, nhr-105, nhr-106, nhr-107, nhr-108, nhr-109, nhr-11, nhr-110, nhr-111, nhr-112, nhr-113, nhr-114, nhr-115, nhr-116, nhr-117, nhr-118, nhr-119, nhr-12, nhr-120, nhr-121, nhr-122, nhr-123, nhr-124, nhr-125, nhr-126, nhr-127, nhr-128, nhr-129, nhr-13, nhr-130, nhr-131, nhr-132, nhr-133, nhr-134, nhr-135, nhr-136, nhr-137, nhr-138, nhr-139, nhr-14, nhr-140, nhr-141, nhr-142, nhr-143, nhr-145, nhr-146, nhr-147, nhr-148, nhr-149, nhr-15, nhr-150, nhr-152, nhr-153, nhr-154, nhr-155, nhr-156, nhr-157, nhr-158, nhr-159, nhr-16, nhr-161, nhr-162, nhr-163, nhr-164, nhr-165, nhr-166, nhr-167, nhr-168, nhr-169, nhr-17, nhr-170, nhr-171, nhr-172, nhr-173, nhr-174, nhr-175, nhr-176, nhr-177, nhr-178, nhr-179, nhr-18, nhr-180, nhr-181, nhr-182, nhr-183, nhr-184, nhr-185, nhr-186, nhr-187, nhr-188, nhr-189, nhr-19, nhr-190, nhr-191, nhr-192, nhr-193, nhr-194, nhr-195, nhr-196, nhr-197, nhr-198, nhr-199, nhr-2, nhr-20, nhr-201, nhr-202, nhr-203, nhr-204, nhr-205, nhr-206, nhr-207, nhr-208, nhr-209, nhr-21, nhr-210, nhr-211, nhr-212, nhr-213, nhr-214, nhr-215, nhr-216, nhr-217, nhr-218, nhr-219, nhr-22, nhr-220, nhr-221, nhr-222, nhr-223, nhr-225, nhr-226, nhr-227, nhr-228, nhr-229, nhr-23, nhr-230, nhr-231, nhr-232, nhr-233, nhr-234, nhr-237, nhr-238, nhr-239, nhr-241, nhr-242, nhr-243, nhr-244, nhr-245, nhr-246, nhr-247, nhr-248, nhr-249, nhr-25, nhr-250, nhr-251, nhr-252, nhr-253, nhr-254, nhr-255, nhr-256, nhr-257, nhr-258, nhr-26, nhr-260, nhr-261, nhr-262, nhr-263, nhr-264, nhr-265, nhr-266, nhr-267, nhr-268, nhr-269, nhr-27, nhr-270, nhr-271, nhr-272, nhr-273, nhr-274, nhr-275, nhr-276, nhr-277, nhr-278, nhr-28, nhr-280, nhr-281, nhr-282, nhr-283, nhr-285, nhr-286, nhr-288, nhr-3, nhr-30, nhr-31, nhr-32, nhr-33, nhr-34, nhr-35, nhr-36, nhr-37, nhr-38, nhr-39, nhr-4, nhr-40, nhr-41, nhr-42, nhr-43, nhr-44, nhr-45, nhr-46, nhr-47, nhr-47, nhr-48, nhr-49, nhr-5, nhr-50, nhr-51, nhr-52, nhr-53, nhr-54, nhr-55, nhr-56, nhr-57, nhr-58, nhr-59, nhr-6, nhr-60, nhr-61, nhr-62, nhr-63, nhr-64, nhr-65, nhr-66, nhr-67, nhr-68, nhr-69, nhr-7, nhr-70, nhr-71, nhr-72, nhr-73, nhr-74, nhr-75, nhr-76, nhr-77, nhr-78, nhr-79, nhr-8, nhr-80, nhr-81, nhr-82, nhr-83, nhr-84, nhr-85, nhr-86, nhr-87, nhr-88, nhr-89, nhr-9, nhr-90, nhr-91, nhr-92, nhr-94, nhr-95, nhr-96, nhr-97, nhr-98, nhr-99, nob-1, ntl-2, ntl-3, nurf-1, odr-7, oma-1, oma-2, pag-3, pal-1, pax-1, pax-3, peb-1, pes-1, pha-1, pha-2, pha-4, php-3, pie-1, pop-1, pos-1, pqn-47, pqn-75, psa-1, rabx-5, rbr-2, ref-1, rnt-1, sbp-1, sdc-1, sdc-2, sdc-3, sea-1, sem-4, sex-1, skn-1, sknr-1, sma-2, sma-3, sma-4, smk-1, sop-2, sox-1, sox-2, sox-3, spr-1, sptf-2, sptf-3, srab-2, srt-58, srw-49, sta-1, tab-1, taf-4, taf-5, tag-153, tag-182, tag-185, tag-192, tag-295, tag-331, tag-347, tag-350, tag-68, tag-97, tbx-11, tbx-2, tbx-30, tbx-31, tbx-32, tbx-33, tbx-34, tbx-35, tbx-36, tbx-37, tbx-38, tbx-39, tbx-40, tbx-41, tbx-7, tbx-8, tbx-9, tra-1, tra-4, ttx-1, ttx-3, unc-120, unc-130, unc-3, unc-30, unc-37, unc-39, unc-4, unc-42, unc-55, unc-62, unc-86, vab-15, vab-3, vab-7, xbp-1, zag-1, zfp-1, zim-1, zip-1, zip-2, zip-3, zip-4, zip-5 및 ztf-7이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 아르케알(archeal) TF의 조작된 버전, 예컨대, APE_0290.1, APE_0293, APE_0880b, APE_1602a, APE_2413, APE_2505, APE_0656a, APE_1799a, APE_1458a, APE_1495a, APE_2570.1, APE_0416b.1, APE_0883a, APE_0535, APE_0142, APE_2021.1, APE_0060.1, APE_0197.1, APE_0778, APE_2011.1, APE_0168.1, APE_2517.1, APE_0288, APE_0002, APE_1360.1, APE_2091.1, APE_0454, APEJ862.1, APE_0669.1, APE_2443.1, APE_0787.1, APE_2004.1, APE_0025.1, APE_0153.1, AF0653, AF1264, AF1270, AF1544, AF1743, AF1807, AF1853, AF2008, AF2136, AF2404, AF0529, AF0114, AF0396, AF1298, AF1564, AF1697, AF1869, AF2271, AF1404, AF1148, AF0474, AF0584, AF1723, AF1622, AF1448, AF0439, AF1493, AF0337, AF0743, AF0365, AF1591, AF0128, AF0005, AF1745, AF0569, AF2106, AF1785, AF1984, AF2395, AF2232, AF0805, AF1429, AF0111, AF1627, AF1787, AF1793, AF1977, AF2118, AF2414, AF0643, AF1022, AF1121, AF2127, AF0139, AF0363, AF0998, AF1596, AF0673, AF2227, AF1542, AF2203, AF1459, AF1968, AF1516, AF0373, AF1817, AF1299, AF0757, AF0213, AF1009, AF1232, AF0026, AF1662, AF1846, AF2143, AF0674, Cmaq_0146, Cmaq_0924, Cmaq_1273, Cmaq_1369, Cmaq_1488, Cmaq_1508, Cmaq_1561, Cmaq_1699, Cmaq_0215, Cmaq_1704, Cmaq_1956, Cmaq_0058, Cmaq_1637, Cmaq_0227, Cmaq_0287, Cmaq_1606, Cmaq_1720, Cmaq_0112, Cmaq_1149, Cmaq_1687, Cmaq_0411, Cmaq_1925, Cmaq_0078, Cmaq_0314, Cmaq_0768, Cmaq_1206, Cmaq_0480, Cmaq_0797, Cmaq_1388, Cmaq_0152, Cmaq_0601, Cmaq_1188, Mboo_0375, Mboo_0423, Mboo_0749, Mboo_1012, Mboo_1134, Mboo_1154, Mboo_1189, Mboo_1266, Mboo_1711, Mboo_1971, Mboo_0002, Mboo_0956, Mboo_1071, Mboo_1405, Mboo_1643, Mboo_0973, Mboo_1170, Mboo_0158, Mboo_0195, Mboo_0277, Mboo_1462, Mboo_1574, Mboo_1649, Mboo_2112, Mboo_0013, Mboo_0386, Mboo_0946, Mboo_0977, Mboo_1081, Mboo_2241, Mboo_0142, Mboo_0396, Mboo_0409, Mboo_0976, Mboo_2244, Mboo_0526, Mboo_0346, Mboo_1018, Mboo_0917, Mboo_0323, Mboo_0916, Mboo_1680, Mboo_1288, Mboo_2311, Mboo_2048, Mboo_1027, Mboo_2312, rrnAC0161, rrnAC0578, rrnAC0961, rrnAC3494, rrnB0118, pNG7045, pNG6160, rrnAC0867, rrnAC2723, rrnAC3399, rrnAC3447, rrnB0052, rrnAC1653, rrnAC2779, pNG7038, rrnAC1252, rrnAC3288, rrnAC3307, rrnAC0503, rrnAC1269, pNG6047, rrnAC2622, rrnAC3290, rrnAC3365, rrnAC2301, pNG6157, rrnAC2002, rrnAC1238, rrnAC3207, pNG2039, pNG7160, rrnAC2748, rrnB0134, rrnAC2283, rrnAC1714, rrnAC1715, rrnAC2338, rrnAC2339, rrnAC2900, rrnAC0341, rrnAC3191, rrnAC1825, rrnAC2037, rrnAC0496, rrnAC3074, rrnAC2669, rrnAC0019, rrnAC0231, rrnAC0564, rrnAC0640, rrnAC1193, rrnAC1687, rrnAC1786, rrnAC1895, rrnAC1953, rrnAC1996, rrnAC2017, rrnAC2022, rrnAC2052, rrnAC2070, rrnAC2160, rrnAC2472, rrnAC2785, rrnAC2936, rrnAC3167, rrnAC3451, rrnAC3486, rrnAC3490, rrnB0253, rrnB0269, pNG7159, pNG7188, pNG7357, pNG6134, rrnAC0376, rrnAC1217, rrnAC1541, rrnAC1663, rrnAC3229, pNG7223, rrnAC0440, rrnAC0535, rrnAC1742, rrnAC2519, rrnAC1764, rrnAC1777, rrnAC2762, rrnAC3264, rrnAC0417, rrnAC1303, rrnB0301, pNG6155, pNG7021, pNG7343, rrnAC1964, pNG7171, rrnAC1338, pNG7344, rrnAC0230, rrnAC1971, rrnB0222, rrnAC0385, rrnAC0312, pNG7133, rrnAC0006, rrnAC1805, rrnAC3501, pNG7312, rrnAC0435, rrnAC0768, rrnAC0992, rrnAC2270, rrnAC3322, rrnB0112, rrnB0157, rrnB0161, pNG6058, pNG6092, pNG5119, pNG5140, pNG4042, pNG2006, pNG1015, rrnAC0199, rrnAC0681, rrnAC1765, rrnAC1767, pNG5067, pNG7180, pNG7307, pNG7183, rrnAC3384, pNG5131, rrnAC2777, pNG5071, rrnAC1472, pNG7308, rrnAC0869, rrnB0148, rrnAC2051, rrnAC0016, rrnAC1875, pNG6072, pNG6123, rrnAC2769, rrnAC1357, rrnAC1126, rrnAC0861, rrnAC0172, rrnAC0420, rrnAC0914, rrnAC2354, rrnAC3310, rrnAC3337, pNG5013, pNG5133, rrnAC3082, rrnB0074, pNG6075, pNG5024, rrnAC0924, rrnB0235, pNG7146, VNG0462C, VNG7122, VNG7125, VNG2445C, VNG0591C, VNG1843C, VNG0320H, VNG1123Gm, VNG1237C, VNG1285G, VNG2094G, VNG1351G, VNG1377G, VNG1179C, VNG1922G, VNG1816G, VNG0134G, VNG0194H, VNG0147C, VNG6193H, VNG2163H, VNG0101G, VNG1836G, VNG0530G, VNG0536G, VNG0835G, VNG2579G, VNG6349C, VNG1394H, VNG0113H, VNG0156C, VNG0160G, VNG0826C, VNG0852C, VNG1207C, VNG1488G, VNG6065G, VNG6461G, VNG7048, VNG7161, VNG1464G, VNG1548C, VNG0247C, VNG0471C, VNG0878Gm, VNG1029C, VNG1616C, VNG2112C, VNG6009H, VNG7007, VNG0704C, VNG1405C, VNG6318G, VNG0142C, VNG6072C, VNG6454C, VNG7053, VNG7156, VNG0703H, VNG0258H, VNG0751C, VNG1426H, VNG2020C, VNG6048H, VNG6126H, VNG6239G, VNG6478H, VNG7102, VNG6027G, VNG7023, VNG1786H, VNG2629G, VNG1598a, VNG7031, VNG6037G, VNG7171, VNG7114, VNG7038, VNG2243G, VNG6140G, VNG7100, VNG6476G, VNG6438G, VNG6050G, VNG0726C, VNG1390H, VNG6351G, VNG2184G, VNG0869G, VNG0254G, VNG6389G, VNG0315G, VNG0734G, VNG0757G, VNG1451C, VNG1886C, VNG1903Cm, VNG0985H, VNG6377H, HQ2607A, HQ2612A, HQ2779A, HQ1740A, HQ1541A, HQ1491A, HQ2619A, HQ1811A, HQ3063A, HQ3354A, HQ3642A, HQ2773A, HQ1436A, HQ2221A, HQ1414A, HQ3339A, HQ2484A, HQ3265A, HQ3620A, HQ1268A, HQ1388A, HQ1866A, HQ1563A, HQ1710A, HQ1962A, HQ1084A, HQ1739A, HQ1861A, HQ1863A, HQ2750A, HQ2664A, HQ2869A, HQ3058A, HQ3361A, HQ1277A, HQ2225A, HQ1993A, HQ1937A, HQ1088A, HQ1724A, HQ1568A, HQ2167A, HQ1230A, HQ2407A, HQ3108A, HQ1973A, HQ3260A, HQ2527A, HQ3410A, HQ2369A, HQ2564A, HQ1153A, HQ1227A, HQ3654A, HQ1867A, HQ2571A, HQ1625A, HQ3408A, HQ1689A, HQ2491A, HQ2726A, HQ2987A, HQ1041A, HQ1898A, HQ1900A, HQ1118A, Hbut_1261, Hbut_0073, Hbut_0009, Hbut_0100, Hbut_0987, Hbut_1340, Hbut_0120, Hbut_0990, Hbut_0316, Hbut_0659, Hbut_0660, Hbut_0366, Hbut_0204, Hbut_1498, Hbut_1630, Hbut_1485, Hbut_1260, Hbut_0942, Hbut_0163, Hbut_0116, Hbut_0207, Hbut_1516, Hbut_0476, Hbut_1139, Hbut_0299, Hbut_0033, Hbut_0336, Hbut_1471, Hbut_1522, Hbut_0601, Hbut_0934, Hbut_0458, Hbut_0054, Hbut_1136, Hbut_0646, Hbut_0815, lgni_0122, lgni_0494, lgni_0706, lgni_1249, lgni_0226, lgni_0308, lgni_0658, lgni_0702, lgni_0486, lgni_0602, lgni_1394, lgni_0858, lgni_1361, lgni_0354, lgni_0989, lgni_1372, lgni_1124, Msed_0229, Msed_0717, Msed_1005, Msed_1190, Msed_1224, Msed_1970, Msed_2175, Msed_0166, Msed_0688, Msed_1202, Msed_1209, Msed_1765, Msed_1956, Msed_2295, Msed_0619, Msed_0621, Msed_2232, Msed_0140, Msed_2016, Msed_0767, Msed_1126, Msed_0856, Msed_0992, Msed_1773, Msed_1818, Msed_2183, Msed_1598, Msed_1725, Msed_2276, Msed_2293, Msed_1450, Msed_0265, Msed_0492, Msed_1279, Msed_1397, Msed_1563, Msed_1566, Msed_2027, Msed_0565, Msed_0868, Msed_1371, Msed_1483, Msed_1728, Msed_1351, Msed_1733, Msed_2209, Msed_2279, Msed_2233, MTH107, MTH517, MTH899, MTH1438, MTH1795, MTH163, MTH1288, MTH1349, MTH864, MTH1193, MTH254, MTH821, MTH1696, MTH739, MTH603, MTH214, MTH936, MTH659, MTH700, MTH729, MTH967, MTH1553, MTH1328, MTH1470, MTH1285, MTH1545, MTH931, MTH313, MTH1569, MTH281, MTH1488, MTH1521, MTH1627, MTH1063, MTH1787, MTH885, MTH1669, MTH1454, Msm_1107, Msm_1126, Msm_1350, Msm_1032, Msm_0213, Msm_0844, Msm_1260, Msm_0364, Msm_0218, Msm_0026, Msm_0329, Msm_0355, Msm_0453, Msm_1150, Msm_1408, Msm_0864, Msm_0413, Msm_1230, Msm_1499, Msm_1417, Msm_1250, Msm_1090, Msm_0720, Msm_0650, Msm_0424, Msm_0631, Msm_1445, Mbur_0656, Mbur_1148, Mbur_1658, Mbur_1965, Mbur_2405, Mbur_1168, Mbur_0166, Mbur_0946, Mbur_1817, Mbur_1830, Mbur_0231, Mbur_0234, Mbur_2100, Mbur_1375, Mbur_2041, Mbur_0776, Mbur_0783, Mbur_2071, Mbur_1477, Mbur_1871, Mbur_1635, Mbur_1221, Mbur_0292, Mbur_0512, Mbur_0609, Mbur_0661, Mbur_1211, Mbur_1719, Mbur_1811, Mbur_1931, Mbur_2112, Mbur_2130, Mbur_2048, Mbur_2144, Mbur_0368, Mbur_1483, Mbur_2274, Mbur_1359, Mbur_2306, Mbur_1647, Mbur_0631, Mbur_0378, Mbur_0085, Mbur_1496, Mbur_0963, Mbur_0372, Mbur_1140, Mbur_2097, Mbur_2262, Mbur_1532, Maeo_0092, Maeo_0872, Maeo_0888, Maeo_1298, Maeo_1146, Maeo_1061, Maeo_1147, Maeo_0865, Maeo_0659, Maeo_0679, Maeo_1305, Maeo_0977, Maeo_1182, Maeo_1472, Maeo_1362, Maeo_0019, Maeo_0277, Maeo_0356, Maeo_0719, Maeo_1032, Maeo_1289, Maeo_0698, Maeo_1183, Maeo_0223, Maeo_0822, Maeo_0218, Maeo_0186, Maeo_1155, Maeo_0575, Maeo_0728, Maeo_0696, Maeo_0664, MJ0432, MJ1082, MJ1325, MJ0229, MJ0361, MJ1553, MJ1563, MJ0774, MJ1398, MJ0723, MJ0151, MJ0589a, MJECL29, MJ1647, MJ1258, MJ0168, MJ0932, MJ0080, MJ0549, MJ0767, MJ1679, MJ0568, MJ 1005, MJ0529, MJ0586, MJ0621, MJ1164, MJ1420, MJ1545, MJ0272, MJ0925, MJ0300, MJ1120, MJ0379, MJ0558, MJ1254, MJ0159, MJ0944, MJ0241, MJ0173, MJ0507, MJ0782, MJ0777, MJ1503, MJ1623, MmarC5_0244, MmarC5_1146, MmarC5_0136, MmarC5_1648, MmarC5_1124, MmarC5_0967, MmarC5_1647, MmarC5_0448, MmarC5_0231, MmarC5_0579, MmarC5_1252, MmarC5_1664, MmarC5_0974, MmarC5_0625, MmarC5_1666, MmarC5_0111, MmarC5_1039, MmarC5_0316, MmarC5_0131, MmarC5_1762, MmarC5_1579, MmarC5_0380, MmarC5_0898, MmarC5_0813, MmarC5_1143, MmarC5_1694, MmarC5_1294, MmarC5_1236, MmarC5_1150, MmarC5_1138, MmarC5_1543, MmarC5_0999, MmarC5_1507, MmarC5_0876, MmarC5_0202, MmarC5_1416, MmarC5_0612, MmarC5_0571, MmarC5_1100, MmarC5_1639, MmarC5_1644, MmarC5_0714, MmarC5_0484, MmarC5_0976, MmarC6_0024, MmarC6_0026, MmarC6_0104, MmarC6_0105, MmarC6_0128, MmarC6_0252, MmarC6_0566, MmarC6_0917, MmarC6_1231, MmarC6_0916, MmarC6_1531, MmarC6_0524, MmarC6_1326, MmarC6_1644, MmarC6_0165, MmarC6_0929, MmarC6_0258, MmarC6_0037, MmarC6_0055, MmarC6_1206, MmarC6_1606, MmarC6_0210, MmarC6_0325, MmarC6_0744, MmarC6_0850, MmarC6_1025, MmarC6_1226, MmarC6_1398, MmarC6_1462, MmarC6_1664, MmarC6_1175, MmarC6_0959, MmarC6_0931, MmarC6_0136, MmarC6_0425, MmarC6_0508, MmarC6_0285, MmarC6_0184, MmarC6_0443, MmarC6_0782, MmarC6_1297, MmarC6_0861, MmarC6_0696, MmarC6_1636, MmarC6_1817, MmarC6_0908, MmarC6_0913, MmarC6_0262, MmarC6_1567, MmarC6_1748, MmarC7_0274, MmarC7_0687, MmarC7_1029, MmarC7_1513, MmarC7_1661, MmarC7_1030, MmarC7_0388, MmarC7_0257, MmarC7_0592, MmarC7_1384, MmarC7_1017, MmarC7_1655, MmarC7_0306, MmarC7_0712, MmarC7_0235, MmarC7_0457, MmarC7_0521, MmarC7_0692, MmarC7_0743, MmarC7_0919, MmarC7_1096, MmarC7_1211, MmarC7_1587, MmarC7_1702, MmarC7_0987, MmarC7_1015, MmarC7_0031, MmarC7_1400, MmarC7_1790, MmarC7_1499, MmarC7_1629, MmarC7_1168, MmarC7_1727, MmarC7_0621, MmarC7_1085, MmarC7_1260, MmarC7_0085, MmarC7_0265, MmarC7_1461, MmarC7_1038, MmarC7_1033, MmarC7_0154, MmarC7_0352, MmarC7_1652, MmarC7_1455, MMP0499, MMP1442, MMP0480, MMP0752, MMP0032, MMP0460, MMP0637, MMP0033, MMP0217, MMP1137, MMP0386, MMP1347, MMP1015, MMP0719, MMP0020, MMP0631, MMP0742, MMP1467, MMP1052, MMP0097, MMP0209, MMP0568, MMP0674, MMP0678, MMP0993, MMP1210, MMP1275, MMP1447, MMP1646, MMP1499, MMP0018, MMP1712, MMP0402, MMP0787, MMP0607, MMP0168, MMP0700, MMP0465, MMP1376, MMP0086, MMP0257, MMP0840, MMP1023, MMP0791, MMP0799, MMP0041, MMP0036, MMP0907, MMP0629, MMP1100, Mevan_0753, Mevan_1029, Mevan_1232, Mevan_1560, Mevan_1502, Mevan_1030, Mevan_0459, Mevan_0343, Mevan_0658, Mevan_1373, Mevan_1201, Mevan_1594, Mevan_1567, Mevan_1203, Mevan_0375, Mevan_0778, Mevan_0320, Mevan_0525, Mevan_0587, Mevan_0758, Mevan_0808, Mevan_0951, Mevan_1109, Mevan_1444, Mevan_1514, Mevan_1517, Mevan_1014, Mevan_0136, Mevan_0295, Mevan_1389, Mevan_1479, Mevan_1173, Mevan_1578, Mevan_1653, Mevan_0686, Mevan_1098, Mevan_1270, Mevan_0270, Mevan_0282, Mevan_1620, Mevan_1668, Mevan_1038, Mevan_1044, Mevan_1050, Mevan_1056, Mevan_1033, Mevan_0014, Mevan_0425, Mevan_0095, Mlab_0303, Mlab_0817, Mlab_0821, Mlab_1236, Mlab_1381, Mlab_0824, Mlab_0002, Mlab_0494, Mlab_0162, Mlab_0744, Mlab_1629, Mlab_0854, Mlab_0909, Mlab_1549, Mlab_0037, Mlab_0071, Mlab_0160, Mlab_1173, Mlab_1603, Mlab_1630, Mlab_1666, Mlab_1628, Mlab_0070, Mlab_1522, Mlab_0331, Mlab_1259, Mlab_0324, Mlab_1366, Mlab_1576, Mlab_0353, Mlab_0010, Mlab_0295, Mlab_0588, Mlab_1668, Mlab_0447, Mlab_0440, Mlab_0197, Mlab_1697, Mlab_1694, Mlab_1710, Mlab_1511, Mlab_0458, Mlab_0497, Mlab_0762, Mlab_0988, Mlab_0826, Memar_0011, Memar_0013, Memar_1330, Memar_1512, Memar_1567, Memar_1770, Memar_2080, Memar_0129, Memar_0140, Memar_0431, Memar_1231, Memar_1756, Memar_2162, Memar_2068, Memar_1225, Memar_0002, Memar_1921, Memar_0834, Memar_2239, Memar_1448, Memar_0817, Memar_2411, Memar_2490, Memar_2264, Memar_1471, Memar_1420, Memar_0458, Memar_1291, Memar_1391, Memar_1410, Memar_1819, Memar_2218, Memar_2347, Memar_2360, Memar_2449, Memar_1304, Memar_0106, Memar_0096, Memar_0419, Memar_1120, Memar_0385, Memar_0555, Memar_1103, Memar_1319, Memar_2487, Memar_1252, Memar_1388, Memar_0473, Memar_1524, Memar_0459, Memar_0487, Memar_1209, Memar_1387, Memar_2116, MK0576, MK1025, MK0542, MK1515, MK0506, MK1677, MK1502, MK1190, MK0175, MK0800, MK0457, MK0449, MK1380, MK1430, MK0574, MK1482, MK0984, MK0337, MK1587, MK0839, MK0619, MK0858, MK0495, MK0253, Mthe_1108, Mthe_1291, Mthe_1230, Mthe_0612, Mthe_0503, Mthe_0879, Mthe_0047, Mthe_0598, Mthe_0023, Mthe_0662, Mthe_0543, Mthe_0154, Mthe_0459, Mthe_1389, Mthe_1446, Mthe_1633, Mthe_1233, Mthe_0669, Mthe_0067, Mthe_0404, Mthe_0982, Mthe_1201, Mthe_0152, Mthe_0265, Mthe_1650, Mthe_1683, Mthe_0889, MA0191, MA0342, MA0380, MA1458, MA2551, MA3784, MA3925, MA3940, MA3952, MA4076, MA4344, MA4484, MA4576, MA0207, MA0750, MA2499, MA3597, MA4479, MA2544, MA4480, MA0504, MA2921, MA0862, MA0205, MA0460, MA0622, MA0629, MA1953, MA4398, MA4560, MA0723, MA1529, MA1551, MA2421, MA1531, MA0924, MA0575, MA1588, MA0672, MA1395, MA4075, MA1763, MA2814, MA3468, MA0022, MA4338, MA2133, MA0971, MA1005, MA0067, MA1424, MA1815, MA4668, MA2914, MA3524, MA4040, MA4267, MA3984, MA0283, MA0333, MA0414, MA1339, MA3166, MA0176, MA0180, MA0743, MA1863, MA2051, MA2055, MA2206, MA2211, MA2771, MA3189, MA4167, MA1122, MA3015, MA0079, MA0989, MA4404, MA2093, MA1671, MA4106, MA4346, MA0278, MA4331, MA0179, MA2948, MA3586, MA2761, MA1487, MA1771, MA2746, MA0364, MA2951, MA0354, MA2902, MA0368, MA2764, MA2766, MA0178, MA2782, MA2493, MA0610, MA3871, MA0287, MA0359, MA1835, MA2057, MA2207, MA2212, MA3151, MA4622, MA0926, MA1664, MA4408, MA1868, Mbar_A0506, Mbar_A0581, Mbar_A0738, Mbar_A0909, Mbar_A1363, Mbar_A1705, Mbar_A1707, Mbar_A1708, Mbar_A1719, Mbar_A2323, Mbar_A2748, Mbar_A3221, Mbar_A3427, Mbar_A1541, Mbar_A1729, Mbar_A2416, Mbar_A3312, Mbar_A0803, Mbar_A3558, Mbar_A0794, Mbar_A2965, Mbar_A1070, Mbar_A1333, Mbar_A2865, Mbar_A1639, Mbar_A3371, Mbar_A0650, Mbar_A3377, Mbar_A3361, Mbar_A0654, Mbar_A3464, Mbar_A1460, Mbar_A2808, Mbar_A1584, Mbar_A2743, Mbar_A2250, Mbar_A0507, Mbar_A0992, Mbar_A1457, Mbar_A0588, Mbar_A0122, Mbar_A2068, Mbar_A0552, Mbar_A0621, Mbar_A0692, Mbar_A1033, Mbar_A2079, Mbar_A2171, Mbar_A2318, Mbar_A2819, Mbar_A2992, Mbar_A3339, Mbar_A1265, Mbar_A1377, Mbar_A1884, Mbar_A2294, Mbar_A3663, Mbar_A2575, Mbar_A2637, Mbar_A3146, Mbar_A3330, Mbar_A3493, Mbar_A2012, Mbar_A2036, Mbar_A2688, Mbar_A3560, Mbar_A1076, Mbar_A0340, Mbar_A0520, Mbar_A1497, Mbar_A3486, Mbar_A1949, Mbar_A0475, Mbar_A0579, Mbar_A1062, Mbar_A0595, Mbar_A3297, Mbar_A3442, Mbar_A3419, Mbar_A0834, Mbar_A0787, Mbar_A2740, Mbar_A1394, Mbar_A0196, Mbar_A1270, Mbar_A3331, Mbar_A3578, Mbar_A3670, Mbar_A1080, MM0272, MM0662, MM0841, MM1040, MM1257, MM1484, MM1796, MM2237, MM2242, MM2246, MM2247, MM2261, MM2525, MM2985, MM3068, MM3208, MM1882, MM1494, MM3092, MM1595, MM3173, MM0565, MM1492, MM0266, MM1080, MM1605, MM1650, MM2809, MM2861, MM2446, MM2441, MM2040, MM1728, MM1739, MM2416, MM1825, MM0666, MM0842, MM2657, MM1332, MM2573, MM1034, MM2606, MM0247, MM0444, MM0872, MM0927, MM1363, MM2394, MM2895, MM3179, MM1005, MM3233, MM1550, MM0359, MM0361, MM1586, MM1863, MM2851, MM2853, MM3117, MM0116, MM0289, MM0346, MM1903, MM3195, MM3170, MM1085, MM0386, MM2835, MM0811, MM1042, MM1027, MM2184, MM1028, MM0432, MM2546, MM1614, MM1772, MM0692, MM0146, MM0345, MM0369, MM1554, MM2854, MM1094, MM2042, MM3115, Msp_0061, Msp_0120, Msp_1519, Msp_0293, Msp_1556, Msp_0769, Msp_0168, Msp_0614, Msp_0518, Msp_0122, Msp_0383, Msp_1218, Msp_0446, Msp_0265, Msp_0608, Msp_1143, Msp_1207, Msp_0248, Msp_0512, Msp_0823, Msp_1188, Msp_0235, Msp_0194, Msp_1057, Msp_1097, Msp_0717, Msp_0971, Msp_1360, Msp_1272, Msp_1125, Msp_0149, Mhun_0040, Mhun_0316, Mhun_0873, Mhun_1073, Mhun_1644, Mhun_2448, Mhun_2633, Mhun_2472, Mhun_0365, Mhun_0919, Mhun_0576, Mhun_0165, Mhun_2458, Mhun_0842, Mhun_0941, Mhun_1324, Mhun_1346, Mhun_2089, Mhun_1313, Mhun_1731, Mhun_1706, Mhun_0152, Mhun_0501, Mhun_1037, Mhun_2548, Mhun_2928, Mhun_3036, Mhun_0241, Mhun_1541, Mhun_2190, Mhun_0646, Mhun_1347, Mhun_1533, Mhun_1553, Mhun_1866, Mhun_1954, Mhun_0253, Mhun_1259, Mhun_1451, Mhun_2502, Mhun_0684, Mhun_2259, Mhun_0763, Mhun_1327, Mhun_1530, Mhun_2935, Mhun_2804, Mhun_0568, Mhun_0593, Mhun_1236, Mhun_1656, Mhun_2481, Mhun_2797, Mhun_0497, Mhun_0575, Mhun_0588, NEQ328, NEQ229, NEQ348, NEQ288, NEQ453, NEQ143, NEQ039, NEQ276, NEQ098, NEQ541, NP1838A, NP2534A, NP3936A, NP6056A, NP2558A, NP1144A, NP0458A, NP2490A, NP2664A, NP3370A, NP0078A, NP5052A, NP4026A, NP6200A, NP0924A, NP4828A, NP2752A, NP6106A, NP2470A, NP2474A, NP0316A, NP0252A, NP5326A, NP1048A, NP2958A, NP5152A, NP4632A, NP3636A, NP3734A, NP4552A, NP5064A, NP1496A, NP4726A, NP2878A, NP0136A, NP0162A, NP0654A, NP1532A, NP1538A, NP1564A, NP2794A, NP4286A, NP4406A, NP5130A, NP5298A, NP6030A, NP6220A, NP4436A, NP1320A, NP2146A, NP3466A, NP4796A, NP5168A, NP3046A, NP2812A, NP3608A, NP2618A, NP6176A, NP3330A, NP7054A, NP2762A, NP4124A, NP3490A, NP1128A, NP1628A, NP2114A, NP0674A, NP2366A, NP3002A, NP3776A, NP4444A, NP1296A, NP1064A, NP4080A, NP4082A, NP0534A, NP2466A, NP3718A, NP5096A, NP2220A, NP5186A, NP1684A, NP2246A, NP4822A, NP4326A, NP4106A, NP2518A, NP5272A, NP6088A, NP4258A, PT00082, PTO0457, PTO0754, PTO0795, PT00420, PT01287, PTO0595, PTO0891, PT00200, PTO1201, PTO0428, PTO0376, PTO0514, PTO0375, PTO0781, PT01148, PTO0979, PTO0276, PTO0843, PTO0557, PTO1105, PT01211, PT01517, PTO1052, PTO1150, PTO0114, PTO1041, PT01176, PT00063, PTO0799, PT01388, PT01389, PTO0914, PTO1110, PT01216, PTO0675, PT01123, PT00506, PT01258, PT01372, PTO0363, PTO1340, PT01338, PTO1067, PT01454, PT01523, PTO0576, PTO0198, PAE0731, PAE0738, PAE1612, PAE2042, PAE2911, PAE1948, PAE2655, PAE0385, PAE2225, PAE3116, PAE2186, PAE1103, PAE1592, PAE1848, PAE3387, PAE1507, PAE1986, PAE3469, PAE3471, PAE0659, PAE1443, PAE1484, PAE0296, PAE2022, PAE2357, PAE1544, PAE0640, PAE2309, PAE3163, PAE2449, PAE3605, PAE0783, PAE1627, PAE1638, PAE2071, PAE3208, PAE0019, PAE0813, PAE3327, PAE0146, PAE2679, PAE2684, PAE1218, PAE1760, PAE0013, PAE3437, PAE2640, PAE3378, PAE2164, PAE0171, PAE0170, PAE3329, PAE2120, PAE1645, PAE0781, PAE2282, Pars_0006, Pars_0433, Pars_0703, Pars_0836, Pars_0990, Pars_1924, Pars_2088, Pars_2298, Pars_0264, Pars_2028, Pars_0627, Pars_1855, Pars_2059, Pars_1853, Pars_0399, Pars_0425, Pars_1561, Pars_2084, Pars_0343, Pars_0668, Pars_2155, Pars_0438, Pars_1526, Pars_2364, Pars_1428, Pars_0037, Pars_1981, Pars_1988, Pars_2104, Pars_0057, Pars_0792, Pars_0504, Pars_0550, Pars_1742, Pars_1776, Pars_0311, Pars_0752, Pars_1087, Pars_1872, Pars_1005, Pars_0806, Pars_2186, Pars_2187, Pars_1743, Pars_2132, Pars_1649, Pars_1976, Pars_0035, Pars_1810, Pars_2125, Pcal_0142, Pcal_0905, Pcal_0946, Pcal_0412, Pcal_0495, Pcal_0687, Pcal_1273, Pcal_0822, Pcal_1595, Pcal_1185, Pcal_0610, Pcal_1183, Pcal_2085, Pcal_0796, Pcal_0536, Pcal_1689, Pcal_0008, Pcal_1198, Pcal_1653, Pcal_0295, Pcal_1924, Pcal_1927, Pcal_0200, Pcal_0589, Pcal_0596, Pcal_2145, Pcal_0791, Pcal_0023, Pcal_1415, Pcal_1735, Pcal_0266, Pcal_0346, Pcal_0543, Pcal_0792, Pcal_1032, Pcal_0159, Pcal_1078, Pcal_1890, Pcal_1316, Pcal_1055, Pcal_0584, Pcal_1734, Pcal_2147, Pcal_1638, Pcal_2070, Pisl_1759, Pisl_2001, Pisl_0858, Pisl_1838, Pisl_0307, Pisl_0653, Pisl_1426, Pisl_1248, Pisl_1639, Pisl_1808, Pisl_0995, Pisl_1590, Pisl_0997, Pisl_0709, Pisl_1563, Pisl_1834, Pisl_1578, Pisl_0622, Pisl_1613, Pisl_0725, Pisl_1023, Pisl_0410, Pisl_1076, Pisl_1655, Pisl_1662, Pisl_1854, Pisl_0045, Pisl_1100, Pisl_0810, Pisl_0572, Pisl_1971, Pisl_1303, Pisl_1717, Pisl_0038, Pisl_0979, Pisl_0565, Pisl_1878, Pisl_0807, Pisl_1975, Pisl_1974, Pisl_0573, Pisl_0955, Pisl_1667, Pisl_1074, Pisl_1008, Pisl_1250, PAB2298, PAB1869, PAB0625, PAB0751, PAB1002, PAB2328, PAB0125, PAB0208, PAB0619, PAB1229, PAB1227, PAB0108, PAB0322, PAB0392, PAB2312, PAB7115, PAB2062.1n, PAB1938, PAB1236, PAB2257, PAB7359, PAB2299, PAB0758a, PAB3089, PAB3117, PAB0960, PAB1522.1n, PAB2324, PAB0714, PAB2311, PAB1533, PAB0211, PAB2104, PAB2035, PAB0475, PAB0842, PAB0668, PAB7155, PAB3293, PAB0917, PAB0661, PAB0953, PAB1243, PAB1544, PAB0331, PAB1922, PAB7338, PAB0603, PAB1517, PAB1726, PAB1641, PAB1642, PAB0976, PAB1912, PAB0950, PAB0838, PF0007, PF0230, PF1072, PF1406, PF2051, PF0113, PF0232, PF1790, PF1088, PF0095, PF1734, PF0054, PF1543, PF1732, PF0250, PF0739, PF1231, PF1601, PF1022, PF1893, PF0607, PF0829, PF1722, PF1831, PF0322, PF0524, PF2053, PF0851, PF1194, PF0055, PF0505, PF0512, PF1386, PF1735, PF1794, PF1851, PF0691, PF0487, PF0988, PF1029, PF2062, PF0263, PF0709, PF1476, PF0584, PF1198, PF0535, PF1295, PF1338, PF1337, PF0687, PF1377, PF0491, PF0496, PF0661, PF1743, PF0124, PF0649, PH0062, PH1101, PH0199, PH0289, PH0825, PH1061, PH1406, PH1744, PH1930, PH1932, PH0977, PH0952, PH0180, PH1692, PH0045, PH1856.1n, PH0061, PHS045, PH1592, PH1916, PH0140, PH1519, PHS023, PH1055, PHS034, PHS051, PHS046, PH0601, PHS024, PH0468, PH1163, PH0046, PH0787, PH0783, PH1471, PH1691, PH1748, PH1808, PH0660, PH0804, PH0995, PH0614, PH0914, PH0718.1n, PH1080, PH0763, PH1009, PH1161, PH1160, PH1482, PH0864, PH0619, PH0751, PH0799, PH1034, PH0588, Smar_0567, Smar_0017, Smar_0429, Smar_1295, Smar_0048, Smar_0184, Smar_0954, Smar_1451, Smar_0205, Smar_0336, Smar_0366, Smar_1141, Smar_0476, Smar_0879, Smar_0338, Smar_0194, Smar_0612, Smar_0915, Smar_1254, Smar_1341, Smar_0279, Smar_1409, Smar_0319, Smar_0758, Smar_1442, Smar_1514, Smar_1075, Smar_1322, Smar_0054, Smar_1137, Smar_1250, Smar_0918, Smar_0086, Saci_0006, Saci_0446, Saci_1068, Saci_1787, Saci_1979, Saci_0800, Saci_1710, Saci_2236, Saci_2266, Saci_2136, Saci_0992, Saci_0731, Saci_0752, Saci_1304, Saci_1588, Saci_0944, Saci_0843, Saci_0942, Saci_0264, Saci_1391, Saci_0476, Saci_1223, Saci_0112, Saci_0048, Saci_1851, Saci_0455, Saci_2061, Saci_2116, Saci_2167, Saci_2183, Saci_2296, Saci_0655, Saci_1344, Saci_1505, Saci_2359, Saci_1192, Saci_2313, Saci_0161, Saci_0102, Saci_0133, Saci_0874, Saci_1219, Saci_1482, Saci_1670, Saci_1956, Saci_2112, Saci_0488, Saci_0483, Saci_1180, Saci_1171, Saci_1186, Saci_1242, Saci_0489, Saci_1005, Saci_2352, Saci_0380, Saci_1336, Saci_1230, Saci_2283, Saci_1107, Saci_0866, Saci_1341, Saci_0652, Saci_0842, Saci_1161, SSO0458, SSO0620, SSO9953, SSO2688, SSO0200, SSO1423, SSO2114, SSO2347, SSO3103, SSO5522, SSO0977, SSO0606, SSO2131, SSO10340, SSO0157, SSO6024, SSO0659, SSO5826, SSO10342, SSO3242, SSO0669, SSO2273, SSO2244, SSO1589, SSO1255, SSO0447, SSO0785, SSO1008, SSO1219, SSO1306, SSO1536, SSO2058, SSO3061, SSO3080, SSO1868, SSO3097, SSO2474, SSO3188, SSO0107, SSO0270, SSO0387, SSO0942, SSO1066, SSO0040, SSO1264, SSO1384, SSO1750, SSO1897, SSO2090, SSO2132, SSO2933, SSO2992, SSO2897, SSO3176, SSO0048, SSO0365, SSO1082, SSO1108, SSO1352, SSO1101, SSO1110, SSO2652, SSO1695, SSO1748, SSO2957, SSO2327, SSO0038, SSO0049, SSO0994, SSO2138, SSO2571, SSO0951, SSO2206, SSO2089, SSO2598, SSO2506, SSO0446, SSO0946, SSO0266, SSO0426, SSO2073, ST0236, ST1060, ST1064, ST1076, ST1486, ST1604, ST1889, STS229, ST0720, ST0173, STS095, ST2514, ST1022, ST2372, ST0193, ST0489, ST1115, ST1301, STS042, ST1473, STS071, STS074, STS163, STS072, STS250, STS248, ST2039, ST2236, ST2114, ST2562, ST0051, ST0164, ST0722, ST2550, ST1593, ST0256, ST0331, ST1268, ST2084, ST2190, ST1409, ST0808, STS035, ST0758, ST1043, ST1386, ST1710, ST1716, ST1867, ST1890, ST2388, STS086, ST0749, ST0837, ST0980, ST2050, ST0757, ST0766, ST2210, ST1773, ST1340, ST1054, ST1275, ST1007, ST1041, ST0684, ST0072, ST0349, ST 1271, ST0334, ST1630, ST0371, TK0063, TK0559, TK1041, TK1261, TK1826, TK1881, TK2190, TK1086, TK1883, TK1955, TK2291, TK2134, TK1285, TK1487, TK0168, TK1331, TK0567, TK0834, TK1491, TK1210, TK2110, TK2052, TK0143, TK1413, TK2289, TK2270, TK1815, TK1439, TK0695, TK1259, TK0107, TK0448, TK1057, TK1058, TK1272, TK0697, TK0126, TK0539, TK1266, TK1688, TK2197, TK2218, TK1489, TK1339, TK0142, TK0169, TK1246, TK0770, TK1494, TK1924, TK2107, TK1143, TK1654, TK0151, TK0779, TK2151, TK0132, TK2287, TK1280, TK2024, TK0471, TK1769, TK1913, TK1050, Tpen_0466, Tpen_0552, Tpen_0860, Tpen_1509, Tpen_0232, Tpen_0836, Tpen_1499, Tpen_0577, Tpen_0018, Tpen_0579, Tpen_0150, Tpen_0366, Tpen_0869, Tpen_0668, Tpen_0348, Tpen_1236, Tpen_0124, Tpen_0102, Tpen_0973, Tpen_1621, Tpen_0378, Tpen_0538, Tpen_0707, Tpen_0776, Tpen_0069, Tpen_0090, Tpen_0173, Tpen_1796, Tpen_1358, Tpen_0115, Tpen_1464, Tpen_1595, Tpen_1401, Tpen_0901, Tpen_1818, Tpen_0293, Tpen_0690, Tpen_0374, Tpen_0710, Tpen_0070, Tpen_1551, Tpen_1591, Tpen_1154, Tpen_1562, Ta0472, Ta0731, Ta1110, Ta0115, Ta1173, Ta1443, Ta0185, Ta0678, Ta0608, Ta0257, Ta0981, Ta0093, Ta0550m, Ta0842, Ta0872, Ta1362m, Ta0736, Ta1394, Ta0166, Ta0675, Ta0748, Ta1231, Ta1186, Ta0106, Ta0948, Ta1282m, Ta1363, Ta0131, Ta0320m, Ta0411, Ta1064, Ta1166, Ta1218, Ta1503, Ta0201, Ta0346, Ta1496, Ta0868m, Ta1061m, Ta0825, Ta0795, Ta0199, Ta1485, Ta0945, Ta0940, Ta0134, Ta0685, Ta0890, Ta1324, TVN0192, TVN0983, TVN1251, TVN0658, TVN0295, TVN1196, TVN1337, TVN1127, TVN0160, TVN0945, TVN0938, TVN0292, TVN0236, TVN0364, TVN0447, TVN0906, TVN1422, TVN0185, TVN0291, TVN0514, TVN1093, TVN0210, TVN1272, TVN0519, TVN0603, TVN1246, TVN1408, TVN1203, TVN1162, TVN0516, TVN1265, TVN1392, TVN1493, TVN0934, TVN0728, TVN0704, TVN1394, TVN0084, TVN1083, TVN1089, TVN0213, TVN1149, TVN0972, TVN0377, LRC567, RCIX1274, RCIX1420, RCIX1655, RC 1X1698, RCIX2213, RCIX2336, RRC298, RRC486, RRC76, RCIX1140, RCIX2193, RCIX670, RCIX684, RCIX808, RCIX820, LRC582, RCIX785, LRC109, RCIX103, RCIX105, RCIX106, RCIX1508, RCIX1739, RCIX2247, RRC465, RCIX1740, RCIX2328, RRC178, LRC575, RCIX1349, RCIX1520, LRC520, RCIX125, RCIX1430, RCIX148, RCIX1527, RCIX1743, RCIX2456, RCIX449, RCIX571, RRC212, RCIX960, LRC190, RCIX1230, RCIX414, RCIX1747, LRC319, RCIX1292, RCIX1376, RCIX2173, RCIX2196, RRC154, RCIX1238, RCIX1068, RCIX1190, RCIX1914, RCIX2177, RCIX824, RCIX989, RCIX2108, LRC274, LRC304, RCIX1189, RCIX1785, RCIX1790 및 RCIX90이다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서 및/또는 스위치는 바실러스 서브틸리스 TF, 예컨대, Abh, AbrB, AcoR, AdaA, AhrC, AlaR, AlsR, AnsR, AraR, ArfM, ArsR, AzlB, BirA, BkdR, BltR, BmrR, CcpA, CcpB, CcpC, CggR, CheB, CheV, CheY, CitR, CitT, CodY, ComA, ComK, ComZ, CssR, CtsR, DctR, DegA, DegU, DeoR, DnaA, ExuR, FNR, FruR, Fur, GabR, GerE, GlcK, GlcR, GlcT, GlnR, GlpP, GltC, GltR, GntR, GutR, Fibs, Hpr, HrcA, HtrA, HutP, HxlR, IolR, Ipi, KdgR, KipR, LacR, LevR, LexA, LicR, LicT, LmrA, LrpA, LrpB, LrpC, LytR, LytT, ManR, MecA, Med, MntR, MsmR, Mta, MtlR, MtrB, NhaX, PadR, PaiA, PaiB, PerR, 파지(Phage) PBSX 전사 조절인자, PhoP, PksA, PucR, PurR, PyrR, RbsR, ResD, Rho, RocR, Rok, RplT, RsfA, SacT, SacV, SacY, SenS, SigA, SigB, SigD, SigE, SigF, SigG, SigH, SigI, SigK, SigL, SigM, SigV, SigW, SigX, SigY, SigZ, SinR, Sir, SplA, SpoOA, SpoOF, SpoIIID, SpoVT, TenA, TenI, TnrA, TreR, TrnB-Gly1, TrnB-Phe, TrnD-Cys, TrnD-Gly, TrnD-Phe, TrnD-Ser, TrnD-Trp, TrnD-Tyr, Trnl-Gly, Trnl-Thr, TrnJ-Gly, TrnS-Leu2, TrnSL-Tyr1, TrnSL-Val2, Xpf, Xre, XylR, YacF, YazB, YbaL, YbbB, YbbH, YbdJ, YbfA, YbfI, YbfP, YbgA, YcbA, YcbB, YcbG, YcbL, YccF, YccH, YceK, YcgE, YcgK, YclA, YclJ, YcnC, YcnK, YcxD, YczG, YdcH, YdcN, YdeB, YdeC, YdeE, YdeF, YdeL, YdeP, YdeS, YdeT, YdfD, YdfF, YdfI, YdfL, YdgC, YdgG, YdgJ, YdhC, YdhQ, YdhR, YdiH, YdzF, YerO, YesN, YesS, YetL, YezC, YezE, YfhP, YfiA, YfiF, YfiK, YfiR, YfiV, YfmP, YhbI, YhcB, YhcF, YhcZ, YhdE, YhdI, YhdQ, YhgD, YhjH, YhjM, YisR, YisV, YjbD, YjdI, YkmA, YkoG, YkoM, YkvE, YkvN, YkvZ, YlaC, YlbO, YlpC, YmfC, YneI, YoaU, YobD, YobQ, YocG, YodB, YofA, YonR, YopO, YopS, YozA, YozG, YpbH, YplP, YpoP, YpuH, YqaE, YqaF, YqaG, YqfL, YqzB, YraB, YraN, YrdQ, YrhI, YrhM, YrkP, YrxA, YrzC, YsiA, YsmB, YtcD, YtdP, YtlL, YtrA, YtsA, YttP, YtzE, YufM, YulB, YurK, YusO, YusT, YuxN, YvaF, YvaN, YvaO, YvaP, YvbA, YvbU, YvcP, YvdE, YvdT, YvfI, YvfU, YvhJ, YvkB, YvmB, YvnA, YvoA, YvqC, YvrH, YvrI, YvyD, YvzC, YwaE, YwbL, YwcC, YwfK, YwgB, YwhA, YwoH, YwqM, YwrC, YwtF, YxaD, YxaF, YxbF, YxdJ, YxjL, YxjO, YyaN, YybA, YybE, YybR, YycF, YydK 및 Zur의 조작된 버전이다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서 및/또는 스위치는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) TF의 조작된 버전, 예컨대, AT1G01060, AT1G01380, AT1G01530, AT1G02340, AT1G04370, AT1G06160, AT1G07640, AT1G09530, AT1G09770, AT1G10170, AT1G12610, AT1G12860, AT1G12980, AT1G13960, AT1G14350, AT1G14920, AT1G15360, AT1G16490, AT1G18570, AT1G19220, AT1G19350, AT1G19850, AT1G21970, AT1G22070, AT1G23420, AT1G24260, AT1G24590, AT1G25560, AT1G26310, AT1G26870, AT1G26945, AT1G27730, AT1G28300, AT1G30210, AT1G30330, AT1G30490, AT1G32330, AT1G32540, AT1G32640, AT1G32770, AT1G33240, AT1G34370, AT1G34790, AT1G35515, AT1G42990, AT1G45249, AT1G46768, AT1G47870, AT1G51700, AT1G52150, AT1G52880, AT1G52890, AT1G53230, AT1G53910, AT1G54060, AT1G55580, AT1G55600, AT1G56010, AT1G56650, AT1G62300, AT1G62360, AT1G63650, AT1G65620, AT1G66350, AT1G66390, AT1G66600, AT1G67260, AT1G68640, AT1G69120, AT1G69180, AT1G69490, AT1G69600, AT1G70510, AT1G71030, AT1G71692, AT1G71930, AT1G73730, AT1G74930, AT1G75080, AT1G76420, AT1G77850, AT1G78600, AT1G79180, AT1G79580, AT1G79840, AT2G01500, AT2G01570, AT2G01930, AT2G02450, AT2G03340, AT2G16910, AT2G17950, AT2G20180, AT2G22300, AT2G22540, AT2G22630, AT2G22770, AT2G23760, AT2G24570, AT2G26150, AT2G27050, AT2G27300, AT2G27990, AT2G28160, AT2G28350, AT2G28550, AT2G28610, AT2G30250, AT2G30432, AT2G33810, AT2G33835, AT2G33860, AT2G33880, AT2G34710, AT2G36010, AT2G36270, AT2G36890, AT2G37260, AT2G37630, AT2G38470, AT2G40220, AT2G40950, AT2G42200, AT2G42830, AT2G43010, AT2G45190, AT2G45660, AT2G46270, AT2G46410, AT2G46680, AT2G46770, AT2G46830, AT2G46870, AT2G46970, AT2G47190, AT2G47460, AT3G01140, AT3G01470, AT3G02990, AT3G03450, AT3G04670, AT3G07650, AT3G 10800, AT3G11440, AT3G12250, AT3G13540, AT3G13890, AT3G15170, AT3G15210, AT3G15500, AT3G15510, AT3G16770, AT3G16857, AT3G17609, AT3G 18990, AT3G19290, AT3G20310, AT3G20770, AT3G22170, AT3G23130, AT3G23250, AT3G24650, AT3G25710, AT3G26744, AT3G26790, AT3G27785, AT3G27810, AT3G27920, AT3G28470, AT3G28910, AT3G44750, AT3G46640, AT3G48160, AT3G48430, AT3G49940, AT3G50410, AT3G51060, AT3G54220, AT3G54320, AT3G54340, AT3G54620, AT3G55370, AT3G56400, AT3G58070, AT3G58780, AT3G59060, AT3G61850, AT3G61890, AT3G61910, AT3G62420, AT4G00120, AT4G00180, AT4G00220, AT4G01250, AT4G01540, AT4G02560, AT4G04450, AT4G08150, AT4G09820, AT4G09960, AT4G 15090, AT4G16110, AT4G16780, AT4G17750, AT4G 18960, AT4G20380, AT4G21330, AT4G21750, AT4G23550, AT4G23810, AT4G24020, AT4G24240, AT4G24470, AT4G24540, AT4G25470, AT4G25480, AT4G25490, AT4G25530, AT4G26150, AT4G27330, AT4G27410, AT4G28110, AT4G28610, AT4G30080, AT4G31550, AT4G31800, AT4G31920, AT4G32730, AT4G32880, AT4G32980, AT4G34000, AT4G34590, AT4G34990, AT4G35900, AT4G36730, AT4G36870, AT4G36920, AT4G36930, AT4G37540, AT4G37650, AT4G37750, AT4G38620, AT5G01900, AT5G02030, AT5G02470, AT5G03150, AT5G03680, AT5G03790, AT5G04240, AT5G05410, AT5G06070, AT5G06100, AT5G06650, AT5G06950, AT5G06960, AT5G07100, AT5G07690, AT5G07700, AT5G08130, AT5G09750, AT5G10140, AT5G10510, AT5G11260, AT5G11510, AT5G12870, AT5G13790, AT5G14010, AT5G14750, AT5G14960, AT5G15840, AT5G15850, AT5G16560, AT5G16820, AT5G17300, AT5G17430, AT5G18560, AT5G18830, AT5G20240, AT5G20730, AT5G21120, AT5G22220, AT5G22570, AT5G23000, AT5G23260, AT5G26660, AT5G35550, AT5G35770, AT5G37020, AT5G37260, AT5G40330, AT5G40350, AT5G40360, AT5G41315, AT5G41410, AT5G42630, AT5G43270, AT5G45980, AT5G47220, AT5G48670, AT5G51990, AT5G52830, AT5G53200, AT5G53210, AT5G53950, AT5G54070, AT5G56110, AT5G56270, AT5G56860, AT5G59570, AT5G59820, AT5G60690, AT5G60890, AT5G60910, AT5G61270, AT5G61420, AT5G61850, AT5G62000, AT5G62020, AT5G62380, AT5G62430, AT5G65050, AT5G66870, AT5G67300 및 AT5G67420이다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서 및/또는 스위치는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) TF의 조작된 버전, 예컨대, CG10325, CG11648, CG6093, CG3796, CG9151, CG15845, CG3935, CG3166, CG8376, CG3258, CG6677, CG3629, CG1034, CG3578, CG11491, CG12653, CG1759, CG6384, CG11924, CG4881, CG8367, CG17894, CG8669, CG2714, CG5893, CG9745, CG5102, CG2189, CG33183, CG9908, CG10798, CG1897, CG11094, CG2711, CG10604, CG32346, CG5714, CG1765, CG7383, CG32180, CG8127, CG1007, CG2988, CG9015, CG14941, CG8365, CG2328, CG8933, CG10488, CG6502, CG10002, CG2707, CG 10034, CG2047, CG4059, CG33133, CG9656, CG2692, CG3388, CG7952, CG6494, CG11607, CG9786, CG4694, CG9768, CG1619, CG5748, CG17117, CG17835, CG2275, CG33956, CG10197, CG4717, CG4761, CG3340, CG3647, CG3758, CG4158, CG4148, CG7664, CG10699, CG5954, CG17743, CG1264, CG3839, CG32120, CG1689, CG8346, CG6096, CG8361, CG1705, CG14548, CG8328, CG8333, CG2050, CG18740, CG9045, CG10250, CG11450, CG6534, CG3851, CG1133, CG7467, CG6824, CG5109, CG12212, CG3978, CG17077, CG9610, CG8246, CG6716, CG7230, CG6348, CG10393, CG1849, CG9495, CG1030, CG8544, CG7734, CG1641, CG16738, CG3956, CG3836, CG11121, CG7847, CG3992, CG7938, CG17958, CG6993, CG8573, CG8599, CG8409, CG8068, CG11502, CG4216, CG16778, CG1378, CG6883, CG8651, CG1374, CG1856, CG10619, CG2956, CG10388, CG2762, CG4380, CG6172, CG7803, CG1046, CG1048, CG3411, CG12154, CG7895, CG3827, CG11387, CG17950, CG12287, CG7450, CG2368, CG6143, CG6338, CG2939, CG6464, CG17228, CG1322, CG1449, CG7672, CG14307, CG7771, CG5403, CG3497, CG5488, CG4220, CG2125, CG18412, CG7902, CG7937, CG18023, CG9097, CG2102, CG1130, CG3242, CG10021, CG1132, CG3668, CG11921, CG11922, CG9310, CG8887, CG3114, CG6634, CG1464, CG11049, CG14513, CG3090, CG8404, CG3886, CG12052, CG4354, CG1454, CG7018, CG5583, CG2914, CG4952, CG5683, CG4491, CG33152, CG9930, CG5441, CG6570, CG3905, CG8704, CG17921, CG4817, CG7562, CG2851, CG5965, CG7508, CG5580, CG5557, CG6964, CG5575, CG6794, CG2655, CG3052, CG6545, CG7187, CG17161, CG8625, CG12399, CG1775, CG1429, CG31240, CG7260, CG5529, CG4654, CG12223, CG6376, CG5247, CG11494, CG33261, CG12296, CG8103, CG1072, CG7959, CG7960, CG8567, CG18389, CG11992, CG5069, CG12245, CG10601, CG6103, CG1864, CG2678, CG5264, CG11987, CG6215, CG8522, CG7199, CG11783, CG8396, CG11798, CG9019, CG4029, CG10036, CG7951, CG7659, CG1650, CG10159, CG15319, CG5838, CG9398, CG7413, CG5393, CG10571, CG10605, CG14029, CG6604, CG17888, CG13598, CG4257, CG13951, CG9648, CG11186, CG3858, CG9696, CG5799, CG14938, CG1343, CG6312, CG5201, CG10052, CG8013, CG1447, CG32788, CG11202, CG9415, CG1507, CG10270, CG3998, CG5005, CG10269, CG7391, CG8667, CG8727, CG5206, CG13316, CG7807, CG2819, CG3848, CG16902, CG6269, CG10016, CG7760, CG9653, CG1414, CG15552, CG4013, CG8524, CG1071, CG5649, CG2712, CG1605, CG11182, CG18455, CG4303, CG9102, CG17829, CG2932, CG11551, CG2262, CG8474, CG6352, CG6121, CG7958, CG4143, CG11354, CG5935, CG8290, CG32575, CG9418, CG11352, CG3871, CG6627, CG1024, CG8108, CG2790, CG1966, CG11194, CG9776, CG7758, CG8208, CG2244, CG5067, CG5229, CG18783, CG18124, CG15286, CG11405, CG3268, CG11902, CG5133, CG15269, CG3491, CG17328, CG4185, CG16863, CG12630, CG32904, CG17594, CG1922, CG13906, CG18024, CG9233, CG12690, CG2875, CG17592, CG4136, CG12236, CG3726, CG3815, CG3847, CG14441, CG14438, CG3075, CG4575, CG3032, CG4617, CG9650, CG2116, CG2120, CG2129, CG15336, CG10959, CG18262, CG11294, CG12075, CG15365, CG7041, CG7055, CG2889, CG9817, CG2202, CG11122, CG11696, CG11695, CG11085, CG4404, CG4318, CG15749, CG1716, CG11172, CG11071, CG6211, CG9215, CG8119, CG8944, CG8578, CG8909, CG8924, CG9609, CG6769, CG5927, CG6470, CG7101, CG7556, CG14200, CG9571, CG11710, CG1529, CG11617, CG4133, CG31670, CG11723, CG17257, CG3407, CG17612, CG15435, CG15436, CG9088, CG13775, CG9200, CG4496, CG3838, CG13123, CG18619, CG18144, CG5034, CG12299, CG4621, CG6686, CG6792, CG9932, CG5204, CG9305, CG7099, CG5953, CG17912, CG5545, CG10348, CG10431, CG10446, CG17568, CG10263, CG10366, CG10462, CG10447, CG10631, CG10949, CG9342, CG18362, CG15216, CG1832, CG3136, CG2682, CG1845, CG1621, CG1620, CG1603, CG1602, CG12769, CG11641, CG8643, CG8216, CG1663, CG18446, CG12744, CG1407, CG18011, CG12942, CG12391, CG13204, CG12370, CG8821, CG8819, CG3850, CG4676, CG6061, CG6701, CG17385, CG17390, CG10209, CG8089, CG8092, CG16801, CG8314, CG8388, CG7786, CG4282, CG15710, CG17287, CG18468, CG4903, CG15073, CG11906, CG13424, CG9954, CG10543, CG9437, CG10321, CG10318, CG13493, CG11301, CG10344, CG9895, CG9890, CG9876, CG3941, CG5591, CG3065, CG3328, CG11414, CG4707, CG6905, CG1233, CG17181, CG13897, CG9139, CG2199, CG12104, CG1244, CG15812, CG14962, CG14965, CG12029, CG12605, CG15011, CG5249, CG17334, CG13287, CG13296, CG10274, CG7386, CG10147, CG8591, CG7404, CG7015, CG6683, CG6765, CG5093, CG5187, CG3891, CG3445, CG3654, CG7839, CG6272, CG11799, CG7368, CG4328, CG10704, CG10654, CG14117, CG17361, CG17359, CG7345, CG3919, CG6854, CG13458, CG7372, CG15715, CG9705, CG32171, CG18265, CG7271, CG4076, CG8765, CG11456, CG10565, CG7204, CG11247, CG14451, CG14655, CG14667, CG12162, CG10979, CG10296, CG9727, CG10267, CG33323, CG2702, CG9638, CG7963, CG8145, CG11762, CG8159, CG9793, CG9797, CG8359, CG11966, CG11984, CG11033, CG12952, CG16779, CG8301, CG8319, CG16899, CG8478, CG8484, CG6254, CG4570, CG4820, CG6689, CG6791, CG14710, CG6808, CG14711, CG6813, CG18476, CG6913, CG10042, CG5196, CG5245, CG33976, CG7518, CG15889, CG3143, CG7987, CG14860, CG6654, CG6276, CG5083, CG10278, CG5952, CG10309, CG3995, CG17803, CG17806, CG17802, CG17801, CG7357, CG7785, CG18599, CG7691, CG17186, CG4424, CG4854, CG4413, CG4936, CG4360, CG4217, CG15696, CG5737, CG7056, CG7045, CG7046, CG6990, CG4677, CG33336, CG4374, CG6129, CG5669, CG13617, CG13624, CG6892, CG11375, CG10669, CG4553, CG4730, CG17198, CG17197, CG17195, CG4956, CG32474, CG3350, CG5586, CG1647, CG14514, CG15504, CG15514, CG7928, CG2229, CG12071, CG11317, CG12054, CG1792, CG2052, CG11093, CG11152, CG11153, CG17172, CG6889, CG3743, CG13475, CG3526, CG11398, CG12767, CG15367, CG33473, CG14767, CG3576, CG12659, CG13109, CG12809, CG8817, CG8254, CG16910, CG3274, CG18764, CG32139, CG32577, CG2380, CG15736, CG13399, CG4427, CG12219, CG18647, CG31753, CG33720, CG30011, CG30020, CG30077, CG30401, CG30403, CG30420, CG30431, CG30443, CG31169, CG31224, CG31365, CG31388, CG31392, CG31441, CG31460, CG31481, CG31510, CG31612, CG31632, CG31642, CG31782, CG31835, CG31875, CG31955, CG32006, CG32050, CG32105, CG32121, CG32264, CG32296, CG32532, CG32719, CG32767, CG32772, CG32778, CG32830, CG33695, CG32982, CG33178, CG33213, CG33221, CG33520, CG33525, CG33557, CG33936, CG33980, CG34031, CG12632, CG17469, CG34100, CG34145, CG34149, CG34340, CG34346, CG34367, CG34376, CG34395, CG34403, CG34406, CG34407, CG34415, CG34419, CG34421, CG34422, CG8961, CG9397, CG10037, CG31258, CG31666, CG12196, CG6930, CG12238, CG33546, CG42234, CG34360, CG42267, CG42277, CG42281, CG42311, CG42332, CG42344, CG4807, CG7752, CG12701, CG17100, CG11971, CG42516, CG42515, CG6667, CG1028, CG3281, CG12124, CG42599, CG8506, CG17836, CG1070 및 CG8676이다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서 및/또는 스위치는, 마우스 TF의 조작된 버전, 예컨대, 마우스 좌위 11538, 11568, 11569, 11614, 11622, 11624, 11632, 11634, 11694, 11695, 11733, 11736, 11819, 11835, 11859, 11863, 11864, 11865, 11878, 11906, 11908, 11909, 11910, 11911, 11920, 11921, 11922, 11923, 11924, 11925, 11991, 12013, 12014, 12020, 12021, 12022, 12023, 12029, 12051, 12053, 12142, 12151, 12173, 12180, 12189, 12192, 12224, 12265, 12326, 12355, 12387, 12393, 12394, 12395, 12399, 12400, 12416, 12417, 12418, 12454, 12455, 12566, 12567, 12572, 12578, 12579, 12580, 12581, 12590, 12591, 12592, 12606, 12607, 12608, 12609, 12611, 12653, 12677, 12705, 12753, 12785, 12848, 12912, 12913, 12914, 12915, 12916, 12951, 13017, 13018, 13047, 13048, 13134, 13163, 13170, 13172, 13180, 13196, 13198, 13345, 13390, 13392, 13393, 13394, 13395, 13396, 13433, 13435, 13486, 13494, 13496, 13555, 13557, 13559, 13560, 13591, 13592, 13593, 13626, 13653, 13654, 13655, 13656, 13661, 13709, 13710, 13711, 13712, 13713, 13714, 13716, 13796, 13797, 13798, 13799, 13813, 13819, 13864, 13865, 13871, 13872, 13875, 13876, 13982, 13983, 13984, 14008, 14009, 14011, 14013, 14025, 14028, 14029, 14030, 14055, 14056, 14085, 14105, 14106, 14154, 14155, 14200, 14233, 14234, 14235, 14236, 14237, 14238, 14239, 14240, 14241, 14247, 14281, 14282, 14283, 14284, 14359, 14390, 14391, 14457, 14460, 14461, 14462, 14463, 14464, 14465, 14472, 14489, 14531, 14534, 14536, 14581, 14582, 14605, 14632, 14633, 14634, 14659, 14797, 14815, 14836, 14842, 14843, 14884, 14885, 14886, 14896, 14912, 15110, 15111, 15161, 15163, 15181, 15182, 15183, 15184, 15185, 15193, 15205, 15206, 15207, 15208, 15209, 15213, 15214, 15218, 15220, 15221, 15223, 15227, 15228, 15229, 15242, 15248, 15251, 15258, 15260, 15273, 15284, 15285, 15331, 15353, 15354, 15361, 15364, 15370, 15371, 15372, 15373, 15375, 15376, 15377, 15378, 15379, 15384, 15394, 15395, 15396, 15397, 15398, 15399, 15400, 15401, 15402, 15403, 15404, 15405, 15407, 15408, 15410, 15412, 15413, 15414, 15415, 15416, 15417, 15421, 15422, 15423, 15424, 15425, 15426, 15427, 15429, 15430, 15431, 15432, 15433, 15434, 15436, 15437, 15438, 15460, 15499, 15500, 15563, 15569, 15900, 15901, 15902, 15903, 15904, 15951, 15976, 16150, 16151, 16201, 16348, 16362, 16363, 16364, 16371, 16372, 16373, 16391, 16392, 16476, 16477, 16478, 16596, 16597, 16598, 16599, 16600, 16601, 16656, 16658, 16761, 16764, 16814, 16815, 16825, 16826, 16842, 16869, 16870, 16871, 16872, 16873, 16874, 16875, 16876, 16909, 16911, 16917, 16918, 16969, 17095, 17119, 17121, 17122, 17125, 17126, 17127, 17128, 17129, 17130, 17131, 17132, 17133, 17134, 17135, 17172, 17173, 17187, 17188, 17191, 17192, 17215, 17216, 17217, 17218, 17219, 17220, 17257, 17258, 17259, 17260, 17261, 17268, 17274, 17283, 17285, 17286, 17300, 17301, 17318, 17341, 17342, 17344, 17354, 17355, 17420, 17425, 17428, 17480, 17536, 17537, 17681, 17684, 17692, 17701, 17702, 17703, 17749, 17764, 17765, 17859, 17863, 17864, 17865, 17869, 17870, 17876, 17877, 17878, 17927, 17928, 17932, 17933, 17936, 17937, 17938, 17977, 17978, 17979, 17984, 18002, 18012, 18013, 18014, 18018, 18019, 18020, 18021, 18022, 18023, 18024, 18025, 18027, 18028, 18029, 18030, 18032, 18033, 18034, 18036, 18037, 18038, 18044, 18045, 18046, 18071, 18072, 18088, 18089, 18091, 18092, 18094, 18095, 18096, 18109, 18124, 18128, 18129, 18131, 18132, 18140, 18142, 18143, 18171, 18181, 18185, 18193, 18198, 18227, 18291, 18292, 18393, 18412, 18420, 18423, 18424, 18426, 18432, 18503, 18504, 18505, 18506, 18507, 18508, 18509, 18510, 18511, 18514, 18515, 18516, 18519, 18572, 18606, 18609, 18612, 18616, 18617, 18626, 18627, 18628, 18667, 18676, 18685, 18736, 18740, 18741, 18742, 18771, 18789, 18854, 18933, 18935, 18983, 18985, 18986, 18987, 18988, 18990, 18991, 18992, 18993, 18994, 18995, 18996, 18997, 18998, 18999, 19009, 19013, 19014, 19015, 19016, 19017, 19018, 19049, 19056, 19060, 19084, 19099, 19127, 19130, 19182, 19184, 19202, 19213, 19231, 19290, 19291, 19326, 19330, 19377, 19401, 19411, 19434, 19645, 19650, 19651, 19664, 19668, 19687, 19696, 19697, 19698, 19708, 19712 19724 19725 19726, 19727, 19763, 19820, 19822, 19826, 19883, 19885, 20016, 20017, 20018, 20019, 20020, 20021, 20022, 20024, 20128, 20174, 20181, 20182, 20183, 20185, 20186, 20204, 20218, 20220, 20230, 20231, 20232, 20289, 20371, 20375, 20384, 20409, 20429, 20439, 20464, 20465, 20466, 20467, 20471, 20472, 20473, 20474, 20475, 20476, 20480, 20481, 20583, 20585, 20586, 20587, 20589, 20591, 20592, 20602, 20613, 20638, 20664, 20665, 20666, 20667, 20668, 20669, 20670, 20671, 20672, 20673, 20674, 20675, 20677, 20678, 20679, 20680, 20681, 20682, 20683, 20687, 20688, 20689, 20728, 20787, 20788, 20807, 20819, 20833, 20841, 20842, 20846, 20847, 20848, 20849, 20850, 20851, 20852, 20893, 20901, 20904, 20922, 20923, 20924, 20997, 21339, 21340, 21341, 21343, 21349, 21350, 21374, 21375, 21380, 21382, 21383, 21384, 21385, 21386, 21387, 21388, 21389, 21399, 21400, 21401, 21405, 21406, 21407, 21408, 21410, 21411, 21412, 21413, 21414, 21415, 21416, 21417, 21418, 21419, 21420, 21422, 21423, 21425, 21426, 21427, 21428, 21429, 21652, 21674, 21676, 21677, 21678, 21679, 21685, 21780, 21781, 21783, 21804, 21807, 21815, 21833, 21834, 21835, 21843, 21847, 21848, 21849, 21869, 21885, 21886, 21887, 21888, 21907, 21908, 21909, 21917, 21929, 21945, 21981, 22025, 22026, 22051, 22057, 22059, 22061, 22062, 22088, 22160, 22200, 22221, 22255, 22259, 22260, 22278, 22282, 22286, 22326, 22337, 22383, 22385, 22431, 22433, 22608, 22632, 22634, 22639, 22640, 22642, 22646, 22654, 22658, 22661, 22666, 22668, 22678, 22680, 22685, 22689, 22691, 22694, 22695, 22696, 22697, 22698, 22700, 22701, 22702, 22704, 22709, 22710, 22712, 22715, 22717, 22718, 22719, 22722, 22750, 22751, 22754, 22755, 22756, 22757, 22758, 22759, 22761, 22762, 22764, 22767, 22768, 22770, 22771, 22772, 22773, 22775, 22776, 22778, 22779, 22780, 23808, 23827, 23849, 23850, 23856, 23857, 23871, 23872, 23885, 23894, 23942, 23957, 23958, 23989, 23994, 24068, 24074, 24075, 24113, 24116, 24135, 24136, 26356, 26371, 26379, 26380, 26381, 26386, 26404, 26413, 26417, 26419, 26423, 26424, 26427, 26461, 26465, 26573, 26754, 26927, 26939, 27049, 27056, 27057, 27059, 27081, 27140, 27217, 27223, 27224, 27274, 27386, 28019, 29806, 29808, 29813, 29861, 29871, 30046, 30051, 30794, 30841, 30923, 30927, 30928, 30942, 30944, 30946, 30951, 50496, 50524, 50721, 50754, 50777, 50783, 50794, 50796, 50817, 50868, 50887, 50907, 50913, 50914, 50916, 50996, 51792, 51813, 52024, 52040, 52231, 52502, 52609, 52615, 52705, 52708, 52712, 52897, 53314, 53317, 53357, 53380, 53415, 53417, 53626, 53868, 53869, 53970, 53975, 54006, 54123, 54131, 54132, 54139, 54169, 54343, 54352, 54388, 54422, 54446, 54562, 54601, 54633, 54678, 54711, 55927, 55942, 55994, 56030, 56070, 56196, 56198, 56218, 56220, 56222, 56233, 56275, 56309, 56312, 56314, 56321, 56353, 56380, 56381, 56404, 56406, 56449, 56458, 56469, 56484, 56490, 56501, 56503, 56505, 56522, 56523, 56525, 56613, 56642, 56707, 56736, 56771, 56784, 56787, 56805, 56809, 56856, 56869, 57080, 57230, 57246, 57314, 57316, 57376, 57737, 57745, 57748, 57756, 57765, 57782, 58172, 58180, 58198, 58202, 58206, 58234, 58805, 59004, 59021, 59024, 59026, 59035, 59057, 59058, 60345, 60406, 60611, 64050, 64144, 64290, 64379, 64383, 64384, 64406, 64453, 64685, 65020, 65247, 65255, 65256, 65257, 66056, 66118, 66136, 66213, 66233, 66277, 66352, 66376, 66420, 66464, 66491, 66505, 66556, 66596, 66622, 66634, 66642, 66671, 66698, 66729, 66799, 66867, 66880, 66923, 66930, 66959, 66970, 66980, 66985, 67057, 67065, 67122, 67150, 67151, 67155, 67199, 67235, 67260, 67279, 67288, 67367, 67370, 67379, 67381, 67389, 67419, 67439, 67575, 67657, 67673, 67692, 67710, 67815, 67847, 67873, 67949, 67985, 67993, 68040, 68153, 68196, 68268, 68346, 68479, 68558, 68701, 68705, 68776, 68839, 68842, 68854, 68910, 68911, 68992, 69020, 69125, 69167, 69168, 69188, 69234, 69241, 69257, 69260, 69299, 69317, 69389, 69539, 69606, 69656, 69716, 69790, 69833, 69890, 69920, 69944, 70073, 70122, 70127, 70315, 70350, 70392, 70408, 70428, 70459, 70497, 70508, 70601, 70625, 70637, 70650, 70673, 70779, 70796, 70797, 70823, 70859, 70981, 71041, 71063, 71131, 71137, 71163, 71176, 71241, 71280, 71371, 71375, 71409, 71458, 71468, 71592, 71597, 71702, 71722, 71752, 71767, 71777, 71782, 71793, 71828, 71834, 71838, 71839, 71939, 71949, 71990, 71991, 72057, 72074, 72135, 72180, 72195, 72199, 72290, 72293, 72323, 72325, 72388, 72459, 72465, 72475, 72556, 72567, 72615, 72720, 72727, 72739, 72823, 72949, 72958, 73178, 73181, 73340, 73389, 73451, 73469, 73503, 73610, 73614, 73844, 73845, 73945, 74007, 74068, 74106, 74120, 74123, 74149, 74164, 74168, 74197, 74282, 74318, 74322, 74326, 74335, 74352, 74377, 74481, 74533, 74561, 74570, 74838, 75196, 75199, 75210, 75291, 75305, 75339, 75387, 75480, 75482, 75507, 75572, 75599, 75605, 75646, 75725, 75901, 76007, 76022, 76294, 76308, 76365, 76389, 76467, 76572, 76580, 76793, 76803, 76804, 76834, 76893, 76900, 77057, 77114, 77117, 77264, 77286, 77318, 77480, 77683, 77889, 77907, 77913, 78020, 78088, 78246, 78251, 78284, 78455, 78469, 78541, 78619, 78656, 78699, 78703, 78783, 78829, 78910, 78912, 78921, 78929, 79221, 79233, 79362, 79401, 80283, 80509, 80720, 80732, 80859, 80902, 81601, 81630, 81703, 81845, 81879, 83383, 83395, 83396, 83557, 83602, 83925, 83993, 84653, 93674, 93681, 93686, 93691, 93759, 93760, 93761, 93762, 93837, 93871, 94047, 94112, 94187, 94275, 96979, 97064, 97165, 98053, 98403, 99377, 99730, 100090, 100563, 100710, 100978, 101095, 101206, 102162, 102209, 102334, 103136, 103806, 103889, 104328, 104349, 104360, 104383, 104384, 104394, 104886, 105377, 105594, 105859, 106795, 106894, 107351, 107433, 107499, 107503, 107568, 107586, 107751, 107765, 107771, 107889, 107932, 107951, 108060, 108098, 108143, 108655, 108672, 108857, 109113, 109115, 109575, 109594, 109663, 109676, 109889, 109910, 109958, 109972, 109973, 109995, 110052, 110061, 110068, 110109, 110147, 110506, 110521, 110616, 110641, 110647, 110648, 110784, 110796, 110805, 110913, 112077, 114142, 114565, 114606, 114642, 114774, 114889, 116810, 116848, 116870, 116871, 116912, 117168, 117198, 117590, 118445, 140477, 140490, 140500, 140577, 140743, 170574, 170644, 170729, 170740, 170767, 170787, 170791, 170826, 170938, 192195, 192231, 192285, 192651, 192657, 193796, 195333, 208076, 208258, 208266, 208292, 208439, 208677, 208715, 209011, 209357, 209361, 209416, 209446, 209448, 209707, 210135, 210162, 211378, 212168, 212276, 212391, 212712, 213010, 213990, 214105, 214162, 214384, 214669, 214899, 215031, 216151, 216154, 216285, 216456, 216558, 216578, 217031, 217082, 217127, 217166, 217558, 218030, 218440, 218490, 218624, 218772, 218989, 219150, 223227, 223690, 223701, 223922, 224419, 224585, 224656, 224694, 224829, 224902, 224903, 225876, 225895, 225998, 226049, 226182, 226442, 226641, 226747, 226896, 227099, 227644, 227656, 227940, 228136, 228598, 228731, 228775, 228790, 228829, 228839, 228852, 228869, 228876, 228880, 228980, 229004, 229534, 229663, 229906, 230073, 230162, 230587, 230674, 230700, 230753, 230908, 230936, 230991, 231044, 231051, 231329, 231386, 231986, 231991, 232232, 232337, 232807, 232853, 232854, 232878, 232906, 233056, 233410, 233490, 233863, 233887, 233890, 233908, 233987, 234725, 234959, 235028, 235041, 235050, 235320, 235442, 235582, 235623, 235682, 236193, 237052, 237336, 237409, 237615, 237758, 237960, 238247, 239099, 239546, 239652, 240064, 240120, 240263, 240427, 240442, 240476, 240590, 240690, 241066, 241447, 241520, 242523, 242620, 242705, 243187, 243833, 243906, 243931, 243963, 243983, 244349, 244713, 244813, 244954, 245572, 245583, 245596, 245688, 245841, 246086, 246196, 246198, 246791, 252829, 260298, 268281, 268301, 268396, 268448, 268564, 268741, 268903, 268932, 269252, 269713, 269870, 270076, 270627, 271278, 271305, 272347, 272359, 272382, 277353, 319196, 319207, 319535, 319594, 319599, 319601, 319615, 319695, 319785, 320067, 320376, 320429, 320586, 320595, 320790, 320799, 320875, 320995, 328572, 330301, 330361, 330502, 332937, 338353, 347691, 353187, 353208, 378435, 381319, 356626 및 386655이다.
예시적인 aTF는 문헌[Ramos, et al. Microbiology and Molecular Biology Reviews, June 2005, p. 326-356 및 Tropell, et al. Microbiol Mol Biol Rev. 2004 Sep;68(3):474-500]에서 발견되고, 이의 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단백질 센서 아미노산 서열은, 조작이 일어날 때, 각종 실시형태에 있어서, BLASTP, PSI-BLAST, DELTA-BLAST, 또는 HMMER, JackHMMER, 또는 서열 동족체 검색에 의해 선택된 대응하는 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 사용해서 서열 동족체에 의해 선택될 수 있다.
후보 단백질 센서일 수 있는 단백질 서열을 식별하는 방법은, US 2016/0063177에서 발견되되, 해당 문헌의 전체 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 야생형 알로스테릭 단백질 센서의 결합 활성을 변화시키는 조작 접근법, 예컨대, 알로스테릭 단백질 동족 리간드(즉, 야생형 알로스테릭 단백질 센서에 결합하는 리간드)을 희생하면서 표적 분자를 결합하는 데 적합하게 되도록 야생형 알로스테릭 단백질 센서를 조작하는 것은 돌연변이유발을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 돌연변이유발은, 예컨대, 치환, 삽입, 결실 및 절단으로부터 독립적으로 선택된, 야생형 알로스테릭 단백질 센서에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이고, 보전적 및/또는 비-보존적 치환을 포함할 수 있다.
"보존적 치환"은, 예를 들어, 내포된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 속성의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 20개의 천연 유래 아미노산은 이하의 6가지 표준 아미노산 군으로 그룹화된다: (1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Glu; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이,"보존적 치환"은 위에서 나타낸 6가지 표준 아미노산기의 동일 군 내에 열거된 다른 아미노산으로의 아미노산의 교환으로서 정의된다. 예를 들어, Glu로의 Asp의 교환은 그렇게 변형된 폴리펩타이드에 하나의 음전하를 유지시킨다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 능력에 기초하여 서로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "비-보존적 치환"은 위에서 나타낸 6가지 표준 아미노산군 (1) 내지 (6) 중 상이한 군에 열거된 다른 아미노산으로의 아미노산의 교환으로서 정의된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 치환은 또한 비-고전적인 아미노산(예컨대, 일반적으로 셀레노시스테인, 피로라이신, N-폼일메티오닌 β-알라닌, GABA 및 δ-아미노레불린산, 4-아미노벤조산(PABA), 일반적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4-다이아미노부티르산, α-아미노 아이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, γ-Abu, ε-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 아이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코솜, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산, 예컨대, β-메틸 아미노산, C α-메틸 아미노산, N α-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 기존의 알로스테릭 단백질, 예컨대, aTF로부터의 설계를 이용해서 조작된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 설계는 인 실리코 설계(in silico design)를 포함한다. 예시적인, 비제한적인 설계 원리는 US 2016/0063177에서 발견되며, 이의 전체 내용은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입된다.
예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 분자 모델링은 알로스테릭 단백질이 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있게 부여할 수 있는 알로스테릭 단백질에서의 돌연변이를 예측하는데 사용된다. 각종 실시형태에 있어서, 전형적으로 x-선 결정학, 핵자기공명(NMR), 산란, 또는 회절 수법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 실험 방법을 통해서 얻어진 실험적으로 유도된 3-차원 단백질 구조란 언급은 알로스테릭 단백질이 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있게 부여할 수 있는 돌연변이를 모델링 및/또는 예측하기 위하여 이용된다. 각종 실시형태에 있어서, ROSETTA 소프트웨어 스위트(software suite)는 모델링을 돕는데 이용된다(문헌[Kaufmann et al. Biochemistry. 2010 Apr 13;49(14):2987-98] 참조, 이의 전체 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다). 대안적으로, 또는 조합하여, ROBETTA, TASSER, l-TASSER, HHpred, HHsearch, 또는 MODELLER, 또는 SWISS-MODEL과 같은 상동성 모델링 알고리즘이 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, (제한 없이) 알로스테릭 단백질이 실험적으로 유도된 3-차원 단백질 구조를 결여하는 것과 같이, 상동성 모델링 알고리즘은 서열 상동성 모델을 구축하는데 사용될 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 하나 이상의 서열 또는 구조 동족체는 3-차원 단백질 구조의 아미노산 서열에 대해서 90% 미만의 아미노산 서열 동일성, 85% 미만의 아미노산 서열 동일성, 80% 미만의 아미노산 서열 동일성, 75% 미만의 아미노산 서열 동일성, 70% 미만의 아미노산 서열 동일성, 65% 미만의 아미노산 서열 동일성, 60% 미만의 아미노산 서열 동일성, 55% 미만의 아미노산 서열 동일성, 50% 미만의 아미노산 서열 동일성, 45% 미만의 아미노산 서열 동일성, 40% 미만의 아미노산 서열 동일성, 35% 미만의 아미노산 서열 동일성, 30% 미만의 아미노산 서열 동일성, 25% 미만의 아미노산 서열 동일성, 또는 그 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 예시적인 상동성 모델링 방법 및 원리는 US 2016/0063177, 예컨대, 단락 [0085] 내지 [0093]에서 발견되며, 이들의 전체 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 야생형 알로스테릭 단백질의 구조는 (예컨대, 하나 이상의 표적 분자를 알로스테릭 단백질의 구조 내에 도킹시킴으로써) 알로스테릭 단백질에 하나 이상의 표적 분자를 결합할 수 있게 하는 변형에 대해서 평가된다. 예시적인 도킹 방법 및 원리는 US 2016/0063177, 예컨대, 단락 [0095] 내지 [0101]에서 발견되며, 이들의 전체 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
각종 실시형태에 있어서, 야생형 알로스테릭 단백질로의 잠재적 돌연변이의 라이브러리가 제조되고, 양성 또는 음성 선택이 목적하는 돌연변이체를 스크리닝하는데 사용된다.
각종 실시형태에 있어서, 조작은 컴퓨터 단백질 설계의 기술(미국 특허 제7,574,306호 및 미국 특허 제8,340,951호(이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같음) 유도 발생 기술, 합리적인 돌연변이유발, 또는 이들의 임의의 적합한 조합을 사용할 수 있다.
각종 실시형태에 있어서, 알로스테릭 단백질에 대한 잠재적인 돌연변이의 라이브러리가 제조되고 양성 또는 음성 선택이 목적하는 돌연변이체를 스크리닝하는데 이용된다.
각종 실시형태에 있어서, 조작은 컴퓨터 단백질 설계 기술(본 명세서에 전문이 참조에 의해 편입된 미국 특허 제7,574,306호 및 미국 특허 제8,340,951호에 개시된 바와 같음) 유도 전개 기술, 합리적인 돌연변이유발, 또는 이들의 임의의 적합한 조합을 사용할 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이 기술, 예컨대, 유전자 셔플링(gene shuffling), 상동성 재조합(homologous recombination), 도메인 스와핑(domain swapping), 심층 돌연변이 스캐닝(deep mutation scanning) 및/또는 랜덤 돌연변이유발(random mutagenesis)이 이용될 수 있다.
예시적인 단백질 센서 및 동족 리간드는 WO 2015/127242, 예를 들어, 제7 페이지의 표(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에서 발견된다.
각종 실시형태에 있어서, 단백질 센서는 기존의 알로스테릭 단백질, 예컨대, aTF로부터의 설계를 이용해서 조작된다. 각종 실시형태에 있어서, 설계는 인 실리코 설계를 포함한다. 예시적인 설계 원리는 US 2016/0063177에서 발견되며, 이의 전체 내용은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입된다.
예를 들어, 각종 실시형태에 있어서, 분자 모델링은 알로스테릭 단백질이 1개 이상의 표적 분자에 결합할 수 있게 하는 알로스테릭 단백질에서의 돌연변이를 예측하는데 사용된다. 각종 실시형태에 있어서, 전형적으로, x-선 결정학, 핵자기공명(NMR), 산란, 또는 회절 기술을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 실험적 방법을 통해서 얻어진 실험적으로 유도된 3-차원 단백질 구조에 대한 언급은 알로스테릭 단백질이 1개 이상의 표적 분자에 결합할 수 있게 하는 알로스테릭 단백질에서의 돌연변이를 모델링 및/또는 예측하는데 사용된다. 각종 실시형태에 있어서, ROSETTA 소프트웨어 스위트는 모델링을 돕는데 이용된다(문헌[Kaufmann et al. Biochemistry. 2010 Apr 13;49(14):2987-98] 참조, 이의 전체 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다).
대안적으로 또는 조합하여, 상동성 모델링 알고리즘, 예컨대, ROBETTA, TASSER, l-TASSER, HHpred, HHsearch 또는 MODELLER, 또는 SWISS-MODEL이 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 예컨대, (제한 없이) 알로스테릭 단백질이 실험적으로 유도된 3-차원 단백질 구조를 결여하는 것, 상동성 모델링 알고리즘은 서열 상동성 모델을 결합하는데 사용될 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 하나 이상의 서열 또는 구조 동족체는 3-차원 단백질 구조의 아미노산 서열에 대해서 90% 미만의 아미노산 서열 동일성, 85% 미만의 아미노산 서열 동일성, 80% 미만의 아미노산 서열 동일성, 75% 미만의 아미노산 서열 동일성, 70% 미만의 아미노산 서열 동일성, 65% 미만의 아미노산 서열 동일성, 60% 미만의 아미노산 서열 동일성, 55% 미만의 아미노산 서열 동일성, 50% 미만의 아미노산 서열 동일성, 45% 미만의 아미노산 서열 동일성, 40% 미만의 아미노산 서열 동일성, 35% 미만의 아미노산 서열 동일성, 30% 미만의 아미노산 서열 동일성, 25% 미만의 아미노산 서열 동일성, 또는 그 미만의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 예시적인 동족성 모델링 방법 및 원리는 US 2016/0063177, 예컨대, 단락 [0085] 내지 [0093]에서 발견되고, 이들의 전체 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 알로스테릭 단백질의 구조는 (예컨대, 알로스테릭 단백질의 구조에 하나 이상의 표적 분자를 도킹함으로써) 알로스테릭 단백질이 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있게 하는 변형에 대해서 평가된다. 예시적인 도킹 방법 및 원리는 US 2016/0063177, 예컨대, 단락 [0095] 내지 [0101]에서 발견되며, 이들의 전체 내용은 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
각종 실시형태에 있어서, 알로스테릭 단백질에 대한 잠재적인 돌연변이의 라이브러리가 제조되고 양성 또는 음성 선택이 목적하는 돌연변이체를 스크리닝하는데 이용된다.
각종 실시형태에 있어서, 조작은 컴퓨터 단백질 설계 기술(본 명세서에 전문이 참조에 의해 편입된 미국 특허 제7,574,306호 및 미국 특허 제8,340,951호에 개시된 바와 같음) 유도 전개 기술, 합리적인 돌연변이유발, 또는 이들의 임의의 적합한 조합을 사용할 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 돌연변이 기술, 예컨대, 유전자 셔플링, 상동성 재조합, 도메인 스와핑, 심층 돌연변이 스캐닝 및/또는 랜덤 돌연변이유발이 이용될 수 있다.
제한으로서가 아니라 예로서, 표 1은 본 발명의 각종 실시형태에 따라서 변형될 수 있는 예시적인 단백질 센서를 제공한다. 예를 들어, 각종 실시형태에 있어서, 당업자는 aTF("섀시(Chassis)") 및/또는 천연 리간드를 선택할 수 있고, 본 명세서에서의 개시내용에 따라서, 제공된 대표적인 구조(PDB), 표적 분자 또는 표적 분자의 섀시에 대한 설계 조작된 단백질 센서(표적 분자 특성 칼럼 참조)를 참조할 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
각종 실시형태에 있어서, 돌연변이 또는 인 실리코 설계에 대해서 표적화된 아미노산은 도킹을 통해서 또는 실험적 방법, 예컨대, x-선 결정학에 의해 결합 포켓으로 모델링된 리간드의 약 3, 또는 약 5, 또는 약 7, 또는 약 10, 또는 약 12 옹스트롬(예컨대, 약 3 내지 약 12 옹스트롬, 또는 약 5 내지 약 12 옹스트롬, 또는 약 7 내지 약 12 옹스트롬, 또는 약 10 내지 약 12 옹스트롬, 또는 약 3 내지 약 5 옹스트롬, 또는 약 3 내지 약 7 옹스트롬, 또는 약 3 내지 약 10 옹스트롬) 이내인 것이다.
단백질 센서 및/또는 스위치가 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있는 돌연변이된 알로스테릭 단백질은 표준 결합 검정(예컨대, 형광, 방사선 검정 등)을 이용해서 스크리닝될 수 있다.
각종 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 문헌[Taylor, et al. Nat. Methods 13(2): 177](이의 전체 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 기재된 바와 같이 조작된다.
조작된 생산자 균주/세포
위에서 기재된 조작된 생산자 균주(또는 세포)는 적어도 하나의 관심대상 표적 산물(또는 분자)을 생산하도록 조작된 균주 또는 세포(예컨대, 박테리아, 효모, 조류, 식물, 곤충, 또는 포유류(인간 또는 비-인간) 균주 또는 세포)를 지칭하며, 여기서 관심대상 표적 산물(또는 분자)은 위에서 논의된 센서 시스템에 의해 검출(예컨대, 조작된 센서 플라스미드 또는 균주에 의해 검출)될 수 있다.
예로써, 일부 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서가 조작될 수 있는 관심대상 표적 산물(또는 분자)은 WO 2015/017866, 예컨대, 단락 [00107] 내지 [00112](이의 전체 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 기재된 화합물 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 기술의 표적 분자는 세포에 독성이고/이거나, 세포 환경에서 검출 가능한 방법으로 조작된 단백질 센서에 용이하게 결합하거나 상호작용할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 단백질 센서는 이의 동족 리간드 동일성 및 임의의 공통성에 기초하여 선택되고, 동족 리간드는 표적 분자와 함께 가질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 동족 리간드와 표적 분자 간의 공유 화학기는 하나를 동족 리간드에 결합하는 조작된 단백질 센서에 유도할 수 있고, 표적 분자에 결합할 수 있도록 단백질 센서의 조작을 초래할 수 있다.
제한으로서가 아니라 예로써, 표 1(상기)은 예시적인 표적 분자 또는 표적 분자의 섀시(표적 분자 특성 칼럼 참조)를 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 표적 분자(또는 산물)는 나린게닌이다.
리포터
몇몇 실시형태에 있어서, 본 기술에서의 유용한 리포터는, 고유한 분광 시그니처(spectral signature)를 가진 단백질, 예컨대, 제한 없이, 마이크로타이터 플레이트 형광측정기, 형광 현미경, 시각적 검사, 또는 형광 활성화 세포 분류기(FACS)를 이용해서 그의 흡수 및 형광을 측정함으로써 발현이 결정될 수 있는 녹색 형광 단백질을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터는 또한 제한 없이 흡광도, 물리적 특성, 예컨대, 자력 및 임피던스, 산화환원 상태의 변화, 검정 가능한 효소적 활성도, 예컨대, 포스파타아제, 베타-갈락토시다제, 퍼옥시다제( peroxidase), 루시페라제, 또는 가스 발생 효소에 기초한 분광 시그니처를 포함한다. 대안적으로, 몇몇 실시형태에 있어서, 리포터를 암호화하는 선형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 및 전사 인자 라이브러리 구성원은 폴리머라제에 의한 증폭으로 제한되지 않는 경우에 리포터로서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 기술은 고유한 분광 시그니처 및/또는 검정 가능한 효소 활성도를 갖는 단백질을 포함하는 리포터 유전자 시스템을 포함한다. 예시적인 리포터 시스템 또는 검출 방법은 화학발광 또는 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein: EGFP), 레닐라 레니포르미스(Renilla Reniformis) 녹색 형광 단백질, GFPmut2, GFPuv4, 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 사이안 형광 단백질(CFP), 증강된 사이안 형광 단백질(ECFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 크로모단백질, 시트린 및 디스코소마(dsRED)로부터의 적색 형광 단백질, 적외 형광 단백질, 루시페라제, 움벨리페론, 로다민, 플루오레세인, 다이클로로트라이아진일아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 피코에리트린 등을 이용하는 것을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 검출 가능한 생물발광 단백질의 예는 루시페라제(예컨대, 박테리아, 파이어플라이, 클릭 비틀(click beetle) 등), 루시페린, 에쿠오린 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 검출 가능한 효소 시스템의 예는 갈락토시다제, 글루코리니다제(glucorinidase), 포스파타아제, 퍼옥시다제, 콜린에스테라제, 프로테아제 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 다른 실시형태에 있어서, 리포터 시스템 검출 방법은 효소를 포함한다. 소정의 다른 실시형태에 있어서, 검출 가능한 마커는 qPCR에 의한 유전 변이에 대해서 신속하게 검정될 수 있는 비필수 유전자이다. 소정의 다른 실시형태에 있어서, 검출 가능한 마커는 역선택에 의해 기능성에 대해서 신속하게 검정될 수 있는 약물 내성 마커이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 마커는 영양학적 마커, 예컨대, 영양요구체 균주 중 필요한 대사산물의 생산, 단일 탄소 공급원 상에서 성장시키는 능력, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 성장 선택 전략이다.
소정의 실시형태에 있어서, 리포터는, 함께 존재할 경우, 기능적 리포터를 생산하는 2종 이상의 성분으로 구성된다. 그 예는 스플릿(split) GFP, 및 효소, 예컨대, 루시페라제, 베타 갈락토시다제, 베타 락타마제 및 다이하이드로폴레이트 환원효소를 포함한다. 스플릿 리포터의 하나 이상의 성분이 도입되어 더 적은 성분의 세포 생산의 검출을 외인성으로 허용 가능할 수 있다. 스플릿 리포터는 세포 내에서, 세포 외에서 또는 둘 다에서 검출을 허용하는 다른 단백질에 융합된 상보적 스플릿 리포터를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 스플릿 GFP 융합 단백질은, 생산 세포가 이의 상보체로 캡슐화될 때까지 기능적 리포터를 생산하는 능력을 가지 않도록 하는 상보적 리포터 성분에 캡슐화된 세포에 의해 분비될 수 있다. 이러한 스플릿 시스템의 하나 이상의 성분은 독립적으로 생산되고, 세포에 대한 검출 시약이 검정됨에 따라서 첨가될 수 있다.
예를 들어, 베타-글루코시다제 및 안탁틱(Antarctic) 포스파타아제는 이의 대응하는 형광원 기재인 플루오레세인 다이-(β-D-글루코피라노사이드) 및 플루오레세인 다이포스페이트를 가진 리포터 시스템으로서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, aTF 자체의 결합 이벤트는 무세포 환경에서 광학 방법 또는 비광학 방법을 통해서 aTF 상태의 물리적 판독을 제공하는데 사용된다. 예를 들어, 비제한적인 예에서, aTF는 형광 단백질에 결합되고, DNA 결합 부위는 ??처(quencher) 분자에 결합된다. 형광 판독은 aTF가 DNA 결합 부위 자체로부터 방출될 경우에만 가능하다. 이 방법은 aTF 결합 이벤트의 직접 판독을 허용한다. 이 전략은 형광단 ??처쌍으로 제한되지 않지만, 또한 스플릿 단백질과 같은 다른 판독을 이용할 수 있다. 또한, 결합 이벤트는 단백질 디스플레이 방법의 경우에 기능적 단백질을 비기능적 단백질로부터 물리적으로 분리시키는데 사용될 수 있다.
숙주 균주/세포
각종 실시형태에 있어서, 본 기술의 숙주 세포(즉, 센서 균주/세포 및 생산자 균주/세포)는 진핵생물 및/또는 원핵생물 세포, 예컨대, 박테리아, 효모, 조류, 식물, 곤충, 포유류 세포(인간 또는 비-인간) 및 불멸의 세포주를 포함한다.
예로써, 몇몇 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 카스텔리(Saccharomyces castellii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클라미도모나스 레인하르트티이(Chlamydomonas reinhardtii), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 또는 캐노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, 에셰리키아 종(Escherichia spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.), 지노모나스 종(Zymonas spp.), 아세토박터 송(Acetobacter spp.), 시트로박터 종(Citrobacter spp.), 시네코시스티스 종(Synechocystis spp.), 리조비움 종(Rhizobium spp.), 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 코리네박테륨 종(Corynebacterium spp.), 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp.), 잔토모나스 종(Xanthomonas spp.), 락토바실러스 종(Lactobacillus spp.), 락토코커스 종(Lactococcus spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.), 페도박터 종(Pedobacter spp.), 박테로이데스 종(Bacteroides spp.), 알칼리게네스 종(Alcaligenes spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 아에로모나스 종(Aeromonas spp.), 아조토박터 종(Azotobacter spp.), 코마모나스 종(Comamonas spp.), 마이코박테륨 종(Mycobacterium spp.), 로도코커스 종(Rhodococcus spp.), 글루코노박터 종(Gluconobacter spp.), 랄스토니아 종(Ralstonia spp.), 아시디티오바실러스 종(Acidithiobacillus spp.), 미크로루나투스 종(Microlunatus spp.), 게오박터 종(Geobacter spp.), 게오바실러스 종(Geobacillus spp.), 아트로박터 종(Arthrobacter spp.), 플라보박테륨 종(Flavobacterium spp.), 세라티아 종(Serratia spp.), 사카로폴리스포라 종(Saccharopolyspora spp.), 써무스 종(Thermus spp.), 스테노트로포모나스 종(Stenotrophomonas spp.), 크로모박테륨 종(Chromobacterium spp.), 시노르히조비움 종(Sinorhizobium spp.), 사카로폴리스포라 종(Saccharopolyspora spp.), 아그로박테륨 종(Agrobacterium spp.) 및 펜토에아 종(Pantoea spp.)이다. 박테리아 세포는 그램 음성 세포, 예컨대, 이콜라이, 또는 그램 양성 세포, 예컨대, 바실러스의 종일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포, 예컨대, 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 스키조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루베로마이세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로마이세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노마이세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.), 데바료마이세스 종(Debaryomyces spp.), 야로위아 종(Yarrowia spp.) 및 공업적 배수체 효모 균주이다. 바람직하게는, 효모 균주는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 또는 야로위아 종 균주이다. 진균의 다른 예는 아스페르길루스 종(Aspergillus spp.), 페니실륨 종(Pennicilium spp.), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 아크레모늄 종(Acremonium spp.), 뉴로스포라 종(Neurospora spp.), 소르다리아 종(Sordaria spp.), 마그나포르테 종(Magnaporthe spp.), 알로마이세스 종(Allomyces spp.), 우스틸라고 종(Ustilago spp.), 보트리티스 종(Botrytis spp.) 및 트리코더마 종(Trichoderma spp.)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 조류 세포 또는 식물 세포(예컨대, 에이. 탈리아나(A. thaliana), 씨. 레인하르드티이(C. reinhardtii), 아르트로스피라(Arthrospira), 피. 트리코무툼(P. tricomutum), 엔. 타바쿰(N. tabacum), 티. 수에시카(T. suecica), 피. 카르테래(P. carterae), 클로렐라 종(Chlorella spp.), 예컨대, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris))이다.
표적 세포는 트랜스제닉 및 재조합 세포주를 포함할 수 있다. 또한, 이종성 세포주, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)가 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 악티노마이세테스 종(Actinomycetes spp.) 세포이다. 악티노마이세테스는, 예를 들어, 악티노마이세스(Actinomyces), 악티노마두라(Actinomadura), 노카르디아(Nocardia), 스트렙토마이세스 및 관련 속(genera)을 포함하는 분지 필라멘트를 형성하는 박테리아의 이종성 수집물이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 악티노마이세스는 스트렙토마이세스를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 악티노마이세테스 종 세포는 스트렙토마이세스 세포(예컨대, 에스. 코엘리칼라)이다. 스트렙토마이세스는, 비제한적인 예로서, 에스. 노우르세이(S. noursei), 에스. 노도서스(S. nodosus), 에스. 나탈렌시스(S. natalensis), 에스. 베네주엘래(S. venezuelae), 에스. 로세오스포러스(S. roseosporus), 에스. 프라디애(S. fradiae), 에스. 린콜넨시스(S. lincolnensis), 에스. 알보니게르(S. alboniger), 에스. 그리세우스(S. griseus), 에스. 리모서스(S. rimosus), 에스. 아우레오파시엔스(S. aureofaciens), 에스 클라불리게루스(S. clavuligerus), 에스. 아베르미틸리스(S. avermitilis), 에스. 플라텐시스(S. platensis), 에스. 베르티실루스(S. verticillus), 에스. 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus) 및 에스. 비리도크로메오게네스(S. viridochromeogenes)를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 바실러스 종 세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 바실러스 종 세포는 비. 알칼로필루스(B. alcalophilus), 비. 알베이(B. alvei), 비. 아미노보란스(B. aminovorans), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 아네우리노라이티쿠스(B. aneurinolyticus), 비. 안트라시스(B. anthracis), 비. 아쿠아에만스(B. aquaemans), 비. 아트로페우스(B. atrophaeus), 비. 보로니필루스(B. boroniphilus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 칼도라이티쿠스(B. caldolyticus), 비. 센트로스포루스(B. centrosporus), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 시르쿨란스(B. circulans), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비 피르무스(B. firmus), 비. 플라보테르무스(B. flavothermus), 비. 푸시포르미스(B. fusiformis), 비. 갈리시엔시스(B. galliciensis), 비. 글로비기이(B. globigii), 비. 인페무스(B. infemus), 비, 라르베(B. larvae), 비. 라테로스포루스(B. laterosporus), 비. 렌투스(B. lentus), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 메가테륨(B. megaterium), 비. 메센테리쿠스(B. mesentericus), 비. 무실라기노서스(B. mucilaginosus), 비. 마이코이데스(B. mycoides), 비. 나토(B. natto), 비. 판토텐티쿠스(B. pantothenticus), 비. 폴리믹사(B. polymyxa), 비. 슈도안트라시스(B. pseudoanthracis), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 쉴레겔리(B. schlegelii), 비. 스패리쿠스(B. sphaericus), 비. 스포로테르모두란스(B. sporothermodurans), 비. 스테아로테르모필러스(B. stearothermophilus), 비. 서브틸리스, 비. 테르모글루코시다시우스(B. thermoglucosidasius), 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis), 비. 불가티스(B. vulgatis) 및 비. 바이헨스테파넨시스(B. weihenstephanensis)로부터 선택된다.
조작된 센서 또는 생산자 균주/세포용 액적
분산된 액적의 높은 계면 영역으로 인해, 유화제 없는 에멀션은 열역학적으로 불안정한 시스템이다. 에멀션 액적을 안정화시키기 위하여, 낮은 몰질량 계면활성제 또는 표면-활성 중합체는 통상 상들 간의 계면 장력을 감소시키기 위하여 제형에 포함되어야 한다. 액적을 안정화시키는 하나의 방법은 계면활성제를 대체하도록 고체 입자(예컨대, 나노입자)를 사용하는 것에 의한다. 고체 입자는 두 비혼화성 유체 또는 액체 간의 계면에 측정되어, 유착(coalescence)에 대해서 강인한 장벽을 구축한다. 고체 입자는 유착을 저감 또는 방지하여, 에멀션에 더 높은 안정성을 가져오게 한다. 달걀 껍질과 유사하게, 고체 입자의 치밀층은 에멀션 액적이 유착을 저지하도록 강인한 가피(rigid crust)를 만든다.
피커링 에멀션은 유화제 대신에 고체 입자에 의해 안정화된 에멀션이다. 피커링 에멀션은 계면활성제에 의해 안정화된 고전적인 에멀션이 갖지 않는 많은 고유한 특징, 예컨대, 우수한 안정성 및 낮은 독성을 갖는다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 방법은 플루오린화된 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인 액적을 포함한다. 본 기술의 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 피커링 에멀션이다. 이어서, 액적은 표적 분자의 수준에 대해서 검정될 수 있고, 여기서 조작된 단백질 센서는 조작된 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공한다. 본 개시내용의 방법은 액적을 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포와 단리시키는 단계; 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 액적을 파괴하여 조작된 생산자 세포의 집단을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포의 풀은 조작된 센서 플라스미드로 형질전환된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은 조작된 생산자 세포를 함유하는 각각의 액적을 조작된 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계를 포함하되, 여기서 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적을 둘러싸는 비혼화성 연속상은 플루오린화계 오일 또는 에멀션이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적을 둘러싸는 비혼화성 연속상은 유기 오일이다. 플루오린화계 오일은, 몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화 오일, 플루오린화 중합체, 플루오로카본 중 물 에멀션, 퍼플루오로카본 중 물 에멀션, 또는 이들의 조합물이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적을 둘러싸는 비혼화성 연속상은 유기 오일이다.
피커링 에멀션은 몇 가지 방식으로 안정화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 오일 또는 유기 오일의 사슬 길이를 감소함으로써 안정화된다. 오일 또는 유기 오일 사슬 길이의 감소 시, 오일 또는 유기 오일의 용해도가 증가되어, 안정화된 피커링 에멀션의 제조를 가능하게 한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 플루오린화된 오일 또는 에멀션은 입자에 의해 선택적으로 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 부분 플루오린화 나노입자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 부분 소수성 나노입자(예컨대, 실리카-기반 소수성 나노입자)이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 탄화수소(예컨대, 헥사데칸, 도데칸, 데칸)에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 오일 또는 유기 오일, 예컨대, 미네랄 오일, 옥수수유 또는 피마자유에 의해 안정화된 피커링 에멀션이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 Tween, Triton X-100, Triton X-114, SPAN, Arlacel, 비이온성 유화제, 예컨대, ABIL, 세정제, 또는 이들의 조합물과 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 단백질 안정제(예컨대, BSA, β-락토글로불린, BCN)와 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 비이온성 세정제 또는 당(예컨대, 글루코스, 프럭토스, 락토스)과 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단백질 안정제, 비이온성 세정제 또는 당은 제2 상(예컨대, 수성, 유기, 또는 액적 상)으로부터 제1 상(예컨대, 오일-기반 상)으로의 유기물의 확산을 저감시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 Tween, Triton X-100, Triton X-114, SPAN, Arlacel, 비이온성 유화제, 예컨대, ABIL, 세정제, 또는 이들의 조합물에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 단백질 안정제(예컨대, BSA, β-락토글로불린, BCN)에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 비이온성 세정제 또는 당(예컨대, 글루코스, 프럭토스, 락토스)과 조합된 오일 또는 유기 오일에 의해 안정화된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 피커링 에멀션은 2개의 비혼화성 상 간의 계면에 축적된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 상은 연속상이고, 제2 상은 분산상이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 에멀션은 오일-기반 제1 상, 예컨대, 플루오로카본 상과, 제2 상(예컨대, 유기물, 수성, 액적, 탄화수소, 또는 가스 상)을 포함한다. 예를 들어, 제1 상은 적어도 1종의 플루오린화된 용매를 가진 플루오로카본 상일 수 있고, 제2 상은 플루오린화된 용매, 예컨대, 유기물, 수성, 액적, 탄화수소, 또는 가스 상과 비혼화성일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제2 상은 수성상이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제2 상은 탄화수소 상이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용은 액체에 의해 둘러싸인 유체의 액적을 생산하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 유체 및 액체는, 본질적으로 많은 경우에 비혼화성, 예컨대, 관심 대상 시간 규모(예컨대, 특정 시스템 또는 디바이스를 통해서 이송될 유체성 액적을 취하는 시간)로 비혼화성일 수 있다. 유체는 기타 종, 예를 들어 소정의 분자 종, 예컨대, 세포, 입자 등을 함유할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 제2 유체에 의해 완전히 둘러싸인 제1 유체의 단리된 부분이다. 액적은 반드시 구형일 필요는 없지만, 예를 들어, 외부 환경에 따라서 기타 형상도 가정될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 액적이 위치된 유체 흐름에 수직인 채널의 최대 치수와 실질적으로 동일한 최소 단면 치수를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 액적은 용어 "마이크로캡슐"과 호환 가능하게 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 액적은 에멀션(예컨대, 피커링 에멀션); 초소형 또는 콜로이드성 크기의 액적으로서 하나의 상이 다른 상에 분산된 2종의 비혼화성 유체 또는 액체 상의 시스템으로부터 형성된다.
에멀션은 비혼화성 액체의 임의의 적합한 조합으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 에멀션은 수성 액체 및 소수성, 비혼화성 액체, 예컨대 오일을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 본 개시내용의 에멀션으로부터 형성된 액적이 개시되되, 이는 (a) 연속상, 및 (b) 연속상에 분산된 적어도 하나의 액적을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 (a) 연속 친형광성(fluorophilic) 상, 및 (b) 연속 친형광성 상에 분산된 적어도 하나의 분산된 수성 또는 친지성 상을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 분산 상(예컨대, 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상)은 적어도 하나의 조작된 생산자 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조작된 생산자 세포는 플루오로 상 및 수성, 유기, 탄화수소 또는 가스 상의 계면에서 양친매성 입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자)에 고정된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 양친매성 입자(예컨대, 실리카-기반 나노입자) 및 이들의 조합물은, 액적 내부에 수행될 수 있는 공정을 간섭하는 일 없이 액적의 유착에 대해서 충분한 안정화를 제공한다.
에멀션은 1종 이상의 표면-활성제(계면활성제)의 첨가에 의해 안정화될 수 있다. 이들 계면활성제는 유화제라고 지칭되며, 예를 들어, 상의 분리를 방지(적어도 지연)시키기 위하여 물/오일 계면에서 작용한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션은 플루오로카본(또는 퍼플루오로카본) 연속상을 포함한다. 예를 들어, 안정적인 퍼플루오로옥틸중수 및 퍼플루오로옥틸에탄중수 에멀션은 계면활성제로서 F-알킬 다이모르폴리노포스페이트를 이용해서 형성될 수 있다. 비-플루오린화 화합물은 플루오로카본 및 퍼플루오로카본에 본질적으로 불용성이고, 소형 약물-유사 분자(전형적으로 <500 Da 및 Log P<5)는, 마이크로캡슐(예컨대, 액적) 간에 교환이 거의 없이 또는 없이, 플루오로카본중수 및 퍼플루오로카본중수 에멀션의 수성 마이크로캡슐에서 매우 효과적으로 구분된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 에멀션의 작성은 일반적으로 상을 함께 강제하기 위하여 기계적 에너지의 인가를 필요로 한다. 교반기(예컨대, 자기 교반바, 프로펠러 및 터빈 교반기, 패들 디바이스 및 위스크(whisk)), 균질화기(회전자-고정자 균질화기, 고압 밸브 균질화기 및 제트 균질화기 포함), 콜로이드 밀, 초음파 및 '막 유화' 디바이스 및 미세유체 디바이스를 비롯한 다양한 기계적 디바이스를 이용하는, 이를 행하는 각종 방법이 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복잡한 생화학적 과정, 현저하게는 유전자 전사 및 번역은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같이 수성상 마이크로캡슐에서 활성적이고, 이는 중수 에멀션에서 형성된다. 이것은 유전자의 선택을 위하여 유중수 에멀션에서의 구획화를 가능하게 할 수 있고, 이는 에멀션 마이크로캡슐에서 전사되고 번역되며, 이들이 암호화되는 단백질의 결합 또는 촉매 활성에 의해 선택된다. 에멀션으로 형성된 수성 마이크로캡슐은 일반적으로 핵산, 단백질, 또는 효소의 산물의 임의의 교환이 마이크로캡슐 간의 반응을 촉매한다면 거의 안정적이지 않다. 본 개시내용의 몇몇 실시형태에 있어서, 본 기술은 최대 수천 리터의 공업적 규모까지의 용적을 가진 에멀션을 작성하도록 존재한다.
몇몇 실시형태에 있어서, "마이크로캡슐"은 상이한 유체 중에 1종의 유체의 액적일 수 있고, 여기서 제한된 성분은 담체 유체에서가 아니라 액적에서 가용성이다. 몇몇 실시형태에 있어서 벽, 예컨대, 막을 획정하는 제3의 재료가 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 마이크로캡슐은, 유전자 산물이 암호화되는 이들의 기능에 따라서 유전자 요소의 분류를 허용하는 본 명세서에 기재된 분자 기전의 성분의 교환을 규제하는 한정된 가장자리를 갖는 인공 구획이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "마이크로캡슐"은 용어 "액적"과 호환 가능하게 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 미세유체 제어는 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위하여 액적의 형성 및/또는 이동을 유도하거나 또는 다르게는 제어하는 미세유체 채널을 갖는 미세유체 시스템을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 액적 형성의 "미세유체 제어"는 제2 유체 내에 유체의 "액적"을 형성하는 미세유체 디바이스를 사용한 액적의 작성을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 미세유체 제어하에 분류된 액적은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 분류 절차와 연관된 하나 이상의 기능을 수행하는 미세유체 디바이스를 이용해서 분류된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 액적은 미세유체 제어하에 있고, 미세유체 제어는 미세유체 채널을 갖는 미세유체 시스템을 포함하며, 채널은 유체의 흐름을 적어도 부분적으로 유도하는 특징부를 갖는다. 채널은 임의의 단면 형상(원형, 타원형, 삼각형, 불규칙 형상, 정사각형 또는 직사각형 등)을 가질 수 있고, 덮여 있을 수 있거나 노출될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 채널은 완전히 덮여 있을 수 있거나, 또는 채널의 적어도 일부분은 완전히 봉합된 단면을 가질 수 있거나, 또는 전체 채널은 이의 입구(들) 및 출구(들)를 제외하고 그의 전체 길이를 따라 완전히 봉합되어 있을 수 있다. 채널은 또한 적어도 2:1, 더욱 전형적으로 적어도 3:1, 5:1, 또는 10:1 이상의 애스펙트비(길이 대 평균 단면 치수)를 가질 수 있다. 개방 채널은 유체 수송에 대한 제어를 용이하게 하는 특징, 예컨대, 구조 특징(세장형 만입부(elongated indentation) 및/또는 물리적 또는 화학적 특징(소수성 대 친수성) 또는 유체에 힘(예컨대, 수용력)을 작용할 수 있는 기타 특징을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 채널 내 유체는 채널을 부분적으로 또는 완전히 충전시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개방 채널이 사용되고, 유체는, 예를 들어, 표면 장력(예컨대, 오목 또는 볼록 메니스커스)을 사용해서 채널 내에서 유지될 수 있다. 채널은, 임의의 크기, 예를 들어, 약 5㎜ 또는 2㎜ 미만, 또는 약 1㎜ 미만, 또는 약 500 미크론 미만, 약 200 미크론 미만, 약 100 미크론 미만, 약 60 미크론 미만, 약 50 미크론 미만, 약 40 미크론 미만, 약 30 미크론 미만, 약 25 미크론 미만, 약 10 미크론 미만, 약 3 미크론 미만, 약 1 미크론 미만, 약 300㎚ 미만, 약 100㎚ 미만, 약 30㎚ 미만, 또는 약 10㎚ 미만의 유체 흐름에 수직인 최대 치수를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 채널의 치수는 유체가 물품 또는 기재를 통해 자유롭게 흐르는 것을 가능하게 하도록 선택될 수 있다. 채널의 치수는 또한 예를 들어, 채널 내 소정의 용적 또는 선형 유량을 허용하도록 선택될 수 있다. 물론, 채널의 개수 및 채널의 형상은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 변화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 1개 초과의 채널 또는 모세관이 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 채널이 사용될 수 있되, 여기서 이들은 서로 내부에 위치되거나, 서로 인접하여 위치되거나, 서로 교차하도록 위치되는 등이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 개시내용의 액적은 에멀션(예컨대, 피커링 에멀션); 예를 들어, 초소형 또는 콜로이드성 크기의 액적으로서 하나의 상이 다른 상에 분산된 2가지 비혼화성 유체 또는 액체 상의 시스템으로부터 형성된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 유체는 액체이고 이 용어는 호환 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 유체는 유동을 허용하는 임의의 적합한 점도를 가질 수 있다. 2종 이상의 유체가 존재할 경우, 각 유체는, 유체 간의 관계를 고려해서, 당업자에 의해 본질적으로 임의의 유체(액체, 가스 등) 중에서 독립적으로 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 유체는 각각 혼화성 또는 비혼화성일 수 있다. 예를 들어, 2종의 유체는 유체의 스트림의 형성 시간 프레임 내에, 또는 반응 또는 상호작용의 시간 프레임 내에 비혼화성이 되도록 선택될 수 있다. 부분들이 상당한 시간 기간 동안 액체인 채로 있는 경우, 유체는 상당히 비혼화성이어야 한다. 접촉 및/또는 형성 후에, 분산된 부분이 중합 등에 의해 신속하게 경화될 수 있는 경우, 유체는 비혼화성일 필요는 없다. 당업자는, 본 발명의 기술을 수행하기 위하여 접촉각 측정 등을 이용해서 적절한 혼화성 또는 비혼화성 유체를 선택할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 복수의 액적 내에 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 것에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 액적은 적어도 하나의 비불멸 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 방법은, 미국 특허 공개 제US2009/0068170호(이의 내용은 이의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 편입됨)에 개시된 바와 같이, 액적 내에 비불멸 세포에 의해 분비된 종의 특성을 결정하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 복수의 수성 액적 내 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 것에 관한 것으로, 각각의 액적은, 미국 특허 공개 제US2010/0022414(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같은, 균일한 크기이고 단지 제한된 양의 시약을 소비하면서 다수의 검정을 수행하는데 유용한 액적 라이브러리를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 미국 특허 공개 제US2017/0028365호(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같은, 복수의 수성 액적을 포함하는 에멀션 라이브러리 내 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 것에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 미국 특허 공개 제US2013/0084572호(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같은, 액적으로부터 검출된 신호를 이용해서 제어되고/되거나 교정된 액적-기반 검정에서의 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 것에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 미국 특허 공개 제2014/0179544호(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같은, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 것에 관한 것으로, 입력 유로, 교차 영역 및 출력 유로를 포함하는 검출기 디바이스를 갖는 시스템에서 액적을 검출하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 미국 특허 공개 제201/80104693호(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같은, 액적 내 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하고, 미세유체 액적 및 액적 내 입자를 검출하는 것뿐만 아니라 상기 액적을 분류하는 것에 관한 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 수성 분산상; 플루오린화 오일을 포함하는 연속상; 및 아마이드 결합을 통해서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 블록에 결합된 퍼플루오린화된 폴리에터(PFPE) 블록을 포함하는 블록 공중합체를 포함하는 계면활성제를 포함하는, 에멀션 중 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 것에 관한 것으로, 계면활성제는 미국 특허 제9,012,390호(이의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같은 화학식 -(CnF2nO)x-(CmF2m)y-CONH-를 포함하고, n, m, x 및 y는 양의 정수이다.
본 발명은 비제한적인 예를 참조하여 더욱 설명한다.
실시예
실시예 1: 이콜라이 MG 1655 돌연변이체에 대한 센서 반응 변동.
동일한 배경으로부터 유래하는 게놈 돌연변이체에 대한 센서 변동의 일례로서, 도 1A 내지 도 1C는 MAGE-조작된 이콜라이 MG 1655 집단으로부터 3개의 랜덤하게 선택된 구성원의 센서 반응을 도시한다. 3개의 클론은 조작된 ttgAp 프로모터의 제어하에 TtgR 및 gfp를 잠복시키고 있는 배지-카피 플라스미드로 형질전환시켰다. 외인성으로 인가된 나린게닌(0, 31, 63 또는 125μM)은 3개 균주에서 상이한 수준의 GFP 발현을 유도하였다. 이들 실험 동안 나린게닌 경로 효소가 존재하지 않아, 내인성으로 생산된 나린게린에 의한 어떠한 간섭도 제거하였다. 게놈으로의 센서 시스템의 이동 시(도시 생략) 또는 하이-카피(high-copy) 센서 플라스미드로의 전환 시(도 2a) 변동은 해소되지 않았다.
도 2a 내지 도 2d는, 적절한 aTF-조절 조작자의 제어하에 4개의 aTF 중 하나(TtgR(도 2a), TetR(도 2b), PcaV(도 2c) 또는 QacR(도 2d)) 및 gfp를 잠복시키는 하이-카피 플라스미드로 형질전환된, 도 1A 내지 도 1C로부터 동일한 3개의 MAGE-조작된 이콜라이 MG1655 돌연변이체의 센서 반응의 변동을 나타낸다. 각각의 센서 시스템은, 도면에 나타낸 바와 같이, 상이한 수준의 적절한 동족 리간드에 의해 유도되었다. 균주 컬러는 모든 패널에 걸쳐서 일치하였다. TtgR 센서 시스템에 대한 센서 반응의 경향(적색 = 가장 밝음, 오렌지색 = 중간, 청색 = 가장 어두움)은 상이한 센서 시스템에 걸쳐서 유지되지 않았으며, 이는 그 원인이 포괄적이지 않음을 시사한다.
실시예 2: 생산 변이에 걸친 표적 생산 분자의 확산.
도 3은 생산 균주에 걸친 확산에 의한 영향을 입증한다. 2E6이라 지칭되는 이콜라이 K-12 MG1655 돌연변이체는, 증대된 나린게닌 전구체 농도에 대해서 MAGE-조작되었고 2개의 개별의 나린게닌 경로 플라스미드, 즉, pNARlow　및 pNARhigh로 형질전환되어, 높은 나린게닌-생산 균주(적색, M9 1% 글루코스 중 24시간 배취 배양에서 대략 180μM 생산) 및 낮은 나린게닌-생산 균주(청색, M9 1% 글루코스 중 24시간 배취 배양에서 대략 60μM 생산)를 초래하였다. 생산성을 달리하는 이들 2가지 균주는 개별적으로 함께 인큐베이팅되었다(오렌지색). 높은- 및 낮은-생산 균주는 함께 배양될 때 평균화된 신호를 나타내며, 이는 균주에 걸친 나린게닌 확산이 벌크 액체 배양액 중 더 양호한 생산자에 대한 스크리닝을 금지하는 것을 시사한다. 단, 이 실시예에서, 생산의 차이는, 주된 대사산물 농도를 변화시키기 위하여 대규모 게놈 돌연변이보다 오히려 나린게닌 경로 효소의 플라스미드-기반 조작의 결과임에 유의한다. 이러한 상황에서, 실시예 1에서 관찰된 센서 반응 변동은 관찰되지 않았다.
실시예 3: 생산자로부터 센서를 분리하는 수단으로서의 공배양.
도 4A 및 도 4B는 스크리닝용의 실용적 전략으로서 생산자 세포 및 센서 세포의 공배양을 확립시키고 있다. 센서 세포는, 이콜라이 BW25113 Δptsl::kanR 배경에서 조작되었고, 이는 단독 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 성장될 수 없다. 글루코스 수송체 ptsl 및 형광 리포터 gfp는, GFP 신호의 성장 및 크기가 나린게닌-의존적이 되도록 플라스미드 pSENSORGFP-Ptsl에 대한 TtgR-조절-프로모터의 제어하에 코-시스트론성으로(co-cistronically) 발현되었다. 도 4A에서, 나린게닌-의존적 성장 및 GFP 신호의 크기를 갖는 센서 세포는 실시예 2에서 논의된 생산자 균주 2E6과 액체 중에 공배양시켜 3개의 나린게닌 경로 플라스미드 또는 제어 플라스미드로 형질전환시켰다: 경로 음성 대조군 pNARnull(적색), 낮은 나린게닌-생산 경로 pNARlow(청색, M9 1% 글루코스 중 단리된 24시간 배취 배양에서의 대략 60μM 생산), 또는 높은 나린게닌-생산 경로 pNARhigh(오렌지색, M9 1% 글루코스 중 24시간 배취 배양에서 대략 180μM 생산). 어두운 집단은 GFP 신호를 갖지 않는 생산자 세포를 나타낸다. 밝은 집단은 총 공배양된 집단의 비 그리고 또한 생산 증가에 따른 GFP 반응의 크기가 증가되는 센서 세포 집단을 나타낸다. 도 4B에서, 센서 세포는 유중수 액적 중 경로 음성 대조군 세포 또는 높은 나린게닌-생산 세포와 공배양하였다. 인큐베이션 후에, 유중수 액적은 다른 수성상에 캡슐화하여, 수중유중수(water-in-oil-in-water) 액적을 생성하였으며, 이는 표준 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 대해 관찰되었다. 공배양된 높은-생산자 및 센서 세포의 분포(오렌지색)는 공배양된 비-생산자 및 센서 세포(적색)와는 용이하게 구분된다.
실시예 4: 액적에서의 공배양
2E6 pNARnull, 2E6 pNARlow, 2E6 pNARhigh를 실시예 3에 기재된 이콜라이 BW25113 Δptsl::kanR pSENSORGFP-Ptsl 센서 균주와 공배양하였다. 4가지 배양액을 LB 배지에서 하룻밤 성장시키고, 적절한 항생제가 보충된 최소 배지에서 1 내지 100으로 더욱 희석시키고, 이어서 대수상으로 성장시켰다. 일단 대수상에 있으면, 이콜라이를 1x 여과된 M9 염으로 3회 헹구고, 이어서 1.0의 OD600으로 희석시켰다. 2E6 균주를 0.01의 OD600으로 희석시켜, 단일 생산자 균주가 각 캡슐화된 액적에 존재하는 것을 확인하였고, 센서 세포를 0.1로 희석시켜, 각 액적이 적어도 5개의 센서 세포를 갖는 것을 확인하였다. 6개 세트의 액적을 생성하였다: (1) 센서 세포 단독, (2) 500μM 나린게닌과 함께 센서 세포, (3) 센서 세포 및 1mM IPTG와 함께 2E6 pNARhigh, (4) 센서 세포 및 1mM IPTG와 함께 2E6 pNARnull, (5) 센서 세포 및 1mM IPTG와 함께 2E6 pNARlow, 및 (6) 나린게닌 단독 액적. HFE7500 중 1% Ran 플루오로계면활성제로 구성된 오일 상 및 세포 용액을 1㎖ 유리 시린지에 장입하고 2개의 하버드 장치(Harvard Apparatus) 시린지 펌프에 연결하였다. 액체를 Dolomite로부터의 50㎛ 접합 흐름 집중(junction flow focusing), 플루오로필릭 칩(fluorophilic chip)을 이용해서 오일상 및 수성상에 대해서 각각 14 및 10 ㎕/분의 속도에서 유화시켰다. 형성된 액적을 5㎖ 원심관에 수집하였다. 형성 후에, 액적을 텀블링하면서 33℃에서 48시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 액적을 현미경하에 촬영하였다. 500μM 나린게닌을 가진 양성 대조군 액적은 매우 형광성인 한편(도 5d), 음성 대조군 액적은 어두웠다(도 5a). pNARlow　및 pNARhigh 공배양된 액적은 검출 가능한 형광을 생성하였다(도 5b 및 도 5c). 2E6 pNARhigh　생산자는 더 많은 나린게닌을 생산하였고, 2E6 pNARlow　생산자 세포가 또한 더 밝은 공배양된 액적을 초래하였다. 500μM 나린게닌을 함유하는 액적과 혼합된 센서 세포 액적은 액적 간에 확산을 보이지 않았다(도 6). HPLC에 의해 분석된 추가의 확산 데이터는 최소의 나린게닌을 나타내고 오일<20%로의 확산을 보상한다(데이터 제시 생략). 분석 후에, 단일 에멀션을 Dolomite로부터의 50μM 흐름 집중 친수성 칩을 이용해서 벌크 수성상 이중 에멀션으로 전환하였다. 이렇게 함으로써, 액적을 1㎖ 유리 시린지에 장입하고, 제2 유리 시린지에 액적 내부와 등장성으로 균형을 맞추기 위하여 신선한 성장 배지를 충전하였다. 시린지를 2개의 하버드 장치 시린지 펌프 상에 장입하고 이어서 칩에 접속하였다. 이중 에멀션이 시린지당 15 ㎕/분의 유량으로 형성되었고 15㎖ 원심분리관에 수집하였다. 이중 에멀션은 FACS 분석 전에 현미경하에 분석하였다. 액적의 3개의 집단은 현미경하에 가시적이다: (1) 빈 액적, (2) 형광 센서 세포 및 생산자 세포를 함유하는 액적, 및 (3) 비-형광 센서 세포 및 비생산자를 함유하는 액적(도 7). 액적의 FACS 분석은 3개의 집단을 또한 도시한다(도 8A 내지 도 8C). 비-생산자 함유 액적은 대략 2,000 RFU의 평균 집단 형광을 입증한다(도 8A). 생산자 함유 액적은 대략 100,000 RFU의 평균 집단 형광을 입증한다(도 8B). 두 균주의 믹스를 함유하는 액적 집단은 두 별개의 형광 하위집단을 입증한다(도 8C).
실시예 5: 액적 구획화를 이용해서 주된 산물의 확산을 방지.
2E6 pNARnull 및 2E6 pNARhigh를, TtgR-유래 센서를 이용해서 나린게닌에 반응해서 GFP를 생산하는 pSENSORGFP 나린게닌 센서 시스템으로 추가로 형질전환시켰다. 2가지 배양액을 적절한 항생제로 보충된 최소 배지에서 1 내지 100으로 치환된 LB 배지에서 하룻밤 성장시키고, 이어서 대수상으로 성장시켰다. 일단 대수상에서, 이콜라이를 1x 여과된 M9 염으로 3회 헹구고, 이어서 1.0의 OD600으로 희석시켰다. 이어서, 단일 생산자 균주가 각 캡슐화된 액적에 존재하는 것을 보장하게 하기 위하여 2E6 균주를 0.01의 OD600로 더욱 희석시켰다. 3세트의 액적, 즉, (1) 2E6 pNARhigh　세포 단독, (2) 2E6 pNARnull　세포 단독, 및 (3) 2E6 pNARhigh　세포와 2E6 pNARnull　세포의 1:1 혼합물을 제조하였다. HFE7500 중 1% Ran 플루오로계면활성제로 이루어진 세포 용액 및 오일 상을 1㎖ 유리 시린지에 장입하고, 2개의 하버드 장치 시린지 펌프에 연결하였다. 액체를 오일상 및 수성상에 대해서 각각 Dolomite로부터의 50 um 접합 흐름 집중 플루오로필릭 칩을 이용해서 14 및 10 ㎕/분의 속도로 유화시켰다. 형성된 액적을 5㎖ 원심관에서 수집하였다. 형성 후에, 액적을 48시간 동안 텀블링하면서 33℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 액적을 동일 용적의 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로-1-옥탄올을 이용해서 30초 동안 와류(vortex)시키고, 이어서 원심분리시켜 상들을 분리시켰다. 회수된 이콜라이를 함유하는 수성상을 새로운 관에 이송하고 이어서 FACS 분석을 위하여 희석시켰다. 집단의 형광 분포를 FACS에 의해서 측정하였다. 2E6 pNARnull 세포는 대략 30,000 RFU의 평균 집단 형광을 입증하였다(도 9A). 2E6 pNARhigh　나린게닌 생산자 세포는 비-생산자 균주의 10배인 대략 300,000 RFU의 평균 집단 형광을 입증하였다(도 9B). 각 생산자 균주를 단리시키기 위하여 액적을 함께 성장시킨 경우, 2개의 형광 하위집단은 산물의 확산을 제거하는 액적 능력, 따라서 집단 평균화를 입증하는 것으로 보인다(도 9C).
도 10은, 확산을 제거하기 위하여 액적 내 인큐베이션을 수행 후, 경로 음성 대조군 2E6 pNARnull pSENSORGFP로부터 높은 나린게닌-생산 균주 2E6 pNARhigh　pSENSORGFP의 농축을 입증하고 있다. 이 실험에서 이용된 액적 크기에서 단일 세포 장입을 확보하기 위하여 0.003의 OD600으로 희석된 것을 제외하고, 세포를 배양하고 위에서와 같이 세척하였다. 오일상 및 수성상에 대해서 각각 20 및 12 ㎕/분의 속도에서 인-하우스에서 제작된 25㎛ 접합 흐름 집중 PDMS 칩에서 액체를 유화시킨 것을 제외하고 위에서 기재된 바와 같이 액적을 생성하였다. 개별의 액적 세트를 2E6 pNARhigh　pSENSORGFP, 2E6 pNARnull pSENSORGFP에 대해서 생성하고, 2E6 pNARhigh　pSENSORGFP 및 2E6 pNARnull pSENSORGFP를 사전 혼합하였다. 형성된 액적을 5㎖ 원심관에 수집하였다. 형성 후에, 액적을 24시간 동안 텀블링하면서 33℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 액적을 동일 용적의 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로-1-옥탄올을 이용해서 파괴시키고, 30초 동안 와류시키고, 이어서 원심분리시켜 상들을 분리시켰다. 회수된 이콜라이를 함유하는 수성상은 새로운 관으로 옮기고, 이어서 FACS 분석 및 세포 분류를 위하여 희석시켰다. 2E6 pNARhigh　pSENSORGFP(청색), 2E6 pNARnull pSENSORGFP(적색), 및 혼합된 2E6 pNARhigh　pSENSORGFP 및 2E6 pNARnull　pSENSORGFP(오렌지색) 액적으로부터의 세포를 Bio-Rad S3E FACS 상에서 분석하였다. 분석 후에, 혼합된 2E6 pNARhigh　pSENSORGFP 및 2E6 pNARnull　pSENSORGFP 액적으로부터의 세포를 이하에 묘사된 게이팅 전략을 이용해서 분류하였다. 분류된 세포와 비분류된 세포를 평판 배양하고, 비분류된 집단과 분류된 집단으로부터의 클론을 생산 배지에서 성장시켜, 경로+ 세포의 퍼센트(경로+에서의 높은 GFP 신호 및 경로-클론에서의 암흑에 의해 결정)를 결정하였다. 본 발명자들은 이 하나의 농축 사이클에서 경로+ 세포의 대략 7-배 농축을 관찰하였다.
도 11은 "세포 내 센서"에 의한 낮은- 대 높은-생산자의 액적 캡슐화를 도시하며, 여기서 동일한 세포는 리간드 및 센서 생산 둘 다를 초래하며, 형광(녹색) 판독 강도(높은 생산자 세포에서, 우측)는 생산된 리간드의 농도와 연관된다.
실시예 6: 공배양 센서 세포를 이용한 높은 생산지의 농축
도 12는 액적 시스템에서의 낮은- 또는 높은-생산자로 캡슐화된 "공배양 센서 세포"의 시스템을 도시한다. 여기서, 단지 비생산 세포는 센서 판독에 기여하여, 세포 생산 시 부담을 저감시키는데, 여기서 형광(녹색) 판독 강도(높은 생산자 세포에서, 좌측)는 생산된 리간드의 농도와 연관된다.
도 13은 실시예 3에 기재된 Δptsi::kanR pSENSORGFP-ptsi　센서 균주에 의한 액적 공배양 전략을 이용하는 낮은 경로 제어 2E6 pNARlow로부터 높은 나린게닌-생산 균주 2E6 pNARhigh의 농축을 입증한다. 3가지 배양액을 정지상까지 LB 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 이어서, 세포를 1% 글루코스, 0.1% 플루로닉(pluronic) F-68, 및 1mM IPTG를 가진 여과된 2x M9 배지로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 세척액에 사용된 동일 여과 배지에 재현탁시켜, Δptsi::kanR pSENSORGFP-ptsi　세포를 0.2의 OD600에 재현탁시켰다. 이것에, 2E6 pNARhigh　또는 2E6 pNARlow를 0.066의 OD600에서 첨가하여 동일 농도(OD600 = 0.2)의 센서 세포와 낮은 또는 높은 생산 세포의 2종의 개별의 혼합물을 만들었다. 오일상 및 수성상에 대해서 각각 20 및 12 ㎕/분의 속도에서 25㎛ 접합 흐름 집중을 이용하는 PDMS 칩을 이용해서, 오일 상으로서 HFE 7500 + 1% 008-FS, 그리고 수성상으로서 선행하는 세포 혼합물을 이용해서 각 배양액에 대해서 개별적으로 액적을 생성하였다. 형성 후에, 액적을 24시간 동안 텀블링하면서 33℃에서 인큐베이션하였다. 분류 전에, 액적을 대략 [10]:[1][Δptsi::kanR pSENSORGFP-ptsi+2E6 pNARlow]:[Δptsi::kanR pSENSORGFP-ptsi+2E6 pNARhigh]에서 혼합하였다. 이어서, 액적을 높은 전압(대략 1kV)을 공급할 수 있는 인듐 전극이 착좌된 40㎛ 접합부를 갖는 45㎛ 높이 분류기 칩으로 인-하우스에서 제조된 PDMS 분류기 칩에 대해서 분류하여, 수성 액적을 목적하는 채널로 이동시키기 위한 전기영동 효과를 일으켰다. 액적을 60배 배율로 모니터링하였으며, 여기서 PMT 전압 신호는 인-하우스 프로그래밍된 마이크로칩을 이용해서 검정하여, 사용자 정의된 역치보다 큰 신호를 포함하는 액적이 10kHz 주파수에서 800V에 450㎲를 인가하고 분류함으로써 분류된 채널에 분류되도록 하였다. 그 후, 분류된 액적과 비분류된 액적을 수집하여 동일 용적의 1H,1H,2H,2H-퍼플루오로-1-옥탄올을 이용해서 파괴하고, 30초 동안 와류시키고, 이어서 원심분리하여 상들을 분리하였다. LB를 파괴된 액적 혼합물에 첨가하고, 세포를 적절한 항생제를 가진 한천 플레이트 상에 평판 배양하였다. 분류된 세포 플레이트와 비분류된 세포 플레이트를 플레이트로부터 다음날 개별적으로 스크레이핑하고, 하룻밤 배양을 위하여 적절한 항생제를 가진 LB에 재접종하였다. 분류된 배양액 및 비분류된 배양액의 미니프렙(miniprep)을, 전체로서 집단을 나타내는 DNA를 추출하도록 완성하였다. 혼합된 플라스미드 집단의 이중 소화는, pNARlow　대 pNARhigh로부터의 플라스미드의 양의 차이분이 Ndel 및 Xhol의 이중 제한 효소 소화 시에 식별될 수 있도록 나타낸다(도 13에서의 이론적 소화 참조, 좌측). 분류된 미니프렙 및 비분류된 미니프렙으로부터의 DNA의 동등한 용적/농도가 이중 소화에 적용되었으며, 여기서 30㎕의 95 ng/㎕ 미니프렙화된 DNA를 35㎕의 최종 용적에서 1x CutSmart 완충액 중 0.6 U/㎕의 각 효소와 37℃에서 3시간 동안, 이어서 65℃에서 20분 동안 혼합하고, 12℃에서 유지하였다. 이어서 소화된 DNA를 90V에서 60분 동안 1% 아가로스 겔 상에 가동시키고 SybrSafe로 염색하고 영상화하였다(도 13에서의 실험적 소화 참조, 우측). 본 발명자들은 분류된 집단 대 비분류된 집단에서 pNARhigh　대역 대 pNARlow　대역의 존재에서 비교할 경우 농도계에 의해 경로 pNARhigh　세포의 8-배 초과의 농축을 관찰하였다.
도 14A, 도 14B, 도 14C, 도 14D 및 도 14E는 이중 에멀션 WOW 액적의 분류를 도시한다. 흐름-집중 미세유체 디바이스(flow-focusing microfluidic device)는 초기 OD600 0.75 A의 이콜라이 세포(P674, RFP 양성)를 캡슐화하는 단일 에멀션을 생성시키는데 사용하였다. 수성 유량은 6.5 ㎕/분이었고, 외부 오일 유량은 30 μ/분이었다. 디바이스의 단면에서의 기하 형태는 10㎛ 폭 및 50㎛ 높이였다. 유중수(WO) 액적의 평균 크기는 직경이 30㎛였다. 이어서, 단일 에멀션의 크림층을 1㎖ BD 플라스틱 시린지에 장입하고, 2 ㎕/분의 유량에서 다른 흐름-집중 미세유체 디바이스에 재주사하였다. 3% PVA가 보충된 LB+KAN 배양 배지로 이루어진 외부 수성상을, 35um 폭 및 35um 높이인 흐름-집중 구역에서 수중유중수(WOW) 액적을 핀치 오프하기 위하여 30 ㎕/분의 유량으로 가동시켰다. WOW 액적의 평균 크기는 직경이 40㎛였다. 생성된 WOW 액적을 3% PVA를 갖는 LB+KAN 배양 배지로 덮인 수집관의 바닥부에 가라앉혔다.
WOW가 WOW 생산 동안 발생된 비캡슐화된 이콜라이로부터 분류될 있는 것을 나타내기 위하여, GFP 발현 이콜라이를 WOW 현탁액에 첨가하였다.
도 14A에서, 순방향 산란 대 측방향 산란 플롯은 크기에 기초한 3개의 별개의 집단을 도시한다. 기원으로부터의 유리 이콜라이는 3.7%의 표시된 이벤트를 나타내고, 축 최대치 부근의 WOW는 38%의 표시된 이벤트를 나타내며, WOW 지스러기의 광범위한 집단의 크기가 이들 사이에 있다. 도 14B는 도 14A로부터의 이콜라이 크기 집단의 GFP 채널 형광 반응을 도시한다. 채널 간의 누설로 인해, RFP 양성 이콜라이는 약 75 형광 단위에서 집단으로서 나타낸다. WOW 집단에 첨가된 GFP 양성 이콜라이는 약 1000 내지 10000 형광 단위로 표시된다. 도 14C는 도 14A로부터의 WOW 크기 이벤트의 RFP 채널 형광을 나타낸다. RFP 이콜라이 함유 WOW는 약 90 형광 단위의 집단으로서 표시된다. 암흑 WOW 또는 WOW와 같은 크기의 오일 단독 액적은 약 2 형광 단위의 집단으로서 표시된다. 10,000 WOW 이벤트는 집단으로부터 분류되었고, 분류 후 집단은 도 14D에 도시되어 있다. WOW 액적은 0.1%의 이벤트의 존재에 의해 나타낸 바와 같이 분류 공정에 의해 파괴되는 것에 유의해야 한다. 유리 이콜라이는 분류 후에 관찰된 이벤트의 54%를 나타낸다. 도 14E는 이콜라이의 GFP 채널 형광 반응이 도 14D로부터의 집단을 크기 조절하는 것을 나타낸다. RFP 세포만이 축 상에서 관찰되는 것에 유의한다. 이것은 WOW가 FACS 분류 과정을 견디지 못하는 한편, WOW로부터 이콜라이를 함유하는 RFP만 수집관에 분류되는 것을 입증한다.
1H,1H,2H,2H-퍼플루오로-1-옥탄올을 가진 액적을 파괴시켜 개별의 세포 이벤트를 분류하는 것의 대안으로, 단일 에멀션 액적은 이중 에멀션을 형성하도록 제2 수성상에 캡슐화되어 표준 FACS 상에서 분석/분류될 수 있다. 도 15는 혼합된 2E6 pNARhigh pSENSORGFP 및 2E6 pNARnull pSENSORGFP 이중 에멀션 액적의 분석을 입증한다. 두 균주의 하룻밤 LB 사전 배양액을 세척하고, OD 0.04의 세포 밀도로 여과된 최소 글루코스에 재현탁시켜, 높은 점유율을 확보하는데 사용하였다. 단일 에멀션 액적은 실시예 4에 기재된 프로토콜을 개별적으로 이용해서 2E6 pNARhigh pSENSORGFP 및 2E6 pNARnull pSENSORGFP에 대해서 생성되었다. 형성 후에, 2개 액적 세트는 18시간 동안 텀블링하면서 30℃에서 인큐베이션하였고, 이 시점에서, 또한 실시예 4에 기재된 바와 같이, 이들을 혼합하여 이중 에멀션을 생성하는데 사용하였다. 이중 에멀션의 FACS 분석은, 혼합된 높은 생산자 집단과 비-생산자 집단의 분석과 일치하는, 게이팅된 이중 에멀션 이벤트(게이트 K, 크기에 기초하여 식별됨) 내에 2개의 별개의 GFP(FITC-A-보상된) 집단을 도시한다.
전형적인 플루오로계면활성제(통상 독접적인 분자/중합체/블록 공중합체)의 사용과 더불어, 나노입자 기반 피커링 에멀션은 또한 유중수 액적 및 수중유 액적을 캡슐화하는 역할을 할 수 있다.
도 16은 유중수 피커링 에멀션이 또한 형광 신호를 얻기 위하여 생산자 + 상관 센서 시스템과 사용될 수 있는 것을 입증한다. LB 배지 + 적절한 항생제로부터의 2E6 pNARhigh pSENSORGFP 하룻밤 배양액을, 동일 용적으로 3회 세척하고, 여과된 2x M9, 1% 글루코스, 1mM IPTG, 0.1% 플루로닉 F68, 및 적절한 항생제에 재현탁시켜서, 최종 재현탁 OD600이 단일 세포 액적 장입 수성상으로서 사용하기 위하여 (종래의 경험적 푸아송 분포 결정에 따라) 0.008이 되도록 하였다. 액적은, 피커링 에멀션 용액(플루오로페이즈, Dolomite사 제품)에 대해서 20 ㎕/분의 유량으로 그리고 수성상을 함유하는 세포에 대해서 12 pℓ/분의 유량으로 50㎛ 깊이의 단일 수성 스트림 액적 발생기 칩을 이용해서 생성되어, 35 내지 40㎛ 직경의 액적을 생성하였다. 액적을 오비탈 쉐이커에서 33℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 다음날, 세포 특징/액적 점유율을 관찰하기 위하여 액적을 촬영하였다. 결과는 세포가 경로 분자 생산과 연관된 형광 리포터(GFP 채널)의 증식(하나 초과의 단일 세포/점유된 액적, 명시야) 및 생산 둘 다를 가능하게 한 것을 나타낸다.
등가물
명세서의 다음 부분 및 첨부된 청구범위에서, 재료, 원료 함유량, 용어 및 반응 온도의 양, 양의 비 및 기타에 대한 것과 같은 수치 범위, 양, 값 및 백분율은 모두, 용어 "약"이 값, 양 또는 범위로 명확하게 나타낼 수 있지 않더라도 마치 용어 "약"이 선행하는 것처럼 읽을 수 있다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 이하의 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻어지도록 추구되는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 적어도, 청구범위의 범주와 등가의 원칙의 적용을 한정하는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 감안하여 그리고 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 최광의 범위를 제시하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체예에 제시된 수치값은 가능한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치는 이의 기저를 이루는 각각의 시험 측정치에서 발견되는 표준 편차로부터 반드시 기인하는 오차를 고유하게 함유한다. 또한, 수치 범위가 본 명세서에 제시되는 경우, 이들 범위는 인용된 범위 종점(예컨대, 종점이 사용될 수 있음)을 포함한다. 중량 퍼센트가 본 명세서에서 사용될 경우, 보고된 수치는 전체 중량에 대한 것이다.
또한, 본 명세서에 인용된 어떠한 수치 범위라도 본 명세서에 포함되는 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 의도되는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"의 범위는, 1 이상의 최소값과 10 이하의 최대값을 갖는, 1의 인용된 최소값과 10의 인용된 최대값 사이의 모든 하위 범위(이를 포함)를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어 "하나", "단수" 표현은 달리 표시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 개시된 임의의 양상 또는 실시형태는 본 명세서에 개시된 임의의 다른 양상 또는 실시형태와 조합될 수 있다.
본 명세서에서 참조에 의해 포함되는 것으로 기술되는 임의의 특허, 공보 또는 다른 개시 자료는 전체로 또는 부분적으로 본 개시내용에 제시된 기존의 정의, 진술 또는 기타 개시 자료와 모순되지 않을 정도로만 본 명세서에 편입된다. 그와 같이, 그리고 필요한 정도까지, 본 명세서에 명백하게 제시된 바와 같은 개시내용은, 참조에 의해 본 명세서에 편입된 임의의 상충하는 재료를 대신한다. 본 명세서에 참조에 의해 편입되는 것으로 기술되었지만 본 명세서에 제시된 기존의 정의, 진술 또는 기타 개시 재료와 상충하는 임의의 자료 또는 이의 일부는 단지 편입된 자료와 기존의 개시 자료 사이에 상충이 없는 정도까지 편입될 것이다.
본 발명은 바람직한 실시형태를 참조하여 특히 표시되고 기재되었지만, 형태 및 상세의 각종 변화가 첨부된 청구범위에 의해 포괄되는 본 발명의 범위로부터 벗어나는 일 없이 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

Claims (141)

  1. 조작된 생산자 세포(engineered producer cell)의 집단(population)을 생산하는 방법으로서,
    유전자 변이된(genetically varied) 생산자 세포의 풀(pool)로부터의 각 생산자 세포를 액적(droplet)에 캡슐화하여, 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성하는 단계;
    표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터(reporter)의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독(readout)을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계;
    액적을 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및
    생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 상기 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 상기 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단(enriched population)인, 상기 생산자 세포의 집단을 형성시키는 단계
    를 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 파괴하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류(sorting)하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분류하는 것은 형광 활성화 액적 분류(fluorescence activated droplet sorting: FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 분류하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분류하는 것은 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적을 파괴하는 것은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적을 파괴시켜, 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키는 것을 포함하고, 상기 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA가 에피솜으로(episomally) 암호화된, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 플라스미드 상에 암호화된, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 상기 생산자 세포의 게놈에 통합된(integrated), 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서는 상기 생산자 세포 내에 형질주입(transfect), 형질도입(transduce), 형질전환(transform)되거나 또는 되었거나 또는 다르게는 이용 가능하게 만들거나 또는 만들어진 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터는 상기 센서-기반 단백질에 의해 차례로 활성화되는 검출 가능한 마커를 암호화하는 유전자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 검출 가능한 마커는 효소 또는 선택 가능한 마커인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 효소는 lacZ, 루시페라제(luciferase) 또는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 영양요구체(auxotroph), 항생제, 내성 마커(resistance marker), 독소, 또는 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 형광 단백질인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물은 분광법 또는 분광측정법에 의해 검출되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자가 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 플라스미드 상에 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 유전자와 동일한 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  20. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 게놈에 통합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 생산자 세포의 풀이 취해지는 조작된 생산자 균주 라이브러리를 생산하는 단계를 더 포함하되, 상기 조작된 생산자 균주 라이브러리는 하나 이상의 표적 분자를 생산하도록 조작되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 다중 자동화 게놈-공학(multiplex automated genome-engineering: MAGE)으로부터 선택된 게놈 다양화 기법(genomic diversifying technology)을 통해서, 플라스미드-기반 생산 변이, 또는 비-GMO 방법에 의해 생성되고, 비-GMO 방법이 화학적 돌연변이유발, 방사선 및 전이인자로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적은 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 더 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서에 의해 제공된 판독 수준은 리포터에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 리포터는 GFP인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 전사 인자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자는 알로스테릭 전사 인자(allosteric transcription factor: aTF)인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 LysR, AraC/XylS, TetR, LuxR, Lacl, ArsR, MerR, AsnC, MarR, NtrC(EBP), OmpR, DeoR, 저온 충격(Cold shock), GntR, 및 Crp 패밀리 구성원으로부터 선택된 조작된 원핵생물 전사 조절인자 패밀리 구성원인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 표 1에 열거된 조작된 aTF(aTF("섀시(Chassis)")인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자는 표 1에 열거된 표적 분자(표적 분자 특성)로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  31. 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법으로서,
    조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 상기 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계;
    유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계;
    표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해 상기 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계;
    상기 액적을 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계; 및
    생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 파괴하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 분류하는 것은 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 분류하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 분류하는 것은 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적을 파괴하는 것은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적을 파괴시켜, 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키는 것을 포함하고, 상기 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  39. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 상기 생산자 세포의 게놈에 통합된, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서는 상기 생산자 세포 내에 형질주입, 형질도입, 형질전환되거나 또는 되었거나 또는 다르게는 이용 가능하게 만들거나 또는 만들어진 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터는 센서-기반 단백질에 의해 차례로 활성화되는 검출 가능한 마커를 암호화하는 유전자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 검출 가능한 마커는 효소 또는 선택 가능한 마커인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 효소는 lacZ, 루시페라제 또는 알칼리성 포스파타아제로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 영양요구체, 항생제, 내성 마커, 독소, 또는 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 형광 단백질인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물은 분광법 또는 분광측정법에 의해 검출되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  47. 제41항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 플라스미드 상에 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 유전자와 동일한 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  50. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 게놈에 통합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  51. 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 생산자 세포의 풀이 취해지는 조작된 생산자 균주 라이브러리를 생산하는 단계를 더 포함하되, 상기 조작된 생산자 균주 라이브러리는 하나 이상의 표적 분자를 생산하도록 조작되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 조작된 생산자 균주 라이브러리는 조작된 센서 플라스미드로 상기 조작된 생산자 세포의 풀을 형질전환시키기 전에 생산되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 조작된 생산자 균주 라이브러리는 조작된 센서 플라스미드로 상기 조작된 생산자 세포의 풀을 형질전환시킨 후에 생산되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  54. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 다중 자동화 게놈-공학(MAGE)으로부터 선택된 게놈 다양화 기법, 플라스미드-기반 생산 변이를 통해서, 또는 비-GMO 방법에 의해 생성되고, 비-GMO 방법이 화학적 돌연변이유발, 방사선 및 전이인자로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  55. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적은 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 더 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  56. 제31항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서에 의해 제공된 판독 수준은 리포터에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 리포터는 GFP인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  58. 제31항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 전사 인자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  59. 제31항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자는 알로스테릭 전사 인자(aTF)인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  60. 제31항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 LysR, AraC/XylS, TetR, LuxR, Lacl, ArsR, MerR, AsnC, MarR, NtrC(EBP), OmpR, DeoR, 저온 충격, GntR, 및 Crp 패밀리 구성원으로부터 선택된 조작된 원핵생물 전사 조절인자 패밀리 구성원인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  61. 제31항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 표 1에 열거된 조작된 aTF(aTF("섀시"))인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  62. 제31항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자는 표 1에 열거된 표적 분자(표적 분자 특성)로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  63. 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법으로서,
    유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계;
    상기 생산자 세포를 함유하는 각 액적을 조작된-단백질 기반 센서 세포(engineered-protein based sensor cell)를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 액적과 병합하는 단계;
    표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계;
    병합된 액적을 분류하여, 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및
    생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 상기 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 파괴하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 분류는 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 분류하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 분류는 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적을 파괴하는 것은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적을 파괴시켜, 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키는 것을 포함하고, 상기 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  71. 제63항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 상기 생산자 세포의 게놈에 통합된, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서는 상기 생산자 세포 내에 형질주입, 형질도입, 형질전환되거나 또는 되었거나 또는 다르게는 이용 가능하게 만들거나 또는 만들어진 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터는 센서-기반 단백질에 의해 차례로 활성화되는 검출 가능한 마커를 암호화하는 유전자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 검출 가능한 마커는 효소 또는 선택 가능한 마커인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 효소는 lacZ, 루시페라제 또는 알칼리성 포스파타아제로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 영양요구체, 항생제, 내성 마커, 독소, 또는 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 형광 단백질인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물은 분광법 또는 분광측정법에 의해 검출되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  79. 제73항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 플라스미드 상에 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 유전자와 동일한 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  82. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 게놈에 통합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  83. 제63항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 생산자 세포의 풀이 취해지는 조작된 생산자 균주 라이브러리를 생산하는 단계를 더 포함하되, 상기 조작된 생산자 균주 라이브러리는 하나 이상의 표적 분자를 생산하도록 조작되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  84. 제63항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 다중 자동화 게놈-공학(MAGE)으로부터 선택된 게놈 다양화 기법, 플라스미드-기반 생산 변이를 통해서, 또는 비-GMO 방법에 의해 생성되고, 비-GMO 방법이 화학적 돌연변이유발, 방사선 및 전이인자로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  85. 제63항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적은 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 더 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  86. 제63항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서에 의해 제공된 판독 수준은 리포터에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 리포터는 GFP인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  88. 제63항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 전사 인자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  89. 제63항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자는 알로스테릭 전사 인자(aTF)인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  90. 제63항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 LysR, AraC/XylS, TetR, LuxR, Lacl, ArsR, MerR, AsnC, MarR, NtrC(EBP), OmpR, DeoR, 저온 충격, GntR, 및 Crp 패밀리 구성원으로부터 선택된 조작된 원핵생물 전사 조절인자 패밀리 구성원인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  91. 제63항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 표 1에 열거된 조작된 aTF(aTF("섀시"))인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  92. 제63항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자는 표 1에 열거된 표적 분자(표적 분자 특성)로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  93. 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법으로서,
    조작된 생산자 세포의 풀을 조작된 센서 플라스미드로 형질전환시키는 단계로서, 상기 조작된 센서 플라스미드는 조작된 단백질 센서를 암호화하는, 상기 형질전환시키는 단계;
    유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서;
    각각의 액적은 플루오린화계(fluorinated-based) 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계;
    표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계;
    액적을 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계;
    생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  94. 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법으로서,
    유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서, 각각의 액적은,
    (a) 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸이고, 그리고
    (b) 조작된 센서 세포를 포함하고, 상기 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 액적을 형성시키는 단계;
    표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서는 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계;
    상기 액적을 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 생산자 세포와 단리시키는 단계;
    생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  95. 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법으로서,
    유전자 변이된 생산자 세포의 풀로부터의 각 생산자 세포를 액적에 캡슐화하여 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 복수의 액적을 형성시키는 단계로서;
    각각의 액적은 플루오린화계 오일 또는 에멀션을 포함하는 비혼화성 연속상에 의해 둘러싸인, 상기 액적을 형성시키는 단계;
    상기 생산자 세포를 함유하는 각 액적을 조작된-단백질 기반 센서 세포를 캡슐화하는 액적과 병합하는 단계로서, 상기 조작된 센서 세포는 조작된 단백질 센서를 생산하는, 상기 병합하는 단계;
    표적 분자의 수준에 대해서 상기 액적을 검정하는 단계로서, 조작된 단백질-기반 센서가 리포터의 활성화 또는 억제를 통해서 상기 생산자 세포에 의해 생산된 목적하는 표적 분자의 수준의 판독을 제공하는, 상기 액적을 검정하는 단계;
    병합된 액적을 분류하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 생산자 세포를 함유하는 액적을 단리시키는 단계; 및
    생산자 세포의 집단을 형성시키기 위하여 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 세포를 회수하는 단계로서, 상기 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 농축된 집단인, 상기 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 유기 오일, 플루오린화 오일, 플루오린화 중합체, 플루오로카본 중 물 에멀션(water-in fluorocarbon emulsion), 퍼플루오로카본 중 물 에멀션(water-in perfluorocarbon emulsion), 또는 이들의 조합물인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  97. 제93항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플루오린화계 오일 또는 에멀션은 입자에 의해 안정화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 입자는 부분 플루오린화 나노입자 또는 부분 소수성 나노입자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 부분 플루오린화 나노입자 또는 부분 소수성 나노입자는 실리카-기반 나노입자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적은 미세유체 제어하에 있는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  101. 제93항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 생산자 세포의 풀이 취해지는 조작된 생산자 균주 라이브러리를 생산하는 단계를 더 포함하되, 상기 조작된 생산자 균주 라이브러리는 하나 이상의 표적 분자를 생산하도록 조작되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 조작된 생산자 균주 라이브러리는 다중 자동화 게놈-공학(MAGE)으로부터 선택된 게놈 다양화 기법, 플라스미드-기반 생산 변이를 통해서, 또는 비-GMO 방법에 의해 생성되고, 비-GMO 방법이 화학적 돌연변이유발, 방사선 및 전이인자로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  103. 제93항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 상기 액적은 성장 배지 및 임의의 필요한 유도제를 더 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  104. 제93항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서에 의해 제공된 판독 수준은 리포터에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 리포터는 GFP인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  106. 제93항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 전사 인자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  107. 제93항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 인자는 알로스테릭 전사 인자(aTF)인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  108. 제93항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 LysR, AraC/XylS, TetR, LuxR, Lacl, ArsR, MerR, AsnC, MarR, NtrC(EBP), OmpR, DeoR, 저온 충격, GntR 및 Crp 패밀리 구성원으로부터 선택된 조작된 원핵생물 전사 조절인자 패밀리 구성원인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  109. 제93항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질 센서는 표 1에 열거된 조작된 aTF인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  110. 제93항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분자는 표 1에 열거된 표적 분자(표적 분자 특성)로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  111. 제93항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 파괴하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 분류는 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  113. 제93항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회수는,
    (a) 상기 액적을 분류하는 것,
    (b) 상기 유전자 변이된 생산자 세포를 분류하는 것 및
    (c) 성장 배지에서 상기 생산자 세포를 성장시키는 것
    을 포함하는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 분류는 형광 활성화 액적 분류(FADS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  115. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액적을 파괴하는 것은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 단리된 조작된 생산자 세포를 캡슐화하는 액적을 파괴시켜, 조작된 생산자 세포의 집단을 형성시키는 것을 포함하되, 상기 조작된 생산자 세포의 집단은 목적하는 수준의 상기 표적 분자를 생산하는 조작된 생산자 세포의 농축된 집단인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  116. 제93항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  118. 제93항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 DNA는 상기 생산자 세포의 게놈에 통합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  119. 제93항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서는 상기 생산자 세포 내에 형질주입, 형질도입, 형질전환되거나 또는 되었거나 또는 다르게는 이용 가능하게 만들거나 또는 만들어진 것인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  120. 제93항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터는 센서-기반 단백질에 의해 차례로 활성화되는 검출 가능한 마커를 암호화하는 유전자인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 검출 가능한 마커는 효소 또는 선택 가능한 마커인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 효소는 lacZ, 루시페라제 또는 알칼리성 포스파타아제로부터 선택되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 영양요구체, 항생제, 내성 마커, 독소, 또는 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  124. 제120항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커는 형광 단백질인, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 스펙트럼으로 검출 가능한 유전자 산물은 분광법 또는 분광측정법에 의해 검출되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  126. 제120항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 플라스미드 상에 에피솜으로 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 조작된 단백질-기반 센서를 암호화하는 유전자와 동일한 플라스미드 상에 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  129. 제120항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터를 암호화하는 유전자는 상기 게놈에 통합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  130. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 상기 생산자 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  131. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 공동-캡슐화된 센서 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  132. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 개별의 액적에 캡슐화되는 센서 세포 내에서 암호화되고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 상기 액적과 병합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  133. 제31항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 상기 생산자 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  134. 제31항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 공동-캡슐화된 센서 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  135. 제31항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 개별의 액적에 캡슐화되는 센서 세포 내에서 암호화되고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 상기 액적과 병합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  136. 제63항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 and 리포터는 상기 생산자 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  137. 제63항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 공동-캡슐화된 센서 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  138. 제63항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 개별의 액적에 캡슐화되는 센서 세포 내에서 암호화되고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 상기 액적과 병합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  139. 제93항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 상기 생산자 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  140. 제93항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 공동-캡슐화된 센서 세포 내에서 암호화되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
  141. 제93항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 단백질-기반 센서 및 리포터는 개별의 액적에 캡슐화되는 센서 세포 내에서 암호화되고, 이어서 조작된 생산자 세포를 함유하는 상기 액적과 병합되는, 조작된 생산자 세포의 집단을 생산하는 방법.
KR1020207025821A 2018-02-15 2019-02-15 센서 시스템 KR20200121824A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862631090P 2018-02-15 2018-02-15
US62/631,090 2018-02-15
US201862730355P 2018-09-12 2018-09-12
US62/730,355 2018-09-12
PCT/US2019/018273 WO2019161243A1 (en) 2018-02-15 2019-02-15 Sensor systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200121824A true KR20200121824A (ko) 2020-10-26

Family

ID=67618834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207025821A KR20200121824A (ko) 2018-02-15 2019-02-15 센서 시스템

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20200399632A1 (ko)
EP (1) EP3752596A4 (ko)
JP (2) JP2021514202A (ko)
KR (1) KR20200121824A (ko)
CN (1) CN112088212A (ko)
CA (1) CA3091145A1 (ko)
WO (1) WO2019161243A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022060140A1 (ko) 2020-09-21 2022-03-24 주식회사 엘지에너지솔루션 리튬 이차전지 및 이의 제조방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023240871A1 (zh) * 2022-06-16 2023-12-21 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用
GB202215611D0 (en) * 2022-10-21 2022-12-07 Univ College Dublin National Univ Of Ireland A biosensor comprising a genetically modified microorganism

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010009365A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
WO2013116698A2 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
WO2014158594A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 President And Fellows Of Harvard College Methods for selecting microbes from a genetically modified library to detect and optimize the production of metabolites
CN106232827A (zh) * 2014-02-21 2016-12-14 哈佛学院董事及会员团体 变构蛋白的从头设计
GB201421850D0 (en) * 2014-12-09 2015-01-21 Bactevo Ltd Method for screening for bioactive natural products
WO2017062965A1 (en) * 2015-10-08 2017-04-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Highly sensitive optical sensor for polymerase screening

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022060140A1 (ko) 2020-09-21 2022-03-24 주식회사 엘지에너지솔루션 리튬 이차전지 및 이의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
CA3091145A1 (en) 2019-08-22
EP3752596A1 (en) 2020-12-23
WO2019161243A1 (en) 2019-08-22
CN112088212A (zh) 2020-12-15
US20200399632A1 (en) 2020-12-24
JP2021514202A (ja) 2021-06-10
JP2024029259A (ja) 2024-03-05
EP3752596A4 (en) 2021-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024029259A (ja) センサー系
JP6196241B2 (ja) 生物学的に活性なポリペプチドのハイスループットスクリーニング
Marchand et al. Peptide‐based communication system enables Escherichia coli to Bacillus megaterium interspecies signaling
Scanlon et al. A high‐throughput screen for antibiotic drug discovery
US20190195864A1 (en) Cell-free sensor systems
Rose et al. Substrate-dependent assembly of the Tat translocase as observed in live Escherichia coli cells
US20230324306A1 (en) Method for ultra-high performance screening of biological objects
Kaspar et al. Intercellular communication via the comX-inducing peptide (XIP) of Streptococcus mutans
Di Girolamo et al. Stable and selective permeable hydrogel microcapsules for high-throughput cell cultivation and enzymatic analysis
Dagkesamanskaya et al. Use of photoswitchable fluorescent proteins for droplet-based microfluidic screening
Ruszczak et al. Physicochemical properties predict retention of antibiotics in water-in-oil droplets
Kaiser Are myxobacteria intelligent?
US10260064B2 (en) Programmed droplet rupture for directed evolution
Brechun et al. Selection of protein–protein interactions of desired affinities with a bandpass circuit
US20230295560A1 (en) Synthetic ecologies for drug discovery
Roggo et al. Heterologous expression of Pseudomonas putida methyl-accepting chemotaxis proteins yields Escherichia coli chemotactic to aromatic compounds
Bongaerts Target essential surrogate E. coli (TESEC): a technology platform for tuberculosis drug discovery and the investigation into the mutational landscape of drug targets
Hamm Molecular Regulation of Bacterial Stress Responses and Pyocin Production
Dabene Functional and Quantitative High-Throughput Screening for Hydrolases Secreted by B. subtilis
Wójcik Pathogenic, versatile and tunable activity of sortase, a transpeptidation machine
Lim Droplet Microfluidics for Single-cell Genomics
Weihs A supramolecular structure in the membrane of Staphylococcus aureus
Scharn Movement and stability of the staphylococcal cassette chromosome mec among Staphylococcus aureus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application