JP2024029259A - センサー系 - Google Patents
センサー系 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024029259A JP2024029259A JP2024006721A JP2024006721A JP2024029259A JP 2024029259 A JP2024029259 A JP 2024029259A JP 2024006721 A JP2024006721 A JP 2024006721A JP 2024006721 A JP2024006721 A JP 2024006721A JP 2024029259 A JP2024029259 A JP 2024029259A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- modified
- sensor
- producer cells
- cells
- producer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 292
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 246
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 194
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 179
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 87
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 86
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 82
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 82
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 61
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 claims description 45
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 41
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 claims description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 28
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 26
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 238000002421 fluorescence-activated droplet sorting Methods 0.000 claims description 24
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 20
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 11
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 11
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 9
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 9
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 8
- 229920002313 fluoropolymer Polymers 0.000 claims description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 670
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 173
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 163
- -1 ArlacelTM P135) Chemical compound 0.000 description 147
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 112
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 104
- 239000000047 product Substances 0.000 description 79
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 53
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 52
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 52
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 47
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 description 47
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 description 47
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 36
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 34
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 33
- 230000004044 response Effects 0.000 description 29
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 22
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 22
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 21
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 21
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 20
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 19
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 16
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 15
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 13
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 10
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 7
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 6
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 5
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 5
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 5
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 5
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GRJRKPMIRMSBNK-UHFFFAOYSA-N 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctan-1-ol Chemical compound OCCC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F GRJRKPMIRMSBNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 4
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- NWGKJDSIEKMTRX-BFWOXRRGSA-N [(2r)-2-[(3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)C1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-BFWOXRRGSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N decane Chemical compound CCCCCCCCCC DIOQZVSQGTUSAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000514 dolomite Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010459 dolomite Substances 0.000 description 4
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N hexadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC DCAYPVUWAIABOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 3
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 3
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 3
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HHBBIOLEJRWIGU-UHFFFAOYSA-N 4-ethoxy-1,1,1,2,2,3,3,4,5,6,6,6-dodecafluoro-5-(trifluoromethyl)hexane Chemical compound CCOC(F)(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F HHBBIOLEJRWIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical class NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 2
- 101100421503 Arabidopsis thaliana SIGA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 2
- 101100395324 Caenorhabditis elegans hmg-1.2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100400624 Caenorhabditis elegans mbr-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100294112 Caenorhabditis elegans nhr-47 gene Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 2
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 2
- 101100165228 Clostridium perfringens bcn gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 101100121705 Drosophila melanogaster sens gene Proteins 0.000 description 2
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 description 2
- 241001013691 Escherichia coli BW25113 Species 0.000 description 2
- 241001135750 Geobacter Species 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101100326385 Mus musculus Btc gene Proteins 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 2
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 description 2
- IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N Sorbitan monopalmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N 0.000 description 2
- HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N Sorbitan monostearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N 0.000 description 2
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 2
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 2
- 101150057353 Ttk gene Proteins 0.000 description 2
- IJCWFDPJFXGQBN-RYNSOKOISA-N [(2R)-2-[(2R,3R,4S)-4-hydroxy-3-octadecanoyloxyoxolan-2-yl]-2-octadecanoyloxyethyl] octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IJCWFDPJFXGQBN-RYNSOKOISA-N 0.000 description 2
- LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N [(2r)-2-[(2r,3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O LWZFANDGMFTDAV-BURFUSLBSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001343 alkyl silanes Chemical class 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical class OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 108010045262 enhanced cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 2
- 239000012875 nonionic emulsifier Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011067 sorbitan monolaureate Nutrition 0.000 description 2
- 235000011078 sorbitan tristearate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical class OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical class OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical class CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- IMZBXSAKACGTPH-UHFFFAOYSA-N (3-oxo-6'-phosphonooxyspiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1OC1=CC(OP(O)(=O)O)=CC=C21 IMZBXSAKACGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LWRNQOBXRHWPGE-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2,3,3,4,4,4a,5,5,6,6,7,7,8,8a-heptadecafluoro-8-(trifluoromethyl)naphthalene Chemical compound FC1(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C2(F)C(C(F)(F)F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C21F LWRNQOBXRHWPGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150059521 AHRR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589234 Acetobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000266272 Acidithiobacillus Species 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 102100032157 Adenylate cyclase type 10 Human genes 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 101100001475 Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila (strain ATCC 7966 / DSM 30187 / BCRC 13018 / CCUG 14551 / JCM 1027 / KCTC 2358 / NCIMB 9240 / NCTC 8049) alr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100103731 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) APE_0142 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100105203 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) APE_0778 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100175628 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) glk gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256787 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424893 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100536771 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 1
- 241001136561 Allomyces Species 0.000 description 1
- 241000193741 Aneurinibacillus aneurinilyticus Species 0.000 description 1
- 241001468259 Anoxybacillus flavithermus Species 0.000 description 1
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100058739 Arabidopsis thaliana BZR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100042610 Arabidopsis thaliana SIGB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000180579 Arca Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241001495180 Arthrospira Species 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193375 Bacillus alcalophilus Species 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000193410 Bacillus atrophaeus Species 0.000 description 1
- 241000966273 Bacillus boroniphilus Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 1
- 241001385703 Bacillus galliciensis Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 241000202341 Bacillus sporothermodurans Species 0.000 description 1
- 101100544166 Bacillus subtilis (strain 168) yhcK gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000606123 Bacteroides thetaiotaomicron Species 0.000 description 1
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 241001465180 Botrytis Species 0.000 description 1
- 241000722885 Brettanomyces Species 0.000 description 1
- 241000534628 Brevibacillus centrosporus Species 0.000 description 1
- 241000193417 Brevibacillus laterosporus Species 0.000 description 1
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 1
- 101150107019 CEP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 101100001231 Caenorhabditis elegans aha-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100001271 Caenorhabditis elegans ahr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100492584 Caenorhabditis elegans ast-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100026251 Caenorhabditis elegans atf-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100164160 Caenorhabditis elegans atf-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100326201 Caenorhabditis elegans blmp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437861 Caenorhabditis elegans brc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100327050 Caenorhabditis elegans cbp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100383153 Caenorhabditis elegans cdk-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231506 Caenorhabditis elegans ceh-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231513 Caenorhabditis elegans ceh-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231514 Caenorhabditis elegans ceh-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231515 Caenorhabditis elegans ceh-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124474 Caenorhabditis elegans ceh-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124475 Caenorhabditis elegans ceh-16 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100059612 Caenorhabditis elegans ceh-17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124476 Caenorhabditis elegans ceh-18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124477 Caenorhabditis elegans ceh-19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231507 Caenorhabditis elegans ceh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124486 Caenorhabditis elegans ceh-20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124487 Caenorhabditis elegans ceh-21 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124488 Caenorhabditis elegans ceh-22 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178161 Caenorhabditis elegans ceh-23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100059613 Caenorhabditis elegans ceh-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178166 Caenorhabditis elegans ceh-31 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178167 Caenorhabditis elegans ceh-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178168 Caenorhabditis elegans ceh-33 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178169 Caenorhabditis elegans ceh-34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178171 Caenorhabditis elegans ceh-36 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178172 Caenorhabditis elegans ceh-37 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178173 Caenorhabditis elegans ceh-38 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178174 Caenorhabditis elegans ceh-39 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178175 Caenorhabditis elegans ceh-40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178176 Caenorhabditis elegans ceh-43 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231508 Caenorhabditis elegans ceh-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231509 Caenorhabditis elegans ceh-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100059615 Caenorhabditis elegans ceh-60 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231510 Caenorhabditis elegans ceh-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231511 Caenorhabditis elegans ceh-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100231512 Caenorhabditis elegans ceh-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100166838 Caenorhabditis elegans ces-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100439236 Caenorhabditis elegans cfi-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100220553 Caenorhabditis elegans chd-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459917 Caenorhabditis elegans cnd-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100008635 Caenorhabditis elegans daf-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100008636 Caenorhabditis elegans daf-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100447050 Caenorhabditis elegans daf-16 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100008637 Caenorhabditis elegans daf-19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100008646 Caenorhabditis elegans daf-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100386238 Caenorhabditis elegans daf-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100386717 Caenorhabditis elegans dcp-66 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100277917 Caenorhabditis elegans dmd-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100277918 Caenorhabditis elegans dmd-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152794 Caenorhabditis elegans dpl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100388124 Caenorhabditis elegans dpy-26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100223811 Caenorhabditis elegans dsc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100388831 Caenorhabditis elegans efl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011365 Caenorhabditis elegans egl-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011370 Caenorhabditis elegans egl-27 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011371 Caenorhabditis elegans egl-43 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011372 Caenorhabditis elegans egl-44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011373 Caenorhabditis elegans egl-46 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011376 Caenorhabditis elegans egl-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100445049 Caenorhabditis elegans elt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100445050 Caenorhabditis elegans elt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100445051 Caenorhabditis elegans elt-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100445052 Caenorhabditis elegans elt-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100065718 Caenorhabditis elegans ets-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100065720 Caenorhabditis elegans ets-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100172900 Caenorhabditis elegans eya-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100226769 Caenorhabditis elegans fax-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100120165 Caenorhabditis elegans fkh-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100120166 Caenorhabditis elegans fkh-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100120167 Caenorhabditis elegans fkh-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100120168 Caenorhabditis elegans fkh-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100120169 Caenorhabditis elegans fkh-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100174180 Caenorhabditis elegans fos-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100281537 Caenorhabditis elegans fozi-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100175353 Caenorhabditis elegans gei-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100025924 Caenorhabditis elegans gei-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394231 Caenorhabditis elegans ham-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100016516 Caenorhabditis elegans hbl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100450705 Caenorhabditis elegans hif-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451196 Caenorhabditis elegans hizr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124469 Caenorhabditis elegans hlh-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124470 Caenorhabditis elegans hlh-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124471 Caenorhabditis elegans hlh-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124472 Caenorhabditis elegans hlh-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124473 Caenorhabditis elegans hlh-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017496 Caenorhabditis elegans hlh-15 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017497 Caenorhabditis elegans hlh-17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017499 Caenorhabditis elegans hlh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017498 Caenorhabditis elegans hlh-26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017502 Caenorhabditis elegans hlh-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017500 Caenorhabditis elegans hlh-30 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017503 Caenorhabditis elegans hlh-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100017504 Caenorhabditis elegans hlh-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100538958 Caenorhabditis elegans hlh-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257817 Caenorhabditis elegans hmg-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257815 Caenorhabditis elegans hmg-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100395331 Caenorhabditis elegans hmg-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451306 Caenorhabditis elegans hnd-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124874 Caenorhabditis elegans hsf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100126292 Caenorhabditis elegans irx-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100074187 Caenorhabditis elegans lag-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100335314 Caenorhabditis elegans let-381 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100454442 Caenorhabditis elegans let-418 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100511175 Caenorhabditis elegans lim-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100511176 Caenorhabditis elegans lim-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100511177 Caenorhabditis elegans lim-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100343342 Caenorhabditis elegans lin-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100074836 Caenorhabditis elegans lin-22 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100074840 Caenorhabditis elegans lin-26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100181921 Caenorhabditis elegans lin-31 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100181922 Caenorhabditis elegans lin-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100181923 Caenorhabditis elegans lin-35 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100181928 Caenorhabditis elegans lin-39 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100181931 Caenorhabditis elegans lin-41 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100235539 Caenorhabditis elegans lin-49 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100235550 Caenorhabditis elegans lin-54 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100021264 Caenorhabditis elegans lin-59 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100021266 Caenorhabditis elegans lin-61 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100075828 Caenorhabditis elegans mab-23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100075830 Caenorhabditis elegans mab-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100313161 Caenorhabditis elegans mab-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100236847 Caenorhabditis elegans mdl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100290713 Caenorhabditis elegans mef-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100512897 Caenorhabditis elegans mes-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100512901 Caenorhabditis elegans mes-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100512904 Caenorhabditis elegans mes-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100456968 Caenorhabditis elegans mex-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100237383 Caenorhabditis elegans mex-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260020 Caenorhabditis elegans mls-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451301 Caenorhabditis elegans mls-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100428830 Caenorhabditis elegans mml-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459234 Caenorhabditis elegans mxl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459235 Caenorhabditis elegans mxl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100459236 Caenorhabditis elegans mxl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100404599 Caenorhabditis elegans nfi-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079899 Caenorhabditis elegans nfx-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516502 Caenorhabditis elegans ngn-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240516 Caenorhabditis elegans nhr-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348501 Caenorhabditis elegans nhr-100 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348502 Caenorhabditis elegans nhr-103 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348503 Caenorhabditis elegans nhr-106 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348504 Caenorhabditis elegans nhr-108 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240517 Caenorhabditis elegans nhr-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348505 Caenorhabditis elegans nhr-111 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348506 Caenorhabditis elegans nhr-114 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348507 Caenorhabditis elegans nhr-115 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240518 Caenorhabditis elegans nhr-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348508 Caenorhabditis elegans nhr-121 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348509 Caenorhabditis elegans nhr-124 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348510 Caenorhabditis elegans nhr-125 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348511 Caenorhabditis elegans nhr-127 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240519 Caenorhabditis elegans nhr-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348512 Caenorhabditis elegans nhr-130 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460291 Caenorhabditis elegans nhr-133 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460292 Caenorhabditis elegans nhr-134 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460293 Caenorhabditis elegans nhr-136 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240520 Caenorhabditis elegans nhr-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460294 Caenorhabditis elegans nhr-150 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460295 Caenorhabditis elegans nhr-153 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460296 Caenorhabditis elegans nhr-154 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240521 Caenorhabditis elegans nhr-16 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460297 Caenorhabditis elegans nhr-164 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460298 Caenorhabditis elegans nhr-167 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460299 Caenorhabditis elegans nhr-169 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460300 Caenorhabditis elegans nhr-174 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240522 Caenorhabditis elegans nhr-18 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240523 Caenorhabditis elegans nhr-19 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460301 Caenorhabditis elegans nhr-197 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460302 Caenorhabditis elegans nhr-199 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294102 Caenorhabditis elegans nhr-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240526 Caenorhabditis elegans nhr-20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460303 Caenorhabditis elegans nhr-213 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460304 Caenorhabditis elegans nhr-217 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460305 Caenorhabditis elegans nhr-218 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240527 Caenorhabditis elegans nhr-22 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240528 Caenorhabditis elegans nhr-23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240529 Caenorhabditis elegans nhr-25 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460306 Caenorhabditis elegans nhr-268 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240530 Caenorhabditis elegans nhr-27 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294106 Caenorhabditis elegans nhr-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294103 Caenorhabditis elegans nhr-31 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294104 Caenorhabditis elegans nhr-34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294105 Caenorhabditis elegans nhr-35 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294115 Caenorhabditis elegans nhr-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294107 Caenorhabditis elegans nhr-40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294108 Caenorhabditis elegans nhr-41 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294109 Caenorhabditis elegans nhr-42 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294110 Caenorhabditis elegans nhr-43 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294111 Caenorhabditis elegans nhr-44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294113 Caenorhabditis elegans nhr-48 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294114 Caenorhabditis elegans nhr-49 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516554 Caenorhabditis elegans nhr-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294116 Caenorhabditis elegans nhr-51 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294117 Caenorhabditis elegans nhr-52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294118 Caenorhabditis elegans nhr-53 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294119 Caenorhabditis elegans nhr-54 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294120 Caenorhabditis elegans nhr-55 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294121 Caenorhabditis elegans nhr-57 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516553 Caenorhabditis elegans nhr-59 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516563 Caenorhabditis elegans nhr-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516555 Caenorhabditis elegans nhr-60 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516556 Caenorhabditis elegans nhr-61 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516557 Caenorhabditis elegans nhr-62 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516558 Caenorhabditis elegans nhr-64 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516559 Caenorhabditis elegans nhr-65 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516560 Caenorhabditis elegans nhr-67 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516561 Caenorhabditis elegans nhr-68 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516562 Caenorhabditis elegans nhr-69 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516568 Caenorhabditis elegans nhr-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516564 Caenorhabditis elegans nhr-71 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516565 Caenorhabditis elegans nhr-76 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516566 Caenorhabditis elegans nhr-77 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516567 Caenorhabditis elegans nhr-79 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516572 Caenorhabditis elegans nhr-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516569 Caenorhabditis elegans nhr-85 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516570 Caenorhabditis elegans nhr-86 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100516571 Caenorhabditis elegans nhr-89 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079984 Caenorhabditis elegans nhr-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079979 Caenorhabditis elegans nhr-90 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079980 Caenorhabditis elegans nhr-91 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079981 Caenorhabditis elegans nhr-96 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079982 Caenorhabditis elegans nhr-97 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100079983 Caenorhabditis elegans nhr-98 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100404912 Caenorhabditis elegans nob-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100027170 Caenorhabditis elegans nurf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100518205 Caenorhabditis elegans odr-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100346154 Caenorhabditis elegans oma-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100346155 Caenorhabditis elegans oma-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100518995 Caenorhabditis elegans pax-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100297395 Caenorhabditis elegans pha-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100297538 Caenorhabditis elegans php-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100243951 Caenorhabditis elegans pie-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100084421 Caenorhabditis elegans pros-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100476924 Caenorhabditis elegans sdc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256304 Caenorhabditis elegans sdc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256309 Caenorhabditis elegans sdc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100313164 Caenorhabditis elegans sea-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100149246 Caenorhabditis elegans sem-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100149536 Caenorhabditis elegans skn-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257127 Caenorhabditis elegans sma-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257133 Caenorhabditis elegans sma-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257134 Caenorhabditis elegans sma-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100366098 Caenorhabditis elegans snpc-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310641 Caenorhabditis elegans sop-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100355949 Caenorhabditis elegans spr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100366556 Caenorhabditis elegans sptf-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100045312 Caenorhabditis elegans taf-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100313160 Caenorhabditis elegans tbx-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152579 Caenorhabditis elegans tbx-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152587 Caenorhabditis elegans tbx-31 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152588 Caenorhabditis elegans tbx-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152589 Caenorhabditis elegans tbx-33 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152590 Caenorhabditis elegans tbx-34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152591 Caenorhabditis elegans tbx-35 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152592 Caenorhabditis elegans tbx-36 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152593 Caenorhabditis elegans tbx-37 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152594 Caenorhabditis elegans tbx-38 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152595 Caenorhabditis elegans tbx-39 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206161 Caenorhabditis elegans tbx-40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206162 Caenorhabditis elegans tbx-41 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424704 Caenorhabditis elegans tbx-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424705 Caenorhabditis elegans tbx-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424706 Caenorhabditis elegans tbx-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100370282 Caenorhabditis elegans tra-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100483112 Caenorhabditis elegans ttx-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100366604 Caenorhabditis elegans unc-120 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100155407 Caenorhabditis elegans unc-130 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100048443 Caenorhabditis elegans unc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100048438 Caenorhabditis elegans unc-30 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100048442 Caenorhabditis elegans unc-37 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178170 Caenorhabditis elegans unc-39 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100048445 Caenorhabditis elegans unc-42 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100316121 Caenorhabditis elegans unc-55 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100539485 Caenorhabditis elegans unc-86 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100540120 Caenorhabditis elegans vab-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100540121 Caenorhabditis elegans vab-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100317454 Caenorhabditis elegans xbp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100268056 Caenorhabditis elegans zag-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100489396 Caenorhabditis elegans zip-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100489405 Caenorhabditis elegans zip-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100433229 Caenorhabditis elegans zip-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100377467 Caenorhabditis elegans ztf-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000017399 Caesalpinia tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- 101100203088 Caldivirga maquilingensis (strain ATCC 700844 / DSM 13496 / JCM 10307 / IC-167) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424897 Caldivirga maquilingensis (strain ATCC 700844 / DSM 13496 / JCM 10307 / IC-167) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100536773 Caldivirga maquilingensis (strain ATCC 700844 / DSM 13496 / JCM 10307 / IC-167) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 101150027751 Casr gene Proteins 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 240000009108 Chlorella vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007089 Chlorella vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 101100041257 Chlorobaculum tepidum (strain ATCC 49652 / DSM 12025 / NBRC 103806 / TLS) rub2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 241000941525 Chromobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- 108091005960 Citrine Proteins 0.000 description 1
- 241000873310 Citrobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 description 1
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 description 1
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- NOQGZXFMHARMLW-UHFFFAOYSA-N Daminozide Chemical compound CN(C)NC(=O)CCC(O)=O NOQGZXFMHARMLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235035 Debaryomyces Species 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000006867 Discosoma Species 0.000 description 1
- 108010003661 Distal-less homeobox proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004648 Distal-less homeobox proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001147784 Domibacillus aminovorans Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101100512902 Drosophila melanogaster Mes-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150029010 Edc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 101100378884 Escherichia coli (strain K12) allR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100269658 Escherichia coli (strain K12) allS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100132752 Escherichia coli (strain K12) nanR gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100022366 Fatty acyl-CoA reductase 1 Human genes 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001149959 Fusarium sp. Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 241000589236 Gluconobacter Species 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710130691 HTH-type transcriptional regulator TnrA Proteins 0.000 description 1
- 101100486258 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) rrnAC0199 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100133429 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) rrnAC1238 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100158099 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) rrnAC2519 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480758 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100536775 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241000033197 Hemibarbus labeo Species 0.000 description 1
- 101000775498 Homo sapiens Adenylate cyclase type 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000824458 Homo sapiens Fatty acyl-CoA reductase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000582994 Homo sapiens Myelin regulatory factor Proteins 0.000 description 1
- 101000637326 Homo sapiens Neuroguidin Proteins 0.000 description 1
- 101001041393 Homo sapiens Serine protease HTRA1 Proteins 0.000 description 1
- 101000987025 Homo sapiens Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical class O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 101100369189 Hyperthermus butylicus (strain DSM 5456 / JCM 9403 / PLM1-5) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000186984 Kitasatospora aureofaciens Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical class CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical class NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical class OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical class NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N L-homocitrulline Chemical class NC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Chemical class CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical class CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 108050005311 LexA-like Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001134775 Lysinibacillus fusiformis Species 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- 101000819644 Lysinibacillus sphaericus UPF0309 protein in nagA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 description 1
- 101100264987 Metallosphaera sedula (strain ATCC 51363 / DSM 5348 / JCM 9185 / NBRC 15509 / TH2) Msed_1725 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369207 Metallosphaera sedula (strain ATCC 51363 / DSM 5348 / JCM 9185 / NBRC 15509 / TH2) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100487029 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) Msm_0453 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480768 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260193 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369206 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178102 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) MJECL29 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480763 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369198 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294176 Methanocella arvoryzae (strain DSM 22066 / NBRC 105507 / MRE50) UNCMA_03340 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100485949 Methanocella arvoryzae (strain DSM 22066 / NBRC 105507 / MRE50) UNCMA_15260 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369193 Methanocella arvoryzae (strain DSM 22066 / NBRC 105507 / MRE50) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100374133 Methanococcoides burtonii (strain DSM 6242 / NBRC 107633 / OCM 468 / ACE-M) Mbur_1811 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294177 Methanococcoides burtonii (strain DSM 6242 / NBRC 107633 / OCM 468 / ACE-M) Mbur_2041 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100365609 Methanococcoides burtonii (strain DSM 6242 / NBRC 107633 / OCM 468 / ACE-M) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369196 Methanococcoides burtonii (strain DSM 6242 / NBRC 107633 / OCM 468 / ACE-M) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294175 Methanococcus aeolicus (strain ATCC BAA-1280 / DSM 17508 / OCM 812 / Nankai-3) Maeo_1182 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480762 Methanococcus aeolicus (strain ATCC BAA-1280 / DSM 17508 / OCM 812 / Nankai-3) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424907 Methanococcus aeolicus (strain ATCC BAA-1280 / DSM 17508 / OCM 812 / Nankai-3) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100159104 Methanococcus maripaludis (strain C5 / ATCC BAA-1333) MmarC5_0898 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100294180 Methanococcus maripaludis (strain C5 / ATCC BAA-1333) MmarC5_1664 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369201 Methanococcus maripaludis (strain C5 / ATCC BAA-1333) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100104151 Methanococcus maripaludis (strain C6 / ATCC BAA-1332) MmarC6_0210 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080028 Methanococcus maripaludis (strain C6 / ATCC BAA-1332) MmarC6_0929 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480765 Methanococcus maripaludis (strain C6 / ATCC BAA-1332) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080029 Methanococcus maripaludis (strain C7 / ATCC BAA-1331) MmarC7_1017 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100157698 Methanococcus maripaludis (strain C7 / ATCC BAA-1331) MmarC7_1702 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480766 Methanococcus maripaludis (strain C7 / ATCC BAA-1331) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260187 Methanococcus maripaludis (strain C7 / ATCC BAA-1331) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369202 Methanococcus maripaludis (strain C7 / ATCC BAA-1331) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080030 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) MMP0020 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100373526 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) MMP0086 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100266167 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) MMP0678 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100517201 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) nrpR gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480767 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260190 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369205 Methanococcus maripaludis (strain S2 / LL) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100103462 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) Mevan_1098 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080032 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) Mevan_1201 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100541695 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) Mevan_1514 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480773 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206358 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100157654 Methanocorpusculum labreanum (strain ATCC 43576 / DSM 4855 / Z) Mlab_0160 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100141070 Methanocorpusculum labreanum (strain ATCC 43576 / DSM 4855 / Z) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369200 Methanocorpusculum labreanum (strain ATCC 43576 / DSM 4855 / Z) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100265313 Methanoculleus marisnigri (strain ATCC 35101 / DSM 1498 / JR1) Memar_2347 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260189 Methanoculleus marisnigri (strain ATCC 35101 / DSM 1498 / JR1) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369204 Methanoculleus marisnigri (strain ATCC 35101 / DSM 1498 / JR1) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480764 Methanopyrus kandleri (strain AV19 / DSM 6324 / JCM 9639 / NBRC 100938) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424911 Methanopyrus kandleri (strain AV19 / DSM 6324 / JCM 9639 / NBRC 100938) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369199 Methanopyrus kandleri (strain AV19 / DSM 6324 / JCM 9639 / NBRC 100938) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100211347 Methanoregula boonei (strain DSM 21154 / JCM 14090 / 6A8) Mboo_0195 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100424909 Methanoregula boonei (strain DSM 21154 / JCM 14090 / 6A8) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100050991 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Mbar_A2318 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100001240 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) ahbB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369195 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100050251 Methanosphaera stadtmanae (strain ATCC 43021 / DSM 3091 / JCM 11832 / MCB-3) Msp_1143 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100365617 Methanosphaera stadtmanae (strain ATCC 43021 / DSM 3091 / JCM 11832 / MCB-3) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480769 Methanosphaera stadtmanae (strain ATCC 43021 / DSM 3091 / JCM 11832 / MCB-3) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260194 Methanosphaera stadtmanae (strain ATCC 43021 / DSM 3091 / JCM 11832 / MCB-3) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369208 Methanosphaera stadtmanae (strain ATCC 43021 / DSM 3091 / JCM 11832 / MCB-3) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100318707 Methanospirillum hungatei JF-1 (strain ATCC 27890 / DSM 864 / NBRC 100397 / JF-1) Mhun_2548 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100141067 Methanospirillum hungatei JF-1 (strain ATCC 27890 / DSM 864 / NBRC 100397 / JF-1) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369197 Methanospirillum hungatei JF-1 (strain ATCC 27890 / DSM 864 / NBRC 100397 / JF-1) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080031 Methanothrix thermoacetophila (strain DSM 6194 / JCM 14653 / NBRC 101360 / PT) Mthe_0662 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480772 Methanothrix thermoacetophila (strain DSM 6194 / JCM 14653 / NBRC 101360 / PT) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260197 Methanothrix thermoacetophila (strain DSM 6194 / JCM 14653 / NBRC 101360 / PT) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206357 Methanothrix thermoacetophila (strain DSM 6194 / JCM 14653 / NBRC 101360 / PT) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241001148170 Microlunatus Species 0.000 description 1
- 241000108056 Monas Species 0.000 description 1
- 101150082137 Mtrr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100382264 Mus musculus Ca14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100112373 Mus musculus Ctsm gene Proteins 0.000 description 1
- 101100005318 Mus musculus Ctsr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100011750 Mus musculus Hsp90b1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100236209 Mus musculus Ltb4r gene Proteins 0.000 description 1
- 101100518987 Mus musculus Pax1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100518997 Mus musculus Pax3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100045406 Mus musculus Tap2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000635833 Mus musculus Tissue factor Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 101100111646 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) blaI gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030372 Myelin regulatory factor Human genes 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091008729 NR1G1 Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 102100032139 Neuroguidin Human genes 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 101100333320 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) end-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100076157 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mbf-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 102100034408 Nuclear transcription factor Y subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710115878 Nuclear transcription factor Y subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100022201 Nuclear transcription factor Y subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 101710205449 Nuclear transcription factor Y subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100031719 Nuclear transcription factor Y subunit gamma Human genes 0.000 description 1
- 101710150472 Nuclear transcription factor Y subunit gamma Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700124 Octodon degus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Chemical class NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Chemical class OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001250072 Oryctes rhinoceros Species 0.000 description 1
- 101150072055 PAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150025129 POP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235652 Pachysolen Species 0.000 description 1
- 241000178961 Paenibacillus alvei Species 0.000 description 1
- 241000193418 Paenibacillus larvae Species 0.000 description 1
- 241000881860 Paenibacillus mucilaginosus Species 0.000 description 1
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 241000193390 Parageobacillus thermoglucosidasius Species 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241001660097 Pedobacter Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000199264 Phaseolus carteri Species 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 101100487238 Picrophilus torridus (strain ATCC 700027 / DSM 9790 / JCM 10055 / NBRC 100828) PTO0557 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100203108 Picrophilus torridus (strain ATCC 700027 / DSM 9790 / JCM 10055 / NBRC 100828) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206141 Picrophilus torridus (strain ATCC 700027 / DSM 9790 / JCM 10055 / NBRC 100828) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101000925883 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Elastase Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 101100486031 Pyrobaculum aerophilum (strain ATCC 51768 / DSM 7523 / JCM 9630 / CIP 104966 / NBRC 100827 / IM2) PAE1627 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256793 Pyrobaculum aerophilum (strain ATCC 51768 / DSM 7523 / JCM 9630 / CIP 104966 / NBRC 100827 / IM2) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206145 Pyrobaculum aerophilum (strain ATCC 51768 / DSM 7523 / JCM 9630 / CIP 104966 / NBRC 100827 / IM2) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260203 Pyrobaculum aerophilum (strain ATCC 51768 / DSM 7523 / JCM 9630 / CIP 104966 / NBRC 100827 / IM2) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206362 Pyrobaculum aerophilum (strain ATCC 51768 / DSM 7523 / JCM 9630 / CIP 104966 / NBRC 100827 / IM2) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256794 Pyrobaculum arsenaticum (strain DSM 13514 / JCM 11321 / PZ6) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206363 Pyrobaculum arsenaticum (strain DSM 13514 / JCM 11321 / PZ6) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100014833 Pyrobaculum calidifontis (strain DSM 21063 / JCM 11548 / VA1) Pcal_1032 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256795 Pyrobaculum calidifontis (strain DSM 21063 / JCM 11548 / VA1) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206146 Pyrobaculum calidifontis (strain DSM 21063 / JCM 11548 / VA1) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206364 Pyrobaculum calidifontis (strain DSM 21063 / JCM 11548 / VA1) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256797 Pyrobaculum islandicum (strain DSM 4184 / JCM 9189 / GEO3) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206149 Pyrobaculum islandicum (strain DSM 4184 / JCM 9189 / GEO3) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152769 Pyrobaculum islandicum (strain DSM 4184 / JCM 9189 / GEO3) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206367 Pyrobaculum islandicum (strain DSM 4184 / JCM 9189 / GEO3) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100412389 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB00550 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100412395 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB00690 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100301515 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB01370 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100177167 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB03470 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100319045 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB03670 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100177178 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB04720 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100247955 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB04820 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100210905 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB13000 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100157495 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB14350 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080038 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB14420 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100247958 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) PYRAB16920 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100301526 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) fl11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100301529 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) lrpA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100034121 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206144 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260202 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206361 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100104970 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) PF0535 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100034125 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256796 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206147 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100260205 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080040 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) PH0601 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100177180 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) PH1701.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100177169 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) PH1782.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100034126 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206148 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152768 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) tfb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206366 Pyrococcus horikoshii (strain ATCC 700860 / DSM 12428 / JCM 9974 / NBRC 100139 / OT-3) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 101100172720 Rattus norvegicus Ces1e gene Proteins 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100337058 Rattus norvegicus Glp1r gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240886 Rattus norvegicus Nptx2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100083855 Rattus norvegicus Pou2f3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000952054 Rhizopus sp. Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150081243 STA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080045 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) SSO0659 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100212633 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) SSO0942 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100182526 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) lrs14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100400215 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) lysM gene Proteins 0.000 description 1
- 101100256808 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206153 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369153 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tfbA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100369160 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tfbB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206369 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100273994 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CFT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100496466 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CMR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100152661 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TDA9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100370026 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TOG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100263680 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) VHR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100106006 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YER130C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100267097 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YGR067C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100320750 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YLL054C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100267497 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YLR278C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100376725 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YNR063W gene Proteins 0.000 description 1
- 101100320971 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPR015C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100320973 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPR022C gene Proteins 0.000 description 1
- 101100267719 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPR196W gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000187560 Saccharopolyspora Species 0.000 description 1
- 241001468199 Saccharopolyspora sp. Species 0.000 description 1
- 101100094962 Salmo salar salarin gene Proteins 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000235060 Scheffersomyces stipitis Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000720795 Schizosaccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000015473 Schizothorax griseus Species 0.000 description 1
- 102100021119 Serine protease HTRA1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027864 Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A Human genes 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241001591005 Siga Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000144249 Sinorhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000221948 Sordaria Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000122973 Stenotrophomonas maltophilia Species 0.000 description 1
- 241000983364 Stenotrophomonas sp. Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101000901034 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp2 Proteins 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000913727 Streptomyces alboniger Species 0.000 description 1
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 description 1
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 description 1
- 241000958215 Streptomyces filamentosus Species 0.000 description 1
- 241000187438 Streptomyces fradiae Species 0.000 description 1
- 241000187399 Streptomyces lincolnensis Species 0.000 description 1
- 241000970906 Streptomyces natalensis Species 0.000 description 1
- 241000122969 Streptomyces nodosus Species 0.000 description 1
- 241000187419 Streptomyces rimosus Species 0.000 description 1
- 241000531819 Streptomyces venezuelae Species 0.000 description 1
- 241001147844 Streptomyces verticillus Species 0.000 description 1
- 101100318036 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) Saci_1344 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100056430 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) arnR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100421404 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100098939 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100206371 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 241000160715 Sulfolobus tokodaii Species 0.000 description 1
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 1
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 description 1
- 241000388430 Tara Species 0.000 description 1
- 101100194809 Thermococcus kodakarensis (strain ATCC BAA-918 / JCM 12380 / KOD1) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100098943 Thermococcus kodakarensis (strain ATCC BAA-918 / JCM 12380 / KOD1) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480998 Thermococcus kodakarensis (strain ATCC BAA-918 / JCM 12380 / KOD1) tfe gene Proteins 0.000 description 1
- 101100194808 Thermoplasma acidophilum (strain ATCC 25905 / DSM 1728 / JCM 9062 / NBRC 15155 / AMRC-C165) ribK gene Proteins 0.000 description 1
- 101100203120 Thermoplasma acidophilum (strain ATCC 25905 / DSM 1728 / JCM 9062 / NBRC 15155 / AMRC-C165) sfsA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100098941 Thermoplasma acidophilum (strain ATCC 25905 / DSM 1728 / JCM 9062 / NBRC 15155 / AMRC-C165) tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589497 Thermus sp. Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 1
- 241000193396 Virgibacillus pantothenticus Species 0.000 description 1
- 108091034857 Whirly family Proteins 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000490645 Yarrowia sp. Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 102100028610 Zinc finger protein 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 101710144834 Zinc finger protein 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193761 [Bacillus] caldolyticus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229920006397 acrylic thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 101150091502 ced-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150031236 ceh-24 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150051158 ceh-30 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150089239 ceh-44 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011035 citrine Substances 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Chemical class OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150019229 dpy-20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028817 dpy-22 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007843 droplet-based assay Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007792 gaseous phase Substances 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 230000008826 genomic mutation Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 210000005256 gram-negative cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150064902 hlh-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 101150016833 mec-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150009274 nhr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150024084 nhr-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960004624 perflexane Drugs 0.000 description 1
- ZJIJAJXFLBMLCK-UHFFFAOYSA-N perfluorohexane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F ZJIJAJXFLBMLCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 101150069431 rbr-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 101150117326 sigA gene Proteins 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940081330 tena Drugs 0.000 description 1
- ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N tert-butyl prop-2-enoate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)C=C ISXSCDLOGDJUNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N tetrahydropyrrole Natural products C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 101150117196 tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Chemical class ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- AVYKQOAMZCAHRG-UHFFFAOYSA-N triethoxy(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F AVYKQOAMZCAHRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150057095 ttgR gene Proteins 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150096625 unc-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150109253 unc-62 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150022879 vab-15 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150047957 yfiR gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
- B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
- B01F23/41—Emulsifying
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
- C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/149—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties
- G01N15/1492—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry specially adapted for sorting particles, e.g. by their size or optical properties within droplets
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1481—Optical analysis of particles within droplets
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】生物工学における標的分子の検出の改善をもたらす方法及び組成物を提供する。【解決手段】改変されたセンサー技術を使用して、バルク混合液滴又はマイクロ流体的に生成された液滴内の改変された産生株の増殖及び選択を改善するための方法及び組成物。【選択図】図11
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年2月15日に出願された米国仮出願第62/631,090号、及び2018年9月12日に出願された米国仮出願第62/730,355号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、2018年2月15日に出願された米国仮出願第62/631,090号、及び2018年9月12日に出願された米国仮出願第62/730,355号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
本技術は、改変タンパク質センサー(engineered protein sensor)を使用して改変産物産生細胞(engineered producer producing cell)を検出及び濃縮するための方法及び組成物に関する。
政府所有権
本発明は、国防高等研究計画局(DARPA)から授与された助成金番号D16PC00132に基づく米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国防高等研究計画局(DARPA)から授与された助成金番号D16PC00132に基づく米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
小分子の認識を転写生産に直接結びつける単一タンパク質である細菌性アロステリック転写因子(aTF)の使用は、酵素の生物学的生産及び検出を改善する代謝工学戦略における使用が提案されている(Taylor,et al.Nat.Methods 13(2):177)。エフェクターの結合によって引き起こされるタンパク質の構造変化により、特定のオペレーターDNA配列に対するその親和性が調節され、それにより遺伝子発現が最大5000倍まで変化する。これにより、aTFセンサーは、合成生物学の多くの適用の中心となる感知及び応答の課題(sense-and-respond challenge)に対処するための興味深いパラダイムになる。
aTFは迅速にリガンドを感知し、レポーター(例えば、蛍光タンパク質又は選択マーカー)の発現誘導などの標的化された転写の変化を誘発する。これにより、同族リガンドの細胞内濃度が高い細胞の濃縮が可能になる(例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)又は増殖による)。代謝工学の観点では、これにより、改変株をスクリーニング可能なスループットが大幅に向上する。
しかしながら、特定のゲノム工学の状況(例えば、コア代謝プロセスを対象とする大規模なゲノム操作を行う場合)では、センサーの性能の変動により、改変センサーを確実に展開できない場合がある。プラスミドをベースとしたリジンセンサー系でスクリーニングされた大腸菌(E.coli)変異体の化学的に変異誘発されたライブラリーなど、変異体間のセンサー応答変動が見られた(Binder et al.,Genome Biology,73(R40),1-12,2012)。
センサーの性能は、生産機能及び感知機能を分断することによって回復され得る。例えば、一方の株が生産専用でもう一方の株が感知専用である2種類の株を共培養すると、ゲノムの変動によって生産レベルを変更できる一方で、改変されていない各センサー株は、産生株により産生される産物のレベルに対して確実な応答を提供する。しかしながら、このためには、スクリーニングされる改変産生株の各々を、センサー株を用いて独自の増殖容器で増殖させる必要があり、これは、106を超える独自のメンバーを有する産生株ライブラリーを使用する際に課題を提示する。
他の状況では(例えば、拡散性産物又は能動的に排出される産物と共に機能する場合)、改変産生株群を分離した状態で増殖させてスクリーニングし、集団中の非産生株と改善された産生株とのクロストークを回避する必要がある。例えば、大量のナリンゲニン又は少量のナリンゲニンを産生し、GFPに基づいたナリンゲニンセンサー系で形質転換される2種類の産生株を共培養すると、産生期後にGFPに基づく強い蛍光及び弱い蛍光を示す2つの亜集団が生成されるべきである。しかしながら、産生後、1種類の中間蛍光集団のみが見られ、各細胞の個々の産生合計ではなく、集団全体にわたる拡散産物のバルクレベルへの応答が示唆される(実施例2、図3)。実際の選択では、この集団の平均化又はクロストークは、研究者が残りの集団から産生量のより高い改変菌株を特定する能力を阻害することとなる。この課題を克服するには、さらに各改変株を各自の増殖容器内で独自に区画化する必要がある。
したがって、改変産物産生細胞を検出及び濃縮するための改良された方法及び系が必要である。
本技術は、改変されたセンサー技術を使用して、バルク混合液滴又はマイクロ流体的に生成された液滴内の改変された産生株(すなわち、細胞)の増殖及び選択を改善するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体的に生成された液滴は、大規模に改変株のための均一で単離された増殖容器を提供する。いくつかの実施形態において、液滴は、20kHz未満(例えば、約20kHz未満、約15kHz未満、約10kHz未満、又は約5kHz未満)で生成され、毎秒2,000~5,000(例えば、約2,000、約2,500、約3,000、約3,500、約4,000、約4,500、又は約5,000)の固有の産生株の封入(encapsulation)が可能となり、これにより、1日に、マイクロ流体デバイスあたり5億未満の固有の産生株のスクリーニングを実施できる。
一態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞それぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、(a)フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び(b)改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞の集団を作製する方法であって、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
一態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、及び各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含み、各液滴は、(a)フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び(b)改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合した液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
一態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための組成物及び方法であって、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及びアッセイするための改変センサー系も含んでおり、前記センサー系はゲノム内又はプラスミド上に存在していてもよい、前記組成物及び方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株(すなわち、細胞)の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための組成物及び方法に関する。様々な実施形態において、改変センサー株は、標的分子を検出可能なaTFセンサーであるセンサー系を保有する。
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖し、次いで改変産生細胞を含む液滴を、改変センサー系(例えば、細胞をベースとしたセンサー系又はインビトロセンサー系)を含む第2のレポート液滴と融合させることにより、産生レベルをアッセイするための組成物及び方法に関する。様々な実施形態において、改変センサー株は、標的分子を検出可能なaTFセンサーを収容する。
別の態様では、本技術は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及び照合する(interrogating)ための改変センサープラスミドがさらに含む、前記方法に関する。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は、修飾シリカナノ粒子(例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子)である。様々な実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子はシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
別の態様では、本技術は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、且つ各液滴は、改変センサー細胞を含む、前記方法に関する。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は修飾シリカナノ粒子(例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子)である。様々な実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させ、ここで、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、次いで前記改変産生細胞を含む液滴を、改変センサー系を含む第2のレポート液滴と融合させることにより、産生レベルをアッセイするための方法に関する。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。様々な実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は、修飾シリカナノ粒子(例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子)である。様々な実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子はシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。様々な実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
本明細書で開示される任意の態様又は実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
一態様では、本技術は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させてアッセイするための方法であって、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及び照合するための改変センサー系をさらに含む、前記方法に関する。
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、限定されないが、多重自動ゲノム工学法(MAGE)などのゲノム多様化技術を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動(例えば、酵素ホモログの生物資源調査、プロモーター変動など)、非GMO法、若しくは産生の多様性をもたらすその他のメカニズムによって生成される。その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2015/017866号及び国際公開第2008/052101号を参照。
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、少なくとも1種類の改変センサープラスミド又はセンサー系で形質転換される。
いくつかの実施形態では、ライブラリーからの改変産生株のプールは、増殖培地、及びアラビノース、アンヒドロテトラサイクリン、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド、熱、光、又は表1に記載の化合物を含むがこれらに限定されない任意の必要な誘導剤を含む液滴中に乳化される。いくつかの実施形態では、乳化された株が増殖し、所望の産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの株のための産物が蓄積される。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約1~24時間、約4~20時間、約8~16時間、又は約10~14時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約24~72時間、約28~68時間、約32~64時間、約36~60時間、約40~56時間、又は約44~52時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は約1週間又は約2週間である。
いくつかの実施形態では、乳化された株は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約1μg/L~100μg/L、約10μg/L~90μg/L、約20μg/L~80μg/L、約30μg/L~70μg/L、約40μg/L~60μg/L、又は約45μg/L~55μg/Lである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約100μg/L~1000μg/L、約200μg/L~900μg/L、約300μg/L~800μg/L、約400μg/L~700μg/L、又は約500μg/L~600μg/Lである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約1g/L~200g/L、約20g/L~180g/L、約40g/L~160g/L、約60g/L~140g/L、約80g/L~120g/L、又は約90g/L~100g/Lである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約100g/L~500g/L、約150g/L~450g/L、約200g/L~400g/L、又は約250g/L~350g/Lである。
限定する目的ではないが例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、GFP又は以下で説明する他の任意の例示的なレポーター系である。いくつかの実施形態では、液滴は破壊され、細胞はFACSのような適切な選別技術を使用して選別される。
いくつかの実施形態では、液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって、又は第2のバルク水乳剤を形成した後FACSで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。液滴が選別されると、液滴は破壊され、濃縮された改変産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。別の実施形態では、産生細胞のプラスミドが配列決定される(例えば、プラスミドをベースとした経路を生物資源調査する場合)。
いくつかの実施形態では、産生株の増殖又は生存能は、産生される産物の量に直接的に依存し比例する。非限定的な例として、一実施形態では、改変産生株ライブラリーが生成され、改変センサープラスミドで形質転換され、形質転換された改変産生株のプールは、増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む液滴に乳化され、前記形質転換された改変産生細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの細胞のための産物が蓄積され、前記形質転換された改変産生細胞は、高率で増殖するか、又は毒素を相殺する物質を産生することによって前記産物の蓄積に応答し、次いで、前記増殖し生存可能な形質転換された改変産生細胞は、改変産生細胞の濃縮された集団を形成する液滴から放出される。
いくつかの実施形態では、改変産生株はセンサー系を含む。非限定的な例として、一実施形態では、改変産生株ライブラリーが生成され、プラスミド上の改変センサー系で形質転換され、形質転換された改変産生株のプールは、増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む液滴に乳化され、前記形質転換された改変産生細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの細胞のための産物が蓄積され、前記形質転換された改変産生細胞のセンサー系は、GFPなどのレポーターの発現を介して前記産物の蓄積に応答し、次いで、前記改変産生細胞は、前記液滴から放出され、FACSで選別される。
別の態様では、本技術は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法に関する。
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、その内容全体が参照により援用される、ゲノム多様化技術(例えば、限定されないが、Farzadfard F,Lu
TK.Genomically Encoded Analog Memory with Precise In v/Vo DNA Writing in Living Cell Populations.Science(New York,NY).2014;346(6211):1256272.doi:10.1126/science.1256272に記載のCRISPR/Cas法、MAGE、SCRIBE法に関連するレトロン(Retron)をベースとした組換え手法など)を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動(例えば、酵素ホモログ、プロモーター変動などの生物資源調査)若しくは非GMO法などの産生の多様性を生成するその他のメカニズムによって生成される。例として、いくつかの実施形態では、非GMO法には、化学的変異誘発、放射線、及び転位(transposition)が含まれるが、これらに限定されない。
TK.Genomically Encoded Analog Memory with Precise In v/Vo DNA Writing in Living Cell Populations.Science(New York,NY).2014;346(6211):1256272.doi:10.1126/science.1256272に記載のCRISPR/Cas法、MAGE、SCRIBE法に関連するレトロン(Retron)をベースとした組換え手法など)を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動(例えば、酵素ホモログ、プロモーター変動などの生物資源調査)若しくは非GMO法などの産生の多様性を生成するその他のメカニズムによって生成される。例として、いくつかの実施形態では、非GMO法には、化学的変異誘発、放射線、及び転位(transposition)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ライブラリーからの改変産生株のプールは、増殖培地、任意の必要な誘導剤、及び1又は複数の改変センサー細胞を含む液滴中に乳化される。いくつかの実施形態では、細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの株のための産物が蓄積される。いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。限定する目的ではないが例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、GFPである。いくつかの実施形態では、液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって、又は第2のバルク水乳剤を形成し、次いでFACSで二重乳剤を選別することによって選別される。液滴が選別されると、液滴は破壊され、濃縮された改変産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。別の実施形態では、産生細胞のプラスミドが配列決定される(例えば、プラスミドをベースとした経路を生物資源調査する場合)。
いくつかの実施形態では、液滴中の改変センサー細胞の増殖は、共封入された改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルに依存する。例として、いくつかの実施形態では、改変センサーは、増殖に必要な重要なタンパク質の発現を制御する。これにより、産生細胞が標的分子を作成する期間を有する前にセンサー細胞が産生栄養素を利用することが防げられることとなる。
いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、センサー細胞が産生に必要な栄養素を消費することを防げるために、改変産生細胞とは別の炭素源を利用するように改変されている。
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させ、次いで改変産生細胞を含む前記液滴を改変センサー系を含む第2のレポート液滴と融合させることによって産生レベルをアッセイするための方法に関する。いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、ゲノム多様化技術(限定されないが、MAGEなど)を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動(例えば、酵素ホモログの生物資源調査、プロモーター変動など)、非GMO法、若しくは産生の多様性をもたらすその他のメカニズムによって生成される。
いくつかの実施形態では、前記ライブラリーからの改変産生株のプールは液滴中に乳化され、ここで、前記液滴は増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能な改変産生細胞内に産物が蓄積する。いくつかの実施形態において、改変産生細胞を含む液滴は、レポーターを産生するセンサー系(例えば、細胞をベースとしたセンサー系又はインビトロセンサー系)を含む液滴の第2のセットと融合される。
いくつかの実施形態では、レポーターは、改変産生細胞によって産生される産物の量に比例して産生され、融合された液滴は、レポーターレベルについてアッセイされる。いくつかの実施形態では、前記融合された液滴は、レポーターの発現レベルによって選別される。いくつかの実施形態では、前記液滴は、第2のバルク水乳剤を形成し、次いでFACSで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、融合された液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴が選別された後、液滴は破壊され、濃縮された産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。いくつかの実施形態では、前記液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、前記液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。
いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約1μg/L~100μg/L、約10μg/L~90μg/L、約20μg/L~80μg/L、約30μg/L~70μg/L、約40μg/L~60μg/L、又は約45μg/L~55μg/Lである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約100μg/L~1000μg/L、約200μg/L~900μg/L、約300μg/L~800μg/L、約400μg/L~700μg/L、又は約500μg/L~600μg/Lである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約1g/L~200g/L、約20g/L~180g/L、約40g/L~160g/L、約60g/L~140g/L、約80g/L~120g/L、又は約90g/L~100g/Lである。いくつかの実施形態では、前記封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約100g/L~500g/L、約150g/L~450g/L、約200g/L~400g/L、又は約250g/L~350g/Lである。
いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、産生される産物の量に正比例して抗毒素を産生し、前記改変産生細胞を含む液滴は、産生段階後に一定量の毒素を有する液滴と別々に融合される。いくつかの実施形態では、所望のレベルの産物を産生した前記改変産生細胞は、第2の乳化において生存するために十分な抗毒素を産生したと考えられる。いくつかの実施形態では、短時間のインキュベーションの後、融合された液滴は破壊され、濃縮された生存可能な改変産生細胞集団が回収される。
別の態様では、本技術は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、有機油、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、各改変産生細胞は、標的分子の産生をレポート及び照合するための改変センサープラスミドを追加的に含む、前記方法に関する。
別の態様では、本技術は、改変産生株による標的分子の産生についてレポートする別個の改変センサー株の存在下において、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖及びアッセイするための方法であって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、各液滴は、改変センサー細胞を含む、前記方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、液滴中で改変産生株ライブラリーのクローンメンバーを増殖させ、ここで、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれており、次いで前記改変産生細胞を含む液滴を、改変センサー系を含む第2のレポート液滴と融合させることにより、産物の産生レベルをアッセイするための方法に関する。
本技術のいくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、所望により粒子によって安定化される。様々な実施形態では、粒子は修飾シリカナノ粒子(例えば、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子)である。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
いくつかの実施形態では、乳剤は、水相に分散された水非混和性液体を含むピカリング乳剤(例えば、水中油型(O/W型)乳剤)である。いくつかの実施形態では、乳剤は有機油を含む。いくつかの実施形態では、水非混和性液体は、油又は有機油(例えば、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油)である。
いくつかの実施形態では、乳剤は、連続油相に分散された水性液滴を含むピカリング乳剤(例えば、油中水型(W/O型)乳剤)である。いくつかの実施形態では、乳剤は有機油を含む。いくつかの実施形態では、水非混和性液体は、油又は有機油(例えば、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油)である。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、油又は有機油の鎖長を減少させることにより安定化される。いくつかの実施形態では、油又は有機油の鎖長は、少なくとも1個の炭素原子、少なくとも2個の炭素原子、少なくとも3個の炭素原子、少なくとも4個の炭素原子、少なくとも5個の炭素原子、少なくとも6個の炭素原子、少なくとも7個の炭素原子、少なくとも8個の炭素原子、少なくとも9個の炭素原子、少なくとも10個の炭素原子、少なくとも11個の炭素原子、少なくとも12個の炭素原子、少なくとも13個の炭素原子、少なくとも14個の炭素原子、少なくとも15個の炭素原子、少なくとも16個の炭素原子、少なくとも17個の炭素原子、少なくとも18個の炭素原子、少なくとも19個の炭素原子、又は少なくとも20個の炭素原子が減少している。
いくつかの実施形態では、乳剤は、炭化水素によって安定化されたピカリング乳剤である。例えば、乳剤は、ヘキサデカン、ドデカン、デカン、オクタン、ヘプタン、及びヘキサンによって安定化してもよい。
いくつかの実施形態では、乳剤は、油又は有機油によって安定化されたピカリング乳剤である。例えば、乳剤は、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油などの有機油によって安定化してもよい。いくつかの実施形態では、乳剤は、Tween(例えば、Tween 20、Tween 21、Tween 40、Tween 60、Tween 61、Tween 65、Tween 80、Tween 81、Tween 85)、Triton X-100、Triton X-114、SPAN(例えば、SPAN 20、SPAN 40、SPAN 60、SPAN 65、SPAN 80、SPAN 85)、Arlacel(例えば、Arlacel(商標)P135)、Atlox(例えば、Atlox(商標)4912)、ABIL(例えば、ABIL(登録商標)EM 90)などの非イオン性乳化剤、界面活性剤(例えば、ABILをベースとした界面活性剤)、又はそれらの組み合わせと組み合わせた油又は有機油によって安定化される。
いくつかの実施形態では、乳剤は、油又は有機油によって安定化されたピカリング乳剤である。例えば、乳剤は、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油などの有機油によって安定化してもよい。いくつかの実施形態では、乳剤は、タンパク質安定剤(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、β-ラクトグロブリン、β-カゼイン(BCN))と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖(例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース)と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤、又は糖は、第2相(例えば、水相、有機相、又は液滴相)から第1相(例えば、油性相)への有機物の拡散を低減する。
いくつかの実施形態では、乳剤は、Tween(例えば、Tween 20、Tween 21、Tween 40、Tween 60、Tween 61、Tween 65、Tween 80、Tween 81、Tween 85)、Triton X-100、Triton X-114、SPAN(例えば、SPAN 20、SPAN 40、SPAN 60、SPAN 65、SPAN 80、SPAN 85)、Arlacel(例えば、Arlacel(商標)P135)、Atlox(例えば、Atlox(商標)4912)、ABIL(例えば、ABIL(登録商標)EM 90)などの非イオン性乳化剤、界面活性剤(例えば、ABILをベースとした界面活性剤)、又はそれらの組み合わせによって安定化されたピカリング乳剤である。
いくつかの実施形態では、乳剤は、タンパク質安定剤(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、β-ラクトグロブリン、β-カゼイン(BCN))で安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖(例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース)によって安定化される。いくつかの実施形態では、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤、又は糖は、第2相(例えば、水相、有機相、又は液滴相)から第1相(例えば、油性相)への有機物の拡散を低減する。
いくつかの実施形態では、乳剤は、固体粒子によって安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、固体粒子は無機又は有機粒子である。例えば、ピカリング乳剤は、シリカ、炭酸カルシウム、粘度、金粒子及びカーボンブラック粒子、有機ラテックス、デンプン、ハイドロゲルの粒子及びコポリマーの粒子によって安定化してもよい。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、タンパク質、細菌、及び胞子粒子によって安定化される。
いくつかの実施形態では、乳剤は、固体粒子によって安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、粒子は修飾シリカナノ粒子である。いくつかの実施形態では、修飾シリカナノ粒子は、部分的にフッ素化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、修飾シリカナノ粒子は、部分的に疎水性のナノ粒子である。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のシリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、2つの非混和性相間の界面に蓄積する。いくつかの実施形態では、第1相は連続相であり、第2相は分散相である。いくつかの実施形態では、本開示の乳剤は、フルオロカーボン相又は有機油などの油をベースとした第1相、及び第2相(例えば、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相)を含む。例えば、第1相は、少なくとも1種類のフッ素化溶媒を有するフルオロカーボン相であってもよく、第2相は、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相など、フッ素化溶媒と非混和性であってもよい。いくつかの実施形態では、第2相は水相である。いくつかの実施形態では、第2相は炭化水素相である。
いくつかの実施形態では、第1相は、少なくとも1種類のフッ素化溶媒を含むフルオラス(fluorous)相であり、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、フッ素化溶媒中に分散されている。
いくつかの実施形態では、第1相は、前記溶媒中に分散された部分的に疎水性のナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、第1相(すなわち、フルオラス相)は、CxFyFIzXmで表される少なくとも1種類のフルオロカーボンを含み、ここで、Xは任意の要素(N及びOを含むがこれらに限定されない)であってもよく、x、y、z、及びmは正の整数である。いくつかの実施形態では、第1相はフルオラス相であり、HFE-7500(C9H5OF15)、HFE-7600(C8H6OF12)、FC-40(C21F48N2)、パーフルオロヘキサン(C6F14)、及び/又はパーフルオロメチルデカリン(PFMD又はC11F20)をフッ素化溶剤として含む。フッ素化溶媒は特に限定されないが、異なる物理的特性を有する多様な範囲のフッ素化化合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、フッ素化溶媒は、HFE-7500及びHFE-7600などのハイドロフルオロエーテルなど、粘度が低い部分的にフッ素化された極性溶媒を含む。いくつかの実施形態では、フッ素化溶媒は、FC-40など、高粘度の過フッ素化極性溶媒を含む。一部の実施形態では、フッ素化溶媒は、C6F14など、低粘度の過フッ素化非極性溶媒を含む。いくつかの実施形態では、フッ素化溶媒は、PFMDなど、高粘度の過フッ素化非極性溶媒を含む。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、少なくとも1種類のフッ素化溶媒を含むフルオロカーボン相と、フッ素化溶媒に対して非混和性の流体を含む第2相とを含み、部分的にフッ素化されたナノ粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)が、フルオロカーボン相と第2相との界面に吸着する。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、第1相と、第1相に対して非混和性の流体を含む第2相とを含み、部分的に疎水性のナノ粒子(例えば、シリカをベースとした疎水性ナノ粒子)は、第1相と第2相との界面に吸着する。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、連続フルオロカーボン相と、連続フルオロカーボン相に分散された少なくとも1つの水相、有機相、炭化水素相、若しくは気相の液滴、又は少なくとも1つの気相の気泡を含む第2相とを含む。例えば、いくつかの実施形態では、乳剤は、連続フルオロカーボン相と水相とを含むか、連続フルオロカーボン相と有機相を含むか、連続フルオロカーボン相と炭化水素相とを含むか、又は連続フルオロカーボン相と気相とを含む。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、連続炭化水素相と、連続炭化水素相中に分散されたフルオロカーボン相の液滴の少なくとも1つとを含む。
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)は、フルオロカーボン相などの第1相と、水性流体若しくは有機流体であってもよい第2相又は炭化水素相との界面に吸着する。
いくつかの実施形態では、部分的に疎水性のナノ粒子(例えば、シリカをベースとした疎水性ナノ粒子)は、第1相と、水性流体若しくは有機流体であってもよい第2相、液滴、又は炭化水素相との界面に吸着する。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤はいくつかの方法で修飾可能である。例えば、ピカリング乳剤は、ポリエチレングリコール(PEG)などの親水性ポリマーを分散相に導入することで修飾可能であるが、F-SiO2ナノ粒子(NP)は連続相にあらかじめ分散されている。液滴が生成されると、F-SiO2 NPは水と油との界面に吸着し、親水性ポリマーは液滴内からF-SiO2 NPの表面に吸着する。例えば、PEGと吸着している部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、本明細書では「PEGads-F-SiO2NP」と称される。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーと共有結合でグラフトされた粒子は、連続相に分散させてもよい。例えば、PEGと共有結合でグラフトされた部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、本明細書では「PEGcovalent-F-SiO2NP」と称される。ピカリング乳剤のその他の修飾としては、親水性ポリマーを部分的にフッ素化された粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)上に共有結合でグラフトすることが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、部分的にフッ素化された粒子上に共有結合でグラフトされる。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーは、部分的にフッ素化された粒子に共有結合されていない。
本開示のいくつかの実施形態では、親水性ポリマーはPEGである。いくつかの実施形態では、親水性ポリマーとしては、高分子電解質、並びにホモポリマー(例えば、ポリエーテル、ポリアクリルアミド(PAM)、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(アクリル酸)、ポリメタクリレート及び他のアクリルポリマー、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP))及びブロックコポリマーなどの非イオン性ポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、連続フルオロカーボン相と、水相を含む第2相とを含む。いくつかの実施形態では、水相は、界面で部分的にフッ素化された粒子に吸着している少なくとも1種類の親水性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水相液滴は、PEGads-F-SiO2NP又はPEGcovalent-F-SiO2NPなど、界面で部分的にフッ素化されたナノ粒子に吸着している少なくとも1種類の親水性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、第2相(例えば、水相)は、約0.01mg/mL以上、約0.02mg/mL以上、約0.05mg/mL以上、約0.1mg/mL以上、約0.2mg/mL以上、約0.5mg/mL以上、約1mg/mL以上、約2mg/mL以上、約5mg/mL以上、又は約10mg/mL以上の親水性ポリマー(例えば、PEG)を含む。いくつかの実施形態では、水相は、タンパク質及び酵素の液滴界面への非特異的吸着を防止してそれらの活性を維持するための有効量の親水性ポリマー(例えば、PEG)を含む。
いくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤は、(a)連続フルオラス相、(b)連続フルオラス相に分散された水相、有機相、炭化水素相、若しくは気相の液滴、又は気泡の少なくとも1つ、及び(c)第1相(例えば、フルオラス相)の界面に吸着している部分的にフッ素化された粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)又は部分的に疎水性のシリカナノ粒子の少なくとも1種、及び水相、有機相、炭化水素相、若しくは気相を含み、前記シリカナノ粒子は部分的にフッ素化されているか部分的に疎水性である。
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化された粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)は、フルオラス相と水相、有機相、炭化水素相、又は気相との界面に吸着する前に、フルオラス相に最初に分散される。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化された粒子は、フルオラス相と水相又は有機相との界面に吸着する前に、水相、有機相、炭化水素相、又は気相に最初に分散される。
いくつかの実施形態では、第1相(例えば、水相)は、緩衝液、塩、栄養素、治療薬、薬剤、ホルモン、抗体、鎮痛剤、抗凝固剤、抗炎症化合物、抗菌組成物、サイトカイン、増殖因子、インターフェロン、脂質、オリゴヌクレオチド、ポリマー、多糖類、ポリペプチド、プロテアーゼ阻害剤、細胞、核酸、RNA、DNA、血管収縮剤若しくは血管拡張剤、ビタミン、ミネラル、又は安定剤などの追加成分を含む。いくつかの実施形態では、化学的及び/又は生物学的反応が水相中で行われる。
いくつかの実施形態では、乳剤(例えば、ピカリング乳剤)は、ナノ粒子などの粒子によって封入された液相を含む。いくつかの実施形態では、粒子は部分的にフッ素化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のナノ粒子である。いくつかの実施形態では、部分的に疎水性のナノ粒子は、シリカをベースとしたナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、本開示に記載されるナノ粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)及びそれらの組み合わせにより、液滴内部で実施可能なプロセスを妨げることなく、液滴の合体(coalescence)に対する安定化をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示に記載のフッ素化をベースとした油又は乳剤は、フルオロフォア(蛍光色素分子)及び蛍光性基質(例えば、レゾルフィン、フルオレセイン、レサズリン、4-メチルウンベリフェロンなど)の分散相から連続相への漏出を効果的に防止する。いくつかの実施形態では、本開示により、フルオロフォア及び蛍光性基質(例えば、レゾルフィン、フルオレセイン、レサズリン、4-メチルウンベリフェロンなど)の漏出を、漏出から1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、1日間、2日間、3日間、4日間、又は5日間、効果的に防止する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の乳剤は、マイクロフルイディクスによって作製される。例えば、本明細書に記載の乳剤は、ホモジナイザー又は振盪によって作製され得る。
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。いくつかの実施形態では、マイクロ流体制御は、マイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスによるものである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)は、マイクロ流体チャネル内に存在する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の少なくとも約50%(例えば、数又は重量による)、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子である。
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、ナノ粒子の表面に共有結合されたフッ素化基を含む。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、粒子の表面に結合されたフッ化アルキル基など、粒子の表面に結合されたフッ素化炭化水素基を含む。例えば、フッ素化炭化水素基としては、炭化水素基あたり1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個以上、又は13個以上のフッ素原子で置換されたC1-C20、C2-C20、C5-C20、C10-C20、C1-C15、C2-C15、C5-C15、C10-C15、C1-C10、C2-C10、C5-C10、及びC5-C8炭化水素基が挙げられる。他の種類のハロゲン化炭化水素基も粒子の表面に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、部分的にフッ素化又は過フッ素化されたアルキルシランの少なくとも1つで部分的に誘導体化されている。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、直鎖炭素鎖を含む部分的にフッ素化又は過フッ素化されたアルキルシランの少なくとも1つで部分的に誘導体化されている。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、表面上の1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチルトリエトキシシラン(FAS)で部分的に誘導体化されている。
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、フッ素化された基に加えて又はその代わりに、粒子の表面に共有結合された親水性基を含む。いくつかの実施形態では、両親媒性粒子は、粒子の表面に共有結合されたアミン基を含む。いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化されたシリカナノ粒子は、粒子の表面に共有結合されたその他の化学基を含み、その他の化学基としては-OH、-COOH、NH2、-CxHy、-SO3H、フルオレセインなどのフルオロフォア、ローダミン、ビオチンなどの巨大分子、ストレプトアビジン、及びポリエチレングリコール(PEG)が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、部分的にフッ素化された又は部分的に疎水性のシリカナノ粒子に加えて、機能化可能な表面を有し、両親媒性となり得るその他の粒子も、本明細書に開示される技術の実施形態と互換性がある。例えば、そのような粒子には、貴金属、半導体、又は有機ポリマーから作製されたものが含まれる。シリカは用途が広い表面機能性を有し、経済的で生体適合性があり、光学的に不活性であるため、1つの好ましい選択肢である。
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、限定されないが、CRISPR/Cas法、多重自動ゲノム工学法(MAGE)などのゲノム多様化技術を使って、又はプラスミドをベースとした産生の変動(例えば、酵素ホモログの生物資源調査、プロモーター変動など)、非GMO法、若しくはこれらに限定されないが、化学的変異誘発、放射線、及び転位(transposition)など、産生の多様性をもたらすその他のメカニズムによって生成される。その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2015/017866号及び国際公開第2008/052101号を参照。
いくつかの実施形態では、改変産生株ライブラリーは、プラスミド上又はゲノムに組み込まれたものなど、少なくとも1つの改変センサー系で形質転換される。
いくつかの実施形態では、ライブラリーからの改変産生株のプールは、増殖培地、及びアラビノース、アンヒドロテトラサイクリン、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド、熱、光、又は表1(標的分子の特性)に記載の化合物を含むがこれらに限定されない任意の必要な誘導剤を含む液滴中に乳化されている。いくつかの実施形態では、乳化された株が増殖し、所望の産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの株のための産物が蓄積される。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約1~24時間、約4~20時間、約8~16時間、又は約10~14時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約24~72時間、約28~68時間、約32~64時間、約36~60時間、約40~56時間、又は約44~52時間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14日間である。いくつかの実施形態では、前記一定期間は約1週間又は約2週間である。
いくつかの実施形態では、液滴中の改変センサー細胞の増殖は、共封入された改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルに依存する。例として、いくつかの実施形態では、改変センサーは、増殖に必要な重要なタンパク質の発現を制御する。これにより、産生細胞が標的分子を作成する期間を有する前にセンサー細胞が産生栄養素を利用することが防げられることとなる。
いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、センサー細胞が産生に必要な栄養素を消費することを防げるために、改変産生細胞とは別の炭素源を利用するように改変されている。
いくつかの実施形態では、改変センサー細胞は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。限定ではなく例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、GFPである。
いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、産生株ライブラリーが生成される前又は後で、プラスミド上又はゲノム内に存在するレポーターを産生するセンサー系で形質転換されている。いくつかの実施形態では、液滴は、他の化学物質による誘導を伴って、又は伴わずに、本明細書に記載の一定期間後に破壊され、産生細胞はFACSでソートされ、所望の標的分子のより高産生体が分離又は濃縮される。
いくつかの実施形態では、液滴は、専用の液滴選別機器を使って、又は第2のバルク水乳剤を形成し、次いでFACSで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。液滴が選別されると、液滴は破壊され、濃縮された改変産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。別の実施形態では、産生細胞のプラスミドは配列決定される(例えば、プラスミドをベースとした経路を生物資源調査する場合)。
いくつかの実施形態において、改変産生細胞を含む液滴は、レポーターを産生するセンサー系(例えば、細胞をベースとしたセンサー系又はインビトロセンサー系)を含む液滴の第2のセットと融合される。
いくつかの実施形態では、レポーターは、改変産生細胞によって産生される産物の量に比例して産生され、融合された液滴は、レポーターレベルについてアッセイされる。いくつかの実施形態では、融合された液滴は、レポーターの発現レベルによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、第2のバルク水乳剤を形成し、次いでFACSで二重乳剤を選別することによって選別される。いくつかの実施形態では、融合された液滴は、専用の液滴選別機器を使用することによって選別される。いくつかの実施形態では、液滴が選別された後、液滴は破壊され、濃縮された産生細胞が放出される。いくつかの実施形態では、選別された液滴からの改変産生細胞のゲノムは、次世代シーケンシングに供される。いくつかの実施形態では、液滴は、産生される産物のレベルに従って選別される。いくつかの実施形態では、液滴は、封入された改変産生細胞によって産生される産物の所望のレベルに従って選別される。
いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約1μg/L~100μg/L、約10μg/L~90μg/L、約20μg/L~80μg/L、約30μg/L~70μg/L、約40μg/L~60μg/L、又は約45μg/L~55μg/Lである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約100μg/L~1000μg/L、約200μg/L~900μg/L、約300μg/L~800μg/L、約400μg/L~700μg/L、又は約500μg/L~600μg/Lである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約1g/L~200g/L、約20g/L~180g/L、約40g/L~160g/L、約60g/L~140g/L、約80g/L~120g/L、又は約90g/L~100g/Lである。いくつかの実施形態では、封入された改変産生細胞によって産生される産物の望ましいレベルは、約100g/L~500g/L、約150g/L~450g/L、約200g/L~400g/L、又は約250g/L~350g/Lである。
いくつかの実施形態では、乳化された株は、レポーターを使用して産物レベルの直接的読み取りを提供する改変センサー系を使用して応答を生成する。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約1μg/L~100μg/L、約10μg/L~90μg/L、約20μg/L~80μg/L、約30μg/L~70μg/L、約40μg/L~60μg/L、又は約45μg/L~55μg/Lである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約100μg/L~1000μg/L、約200μg/L~900μg/L、約300μg/L~800μg/L、約400μg/L~700μg/L、又は約500μg/L~600μg/Lである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約1g/L~200g/L、約20g/L~180g/L、約40g/L~160g/L、約60g/L~140g/L、約80g/L~120g/L、又は約90g/L~100g/Lである。いくつかの実施形態では、産物レベルの直接的な読み取りは、約100g/L~500g/L、約150g/L~450g/L、約200g/L~400g/L、又は約250g/L~350g/Lである。
限定する目的ではないが例として、いくつかの実施形態では、レポーターは、GFP、又は以下で説明するその他の例示的なレポーター系である。いくつかの実施形態では、液滴は破壊され、細胞は、FACSのような適切な選別技術を使用して選別される。
いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、産生される産物の量に正比例して抗毒素を産生し、改変産生細胞を含む液滴は、産生段階後に一定量の毒素を有する液滴と別々に融合される。いくつかの実施形態では、所望のレベルの産物を産生した改変産生細胞は、第2の乳化において生存するために十分な抗毒素を産生したと考えられる。いくつかの実施形態では、短時間のインキュベーションの後、融合された液滴は破壊され、濃縮された生存可能な改変産生細胞集団が回収される。
いくつかの実施形態では、産生株の増殖又は生存能は、産生される産物の量に直接的に依存し比例する。非限定的な例として、一実施形態では、改変産生株ライブラリーが生成され、改変センサープラスミドで形質転換され、形質転換された改変産生株のプールは、増殖培地及び任意の必要な誘導剤を含む液滴に乳化され、前記形質転換された改変産生細胞が増殖し、産物の産生が一定期間起こり、その結果、標的分子を産生可能なそれらの細胞のための産物が蓄積され、前記形質転換された改変産生細胞は、高率で増殖するか、又は毒素を相殺する物質を産生することによって産物の蓄積に応答し、次いで、増殖し生存可能な形質転換された改変産生細胞は、前記改変産生細胞の濃縮された集団を形成する液滴から放出される。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、前記改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、及び各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むことであって、各液滴は、(a)フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び(b)改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記改変産生細胞は、所望の標的分子のための改変タンパク質をベースとしたセンサーと、前記タンパク質センサーによって活性化又は抑制されるレポーターとを含むこと、及び各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記融合された液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーは、前記改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合した液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞を含む液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、改変産生細胞の集団を形成することであって、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
いくつかの実施形態では、前記回収は、(a)前記液滴を破壊すること、(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態では、前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による。
いくつかの実施形態では、前記回収は、(a)前記液滴を選別すること、(b)前記選別された液滴を破壊すること、及び(c)増殖培地で前記破壊された液滴をプレーティングすることを含む。いくつかの実施形態では、前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による。
いくつかの実施形態では、前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている。
いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである。いくつかの実施形態では、前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている。いくつかの実施形態では、前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている。
いくつかの実施形態では、前記方法が、改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される。いくつかの実施形態では、前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換する前に作製される。いくつかの実施形態では、前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換した後に作製される。
いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている。
一態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、(a)フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び(b)改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
別の態様では、本発明は、遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースのセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であることを含む、改変産生細胞の集団を作製する方法に関する。
いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている。いくつかの実施形態では、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている。
改変センサー株/細胞
前述の改変センサー株(又は細胞)は、少なくとも1種類の改変タンパク質センサーを発現するように形質転換された株又は細胞(例えば、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、又は哺乳動物(ヒト又は非ヒト)の株又は細胞)を指す。本明細書で使用される場合、「改変タンパク質センサー」は、標的に結合し、標的の検出を可能にするアロステリックタンパク質(例えば、センサー)を指し、前記アロステリックタンパク質は修飾されている。いくつかの実施形態では、アロステリックタンパク質は、1又は複数の変異によって修飾されている。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは非転写因子(non-TF)センサーである。
前述の改変センサー株(又は細胞)は、少なくとも1種類の改変タンパク質センサーを発現するように形質転換された株又は細胞(例えば、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、又は哺乳動物(ヒト又は非ヒト)の株又は細胞)を指す。本明細書で使用される場合、「改変タンパク質センサー」は、標的に結合し、標的の検出を可能にするアロステリックタンパク質(例えば、センサー)を指し、前記アロステリックタンパク質は修飾されている。いくつかの実施形態では、アロステリックタンパク質は、1又は複数の変異によって修飾されている。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは非転写因子(non-TF)センサーである。
いくつかの実施形態では、株(又は細胞)は、改変タンパク質センサーをコードするプラスミド(例えば、改変センサープラスミド)によって形質転換される。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、転写因子である。いくつかの実施形態では、前記転写因子は、アロステリック転写因子(aTF)である。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、細胞又は無細胞で標的分子の検出を可能にする。
改変タンパク質センサーを設計及び作成する方法は、その内容全体が参照により援用される、PCT/US2017/047009号及びPCT/US2017/047012号、並びに国際公開第2015/127242号及び国際公開第2016/168182号に記載されている。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーはaTF、例えば真核生物のaTFである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーのメンバーなどの原核生物の転写調節因子ファミリーを改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、AbrB、AlpA、AraC、ArgR、ArsR、AsnC、BetR、Bhl、CitT、CodY、ComK、Crl、Crp、CsoR、CtsR、DeoR、DnaA、DtxR、Ecf、FaeA、Fe_dep_repress、FeoC、Fis、FlhC、FlhD、Fur、GntR、GutM、Hns、HrcA、HxIR、IcIR、KorB、LacI、LexA、Lsr2、LuxR、LysR、LytTR、MarR、MerR、MetJ、Mga、Mor、MtIR、NarL、NtrC、OmpR、PadR、Prd、PrrA、PucR、PuR、Rok、Ros_MucR、RpiR、RpoD、RpoN、Rrf2、RtcR、Sarp、SfsA、SinR、SorC、SpoOA、TetR、TrmB、TrpR、WhiB、Xre、YcbB、及びYesNファミリーのメンバーなどの原核生物の転写調節因子ファミリーを改変したものである。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサーは、AcrR、ActlI、AmeR AmrR、ArpR、BpeR、EnvR E、EthR、HydR、IfeR、LanK、LfrR、LmrA、MtrR、Pip、PqrA、QacR、RifQ、RmrR、SimReg、SmeT、SrpR、TcmR、TetR、TtgR、TtgW、UrdK、VarR、YdeS、ArpA、Aur1B、BarA、CalR1、CprB、FarA、JadR、JadR2、MphB、NonG、PhlF、TylQ、VanT、TarA、TyIP、BM1P1、Bm1P1、Bm3R1、ButR、CampR、CamR、CymR、DhaR、KstR、LexA-like、AcnR、PaaR、PsbI、ThlR、UidR、YDH1、BetI、McbR、MphR、PhaD、Q9ZF45、TtK、Yhgd又はYixD、CasR、IcaR、LitR、LuxR、LuxT、OpaR、Orf2、SmcR、HapR、Ef0113、HlyllR、BarB、ScbR、MmfR、AmtR、PsrA、及びYjdCなどのTetRファミリーの受容体のメンバーを改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、リガンド及びDNAの両方に直接結合するか、又はタンパク質カスケードを介して機能する、2成分系又はハイブリッド2成分系を改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは真核生物のaTFである。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、RovM(Yersinia pseudotuberculosis)、HcaR(Acinetobacter)、BlcR(Agrobacterium tumefaciens)、HetR(Anabaena spp.)、HetR(Anabaena spp.)、DesR(B.subtilis)、HylllR(Bacillus cereus)、PlcR(Bacillus cereus)、CcpA(Bacillus megaterium)、YvoA(Bacillus subtilis)、AhrR(Bacillus subtilis)、MntR(Bacillus subtilis)、GabR(Bacillus subtilis)、SinR(Bacillus subtilis)、CggR(Bacillus subtilis)、FapR(Bacillus subtilis)、OhrR(Bacillus subtilis)、PurR(Bacillus subtilis)、Rrf2(Bacillus subtilis)、BmrR(Bacillus subtilis)、CcpNリプレッサー(Bacillus
subtilis)、TreR(Bacillus subtilis)、CodY(Bacillus subtilis)、yfiR(Bacillus subtilis)、OhrR(Bacillus subtilis)、Rex(Bacillus subtilis、Thermus thermophilus、Thermus aquaticus)、NprR(Bacillus thuringiensis)、BtAraR(Bacteriodes thetaiotaomicron)、AraR(Bacteroides thetaiotaomicron VPI)、DntR(Burkholderia cepacia)、CmeR(Camplylobacter
jejuni)、CviR(Chromobacterium violaceum)、TsaR(Comamonas testosteroni)、CGL2612(Corynebacterium glatamicum)、ClgR(Corynebacterium glutamicum)、LldR(CGL2915)(Corynebacterium glutamicum)、NtcA(Cyanobacterium
Anabaena)、HucR(Deinococcus radiodurans)、LacI(E.coli)、PrgX(Enterococcus faecalis)、NikR(Helobacter pylon)、LmrR(Lactococcus lactis)、CcpA(Lactococcus lactis)、MtbCRP(Mycobacterium tuberculosis)、EthR(Mycobacterium tuberculosis)、MosR(Mycobacterium tuberculosis)、PhoP(Mycobacterium tuberculosis)、Rv1846c(Mycobacterium tuberculosis)、EthR(Mycobacterium tuberculosis)、LysR(Neisseria meningitdis)、NMB0573/AsnC(Neisseria meningitidis)、TetR-クラスFI(Pasteurella multocida)、MexR(Pseudomonas aeruginosa)、DNR(Pseudomonas aeruginosa)、PA01(Pseudomonas aeruginosa)、PA2196(Pseudomonas aeruginosa)、ttgR(Pseudomonas putida)、Cra(Pseudomonas putida)、QscR(Psudemonas aeruginosa)、ActR(S.coelicolor)、SC00520(S.coelicolor)、CprB(S.coelicolor)、SlyA(Salmonella enterica SlyA)、FapR(Staphylococcus aureus)、OacR(Staphylococcus aureus)、SarZ(Staphylococcus aureus)、IcaR(Staphylococcus aureus)、LcaR(Staphylococcus epidermidis)、SMET(Stenotrophomonas maltophilia)、PcaV(SCO6704)(Streptomyces coelicolor)、SC04008(Streptomyces coelicolor)、NdgR(Streptomyces coelicolor)、CprB(Streptomyces coelicolor)、SCO0253(Streptomyces coelicolor)、TetRファミリー(Streptomyces coelicolor)、SC00520(Streptomyces coelicolor)、SC04942(Streptomyces coelicolor)、SC04313(Streptomyces coelicolor)、TetRファミリー(Streptomyces coelicolor)、SC07222(Streptomyces coelicolor)、SCO3205(Streptomyces coelicolor)、SCO3201(Streptomyces coelicolor)、ST1710(Sulfolobus tokodaii ST1710)、HrcA(Thermotoga maritima)、TM1030(Thermotoga maritima)、tm 1171(thermotoga maritima)、IclR(thermotoga maritima)、CarH(Thermus thermophilus)、FadR(Vibrio cholerae)、SmcR(Vibrio vulnificus)、及びRovA(Yersinia pestis)を改変したものである。
subtilis)、TreR(Bacillus subtilis)、CodY(Bacillus subtilis)、yfiR(Bacillus subtilis)、OhrR(Bacillus subtilis)、Rex(Bacillus subtilis、Thermus thermophilus、Thermus aquaticus)、NprR(Bacillus thuringiensis)、BtAraR(Bacteriodes thetaiotaomicron)、AraR(Bacteroides thetaiotaomicron VPI)、DntR(Burkholderia cepacia)、CmeR(Camplylobacter
jejuni)、CviR(Chromobacterium violaceum)、TsaR(Comamonas testosteroni)、CGL2612(Corynebacterium glatamicum)、ClgR(Corynebacterium glutamicum)、LldR(CGL2915)(Corynebacterium glutamicum)、NtcA(Cyanobacterium
Anabaena)、HucR(Deinococcus radiodurans)、LacI(E.coli)、PrgX(Enterococcus faecalis)、NikR(Helobacter pylon)、LmrR(Lactococcus lactis)、CcpA(Lactococcus lactis)、MtbCRP(Mycobacterium tuberculosis)、EthR(Mycobacterium tuberculosis)、MosR(Mycobacterium tuberculosis)、PhoP(Mycobacterium tuberculosis)、Rv1846c(Mycobacterium tuberculosis)、EthR(Mycobacterium tuberculosis)、LysR(Neisseria meningitdis)、NMB0573/AsnC(Neisseria meningitidis)、TetR-クラスFI(Pasteurella multocida)、MexR(Pseudomonas aeruginosa)、DNR(Pseudomonas aeruginosa)、PA01(Pseudomonas aeruginosa)、PA2196(Pseudomonas aeruginosa)、ttgR(Pseudomonas putida)、Cra(Pseudomonas putida)、QscR(Psudemonas aeruginosa)、ActR(S.coelicolor)、SC00520(S.coelicolor)、CprB(S.coelicolor)、SlyA(Salmonella enterica SlyA)、FapR(Staphylococcus aureus)、OacR(Staphylococcus aureus)、SarZ(Staphylococcus aureus)、IcaR(Staphylococcus aureus)、LcaR(Staphylococcus epidermidis)、SMET(Stenotrophomonas maltophilia)、PcaV(SCO6704)(Streptomyces coelicolor)、SC04008(Streptomyces coelicolor)、NdgR(Streptomyces coelicolor)、CprB(Streptomyces coelicolor)、SCO0253(Streptomyces coelicolor)、TetRファミリー(Streptomyces coelicolor)、SC00520(Streptomyces coelicolor)、SC04942(Streptomyces coelicolor)、SC04313(Streptomyces coelicolor)、TetRファミリー(Streptomyces coelicolor)、SC07222(Streptomyces coelicolor)、SCO3205(Streptomyces coelicolor)、SCO3201(Streptomyces coelicolor)、ST1710(Sulfolobus tokodaii ST1710)、HrcA(Thermotoga maritima)、TM1030(Thermotoga maritima)、tm 1171(thermotoga maritima)、IclR(thermotoga maritima)、CarH(Thermus thermophilus)、FadR(Vibrio cholerae)、SmcR(Vibrio vulnificus)、及びRovA(Yersinia pestis)を改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、MphR、AlkS、AlkR、CdaR、BenM、RUNX1、MarR、AphA、Pex、CatM、AtzR、CatR、ClcR、CbbR、CysB、CbnR、OxyR、OccR、及びCrgAを改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ArcA、AtoC、BaeR、BasR、CitB、CpxR、CreB、CusR、DcuR、DpiA、EvgA、KdpE、NarL、NarP、OmpR、PhoB、PhoP、QseB、RcsB、RstA、TorR、UhpA、UvrY、YedW、YehT、YfhK、YgiX、YpdB、ZraR、RssB、AgaR、AMR(ybbU)、ArsR、AscG、BetI、BglJ、CadC、CaiF、CelD、CueR、CynR、ExuR、FecR、FucR、Fur、GatR、GutM、GutR(SrlR)、ModE、MtlR、NagC、NanR(yhcK)、NhaR、PhnF、PutA、RbsR、RhaR、RhaS、RpiR(AlsR)、SdiA、UidR、XapR、XylR、ZntR、AllS(ybbS)、Arac、ArgR、AsnC、CysB、CytR、DsdC、GalR、GalS、GcvA、GcvR、GlcC、GlpR、GntR、IdnR、LctR、Lrp、LysR、MelR、MhpR、TdcA、TdcR、TetR、TreR、TrpR、及びTyrRなどの大腸菌(E.coli)TFを改変したものである。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、AP2、C2H2、Dof、GATA、HD-ZIP、M-type、NF-YA、S1Fa-like、TCP、YABBY、ARF、C3H、E2F/DP、GRAS、HRT-like、MIKC、NF-YB、SAP、Trihelix、ZF-HD、ARR-B、CAMTA、EIL、GRF、HSF、MYB、NF-YC、SBP、VOZ、bHLH、B3、CO-like、ERF、GeBP、LBD、MYB_related、NZZ/SPL、SRS、WOX、bZIP、BBR-BPC、CPP、FAR1、HB-PHD、LFY、NAC、Nin-like、STAT、WRKY、BES1、DBB、G2-like、HB-other、LSD、NF-X1、RAV、TALE、及びWhirlyファミリーのメンバーなどの植物転写調節因子ファミリーを改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、Abf1p、Abf2p、Aca1p、Ace2p、Adr1p、Aft1p、Aft2p、Arg80p、Arg81p、Aro80p、Arr1p、Asg1p、Ash1p、Azf1p、Bas1p、Cad1p、Cat8p、Cbf1p、Cep3p、Cha4p、Cin5p、Crz1p、Cst6p、Cup2p、Cup9p、Dal80p、Dal81p、Dal82p、Dot6p、Ecm22p、Ecm23p、Eds1p、Ert1p、Fhl1p、Fkh1p、Fkh2p、Flo8p、Fzf1p、Gal4p、Gat1p、Gat3p、Gat4p、Gcn4p、Gcr1p、Gis1p、Gln3p、Gsm1p、Gzf3p、Haa1p、Hac1p、Hal9p、Hap1p、Hap2p、Hap3p、Hap4p、Hap5p、Hcm1p、Hmlalpha2p、Hmra2p、Hsf1p、Ime1p、lno2p、lno4p、Ixr1p、Kar4p、Leu3p、Lys14p、Mac1p、Mal63p、Matalpha2p、Mbp1p、Mcm1p、Met31p、Met32p、Met4p、Mga1p、Mig1p、Mig2p、Mig3p、Mot2p、Mot3p、Msn1p、Msn2p、Msn4p、Mss11p、Ndt80p、Nhpl0p、Nhp6ap、Nhp6bp、Nrg1p、Nrg2p、Oaf1p、Pdr1p、Pdr3p、Pdr8p、Phd1p、Pho2p、Pho4p、Pip2p、Ppr1p、Put3p、Rap1p、Rdr1p、Rds1p、Rds2p、Reb1p、Rei1p、Rfx1p、Rgm1p、Rgt1p、Rim101p、Rlm1p、Rme1p、Rox1p、Rph1p、Rpn4p、Rsc30p、Rsc3p、Rsf2p、Rtg1p、Rtg3p、Sfl1p、Sfp1p、Sip4p、Skn7p、Sko1p、Smp1p、Sok2p、Spt15p、Srd1p、Stb3p、Stb4p、Stb5p、Ste12p、Stp1p、Stp2p、Stp3p、Stp4p、Sum1p、Sut1p、Sut2p、Swi4p、Swi5p、Tbf1p、Tbs1p、Tea1p、Tec1p、Tod6p、Tos8p、Tye7p、Uga3p、Ume6p、Upc2p、Urc2p、Usv1p、Vhr1p、War1p、Xbp1p、YER064C、YER130C、YER184C、YGR067C、YKL222C、YLL054C、YLR278C、YML081W、YNR063W、YPR013C、YPR015C、YPR022C、YPR196W、Yap1p、Yap3p、Yap5p、Yap6p、Yap7p、Yox1p、Yrm1p、Yrr1p、及びZap1pなどの酵母TFを改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、ada-2、aha-1、ahr-1、alr-1、ast-1、atf-2、atf-5、atf-6、atf-7、athp-1、blmp-1、bra-2、brc-1、cbp-1、ccr-4、cdk-9、ced-6、ceh-1、ceh-10、ceh-12、ceh-13、ceh-14、ceh-16、ceh-17、ceh-18、ceh-19、ceh-2、ceh-20、ceh-21、ceh-22、ceh-23、ceh-24、ceh-26、ceh-27、ceh-28、ceh-30、ceh-31、ceh-32、ceh-33、ceh-34、ceh-36、ceh-37、ceh-38、ceh-39、ceh-40、ceh-41、ceh-43、ceh-44、ceh-45、ceh-48、ceh-49、ceh-5、ceh-6、ceh-60、ceh-7、ceh-8、ceh-9、cep-1、ces-1、ces-2、cey-1、cey-2、cey-3、cey-4、cfi-1、chd-3、cky-1、cnd-1、cog-1、crh-1、daf-12、daf-14、daf-16、daf-19、daf-3、daf-8、dcp-66、die-1、dlx-1、dmd-3、dmd-4、dmd-5、dmd-6、dnj-11、dpl-1、dpr-1、dpy-20、dpy-22、dpy-26、dro-1、dsc-1、efl-1、efl-2、egl-13、egl-18、egl-27、egl-38、egl-43、egl-44、egl-46、egl-5、ekl-2、ekl-4、elc-1、elt-1、elt-2、elt-3、elt-4、elt-6、elt-7、end-1、end-3、eor-1、ets-4、ets-5、eya-1、fax-1、fkh-10、fkh-2、fkh-3、fkh-4、fkh-5、fkh-6、fkh-7、fkh-8、fkh-9、flt-1、fos-1、fozi-1、gei-11、gei-13、gei-3、gei-8、gfl-1、gla-3、ham-2、hbl-1、hif-1、hlh-1、hlh-10、hlh-11、hlh-12、hlh-13、hlh-14、hlh-15、hlh-16、hlh-17、hlh-19、hlh-2、hlh-25、hlh-26、hlh-27、hlh-28、hlh-29、hlh-3、hlh-30、hlh-4、hlh-6、hlh-8、hmg-1.1、hmg-1.2、hmg-1.2、hmg-11、hmg-12、hmg-3、hmg-4、hmg-5、hnd-1、hsf-1、irx-1、lag-1、let-381、let-418、lfi-1、lim-4、lim-6、lim-7、lin-1、lin-11、lin-22、lin-26、lin-28、lin-31、lin-32、lin-35、lin-39、lin-40、lin-41、lin-48、lin-49、lin-54、lin-59、lin-61、lir-1、lpd-2、lsl-1、lss-4、lst-3、mab-23、mab-3、mab-5、mab-9、mbf-1、mbr-1、mbr-1、mdl-1、mec-3、med-1、med-2、mef-2、mes-2、mes-4、mes-6、mex-1、mex-5、mex-6、mgl-2、mls-1、mls-2、mml-1、mua-1、mxl-1、mxl-2、mxl-3、nfi-1、ngn-1、nhr-1、nhr-10、nhr-100、nhr-101、nhr-102、nhr-103、nhr-104、nhr-105、nhr-106、nhr-107、nhr-108、nhr-109、nhr-11、nhr-110、nhr-111、nhr-112、nhr-113、nhr-114、nhr-115、nhr-116、nhr-117、nhr-118、nhr-119、nhr-12、nhr-120、nhr-121、nhr-122、nhr-123、nhr-124、nhr-125、nhr-126、nhr-127、nhr-128、nhr-129、nhr-13、nhr-130、nhr-131、nhr-132、nhr-133、nhr-134、nhr-135、nhr-136、nhr-137、nhr-138、nhr-139、nhr-14、nhr-140、nhr-141、nhr-142、nhr-143、nhr-145、nhr-146、nhr-147、nhr-148、nhr-149、nhr-15、nhr-150、nhr-152、nhr-153、nhr-154、nhr-155、nhr-156、nhr-157、nhr-158、nhr-159、nhr-16、nhr-161、nhr-162、nhr-163、nhr-164、nhr-165、nhr-166、nhr-167、nhr-168、nhr-169、nhr-17、nhr-170、nhr-171、nhr-172、nhr-173、nhr-174、nhr-175、nhr-176、nhr-177、nhr-178、nhr-179、nhr-18、nhr-180、nhr-181、nhr-182、nhr-183、nhr-184、nhr-185、nhr-186、nhr-187、nhr-188、nhr-189、nhr-19、nhr-190、nhr-191、nhr-192、nhr-193、nhr-194、nhr-195、nhr-196、nhr-197、nhr-198、nhr-199、nhr-2、nhr-20、nhr-201、nhr-202、nhr-203、nhr-204、nhr-205、nhr-206、nhr-207、nhr-208、nhr-209、nhr-21、nhr-210、nhr-211、nhr-212、nhr-213、nhr-214、nhr-215、nhr-216、nhr-217、nhr-218、nhr-219、nhr-22、nhr-220、nhr-221、nhr-222、nhr-223、nhr-225、nhr-226、nhr-227、nhr-228、nhr-229、nhr-23、nhr-230、nhr-231、nhr-232、nhr-233、nhr-234、nhr-237、nhr-238、nhr-239、nhr-241、nhr-242、nhr-243、nhr-244、nhr-245、nhr-246、nhr-247、nhr-248、nhr-249、nhr-25、nhr-250、nhr-251、nhr-252、nhr-253、nhr-254、nhr-255、nhr-256、nhr-257、nhr-258、nhr-26、nhr-260、nhr-261、nhr-262、nhr-263、nhr-264、nhr-265、nhr-266、nhr-267、nhr-268、nhr-269、nhr-27、nhr-270、nhr-271、nhr-272、nhr-273、nhr-274、nhr-275、nhr-276、nhr-277、nhr-278、nhr-28、nhr-280、nhr-281、nhr-282、nhr-283、nhr-285、nhr-286、nhr-288、nhr-3、nhr-30、nhr-31、nhr-32、nhr-33、nhr-34、nhr-35、nhr-36、nhr-37、nhr-38、nhr-39、nhr-4、nhr-40、nhr-41、nhr-42、nhr-43、nhr-44、nhr-45、nhr-46、nhr-47、nhr-47、nhr-48、nhr-49、nhr-5、nhr-50、nhr-51、nhr-52、nhr-53、nhr-54、nhr-55、nhr-56、nhr-57、nhr-58、nhr-59、nhr-6、nhr-60、nhr-61、nhr-62、nhr-63、nhr-64、nhr-65、nhr-66、nhr-67、nhr-68、nhr-69、nhr-7、nhr-70、nhr-71、nhr-72、nhr-73、nhr-74、nhr-75、nhr-76、nhr-77、nhr-78、nhr-79、nhr-8、nhr-80、nhr-81、nhr-82、nhr-83、nhr-84、nhr-85、nhr-86、nhr-87、nhr-88、nhr-89、nhr-9、nhr-90、nhr-91、nhr-92、nhr-94、nhr-95、nhr-96、nhr-97、nhr-98、nhr-99、nob-1、ntl-2、ntl-3、nurf-1、odr-7、oma-1、oma-2、pag-3、pal-1、pax-1、pax-3、peb-1、pes-1、pha-1、pha-2、pha-4、php-3、pie-1、pop-1、pos-1、pqn-47、pqn-75、psa-1、rabx-5、rbr-2、ref-1、rnt-1、sbp-1、sdc-1、sdc-2、sdc-3、sea-1、sem-4、sex-1、skn-1、sknr-1、sma-2、sma-3、sma-4、smk-1、sop-2、sox-1、sox-2、sox-3、spr-1、sptf-2、sptf-3、srab-2、srt-58、srw-49、sta-1、tab-1、taf-4、taf-5、tag-153、tag-182、tag-185、tag-192、tag-295、tag-331、tag-347、tag-350、tag-68、tag-97、tbx-11、tbx-2、tbx-30、tbx-31、tbx-32、tbx-33、tbx-34、tbx-35、tbx-36、tbx-37、tbx-38、tbx-39、tbx-40、tbx-41、tbx-7、tbx-8、tbx-9、tra-1、tra-4、ttx-1、ttx-3、unc-120、unc-130、unc-3、unc-30、unc-37、unc-39、unc-4、unc-42、unc-55、unc-62、unc-86、vab-15、vab-3、vab-7、xbp-1、zag-1、zfp-1、zim-1、zip-1、zip-2、zip-3、zip-4、zip-5、及びztf-7などの線虫TFを改変したものである。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、例えば、APE_0290.1、APE_0293、APE_0880b、APE_1602a、APE_2413、APE_2505、APE_0656a、APE_1799a、APE_1458a、APE_1495a、APE_2570.1、APE_0416b.1、APE_0883a、APE_0535、APE_0142、APE_2021.1、APE_0060.1、APE_0197.1、APE_0778、APE_2011.1、APE_0168.1、APE_2517.1、APE_0288、APE_0002、APE_1360.1、APE_2091.1、APE_0454、APE_1862.1、APE_0669.1、APE_2443.1、APE_0787.1、APE_2004.1、APE_0025.1、APE_0153.1、AF0653、AF1264、AF1270、AF1544、AF1743、AF1807、AF1853、AF2008、AF2136、AF2404、AF0529、AF0114、AF0396、AF1298、AF1564、AF1697、AF1869、AF2271、AF1404、AF1148、AF0474、AF0584、AF1723、AF1622、AF1448、AF0439、AF1493、AF0337、AF0743、AF0365、AF1591、AF0128、AF0005、AF1745、AF0569、AF2106、AF1785、AF1984、AF2395、AF2232、AF0805、AF1429、AF0111、AF1627、AF1787、AF1793、AF1977、AF2118、AF2414、AF0643、AF1022、AF1121、AF2127、AF0139、AF0363、AF0998、AF1596、AF0673、AF2227、AF1542、AF2203、AF1459、AF1968、AF1516、AF0373、AF1817、AF1299、AF0757、AF0213、AF1009、AF1232、AF0026、AF1662、AF1846、AF2143、AF0674、Cmaq_0146、Cmaq_0924、Cmaq_1273、Cmaq_1369、Cmaq_1488、Cmaq_1508、Cmaq_1561、Cmaq_1699、Cmaq_0215、Cmaq_1704、Cmaq_1956、Cmaq_0058、Cmaq_1637、Cmaq_0227、Cmaq_0287、Cmaq_1606、Cmaq_1720、Cmaq_0112、Cmaq_1149、Cmaq_1687、Cmaq_0411、Cmaq_1925、Cmaq_0078、Cmaq_0314、Cmaq_0768、Cmaq_1206、Cmaq_0480、Cmaq_0797、Cmaq_1388、Cmaq_0152、Cmaq_0601、Cmaq_1188、Mboo_0375、Mboo_0423、Mboo_0749、Mboo_1012、Mboo_1134、Mboo_1154、Mboo_1189、Mboo_1266、Mboo_1711、Mboo_1971、Mboo_0002、Mboo_0956、Mboo_1071、Mboo_1405、Mboo_1643、Mboo_0973、Mboo_1170、Mboo_0158、Mboo_0195、Mboo_0277、Mboo_1462、Mboo_1574、Mboo_1649、Mboo_2112、Mboo_0013、Mboo_0386、Mboo_0946、Mboo_0977、Mboo_1081、Mboo_2241、Mboo_0142、Mboo_0396、Mboo_0409、Mboo_0976、Mboo_2244、Mboo_0526、Mboo_0346、Mboo_1018、Mboo_0917、Mboo_0323、Mboo_0916、Mboo_1680、Mboo_1288、Mboo_2311、Mboo_2048、Mboo_1027、Mboo_2312、rrnAC0161、rrnAC0578、rrnAC0961、rrnAC3494、rrnB0118、pNG7045、pNG6160、rrnAC0867、rrnAC2723、rrnAC3399、rrnAC3447、rrnB0052、rrnAC1653、rrnAC2779、pNG7038、rrnAC1252、rrnAC3288、rrnAC3307、rrnAC0503、rrnAC1269、pNG6047、rrnAC2622、rrnAC3290、rrnAC3365、rrnAC2301、pNG6157、rrnAC2002、rrnAC1238、rrnAC3207、pNG2039、pNG7160、rrnAC2748、rrnB0134、rrnAC2283、rrnAC1714、rrnAC1715、rrnAC2338、rrnAC2339、rrnAC2900、rrnAC0341、rrnAC3191、rrnAC1825、rrnAC2037、rrnAC0496、rrnAC3074、rrnAC2669、rrnAC0019、rrnAC0231、rrnAC0564、rrnAC0640、rrnAC1193、rrnAC1687、rrnAC1786、rrnAC1895、rrnAC1953、rrnAC1996、rrnAC2017、rrnAC2022、rrnAC2052、rrnAC2070、rrnAC2160、rrnAC2472、rrnAC2785、rrnAC2936、rrnAC3167、rrnAC3451、rrnAC3486、rrnAC3490、rrnB0253、rrnB0269、pNG7159、pNG7188、pNG7357、pNG6134、rrnAC0376、rrnAC1217、rrnAC1541、rrnAC1663、rrnAC3229、pNG7223、rrnAC0440、rrnAC0535、rrnAC1742、rrnAC2519、rrnAC1764、rrnAC1777、rrnAC2762、rrnAC3264、rrnAC0417、rrnAC1303、rrnB0301、pNG6155、pNG7021、pNG7343、rrnAC1964、pNG7171、rrnAC1338、pNG7344、rrnAC0230、rrnAC1971、rrnB0222、rrnAC0385、rrnAC0312、pNG7133、rrnAC0006、rrnAC1805、rrnAC3501、pNG7312、rrnAC0435、rrnAC0768、rrnAC0992、rrnAC2270、rrnAC3322、rrnB0112、rrnB0157、rrnB0161、pNG6058、pNG6092、pNG5119、pNG5140、pNG4042、pNG2006、pNG1015、rrnAC0199、rrnAC0681、rrnAC1765、rrnAC1767、pNG5067、pNG7180、pNG7307、pNG7183、rrnAC3384、pNG5131、rrnAC2777、pNG5071、rrnAC1472、pNG7308、rrnAC0869、rrnB0148、rrnAC2051、rrnAC0016、rrnAC1875、pNG6072、pNG6123、rrnAC2769、rrnAC1357、rrnAC1126、rrnAC0861、rrnAC0172、rrnAC0420、rrnAC0914、rrnAC2354、rrnAC3310、rrnAC3337、pNG5013、pNG5133、rrnAC3082、rrnB0074、pNG6075、pNG5024、rrnAC0924、rrnB0235、pNG7146、VNG0462C、VNG7122、VNG7125、VNG2445C、VNG0591C、VNG1843C、VNG0320H、VNG1123Gm、VNG1237C、VNG1285G、VNG2094G、VNG1351G、VNG1377G、VNG1179C、VNG1922G、VNG1816G、VNG0134G、VNG0194H、VNG0147C、VNG6193H、VNG2163H、VNG0101G、VNG1836G、VNG0530G、VNG0536G、VNG0835G、VNG2579G、VNG6349C、VNG1394H、VNG0113H、VNG0156C、VNG0160G、VNG0826C、VNG0852C、VNG1207C、VNG1488G、VNG6065G、VNG6461G、VNG7048、VNG7161、VNG1464G、VNG1548C、VNG0247C、VNG0471C、VNG0878Gm、VNG1029C、VNG1616C、VNG2112C、VNG6009H、VNG7007、VNG0704C、VNG1405C、VNG6318G、VNG0142C、VNG6072C、VNG6454C、VNG7053、VNG7156、VNG0703H、VNG0258H、VNG0751C、VNG1426H、VNG2020C、VNG6048H、VNG6126H、VNG6239G、VNG6478H、VNG7102、VNG6027G、VNG7023、VNG1786H、VNG2629G、VNG1598a、VNG7031、VNG6037G、VNG7171、VNG7114、VNG7038、VNG2243G、VNG6140G、VNG7100、VNG6476G、VNG6438G、VNG6050G、VNG0726C、VNG1390H、VNG6351G、VNG2184G、VNG0869G、VNG0254G、VNG6389G、VNG0315G、VNG0734G、VNG0757G、VNG1451C、VNG1886C、VNG1903Cm、VNG0985H、VNG6377H、HQ2607A、HQ2612A、HQ2779A、HQ1740A、HQ1541A、HQ1491A、HQ2619A、HQ1811A、HQ3063A、HQ3354A、HQ3642A、HQ2773A、HQ1436A、HQ2221A、HQ1414A、HQ3339A、HQ2484A、HQ3265A、HQ3620A、HQ1268A、HQ1388A、HQ1866A、HQ1563A、HQ1710A、HQ1962A、HQ1084A、HQ1739A、HQ1861A、HQ1863A、HQ2750A、HQ2664A、HQ2869A、HQ3058A、HQ3361A、HQ1277A、HQ2225A、HQ1993A、HQ1937A、HQ1088A、HQ1724A、HQ1568A、HQ2167A、HQ1230A、HQ2407A、HQ3108A、HQ1973A、HQ3260A、HQ2527A、HQ3410A、HQ2369A、HQ2564A、HQ1153A、HQ1227A、HQ3654A、HQ1867A、HQ2571A、HQ1625A、HQ3408A、HQ1689A、HQ2491A、HQ2726A、HQ2987A、HQ1041A、HQ1898A、HQ1900A、HQ1118A、Hbut_1261、Hbut_0073、Hbut_0009、Hbut_0100、Hbut_0987、Hbut_1340、Hbut_0120、Hbut_0990、Hbut_0316、Hbut_0659、Hbut_0660、Hbut_0366、Hbut_0204、Hbut_1498、Hbut_1630、Hbut_1485、Hbut_1260、Hbut_0942、Hbut_0163、Hbut_0116、Hbut_0207、Hbut_1516、Hbut_0476、Hbut_1139、Hbut_0299、Hbut_0033、Hbut_0336、Hbut_1471、Hbut_1522、Hbut_0601、Hbut_0934、Hbut_0458、Hbut_0054、Hbut_1136、Hbut_0646、Hbut_0815、lgni_0122、lgni_0494、lgni_0706、lgni_1249、lgni_0226、lgni_0308、lgni_0658、lgni_0702、lgni_0486、lgni_0602、lgni_1394、lgni
_0858、lgni_1361、lgni_0354、lgni_0989、lgni_1372、lgni_1124、Msed_0229、Msed_0717、Msed_1005、Msed_1190、Msed_1224、Msed_1970、Msed_2175、Msed_0166、Msed_0688、Msed_1202、Msed_1209、Msed_1765、Msed_1956、Msed_2295、Msed_0619、Msed_0621、Msed_2232、Msed_0140、Msed_2016、Msed_0767、Msed_1126、Msed_0856、Msed_0992、Msed_1773、Msed_1818、Msed_2183、Msed_1598、Msed_1725、Msed_2276、Msed_2293、Msed_1450、Msed_0265、Msed_0492、Msed_1279、Msed_1397、Msed_1563、Msed_1566、Msed_2027、Msed_0565、Msed_0868、Msed_1371、Msed_1483、Msed_1728、Msed_1351、Msed_1733、Msed_2209、Msed_2279、Msed_2233、MTH107、MTH517、MTH899、MTH1438、MTH1795、MTH163、MTH1288、MTH1349、MTH864、MTH1193、MTH254、MTH821、MTH1696、MTH739、MTH603、MTH214、MTH936、MTH659、MTH700、MTH729、MTH967、MTH1553、MTH1328、MTH1470、MTH1285、MTH1545、MTH931、MTH313、MTH1569、MTH281、MTH1488、MTH1521、MTH1627、MTH1063、MTH1787、MTH885、MTH1669、MTH1454、Msm_1107、Msm_1126、Msm_1350、Msm_1032、Msm_0213、Msm_0844、Msm_1260、Msm_0364、Msm_0218、Msm_0026、Msm_0329、Msm_0355、Msm_0453、Msm_1150、Msm_1408、Msm_0864、Msm_0413、Msm_1230、Msm_1499、Msm_1417、Msm_1250、Msm_1090、Msm_0720、Msm_0650、Msm_0424、Msm_0631、Msm_1445、Mbur_0656、Mbur_1148、Mbur_1658、Mbur_1965、Mbur_2405、Mbur_1168、Mbur_0166、Mbur_0946、Mbur_1817、Mbur_1830、Mbur_0231、Mbur_0234、Mbur_2100、Mbur_1375、Mbur_2041、Mbur_0776、Mbur_0783、Mbur_2071、Mbur_1477、Mbur_1871、Mbur_1635、Mbur_1221、Mbur_0292、Mbur_0512、Mbur_0609、Mbur_0661、Mbur_1211、Mbur_1719、Mbur_1811、Mbur_1931、Mbur_2112、Mbur_2130、Mbur_2048、Mbur_2144、Mbur_0368、Mbur_1483、Mbur_2274、Mbur_1359、Mbur_2306、Mbur_1647、Mbur_0631、Mbur_0378、Mbur_0085、Mbur_1496、Mbur_0963、Mbur_0372、Mbur_1140、Mbur_2097、Mbur_2262、Mbur_1532、Maeo_0092、Maeo_0872、Maeo_0888、Maeo_1298、Maeo_1146、Maeo_1061、Maeo_1147、Maeo_0865、Maeo_0659、Maeo_0679、Maeo_1305、Maeo_0977、Maeo_1182、Maeo_1472、Maeo_1362、Maeo_0019、Maeo_0277、Maeo_0356、Maeo_0719、Maeo_1032、Maeo_1289、Maeo_0698、Maeo_1183、Maeo_0223、Maeo_0822、Maeo_0218、Maeo_0186、Maeo_1155、Maeo_0575、Maeo_0728、Maeo_0696、Maeo_0664、MJ0432、MJ1082、MJ1325、MJ0229、MJ0361、MJ1553、MJ1563、MJ0774、MJ1398、MJ0723、MJ0151、MJ0589a、MJECL29、MJ1647、MJ1258、MJ0168、MJ0932、MJ0080、MJ0549、MJ0767、MJ1679、MJ0568、MJ1005、MJ0529、MJ0586、MJ0621、MJ1164、MJ1420、MJ1545、MJ0272、MJ0925、MJ0300、MJ1120、MJ0379、MJ0558、MJ1254、MJ0159、MJ0944、MJ0241、MJ0173、MJ0507、MJ0782、MJ0777、MJ1503、MJ1623、MmarC5_0244、MmarC5_1146、MmarC5_0136、MmarC5_1648、MmarC5_1124、MmarC5_0967、MmarC5_1647、MmarC5_0448、MmarC5_0231、MmarC5_0579、MmarC5_1252、MmarC5_1664、MmarC5_0974、MmarC5_0625、MmarC5_1666、MmarC5_0111、MmarC5_1039、MmarC5_0316、MmarC5_0131、MmarC5_1762、MmarC5_1579、MmarC5_0380、MmarC5_0898、MmarC5_0813、MmarC5_1143、MmarC5_1694、MmarC5_1294、MmarC5_1236、MmarC5_1150、MmarC5_1138、MmarC5_1543、MmarC5_0999、MmarC5_1507、MmarC5_0876、MmarC5_0202、MmarC5_1416、MmarC5_0612、MmarC5_0571、MmarC5_1100、MmarC5_1639、MmarC5_1644、MmarC5_0714、MmarC5_0484、MmarC5_0976、MmarC6_0024、MmarC6_0026、MmarC6_0104、MmarC6_0105、MmarC6_0128、MmarC6_0252、MmarC6_0566、MmarC6_0917、MmarC6_1231、MmarC6_0916、MmarC6_1531、MmarC6_0524、MmarC6_1326、MmarC6_1644、MmarC6_0165、MmarC6_0929、MmarC6_0258、MmarC6_0037、MmarC6_0055、MmarC6_1206、MmarC6_1606、MmarC6_0210、MmarC6_0325、MmarC6_0744、MmarC6_0850、MmarC6_1025、MmarC6_1226、MmarC6_1398、MmarC6_1462、MmarC6_1664、MmarC6_1175、MmarC6_0959、MmarC6_0931、MmarC6_0136、MmarC6_0425、MmarC6_0508、MmarC6_0285、MmarC6_0184、MmarC6_0443、MmarC6_0782、MmarC6_1297、MmarC6_0861、MmarC6_0696、MmarC6_1636、MmarC6_1817、MmarC6_0908、MmarC6_0913、MmarC6_0262、MmarC6_1567、MmarC6_1748、MmarC7_0274、MmarC7_0687、MmarC7_1029、MmarC7_1513、MmarC7_1661、MmarC7_1030、MmarC7_0388、MmarC7_0257、MmarC7_0592、MmarC7_1384、MmarC7_1017、MmarC7_1655、MmarC7_0306、MmarC7_0712、MmarC7_0235、MmarC7_0457、MmarC7_0521、MmarC7_0692、MmarC7_0743、MmarC7_0919、MmarC7_1096、MmarC7_1211、MmarC7_1587、MmarC7_1702、MmarC7_0987、MmarC7_1015、MmarC7_0031、MmarC7_1400、MmarC7_1790、MmarC7_1499、MmarC7_1629、MmarC7_1168、MmarC7_1727、MmarC7_0621、MmarC7_1085、MmarC7_1260、MmarC7_0085、MmarC7_0265、MmarC7_1461、MmarC7_1038、MmarC7_1033、MmarC7_0154、MmarC7_0352、MmarC7_1652、MmarC7_1455、MMP0499、MMP1442、MMP0480、MMP0752、MMP0032、MMP0460、MMP0637、MMP0033、MMP0217、MMP1137、MMP0386、MMP1347、MMP1015、MMP0719、MMP0020、MMP0631、MMP0742、MMP1467、MMP1052、MMP0097、MMP0209、MMP0568、MMP0674、MMP0678、MMP0993、MMP1210、MMP1275、MMP1447、MMP1646、MMP1499、MMP0018、MMP1712、MMP0402、MMP0787、MMP0607、MMP0168、MMP0700、MMP0465、MMP1376、MMP0086、MMP0257、MMP0840、MMP1023、MMP0791、MMP0799、MMP0041、MMP0036、MMP0907、MMP0629、MMP1100、Mevan_0753、Mevan_1029、Mevan_1232、Mevan_1560、Mevan_1502、Mevan_1030、Mevan_0459、Mevan_0343、Mevan_0658、Mevan_1373、Mevan_1201、Mevan_1594、Mevan_1567、Mevan_1203、Mevan_0375、Mevan_0778、Mevan_0320、Mevan_0525、Mevan_0587、Mevan_0758、Mevan_0808、Mevan_0951、Mevan_1109、Mevan_1444、Mevan_1514、Mevan_1517、Mevan_1014、Mevan_0136、Mevan_0295、Mevan_1389、Mevan_1479、Mevan_1173、Mevan_1578、Mevan_1653、Mevan_0686、Mevan_1098、Mevan_1270、Mevan_0270、Mevan_0282、Mevan_1620、Mevan_1668、Mevan_1038、Mevan_1044、Mevan_1050、Mevan_1056、Mevan_1033、Mevan_0014、Mevan_0425、Mevan_0095、Mlab_0303、Mlab_0817、Mlab_0821、Mlab_1236、Mlab_1381、Mlab_0824、Mlab_0002、Mlab_0494、Mlab_0162、Mlab_0744、Mlab_1629、Mlab_0854、Mlab_0909、Mlab_1549、Mlab_0037、Mlab_0071、Mlab_0160、Mlab_1173、Mlab_1603、Mlab_1630、Mlab_1666、Mlab_1628、Mlab_0070、Mlab_1522、Mlab_0331、Mlab_1259、Mlab_0324、Mlab_1366、Mlab_1576、Mlab_0353、Mlab_0010、Mla
b_0295、Mlab_0588、Mlab_1668、Mlab_0447、Mlab_0440、Mlab_0197、Mlab_1697、Mlab_1694、Mlab_1710、Mlab_1511、Mlab_0458、Mlab_0497、Mlab_0762、Mlab_0988、Mlab_0826、Memar_0011、Memar_0013、Memar_1330、Memar_1512、Memar_1567、Memar_1770、Memar_2080、Memar_0129、Memar_0140、Memar_0431、Memar_1231、Memar_1756、Memar_2162、Memar_2068、Memar_1225、Memar_0002、Memar_1921、Memar_0834、Memar_2239、Memar_1448、Memar_0817、Memar_2411、Memar_2490、Memar_2264、Memar_1471、Memar_1420、Memar_0458、Memar_1291、Memar_1391、Memar_1410、Memar_1819、Memar_2218、Memar_2347、Memar_2360、Memar_2449、Memar_1304、Memar_0106、Memar_0096、Memar_0419、Memar_1120、Memar_0385、Memar_0555、Memar_1103、Memar_1319、Memar_2487、Memar_1252、Memar_1388、Memar_0473、Memar_1524、Memar_0459、Memar_0487、Memar_1209、Memar_1387、Memar_2116、MK0576、MK1025、MK0542、MK1515、MK0506、MK1677、MK1502、MK1190、MK0175、MK0800、MK0457、MK0449、MK1380、MK1430、MK0574、MK1482、MK0984、MK0337、MK1587、MK0839、MK0619、MK0858、MK0495、MK0253、Mthe_1108、Mthe_1291、Mthe_1230、Mthe_0612、Mthe_0503、Mthe_0879、Mthe_0047、Mthe_0598、Mthe_0023、Mthe_0662、Mthe_0543、Mthe_0154、Mthe_0459、Mthe_1389、Mthe_1446、Mthe_1633、Mthe_1233、Mthe_0669、Mthe_0067、Mthe_0404、Mthe_0982、Mthe_1201、Mthe_0152、Mthe_0265、Mthe_1650、Mthe_1683、Mthe_0889、MA0191、MA0342、MA0380、MA1458、MA2551、MA3784、MA3925、MA3940、MA3952、MA4076、MA4344、MA4484、MA4576、MA0207、MA0750、MA2499、MA3597、MA4479、MA2544、MA4480、MA0504、MA2921、MA0862、MA0205、MA0460、MA0622、MA0629、MA1953、MA4398、MA4560、MA0723、MA1529、MA1551、MA2421、MA1531、MA0924、MA0575、MA1588、MA0672、MA1395、MA4075、MA1763、MA2814、MA3468、MA0022、MA4338、MA2133、MA0971、MA1005、MA0067、MA1424、MA1815、MA4668、MA2914、MA3524、MA4040、MA4267、MA3984、MA0283、MA0333、MA0414、MA1339、MA3166、MA0176、MA0180、MA0743、MA1863、MA2051、MA2055、MA2206、MA2211、MA2771、MA3189、MA4167、MA1122、MA3015、MA0079、MA0989、MA4404、MA2093、MA1671、MA4106、MA4346、MA0278、MA4331、MA0179、MA2948、MA3586、MA2761、MA1487、MA1771、MA2746、MA0364、MA2951、MA0354、MA2902、MA0368、MA2764、MA2766、MA0178、MA2782、MA2493、MA0610、MA3871、MA0287、MA0359、MA1835、MA2057、MA2207、MA2212、MA3151、MA4622、MA0926、MA1664、MA4408、MA1868、Mbar_A0506、Mbar_A0581、Mbar_A0738、Mbar_A0909、Mbar_A1363、Mbar_A1705、Mbar_A1707、Mbar_A1708、Mbar_A1719、Mbar_A2323、Mbar_A2748、Mbar_A3221、Mbar_A3427、Mbar_A1541、Mbar_A1729、Mbar_A2416、Mbar_A3312、Mbar_A0803、Mbar_A3558、Mbar_A0794、Mbar_A2965、Mbar_A1070、Mbar_A1333、Mbar_A2865、Mbar_A1639、Mbar_A3371、Mbar_A0650、Mbar_A3377、Mbar_A3361、Mbar_A0654、Mbar_A3464、Mbar_A1460、Mbar_A2808、Mbar_A1584、Mbar_A2743、Mbar_A2250、Mbar_A0507、Mbar_A0992、Mbar_A1457、Mbar_A0588、Mbar_A0122、Mbar_A2068、Mbar_A0552、Mbar_A0621、Mbar_A0692、Mbar_A1033、Mbar_A2079、Mbar_A2171、Mbar_A2318、Mbar_A2819、Mbar_A2992、Mbar_A3339、Mbar_A1265、Mbar_A1377、Mbar_A1884、Mbar_A2294、Mbar_A3663、Mbar_A2575、Mbar_A2637、Mbar_A3146、Mbar_A3330、Mbar_A3493、Mbar_A2012、Mbar_A2036、Mbar_A2688、Mbar_A3560、Mbar_A1076、Mbar_A0340、Mbar_A0520、Mbar_A1497、Mbar_A3486、Mbar_A1949、Mbar_A0475、Mbar_A0579、Mbar_A1062、Mbar_A0595、Mbar_A3297、Mbar_A3442、Mbar_A3419、Mbar_A0834、Mbar_A0787、Mbar_A2740、Mbar_A1394、Mbar_A0196、Mbar_A1270、Mbar_A3331、Mbar_A3578、Mbar_A3670、Mbar_A1080、MM0272、MM0662、MM0841、MM1040、MM1257、MM1484、MM1796、MM2237、MM2242、MM2246、MM2247、MM2261、MM2525、MM2985、MM3068、MM3208、MM1882、MM1494、MM3092、MM1595、MM3173、MM0565、MM1492、MM0266、MM1080、MM1605、MM1650、MM2809、MM2861、MM2446、MM2441、MM2040、MM1728、MM1739、MM2416、MM1825、MM0666、MM0842、MM2657、MM1332、MM2573、MM1034、MM2606、MM0247、MM0444、MM0872、MM0927、MM1363、MM2394、MM2895、MM3179、MM1005、MM3233、MM1550、MM0359、MM0361、MM1586、MM1863、MM2851、MM2853、MM3117、MM0116、MM0289、MM0346、MM1903、MM3195、MM3170、MM1085、MM0386、MM2835、MM0811、MM1042、MM1027、MM2184、MM1028、MM0432、MM2546、MM1614、MM1772、MM0692、MM0146、MM0345、MM0369、MM1554、MM2854、MM1094、MM2042、MM3115、Msp_0061、Msp_0120、Msp_1519、Msp_0293、Msp_1556、Msp_0769、Msp_0168、Msp_0614、Msp_0518、Msp_0122、Msp_0383、Msp_1218、Msp_0446、Msp_0265、Msp_0608、Msp_1143、Msp_1207、Msp_0248、Msp_0512、Msp_0823、Msp_1188、Msp_0235、Msp_0194、Msp_1057、Msp_1097、Msp_0717、Msp_0971、Msp_1360、Msp_1272、Msp_1125、Msp_0149、Mhun_0040、Mhun_0316、Mhun_0873、Mhun_1073、Mhun_1644、Mhun_2448、Mhun_2633、Mhun_2472、Mhun_0365、Mhun_0919、Mhun_0576、Mhun_0165、Mhun_2458、Mhun_0842、Mhun_0941、Mhun_1324、Mhun_1346、Mhun_2089、Mhun_1313、Mhun_1731、Mhun_1706、Mhun_0152、Mhun_0501、Mhun_1037、Mhun_2548、Mhun_2928、Mhun_3036、Mhun_0241、Mhun_1541、Mhun_2190、Mhun_0646、Mhun_1347、Mhun_1533、Mhun_1553、Mhun_1866、Mhun_1954、Mhun_0253、Mhun_1259、Mhun_1451、Mhun_2502、Mhun_0684、Mhun_2259、Mhun_0763、Mhun_1327、Mhun_1530、Mhun_2935、Mhun_2804、Mhun_0568、Mhun_0593、Mhun_1236、Mhun_1656、Mhun_2481、Mhun_2797、Mhun_0497、Mhun_0575、Mhun_0588、NEQ328、NEQ229、NEQ348、NEQ288、NEQ453、NEQ143、NEQ039、NEQ276、NEQ098、NEQ541、NP1838A、NP2534A、NP3936A、NP6056A、NP2558A、NP1144A、NP0458A、NP2490A、NP2664A、NP3370A、NP0078A、NP5052A、NP4026A、NP6200A、NP0924A、NP4828A、NP2752A、NP6106A、NP2470A、NP2474A、NP0316A、NP0252A、NP5326A、NP1048A、NP2958A、NP5152A、NP4632A、NP3636A、NP3734A、NP4552A、NP5064A、NP1496A、NP4726A、NP2878A、NP0136A、NP0162A、NP0654A、NP1532A、NP1538A、NP1564A、NP2794A、NP4286A、NP4406A、NP5130A、NP5298A、NP6030A、NP6220A、NP4436A、NP1320A、NP2146A、NP3466A、NP4796A、NP5168A、NP3046A、NP2812A、NP3608A、NP2618A、NP6176A、NP3330A、NP7054A、NP2762A、NP4124A、NP3490A、NP1128A、NP1628A、NP2114A、NP0674A、NP2366A、NP3002A、NP3776A、NP4444A、NP1296A、NP1064A、NP4080A、NP4082A、NP0534A、NP2466A、NP3718A、NP
5096A、NP2220A、NP5186A、NP1684A、NP2246A、NP4822A、NP4326A、NP4106A、NP2518A、NP5272A、NP6088A、NP4258A、PTO0082、PTO0457、PTO0754、PTO0795、PTO0420、PTO1287、PTO0595、PTO0891、PTO0200、PTO1201、PTO0428、PTO0376、PTO0514、PTO0375、PTO0781、PT01148、PTO0979、PTO0276、PTO0843、PTO0557、PTO1105、PTO1211、PTO1517、PTO1052、PTO1150、PTO0114、PTO1041、PTO1176、PTO0063、PTO0799、PTO1388、PTO1389、PTO0914、PTO1110、PTO1216、PTO0675、PTO1123、PTO0506、PTO1258、PTO1372、PTO0363、PTO1340、PTO1338、PTO1067、PTO1454、PTO1523、PTO0576、PTO0198、PAE0731、PAE0738、PAE1612、PAE2042、PAE2911、PAE1948、PAE2655、PAE0385、PAE2225、PAE3116、PAE2186、PAE1103、PAE1592、PAE1848、PAE3387、PAE1507、PAE1986、PAE3469、PAE3471、PAE0659、PAE1443、PAE1484、PAE0296、PAE2022、PAE2357、PAE1544、PAE0640、PAE2309、PAE3163、PAE2449、PAE3605、PAE0783、PAE1627、PAE1638、PAE2071、PAE3208、PAE0019、PAE0813、PAE3327、PAE0146、PAE2679、PAE2684、PAE1218、PAE1760、PAE0013、PAE3437、PAE2640、PAE3378、PAE2164、PAE0171、PAE0170、PAE3329、PAE2120、PAE1645、PAE0781、PAE2282、Pars_0006、Pars_0433、Pars_0703、Pars_0836、Pars_0990、Pars_1924、Pars_2088、Pars_2298、Pars_0264、Pars_2028、Pars_0627、Pars_1855、Pars_2059、Pars_1853、Pars_0399、Pars_0425、Pars_1561、Pars_2084、Pars_0343、Pars_0668、Pars_2155、Pars_0438、Pars_1526、Pars_2364、Pars_1428、Pars_0037、Pars_1981、Pars_1988、Pars_2104、Pars_0057、Pars_0792、Pars_0504、Pars_0550、Pars_1742、Pars_1776、Pars_0311、Pars_0752、Pars_1087、Pars_1872、Pars_1005、Pars_0806、Pars_2186、Pars_2187、Pars_1743、Pars_2132、Pars_1649、Pars_1976、Pars_0035、Pars_1810、Pars_2125、Pcal_0142、Pcal_0905、Pcal_0946、Pcal_0412、Pcal_0495、Pcal_0687、Pcal_1273、Pcal_0822、Pcal_1595、Pcal_1185、Pcal_0610、Pcal_1183、Pcal_2085、Pcal_0796、Pcal_0536、Pcal_1689、Pcal_0008、Pcal_1198、Pcal_1653、Pcal_0295、Pcal_1924、Pcal_1927、Pcal_0200、Pcal_0589、Pcal_0596、Pcal_2145、Pcal_0791、Pcal_0023、Pcal_1415、Pcal_1735、Pcal_0266、Pcal_0346、Pcal_0543、Pcal_0792、Pcal_1032、Pcal_0159、Pcal_1078、Pcal_1890、Pcal_1316、Pcal_1055、Pcal_0584、Pcal_1734、Pcal_2147、Pcal_1638、Pcal_2070、Pisl_1759、Pisl_2001、Pisl_0858、Pisl_1838、Pisl_0307、Pisl_0653、Pisl_1426、Pisl_1248、Pisl_1639、Pisl_1808、Pisl_0995、Pisl_1590、Pisl_0997、Pisl_0709、Pisl_1563、Pisl_1834、Pisl_1578、Pisl_0622、Pisl_1613、Pisl_0725、Pisl_1023、Pisl_0410、Pisl_1076、Pisl_1655、Pisl_1662、Pisl_1854、Pisl_0045、Pisl_1100、Pisl_0810、Pisl_0572、Pisl_1971、Pisl_1303、Pisl_1717、Pisl_0038、Pisl_0979、Pisl_0565、Pisl_1878、Pisl_0807、Pisl_1975、Pisl_1974、Pisl_0573、Pisl_0955、Pisl_1667、Pisl_1074、Pisl_1008、Pisl_1250、PAB2298、PAB1869、PAB0625、PAB0751、PAB1002、PAB2328、PAB0125、PAB0208、PAB0619、PAB1229、PAB1227、PAB0108、PAB0322、PAB0392、PAB2312、PAB7115、PAB2062.1n、PAB1938、PAB1236、PAB2257、PAB7359、PAB2299、PAB0758a、PAB3089、PAB3117、PAB0960、PAB1522.1n、PAB2324、PAB0714、PAB2311、PAB1533、PAB0211、PAB2104、PAB2035、PAB0475、PAB0842、PAB0668、PAB7155、PAB3293、PAB0917、PAB0661、PAB0953、PAB1243、PAB1544、PAB0331、PAB1922、PAB7338、PAB0603、PAB1517、PAB1726、PAB1641、PAB1642、PAB0976、PAB1912、PAB0950、PAB0838、PF0007、PF0230、PF1072、PF1406、PF2051、PF0113、PF0232、PF1790、PF1088、PF0095、PF1734、PF0054、PF1543、PF1732、PF0250、PF0739、PF1231、PF1601、PF1022、PF1893、PF0607、PF0829、PF1722、PF1831、PF0322、PF0524、PF2053、PF0851、PF1194、PF0055、PF0505、PF0512、PF1386、PF1735、PF1794、PF1851、PF0691、PF0487、PF0988、PF1029、PF2062、PF0263、PF0709、PF1476、PF0584、PF1198、PF0535、PF1295、PF1338、PF1337、PF0687、PF1377、PF0491、PF0496、PF0661、PF1743、PF0124、PF0649、PH0062、PH1101、PH0199、PH0289、PH0825、PH1061、PH1406、PH1744、PH1930、PH1932、PH0977、PH0952、PH0180、PH1692、PH0045、PH1856.1n、PH0061、PHS045、PH1592、PH1916、PH0140、PH1519、PHS023、PH1055、PHS034、PHS051、PHS046、PH0601、PHS024、PH0468、PH1163、PH0046、PH0787、PH0783、PH1471、PH1691、PH1748、PH1808、PH0660、PH0804、PH0995、PH0614、PH0914、PH0718.1n、PH1080、PH0763、PH1009、PH1161、PH1160、PH1482、PH0864、PH0619、PH0751、PH0799、PH1034、PH0588、Smar_0567、Smar_0017、Smar_0429、Smar_1295、Smar_0048、Smar_0184、Smar_0954、Smar_1451、Smar_0205、Smar_0336、Smar_0366、Smar_1141、Smar_0476、Smar_0879、Smar_0338、Smar_0194、Smar_0612、Smar_0915、Smar_1254、Smar_1341、Smar_0279、Smar_1409、Smar_0319、Smar_0758、Smar_1442、Smar_1514、Smar_1075、Smar_1322、Smar_0054、Smar_1137、Smar_1250、Smar_0918、Smar_0086、Saci_0006、Saci_0446、Saci_1068、Saci_1787、Saci_1979、Saci_0800、Saci_1710、Saci_2236、Saci_2266、Saci_2136、Saci_0992、Saci_0731、Saci_0752、Saci_1304、Saci_1588、Saci_0944、Saci_0843、Saci_0942、Saci_0264、Saci_1391、Saci_0476、Saci_1223、Saci_0112、Saci_0048、Saci_1851、Saci_0455、Saci_2061、Saci_2116、Saci_2167、Saci_2183、Saci_2296、Saci_0655、Saci_1344、Saci_1505、Saci_2359、Saci_1192、Saci_2313、Saci_0161、Saci_0102、Saci_0133、Saci_0874、Saci_1219、Saci_1482、Saci_1670、Saci_1956、Saci_2112、Saci_0488、Saci_0483、Saci_1180、Saci_1171、Saci_1186、Saci_1242、Saci_0489、Saci_1005、Saci_2352、Saci_0380、Saci_1336、Saci_1230、Saci_2283、Saci_1107、Saci_0866、Saci_1341、Saci_0652、Saci_0842、Saci_1161、SSO0458、SSO0620、SSO9953、SSO2688、SSO0200、SSO1423、SSO2114、SSO2347、SSO3103、SS05522、SSO0977、SSO0606、SSO2131、SSO10340、SSO0157、SSO6024、SSO0659、SSO5826、SSO10342、SSO3242、SSO0669、SSO2273、SSO2244、SSO1589、SSO1255、SSO0447、SSO0785、SSO1008、SSO1219、SSO1306、SSO1536、SSO2058、SSO3061、SSO3080、SSO1868、SSO3097、SSO2474、SSO3188、SSO0107、SSO0270、SSO0387、SSO0942、SSO1066、SSO0040、SSO1264、SSO1384、SSO1750、SSO1897、SSO2090、SSO2132、SSO2933、SSO2992、SSO2897、SSO3176、SSO0048、SSO0365、SSO1082、SSO1108、SSO1352、SSO1101、SSO1110、SSO2652、SSO1695、SSO1748、SSO2957、SSO2327、SSO0038、SSO0049、
SSO0994、SSO2138、SSO2571、SSO0951、SSO2206、SSO2089、SSO2598、SSO2506、SSO0446、SSO0946、SSO0266、SSO0426、SSO2073、ST0236、ST1060、ST1064、ST1076、ST1486、ST1604、ST1889、STS229、ST0720、ST0173、STS095、ST2514、ST1022、ST2372、ST0193、ST0489、ST1115、ST1301、STS042、ST1473、STS071、STS074、STS163、STS072、STS250、STS248、ST2039、ST2236、ST2114、ST2562、ST0051、ST0164、ST0722、ST2550、ST1593、ST0256、ST0331、ST1268、ST2084、ST2190、ST1409、ST0808、STS035、ST0758、ST1043、ST1386、ST1710、ST1716、ST1867、ST1890、ST2388、STS086、ST0749、ST0837、ST0980、ST2050、ST0757、ST0766、ST2210、ST1773、ST1340、ST1054、ST1275、ST1007、ST1041、ST0684、ST0072、ST0349、ST1271、ST0334、ST1630、ST0371、TK0063、TK0559、TK1041、TK1261、TK1826、TK1881、TK2190、TK1086、TK1883、TK1955、TK2291、TK2134、TK1285、TK1487、TK0168、TK1331、TK0567、TK0834、TK1491、TK1210、TK2110、TK2052、TK0143、TK1413、TK2289、TK2270、TK1815、TK1439、TK0695、TK1259、TK0107、TK0448、TK1057、TK1058、TK1272、TK0697、TK0126、TK0539、TK1266、TK1688、TK2197、TK2218、TK1489、TK1339、TK0142、TK0169、TK1246、TK0770、TK1494、TK1924、TK2107、TK1143、TK1654、TK0151、TK0779、TK2151、TK0132、TK2287、TK1280、TK2024、TK0471、TK1769、TK1913、TK1050、Tpen_0466、Tpen_0552、Tpen_0860、Tpen_1509、Tpen_0232、Tpen_0836、Tpen_1499、Tpen_0577、Tpen_0018、Tpen_0579、Tpen_0150、Tpen_0366、Tpen_0869、Tpen_0668、Tpen_0348、Tpen_1236、Tpen_0124、Tpen_0102、Tpen_0973、Tpen_1621、Tpen_0378、Tpen_0538、Tpen_0707、Tpen_0776、Tpen_0069、Tpen_0090、Tpen_0173、Tpen_1796、Tpen_1358、Tpen_0115、Tpen_1464、Tpen_1595、Tpen_1401、Tpen_0901、Tpen_1818、Tpen_0293、Tpen_0690、Tpen_0374、Tpen_0710、Tpen_0070、Tpen_1551、Tpen_1591、Tpen_1154、Tpen_1562、Ta0472、Ta0731、Ta1110、Ta0115、Ta1173、Ta1443、Ta0185、Ta0678、Ta0608、Ta0257、Ta0981、Ta0093、Ta0550m、Ta0842、Ta0872、Ta1362m、Ta0736、Ta1394、Ta0166、Ta0675、Ta0748、Ta1231、Ta1186、Ta0106、Ta0948、Ta1282m、Ta1363、Ta0131、Ta0320m、Ta0411、Ta1064、Ta1166、Ta1218、Ta1503、Ta0201、Ta0346、Ta1496、Ta0868m、Ta1061m、Ta0825、Ta0795、Ta0199、Ta1485、Ta0945、Ta0940、Ta0134、Ta0685、Ta0890、Ta1324、TVN0192、TVN0983、TVN1251、TVN0658、TVN0295、TVN1196、TVN1337、TVN1127、TVN0160、TVN0945、TVN0938、TVN0292、TVN0236、TVN0364、TVN0447、TVN0906、TVN1422、TVN0185、TVN0291、TVN0514、TVN1093、TVN0210、TVN1272、TVN0519、TVN0603、TVN1246、TVN1408、TVN1203、TVN1162、TVN0516、TVN1265、TVN1392、TVN1493、TVN0934、TVN0728、TVN0704、TVN1394、TVN0084、TVN1083、TVN1089、TVN0213、TVN1149、TVN0972、TVN0377、LRC567、RCIX1274、RCIX1420、RCIX1655、RC1X1698、RCIX2213、RCIX2336、RRC298、RRC486、RRC76、RCIX1140、RCIX2193、RCIX670、RCIX684、RC1X808、RC1X820、LRC582、RCIX785、LRC109、RCIX103、RCIX105、RCIX106、RCIX1508、RCIX1739、RCIX2247、RRC465、RCIX1740、RCIX2328、RRC178、LRC575、RCIX1349、RCIX1520、LRC520、RCIX125、RCIX1430、RCIX148、RCIX1527、RCIX1743、RCIX2456、RCIX449、RCIX571、RRC212、RCIX960、LRC190、RCIX1230、RCIX414、RCIX1747、LRC319、RCIX1292、RCIX1376、RCIX2173、RCIX2196、RRC154、RCIX1238、RCIX1068、RCIX1190、RCIX1914、RCIX2177、RCIX824、RCIX989、RCIX2108、LRC274、LRC304、RCIX1189、RCIX1785、RCIX1790、及びRCIX90などの古細菌TFを改変したものである。
_0858、lgni_1361、lgni_0354、lgni_0989、lgni_1372、lgni_1124、Msed_0229、Msed_0717、Msed_1005、Msed_1190、Msed_1224、Msed_1970、Msed_2175、Msed_0166、Msed_0688、Msed_1202、Msed_1209、Msed_1765、Msed_1956、Msed_2295、Msed_0619、Msed_0621、Msed_2232、Msed_0140、Msed_2016、Msed_0767、Msed_1126、Msed_0856、Msed_0992、Msed_1773、Msed_1818、Msed_2183、Msed_1598、Msed_1725、Msed_2276、Msed_2293、Msed_1450、Msed_0265、Msed_0492、Msed_1279、Msed_1397、Msed_1563、Msed_1566、Msed_2027、Msed_0565、Msed_0868、Msed_1371、Msed_1483、Msed_1728、Msed_1351、Msed_1733、Msed_2209、Msed_2279、Msed_2233、MTH107、MTH517、MTH899、MTH1438、MTH1795、MTH163、MTH1288、MTH1349、MTH864、MTH1193、MTH254、MTH821、MTH1696、MTH739、MTH603、MTH214、MTH936、MTH659、MTH700、MTH729、MTH967、MTH1553、MTH1328、MTH1470、MTH1285、MTH1545、MTH931、MTH313、MTH1569、MTH281、MTH1488、MTH1521、MTH1627、MTH1063、MTH1787、MTH885、MTH1669、MTH1454、Msm_1107、Msm_1126、Msm_1350、Msm_1032、Msm_0213、Msm_0844、Msm_1260、Msm_0364、Msm_0218、Msm_0026、Msm_0329、Msm_0355、Msm_0453、Msm_1150、Msm_1408、Msm_0864、Msm_0413、Msm_1230、Msm_1499、Msm_1417、Msm_1250、Msm_1090、Msm_0720、Msm_0650、Msm_0424、Msm_0631、Msm_1445、Mbur_0656、Mbur_1148、Mbur_1658、Mbur_1965、Mbur_2405、Mbur_1168、Mbur_0166、Mbur_0946、Mbur_1817、Mbur_1830、Mbur_0231、Mbur_0234、Mbur_2100、Mbur_1375、Mbur_2041、Mbur_0776、Mbur_0783、Mbur_2071、Mbur_1477、Mbur_1871、Mbur_1635、Mbur_1221、Mbur_0292、Mbur_0512、Mbur_0609、Mbur_0661、Mbur_1211、Mbur_1719、Mbur_1811、Mbur_1931、Mbur_2112、Mbur_2130、Mbur_2048、Mbur_2144、Mbur_0368、Mbur_1483、Mbur_2274、Mbur_1359、Mbur_2306、Mbur_1647、Mbur_0631、Mbur_0378、Mbur_0085、Mbur_1496、Mbur_0963、Mbur_0372、Mbur_1140、Mbur_2097、Mbur_2262、Mbur_1532、Maeo_0092、Maeo_0872、Maeo_0888、Maeo_1298、Maeo_1146、Maeo_1061、Maeo_1147、Maeo_0865、Maeo_0659、Maeo_0679、Maeo_1305、Maeo_0977、Maeo_1182、Maeo_1472、Maeo_1362、Maeo_0019、Maeo_0277、Maeo_0356、Maeo_0719、Maeo_1032、Maeo_1289、Maeo_0698、Maeo_1183、Maeo_0223、Maeo_0822、Maeo_0218、Maeo_0186、Maeo_1155、Maeo_0575、Maeo_0728、Maeo_0696、Maeo_0664、MJ0432、MJ1082、MJ1325、MJ0229、MJ0361、MJ1553、MJ1563、MJ0774、MJ1398、MJ0723、MJ0151、MJ0589a、MJECL29、MJ1647、MJ1258、MJ0168、MJ0932、MJ0080、MJ0549、MJ0767、MJ1679、MJ0568、MJ1005、MJ0529、MJ0586、MJ0621、MJ1164、MJ1420、MJ1545、MJ0272、MJ0925、MJ0300、MJ1120、MJ0379、MJ0558、MJ1254、MJ0159、MJ0944、MJ0241、MJ0173、MJ0507、MJ0782、MJ0777、MJ1503、MJ1623、MmarC5_0244、MmarC5_1146、MmarC5_0136、MmarC5_1648、MmarC5_1124、MmarC5_0967、MmarC5_1647、MmarC5_0448、MmarC5_0231、MmarC5_0579、MmarC5_1252、MmarC5_1664、MmarC5_0974、MmarC5_0625、MmarC5_1666、MmarC5_0111、MmarC5_1039、MmarC5_0316、MmarC5_0131、MmarC5_1762、MmarC5_1579、MmarC5_0380、MmarC5_0898、MmarC5_0813、MmarC5_1143、MmarC5_1694、MmarC5_1294、MmarC5_1236、MmarC5_1150、MmarC5_1138、MmarC5_1543、MmarC5_0999、MmarC5_1507、MmarC5_0876、MmarC5_0202、MmarC5_1416、MmarC5_0612、MmarC5_0571、MmarC5_1100、MmarC5_1639、MmarC5_1644、MmarC5_0714、MmarC5_0484、MmarC5_0976、MmarC6_0024、MmarC6_0026、MmarC6_0104、MmarC6_0105、MmarC6_0128、MmarC6_0252、MmarC6_0566、MmarC6_0917、MmarC6_1231、MmarC6_0916、MmarC6_1531、MmarC6_0524、MmarC6_1326、MmarC6_1644、MmarC6_0165、MmarC6_0929、MmarC6_0258、MmarC6_0037、MmarC6_0055、MmarC6_1206、MmarC6_1606、MmarC6_0210、MmarC6_0325、MmarC6_0744、MmarC6_0850、MmarC6_1025、MmarC6_1226、MmarC6_1398、MmarC6_1462、MmarC6_1664、MmarC6_1175、MmarC6_0959、MmarC6_0931、MmarC6_0136、MmarC6_0425、MmarC6_0508、MmarC6_0285、MmarC6_0184、MmarC6_0443、MmarC6_0782、MmarC6_1297、MmarC6_0861、MmarC6_0696、MmarC6_1636、MmarC6_1817、MmarC6_0908、MmarC6_0913、MmarC6_0262、MmarC6_1567、MmarC6_1748、MmarC7_0274、MmarC7_0687、MmarC7_1029、MmarC7_1513、MmarC7_1661、MmarC7_1030、MmarC7_0388、MmarC7_0257、MmarC7_0592、MmarC7_1384、MmarC7_1017、MmarC7_1655、MmarC7_0306、MmarC7_0712、MmarC7_0235、MmarC7_0457、MmarC7_0521、MmarC7_0692、MmarC7_0743、MmarC7_0919、MmarC7_1096、MmarC7_1211、MmarC7_1587、MmarC7_1702、MmarC7_0987、MmarC7_1015、MmarC7_0031、MmarC7_1400、MmarC7_1790、MmarC7_1499、MmarC7_1629、MmarC7_1168、MmarC7_1727、MmarC7_0621、MmarC7_1085、MmarC7_1260、MmarC7_0085、MmarC7_0265、MmarC7_1461、MmarC7_1038、MmarC7_1033、MmarC7_0154、MmarC7_0352、MmarC7_1652、MmarC7_1455、MMP0499、MMP1442、MMP0480、MMP0752、MMP0032、MMP0460、MMP0637、MMP0033、MMP0217、MMP1137、MMP0386、MMP1347、MMP1015、MMP0719、MMP0020、MMP0631、MMP0742、MMP1467、MMP1052、MMP0097、MMP0209、MMP0568、MMP0674、MMP0678、MMP0993、MMP1210、MMP1275、MMP1447、MMP1646、MMP1499、MMP0018、MMP1712、MMP0402、MMP0787、MMP0607、MMP0168、MMP0700、MMP0465、MMP1376、MMP0086、MMP0257、MMP0840、MMP1023、MMP0791、MMP0799、MMP0041、MMP0036、MMP0907、MMP0629、MMP1100、Mevan_0753、Mevan_1029、Mevan_1232、Mevan_1560、Mevan_1502、Mevan_1030、Mevan_0459、Mevan_0343、Mevan_0658、Mevan_1373、Mevan_1201、Mevan_1594、Mevan_1567、Mevan_1203、Mevan_0375、Mevan_0778、Mevan_0320、Mevan_0525、Mevan_0587、Mevan_0758、Mevan_0808、Mevan_0951、Mevan_1109、Mevan_1444、Mevan_1514、Mevan_1517、Mevan_1014、Mevan_0136、Mevan_0295、Mevan_1389、Mevan_1479、Mevan_1173、Mevan_1578、Mevan_1653、Mevan_0686、Mevan_1098、Mevan_1270、Mevan_0270、Mevan_0282、Mevan_1620、Mevan_1668、Mevan_1038、Mevan_1044、Mevan_1050、Mevan_1056、Mevan_1033、Mevan_0014、Mevan_0425、Mevan_0095、Mlab_0303、Mlab_0817、Mlab_0821、Mlab_1236、Mlab_1381、Mlab_0824、Mlab_0002、Mlab_0494、Mlab_0162、Mlab_0744、Mlab_1629、Mlab_0854、Mlab_0909、Mlab_1549、Mlab_0037、Mlab_0071、Mlab_0160、Mlab_1173、Mlab_1603、Mlab_1630、Mlab_1666、Mlab_1628、Mlab_0070、Mlab_1522、Mlab_0331、Mlab_1259、Mlab_0324、Mlab_1366、Mlab_1576、Mlab_0353、Mlab_0010、Mla
b_0295、Mlab_0588、Mlab_1668、Mlab_0447、Mlab_0440、Mlab_0197、Mlab_1697、Mlab_1694、Mlab_1710、Mlab_1511、Mlab_0458、Mlab_0497、Mlab_0762、Mlab_0988、Mlab_0826、Memar_0011、Memar_0013、Memar_1330、Memar_1512、Memar_1567、Memar_1770、Memar_2080、Memar_0129、Memar_0140、Memar_0431、Memar_1231、Memar_1756、Memar_2162、Memar_2068、Memar_1225、Memar_0002、Memar_1921、Memar_0834、Memar_2239、Memar_1448、Memar_0817、Memar_2411、Memar_2490、Memar_2264、Memar_1471、Memar_1420、Memar_0458、Memar_1291、Memar_1391、Memar_1410、Memar_1819、Memar_2218、Memar_2347、Memar_2360、Memar_2449、Memar_1304、Memar_0106、Memar_0096、Memar_0419、Memar_1120、Memar_0385、Memar_0555、Memar_1103、Memar_1319、Memar_2487、Memar_1252、Memar_1388、Memar_0473、Memar_1524、Memar_0459、Memar_0487、Memar_1209、Memar_1387、Memar_2116、MK0576、MK1025、MK0542、MK1515、MK0506、MK1677、MK1502、MK1190、MK0175、MK0800、MK0457、MK0449、MK1380、MK1430、MK0574、MK1482、MK0984、MK0337、MK1587、MK0839、MK0619、MK0858、MK0495、MK0253、Mthe_1108、Mthe_1291、Mthe_1230、Mthe_0612、Mthe_0503、Mthe_0879、Mthe_0047、Mthe_0598、Mthe_0023、Mthe_0662、Mthe_0543、Mthe_0154、Mthe_0459、Mthe_1389、Mthe_1446、Mthe_1633、Mthe_1233、Mthe_0669、Mthe_0067、Mthe_0404、Mthe_0982、Mthe_1201、Mthe_0152、Mthe_0265、Mthe_1650、Mthe_1683、Mthe_0889、MA0191、MA0342、MA0380、MA1458、MA2551、MA3784、MA3925、MA3940、MA3952、MA4076、MA4344、MA4484、MA4576、MA0207、MA0750、MA2499、MA3597、MA4479、MA2544、MA4480、MA0504、MA2921、MA0862、MA0205、MA0460、MA0622、MA0629、MA1953、MA4398、MA4560、MA0723、MA1529、MA1551、MA2421、MA1531、MA0924、MA0575、MA1588、MA0672、MA1395、MA4075、MA1763、MA2814、MA3468、MA0022、MA4338、MA2133、MA0971、MA1005、MA0067、MA1424、MA1815、MA4668、MA2914、MA3524、MA4040、MA4267、MA3984、MA0283、MA0333、MA0414、MA1339、MA3166、MA0176、MA0180、MA0743、MA1863、MA2051、MA2055、MA2206、MA2211、MA2771、MA3189、MA4167、MA1122、MA3015、MA0079、MA0989、MA4404、MA2093、MA1671、MA4106、MA4346、MA0278、MA4331、MA0179、MA2948、MA3586、MA2761、MA1487、MA1771、MA2746、MA0364、MA2951、MA0354、MA2902、MA0368、MA2764、MA2766、MA0178、MA2782、MA2493、MA0610、MA3871、MA0287、MA0359、MA1835、MA2057、MA2207、MA2212、MA3151、MA4622、MA0926、MA1664、MA4408、MA1868、Mbar_A0506、Mbar_A0581、Mbar_A0738、Mbar_A0909、Mbar_A1363、Mbar_A1705、Mbar_A1707、Mbar_A1708、Mbar_A1719、Mbar_A2323、Mbar_A2748、Mbar_A3221、Mbar_A3427、Mbar_A1541、Mbar_A1729、Mbar_A2416、Mbar_A3312、Mbar_A0803、Mbar_A3558、Mbar_A0794、Mbar_A2965、Mbar_A1070、Mbar_A1333、Mbar_A2865、Mbar_A1639、Mbar_A3371、Mbar_A0650、Mbar_A3377、Mbar_A3361、Mbar_A0654、Mbar_A3464、Mbar_A1460、Mbar_A2808、Mbar_A1584、Mbar_A2743、Mbar_A2250、Mbar_A0507、Mbar_A0992、Mbar_A1457、Mbar_A0588、Mbar_A0122、Mbar_A2068、Mbar_A0552、Mbar_A0621、Mbar_A0692、Mbar_A1033、Mbar_A2079、Mbar_A2171、Mbar_A2318、Mbar_A2819、Mbar_A2992、Mbar_A3339、Mbar_A1265、Mbar_A1377、Mbar_A1884、Mbar_A2294、Mbar_A3663、Mbar_A2575、Mbar_A2637、Mbar_A3146、Mbar_A3330、Mbar_A3493、Mbar_A2012、Mbar_A2036、Mbar_A2688、Mbar_A3560、Mbar_A1076、Mbar_A0340、Mbar_A0520、Mbar_A1497、Mbar_A3486、Mbar_A1949、Mbar_A0475、Mbar_A0579、Mbar_A1062、Mbar_A0595、Mbar_A3297、Mbar_A3442、Mbar_A3419、Mbar_A0834、Mbar_A0787、Mbar_A2740、Mbar_A1394、Mbar_A0196、Mbar_A1270、Mbar_A3331、Mbar_A3578、Mbar_A3670、Mbar_A1080、MM0272、MM0662、MM0841、MM1040、MM1257、MM1484、MM1796、MM2237、MM2242、MM2246、MM2247、MM2261、MM2525、MM2985、MM3068、MM3208、MM1882、MM1494、MM3092、MM1595、MM3173、MM0565、MM1492、MM0266、MM1080、MM1605、MM1650、MM2809、MM2861、MM2446、MM2441、MM2040、MM1728、MM1739、MM2416、MM1825、MM0666、MM0842、MM2657、MM1332、MM2573、MM1034、MM2606、MM0247、MM0444、MM0872、MM0927、MM1363、MM2394、MM2895、MM3179、MM1005、MM3233、MM1550、MM0359、MM0361、MM1586、MM1863、MM2851、MM2853、MM3117、MM0116、MM0289、MM0346、MM1903、MM3195、MM3170、MM1085、MM0386、MM2835、MM0811、MM1042、MM1027、MM2184、MM1028、MM0432、MM2546、MM1614、MM1772、MM0692、MM0146、MM0345、MM0369、MM1554、MM2854、MM1094、MM2042、MM3115、Msp_0061、Msp_0120、Msp_1519、Msp_0293、Msp_1556、Msp_0769、Msp_0168、Msp_0614、Msp_0518、Msp_0122、Msp_0383、Msp_1218、Msp_0446、Msp_0265、Msp_0608、Msp_1143、Msp_1207、Msp_0248、Msp_0512、Msp_0823、Msp_1188、Msp_0235、Msp_0194、Msp_1057、Msp_1097、Msp_0717、Msp_0971、Msp_1360、Msp_1272、Msp_1125、Msp_0149、Mhun_0040、Mhun_0316、Mhun_0873、Mhun_1073、Mhun_1644、Mhun_2448、Mhun_2633、Mhun_2472、Mhun_0365、Mhun_0919、Mhun_0576、Mhun_0165、Mhun_2458、Mhun_0842、Mhun_0941、Mhun_1324、Mhun_1346、Mhun_2089、Mhun_1313、Mhun_1731、Mhun_1706、Mhun_0152、Mhun_0501、Mhun_1037、Mhun_2548、Mhun_2928、Mhun_3036、Mhun_0241、Mhun_1541、Mhun_2190、Mhun_0646、Mhun_1347、Mhun_1533、Mhun_1553、Mhun_1866、Mhun_1954、Mhun_0253、Mhun_1259、Mhun_1451、Mhun_2502、Mhun_0684、Mhun_2259、Mhun_0763、Mhun_1327、Mhun_1530、Mhun_2935、Mhun_2804、Mhun_0568、Mhun_0593、Mhun_1236、Mhun_1656、Mhun_2481、Mhun_2797、Mhun_0497、Mhun_0575、Mhun_0588、NEQ328、NEQ229、NEQ348、NEQ288、NEQ453、NEQ143、NEQ039、NEQ276、NEQ098、NEQ541、NP1838A、NP2534A、NP3936A、NP6056A、NP2558A、NP1144A、NP0458A、NP2490A、NP2664A、NP3370A、NP0078A、NP5052A、NP4026A、NP6200A、NP0924A、NP4828A、NP2752A、NP6106A、NP2470A、NP2474A、NP0316A、NP0252A、NP5326A、NP1048A、NP2958A、NP5152A、NP4632A、NP3636A、NP3734A、NP4552A、NP5064A、NP1496A、NP4726A、NP2878A、NP0136A、NP0162A、NP0654A、NP1532A、NP1538A、NP1564A、NP2794A、NP4286A、NP4406A、NP5130A、NP5298A、NP6030A、NP6220A、NP4436A、NP1320A、NP2146A、NP3466A、NP4796A、NP5168A、NP3046A、NP2812A、NP3608A、NP2618A、NP6176A、NP3330A、NP7054A、NP2762A、NP4124A、NP3490A、NP1128A、NP1628A、NP2114A、NP0674A、NP2366A、NP3002A、NP3776A、NP4444A、NP1296A、NP1064A、NP4080A、NP4082A、NP0534A、NP2466A、NP3718A、NP
5096A、NP2220A、NP5186A、NP1684A、NP2246A、NP4822A、NP4326A、NP4106A、NP2518A、NP5272A、NP6088A、NP4258A、PTO0082、PTO0457、PTO0754、PTO0795、PTO0420、PTO1287、PTO0595、PTO0891、PTO0200、PTO1201、PTO0428、PTO0376、PTO0514、PTO0375、PTO0781、PT01148、PTO0979、PTO0276、PTO0843、PTO0557、PTO1105、PTO1211、PTO1517、PTO1052、PTO1150、PTO0114、PTO1041、PTO1176、PTO0063、PTO0799、PTO1388、PTO1389、PTO0914、PTO1110、PTO1216、PTO0675、PTO1123、PTO0506、PTO1258、PTO1372、PTO0363、PTO1340、PTO1338、PTO1067、PTO1454、PTO1523、PTO0576、PTO0198、PAE0731、PAE0738、PAE1612、PAE2042、PAE2911、PAE1948、PAE2655、PAE0385、PAE2225、PAE3116、PAE2186、PAE1103、PAE1592、PAE1848、PAE3387、PAE1507、PAE1986、PAE3469、PAE3471、PAE0659、PAE1443、PAE1484、PAE0296、PAE2022、PAE2357、PAE1544、PAE0640、PAE2309、PAE3163、PAE2449、PAE3605、PAE0783、PAE1627、PAE1638、PAE2071、PAE3208、PAE0019、PAE0813、PAE3327、PAE0146、PAE2679、PAE2684、PAE1218、PAE1760、PAE0013、PAE3437、PAE2640、PAE3378、PAE2164、PAE0171、PAE0170、PAE3329、PAE2120、PAE1645、PAE0781、PAE2282、Pars_0006、Pars_0433、Pars_0703、Pars_0836、Pars_0990、Pars_1924、Pars_2088、Pars_2298、Pars_0264、Pars_2028、Pars_0627、Pars_1855、Pars_2059、Pars_1853、Pars_0399、Pars_0425、Pars_1561、Pars_2084、Pars_0343、Pars_0668、Pars_2155、Pars_0438、Pars_1526、Pars_2364、Pars_1428、Pars_0037、Pars_1981、Pars_1988、Pars_2104、Pars_0057、Pars_0792、Pars_0504、Pars_0550、Pars_1742、Pars_1776、Pars_0311、Pars_0752、Pars_1087、Pars_1872、Pars_1005、Pars_0806、Pars_2186、Pars_2187、Pars_1743、Pars_2132、Pars_1649、Pars_1976、Pars_0035、Pars_1810、Pars_2125、Pcal_0142、Pcal_0905、Pcal_0946、Pcal_0412、Pcal_0495、Pcal_0687、Pcal_1273、Pcal_0822、Pcal_1595、Pcal_1185、Pcal_0610、Pcal_1183、Pcal_2085、Pcal_0796、Pcal_0536、Pcal_1689、Pcal_0008、Pcal_1198、Pcal_1653、Pcal_0295、Pcal_1924、Pcal_1927、Pcal_0200、Pcal_0589、Pcal_0596、Pcal_2145、Pcal_0791、Pcal_0023、Pcal_1415、Pcal_1735、Pcal_0266、Pcal_0346、Pcal_0543、Pcal_0792、Pcal_1032、Pcal_0159、Pcal_1078、Pcal_1890、Pcal_1316、Pcal_1055、Pcal_0584、Pcal_1734、Pcal_2147、Pcal_1638、Pcal_2070、Pisl_1759、Pisl_2001、Pisl_0858、Pisl_1838、Pisl_0307、Pisl_0653、Pisl_1426、Pisl_1248、Pisl_1639、Pisl_1808、Pisl_0995、Pisl_1590、Pisl_0997、Pisl_0709、Pisl_1563、Pisl_1834、Pisl_1578、Pisl_0622、Pisl_1613、Pisl_0725、Pisl_1023、Pisl_0410、Pisl_1076、Pisl_1655、Pisl_1662、Pisl_1854、Pisl_0045、Pisl_1100、Pisl_0810、Pisl_0572、Pisl_1971、Pisl_1303、Pisl_1717、Pisl_0038、Pisl_0979、Pisl_0565、Pisl_1878、Pisl_0807、Pisl_1975、Pisl_1974、Pisl_0573、Pisl_0955、Pisl_1667、Pisl_1074、Pisl_1008、Pisl_1250、PAB2298、PAB1869、PAB0625、PAB0751、PAB1002、PAB2328、PAB0125、PAB0208、PAB0619、PAB1229、PAB1227、PAB0108、PAB0322、PAB0392、PAB2312、PAB7115、PAB2062.1n、PAB1938、PAB1236、PAB2257、PAB7359、PAB2299、PAB0758a、PAB3089、PAB3117、PAB0960、PAB1522.1n、PAB2324、PAB0714、PAB2311、PAB1533、PAB0211、PAB2104、PAB2035、PAB0475、PAB0842、PAB0668、PAB7155、PAB3293、PAB0917、PAB0661、PAB0953、PAB1243、PAB1544、PAB0331、PAB1922、PAB7338、PAB0603、PAB1517、PAB1726、PAB1641、PAB1642、PAB0976、PAB1912、PAB0950、PAB0838、PF0007、PF0230、PF1072、PF1406、PF2051、PF0113、PF0232、PF1790、PF1088、PF0095、PF1734、PF0054、PF1543、PF1732、PF0250、PF0739、PF1231、PF1601、PF1022、PF1893、PF0607、PF0829、PF1722、PF1831、PF0322、PF0524、PF2053、PF0851、PF1194、PF0055、PF0505、PF0512、PF1386、PF1735、PF1794、PF1851、PF0691、PF0487、PF0988、PF1029、PF2062、PF0263、PF0709、PF1476、PF0584、PF1198、PF0535、PF1295、PF1338、PF1337、PF0687、PF1377、PF0491、PF0496、PF0661、PF1743、PF0124、PF0649、PH0062、PH1101、PH0199、PH0289、PH0825、PH1061、PH1406、PH1744、PH1930、PH1932、PH0977、PH0952、PH0180、PH1692、PH0045、PH1856.1n、PH0061、PHS045、PH1592、PH1916、PH0140、PH1519、PHS023、PH1055、PHS034、PHS051、PHS046、PH0601、PHS024、PH0468、PH1163、PH0046、PH0787、PH0783、PH1471、PH1691、PH1748、PH1808、PH0660、PH0804、PH0995、PH0614、PH0914、PH0718.1n、PH1080、PH0763、PH1009、PH1161、PH1160、PH1482、PH0864、PH0619、PH0751、PH0799、PH1034、PH0588、Smar_0567、Smar_0017、Smar_0429、Smar_1295、Smar_0048、Smar_0184、Smar_0954、Smar_1451、Smar_0205、Smar_0336、Smar_0366、Smar_1141、Smar_0476、Smar_0879、Smar_0338、Smar_0194、Smar_0612、Smar_0915、Smar_1254、Smar_1341、Smar_0279、Smar_1409、Smar_0319、Smar_0758、Smar_1442、Smar_1514、Smar_1075、Smar_1322、Smar_0054、Smar_1137、Smar_1250、Smar_0918、Smar_0086、Saci_0006、Saci_0446、Saci_1068、Saci_1787、Saci_1979、Saci_0800、Saci_1710、Saci_2236、Saci_2266、Saci_2136、Saci_0992、Saci_0731、Saci_0752、Saci_1304、Saci_1588、Saci_0944、Saci_0843、Saci_0942、Saci_0264、Saci_1391、Saci_0476、Saci_1223、Saci_0112、Saci_0048、Saci_1851、Saci_0455、Saci_2061、Saci_2116、Saci_2167、Saci_2183、Saci_2296、Saci_0655、Saci_1344、Saci_1505、Saci_2359、Saci_1192、Saci_2313、Saci_0161、Saci_0102、Saci_0133、Saci_0874、Saci_1219、Saci_1482、Saci_1670、Saci_1956、Saci_2112、Saci_0488、Saci_0483、Saci_1180、Saci_1171、Saci_1186、Saci_1242、Saci_0489、Saci_1005、Saci_2352、Saci_0380、Saci_1336、Saci_1230、Saci_2283、Saci_1107、Saci_0866、Saci_1341、Saci_0652、Saci_0842、Saci_1161、SSO0458、SSO0620、SSO9953、SSO2688、SSO0200、SSO1423、SSO2114、SSO2347、SSO3103、SS05522、SSO0977、SSO0606、SSO2131、SSO10340、SSO0157、SSO6024、SSO0659、SSO5826、SSO10342、SSO3242、SSO0669、SSO2273、SSO2244、SSO1589、SSO1255、SSO0447、SSO0785、SSO1008、SSO1219、SSO1306、SSO1536、SSO2058、SSO3061、SSO3080、SSO1868、SSO3097、SSO2474、SSO3188、SSO0107、SSO0270、SSO0387、SSO0942、SSO1066、SSO0040、SSO1264、SSO1384、SSO1750、SSO1897、SSO2090、SSO2132、SSO2933、SSO2992、SSO2897、SSO3176、SSO0048、SSO0365、SSO1082、SSO1108、SSO1352、SSO1101、SSO1110、SSO2652、SSO1695、SSO1748、SSO2957、SSO2327、SSO0038、SSO0049、
SSO0994、SSO2138、SSO2571、SSO0951、SSO2206、SSO2089、SSO2598、SSO2506、SSO0446、SSO0946、SSO0266、SSO0426、SSO2073、ST0236、ST1060、ST1064、ST1076、ST1486、ST1604、ST1889、STS229、ST0720、ST0173、STS095、ST2514、ST1022、ST2372、ST0193、ST0489、ST1115、ST1301、STS042、ST1473、STS071、STS074、STS163、STS072、STS250、STS248、ST2039、ST2236、ST2114、ST2562、ST0051、ST0164、ST0722、ST2550、ST1593、ST0256、ST0331、ST1268、ST2084、ST2190、ST1409、ST0808、STS035、ST0758、ST1043、ST1386、ST1710、ST1716、ST1867、ST1890、ST2388、STS086、ST0749、ST0837、ST0980、ST2050、ST0757、ST0766、ST2210、ST1773、ST1340、ST1054、ST1275、ST1007、ST1041、ST0684、ST0072、ST0349、ST1271、ST0334、ST1630、ST0371、TK0063、TK0559、TK1041、TK1261、TK1826、TK1881、TK2190、TK1086、TK1883、TK1955、TK2291、TK2134、TK1285、TK1487、TK0168、TK1331、TK0567、TK0834、TK1491、TK1210、TK2110、TK2052、TK0143、TK1413、TK2289、TK2270、TK1815、TK1439、TK0695、TK1259、TK0107、TK0448、TK1057、TK1058、TK1272、TK0697、TK0126、TK0539、TK1266、TK1688、TK2197、TK2218、TK1489、TK1339、TK0142、TK0169、TK1246、TK0770、TK1494、TK1924、TK2107、TK1143、TK1654、TK0151、TK0779、TK2151、TK0132、TK2287、TK1280、TK2024、TK0471、TK1769、TK1913、TK1050、Tpen_0466、Tpen_0552、Tpen_0860、Tpen_1509、Tpen_0232、Tpen_0836、Tpen_1499、Tpen_0577、Tpen_0018、Tpen_0579、Tpen_0150、Tpen_0366、Tpen_0869、Tpen_0668、Tpen_0348、Tpen_1236、Tpen_0124、Tpen_0102、Tpen_0973、Tpen_1621、Tpen_0378、Tpen_0538、Tpen_0707、Tpen_0776、Tpen_0069、Tpen_0090、Tpen_0173、Tpen_1796、Tpen_1358、Tpen_0115、Tpen_1464、Tpen_1595、Tpen_1401、Tpen_0901、Tpen_1818、Tpen_0293、Tpen_0690、Tpen_0374、Tpen_0710、Tpen_0070、Tpen_1551、Tpen_1591、Tpen_1154、Tpen_1562、Ta0472、Ta0731、Ta1110、Ta0115、Ta1173、Ta1443、Ta0185、Ta0678、Ta0608、Ta0257、Ta0981、Ta0093、Ta0550m、Ta0842、Ta0872、Ta1362m、Ta0736、Ta1394、Ta0166、Ta0675、Ta0748、Ta1231、Ta1186、Ta0106、Ta0948、Ta1282m、Ta1363、Ta0131、Ta0320m、Ta0411、Ta1064、Ta1166、Ta1218、Ta1503、Ta0201、Ta0346、Ta1496、Ta0868m、Ta1061m、Ta0825、Ta0795、Ta0199、Ta1485、Ta0945、Ta0940、Ta0134、Ta0685、Ta0890、Ta1324、TVN0192、TVN0983、TVN1251、TVN0658、TVN0295、TVN1196、TVN1337、TVN1127、TVN0160、TVN0945、TVN0938、TVN0292、TVN0236、TVN0364、TVN0447、TVN0906、TVN1422、TVN0185、TVN0291、TVN0514、TVN1093、TVN0210、TVN1272、TVN0519、TVN0603、TVN1246、TVN1408、TVN1203、TVN1162、TVN0516、TVN1265、TVN1392、TVN1493、TVN0934、TVN0728、TVN0704、TVN1394、TVN0084、TVN1083、TVN1089、TVN0213、TVN1149、TVN0972、TVN0377、LRC567、RCIX1274、RCIX1420、RCIX1655、RC1X1698、RCIX2213、RCIX2336、RRC298、RRC486、RRC76、RCIX1140、RCIX2193、RCIX670、RCIX684、RC1X808、RC1X820、LRC582、RCIX785、LRC109、RCIX103、RCIX105、RCIX106、RCIX1508、RCIX1739、RCIX2247、RRC465、RCIX1740、RCIX2328、RRC178、LRC575、RCIX1349、RCIX1520、LRC520、RCIX125、RCIX1430、RCIX148、RCIX1527、RCIX1743、RCIX2456、RCIX449、RCIX571、RRC212、RCIX960、LRC190、RCIX1230、RCIX414、RCIX1747、LRC319、RCIX1292、RCIX1376、RCIX2173、RCIX2196、RRC154、RCIX1238、RCIX1068、RCIX1190、RCIX1914、RCIX2177、RCIX824、RCIX989、RCIX2108、LRC274、LRC304、RCIX1189、RCIX1785、RCIX1790、及びRCIX90などの古細菌TFを改変したものである。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び/又はスイッチは、例えば、Abh、AbrB、AcoR、AdaA、AhrC、AlaR、AlsR、AnsR、AraR、ArfM、ArsR、AzlB、BirA、BkdR、BltR、BmrR、CcpA、CcpB、CcpC、CggR、CheB、CheV、CheY、CitR、CitT、CodY、ComA、ComK、ComZ、CssR、CtsR、DctR、DegA、DegU、DeoR、DnaA、ExuR、FNR、FruR、Fur、GabR、GerE、GlcK、GlcR、GlcT、GlnR、GlpP、GltC、GltR、GntR、GutR、Hbs、Hpr、HrcA、HtrA、HutP、HxlR、lolR、Ipi、KdgR、KipR、LacR、LevR、LexA、LicR、LicT、LmrA、LrpA、LrpB、LrpC、LytR、LytT、ManR、MecA、Med、MntR、MsmR、Mta、MtlR、MtrB、NhaX、PadR、PaiA、PaiB、PerR、ファージPBSX転写調節因子、PhoP、PksA、PucR、PurR、PyrR、RbsR、ResD、Rho、RocR、Rok、RplT、RsfA、SacT、SacV、SacY、SenS、SigA、SigB、SigD、SigE、SigF、SigG、SigH、SigI、SigK、SigL、SigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、SinR、Slr、SplA、Spo0A、Spo0F、SpoIIID、SpoVT、TenA、TenI、TnrA、TreR、TrnB-Gly1、TrnB-Phe、TrnD-Cys、TrnD-Gly、TrnD-Phe、TrnD-Ser、TrnD-Trp、TrnD-Tyr、TrnI-Gly、TrnI-Thr、TrnJ-Gly、TrnS-Leu2、TrnSL-Tyr1、TrnSL-Val2、Xpf、Xre、XylR、YacF、YazB、YbaL、YbbB、YbbH、YbdJ、YbfA、YbfI、YbfP、YbgA、YcbA、YcbB、YcbG、YcbL、YccF、YccH、YceK、YcgE、YcgK、YclA、YclJ、YcnC、YcnK、YcxD、YczG、YdcH、YdcN、YdeB、YdeC、YdeE、YdeF、YdeL、YdeP、YdeS、YdeT、YdfD、YdfF、YdfI、YdfL、YdgC、YdgG、YdgJ、YdhC、YdhQ、YdhR、YdiH、YdzF、YerO、YesN、YesS、YetL、YezC、YezE、YfhP、YfiA、YfiF、YfiK、YfiR、YfiV、YfmP、YhbI、YhcB、YhcF、YhcZ、YhdE、YhdI、YhdQ、YhgD、YhjH、YhjM、YisR、YisV、YjbD、YjdI、YkmA、YkoG、YkoM、YkvE、YkvN、YkvZ、YlaC、YlbO、YlpC、YmfC、YneI、YoaU、YobD、YobQ、YocG、YodB、YofA、YonR、YopO、YopS、YozA、YozG、YpbH、YplP、YpoP、YpuH、YqaE、YqaF、YqaG、YqfL、YqzB、YraB、YraN、YrdQ、YrhI、YrhM、YrkP、YrxA、YrzC、YsiA、YsmB、YtcD、YtdP、YtlI、YtrA、YtsA、YttP、YtzE、YufM、YulB、YurK、YusO、YusT、YuxN、YvaF、YvaN、YvaO、YvaP、YvbA、YvbU、YvcP、YvdE、YvdT、Yvfl、YvfU、YvhJ、YvkB、YvmB、YvnA、YvoA、YvqC、YvrH、YvrI、YvyD、YvzC、YwaE、YwbI、YwcC、YwfK、YwgB、YwhA、YwoH、YwqM、YwrC、YwtF、YxaD、YxaF、YxbF、YxdJ、YxjL、YxjO、YyaN、YybA、YybE、YybR、YycF、YydK、及びZurなどの枯草菌(B.subtilis)TFを改変したものである。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び/又はスイッチは、例えば、AT1G01060、AT1G01380、AT1G01530、AT1G02340、AT1G04370、AT1G06160、AT1G07640、AT1G09530、AT1G09770、AT1G10170、AT1G12610、AT1G12860、AT1G12980、AT1G13960、AT1G14350、AT1G14920、AT1G15360、AT1G16490、AT1G18570、AT1G19220、AT1G19350、AT1G19850、AT1G21970、AT1G22070、AT1G23420、AT1G24260、AT1G24590、AT1G25560、AT1G26310、AT1G26870、AT1G26945、AT1G27730、AT1G28300、AT1G30210、AT1G30330、AT1G30490、AT1G32330、AT1G32540、AT1G32640、AT1G32770、AT1G33240、AT1G34370、AT1G34790、AT1G35515、AT1G42990、AT1G45249、AT1G46768、AT1G47870、AT1G51700、AT1G52150、AT1G52880、AT1G52890、AT1G53230、AT1G53910、AT1G54060、AT1G55580、AT1G55600、AT1G56010、AT1G56650、AT1G62300、AT1G62360、AT1G63650、AT1G65620、AT1G66350、AT1G66390、AT1G66600、AT1G67260、AT1G68640、AT1G69120、AT 1G69180、AT1G69490、AT1G69600、AT1G70510、AT1G71030、AT1G71692、AT1G71930、AT1G73730、AT1G74930、AT1G75080、AT1G76420、AT1G77850、AT1G78600、AT1G79180、AT1G79580、AT1G79840、AT2G01500、AT2G01570、AT2G01930、AT2G02450、AT2G03340、AT2G16910、AT2G17950、AT2G20180、AT2G22300、AT2G22540、AT2G22630、AT2G22770、AT2G23760、AT2G24570、AT2G26150、AT2G27050、AT2G27300、AT2G27990、AT2G28160、AT2G28350、AT2G28550、AT2G28610、AT2G30250、AT2G30432、AT2G33810、AT2G33835、AT2G33860、AT2G33880、AT2G34710、AT2G36010、AT2G36270、AT2G36890、AT2G37260、AT2G37630、AT2G38470、AT2G40220、AT2G40950、AT2G42200、AT2G42830、AT2G43010、AT2G45190、AT2G45660、AT2G46270、AT2G46410、AT2G46680、AT2G46770、AT2G46830、AT2G46870、AT2G46970、AT2G47190、AT2G47460、AT3G01140、AT3G01470、AT3G02990、AT3G03450、AT3G04670、AT3G07650、AT3G10800、AT3G11440、AT3G12250、AT3G13540、AT3G13890、AT3G15170、AT3G15210、AT3G15500、AT3G15510、AT3G16770、AT3G16857、AT3G17609、AT3G18990、AT3G19290、AT3G20310、AT3G20770、AT3G22170、AT3G23130、AT3G23250、AT3G24650、AT3G25710、AT3G26744、AT3G26790、AT3G27785、AT3G27810、AT3G27920、AT3G28470、AT3G28910、AT3G44750、AT3G46640、AT3G48160、AT3G48430、AT3G49940、AT3G50410、AT3G51060、AT3G54220、AT3G54320、AT3G54340、AT3G54620、AT3G55370、AT3G56400、AT3G58070、AT3G58780、AT3G59060、AT3G61850、AT3G61890、AT3G61910、AT3G62420、AT4G00120、AT4G00180、AT4G00220、AT4G01250、AT4G01540、AT4G02560、AT4G04450、AT4G08150、AT4G09820、AT4G09960、AT4G15090、AT4G16110、AT4G16780、AT4G17750、AT4G18960、AT4G20380、AT4G21330、AT4G21750、AT4G23550、AT4G23810、AT4G24020、AT4G24240、AT4G24470、AT4G24540、AT4G25470、AT4G25480、AT4G25490、AT4G25530、AT4G26150、AT4G27330、AT4G27410、AT4G28110、AT4G28610、AT4G30080、AT4G31550、AT4G31800、AT4G31920、AT4G32730、AT4G32880、AT4G32980、AT4G34000、AT4G34590、AT4G34990、AT4G35900、AT4G36730、AT4G36870、AT4G36920、AT4G36930、AT4G37540、AT4G37650、AT4G37750、AT4G38620、AT5G01900、AT5G02030、AT5G02470、AT5G03150、AT5G03680、AT5G03790、AT5G04240、AT5G05410、AT5G06070、AT5G06100、AT5G06650、AT5G06950、AT5G06960、AT5G07100、AT5G07690、AT5G07700、AT5G08130、AT5G09750、AT5G10140、AT5G10510、AT5G11260、AT5G11510、AT5G12870、AT5G13790、AT5G14010、AT5G14750、AT5G14960、AT5G15840、AT5G15850、AT5G16560、AT5G16820、AT5G17300、AT5G17430、AT5G18560、AT5G18830、AT5G20240、AT5G20730、AT5G21120、AT5G22220、AT5G22570、AT5G23000、AT5G23260、AT5G26660、AT5G35550、AT5G35770、AT5G37020、AT5G37260、AT5G40330、AT5G40350、AT5G40360、AT5G41315、AT5G41410、AT5G42630、AT5G43270、AT5G45980、AT5G47220、AT5G48670、AT5G51990、AT5G52830、AT5G53200、AT5G53210、AT5G53950、AT5G54070、AT5G56110、AT5G56270、AT5G56860、AT5G59570、AT5G59820、AT5G60690、AT5G60890、AT5G60910、AT5G61270、AT5G61420、AT5G61850、AT5G62000、AT5G62020、AT5G62380、AT5G62430、AT5G65050、AT5G66870、AT5G67300、及びAT5G67420などのシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)TFを改変したものである。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び/又はスイッチは、例えば、CG10325、CG11648、CG6093、CG3796、CG9151、CG15845、CG3935、CG3166、CG8376、CG3258、CG6677、CG3629、CG1034、CG3578、CG11491、CG12653、CG1759、CG6384、CG11924、CG4881、CG8367、CG17894、CG8669、CG2714、CG5893、CG9745、CG5102、CG2189、CG33183、CG9908、CG10798、CG1897、CG11094、CG2711、CG10604、CG32346、CG5714、CG1765、CG7383、CG32180、CG8127、CG1007、CG2988、CG9015、CG14941、CG8365、CG2328、CG8933、CG10488、CG6502、CG10002、CG2707、CG10034、CG2047、CG4059、CG33133、CG9656、CG2692、CG3388、CG7952、CG6494、CG11607、CG9786、CG4694、CG9768、CG1619、CG5748、CG17117、CG17835、CG2275、CG33956、CG10197、CG4717、CG4761、CG3340、CG3647、CG3758、CG4158、CG4148、CG7664、CG10699、CG5954、CG17743、CG1264、CG3839、CG32120、CG1689、CG8346、CG6096、CG8361、CG1705、CG14548、CG8328、CG8333、CG2050、CG18740、CG9045、CG10250、CG11450、CG6534、CG3851、CG1133、CG7467、CG6824、CG5109、CG12212、CG3978、CG17077、CG9610、CG8246、CG6716、CG7230、CG6348、CG10393、CG1849、CG9495、CG1030、CG8544、CG7734、CG1641、CG16738、CG3956、CG3836、CG11121、CG7847、CG3992、CG7938、CG17958、CG6993、CG8573、CG8599、CG8409、CG8068、CG11502、CG4216、CG16778、CG1378、CG6883、CG8651、CG1374、CG1856、CG10619、CG2956、CG10388、CG2762、CG4380、CG6172、CG7803、CG1046、CG1048、CG3411、CG12154、CG7895、CG3827、CG11387、CG17950、CG12287、CG7450、CG2368、CG6143、CG6338、CG2939、CG6464、CG17228、CG1322、CG1449、CG7672、CG14307、CG7771、CG5403、CG3497、CG5488、CG4220、CG2125、CG18412、CG7902、CG7937、CG18023、CG9097、CG2102、CG1130、CG3242、CG10021、CG1132、CG3668、CG11921、CG11922、CG9310、CG8887、CG3114、CG6634、CG1464、CG11049、CG14513、CG3090、CG8404、CG3886、CG12052、CG4354、CG1454、CG7018、CG5583、CG2914、CG4952、CG5683、CG4491、CG33152、CG9930、CG5441、CG6570、CG3905、CG8704、CG17921、CG4817、CG7562、CG2851、CG5965、CG7508、CG5580、CG5557、CG6964、CG5575、CG6794、CG2655、CG3052、CG6545、CG7187、CG17161、CG8625、CG12399、CG1775、CG1429、CG31240、CG7260、CG5529、CG4654、CG12223、CG6376、CG5247、CG11494、CG33261、CG12296、CG8103、CG1072、CG7959、CG7960、CG8567、CG18389、CG11992、CG5069、CG12245、CG10601、CG6103、CG1864、CG2678、CG5264、CG11987、CG6215、CG8522、CG7199、CG11783、CG8396、CG11798、CG9019、CG4029、CG10036、CG7951、CG7659、CG1650、CG10159、CG15319、CG5838、CG9398、CG7413、CG5393、CG10571、CG10605、CG14029、CG6604、CG17888、CG13598、CG4257、CG13951、CG9648、CG11186、CG3858、CG9696、CG5799、CG14938、CG1343、CG6312、CG5201、CG10052、CG8013、CG1447、CG32788、CG11202、CG9415、CG1507、CG10270、CG3998、CG5005、CG10269、CG7391、CG8667、CG8727、CG5206、CG13316、CG7807、CG2819、CG3848、CG16902、CG6269、CG10016、CG7760、CG9653、CG1414、CG15552、CG4013、CG8524、CG1071、CG5649、CG2712、CG1605、CG11182、CG18455、CG4303、CG9102、CG17829、CG2932、CG11551、CG2262、CG8474、CG6352、CG6121、CG7958、CG4143、CG11354、CG5935、CG8290、CG32575、CG9418、CG11352、CG3871、CG6627、CG1024、CG8108、CG2790、CG1966、CG11194、CG9776、CG7758、CG8208、CG2244、CG5067、CG5229、CG18783、CG18124、CG15286、CG11405、CG3268、CG11902、CG5133、CG15269、CG3491、CG17328、CG4185、CG16863、CG12630、CG32904、CG17594、CG1922、CG13906、CG18024、CG9233、CG12690、CG2875、CG17592、CG4136、CG12236、CG3726、CG3815、CG3847、CG14441、CG14438、CG3075、CG4575、CG3032、CG4617、CG9650、CG2116、CG2120、CG2129、CG15336、CG10959、CG18262、CG11294、CG12075、CG15365、CG7041、CG7055、CG2889、CG9817、CG2202、CG11122、CG11696、CG11695、CG11085、CG4404、CG4318、CG15749、CG1716、CG11172、CG11071、CG6211、CG9215、CG8119、CG8944、CG8578、CG8909、CG8924、CG9609、CG6769、CG5927、CG6470、CG7101、CG7556、CG14200、CG9571、CG11710、CG1529、CG11617、CG4133、CG31670、CG11723、CG17257、CG3407、CG17612、CG15435、CG15436、CG9088、CG13775、CG9200、CG4496、CG3838、CG13123、CG18619、CG18144、CG5034、CG12299、CG4621、CG6686、CG6792、CG9932、CG5204、CG9305、CG7099、CG5953、CG17912、CG5545、CG10348、CG10431、CG10446、CG17568、CG10263、CG10366、CG10462、CG10447、CG10631、CG10949、CG9342、CG18362、CG15216、CG1832、CG3136、CG2682、CG1845、CG1621、CG1620、CG1603、CG1602、CG12769、CG11641、CG8643、CG8216、CG1663、CG18446、CG12744、CG1407、CG18011、CG12942、CG12391、CG13204、CG12370、CG8821、CG8819、CG3850、CG4676、CG6061、CG6701、CG17385、CG17390、CG10209、CG8089、CG8092、CG16801、CG8314、CG8388、CG7786、CG4282、CG15710、CG17287、CG18468、CG4903、CG15073、CG11906、CG13424、CG9954、CG10543、CG9437、CG10321、CG10318、CG13493、CG11301、CG10344、CG9895、CG9890、CG9876、CG3941、CG5591、CG3065、CG3328、CG11414、CG4707、CG6905、CG1233、CG17181、CG13897、CG9139、CG2199、CG12104、CG1244、CG15812、CG14962、CG14965、CG12029、CG12605、CG15011、CG5249、CG17334、CG13287、CG13296、CG10274、CG7386、CG10147、CG8591、CG7404、CG7015、CG6683、CG6765、CG5093、CG5187、CG3891、CG3445、CG3654、CG7839、CG6272、CG11799、CG7368、CG4328、CG10704、CG10654、CG14117、CG17361、CG17359、CG7345、CG3919、CG6854、CG13458、CG7372、CG15715、CG9705、CG32171、CG18265、CG7271、CG4076、CG8765、CG11456、CG10565、CG7204、CG11247、CG14451、CG14655、CG14667、CG12162、CG10979、CG10296、CG9727、CG10267、CG33323、CG2702、CG9638、CG7963、CG8145、CG11762、CG8159、CG9793、CG9797、CG8359、CG11966、CG11984、CG11033、CG12952、CG16779、CG8301、CG8319、CG16899、CG8478、CG8484、CG6254、CG4570、CG4820、CG6689、CG6791、CG14710、CG6808、CG14711、CG6813、CG18476、CG6913、CG10042、CG5196、CG5245、CG33976、CG7518、CG15889、CG3143、CG7987、CG14860、CG6654、CG6276、CG5083、CG10278、CG5952、CG10309、CG3995、CG17803、CG17806、CG17802、CG17801、CG7357、CG7785、CG18599、CG7691、CG17186、CG4424、CG4854、CG4413、CG4936、CG4360、CG4217、CG15696、CG5737、CG7056、CG7045、CG7046、CG6990、CG4677、CG33336、CG4374、CG6129、CG5669、CG13617、CG13624、CG6892、CG11375、CG10669、CG4553、CG4730、CG17198、CG17197、CG17195、CG4956、CG32474、CG3350、CG5586、CG1647、CG14514、CG15504、CG15514、CG
7928、CG2229、CG12071、CG11317、CG12054、CG1792、CG2052、CG11093、CG11152、CG11153、CG17172、CG6889、CG3743、CG13475、CG3526、CG11398、CG12767、CG15367、CG33473、CG14767、CG3576、CG12659、CG13109、CG12809、CG8817、CG8254、CG16910、CG3274、CG18764、CG32139、CG32577、CG2380、CG15736、CG13399、CG4427、CG12219、CG18647、CG31753、CG33720、CG30011、CG30020、CG30077、CG30401、CG30403、CG30420、CG30431、CG30443、CG31169、CG31224、CG31365、CG31388、CG31392、CG31441、CG31460、CG31481、CG31510、CG31612、CG31632、CG31642、CG31782、CG31835、CG31875、CG31955、CG32006、CG32050、CG32105、CG32121、CG32264、CG32296、CG32532、CG32719、CG32767、CG32772、CG32778、CG32830、CG33695、CG32982、CG33178、CG33213、CG33221、CG33520、CG33525、CG33557、CG33936、CG33980、CG34031、CG12632、CG17469、CG34100、CG34145、CG34149、CG34340、CG34346、CG34367、CG34376、CG34395、CG34403、CG34406、CG34407、CG34415、CG34419、CG34421、CG34422、CG8961、CG9397、CG10037、CG31258、CG31666、CG12196、CG6930、CG12238、CG33546、CG42234、CG34360、CG42267、CG42277、CG42281、CG42311、CG42332、CG42344、CG4807、CG7752、CG12701、CG17100、CG11971、CG42516、CG42515、CG6667、CG1028、CG3281、CG12124、CG42599、CG8506、CG17836、CG1070、及びCG8676などのキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)TFを改変したものである。
7928、CG2229、CG12071、CG11317、CG12054、CG1792、CG2052、CG11093、CG11152、CG11153、CG17172、CG6889、CG3743、CG13475、CG3526、CG11398、CG12767、CG15367、CG33473、CG14767、CG3576、CG12659、CG13109、CG12809、CG8817、CG8254、CG16910、CG3274、CG18764、CG32139、CG32577、CG2380、CG15736、CG13399、CG4427、CG12219、CG18647、CG31753、CG33720、CG30011、CG30020、CG30077、CG30401、CG30403、CG30420、CG30431、CG30443、CG31169、CG31224、CG31365、CG31388、CG31392、CG31441、CG31460、CG31481、CG31510、CG31612、CG31632、CG31642、CG31782、CG31835、CG31875、CG31955、CG32006、CG32050、CG32105、CG32121、CG32264、CG32296、CG32532、CG32719、CG32767、CG32772、CG32778、CG32830、CG33695、CG32982、CG33178、CG33213、CG33221、CG33520、CG33525、CG33557、CG33936、CG33980、CG34031、CG12632、CG17469、CG34100、CG34145、CG34149、CG34340、CG34346、CG34367、CG34376、CG34395、CG34403、CG34406、CG34407、CG34415、CG34419、CG34421、CG34422、CG8961、CG9397、CG10037、CG31258、CG31666、CG12196、CG6930、CG12238、CG33546、CG42234、CG34360、CG42267、CG42277、CG42281、CG42311、CG42332、CG42344、CG4807、CG7752、CG12701、CG17100、CG11971、CG42516、CG42515、CG6667、CG1028、CG3281、CG12124、CG42599、CG8506、CG17836、CG1070、及びCG8676などのキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)TFを改変したものである。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサー及び/又はスイッチは、例えば、マウス遺伝子座11538、11568、11569、11614、11622、11624、11632、11634、11694、11695、11733、11736、11819、11835、11859、11863、11864、11865、11878、11906、11908、11909、11910、11911、11920、11921、11922、11923、11924、11925、11991、12013、12014、12020、12021、12022、12023、12029、12051、12053、12142、12151、12173、12180、12189、12192、12224、12265、12326、12355、12387、12393、12394、12395、12399、12400、12416、12417、12418、12454、12455、12566、12567、12572、12578、12579、12580、12581、12590、12591、12592、12606、12607、12608、12609、12611、12653、12677、12705、12753、12785、12848、12912、12913、12914、12915、12916、12951、13017、13018、13047、13048、13134、13163、13170、13172、13180、13196、13198、13345、13390、13392、13393、13394、13395、13396、13433、13435、13486、13494、13496、13555、13557、13559、13560、13591、13592、13593、13626、13653、13654、13655、13656、13661、13709、13710、13711、13712、13713、13714、13716、13796、13797、13798、13799、13813、13819、13864、13865、13871、13872、13875、13876、13982、13983、13984、14008、14009、14011、14013、14025、14028、14029、14030、14055、14056、14085、14105、14106、14154、14155、14200、14233、14234、14235、14236、14237、14238、14239、14240、14241、14247、14281、14282、14283、14284、14359、14390、14391、14457、14460、14461、14462、14463、14464、14465、14472、14489、14531、14534、14536、14581、14582、14605、14632、14633、14634、14659、14797、14815、14836、14842、14843、14884、14885、14886、14896、14912、15110、15111、15161、15163、15181、15182、15183、15184、15185、15193、15205、15206、15207、15208、15209、15213、15214、15218、15220、15221、15223、15227、15228、15229、15242、15248、15251、15258、15260、15273、15284、15285、15331、15353、15354、15361、15364、15370、15371、15372、15373、15375、15376、15377、15378、15379、15384、15394、15395、15396、15397、15398、15399、15400、15401、15402、15403、15404、15405、15407、15408、15410、15412、15413、15414、15415、15416、15417、15421、15422、15423、15424、15425、15426、15427、15429、15430、15431、15432、15433、15434、15436、15437、15438、15460、15499、15500、15563、15569、15900、15901、15902、15903、15904、15951、15976、16150、16151、16201、16348、16362、16363、16364、16371、16372、16373、16391、16392、16476、16477、16478、16596、16597、16598、16599、16600、16601、16656、16658、16761、16764、16814、16815、16825、16826、16842、16869、16870、16871、16872、16873、16874、16875、16876、16909、16911、16917、16918、16969、17095、17119、17121、17122、17125、17126、17127、17128、17129、17130、17131、17132、17133、17134、17135、17172、17173、17187、17188、17191、17192、17215、17216、17217、17218、17219、17220、17257、17258、17259、17260、17261、17268、17274、17283、17285、17286、17300、17301、17318、17341、17342、17344、17354、17355、17420、17425、17428、17480、17536、17537、17681、17684、17692、17701、17702、17703、17749、17764、17765、17859、17863、17864、17865、17869、17870、17876、17877、17878、17927、17928、17932、17933、17936、17937、17938、17977、17978、17979、17984、18002、18012、18013、18014、18018、18019、18020、18021、18022、18023、18024、18025、18027、18028、18029、18030、18032、18033、18034、18036、18037、18038、18044、18045、18046、18071、18072、18088、18089、18091、18092、18094、18095、18096、18109、18124、18128、18129、18131、18132、18140、18142、18143、18171、18181、18185、18193、18198、18227、18291、18292、18393、18412、18420、18423、18424、18426、18432、18503、18504、18505、18506、18507、18508、18509、18510、18511、18514、18515、18516、18519、18572、18606、18609、18612、18616、18617、18626、18627、18628、18667、18676、18685、18736、18740、18741、18742、18771、18789、18854、18933、18935、18983、18985、18986、18987、18988、18990、18991、18992、18993、18994、18995、18996、18997、18998、18999、19009、19013、19014、19015、19016、19017、19018、19049、19056、19060、19084、19099、19127、19130、19182、19184、19202、19213、19231、19290、19291、19326、19330、19377、19401、19411、19434、19645、19650、19651、19664、19668、19687、19696、19697、19698、19708、19712、19724、19725、19726、19727、19763、19820、19822、19826、19883、19885、20016、20017、20018、20019、20020、20021、20022、20024、20128、20174、20181、20182、20183、20185、20186、20204、20218、20220、20230、20231、20232、20289、20371、20375、20384、20409、20429、20439、20464、20465、20466、20467、20471、20472、20473、20474、20475、20476、20480、20481、20583、20585、20586、20587、20589、20591、20592、20602、20613、20638、20664、20665、20666、20667、20668、20669、20670、20671、20672、20673、20674、20675、20677、20678、20679、20680、20681、20682、20683、20687、20688、20689、20728、20787、20788、20807、20819、20833、20841、20842、20846、20847、20848、20849、20850、20851、20852、20893、20901、20904、20922、20923、20924、20997、21339、21340、21341、21343、21349、21350、21374、21375、21380、21382、21383、21384、21385、21386、21387、21388、21389、21399、21400、21401、21405、21406、21407、21408、21410、21411、21412、21413、21414、21415、21416、21417、21418、21419、21420、21422、21423、21425、21426、21427、21428、21429、21652、21674、21676、21677、21678、21679、21685、21780、21781、21783、21804、21807、21815、21833、21834、21835、21843、21847、21848、21849、21869、21885、21886、21887、21888、21907、21908、21909、21917、21929、21945、21981、22025、22026、22051、22057、22059、22061、22062、22088、22160、22200、22221、22255、22259、22260、22278、22282、22286、22326、22337、22383、22385、22431、22433、22608、22632、22634、22639、22640、22642、22646、22654、22658、22661、22666、22668、22678、22680、22685、22689、22691、22694、22695、22696、22697、22698、22700、22701、22702、22704、22709、22710、22712、22715、22717、22718、22719、22722、22750、22751、22754、22755、22756、22757、22758、22759、22761、22762、22764、22767、22768、22770、22771、22772、22773、22775、22776、22778、22779、22780、23808、23827、23849、23850、23856、23857、23871、23872、23885、23894、23942、23957、23958、23989、23994、24068、24074、2
4075、24113、24116、24135、24136、26356、26371、26379、26380、26381、26386、26404、26413、26417、26419、26423、26424、26427、26461、26465、26573、26754、26927、26939、27049、27056、27057、27059、27081、27140、27217、27223、27224、27274、27386、28019、29806、29808、29813、29861、29871、30046、30051、30794、30841、30923、30927、30928、30942、30944、30946、30951、50496、50524、50721、50754、50777、50783、50794、50796、50817、50868、50887、50907、50913、50914、50916、50996、51792、51813、52024、52040、52231、52502、52609、52615、52705、52708、52712、52897、53314、53317、53357、53380、53415、53417、53626、53868、53869、53970、53975、54006、54123、54131、54132、54139、54169、54343、54352、54388、54422、54446、54562、54601、54633、54678、54711、55927、55942、55994、56030、56070、56196、56198、56218、56220、56222、56233、56275、56309、56312、56314、56321、56353、56380、56381、56404、56406、56449、56458、56469、56484、56490、56501、56503、56505、56522、56523、56525、56613、56642、56707、56736、56771、56784、56787、56805、56809、56856、56869、57080、57230、57246、57314、57316、57376、57737、57745、57748、57756、57765、57782、58172、58180、58198、58202、58206、58234、58805、59004、59021、59024、59026、59035、59057、59058、60345、60406、60611、64050、64144、64290、64379、64383、64384、64406、64453、64685、65020、65247、65255、65256、65257、66056、66118、66136、66213、66233、66277、66352、66376、66420、66464、66491、66505、66556、66596、66622、66634、66642、66671、66698、66729、66799、66867、66880、66923、66930、66959、66970、66980、66985、67057、67065、67122、67150、67151、67155、67199、67235、67260、67279、67288、67367、67370、67379、67381、67389、67419、67439、67575、67657、67673、67692、67710、67815、67847、67873、67949、67985、67993、68040、68153、68196、68268、68346、68479、68558、68701、68705、68776、68839、68842、68854、68910、68911、68992、69020、69125、69167、69168、69188、69234、69241、69257、69260、69299、69317、69389、69539、69606、69656、69716、69790、69833、69890、69920、69944、70073、70122、70127、70315、70350、70392、70408、70428、70459、70497、70508、70601、70625、70637、70650、70673、70779、70796、70797、70823、70859、70981、71041,71063,71131,71137,71163、71176、71241,71280,71371,71375、71409、71458、71468、71592、71597、71702、71722、71752、71767、71777、71782、71793、71828、71834、71838、71839,71939、71949,71990,71991、72057、72074、72135、72180、72195、72199、72290、72293、72323、72325、72388、72459、72465、72475、72556、72567、72615、72720、72727、72739、72823、72949、72958、73178、73181、73340、73389、73451、73469、73503、73610、73614、73844、73845、73945、74007、74068、74106、74120、74123、74149、74164、74168、74197、74282、74318、74322、74326、74335、74352、74377、74481、74533、74561、74570、74838、75196、75199、75210、75291、75305、75339、75387、75480、75482、75507、75572、75599、75605、75646、75725、75901、76007、76022、76294、76308、76365、76389、76467、76572、76580、76793、76803、76804、76834、76893、76900、77057、77114、77117、77264、77286、77318、77480、77683、77889、77907、77913、78020、78088、78246、78251、78284、78455、78469、78541、78619、78656、78699、78703、78783、78829、78910、78912、78921、78929、79221、79233、79362、79401、80283、80509、80720、80732、80859、80902、81601、81630、81703、81845、81879、83383、83395、83396、83557、83602、83925、83993、84653、93674、93681、93686、93691、93759、93760、93761、93762、93837、93871、94047、94112、94187、94275、96979、97064、97165、98053、98403、99377、99730、100090、100563、100710、100978、101095、101206、102162、102209、102334、103136、103806、103889、104328、104349、104360、104383、104384、104394、104886、105377、105594、105859、106795、106894、107351、107433、107499、107503、107568、107586、107751、107765、107771、107889、107932、107951、108060、108098、108143、108655、108672、108857、109113、109115、109575、109594、109663、109676、109889、109910、109958、109972、109973、109995、110052、110061、110068、110109、110147、110506、110521、110616、110641、110647、110648、110784、110796、110805、110913、112077、114142、114565、114606、114642、114774、114889、116810、116848、116870、116871、116912、117168、117198、117590、118445、140477、140490、140500、140577、140743、170574、170644、170729、170740、170767、170787、170791、170826、170938、192195、192231、192285、192651、192657、193796、195333、208076、208258、208266、208292、208439、208677、208715、209011、209357、209361、209416、209446、209448、209707、210135、210162、211378、212168、212276、212391、212712、213010、213990、214105、214162、214384、214669、214899、215031、216151、216154、216285、216456、216558、216578、217031、217082、217127、217166、217558、218030、218440、218490、218624、218772、218989、219150、223227、223690、223701、223922、224419、224585、224656、224694、224829、224902、224903、225876、225895、225998、226049、226182、226442、226641、226747、226896、227099、227644、227656、227940、228136、228598、228731、228775、228790、228829、228839、228852、228869、228876、228880、228980、229004、229534、229663、229906、230073、230162、230587、230674、230700、230753、230908、230936、230991、231044、231051、231329、231386、231986、231991、232232、232337、232807、232853、232854、232878、232906、233056、233410、233490、233863、233887、233890、233908、233987、234725、234959、235028、235041、235050、235320、235442、235582、235623、235682、236193、237052、237336、237409、237615、237758、237960、238247、239099、239546、239652、240064、240120、240263、240427、240442、240476、240590、240690、241066、241447、241520、242523、242620、242705、243187、243833、243906、243931、243963、243983、244349、244713、244813、244954、245572、245583、245596、245688、245841、246086、246196、246198、246791、252829、260298、268281、268301、268396、268448、268564、268741、268903、268932、269252、269713、269870、270076、270627、271278、271305、272347、272359、272382、277353、319196、319207、319535、319594、319599、3
19601、319615、319695、319785、320067、320376、320429、320586、320595、320790、320799、320875、320995、328572、330301、330361、330502、332937、338353、347691、353187、353208、378435、381319、356626、及び386655などのマウスTFを改変したものである。
4075、24113、24116、24135、24136、26356、26371、26379、26380、26381、26386、26404、26413、26417、26419、26423、26424、26427、26461、26465、26573、26754、26927、26939、27049、27056、27057、27059、27081、27140、27217、27223、27224、27274、27386、28019、29806、29808、29813、29861、29871、30046、30051、30794、30841、30923、30927、30928、30942、30944、30946、30951、50496、50524、50721、50754、50777、50783、50794、50796、50817、50868、50887、50907、50913、50914、50916、50996、51792、51813、52024、52040、52231、52502、52609、52615、52705、52708、52712、52897、53314、53317、53357、53380、53415、53417、53626、53868、53869、53970、53975、54006、54123、54131、54132、54139、54169、54343、54352、54388、54422、54446、54562、54601、54633、54678、54711、55927、55942、55994、56030、56070、56196、56198、56218、56220、56222、56233、56275、56309、56312、56314、56321、56353、56380、56381、56404、56406、56449、56458、56469、56484、56490、56501、56503、56505、56522、56523、56525、56613、56642、56707、56736、56771、56784、56787、56805、56809、56856、56869、57080、57230、57246、57314、57316、57376、57737、57745、57748、57756、57765、57782、58172、58180、58198、58202、58206、58234、58805、59004、59021、59024、59026、59035、59057、59058、60345、60406、60611、64050、64144、64290、64379、64383、64384、64406、64453、64685、65020、65247、65255、65256、65257、66056、66118、66136、66213、66233、66277、66352、66376、66420、66464、66491、66505、66556、66596、66622、66634、66642、66671、66698、66729、66799、66867、66880、66923、66930、66959、66970、66980、66985、67057、67065、67122、67150、67151、67155、67199、67235、67260、67279、67288、67367、67370、67379、67381、67389、67419、67439、67575、67657、67673、67692、67710、67815、67847、67873、67949、67985、67993、68040、68153、68196、68268、68346、68479、68558、68701、68705、68776、68839、68842、68854、68910、68911、68992、69020、69125、69167、69168、69188、69234、69241、69257、69260、69299、69317、69389、69539、69606、69656、69716、69790、69833、69890、69920、69944、70073、70122、70127、70315、70350、70392、70408、70428、70459、70497、70508、70601、70625、70637、70650、70673、70779、70796、70797、70823、70859、70981、71041,71063,71131,71137,71163、71176、71241,71280,71371,71375、71409、71458、71468、71592、71597、71702、71722、71752、71767、71777、71782、71793、71828、71834、71838、71839,71939、71949,71990,71991、72057、72074、72135、72180、72195、72199、72290、72293、72323、72325、72388、72459、72465、72475、72556、72567、72615、72720、72727、72739、72823、72949、72958、73178、73181、73340、73389、73451、73469、73503、73610、73614、73844、73845、73945、74007、74068、74106、74120、74123、74149、74164、74168、74197、74282、74318、74322、74326、74335、74352、74377、74481、74533、74561、74570、74838、75196、75199、75210、75291、75305、75339、75387、75480、75482、75507、75572、75599、75605、75646、75725、75901、76007、76022、76294、76308、76365、76389、76467、76572、76580、76793、76803、76804、76834、76893、76900、77057、77114、77117、77264、77286、77318、77480、77683、77889、77907、77913、78020、78088、78246、78251、78284、78455、78469、78541、78619、78656、78699、78703、78783、78829、78910、78912、78921、78929、79221、79233、79362、79401、80283、80509、80720、80732、80859、80902、81601、81630、81703、81845、81879、83383、83395、83396、83557、83602、83925、83993、84653、93674、93681、93686、93691、93759、93760、93761、93762、93837、93871、94047、94112、94187、94275、96979、97064、97165、98053、98403、99377、99730、100090、100563、100710、100978、101095、101206、102162、102209、102334、103136、103806、103889、104328、104349、104360、104383、104384、104394、104886、105377、105594、105859、106795、106894、107351、107433、107499、107503、107568、107586、107751、107765、107771、107889、107932、107951、108060、108098、108143、108655、108672、108857、109113、109115、109575、109594、109663、109676、109889、109910、109958、109972、109973、109995、110052、110061、110068、110109、110147、110506、110521、110616、110641、110647、110648、110784、110796、110805、110913、112077、114142、114565、114606、114642、114774、114889、116810、116848、116870、116871、116912、117168、117198、117590、118445、140477、140490、140500、140577、140743、170574、170644、170729、170740、170767、170787、170791、170826、170938、192195、192231、192285、192651、192657、193796、195333、208076、208258、208266、208292、208439、208677、208715、209011、209357、209361、209416、209446、209448、209707、210135、210162、211378、212168、212276、212391、212712、213010、213990、214105、214162、214384、214669、214899、215031、216151、216154、216285、216456、216558、216578、217031、217082、217127、217166、217558、218030、218440、218490、218624、218772、218989、219150、223227、223690、223701、223922、224419、224585、224656、224694、224829、224902、224903、225876、225895、225998、226049、226182、226442、226641、226747、226896、227099、227644、227656、227940、228136、228598、228731、228775、228790、228829、228839、228852、228869、228876、228880、228980、229004、229534、229663、229906、230073、230162、230587、230674、230700、230753、230908、230936、230991、231044、231051、231329、231386、231986、231991、232232、232337、232807、232853、232854、232878、232906、233056、233410、233490、233863、233887、233890、233908、233987、234725、234959、235028、235041、235050、235320、235442、235582、235623、235682、236193、237052、237336、237409、237615、237758、237960、238247、239099、239546、239652、240064、240120、240263、240427、240442、240476、240590、240690、241066、241447、241520、242523、242620、242705、243187、243833、243906、243931、243963、243983、244349、244713、244813、244954、245572、245583、245596、245688、245841、246086、246196、246198、246791、252829、260298、268281、268301、268396、268448、268564、268741、268903、268932、269252、269713、269870、270076、270627、271278、271305、272347、272359、272382、277353、319196、319207、319535、319594、319599、3
19601、319615、319695、319785、320067、320376、320429、320586、320595、320790、320799、320875、320995、328572、330301、330361、330502、332937、338353、347691、353187、353208、378435、381319、356626、及び386655などのマウスTFを改変したものである。
例示的aTFは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ramos,et
al.Microbiology and Molecular Biology Reviews,June 2005,p.326-356及びTropell,et al.Microbiol Mol Biol Rev.2004 Sep;68(3):474-500に見出される。
al.Microbiology and Molecular Biology Reviews,June 2005,p.326-356及びTropell,et al.Microbiol Mol Biol Rev.2004 Sep;68(3):474-500に見出される。
いくつかの実施形態では、改変が生じることになるタンパク質センサーのアミノ酸配列は、様々な実施形態において、BLASTP、PSI-BLAST、DELTA-BLAST、HMMER、又はJackHMMERのうちの1又は複数を使用して配列相同性によって選択されてもよく、配列相同性検索によって選択された対応するヌクレオチド配列であってもよい。
タンパク質センサー候補であり得るタンパク質配列を同定する方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号に見出される。
いくつかの実施形態では、野生型アロステリックタンパク質センサーの結合活性を変更する工学的アプローチ、例えば、アロステリックタンパク質の同族リガンド(すなわち野生型アロステリックタンパク質センサーに結合するリガンド)を犠牲にして、野生型アロステリックタンパク質センサーを標的分子の結合に適するように改変することには、変異誘発が含まれる。いくつかの実施形態では、変異誘発は、例えば、置換、挿入、欠失、及び切断から独立して選択される、野生型アロステリックタンパク質センサーに1又は複数のアミノ酸変異を導入することを含む。
いくつかの実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的置換及び/又は非保存的置換を含み得る。
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、大きさ、溶解度、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。20種類の天然アミノ酸は、(1)疎水性:Met,Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro;及び(6)芳香族:Trp、Tyr、Pheの6つの標準アミノ酸群に分類できる。
本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、上記に示される6つの標準的なアミノ酸群の同じ群内に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、GluによるAspの交換は、そのように修飾されたポリペプチドにおいて1つの負電荷を保持している。さらに、グリシンとプロリンは、αヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換されてもよい。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上記に示される6つの標準アミノ酸群(1)~(6)の異なる群に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
いくつかの実施形態では、置換には非古典的なアミノ酸(例えば、セレノシステイン、ピロールリシン、N-ホルミルメチオニン β-アラニン、GABA及びδ-アミノレブリン酸、4-アミノ安息香酸(PABA)、一般的なアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、y-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ザルコシン(sarcosme)、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、デザイナーアミノ酸(β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸など)、及び一般的なアミノ酸類似体)も含まれる場合がある。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、既存のアロステリックタンパク質(例えば、aTF)の設計を使用して改変される。いくつかの実施形態では、設計にはインシリコ設計が含まれる。例示的で非限定的な設計原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号に見出される。
例えば、いくつかの実施形態において、分子モデリングは、アロステリックタンパク質が1又は複数の標的分子に結合することを可能にし得るアロステリックタンパク質における変異を予測するために使用される。様々な実施形態では、通常はX線結晶学、核磁気共鳴(NMR)、散乱、又は回折技術を含むがこれらに限定されない実験的方法によって得られる実験的に導出された三次元タンパク質構造を参照して、アロステリックタンパク質が1又は複数の標的分子に結合できるようにし得るアロステリックタンパク質中の変異がモデル化及び/又は予測される。様々な実施形態では、モデリングを支援するためにROSETTAソフトウェアスイートが使用される(その内容全体が参照により本明細書に援用されるKaufmann et al.Biochemistry.2010 Apr
13;49(14):2987-98を参照)。あるいは、または組み合わせて、ROBETTA、TASSER、l-TASSER、HHpred、HHsearch若しくはMODELLER、又はSWISS-MODELなどの相同性モデリングアルゴリズムを使用してもよい。いくつかの実施形態では、(制限するものではないが)アロステリックタンパク質が実験的に導出された三次元タンパク質構造を欠いているものなど、相同性モデリングアルゴリズムを使用して、配列相同性モデルを構築することができる。様々な実施形態では、1又は複数の配列ホモログ又は構造ホモログは、三次元タンパク質構造のアミノ酸配列に対して、90%未満のアミノ酸配列同一性、85%未満のアミノ酸配列同一性、80%未満のアミノ酸配列同一性、75%未満のアミノ酸配列同一性、70%未満のアミノ酸配列同一性、65%未満のアミノ酸配列同一性、60%未満のアミノ酸配列同一性、55%未満のアミノ酸配列同一性、50%未満のアミノ酸配列同一性、45%未満のアミノ酸配列同一性、40%未満のアミノ酸配列同一性、35%未満のアミノ酸配列同一性、30%未満のアミノ酸配列同一性、25%未満のアミノ酸配列同一性、又はそれ以下のアミノ酸配列同一性を有する。例示的な相同性モデリング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号(例えば、段落[0085]~[0093])に見出される。
13;49(14):2987-98を参照)。あるいは、または組み合わせて、ROBETTA、TASSER、l-TASSER、HHpred、HHsearch若しくはMODELLER、又はSWISS-MODELなどの相同性モデリングアルゴリズムを使用してもよい。いくつかの実施形態では、(制限するものではないが)アロステリックタンパク質が実験的に導出された三次元タンパク質構造を欠いているものなど、相同性モデリングアルゴリズムを使用して、配列相同性モデルを構築することができる。様々な実施形態では、1又は複数の配列ホモログ又は構造ホモログは、三次元タンパク質構造のアミノ酸配列に対して、90%未満のアミノ酸配列同一性、85%未満のアミノ酸配列同一性、80%未満のアミノ酸配列同一性、75%未満のアミノ酸配列同一性、70%未満のアミノ酸配列同一性、65%未満のアミノ酸配列同一性、60%未満のアミノ酸配列同一性、55%未満のアミノ酸配列同一性、50%未満のアミノ酸配列同一性、45%未満のアミノ酸配列同一性、40%未満のアミノ酸配列同一性、35%未満のアミノ酸配列同一性、30%未満のアミノ酸配列同一性、25%未満のアミノ酸配列同一性、又はそれ以下のアミノ酸配列同一性を有する。例示的な相同性モデリング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号(例えば、段落[0085]~[0093])に見出される。
いくつかの実施形態では、野生型アロステリックタンパク質の構造は、(例えば、1又は複数の標的分子をアロステリックタンパク質の構造にドッキングすることにより)アロステリックタンパク質が1又は複数の標的分子に結合できるようにし得る変化について評価される。例示的なドッキング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号(例えば、段落[0095]~[0101])に見出される。
様々な実施形態において、野生型アロステリックタンパク質に対する可能性のある変異のライブラリーが作製され、ポジティブ選択又はネガティブ選択が、所望の変異体をスクリーニングするために使用される。
様々な実施形態において、改変は、(その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第7,574,306号及び米国特許第8,340,951号に開示されているような)コンピュータータンパク質設計、指向性進化法、理論的突然変異誘発、又はそれらの任意の適切な組み合わせの技術を使用し得る。
他の実施形態では、遺伝子シャッフリング、相同組換え、ドメインスワッピング、ディープ変異スキャニング(deep mutation scanning)、及び/又はランダム突然変異誘発などの変異技術を使用することができる。
例示的なタンパク質センサー及び同族リガンドは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第2015/127242号(例えば、7頁の表)に見出される。
様々な実施形態では、タンパク質センサーは、既存のアロステリックタンパク質(例えば、aTF)の設計を使用して改変される。様々な実施形態では、設計にはインシリコ設計が含まれる。例示的な設計原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号に見出される。
例えば、様々な実施形態において、分子モデリングは、アロステリックタンパク質が1又は複数の標的分子に結合することを可能にし得るアロステリックタンパク質における変異を予測するために使用される。様々な実施形態では、通常はX線結晶学、核磁気共鳴(NMR)、散乱、又は回折技術を含むがこれらに限定されない実験的方法によって得られる実験的に導出された三次元タンパク質構造を参照して、アロステリックタンパク質が1又は複数の標的分子に結合できるようにし得るアロステリックタンパク質中の変異がモデル化及び/又は予測される。様々な実施形態では、モデリングを支援するためにROSETTAソフトウェアスイートが使用される(その内容全体が参照により本明細書に援用されるKaufmann et al.Biochemistry.2010 Apr 13;49(14):2987-98を参照)。
あるいは、または組み合わせて、ROBETTA、TASSER、l-TASSER、HHpred、HHsearch若しくはMODELLER、又はSWISS-MODELなどの相同性モデリングアルゴリズムを使用してもよい。いくつかの実施形態では、(制限するものではないが)アロステリックタンパク質が実験的に導出された三次元タンパク質構造を欠いているものなど、相同性モデリングアルゴリズムを使用して、配列相同性モデルを構築することができる。様々な実施形態では、1又は複数の配列ホモログ又は構造ホモログは、三次元タンパク質構造のアミノ酸配列に対して、90%未満のアミノ酸配列同一性、85%未満のアミノ酸配列同一性、80%未満のアミノ酸配列同一性、75%未満のアミノ酸配列同一性、70%未満のアミノ酸配列同一性、65%未満のアミノ酸配列同一性、60%未満のアミノ酸配列同一性、55%未満のアミノ酸配列同一性、50%未満のアミノ酸配列同一性、45%未満のアミノ酸配列同一性、40%未満のアミノ酸配列同一性、35%未満のアミノ酸配列同一性、30%未満のアミノ酸配列同一性、25%未満のアミノ酸配列同一性、又はそれ以下のアミノ酸配列同一性を有する。例示的で非限定的なモデリング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号(例えば、段落[0085]~[0093])に見出される。
いくつかの実施形態では、アロステリックタンパク質の構造は、アロステリックタンパク質が1又は複数の標的分子に結合できるようにし得る変化について評価される(例えば、1又は複数の標的分子をアロステリックタンパク質の構造にドッキングすることにより)。例示的なドッキング方法及び原理は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第2016/0063177号(例えば、段落[0095]~[0101])に見出される。
様々な実施形態において、アロステリックタンパク質に対する可能性のある変異のライブラリーが作製され、ポジティブ選択又はネガティブ選択が、所望の変異体をスクリーニングするために使用される。
様々な実施形態において、改変は、(その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第7,574,306号及び米国特許第8,340,951号に開示されているような)コンピュータータンパク質設計、指向性進化法、理論的突然変異誘発、又はそれらの任意の適切な組み合わせの技術を使用し得る。
他の実施形態では、遺伝子シャッフリング、相同組換え、ドメインスワッピング、ディープ変異スキャニング(deep mutation scanning)、及び/又はランダム突然変異誘発などの変異技術を使用することができる。
限定するものではないが例として、表1は、本発明の様々な実施形態に従って修飾し得る例示的なタンパク質センサーを提示している。例えば、様々な実施形態では、aTF(「外枠」)及び/又はネイティブリガンドを選択し、提示された代表的な構造(PDB)を参照して、本明細書の開示に従って、標的分子又は標的分子群に対する改変タンパク質センサーを設計することができる(「標的分子の特性」の列を参照)。
様々な実施形態では、変異又はインシリコ設計の標的となるアミノ酸は、ドッキングを介して又はX線結晶学などの実験方法によって結合ポケットにモデル化されたリガンドの約3Å、約5Å、約Å7、約10Å、又は約12Å(例えば、約3Å~約12Å、約5Å~約12Å、約7Å~約12Å、約10Å~約12Å、約3Å~約5Å、約3Å~約7Å、又は約3Å~約10Å)の範囲内のアミノ酸である。
1又は複数の標的分子に結合可能なタンパク質センサー及び/又はスイッチであってもよい変異アロステリックタンパク質は、標準的な結合アッセイ(例えば、蛍光アッセイ、放射性アッセイなど)を使用してスクリーニング可能である。
様々な実施形態では、改変タンパク質センサーは、その内容全体が参照により本明細書に援用されるTaylor,et al.Nat.Methods 13(2):177に記載の通り改変される。
改変産生株/細胞
前記改変センサー株(又は細胞)は、少なくとも1種類の目的の標的産物(又は分子)を産生するように改変された株又は細胞(例えば、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、又は哺乳動物(ヒト又は非ヒト)の株又は細胞)を指し、前記目的の標的産物(又は分子)は上述のセンサー系(例えば、改変センサープラスミド又は株による検出)で検出可能である。
前記改変センサー株(又は細胞)は、少なくとも1種類の目的の標的産物(又は分子)を産生するように改変された株又は細胞(例えば、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、又は哺乳動物(ヒト又は非ヒト)の株又は細胞)を指し、前記目的の標的産物(又は分子)は上述のセンサー系(例えば、改変センサープラスミド又は株による検出)で検出可能である。
例として、いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーが改変され得る目的の標的産物(又は分子)は、その内容全体が参照により本明細書に援用される国際公開第2015/017866号(例えば、段落[00107]~[00112])に記載されている化合物のうちの1種類又は複数種類を含む。
いくつかの実施形態では、本技術の標的分子は、細胞に対して有毒であり、及び/又は、細胞環境において検出可能な方法で改変タンパク質センサーと容易に結合又は相互作用することができない。いくつかの実施形態では、改変タンパク質センサーは、同族リガンドの同一性及び同族リガンドが有し得る標的分子との任意の共通性に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、同族リガンドと標的分子の間の共有化学基は、同族リガンドに結合する改変タンパク質センサーに配向させて、標的分子に結合できるようにタンパク質センサーの改変をもたらし得る。
限定するものではないが例として、表1(上記)は、例示的な標的分子又は標的分子群を提示している(「標的分子の特性」の列を参照)。
いくつかの実施形態では、標的分子(又は産物)はナリンゲニンである。
レポーター
いくつかの実施形態では、本技術における有用なレポーターとしては、これらに限定されないが、マイクロタイタープレート蛍光光度計、蛍光顕微鏡、目視検査、又は蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用して吸光度又は蛍光を測定することによって発現を測定され得る緑色蛍光タンパク質など、固有の分光的特徴を有するタンパク質が挙げられるが。いくつかの実施形態では、レポーターとしては、これらに限定されないが、吸着、磁気及びインピーダンスなどの物理的特性、酸化還元状態の変化、並びにホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はガス生成酵素などの分析可能な酵素活性に基づく分光的特徴も挙げられる。あるいは、いくつかの実施形態では、レポーター及び転写因子ライブラリーメンバーをコードする直鎖状の一本鎖DNA又は二本鎖DNAを、限定されないが、ポリメラーゼによる増幅の場合のレポーターとして使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本技術における有用なレポーターとしては、これらに限定されないが、マイクロタイタープレート蛍光光度計、蛍光顕微鏡、目視検査、又は蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用して吸光度又は蛍光を測定することによって発現を測定され得る緑色蛍光タンパク質など、固有の分光的特徴を有するタンパク質が挙げられるが。いくつかの実施形態では、レポーターとしては、これらに限定されないが、吸着、磁気及びインピーダンスなどの物理的特性、酸化還元状態の変化、並びにホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はガス生成酵素などの分析可能な酵素活性に基づく分光的特徴も挙げられる。あるいは、いくつかの実施形態では、レポーター及び転写因子ライブラリーメンバーをコードする直鎖状の一本鎖DNA又は二本鎖DNAを、限定されないが、ポリメラーゼによる増幅の場合のレポーターとして使用してもよい。
いくつかの実施形態では、本技術はレポーター遺伝子系を含み、これには固有の分光的特徴及び/又はアッセイ可能な酵素活性を有するタンパク質が含まれる。例示的なレポーター系又は検出方法としては、これらに限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)、ウミシイタケ(Renilla Reniformis)緑色蛍光タンパク質、GFPmut2、GFPuv4、黄色蛍光タンパク質(YFP)、強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、強化シアン蛍光タンパク質(ECFP)、強化青色蛍光タンパク質(EBFP)、色素タンパク質、シトリン、イソギンチャクモドキ(Discosoma)由来の赤色蛍光タンパク質(dsRED)、赤外蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ウンベリフェロン、ローダミン、フルオレセイン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、及びフィコエリトリンなど、化学発光または蛍光タンパク質を使用するものが挙げられる。検出可能な生物発光タンパク質の例としては、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ(例えば、細菌、ホタル、及びカブトムシなど)、ルシフェリン、及びエクオリンなどが挙げられる。検出可能な酵素系の例としては、これらに限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ、及びプロテアーゼなどが挙げられる。特定の他の実施形態では、レポーター系の検出方法は酵素を含む。特定の他の実施形態では、検出可能なマーカーは、qPCRにより遺伝的変異について迅速にアッセイすることができる非必須遺伝子である。特定の他の実施形態では、検出可能なマーカーは、逆選択によって機能性について容易に評価することができる薬物耐性マーカーである。いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、例えば、栄養要求性株における必要な代謝産物の生産、単一炭素源で増殖する能力、又は当技術分野で知られている他の増殖選択戦略などの栄養マーカーである。
特定の実施形態では、レポーターは、共に存在する場合に機能的レポーターを産生する2以上の成分から構成される。例としては、スプリットGFP、並びにルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、及びジヒドロ葉酸還元酵素などの酵素が挙げられる。スプリットレポーターの1又は複数の成分を外部から導入されてもよく、より少ない成分の細胞産生の検出が可能になる。スプリットレポーターは、別のタンパク質に融合された補完的なスプリットレポーターを検出するために使用してもよく、細胞内、細胞外、又はその両方で検出可能となる。例えば、産生細胞がその補体と封入されるまで機能的なレポーターを産生する能力を持たないように、スプリットGFP融合タンパク質は、補完するレポーター成分と封入された細胞によって排出されてもよい。そのようなスプリット系の1又は複数の成分は、独立して産生されてもよく、アッセイされる細胞に検出試薬として追加されてもよい。
例えば、β-グルコシダーゼ及びAntarcticホスファターゼは、対応する蛍光発生基質であるフルオレセインジ-(-D-グルコピラノシド)及びフルオレセイン二リン酸を含むレポーター系として使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、aTF自体の結合事象は、無細胞環境での光学的方法又は非光学的方法によるaTF状態の物理的な読み出しを提示するために利用される。例えば、非限定的な例では、aTFは蛍光タンパク質に連結され、DNA結合部位はクエンチャー分子に連結される。蛍光読み取りは、aTFがDNA結合部位自体から放出された場合にのみ可能である。この方法では、aTF結合事象を直接読み取ることができる。この戦略はフルオロフォア-クエンチャーの組み合わせに限定されず、スプリットタンパク質などの他の読み出しを使用することも可能である。さらに、タンパク質ディスプレイ法の場合、結合事象を使用して、機能性タンパク質を非機能性タンパク質から物理的に分離してもよい。
宿主株/細胞
様々な実施形態において、本技術の宿主細胞(すなわち、センサー株/細胞及び産生株/細胞)としては、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、哺乳動物(ヒトまたは非ヒト)の細胞などの真核細胞及び/又は原核細胞、並びに不死細胞株が挙げられる。
様々な実施形態において、本技術の宿主細胞(すなわち、センサー株/細胞及び産生株/細胞)としては、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、哺乳動物(ヒトまたは非ヒト)の細胞などの真核細胞及び/又は原核細胞、並びに不死細胞株が挙げられる。
例として、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・カステリ(Saccharomyces castellii)、クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クラミドモナス・レナリディティアナ(Chlamydomonas reinhardtii)、シロイヌナズナ(Arabidopsis
thaliana)、又はカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞であり、エシェリキア(Escherichia)属菌種、ストレプトマイセス(Streptomyces)属菌種、ザイモモナス(Zymonas)属菌種、アセトバクター(Acetobacter)属菌種、シトロバクター(Citrobacter)属菌種、シネコシスティス(Synechocystis)属菌種、リゾビウム(Rhizobium)属菌種、クロストリジウム(Clostridium)属菌種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属菌種、ストレプトコッカス(Streptococcus)属菌種、キサントモナス(Xanthomonas)属菌種、ラクトバチルス(Lactobacillus)属菌種、ラクトコッカス(Lactococcus)属菌種、バチルス(Bacillus)属菌種、ペドバクター(Pedobacter)属菌種、バクテロイデス(Bacteroides)属菌種、アルカリゲネス(Alcaligenes)属菌種、シュードモナス(Pseudomonas)属菌種、エロモナス(Aeromonas)属菌種、アゾトバクター(Azotobacter)属菌種、コマモナス(Comamonas)属菌種、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属菌種、ロドコッカス(Rhodococcus)属菌種、グルコノバクター(Gluconobacter)属菌種、ラルストニア(Ralstonia)属菌種、アシディチオバチルス(Acidithiobacillus)属菌種、ミクロルナタス(Microlunatus)属菌種、ゲオバクター(Geobacter)属菌種、ゲオバチルス(Geobacillus)属菌種、アルスロバクター(Arthrobacter)属菌種、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属菌種、セラチア(Serratia)属菌種、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora)属菌種、サーマス(Thermus)属菌種、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)属菌種、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属菌種、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属菌種、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora)属菌種、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属菌種、及びパンテア(Pantoea)属菌種などである。前記細菌細胞は、大腸菌などのグラム陰性細胞、又はバチルス種などのグラム陽性細胞であってもよい。
thaliana)、又はカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞であり、エシェリキア(Escherichia)属菌種、ストレプトマイセス(Streptomyces)属菌種、ザイモモナス(Zymonas)属菌種、アセトバクター(Acetobacter)属菌種、シトロバクター(Citrobacter)属菌種、シネコシスティス(Synechocystis)属菌種、リゾビウム(Rhizobium)属菌種、クロストリジウム(Clostridium)属菌種、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属菌種、ストレプトコッカス(Streptococcus)属菌種、キサントモナス(Xanthomonas)属菌種、ラクトバチルス(Lactobacillus)属菌種、ラクトコッカス(Lactococcus)属菌種、バチルス(Bacillus)属菌種、ペドバクター(Pedobacter)属菌種、バクテロイデス(Bacteroides)属菌種、アルカリゲネス(Alcaligenes)属菌種、シュードモナス(Pseudomonas)属菌種、エロモナス(Aeromonas)属菌種、アゾトバクター(Azotobacter)属菌種、コマモナス(Comamonas)属菌種、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属菌種、ロドコッカス(Rhodococcus)属菌種、グルコノバクター(Gluconobacter)属菌種、ラルストニア(Ralstonia)属菌種、アシディチオバチルス(Acidithiobacillus)属菌種、ミクロルナタス(Microlunatus)属菌種、ゲオバクター(Geobacter)属菌種、ゲオバチルス(Geobacillus)属菌種、アルスロバクター(Arthrobacter)属菌種、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属菌種、セラチア(Serratia)属菌種、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora)属菌種、サーマス(Thermus)属菌種、ステノトロホモナス(Stenotrophomonas)属菌種、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属菌種、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属菌種、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora)属菌種、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属菌種、及びパンテア(Pantoea)属菌種などである。前記細菌細胞は、大腸菌などのグラム陰性細胞、又はバチルス種などのグラム陽性細胞であってもよい。
いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞などの真菌細胞であり、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属菌種、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属菌種、ピキア(Pichia)属菌種、パフィア(Paffia)属菌種、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属菌種、カンジダ(Candida)属菌種、タラロマイセス(Talaromyces)属菌種、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属菌種、パチソレン(Pachysolen)属菌種、デバリオミセス(Debaryomyces)属菌種、ヤロウイア(Yarrowia)属菌種、及び工業用倍数体酵母株である。好ましくは、前記酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ株又はヤロウイア属菌種株である。真菌の他の例には、アスペルギルス(Aspergillus)属菌種、ペニシリウム(Pennicilium)属菌種、フザリウム(Fusarium)属菌種、リゾプス(Rhizopus)属菌種、アクレモニウム(Acremonium)属菌種、ニューロスポラ(Neurospora)属菌種、ソーダリア(Sordaria)属菌種、マグナポルテ(Magnaporthe)属菌種、アロミセス(Allomyces)属菌種、ウスチラゴ(Ustilago)属菌種、ボトリチス(Botrytis)属菌種、及びトリコデルマ(Trichoderma)属菌種が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は藻類細胞または植物細胞(例えば、シロイヌナズナ(A.thaliana)、コナミドリムシ(C.reinhardtii)、アルソスピラ(Arthrospira)、P.tricomutum、タバコ(N.tabacum)、T.suecica、P.carterae、P.tricomutum、Chlorella vulgarisなどのクロレラ(Chlorella)属菌種)である。
標的細胞は、トランスジェニック細胞株及び組換え細胞株を含んでいてもよい。さらに、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの異種細胞株も使用できる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は放線菌(Actinomycetes)属菌種細胞である。放線菌は、例えば、アクチノマイセス(Actinomyces)、アクチノマジュラ(Actinomadura)、ノカルジア(Nocardia)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、及び関連する属を含む、分岐フィラメントを形成する異種起源の細菌の集合体である。いくつかの実施形態では、アクチノマイセス種は、ストレプトマイセス種を含む。いくつかの実施形態では、放線菌属菌種細胞は、ストレプトマイセス種細胞(例えば、S.coelicolor)である。ストレプトマイセス属菌種には、非限定的な例として、S.noursei、S.nodosus、S.natalensis、S.venezuelae、S.roseosporus、S.fradiae、S.lincolnensis、S.alboniger、S.griseus、S.rimosus、S.aureofaciens、S.clavuligerus、S.avermitilis、S.platensis、S.verticillus、S.hygroscopicus、及びS.viridochromeogenesが含まれる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はバチルス属菌種細胞である。いくつかの実施形態では、バチルス属菌種細胞は、B.alcalophilus、B.alvei、B.aminovorans、B.amyloliquefaciens、B.aneurinolyticus、B.anthracis、B.aquaemans、B.atrophaeus、B.boroniphilus、B.brevis、B.caldolyticus、B.centrosporus、B.cereus、B.circulans、B.coagulans、B.firmus、B.flavothermus、B.fusiformis、B.galliciensis、B.globigii、B.infemus、B.larvae、B.laterosporus、B.lentus、B.licheniformis、B.megaterium、B.mesentericus、B.mucilaginosus、B.mycoides、B.natto、B.pantothenticus、B.polymyxa、B.pseudoanthracis、B.pumilus、B.schlegelii、B.sphaericus、B.sporothermodurans、B.stearothermophilus、B.subtilis、B.thermoglucosidasius、B.thuringiensis、B.vulgatis、及びB.weihenstephanensisから選択される。
改変センサー又は産生株/細胞用の液滴
分散された液滴の界面面積が大きいため、乳化剤を用いない乳剤は熱力学的に不安定な系である。乳剤液滴を安定化させるために、低分子量の界面活性剤又は界面活性ポリマーを通常、配合物に含めて、相間の界面張力を低下させる必要がある。液滴を安定させる1つの方法は、界面活性剤の代わりに固体粒子(例えば、ナノ粒子)を使用することである。固体粒子は、2種類の非混和性流体間又は非混和性液体間の界面に蓄積し、合体に対する強固なバリアを構築する。固体粒子は、合体を低減又は防止し、これにより、乳剤の安定性が向上する。卵殻と同様に、固体粒子の密な層は固いクラストを形成するため、乳剤の液滴は合体に抵抗する。
分散された液滴の界面面積が大きいため、乳化剤を用いない乳剤は熱力学的に不安定な系である。乳剤液滴を安定化させるために、低分子量の界面活性剤又は界面活性ポリマーを通常、配合物に含めて、相間の界面張力を低下させる必要がある。液滴を安定させる1つの方法は、界面活性剤の代わりに固体粒子(例えば、ナノ粒子)を使用することである。固体粒子は、2種類の非混和性流体間又は非混和性液体間の界面に蓄積し、合体に対する強固なバリアを構築する。固体粒子は、合体を低減又は防止し、これにより、乳剤の安定性が向上する。卵殻と同様に、固体粒子の密な層は固いクラストを形成するため、乳剤の液滴は合体に抵抗する。
ピカリング乳剤は、乳化剤の代わりに固体粒子によって安定化された乳剤である。ピカリング乳剤は、優れた安定性や低毒性など、界面活性剤によって安定化される従来の乳剤にはない多くの固有の機能を備えている。
本明細書に開示されるように、本開示の方法は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相に囲まれた液滴を含む。本技術のいくつかの実施形態では、乳剤はピカリング乳剤である。次に、液滴は標的分子のレベルについてアッセイ可能であり、ここで、改変タンパク質センサーは、改変産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供する。本開示の方法は、所望のレベルの標的分子を産生する単離された改変産生細胞を有する液滴を単離すること、及び所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である。
いくつかの実施形態では、改変産生細胞のプールは、改変センサープラスミドで形質転換される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、改変産生細胞を含む各液滴を、改変センサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生することを含む。
いくつかの実施形態では、液滴を囲む非混和性の連続相は、フッ素化をベースとした油又は乳剤である。いくつかの実施形態では、液滴を囲む非混和性の連続相は、有機油である。いくつかの実施形態では、フッ素化をベースとした油又は乳剤が、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、液滴を囲む非混和性の連続相は、有機油である。
ピカリング乳剤はいくつかの方法で安定化され得る。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、油又は有機油の鎖長を減少させることにより安定化される。油又は有機油の鎖長を短くすると、油又は有機油の溶解度が増加し、安定したピカリング乳剤の調製が可能になる。
いくつかの実施形態では、フッ素化油又は乳剤が、所望により粒子によって安定化される。いくつかの実施形態では、粒子は部分的にフッ素化されたナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は部分的に疎水性のナノ粒子(例えば、シリカをベースとした疎水性ナノ粒子)である。
いくつかの実施形態では、乳剤は、炭化水素(例えば、ヘキサデカン、ドデカン、デカン)によって安定化されたピカリング乳剤である。いくつかの実施形態では、乳剤は、鉱油、トウモロコシ油、又はヒマシ油などの油若しくは有機油によって安定化されたピカリング乳剤である。
いくつかの実施形態では、前剤は、Tween、Triton X-100、Triton X-114、SPAN、Arlacel、ABILなどの非イオン性乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせと組み合わせた油又は有機油によって安定化される。
いくつかの実施形態では、乳剤は、タンパク質安定剤(例えば、BSA、β-ラクトグロブリン、BCN)と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖(例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース)と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤、又は糖は、第2相(例えば、水相、有機相、又は液滴相)から第1相(例えば、油性相)への有機物の拡散を低減する。
いくつかの実施形態では、乳剤は、Tween、Triton X-100、Triton X-114、SPAN、Arlacel、ABILなどの非イオン性乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせによって安定化される。いくつかの実施形態では、前乳剤は、タンパク質安定剤(例えば、BSA、β-ラクトグロブリン、BCN)によって安定化される。いくつかの実施形態では、乳剤は、非イオン性界面活性剤又は糖(例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース)と組み合わせた油又は有機油によって安定化される。いくつかの実施形態では、ピカリング乳剤は、2つの非混和性相間の界面に蓄積する。いくつかの実施形態では、第1相は連続相であり、第2相は分散相である。いくつかの実施形態では、本開示の乳剤は、フルオロカーボン相などの油をベースとした第1相、及び第2相(例えば、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相)を含む。例えば、第1相は、少なくとも1種類のフッ素化溶媒を有するフルオロカーボン相であってもよく、第2相は、有機相、水相、液滴相、炭化水素相、又は気相など、フッ素化溶媒と非混和性であってもよい。いくつかの実施形態では、第2相は水相である。いくつかの実施形態では、第2相は炭化水素相である。
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。
いくつかの実施形態では、本開示は、液体に囲まれた流体の液滴を生成するための組成物及び方法に関する。流体と液体は、多くの場合、本質的に非混和性であり得、例えば、目的の時間スケール(例えば、特定の系又はデバイスを通じて流体液滴が輸送されるのにかかる時間)では非混和性であり得る。流体はまた、他の種、例えば、細胞、粒子などの特定の分子種を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、液滴は、第2の流体によって完全に囲まれた第1の流体の隔離された部分である。液滴は必ずしも球形である必要はないが、例えば、外部環境に応じて、他の形状をとり得ることに留意されたい。いくつかの実施形態では、液滴は、液滴が位置する流体の流れに垂直なチャネルの最大寸法に実質的に等しい最小断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、液滴という用語は、「マイクロカプセル」という用語と互換的に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の液滴は、乳剤(例えば、ピカリング乳剤)、すなわち、一方の相が他方の相に分散している2つの非混和性の流体相又は液相の系から、例えば、微視的又はコロイド状のサイズの液滴として、形成される。
乳剤は、非混和性液体の任意の適切な組み合わせから形成され得る。例えば、本明細書に開示される乳剤は、水性液体、及び油などの疎水性の非混和性液体を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書は、本開示の乳剤から形成され、(a)連続相、及び(b)連続相中に分散された少なくとも1つの液滴を含む液滴群を開示する。いくつかの実施形態では、乳剤は、(a)連続的な親フッ素性相、及び(b)前記連続的な親フッ素性相に分散された少なくとも1つの分散された水相又は親油性相を含む。
いくつかの実施形態では、分散相(例えば、水相、有機相、炭化水素相、又は気相)は、少なくとも1つの改変産生細胞を含む。いくつかの実施形態では、改変産生細胞は、フルオラス相と水相、有機相、炭化水素相、又は気相との界面で、両親媒性粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)に固定されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の両親媒性粒子(例えば、シリカをベースとしたナノ粒子)及びそれらの組み合わせにより、液滴内部で実施可能なプロセスを妨げることなく、液滴の合体に対して十分な安定化がもたらされる。
乳剤は、1又は複数の界面活性化剤(界面活性剤)の添加により安定化され得る。これらの界面活性剤は乳化剤と呼ばれ、例えば、水/油界面で作用して、相同士の分離を防止する(又は少なくとも遅延させる)。
いくつかの実施形態では、乳剤は、フルオロカーボン(又はパーフルオロカーボン)連続相で構成される。例えば、界面活性剤としてF-アルキルジモルホリノホスフェートを使用して、安定したパーフルオロオクチル中水乳剤及びパーフルオロオクチル中水乳剤を形成することができる。非フッ素化化合物は、フルオロカーボン及びパーフルオロカーボンに本質的に不溶であり、小さな薬剤のような分子(通常<500Da及びLogP<5)は、マイクロカプセル(例えば、液滴)間の交換がほとんど又は全くなく、フルオロカーボン中水乳剤及びパーフルオロカーボン中水乳剤の水性マイクロカプセルに非常に効果的に区画化されている。
いくつかの実施形態では、乳剤の作製には、通常、相を一つにさせるために機械的エネルギーを適用する必要がある。このためには、攪拌機(磁気攪拌棒、プロペラタービン攪拌機、パドル装置、及び泡立て器など)、ホモジナイザー(ローターステーターホモジナイザー、高圧バルブホモジナイザー、及びジェットホモジナイザーを含む)、コロイドミル、超音波「膜乳化」装置、及びマイクロ流体デバイスを含む種々の機械装置を利用する様々な方法がある。
いくつかの実施形態では、複雑な生化学的プロセス、特に遺伝子の転写及び翻訳は、本明細書に開示されているように、油中水型乳剤中に形成される水相マイクロカプセル中でも有効である。これは、遺伝子の選択について油中水型乳剤の区画化を可能にし、前記遺伝子は乳剤マイクロカプセル中で転写及び翻訳され、それらがコードするタンパク質の結合又は触媒活性によって選択される。乳剤中に形成された水性マイクロカプセルは一般に安定しており、マイクロカプセル間の核酸、タンパク質、又は酵素触媒反応産物の交換は、あるとしてもほとんど生じない。本開示のいくつかの実施形態では、本技術は、何千リットルもの工業規模までの容量の乳剤を作製するために存在する。
いくつかの実施形態では、「マイクロカプセル」は、異なる流体中のある流体の液滴であってもよく、閉じ込められた成分は、前記液滴に溶解するが、キャリア流体には溶解しない。いくつかの実施形態では、膜など、壁を区別する第3の材料が存在する。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、それを区切る境界が、それらがコードする遺伝子産物の機能に従って遺伝因子の選別を可能にする、本明細書に記載の分子メカニズムの成分の交換を制限する人工区画である。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルという用語は、「液滴」という用語と互換的に使用することができる。
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にある。いくつかの実施形態では、マイクロ流体制御は、本明細書に開示された方法を実行するために、液滴の形成及び/又は移動を指示又はそれ以外の方法で制御するマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体システムを含む。例えば、いくつかの実施形態では、液滴形成の「マイクロ流体制御」は、マイクロ流体デバイスを使用して第2の流体内に流体の「液滴」を形成する液滴の作製を指す。いくつかの実施形態では、マイクロ流体制御下で分類された液滴は、本明細書に記載されているように、選別手順に関連する機能の1又は複数を実行するためにマイクロ流体デバイスを使用して選別される。
いくつかの実施形態では、液滴はマイクロ流体制御下にあり、且つ、マイクロ流体制御は、マイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体システムを含み、前記チャネルは、流体の流れを少なくとも部分的に方向付ける特徴を有する。チャネルは、任意の断面形状(円形、楕円形、三角形、不規則、正方形、又は長方形など)を有していてもよく、被覆されていてもされていなくてもよい。いくつかの実施形態では、チャネルは完全に被覆されていてもよく、チャネルの少なくとも一部が完全に囲まれた断面を有していてもよく、入口と出口を除いてチャネル全体が全長にわたって完全に囲まれていてもよい。チャネルは、少なくとも2:1、より一般的には少なくとも3:1、5:1、又は10:1以上のアスペクト比(長さ対平均断面寸法)有し得る。開放チャネルには、例えば、構造的特性(細長いくぼみ)及び/又は物理的若しくは化学的特性(疎水性-親水性)などの流体輸送の制御を容易にする特性、又は流体に力(例えば、封じ込め力(containing force))を及ぼすことができるその他の特性を含む。いくつかの実施形態では、チャネル内の流体は、チャネルを部分的又は完全に満たしてもよい。いくつかの実施形態では、開放チャネルが使用され、流体は、例えば表面張力(例えば、凹状メニスカス又は凸状メニスカス)を使用して、チャネル内に保持されていてもよい。チャネルは、例えば、流体の流れに対して垂直な最大寸法が、約5mm又は2mm未満、約1mm未満、約500ミクロン未満、約200ミクロン未満、約100ミクロン未満、約60ミクロン未満、約50ミクロン未満、約40ミクロン未満、約30ミクロン未満、約25ミクロン未満、約10ミクロン未満、約3ミクロン未満、約1ミクロン未満、約300nm未満、約100nm未満、約30nm未満、又は約10nm未満である、任意のサイズのものであってもよい。いくつかの実施形態では、チャネルの寸法は、流体が物品又は基材を通って自由に流れることができるように選択されてもよい。チャネルの寸法はまた、例えば、チャネル内の流体の特定の体積流量又は線形流量を可能にするように選択されてもよい。当然ながら、チャネルの数及びチャネルの形状は、当業者に公知の任意の方法によって変更することができる。いくつかの実施形態では、複数のチャネル又はキャピラリーを使用してもよい。例えば、2以上のチャネルが使用されてもよく、それらは、互いの内側に配置されるか、互いに隣接して配置されるか、互いに交差するように配置されるなどである。
いくつかの実施形態では、本開示の液滴は、乳剤(例えば、ピカリング乳剤)、すなわち、一方の相が他方の相に分散されている2つの非混和性の流体又は液相の系から、例えば、微視的又はコロイド状のサイズの液滴として、形成される。いくつかの実施形態では、流体は液体であり、これらの用語は交換性がある。いくつかの実施形態では、流体は、流れを可能にする任意の適切な粘度を有し得る。2種類以上の流体が存在する場合、各流体は、流体間の関係を考慮して、本質的に任意の流体(液体、気体など)の中から当業者によって独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、流体はそれぞれ混和性又は非混和性であってもよい。例えば、2種類の流体は、流体の流れの形成の時間枠内で、又は反応や相互作用の時間枠内で非混和性であるように選択され得る。一部分がかなりの期間液体のままである場合、流体は著しく非混和性である必要がある。接触及び/又は形成後、分散した部分が重合などによって迅速に硬化可能な場合、流体は非混和性である必要はない。当業者は、本発明の技術を実行するために、接触角測定などを使用して、適切な混和性又は非混和性流体を選択することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の方法は、複数の液滴中で改変産生細胞の集団を生成することに関する。いくつかの実施形態では、複数の液滴は、少なくとも1つの非不死細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、その内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第2009/0068170号に開示されているように、液滴内の非不死細胞によって分泌される種の特徴を決定することを含む。
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2010/0022414号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、複数の水性液滴内で改変産生細胞の集団を生成することに関し、ここで、各液滴はサイズが均一であり、限られた量の試薬のみを消費しながら多数のアッセイを実行するのに役立つ液滴ライブラリーを含む。
いくつかの実施形態では、その容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2017/0028365号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、複数の水性液滴を含む乳剤ライブラリー内で改変産生細胞の集団を生成することに関する。
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2013/0084572号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、改変産生細胞の集団を、液滴から検出されるシグナルを使用して制御及び/又は校正される液滴をベースとしたアッセイにおいて生成することに関する。
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2014/0179544号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、入力流路、交差領域、及び出力流路を含む検出器デバイスを有するシステムで液滴を検出することを含む、改変産生細胞の集団を生成することに関する。
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第2018/0104693号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、液滴中で改変産生細胞の集団を生成すること、前記液滴内のマイクロ流体液滴及び粒子を検出すること、及び前記液滴を選別することに関する。
いくつかの実施形態では、その内容全体が本明細書に援用される米国特許第9,012,390号に開示されているように、本明細書に開示の方法は、水性分散相、フッ素化油を含む連続相、及びアミド結合を介してポリエチレングリコール(PEG)ブロックに結合された過フッ素化ポリエーテル(PFPE)ブロックを含むブロックコポリマーを含む界面活性剤を含む乳剤中で改変産生細胞の集団を生成することに関し、ここで、前記界面活性剤は式-(CnF2nO)x-(CmF2m)-CONH-(n、m、x、及びyは正の整数である)からなる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明される。
実施例1:大腸菌MG1655変異体間のセンサー応答の変動
同一バックグラウンドに由来するゲノム変異体間のセンサー変動の例として、図1A~図1Cは、MAGE改変大腸菌MG1655集団からランダムに選択された3つのメンバーのセンサー応答を示している。3つのクローンは、改変ttgApプロモーターの制御下にTtgR及びgfpを有する中コピープラスミドで形質転換された。外因的に適用されたナリンゲニン(0μM、31μM、63μM、又は125μM)は、3つの株において異なるレベルのGFP発現を誘導した。これらの実験中にナリンゲニン経路酵素は存在せず、内因的に産生されたナリンゲニンによる干渉は排除される。センサー系をゲノムに導入した場合(図示せず)、又は高コピーセンサープラスミドへ切り替えた場合(図2A)、変動は解消しなかった。
同一バックグラウンドに由来するゲノム変異体間のセンサー変動の例として、図1A~図1Cは、MAGE改変大腸菌MG1655集団からランダムに選択された3つのメンバーのセンサー応答を示している。3つのクローンは、改変ttgApプロモーターの制御下にTtgR及びgfpを有する中コピープラスミドで形質転換された。外因的に適用されたナリンゲニン(0μM、31μM、63μM、又は125μM)は、3つの株において異なるレベルのGFP発現を誘導した。これらの実験中にナリンゲニン経路酵素は存在せず、内因的に産生されたナリンゲニンによる干渉は排除される。センサー系をゲノムに導入した場合(図示せず)、又は高コピーセンサープラスミドへ切り替えた場合(図2A)、変動は解消しなかった。
図2A~図2Dは、図1A~図1Cと同じ3種類のMAGE改変大腸菌MG1655変異体のセンサー応答の変動を示している。これらの変異体は、適切なaTF調節オペレーターの制御下に、4種類のaTF(TtgR(図2A)、TetR(図2B)、PcaV(図2C)、又はQacR(図2D))のうちの1種類及びgfpを有する高コピープラスミドで形質転換された。図示するように、各センサー系は、種々のレベルの適切な同族リガンドによって誘導された。株についての色は全てのパネルで一致している。TtgRセンサー系(赤色=最も明るい、オレンジ色=中間、青色=暗い)に対するセンサー応答の傾向は、異なるセンサー系間で保持されておらず、原因は全体的なものではないことを示唆している。
実施例2:産生変異体間での標的産生分子の拡散
図3は、産生株間の拡散による干渉を示している。「2E6」と称される大腸菌K-12 MG1655変異体を、ナリンゲニン前駆体濃度の向上についてMAGE改変し、2種類の別々のナリンゲニン経路プラスミド(pNARlow及びpNARhigh)で形質転換した結果、ナリンゲニン高産生株(赤色、M9 1%グルコース中での24時間バッチ培養で約180μMの産生物)及びナリンゲニン低産生株(青色、M9 1%グルコース中での24時間バッチ培養で約60μMの産生物)を得た。生産性が異なるこれら2種類の株は、別々にインキュベート及び一緒にインキュベートした(オレンジ色)。高産生株及び低産生株は共培養すると平均的シグナルを示しており、株間のナリンゲニン拡散が、バルク液体培養におけるより優れた産生のスクリーニングに対して抑制的であることを示唆している。本実施例では、産生における違いは、主要代謝産物の濃度を変更する大規模なゲノム変異ではなく、ナリンゲニン経路酵素のプラスミドをベースとした改変の結果であることに注目されたい。これらの状況では、実施例1で観察されたセンサー応答の変動は観察されなかった。
図3は、産生株間の拡散による干渉を示している。「2E6」と称される大腸菌K-12 MG1655変異体を、ナリンゲニン前駆体濃度の向上についてMAGE改変し、2種類の別々のナリンゲニン経路プラスミド(pNARlow及びpNARhigh)で形質転換した結果、ナリンゲニン高産生株(赤色、M9 1%グルコース中での24時間バッチ培養で約180μMの産生物)及びナリンゲニン低産生株(青色、M9 1%グルコース中での24時間バッチ培養で約60μMの産生物)を得た。生産性が異なるこれら2種類の株は、別々にインキュベート及び一緒にインキュベートした(オレンジ色)。高産生株及び低産生株は共培養すると平均的シグナルを示しており、株間のナリンゲニン拡散が、バルク液体培養におけるより優れた産生のスクリーニングに対して抑制的であることを示唆している。本実施例では、産生における違いは、主要代謝産物の濃度を変更する大規模なゲノム変異ではなく、ナリンゲニン経路酵素のプラスミドをベースとした改変の結果であることに注目されたい。これらの状況では、実施例1で観察されたセンサー応答の変動は観察されなかった。
実施例3:産生細胞からセンサー細胞を分離する手段としての共培養
図4A~図4Bは、スクリーニングのための実行可能な戦略としての産生細胞とセンサー細胞の共培養を証明している。センサー細胞は、単一炭素源としてのグルコース上で増殖することができない大腸菌BW25113 Δptsl::kanRバックグラウンドで改変した。グルコーストランスポーターptsl及び蛍光レポーターgfpは、増殖及びGFPシグナルの大きさがナリンゲニン依存性であるように、プラスミドpSENSORGFP-Ptsl上のTtgR調節プロモーターの制御下で共シストロン的に発現された。図4Aでは、増殖及びGFPシグナルの大きさがナリンゲニン依存性であるセンサー細胞を、実施例2に記述される産生株2E6と液体中で共培養し、3種類の異なるナリンゲニン経路プラスミド、すなわち、経路陰性対照であるpNARnull(赤色)、ナリンゲニン低産生経路pNARlow(青色、M9 1%グルコース中での24時間単離バッチ培養で約60μMの産生物)、又はナリンゲニン高産生経路pNARhigh(オレンジ色、M9 1%グルコース中での24時間バッチ培養で約180μMの産生物)、又は対照プラスミドで形質転換した。暗い集団は、GFPシグナルを有しない産生細胞を表している。明るい集団はセンサー細胞集団を表し、共培養集団全体の比率が増加し、産生の増加に伴いGFP応答の大きさも増加している。
図4A~図4Bは、スクリーニングのための実行可能な戦略としての産生細胞とセンサー細胞の共培養を証明している。センサー細胞は、単一炭素源としてのグルコース上で増殖することができない大腸菌BW25113 Δptsl::kanRバックグラウンドで改変した。グルコーストランスポーターptsl及び蛍光レポーターgfpは、増殖及びGFPシグナルの大きさがナリンゲニン依存性であるように、プラスミドpSENSORGFP-Ptsl上のTtgR調節プロモーターの制御下で共シストロン的に発現された。図4Aでは、増殖及びGFPシグナルの大きさがナリンゲニン依存性であるセンサー細胞を、実施例2に記述される産生株2E6と液体中で共培養し、3種類の異なるナリンゲニン経路プラスミド、すなわち、経路陰性対照であるpNARnull(赤色)、ナリンゲニン低産生経路pNARlow(青色、M9 1%グルコース中での24時間単離バッチ培養で約60μMの産生物)、又はナリンゲニン高産生経路pNARhigh(オレンジ色、M9 1%グルコース中での24時間バッチ培養で約180μMの産生物)、又は対照プラスミドで形質転換した。暗い集団は、GFPシグナルを有しない産生細胞を表している。明るい集団はセンサー細胞集団を表し、共培養集団全体の比率が増加し、産生の増加に伴いGFP応答の大きさも増加している。
図4Bでは、センサー細胞は、油中水型液滴中の経路陰性対照細胞又はナリンゲニン高産生細胞と共培養された。インキュベーション後、油中水型液滴は別の水相に封入され、標準的な蛍光活性化セルソーター(FACS)で観察された水中油中水型液滴を生成した。高産生細胞とセンサー細胞の共培養(オレンジ色)の分布は、非産生細胞とセンサー細胞の共培養(赤色)と容易に区別される。
実施例4:液滴中での共培養
2E6 pNARnull、2E6 pNARlow、及び2E6 pNARhighを、実施例3に記載の大腸菌BW25113 Δptsl::kanR pSENSORGFP-Ptslセンサー株と共培養した。4種類の培養物をLB培地で一晩増殖させ、適切な抗生物質を添加した最小培地で1~100倍に希釈し、その後対数期まで増殖させた。対数期に入った時点で、大腸菌を濾過済みの1×M9塩で3回すすぎ、次に、OD600が1.0になるまで希釈した。封入された液滴のそれぞれに単一の産生株が存在することを確実にするために2E6株をOD600が0.01になるまで希釈し、液滴のそれぞれが少なくとも5つのセンサー細胞を有することを確実にするためセンサー細胞を0.1倍に希釈した。以下の6セットの液滴、すなわち、(1)センサー細胞単独の液滴、(2)500μMナリンゲニンとセンサー細胞の液滴、(3)2E6 pNARhighとセンサー細胞及び1mM IPTGの液滴、(4)2E6 pNARnullとセンサー細胞及び1mM IPTGの液滴、(5)2E6 pNARlowとセンサー細胞及び1mM IPTGの液滴、及び(6)ナリンゲニン単独の液滴を生成した。細胞溶液、及びHFE7500の1%Ranフルオロ界面活性剤で構成される油相を1mLガラス製シリンジ中にロードし、2個のHarvard Apparatus社製シリンジポンプに接続した。前記液体を、Dolomite社製の50μmジャンクションフローフォーカシング親フッ素性チップを使用して、油相及び水相のそれぞれについて14μL/分及び10μL/分の速度で乳化した。形成された液滴を5mLの遠心管に収集した。形成後、液滴を転倒させながら33℃で48時間インキュベートした。インキュベーション後、液滴を顕微鏡下で画像化した。500μMのナリンゲニンを含む陽性対照の液滴は非常に蛍光性であるが(図5d)、陰性対照の液滴は暗かった(図5a)。pNARlow及びpNARhighの共培養液滴は、検出可能な蛍光を生成した(図5b及び図5c)。2E6
pNARhigh産生体は、2E6 pNARlow産生細胞よりもナリンゲニンを産生し、より明るい共培養液滴を生じた。500μMナリンゲニンを含む液滴と混合されたセンサー細胞液滴は、液滴間の拡散を示さなかった(図6)。HPLCで分析された追加の拡散データは、前記油へのナリンゲニン及びクマル酸の最小拡散が20%未満であることを示している(データは図示せず)。分析後、Dolomite社製の50μMフローフォーカシング親水性チップを使用して、単一の乳剤をバルク水相二重乳剤に変換した。そのためには、液滴を1mLガラスシリンジにロードし、2番目のガラスシリンジに新鮮な増殖培地を充填して、液滴内部と等張性のバランスをとった。前記シリンジを2つのHarvard Apparatus社製シリンジポンプにロードした後、チップに接続した。シリンジあたり15μL/分の流量で二重乳剤が形成され、15mL遠心管に集めた。FAMS分析の前に、二重乳剤を顕微鏡下で分析した。顕微鏡下で以下の3つの液滴の集団が可視化される:(1)空の液滴、(2)蛍光センサー細胞及び産生細胞を含む液滴及び、(3)非蛍光センサー細胞及び非産生細胞を含む液滴(図7)。液滴のFACS分析では、前記3つの集団も同様に示されている(図8A~図8C)。非産生体含有液滴は、約2,000RFUの平均集団蛍光を示す(図8A)。産生体含有液滴は、約100,000RFUの平均集団蛍光を示す(図8B)。両方の株の混合物を含む液滴集団は、2つの別個の蛍光亜集団を示している(図8C)。
2E6 pNARnull、2E6 pNARlow、及び2E6 pNARhighを、実施例3に記載の大腸菌BW25113 Δptsl::kanR pSENSORGFP-Ptslセンサー株と共培養した。4種類の培養物をLB培地で一晩増殖させ、適切な抗生物質を添加した最小培地で1~100倍に希釈し、その後対数期まで増殖させた。対数期に入った時点で、大腸菌を濾過済みの1×M9塩で3回すすぎ、次に、OD600が1.0になるまで希釈した。封入された液滴のそれぞれに単一の産生株が存在することを確実にするために2E6株をOD600が0.01になるまで希釈し、液滴のそれぞれが少なくとも5つのセンサー細胞を有することを確実にするためセンサー細胞を0.1倍に希釈した。以下の6セットの液滴、すなわち、(1)センサー細胞単独の液滴、(2)500μMナリンゲニンとセンサー細胞の液滴、(3)2E6 pNARhighとセンサー細胞及び1mM IPTGの液滴、(4)2E6 pNARnullとセンサー細胞及び1mM IPTGの液滴、(5)2E6 pNARlowとセンサー細胞及び1mM IPTGの液滴、及び(6)ナリンゲニン単独の液滴を生成した。細胞溶液、及びHFE7500の1%Ranフルオロ界面活性剤で構成される油相を1mLガラス製シリンジ中にロードし、2個のHarvard Apparatus社製シリンジポンプに接続した。前記液体を、Dolomite社製の50μmジャンクションフローフォーカシング親フッ素性チップを使用して、油相及び水相のそれぞれについて14μL/分及び10μL/分の速度で乳化した。形成された液滴を5mLの遠心管に収集した。形成後、液滴を転倒させながら33℃で48時間インキュベートした。インキュベーション後、液滴を顕微鏡下で画像化した。500μMのナリンゲニンを含む陽性対照の液滴は非常に蛍光性であるが(図5d)、陰性対照の液滴は暗かった(図5a)。pNARlow及びpNARhighの共培養液滴は、検出可能な蛍光を生成した(図5b及び図5c)。2E6
pNARhigh産生体は、2E6 pNARlow産生細胞よりもナリンゲニンを産生し、より明るい共培養液滴を生じた。500μMナリンゲニンを含む液滴と混合されたセンサー細胞液滴は、液滴間の拡散を示さなかった(図6)。HPLCで分析された追加の拡散データは、前記油へのナリンゲニン及びクマル酸の最小拡散が20%未満であることを示している(データは図示せず)。分析後、Dolomite社製の50μMフローフォーカシング親水性チップを使用して、単一の乳剤をバルク水相二重乳剤に変換した。そのためには、液滴を1mLガラスシリンジにロードし、2番目のガラスシリンジに新鮮な増殖培地を充填して、液滴内部と等張性のバランスをとった。前記シリンジを2つのHarvard Apparatus社製シリンジポンプにロードした後、チップに接続した。シリンジあたり15μL/分の流量で二重乳剤が形成され、15mL遠心管に集めた。FAMS分析の前に、二重乳剤を顕微鏡下で分析した。顕微鏡下で以下の3つの液滴の集団が可視化される:(1)空の液滴、(2)蛍光センサー細胞及び産生細胞を含む液滴及び、(3)非蛍光センサー細胞及び非産生細胞を含む液滴(図7)。液滴のFACS分析では、前記3つの集団も同様に示されている(図8A~図8C)。非産生体含有液滴は、約2,000RFUの平均集団蛍光を示す(図8A)。産生体含有液滴は、約100,000RFUの平均集団蛍光を示す(図8B)。両方の株の混合物を含む液滴集団は、2つの別個の蛍光亜集団を示している(図8C)。
実施例5:液滴区画化を使用した主要産物の拡散の抑制
2E6 pNARnull及び2E6 pNARhighを、TsgR由来のセンサーを使用してナリンゲニンに応答してGFPを産生するpSENSORGFPナリンゲニンセンサー系でさらに形質転換した。2つの培養物をLB培地で一晩増殖させ、適切な抗生物質を添加した最小培地で1~100倍にさらに希釈し、その後対数期まで増殖させた。対数期に入った時点で、大腸菌を1×濾過済みM9塩で3回すすぎ、次に、OD600が1.0になるまで希釈した。次に、封入された液滴のそれぞれに単一の産生株が存在することを確実にするために各2E6株をOD600が0.01になるまで希釈した。以下の3セットの液滴、すなわち、(1)2E6 pNARhigh細胞単独、(2)2E6 pNARnull細胞単独、及び(3)2E6 pNARhigh細胞と2E6 pNARnull細胞の1:1混合物の液滴を生成した。細胞溶液、及びHFE7500中の1%Ranフルオロ界面活性剤で構成される油相を1mLガラス製シリンジにロードし、2個のHarvard Apparatus社製シリンジポンプに接続した。前記液体を、Dolomite社製の50μmジャンクションフローフォーカシング親フッ素性チップを使用して、油相及び水相のそれぞれ14μL/分及び10μL/分の速度で乳化した。形成された液滴を5mLの遠心管に集めた。形成後、前記液滴を転倒させながら33℃で48時間インキュベートした。インキュベーション後、等量の1H,1H,2H,2H-パーフルオロ-1-オクタノールを使用して30秒間ボルテックスして液滴を破壊し、次いで遠心して相を分離した。回収した大腸菌を含む水相を新しいチューブに移し、FACS分析用に希釈した。集団の蛍光分布をFACSで測定した。2E6 pNARnull細胞は、約30,000RFUの平均集団蛍光を示した(図9(A))。2E6 pNARhighナリンゲニン産生細胞は、約300,000RFUの平均集団蛍光を示し(図9(B))、非産生株の10倍であった。各産生株を分離するために液滴を使用して共に増殖させると、産物の拡散を抑制する液滴の能力及びそれによる集団平均化を示す2つの蛍光亜集団が見られる(図9(C))。
2E6 pNARnull及び2E6 pNARhighを、TsgR由来のセンサーを使用してナリンゲニンに応答してGFPを産生するpSENSORGFPナリンゲニンセンサー系でさらに形質転換した。2つの培養物をLB培地で一晩増殖させ、適切な抗生物質を添加した最小培地で1~100倍にさらに希釈し、その後対数期まで増殖させた。対数期に入った時点で、大腸菌を1×濾過済みM9塩で3回すすぎ、次に、OD600が1.0になるまで希釈した。次に、封入された液滴のそれぞれに単一の産生株が存在することを確実にするために各2E6株をOD600が0.01になるまで希釈した。以下の3セットの液滴、すなわち、(1)2E6 pNARhigh細胞単独、(2)2E6 pNARnull細胞単独、及び(3)2E6 pNARhigh細胞と2E6 pNARnull細胞の1:1混合物の液滴を生成した。細胞溶液、及びHFE7500中の1%Ranフルオロ界面活性剤で構成される油相を1mLガラス製シリンジにロードし、2個のHarvard Apparatus社製シリンジポンプに接続した。前記液体を、Dolomite社製の50μmジャンクションフローフォーカシング親フッ素性チップを使用して、油相及び水相のそれぞれ14μL/分及び10μL/分の速度で乳化した。形成された液滴を5mLの遠心管に集めた。形成後、前記液滴を転倒させながら33℃で48時間インキュベートした。インキュベーション後、等量の1H,1H,2H,2H-パーフルオロ-1-オクタノールを使用して30秒間ボルテックスして液滴を破壊し、次いで遠心して相を分離した。回収した大腸菌を含む水相を新しいチューブに移し、FACS分析用に希釈した。集団の蛍光分布をFACSで測定した。2E6 pNARnull細胞は、約30,000RFUの平均集団蛍光を示した(図9(A))。2E6 pNARhighナリンゲニン産生細胞は、約300,000RFUの平均集団蛍光を示し(図9(B))、非産生株の10倍であった。各産生株を分離するために液滴を使用して共に増殖させると、産物の拡散を抑制する液滴の能力及びそれによる集団平均化を示す2つの蛍光亜集団が見られる(図9(C))。
図10は、拡散を抑制するために液滴内でインキュベートした後の、経路陰性対照である2E6 pNARnullpSENSORGFPからのナリンゲニン高産生株2E6 pNARhigh pSENSORGFPの濃縮を示す。この実験で使用される液滴サイズで単一細胞のローディングを確実にするためにOD600が0.003になるまで希釈した以外は、上記のようにして細胞を培養及び洗浄した。油相及び水相についてそれぞれ20μL/分及び12μL/分の速度で自社製25μmジャンクションフローフォーカシングPDMSチップで乳化した以外は、上記のようにして液滴を生成した。2E6 pNARhighpSENSORGFP、2E6 pNARnull pSENSORGFP、並びに予め混合した2E6 pNARhighpSENSORGFPと2E6 pNARnull pSENSORGFPについて別々の液滴セットを生成した。形成された液滴を5mLの遠心管に集めた。形成後、前記液滴を転倒させながら33℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、等量の1H,1H,2H,2H-パーフルオロ-1-オクタノールを使用して30秒間ボルテックスして液滴を破壊し、次いで遠心して相を分離した。回収した大腸菌を含む水相を新しいチューブに移し、FACS分析及び細胞選別用に希釈した。2E6 pNARhighpSENSORGFP(青色)、2E6
pNARnull pSENSORGFP(赤色)、及び2E6 pNARhighpSENSORGFPと2E6 pNARnullpSENSORGFPの混合物(オレンジ色)の液滴からの細胞を、Bio-Rad S3E FACSで分析した。分析に続いて、前記2E6 pNARhighpSENSORGFPと2E6 pNARnullpSENSORGFPの混合物の液滴からの細胞を、下記のゲーティング戦略を用いて選別した。選別細胞及び未選別細胞をプレーティングし、未選別集団及び選別集団からのクローンを産生培地で成長させて、経路(+)細胞の(経路(+)においてGFPシグナルが高いこと、及び経路(-)クローンにおいて暗いことによって決定される)割合を決定した。この1回の濃縮サイクルで、経路(+)細胞の約7倍の濃縮が観察された。
pNARnull pSENSORGFP(赤色)、及び2E6 pNARhighpSENSORGFPと2E6 pNARnullpSENSORGFPの混合物(オレンジ色)の液滴からの細胞を、Bio-Rad S3E FACSで分析した。分析に続いて、前記2E6 pNARhighpSENSORGFPと2E6 pNARnullpSENSORGFPの混合物の液滴からの細胞を、下記のゲーティング戦略を用いて選別した。選別細胞及び未選別細胞をプレーティングし、未選別集団及び選別集団からのクローンを産生培地で成長させて、経路(+)細胞の(経路(+)においてGFPシグナルが高いこと、及び経路(-)クローンにおいて暗いことによって決定される)割合を決定した。この1回の濃縮サイクルで、経路(+)細胞の約7倍の濃縮が観察された。
図11は、「細胞内センサー」を使用した低産生体及び高産生体の液滴封入を示す画像であり、同一の細胞がリガンド及びセンサーの両方の産生に関与し、蛍光(緑)の読み取り強度(高産生細胞、右)は産生したリガンドの濃度に関連していることを示す。
実施例6:共培養センサー細胞を用いた高産生体の濃縮
図12は、液滴システムにおいて低産生体又は高産生体と共に封入された「共培養センサー細胞」のシステムを示す画像を示す。ここで、非産生細胞のみがセンサー読み取りに寄与し、蛍光(緑色)の読み取り強度(高産生細胞、左)が産生リガンドの濃度に関連付けられている産生細胞への負担を軽減している。
図12は、液滴システムにおいて低産生体又は高産生体と共に封入された「共培養センサー細胞」のシステムを示す画像を示す。ここで、非産生細胞のみがセンサー読み取りに寄与し、蛍光(緑色)の読み取り強度(高産生細胞、左)が産生リガンドの濃度に関連付けられている産生細胞への負担を軽減している。
図13は、実施例3に記載のΔptsi::kanR pSENSORGFP-Ptsiセンサー株との液滴共培養戦略を利用した、低経路対照2E6 pNARlowからのナリンゲニン高産生株2E6 pNARhighの濃縮を示す。3種類の培養物をLB培地で静止期まで一晩増殖させた。次に、細胞を、1%グルコース、0.1%プルロニック(Pluronic)F-68、及び1mM IPTGを含む濾過済み2×M9培地で1回洗浄した。続いて、Δptsi::kanR pSENSORGFP-Ptsi細胞が0.2のOD600で再懸濁されるように、洗浄に使用したのと同じ濾過済み培地に細胞を再懸濁した。これに、2E6 pNARhigh又は2E6 pNARlowを、OD600が0.066で添加し、センサー細胞の濃度が等しい(OD600=0.2)低産生細胞又は高産生細胞の2つの別々の混合物を作製した。HFE 7500+1%008-FSを油相として使用し、前述の細胞混合物を水相として25μmジャンクションフローフォーカシングを備えたPDMSチップを使用して、油相と水相についてそれぞれ20μL/分及び12μL/分の速度で、培養物ごとに別個に液滴を生成した。形成後、前記液滴を転倒させながら33℃で24時間インキュベートした。選別前に、液滴を、約[10]:[1][Δptsi::kanR pSENSORGFP-Ptsi+2E6 pNARlow]:[Δptsi::kanR pSENSORGFP-Ptsi+2E6 pNARhigh]で混合した。次に、高電圧(約1kV)を供給可能なインジウム電極付きの40μmジャンクションを有する高さ45μmのソーターチップを備えた自社製PDMSソーターチップで液滴を選別し、誘電泳動効果を実行して、水滴を所望のチャネルへ移動させた。液滴を60倍の倍率でモニタリングし、PMT電圧シグナルは自社にてプログラムしたマイクロチップを使用して分析した。これによりユーザー定義の閾値より大きいシグナルを含む液滴は、10kHzの周波数で800Vの450μsパルスを印加することにより、選別されたチャネルに選別される。その後、等量の1H,1H,2H,2H-パーフルオロ-1-オクタノールを使用して30秒間ボルテックスして選別液滴及び未選別液滴を集めて破壊し、次いで遠心して相を分離した。LBに破壊液滴混合物を加え、細胞を適切な抗生物質を含む寒天プレート上にプレーティングした。選別細胞及び未選別細胞を翌日各プレートから別々に掻き取り、一晩培養するために適切な抗生物質を含むLBに再接種した。集団全体を代表するDNAを抽出するために、選別細胞培養物及び未選別細胞培養物のミニプレップを完了した。混合プラスミド集団の二重消化は、pNARlowからのプラスミドとpNARhighからのプラスミドの量の差異が、NdeI及びXhoIの二重制限酵素消化により識別できることを示している(図13(左)の理論的消化を参照)。選別ミニプレップ及び未選別ミニプレップからの等量/等濃度のDNAを二重消化に供し、30μLの95ng/μLのミニプレップ完了DNAを0.6U/μLの各酵素と1×CutSmartバッファー中で、最終容量35μLで混合し、37℃で3時間、その後65℃で20分間、さらに12℃で保持した。次に、消化したDNAを1%アガロースゲル上、90Vで60分間電気泳動し、SybrSafeで染色し、画像化した(図13(右)の実験的消化を参照)。選別集団と未選別集団におけるpNARhighバンドとpNARlowバンドの存在を比較すると、濃度測定によって経路pNARhigh細胞の8倍を超える濃縮が観察された。
図14(A)、図14(B)、図14(C)、図14(D)、及び図14(E)は、二重乳剤WOW型液滴の選別を示す。フローフォーカシングマイクロ流体デバイスを使用して、初期OD600が0.75Aである単一乳剤封入大腸菌細胞(P674、RFP陽性)を生成した。水相流量は6.5μL/分、外側の油相流量は30μL/分であった。デバイスの断面の形状は、幅10μm、高さ50μmであった。油中水型(WO型)液滴の平均径は直径30μmであった。次に、単一乳剤のクリーム状の層を1mLのBDプラスチックシリンジにロードし、2μL/分の流速で別のフローフォーカシングマイクロ流体デバイスに再注入した。3%PVAを添加したLB+KAN培地で作成された外側の水相を、30μL/分の流速で流して、幅35μm及び高さ35μmのフローフォーカシングセクションで水中油中水型(WOW型)液滴をつまみ取った。WOW型液滴の平均径は直径40μmであった。生成されたWOW型液滴は、3%PVAを含むLB+KAN培地で被覆された採取チューブの底に沈んだ。
WOW型産生中に生成される未封入の大腸菌からWOW型液滴が選別され得ることを示すために、GFP発現大腸菌をWOW型懸濁液に加えた。
図14(A)では、前方散乱に対する側方散乱のプロットが、サイズに基づいて3つの異なる集団を示している。原点付近の遊離大腸菌は表示された事象の3.7%を表し、軸の最大値付近のWOWは表示された事象の38%を表し、その間にWOW細片のサイズの幅広い集団が存在する。図14(B)は、図14(A)の大腸菌サイズの集団のGFPチャネル蛍光応答を示している。チャンネル間のクロストークにより、RFP陽性大腸菌は約75蛍光単位の集団として表示される。WOW集団に追加されたGFP陽性大腸菌は、約1000~10000の蛍光単位を示す。図14(C)は、図14(A)のWOWサイズの事象のRFPチャネル蛍光を示している。WOWを含むRFP大腸菌は、約90蛍光単位の集団として表示される。暗いWOW又はWOWと同じサイズの油単独の液滴は、約2蛍光単位の集団として表示される。図14(D)に、選別後の集団から10,000のWOW事象を選別したものを示す。事象の0.1%の存在によって示されるように、WOW液滴は選別プロセスによって破壊されることに留意されたい。遊離大腸菌は、選別後に観察された事象の54%に相当する。図14(E)は、図14(D)の大腸菌サイズの集団のGFPチャネル蛍光応答を示している。軸上ではRFP細胞のみが観察されることに留意されたい。このことは、WOWはFACS選別プロセス後に残存しなかったが、WOWからの大腸菌を含むRFPのみが採取チューブに選別されたことを示す。
1H,1H,2H,2H-パーフルオロ-1-オクタノールで液滴を破壊して個別の細胞事象を選別する代わりに、単一の乳剤液滴を第2の水相に封入して二重乳剤を形成し、標準的なFACSで分析/選別することができる。図15は、2E6 pNARhigh
pSENSORGFPと2E6 pNARnull pSENSORGFPの混合物の二重乳剤液滴の分析を示す。2種類の株のLB一晩前培養物を洗浄し、濾過済み最小グルコースに再懸濁して、高い占有率を確保するために使用したOD 0.04の細胞密度とした。実施例4に記載のプロトコルを用いて、2E6 pNARhigh pSENSORGFP及び2E6 pNARnull pSENSORGFPに対して単一の乳剤液滴を個別に形成した。形成後、2つの液滴セットを30℃で18時間転倒させながらインキュベートし、その時点でこれらを混合し、実施例4に記載のように二重乳剤を生成するために使用した。二重乳剤のFACS分析は、ゲーティングによる二重乳剤事象(サイズに基づいて識別されるゲートK)内の2つの異なるGFP(FITC-A-補正)集団を示し、高産生体と非産生体の混合集団の分析と一致している。
pSENSORGFPと2E6 pNARnull pSENSORGFPの混合物の二重乳剤液滴の分析を示す。2種類の株のLB一晩前培養物を洗浄し、濾過済み最小グルコースに再懸濁して、高い占有率を確保するために使用したOD 0.04の細胞密度とした。実施例4に記載のプロトコルを用いて、2E6 pNARhigh pSENSORGFP及び2E6 pNARnull pSENSORGFPに対して単一の乳剤液滴を個別に形成した。形成後、2つの液滴セットを30℃で18時間転倒させながらインキュベートし、その時点でこれらを混合し、実施例4に記載のように二重乳剤を生成するために使用した。二重乳剤のFACS分析は、ゲーティングによる二重乳剤事象(サイズに基づいて識別されるゲートK)内の2つの異なるGFP(FITC-A-補正)集団を示し、高産生体と非産生体の混合集団の分析と一致している。
典型的なフルオロ界面活性剤(通常、独自の分子/ポリマー/ブロックコポリマー)の使用に加えて、ナノ粒子をベースとしたピカリング乳剤は、油中水型液滴及び水中油型液滴の封入にも役立ち得る。図16は、油中水ピカリング乳剤を、産生体+相関センサー系と共に利用して蛍光シグナルを取得できることを示している。適切な抗生物質を加えたLB培地からの2E6 pNARhigh pSENSORGFPの一晩培養物を等量で3回洗浄し、単一細胞液滴ローディング水相として使用するための最終的な再懸濁OD600が0.008(事前の経験的ポアソン分布測定による)となるように、濾過済み2×M9、1%グルコース、1mM IPTG、0.1%プルロニックF68、及び適切な抗生物質に再懸濁した。液滴は、50μmの深さの単一の水流液滴ジェネレータチップを使用して、ピカリング乳剤溶液(Dolomite社製Fluorophase)の場合は20μL/分の流量で、水相を含む細胞の場合は12μL/分の流量で生成され、35~40μmの直径の液滴が生成された。液滴をオービタルシェーカーで33℃、24時間インキュベートした。翌日、細胞の特性/液滴の占有率を観察するために、液滴を画像化した。結果は、細胞が増殖(占有液滴あたり2個以上の細胞、明視野)と経路分子の産生に関連する蛍光レポーター(GFPチャネル)の産生との両方が可能であることを示している。
均等物
本明細書の以下の記載及び添付の特許請求の範囲において、材料の量、元素含有量、反応時間及び反応温度、量の比率についてなど、数値範囲、量、値、及び割合の全ては、「約」という用語が、その値、量、又は範囲と共に明示的に表示されない場合であっても「約」という用語が前に付されているように読まれ得る。したがって、反対の意味を示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告された有効桁数字の数を考慮して、通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるものとする。
本明細書の以下の記載及び添付の特許請求の範囲において、材料の量、元素含有量、反応時間及び反応温度、量の比率についてなど、数値範囲、量、値、及び割合の全ては、「約」という用語が、その値、量、又は範囲と共に明示的に表示されない場合であっても「約」という用語が前に付されているように読まれ得る。したがって、反対の意味を示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告された有効桁数字の数を考慮して、通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるものとする。
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いかなる数値にも、本質的には、その基礎となるそれぞれの試験測定値で見られる標準偏差から必然的に生じる誤差が含まれる。さらに、数値範囲が本明細書に示される場合、これらの範囲は、列挙された範囲の端点を含む(例えば、端点が使用されてもよい)。本明細書で重量パーセントが使用される場合、報告される数値は、総重量に対するものである。
また、本明細書に記載の数値範囲は、その中に含まれる全ての部分範囲を含むことを意図していることを理解されたい。例えば、「1~10」の範囲は、列挙された最小値1と列挙された最大値10の間の(及びそれを含む)全ての部分範囲を含むことを意図し、すなわち、最小値は1以上であり最大値は10以下である。本明細書で使用される「1(つ)」、「a(単数)」、又は「an(単数)」という用語は、別段の指示がない限り、「少なくとも1」又は「1又は複数」を含むことが意図されている。
本明細書で開示される任意の態様又は実施形態は、本明細書で開示される任意の他の態様又は実施形態と組み合わせることができる。
参照により本明細書に援用されるとされた特許、刊行物、又は他の開示資料の全体又は一部は、援用された資料が、本開示に記載の既存の定義、提示、又は他の開示資料のセットと矛盾しない範囲でのみ本明細書に援用される。したがって、必要な範囲で、本明細書に明示的に記載の開示は、参照により本明細書に援用された矛盾する資料に優先する。参照により本明細書に援用されるとされたが、既存の定義、提示、又は本明細書に記載の他の開示資料と矛盾する任意の資料又はその一部は、その援用された資料と既存の開示資料との間に矛盾が生じない範囲でのみ援用される。
本発明は、特にその好ましい実施形態を参照して示され説明されているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に様々な変更を加えてもよいことが当業者によって理解される。
本開示に係る態様は以下の態様も含む。
<1>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<2>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<1>に記載の方法。
<3>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<2>に記載の方法。
<4>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<2>又は<3>に記載の方法。
<5>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<4>に記載の方法。
<6>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<2>~<5>のいずれか一項に記載の方法。
<7>
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<1>~<6>のいずれか一項に記載の方法。
<8>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<7>に記載の方法。
<9>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<1>~<6>のいずれか一項に記載の方法。
<10>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<1>~<9>のいずれか一項に記載の方法。<11>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<1>~<10>のいずれか一項に記載の方法。
<12>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能マーカーである、<11>に記載の方法。<13>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<12>に記載の方法。
<14>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<12>に記載の方法。
<15>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<12>に記載の方法。
<16>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<14>に記載の方法。
<17>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<11>に記載の方法。
<18>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<17>に記載の方法。
<19>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<18>に記載の方法。
<20>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<11>~<18>のいずれか一項に記載の方法。
<21>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<1>~<20>のいずれか一項に記載の方法。
<22>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<1>~<21>のいずれか一項に記載の方法。
<23>
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<1>~<22>のいずれか一項に記載の方法。
<24>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<1>~<23>のいずれか一項に記載の方法。
<25>
前記レポーターがGFPである、<24>に記載の方法。
<26>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<1>~<25>のいずれか一項に記載の方法。
<27>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<1>~<26>のいずれか一項に記載の方法。
<28>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<1>~<27>のいずれか一項に記載の方法。
<29>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)である、<1>~<27>のいずれか一項に記載の方法。
<30>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<1>~<29>のいずれか一項に記載の方法。
<31>
改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、
遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<32>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<31>に記載の方法。
<33>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<32>に記載の方法。
<34>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<33>に記載の方法。
<35>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<34>に記載の方法。
<36>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<32>~<35>のいずれか一項に記載の方法。
<37>
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<31>~<36>のいずれか一項に記載の方法。
<38>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<37>に記載の方法。
<39>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<31>~<36>のいずれか一項に記載の方法。
<40>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<31>~<39>のいずれか一項に記載の方法。
<41>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<31>~<40>のいずれか一項に記載の方法。
<42>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、<41>に記載の方法。
<43>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<42>に記載の方法。
<44>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<42>に記載の方法。
<45>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<42>に記載の方法。
<46>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<44>に記載の方法。
<47>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<41>に記載の方法。
<48>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<47>に記載の方法。
<49>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<48>に記載の方法。
<50>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<41>~<48>のいずれか一項に記載の方法。
<51>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<31>~<50>のいずれか一項に記載の方法。
<52>
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換する前に作製される、<51>に記載の方法。
<53>
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換した後に作製される、<51>に記載の方法。
<54>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<31>~<53>のいずれか一項に記載の方法。
<55>
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<31>~<54>のいずれか一項に記載の方法。
<56>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<31>~<55>のいずれか一項に記載の方法。
<57>
前記レポーターがGFPである、<56>に記載の方法。
<58>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<31>~<57>のいずれか一項に記載の方法。
<59>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<31>~<58>のいずれか一項に記載の方法。
<60>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<31>~<59>のいずれか一項に記載の方法。
<61>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)である、<31>~<58>のいずれか一項に記載の方法。
<62>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<31>~<61>のいずれか一項に記載の方法。
<63>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<64>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<63>に記載の方法。
<65>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<64>に記載の方法。
<66>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<65>に記載の方法。
<67>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<66>に記載の方法。
<68>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<64>~<67>のいずれか一項に記載の方法。
<69>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<63>~<68>のいずれか一項に記載の方法。
<70>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<69>に記載の方法。
<71>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<63>~<78>のいずれか一項に記載の方法。
<72>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<1>~<71>のいずれか一項に記載の方法。
<73>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<1>~<72>のいずれか一項に記載の方法。
<74>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、<73>に記載の方法。
<75>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<74>に記載の方法。
<76>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<74>に記載の方法。
<77>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<74>に記載の方法。
<78>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<76>に記載の方法。
<79>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<73>に記載の方法。
<80>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<79>に記載の方法。
<81>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<80>に記載の方法。
<82>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<73>~<80>のいずれか一項に記載の方法。
<83>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<63>~<82>のいずれか一項に記載の方法。
<84>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<63>~<83>のいずれか一項に記載の方法。
<85>
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<63>~<84>のいずれか一項に記載の方法。
<86>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<63>~<85>のいずれか一項に記載の方法。
<87>
前記レポーターがGFPである、<86>に記載の方法。
<88>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<63>~<87>のいずれか一項に記載の方法。
<89>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<63>~<88>のいずれか一項に記載の方法。
<90>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<63>~<89>のいずれか一項に記載の方法。
<91>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)である、<63>~<89>のいずれか一項に記載の方法。
<92>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<63>~<91>のいずれか一項に記載の方法。
<93>
改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<94>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、
(a)フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び
(b)改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<95>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<96>
前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである、<93>~<95>のいずれか一項に記載の方法。
<97>
前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が粒子によって安定化される、<93>~<96>のいずれか一項に記載の方法。
<98>
前記粒子が、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子である、<97>に記載の方法。
<99>
前記部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子がシリカをベースとしたナノ粒子である、<98>に記載の方法。
<100>
前記液滴がマイクロ流体制御下にある、<93>~<99>のいずれか一項に記載の方法。
<101>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<93>~<100>のいずれか一項に記載の方法。
<102>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<101>に記載の方法。
<103>
前記単離された改変産生細胞を封入する液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<93>~<102>のいずれか一項に記載の方法。
<104>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<93>~<103>のいずれか一項に記載の方法。
<105>
前記レポーターがGFPである、<104>に記載の方法。
<106>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<93>~<105>のいずれか一項に記載の方法。
<107>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<93>~<106>のいずれか一項に記載の方法。
<108>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<93>~<107>のいずれか一項に記載の方法。
<109>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTFである、<93>~<108>のいずれか一項に記載の方法。
<110>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<93>~<109>のいずれか一項に記載の方法。
<111>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<93>~<110>のいずれか一項に記載の方法。
<112>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<111>に記載の方法。
<113>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<93>~<112>のいずれか一項に記載の方法。
<114>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<113>に記載の方法。
<115>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する前記液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<111>~<114>のいずれか一項に記載の方法。
<116>
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<93>~<115>のいずれか一項に記載の方法。
<117>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<116>に記載の方法。
<118>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<93>~<115>のいずれか一項に記載の方法。
<119>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<93>~<118>のいずれか一項に記載の方法。
<120>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<93>~<119>のいずれか一項に記載の方法。
<121>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、<120>に記載の方法。
<122>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<121>に記載の方法。
<123>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<122>に記載の方法。
<124>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<120>に記載の方法。
<125>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<124>に記載の方法。
<126>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<120>に記載の方法。
<127>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<126>に記載の方法。
<128>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<127>に記載の方法。
<129>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<120>~<126>のいずれか一項に記載の方法。
<130>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<1>~<30>のいずれか一項に記載の方法。
<131>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<1>~<30>のいずれか一項に記載の方法。
<132>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<1>~<30>のいずれか一項に記載の方法。
<133>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<31>~<62>のいずれか一項に記載の方法。
<134>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<31>~<62>のいずれか一項に記載の方法。
<135>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<31>~<62>のいずれか一項に記載の方法。
<136>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<63>~<92>のいずれか一項に記載の方法。
<137>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<63>~<92>のいずれか一項に記載の方法。
<138>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<63>~<92>のいずれか一項に記載の方法。
<139>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<93>~<129>のいずれか一項に記載の方法。
<140>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<93>~<129>のいずれか一項に記載の方法。
<141>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<93>~<129>のいずれか一項に記載の方法。
本開示に係る態様は以下の態様も含む。
<1>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<2>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<1>に記載の方法。
<3>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<2>に記載の方法。
<4>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<2>又は<3>に記載の方法。
<5>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<4>に記載の方法。
<6>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<2>~<5>のいずれか一項に記載の方法。
<7>
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<1>~<6>のいずれか一項に記載の方法。
<8>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<7>に記載の方法。
<9>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<1>~<6>のいずれか一項に記載の方法。
<10>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<1>~<9>のいずれか一項に記載の方法。<11>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<1>~<10>のいずれか一項に記載の方法。
<12>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能マーカーである、<11>に記載の方法。<13>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<12>に記載の方法。
<14>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<12>に記載の方法。
<15>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<12>に記載の方法。
<16>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<14>に記載の方法。
<17>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<11>に記載の方法。
<18>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<17>に記載の方法。
<19>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<18>に記載の方法。
<20>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<11>~<18>のいずれか一項に記載の方法。
<21>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<1>~<20>のいずれか一項に記載の方法。
<22>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<1>~<21>のいずれか一項に記載の方法。
<23>
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<1>~<22>のいずれか一項に記載の方法。
<24>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<1>~<23>のいずれか一項に記載の方法。
<25>
前記レポーターがGFPである、<24>に記載の方法。
<26>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<1>~<25>のいずれか一項に記載の方法。
<27>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<1>~<26>のいずれか一項に記載の方法。
<28>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<1>~<27>のいずれか一項に記載の方法。
<29>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)である、<1>~<27>のいずれか一項に記載の方法。
<30>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<1>~<29>のいずれか一項に記載の方法。
<31>
改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、
遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<32>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<31>に記載の方法。
<33>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<32>に記載の方法。
<34>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<33>に記載の方法。
<35>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<34>に記載の方法。
<36>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<32>~<35>のいずれか一項に記載の方法。
<37>
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<31>~<36>のいずれか一項に記載の方法。
<38>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<37>に記載の方法。
<39>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<31>~<36>のいずれか一項に記載の方法。
<40>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<31>~<39>のいずれか一項に記載の方法。
<41>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<31>~<40>のいずれか一項に記載の方法。
<42>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、<41>に記載の方法。
<43>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<42>に記載の方法。
<44>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<42>に記載の方法。
<45>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<42>に記載の方法。
<46>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<44>に記載の方法。
<47>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<41>に記載の方法。
<48>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<47>に記載の方法。
<49>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<48>に記載の方法。
<50>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<41>~<48>のいずれか一項に記載の方法。
<51>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<31>~<50>のいずれか一項に記載の方法。
<52>
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換する前に作製される、<51>に記載の方法。
<53>
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換した後に作製される、<51>に記載の方法。
<54>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<31>~<53>のいずれか一項に記載の方法。
<55>
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<31>~<54>のいずれか一項に記載の方法。
<56>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<31>~<55>のいずれか一項に記載の方法。
<57>
前記レポーターがGFPである、<56>に記載の方法。
<58>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<31>~<57>のいずれか一項に記載の方法。
<59>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<31>~<58>のいずれか一項に記載の方法。
<60>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<31>~<59>のいずれか一項に記載の方法。
<61>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)である、<31>~<58>のいずれか一項に記載の方法。
<62>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<31>~<61>のいずれか一項に記載の方法。
<63>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<64>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<63>に記載の方法。
<65>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<64>に記載の方法。
<66>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<65>に記載の方法。
<67>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<66>に記載の方法。
<68>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<64>~<67>のいずれか一項に記載の方法。
<69>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<63>~<68>のいずれか一項に記載の方法。
<70>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<69>に記載の方法。
<71>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<63>~<78>のいずれか一項に記載の方法。
<72>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<1>~<71>のいずれか一項に記載の方法。
<73>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<1>~<72>のいずれか一項に記載の方法。
<74>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、<73>に記載の方法。
<75>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<74>に記載の方法。
<76>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<74>に記載の方法。
<77>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<74>に記載の方法。
<78>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<76>に記載の方法。
<79>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<73>に記載の方法。
<80>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<79>に記載の方法。
<81>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<80>に記載の方法。
<82>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<73>~<80>のいずれか一項に記載の方法。
<83>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<63>~<82>のいずれか一項に記載の方法。
<84>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<63>~<83>のいずれか一項に記載の方法。
<85>
単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<63>~<84>のいずれか一項に記載の方法。
<86>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<63>~<85>のいずれか一項に記載の方法。
<87>
前記レポーターがGFPである、<86>に記載の方法。
<88>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<63>~<87>のいずれか一項に記載の方法。
<89>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<63>~<88>のいずれか一項に記載の方法。
<90>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<63>~<89>のいずれか一項に記載の方法。
<91>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)である、<63>~<89>のいずれか一項に記載の方法。
<92>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<63>~<91>のいずれか一項に記載の方法。
<93>
改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<94>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、
(a)フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、及び
(b)改変センサー細胞を含み、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、並びに
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<95>
遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成することであって、各液滴は、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれていること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変センサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質をベースとしたセンサーは、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。
<96>
前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである、<93>~<95>のいずれか一項に記載の方法。
<97>
前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が粒子によって安定化される、<93>~<96>のいずれか一項に記載の方法。
<98>
前記粒子が、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子である、<97>に記載の方法。
<99>
前記部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子がシリカをベースとしたナノ粒子である、<98>に記載の方法。
<100>
前記液滴がマイクロ流体制御下にある、<93>~<99>のいずれか一項に記載の方法。
<101>
前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、<93>~<100>のいずれか一項に記載の方法。
<102>
改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、<101>に記載の方法。
<103>
前記単離された改変産生細胞を封入する液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、<93>~<102>のいずれか一項に記載の方法。
<104>
前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、<93>~<103>のいずれか一項に記載の方法。
<105>
前記レポーターがGFPである、<104>に記載の方法。
<106>
前記改変タンパク質センサーが転写因子である、<93>~<105>のいずれか一項に記載の方法。
<107>
前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、<93>~<106>のいずれか一項に記載の方法。
<108>
前記改変タンパク質センサーが、LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、<93>~<107>のいずれか一項に記載の方法。
<109>
前記改変タンパク質センサーが、表1に列挙された改変aTFである、<93>~<108>のいずれか一項に記載の方法。
<110>
前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、<93>~<109>のいずれか一項に記載の方法。
<111>
前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<93>~<110>のいずれか一項に記載の方法。
<112>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<111>に記載の方法。
<113>
前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、<93>~<112>のいずれか一項に記載の方法。
<114>
前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、<113>に記載の方法。
<115>
前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する前記液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、<111>~<114>のいずれか一項に記載の方法。
<116>
改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがエピソーム的にコードされている、<93>~<115>のいずれか一項に記載の方法。
<117>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAがプラスミド上にコードされている、<116>に記載の方法。
<118>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードするDNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、<93>~<115>のいずれか一項に記載の方法。
<119>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、<93>~<118>のいずれか一項に記載の方法。
<120>
前記レポーターが、前記センサーをベースとしたタンパク質によってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、<93>~<119>のいずれか一項に記載の方法。
<121>
前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、<120>に記載の方法。
<122>
前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、<121>に記載の方法。
<123>
前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、<122>に記載の方法。
<124>
前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、<120>に記載の方法。
<125>
前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、<124>に記載の方法。
<126>
前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、<120>に記載の方法。
<127>
前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、<126>に記載の方法。
<128>
前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質をベースとしたセンサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、<127>に記載の方法。
<129>
前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、<120>~<126>のいずれか一項に記載の方法。
<130>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<1>~<30>のいずれか一項に記載の方法。
<131>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<1>~<30>のいずれか一項に記載の方法。
<132>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<1>~<30>のいずれか一項に記載の方法。
<133>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<31>~<62>のいずれか一項に記載の方法。
<134>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<31>~<62>のいずれか一項に記載の方法。
<135>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<31>~<62>のいずれか一項に記載の方法。
<136>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<63>~<92>のいずれか一項に記載の方法。
<137>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<63>~<92>のいずれか一項に記載の方法。
<138>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<63>~<92>のいずれか一項に記載の方法。
<139>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが前記産生細胞内にコードされている、<93>~<129>のいずれか一項に記載の方法。
<140>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、<93>~<129>のいずれか一項に記載の方法。
<141>
前記改変タンパク質をベースとしたセンサー及びレポーターが、別の液滴に封入された後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合されるセンサー細胞内にコードされている、<93>~<129>のいずれか一項に記載の方法。
Claims (47)
- 遺伝的に多様な産生細胞のプールからの改変産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、改変タンパク質センサーが、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、ここで、前記改変タンパク質センサーは表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)であるか、又は前記改変タンパク質センサーはLysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記産生細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。 - 前記回収は、
(a)前記液滴を破壊すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、請求項2又は請求項3に記載の方法。
- 前記液滴を破壊することは、所望のレベルの前記標的分子を産生する単離された改変産生細胞を封入する液滴を破壊して、前記改変産生細胞の集団を形成することを含み、前記改変産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する改変産生細胞の濃縮集団である、請求項2~請求項4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサーはDNAによりコードされ、前記DNAがエピソーム的にコードされている、請求項1~請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサーをコードする前記DNAがプラスミド上にコードされている、請求項6に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサーはDNAによりコードされ、前記DNAが前記産生細胞のゲノムに組み込まれている、請求項1~請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサーが、前記産生細胞内において、トランスフェクトされる若しくはトランスフェクトされている、形質導入される若しくは形質導入されている、形質転換される若しくは形質転換されている、又はそれ以外の方法で利用可能にされる若しくは利用可能にされている、請求項1~請求項8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーターが、前記改変タンパク質センサーによってトランスに活性化される検出可能なマーカーをコードする遺伝子である、請求項1~請求項9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能なマーカーが酵素又は選択可能なマーカーである、請求項10に記載の方法。
- 前記酵素が、lacZ、ルシフェラーゼ、又はアルカリホスファターゼから選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記選択可能なマーカーが栄養要求株、抗生物質、耐性マーカー、毒素、又は分光的に検出可能な遺伝子産物である、請求項11に記載の方法。
- 前記選択可能なマーカーが蛍光タンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 前記分光的に検出可能な遺伝子産物が分光法又は分光分析により検出される、請求項13に記載の方法。
- 前記レポーターをコードする遺伝子がエピソーム的にコードされている、請求項10~請求項15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーターをコードする遺伝子がプラスミド上にエピソーム的にコードされている、請求項16に記載の方法。
- 前記レポーターをコードする遺伝子が、前記改変タンパク質センサーをコードする遺伝子と同じプラスミド上にコードされている、請求項17に記載の方法。
- 前記レポーターをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項10~請求項15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、前記改変産生株ライブラリーは、1又は複数の標的分子を産生するように改変される、請求項1~請求項19のいずれか一項に記載の方法。
- 改変産生株ライブラリーは、多重自動ゲノム工学法(MAGE)、プラスミドをベースとした産生の変動、又は非GMO法から選択されるゲノム多様化技術によって生成され、非GMO法は、化学的変異誘発、放射線、及びトランスポゾンから選択される、請求項1~請求項20のいずれか一項に記載の方法。
- 単離された改変産生細胞を封入する前記液滴が、増殖培地及び任意の必要な誘導剤をさらに含む、請求項1~請求項21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサーによって提供される前記読み取りレベルがレポーターによるものである、請求項1~請求項22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーターがGFPである、請求項23に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサーが転写因子である、請求項1~請求項24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、請求項25に記載の方法。
- 前記標的分子が、表1(標的分子の特性)に列挙された標的分子から選択される、請求項1~請求項26のいずれか一項に記載の方法。
- 改変センサープラスミドを用いて改変産生細胞のプールを形質転換することであって、前記改変センサープラスミドは改変タンパク質センサーをコードすること、ここで、前記改変タンパク質センサーは表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)であるか、又は前記改変タンパク質センサーはLysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、
遺伝的に多様な産生細胞の前記プールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーが、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を有する前記液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記産生細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。 - 前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換する前に作製される、請求項28に記載の方法。 - 前記改変産生細胞のプールが採取される、改変産生株ライブラリーを作製することをさらに含み、
前記改変産生株ライブラリーが、改変センサープラスミドで前記改変産生細胞のプールを形質転換した後に作製される、請求項28に記載の方法。 - 遺伝的に多様な産生細胞のプールからの産生細胞のそれぞれを液滴に封入して、改変産生細胞を封入する複数の液滴を形成すること、
前記産生細胞を含む各液滴を、改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞を封入する液滴と融合させることであって、前記改変タンパク質をベースとしたセンサー細胞は改変タンパク質センサーを産生すること、ここで、前記改変タンパク質センサーは表1に列挙された改変aTF(aTF「外枠」)であるか、又は前記改変タンパク質センサーはLysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR、及びCrpファミリーメンバーから選択される改変原核生物転写調節因子ファミリーメンバーである、
標的分子のレベルについて前記液滴をアッセイすることであって、前記改変タンパク質センサーが、レポーターの活性化又は抑制を通じて前記産生細胞によって産生される所望の標的分子のレベルの読み取りを提供すること、
前記融合された液滴を選別して所望のレベルの前記標的分子を産生する産生細胞を含む液滴を単離すること、及び
所望のレベルの前記標的分子を産生する前記細胞を回収して、産生細胞の集団を形成することであって、前記産生細胞の集団は、所望のレベルの前記標的分子を産生する濃縮集団であること
を含む、改変産生細胞の集団を作製する方法。 - 前記選別は、蛍光活性化液滴選別(FADS)又は蛍光活性化細胞選別(FACS)による、請求項31に記載の方法。
- 前記回収は、
(a)前記液滴を選別すること、
(b)前記遺伝的に多様な産生細胞を選別すること、及び
(c)増殖培地で前記産生細胞を増殖させること
を含む、請求項31又は請求項32に記載の方法。 - 前記改変タンパク質センサーが転写因子である、請求項31~請求項33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記転写因子がアロステリック転写因子(aTF)である、請求項34に記載の方法。
- 前記液滴のそれぞれは、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれている、請求項28に記載の方法。
- 前記液滴のそれぞれは、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれている、請求項1に記載の方法。
- 前記液滴のそれぞれは、フッ素化をベースとした油又は乳剤を含む非混和性の連続相で囲まれている、請求項31に記載の方法。
- 前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が、有機油、フッ素化油、フッ素化ポリマー、フルオロカーボン中水型乳剤、パーフルオロカーボン中水型乳剤、又はそれらの組み合わせである、請求項36~請求項38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フッ素化をベースとした油又は乳剤が粒子によって安定化される、請求項36~請求項39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粒子が、部分的にフッ素化されたナノ粒子又は部分的に疎水性のナノ粒子である、請求項40に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサー及び前記レポーターが、個別の液滴に封入されており、前記個別の液滴はその後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合される、請求項28~請求項30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサー及び前記レポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、請求項31~請求項35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサー及び前記レポーターが、個別の液滴に封入されたセンサー細胞内にコードされており、前記個別の液滴はその後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合される、請求項31~請求項35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサー及び前記レポーターが前記産生細胞内にコードされている、請求項36~請求項41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサー及び前記レポーターが、共封入されたセンサー細胞内にコードされている、請求項36~請求項41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変タンパク質センサー及び前記レポーターが、個別の液滴に封入されたセンサー細胞内にコードされており、前記個別の液滴はその後に改変産生細胞を含む前記液滴と融合される、請求項36~請求項41のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862631090P | 2018-02-15 | 2018-02-15 | |
US62/631,090 | 2018-02-15 | ||
US201862730355P | 2018-09-12 | 2018-09-12 | |
US62/730,355 | 2018-09-12 | ||
PCT/US2019/018273 WO2019161243A1 (en) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | Sensor systems |
JP2020566202A JP2021514202A (ja) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | センサー系 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020566202A Division JP2021514202A (ja) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | センサー系 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024029259A true JP2024029259A (ja) | 2024-03-05 |
Family
ID=67618834
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020566202A Pending JP2021514202A (ja) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | センサー系 |
JP2024006721A Pending JP2024029259A (ja) | 2018-02-15 | 2024-01-19 | センサー系 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020566202A Pending JP2021514202A (ja) | 2018-02-15 | 2019-02-15 | センサー系 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200399632A1 (ja) |
EP (1) | EP3752596A4 (ja) |
JP (2) | JP2021514202A (ja) |
KR (1) | KR20200121824A (ja) |
CN (1) | CN112088212A (ja) |
CA (1) | CA3091145A1 (ja) |
WO (1) | WO2019161243A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022060140A1 (ko) | 2020-09-21 | 2022-03-24 | 주식회사 엘지에너지솔루션 | 리튬 이차전지 및 이의 제조방법 |
WO2023240871A1 (zh) * | 2022-06-16 | 2023-12-21 | 森瑞斯生物科技(深圳)有限公司 | 谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用 |
GB202215611D0 (en) * | 2022-10-21 | 2022-12-07 | Univ College Dublin National Univ Of Ireland | A biosensor comprising a genetically modified microorganism |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100022414A1 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-28 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet Libraries |
WO2013116698A2 (en) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Invenra, Inc. | High throughput screen for biologically active polypeptides |
US10550384B2 (en) * | 2013-03-14 | 2020-02-04 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for selecting microbes from a diverse genetically modified library to detect and optimize the production of metabolites |
JP2017506080A (ja) * | 2014-02-21 | 2017-03-02 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | アロステリックタンパク質の新規設計 |
GB201421850D0 (en) * | 2014-12-09 | 2015-01-21 | Bactevo Ltd | Method for screening for bioactive natural products |
WO2017062965A1 (en) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Highly sensitive optical sensor for polymerase screening |
-
2019
- 2019-02-15 US US16/970,132 patent/US20200399632A1/en active Pending
- 2019-02-15 EP EP19754205.3A patent/EP3752596A4/en active Pending
- 2019-02-15 WO PCT/US2019/018273 patent/WO2019161243A1/en unknown
- 2019-02-15 CN CN201980026017.5A patent/CN112088212A/zh active Pending
- 2019-02-15 CA CA3091145A patent/CA3091145A1/en active Pending
- 2019-02-15 JP JP2020566202A patent/JP2021514202A/ja active Pending
- 2019-02-15 KR KR1020207025821A patent/KR20200121824A/ko active Search and Examination
-
2024
- 2024-01-19 JP JP2024006721A patent/JP2024029259A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2019161243A1 (en) | 2019-08-22 |
EP3752596A1 (en) | 2020-12-23 |
KR20200121824A (ko) | 2020-10-26 |
US20200399632A1 (en) | 2020-12-24 |
EP3752596A4 (en) | 2021-12-15 |
CN112088212A (zh) | 2020-12-15 |
JP2021514202A (ja) | 2021-06-10 |
CA3091145A1 (en) | 2019-08-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2024029259A (ja) | センサー系 | |
US20190218497A1 (en) | Co-incubating confined microbial communities | |
Scanlon et al. | A high‐throughput screen for antibiotic drug discovery | |
Pantaléon et al. | The Clostridium difficile protease Cwp84 modulates both biofilm formation and cell-surface properties | |
US20190195864A1 (en) | Cell-free sensor systems | |
JP2015506699A (ja) | 生物学的に活性なポリペプチドのハイスループットスクリーニング | |
US20230324306A1 (en) | Method for ultra-high performance screening of biological objects | |
Kaspar et al. | Intercellular communication via the comX-inducing peptide (XIP) of Streptococcus mutans | |
Di Girolamo et al. | Stable and selective permeable hydrogel microcapsules for high-throughput cell cultivation and enzymatic analysis | |
Melzer et al. | Cell wall damage reveals spatial flexibility in peptidoglycan synthesis and a nonredundant role for RodA in mycobacteria | |
Mata Martin et al. | Extrachromosomal nucleolus-like compartmentalization by a plasmid-borne ribosomal RNA operon and its role in nucleoid compaction | |
Wu et al. | Rel is required for morphogenesis of resting cells in Mycobacterium smegmatis | |
Dagkesamanskaya et al. | Use of photoswitchable fluorescent proteins for droplet-based microfluidic screening | |
Steinberg et al. | Collective vortex-like movement of Bacillus subtilis facilitates the generation of floating biofilms | |
Dijamentiuk et al. | Invert emulsions alleviate biotic interactions in bacterial mixed culture | |
Kaiser | Are myxobacteria intelligent? | |
Yang et al. | Alanine 32 in PilA is important for PilA stability and type IV pili function in Myxococcus xanthus | |
Rossoni et al. | Membrane vesicles in Acidithiobacillia class extreme acidophiles: Influence on collective behaviors of ‘Fervidacidithiobacillus caldus’ | |
Steinfeld et al. | Communication determines population-level fitness under cation stress by modulating the ratio of motile to sessile B. subtilis cells | |
Haynes | Characterizing Bacillus subtilis colony morphology in response to environmental acidification | |
Hamm | Molecular Regulation of Bacterial Stress Responses and Pyocin Production | |
Weihs | A supramolecular structure in the membrane of Staphylococcus aureus | |
Teran et al. | Endogenous trans-translation structure visualizes the decoding of the first tmRNA alanine codon | |
McCausland | Global analysis of biomineralization genes in magnetotactic bacteria | |
Frustaci | Developing microfluidics and microscopy approaches to investigate bacterial populations with single-cell resolution |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240214 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240214 |