KR20200120929A - 당뇨병을 치료하기 위한 췌장 세포 및 이를 생성하는 방법 - Google Patents

당뇨병을 치료하기 위한 췌장 세포 및 이를 생성하는 방법 Download PDF

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KR20200120929A
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Abstract

본 개시내용은 당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 조성물, 내배엽 세포로 우선적으로 분화하는 세포를 동정하는 방법, 및 인슐린-생성 췌장 세포를 제조하는 방법뿐만 아니라 인슐린 결핍과 관련된 질환을 치료하기 위한 관련된 사용 방법을 제공한다.

Description

당뇨병을 치료하기 위한 췌장 세포 및 이를 생성하는 방법
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)에 따라 2018년 2월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/628,470호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 세포 생물학, 줄기세포, 및 세포 분화의 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 개시내용은 췌장 세포를 생성하는 방법, 세포-기반 요법을 위한 세포를 동정하는 방법, 및 당뇨병을 치료하기 위한 관련된 사용 방법을 제공한다.
하기 논의는 독자가 본 개시내용을 이해하는 데 도움을 주기 위해 제공되고, 본 개시내용에 대한 종래 기술을 기술하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
당뇨병 및 인슐린
진성 당뇨병(즉, 당뇨병)은 신체가 호르몬 인슐린을 생성하거나 반응하는 능력이 손상되어 탄수화물의 비정상적인 대사와 혈액 및 소변에서 당의 수준이 상승하는 질환이다. 이러한 질환은 대안적으로 제1형 진성 당뇨병, 인슐린-의존성 진성 당뇨병(IDDM), 청소년기 성인 발병 당뇨병(MODY), 잠복성 성인 당뇨병(LADA), 불안정 당뇨병, 저체중 당뇨병, 제1.5형, 제2형, 제3형, 비만-관련 당뇨병, 임신성 당뇨병, 및 당해 분야에서 허용된 다른 명명법으로 기술된, 여러 하위-유형으로 세분화된다.
일반적으로, 인슐린-의존성 당뇨병을 갖는 대상체는 혈당을 충분히 낮추기 위해 외인성 인슐린을 투여하는 것을 필요로 한다. 비-인슐린-의존성 대상체는 인슐린에 대한 민감성, 또는 글루코스의 배출을 향상시키는 약물 부류를 포함하는 약제학적 개재로 혈당을 충분히 낮출 수 있다. 인슐린-의존성 당뇨병을 갖는 대상체는 질환이 제1형, MODY, LADA, 불안정, 저체중, 제1.5형, 제2형, 제3형, 비만 관련 당뇨병 또는 이들의 임의의 조합으로서 라벨링되어 있는지의 여부와 관계없이 대상체에게 인슐린-생성 세포를 이식하는 세포 대체 요법으로부터 혜택을 받을 수 있다.
제I형 당뇨병은 대개 어린이 및 청년에서 진단되고, 이전에는 청소년 당뇨병으로서 알려졌다. 당뇨병을 갖는 사람 중 5 내지 10%만이 이러한 형태의 질환을 갖는다. 성인 발병 당뇨병은 이러한 질환의 가장 일반적인 형태이며, 이는 인슐린-생성 베타 세포의 손상 또는 파괴, 인슐린 내성의 발달, 또는 인슐린-생성 베타 세포의 손상과 인슐린 내성의 발달 둘 다로 인해 발생한다. 당뇨병은 유전적 요인 및 환경적 요인의 조합으로 인해 비만이 아닌 성인 및 어린이에서 발생할 수 있다. 비만인 성인 및 어린이에서, 췌장은 혈당을 조절하기 위해 여분의 인슐린을 만들고자 할 수 있지만, 시간에 따라, 혈당을 정상 수준으로 계속되고 유지시킬 수 없다. 신체는 또한 생성되는 인슐린에 덜 민감하게 될 수 있다. 인슐린-분비 베타 세포의 장기적인 과잉-활동은 베타-세포 기능장애 및 사망으로 이어질 수 있다.
당뇨병 증상은 대상체의 혈당 변동 정도에 따라 달라진다. 일부 사람들, 특히, 전당뇨병 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병을 갖는 사람은 초기에 증상을 나타내지 않을 수 있다. 제I형 당뇨병에서, 증상이 빠르게 나타나는 경향이 있고 더욱 심해진다.
제I형 당뇨병 및 제II형 당뇨병의 징후 및 증상 중 일부는 갈증 증가; 잦은 배뇨; 극심한 배고픔; 설명할 수 없는 체중 감소; 소변에 케톤의 존재(케톤은 이용 가능한 인슐린이 충분하지 않을 때 발생하는 근육 및 지방의 분해 부산물임); 피로; 과민성; 흐린 시야; 느리게 치유되는 상처; 잇몸 또는 피부 감염 및 질 감염과 같은 빈번한 감염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 요법
인슐린-의존성 당뇨병 환자는 새로운 인슐린 생성 세포의 이식으로 잠재적으로 치료될 수 있지만, 이러한 방법은 이러한 세포가 충분한 양과 질로 얻기 어렵기 때문에 지금까지 제한되었다(예를 들어, 문헌[Pagliuca FW, et al. Cell, 154(2): 428-439 (2014)] 참조). 이에 따라, 인간 줄기세포로부터 인슐린 생성 베타 세포를 더욱 효율적이고 예측 가능한 방식으로 생성하는 것이 오랫동안 생체의학 연구의 목표였다(동일한 문헌 참조). 이러한 목표를 달성하기 위해, 글루코스에 노출될 때 인슐린을 생산하는 균일한 베타 세포 집단을 생성하는 프로토콜이 확립되어야 한다. 그러나, 이러한 프로토콜은 아직 파악하기 어렵다. 수많은 연구 그룹은 상이한 세포주를 사용하여 다양한 결과를 생성한 다양한 프로토콜을 제안하였다. 이러한 기능적 베타 세포의 일관되지 않는 생산은 치료 이익을 달성하기 위해 요망되는 총 세포 용량을 증가시키고, 이에 따라, 잠재적인 치료법의 비용을 증가시키고 다양한 결과로 인한 임상 적용 가능성을 제한한다.
인간 줄기로부터 인슐린-생성 베타 세포를 생성하기 위한 대부분의 확립된 프로토콜은 매우 가변적인 세포 집단을 생성한다(예를 들어, 문헌[Pagliuca FW, et al. Cell, 154(2): 428-439 (2014)] 참조). 실제로, 제공된 분화 프로토콜을 특정 세포주에 맞게 조정하는 것이 본 분야에서 일반적인 관행이고, 이에 따라, 당해 분야 내에서 분화에 대한 임의의 표준화를 방해한다. 다양한 분화 프로토콜로부터 베타 세포 수율을 개선시키는 방법은 통상적으로 반복적인, 시행착오 타입의 방법에서 분화 경로에 영향을 미치는 다양한 인자들의 조합을 시험하는 것을 포함하였다(예를 들어, 문헌[Pagliuca FW, et al. Cell, 154(2): 428-439 (2014); Rezenia A. et al. Nat. Biotech., 32:1121-33 (2014); Schulz TC et al. Plos One, 7:e37004 (2012). Chetty S. et al. Nat. Methods, 10:553-556 (2012)] 참조). 이에 따라, 하나의 출발 줄기세포 집단으로부터 베타 세포를 제조하기 위한 특정 프로토콜은 상이한 출발 집단을 분화하는 데 효과적이지 않을 수 있다.
또한, 이러한 분야의 연구자들이 지속적으로 높은 백분율의 인슐린-생성 세포를 갖는 분화된 집단을 얻기 위해 고군분투했기 때문에, 얻어진 분화된 세포 집단 내의 불일치는 임의의 제안된 치료법의 임상 적용에 영향을 미쳤다. 이러한 것은 당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 요법의 잠재적인 효능을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 이종 세포의 집단을 함유한 세포 이식체의 종양발생 가능성에 대한 우려를 제기한다. 추가적으로, 세포 배취(cell batch) 간의 낮은 재현성은 세포를 생산하는 비용에 직접적으로 영향을 미치고, 이러한 프로토콜의 임상으로의 변형을 제한한다.
별개의 분화 프로토콜을 사용하는 데 있어서 이러한 변동성 중 일부는 출발 세포주로 추적될 수 있다. 예를 들어, 만능성 세포주가 특정 계통으로 분화하는 이의 능력에 있어서 크게 다를 수 있음을 나타낸다(문헌[Bock C, et al. Cell, 144:439-452 (2011); Lim H, et al. J. Vis . Exp ., (90):e51755 (2014); Osafune K, et al. Nat. Biotechnol ., 26:313-315 (2008)] 참조). 현재 사용되는 분화 프로토콜에 대한 반응에서 개별 인간 줄기세포의 이러한 다양한 능력은, 연구자들이 제공된 세포주 또는 출발 세포가 궁극적으로 치료 세포를 생산할 가능성을 지시하지 않기 때문에, 극복하기 어려운 장애물인 것으로 입증되었다.
또한, 선행 기술로부터 제공된 지침은 실제로 약간 상이한 유전적 배경을 갖는 세포주를 사용할 때 역효과를 낼 수 있다. 예를 들어, 만능성 줄기세포로부터 인슐린-생성 세포를 생성하기 위한 확립된 프로토콜의 일관된 특징은 레티노산 및 사이클로파민에 대한 노출을 제한하는 것이다(문헌[Nostro et al. Stem Cell Reports, 4:1-14 (2015)] 참조). 종래 기술의 다른 일관된 지침은 췌장 세포의 적절한 성숙을 위해 부유 상태로 3차원 배양물에서 분화를 개시하는 것이 요구된다는 것이다(문헌[Pagliuca FW, et al. Cell, 154(2): 428-439 (2014), Rezania et al. Nature Biotechnology, 32(11):1121-33 (2014)] 참조). 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 하기의 이러한 지침은 다양한 줄기세포주로부터 인슐린-분비 세포의 분화를 실제로 억제할 수 있다.
이에 따라, 당뇨병의 치료를 위한 치료제, 인슐린-생성 세포를 생성하는 개선되고 예측 가능한 방법이 여전히 요구되고 있다. 본 개시내용은 이러한 요구를 충족한다.
본 명세서에는 인슐린을 생성하고 당뇨병을 치료하기 위해 이용될 수 있는 세포 및 세포 조성물뿐만 아니라 이를 제조하고 동정하는 방법이 기술된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 포유류 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서, 부착 상태로 포유류 줄기세포를 배양하여, 포유류 줄기세포가 자발적으로 3차원 구조를 형성하게 하는 단계; 및 부유 상태로 3차원 구조를 배양하는 단계를 포함하며, 배양 단계는 레티노산 및 사이클로파민에 대한 적어도 20일 노출을 포함하되, 3차원 구조의 줄기세포를 Wnt3A에 노출시키는 것을 포함하지 않는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서, 액티빈-A(Activin-A) 및 보르트만닌(Wortmannin)을 포함하는 제1 배지 중에서 부착 기질 상에서 포유류 줄기세포를 배양하는 단계로서, 포유류 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는, 상기 배양하는 단계; 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 배지 중에서 세포를 추가로 배양하는 단계; 및 세포가 3차원 세포 구조를 형성할 때 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계를 포함하되, 세포는 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되는 것인 방법을 제공한다.
상기 양태의 일부 실시형태에서, 포유류 줄기세포는 인간 줄기세포일 수 있으며, 일부 실시형태에서, 포유류 줄기세포는 비-인간 영장류 줄기세포일 수 있다. 상기 양태의 일부 실시형태에서, 포유류 줄기세포는 세포주로부터 유래된 것이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 포유류 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서, 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 포유류 줄기세포를 배양하여 포유류 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계; 및 내분비-유도 인자를 포함하는 제2 배지 중에서 내배엽 세포를 배양하여 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계를 포함하되, 포유류 줄기세포는 내배엽 세포로의 분화 전에 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는 것인 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 포유류 줄기세포는 인간 줄기세포, 비-인간 영장류 줄기세포, 또는 돼지, 소, 양, 말, 개 또는 고양이를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 포유동물로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽-유도 인자는 액티빈-A, 레티노산, 및/또는 사이클로파민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 배지는 보르트만닌을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 배지는 Wnt3A를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포는 제1 배지 중에서 1 내지 3일 동안 배양된다.
일부 실시형태에서, 제2 배지는 노긴(noggin) 및/또는 KGF를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 배지는 레티노산 및 사이클로파민을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 제2 배지 중에서 1 내지 4일 동안 배양된다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 KGF를 포함하는 제3 배지 중에서 내분비 세포를 추가로 배양하여 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제3 배지는 노긴 및/또는 표피 성장 인자(EGF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 배지는 레티노산 및 사이클로파민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 제3 배지 중에서 1 내지 4일 동안 배양된다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, 및/또는 Alk5i II를 포함하는 제4 배지 중에서 췌장 전구 세포를 추가로 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제4 배지는 T3을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제4 배지는 레티노산 및 사이클로파민을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 제4 배지 중에서 1 내지 4일 동안 배양된다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 Alk5i II 및/또는 레티노산을 포함하는 제5 배지 중에서 췌장 전구 세포를 추가로 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제5 배지는 T3을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제5 배지는 레티노산 및 사이클로파민을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 제5 배지 중에서 1 내지 5일 동안 배양된다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 Alk5i II, 니코틴아마이드, 및/또는 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I을 포함하는 제6 배지 중에서 췌장 전구 세포를 추가로 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제6 배지는 T3 및/또는 BMP4를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제6 배지는 레티노산 및 사이클로파민을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제6 배지는 글루카곤을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 제6 배지 중에서 1 내지 9일 동안 배양된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인슐린-분비 췌장 세포를 생성하는 방법으로서, 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포를 배양하여 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 인간 줄기세포는 내배엽 세포로의 분화 전에 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는, 상기 분회시키는 단계; 및 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 제2 배지 중에서 내배엽 세포를 배양하여 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계; KGF, 노긴, 및 EGF를 포함하는 제3 배지 중에서 내분비 세포를 배양하여 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계; 및 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, 및 Alk5i II를 포함하는 제4 배지 중에서 췌장 전구 세포를 배양하여 췌장 전구 세포를 인슐린-생성 췌장 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이러한 양태의 일부 실시형태에서, 제2 배양 배지는 KGF를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 줄기세포는 췌장 1차 조직으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 제4 배지는 갑상선 호르몬, 예를 들어, T3을 포함할 수 있다.
이러한 양태의 일부 실시형태에서, 제3 배지 및 제4 배지 둘 다는 레티노산 및 사이클로파민을 포함할 수 있다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 제5 배지 및/또는 제6 배지 중에서 세포를 추가로 배양하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, 제5 배지는 Alk5I II 및 레티노산, 및 선택적으로 사이클로파민을 포함하며, 제6 배지는 Alk5i II, 니코틴아민, IGF-I, 및 선택적으로 레티노산 및 사이클로파민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제6 배지는 글루카곤을 포함할 수 있다.
상기 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 30일 이하 동안 배양될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 조성물로서, 이를 필요로 하는 인간 대상체에 이식하기 위한 적합한 운반체(carrier) 및 대리 췌장 세포의 집단을 포함하되, 대리 췌장 세포의 적어도 66%는 인슐린-생성 췌장 세포인 세포-기반 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 대리 췌장 세포의 적어도 66%는 NeuroD1을 발현시키며, 일부 실시형태에서, 대리 췌장 세포의 적어도 68%는 Nkx6.1을 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 인슐린-생성 췌장 세포는 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 부착 기질 상에서 인간 줄기세포의 집단을 배양하는 단계로서, 포유류 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는 것인 단계; 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 배지 중에서 세포를 추가로 배양하는 단계; 및 세포가 3차원 세포 구조를 형성할 때 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계를 포함하되, 세포는 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되는 것인 방법에 따라 유래된 것이다.
일부 실시형태에서, 내배엽-유도 인자는 액티빈-A 및/또는 보르트만닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 배지는 KGF, 노긴, EGF, 및/또는 갑상선 호르몬, 예를 들어, T3을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대리 췌장 세포는 매크로-캡슐에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 세포는 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 글루코만난, 또는 이들의 조합물을 포함하는 매크로-캡슐에서 캡슐화될 수 있다.
상기 양태의 일부 실시형태에서, 인간 줄기세포는 췌장 1차 조직으로부터 유래되거나, 인간 배아 줄기세포이거나, 유도 만능 줄기세포이거나, 만능성이 아닌 재프로그래밍된 세포이다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍된 세포는 예를 들어, 세포의 게놈 내에 재프로그래밍 유전자를 도입하지 않고 재프로그래밍 유전자를 발현시킴으로써, 췌장 1차 조직으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 유전자는 게놈 내에 도입되지 않은, 적어도 하나의 에피솜 발현 플라스미드 상에 인코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 유전자는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 내배엽 계통으로 우선적으로 분화시키는 미분화 세포를 동정하는 방법으로서, 미분화 세포에서 BHMT2 및 NAP1L1의 발현을 평가하는 단계, 및 BHMT2 발현이 대조군 세포에 비해 하향-조절되고 NAP1L1 발현이 대조군 세포에 비해 상향-조절되는 경우 내배엽 계통으로 분화시키기 위한 선호도를 갖는 것으로서 세포를 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 미분화 세포에서 Cox7A1 및 HSPB2의 발현을 평가하는 단계, 및 Cox7A1 및 HSPB2 발현 둘 다가 대조군 세포에 비해 하향-조절되는 경우 내배엽 계통으로 분화시키기 위한 선호도를 갖는 것으로서 세포를 동정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 대조군 세포는 내배엽 계통보다 우선 분화 또는 중배엽 계통으로 분화시키는 실질적인 무능력을 나타내지 않는 만능 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 평가된 미분화 세포가 내배엽 계통으로 우선적으로 분화할 때, BHMT2 발현은 대조군 세포에 비해 적어도 2 로그 하향-조절되며, NAP1L1 발현은 대조군 세포에 비해 적어도 2 로그 상향-조절된다. 일부 실시형태에서, Cox7A1 및 HSPB2 발현 둘 다는, 평가된 미분화 세포가 내배엽 계통으로 우선적으로 분화할 때, 대조군 세포에 비해 적어도 2 로그 하향-조절된다.
이러한 양태의 일부 실시형태는 GLIS2, CCDC58, MTX3 및 C7orf29의 발현을 평가하는 것을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 평가된 미분화 세포가 내배엽 계통으로 우선적으로 분화할 때, GLIS2, CCDC58 및 MTX3 발현은 대조군 세포에 비해 상향-조절될 수 있으며, C7orf29 발현은 대조군 세포에 비해 하향-조절될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 수준은 Q-PCR에 의해 및/또는 마이크로어레이 분석에 의해 평가된다.
하기 상세한 설명은 예시적이고 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 추가 설명을 제공하기 위해 의도된다.
도 1A 내지 도 1C는 랑게르한스 섬으로부터 유도 만능 줄기세포(iPSC)주 SR1423의 선택을 도시한 것이다. 도 1A는 SR1423의 선택 방식을 도시한 것이다. 도 1B는 면역염색 후 형광 현미경법에 의해 분화 제3일에 내배엽 마커 Sox17(좌측) 및 HNF3beta(중앙)의 SR1423 발현을 도시한 것이다. 도 1C는 SR1423 세포의 분화 제11일에 췌장 마커 Pdx1(좌측) 및 Nkx6.1(중앙)의 면역염색을 도시한 것이다. 병합된 이미지는 핵 염색과 조합된 마커의 공동-염색을 도시한 것이다. 이미지는 40배 배율로 촬영된 것이다.
도 2는 SR1423 세포가 중배엽 계통으로 잘 분화되지 않음을 도시한 것이다. SR1423은 Sox17(내배엽), 브라큐리(Brachyury)(중배엽), 또는 OTX2(외배엽)에 대해 면역염색된 것이다. 핵 염색(중배엽 프레임에서 명백함)은 총 세포 수를 나타낸다. 이러한 도면은 SR1423 세포가 내배엽 및 외배엽이 될 수 있는 능력을 가짐을 입증하지만(Sox17 및 Otx2의 거의 균일한 라벨링에 의해 표시된 바와 같음), 브라큐리를 발현시키지 못하는 것에 의해 명시된 바와 같이, 중배엽으로 거의 분화되지 않는다.
도 3A 내지 도 3D는 SR1423 세포가 만능성 줄기세포의 전형적인 특징을 가지고 있음을 도시한 것이다. 도 3A는 SR1423 세포가 만능성 마커 Oct4, Tra-1-81, Tra-1-60, Sox2, SSEA를 발현시킴을 도시한 것이다. 도 3B는 40회 계대 배양 후 SR1423 세포의 핵형이 정상임을 도시한 것이다. 도 3C는 단일 탠덤 반복 분석(STR)에 의해 평가된 바와 같은 DNA 지문을 도시한 것이다. 도 3D는 SR1423 세포 배가 시간을 도시한 것이다.
도 4A 및 도 4B는 SR1423 세포가 내배엽 계통보다 우선 분화와 상관 관계가 있는 유전자 발현 패턴을 가짐을 도시한 것이다. 도 4A는 SR1423, B, C, 및 D의 유전자 발현 프로파일 클러스터 분석을 도시한 것이다. 내배엽보다 우선 분화를 나타내는 두 개의 세포주(SR1423 및 B)와 우선 분화를 나타내지 않는 두 개의 세포주(C, D) 간의 발현 프로파일의 상관관계는 자율 계층적 클러스터링 분석에 의해 입증되었다. 상향 조절된 유전자는 적색을 표시되며, 하향 조절된 유전자는 녹색으로 표시된다. 차별적으로 발현된 유전자의 서브세트는 조건들 간에 큰 발현 차이를 갖는 유전자를 식별하는 강도 필터를 기초로 하여 이러한 클러스터링 분석으로부터 선택되었다. 가장 큰 발현 차이를 갖는 250개의 유전자가 표시된다. 도 4B qRT는 A에서 확인된 상향 및 하향 조절된 유전자의 서브세트의 PCR 검증을 도시한 것이다.
도 5A 및 도 5B는 SR1423 세포가 강력한 췌장, 호르몬 분비 세포 집단을 생성함을 도시한 것이다. 도 5A는 상단 행에서 Pdx(좌측), Nkx6.1(중앙) 및 병합(우측)에 대한 면역염색된 28일 후 SR1423 분화를 도시한 것이다. 하단 행은 인슐린(좌측), 글루카곤(중앙), 및 병합(우측)에 대한 면역염색을 도시한 것이다. "병합" 이미지는 핵 염색을 포함한다. 모든 이미지는 분화 28일 후 40배 본래 배율(n=10)로 촬영되었다. 도 5B는 집단에서 췌장 세포의 평균 순도의 정량화를 도시한 것이다. 68%의 세포는 Nkx6.1을 발현시키며 66.5%는 인슐린을 발현시키는 것으로 확인되었다.
도 6A 내지 도 6C는 분화가 KGF를 배제함으로써 여러 세포주에서 개선될 수 있음을 도시한 것이다. 도 6A는 KGF와 함께 또는 이의 없이 분화 후 SR1423 세포의 Pdx(좌측) 및 Nkx6.1(중앙)의 면역형광 염색을 도시한 것이다. 도 6B는 KGF와 함께 또는 이의 없이 분화 후 BGO1V의 Pdx(좌측) 및 Nkx6(중앙)의 면역형광 염색을 도시한 것이다. 도 6C는 HDC57 및 BGO1V 세포에서 KGF에 초기 내배엽 세포를 노출시키는 공개된 프로토콜과 개시된 프로토콜을 비교한 것이다. 발현 수준은 원시 적분 밀도(Raw Integrated density)(n=10)에 의해 측정되었고, -KGF 프로토콜 및 +KGF 프로토콜을 비교하였다. 이미지는 40배 배율로 수집되었다. 오차막대는 평균SD를 나타낸 것이다: *P<0.05; ****P<0.0001; ns, 유의미하지 않음.
도 7은 SR1423 분화가 높은 수준의 호르몬-분비를 갖는 배양물을 산출함을 도시한 것이다. 이는 글루코스에 대한 반응으로 SR1423 세포 및 HDC57 세포로부터의 인슐린 분비 및 글루카곤 분비를 비교함으로써 확립되었다. 인슐린 수준 및 글루카곤 수준은 C-펩타이드(인슐린에 대한 대리물로서) 또는 글루카곤 ELISA를 통해 평가되었다.
도 8은 동물 모델에서 당뇨병의 역전을 도시한 것이다. 이식된 세포는 스트렙토조토신-유도된 정상 마우스에 이식 후 혈당을 조절한다. 캡슐화된 세포는 0일에 이식되었다. 나타난 결과는 3마리 마우스의 평균이다. 오차막대는 표준 편차이다.
도 9A 내지 도 9F는 비-인간 영장류(NHP) 조직으로부터 유래된 줄기세포주의 대표적인 예를 도시한 것이다. NHP 도너 A로부터의 미분화된 세포주 A1.3은 만능성 마커 Oct4, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-60(A 내지 D)을 발현시킨다. 이러한 세포는 분화 4일째에 내배엽 마커 Sox17 및 HNF2beta를 발현시키며(E), 12일째에 췌장 마커 Pdx1 및 Nkx6.1을 발현시킨다(F). 세포의 핵은 염색된다.
도 10A 및 도 10B는 글루카곤에 대한 노출이 인슐린 및 글루카곤을 공동-발현시키는 세포의 양을 감소시킨다.
본 명세서에는 당뇨병을 치료하기 위해 사용될 수 있는 인슐린-분비 세포, 및 인간 인슐린-생성 베타 세포의 순수한 치료 세포 집단을 생성시키는 개선된 방법이 기술된다. 보다 상세하게는, 본 개시내용은 포유류 인슐린-분비 세포를 생산하는 방법으로서, 단순 분화 프로토콜이 글루코스에 반응하여 인슐린을 분비시키는 성숙한 표현형을 나타내는 인슐린-분비 세포의 순수한 집단을 산출할 수 있도록, 내배엽 계통으로 분화하고자 하는 선호 또는 소인을 갖는 줄기세포주로 배양을 개시하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 개시된 프로토콜은 다른 단계들 중에서, 줄기세포(특히, 내배엽 계통에 대한 선호 또는 소인을 나타내는 줄기세포)를 장기간(예를 들어, 적어도 20일) 레티노산 및 사이클로파민(또는 화학적 유사체)에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 배양물은 부착 상태로 개시되어, 세포가 자연적으로 그리고 자발적으로 3차원 구조를 형성할 수 있게 하고, 이후에 3차원 구조를 현탁 배양물로 옮길 수 있다. 세포는 부착 상태로 또는 부유 상태로 성장하는 동안, 배양 동안 Wnt3a에 노출되지 않을 수 있다. 추가적으로, 본 개시내용은 또한 세포 요법을 위해 적합하고 내배엽 계통으로 분화하기 것에 대한 소인을 지니는 세포의 집단을 동정하는 방법을 제공한다.
I. 정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 사용되는 맥락에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 사용되는 맥락에서 당업자에게 명확하지 않은 용어로 사용되는 경우에, "약"은 특정 용어의 최대 플러스(plus) 또는 마이너스(minus) 10%를 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 존재하지 않는"은 조성물에 실질적으로 존재하지 않는 제제가 첨가되지 않았다는 것을 지칭할 것이지만, 제제가 미량으로 존재한다는 것을 배제하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "섬 세포(islet cell)"는 말기 분화된 췌장 내분비 세포, 및 일반적으로 췌장 내분비로서 분류되는 자손을 형성하기 위해 사용되는 임의의 전구 세포를 지칭한다. 섬 세포는 섬 세포 계통의 통상적인 형태학적 특징 및 표현형 마커(하기에 예시됨)의 일부를 나타낸다. 성숙한 알파 세포는 글루카곤을 분비하며, 성숙한 베타 세포는 인슐린을 분비하며; 성숙한 델타 세포는 소마토스타틴을 분비하며; PP 세포는 췌장 폴리펩타이드를 분비한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 전구 세포(pancreatic progenitor)", "췌장 전구체(pancreatic precursor)" 또는 "췌장 줄기세포"는 내분비 호르몬을 유효하게 분비하지 않는 췌장 또는 섬 세포이지만, 그러한 세포는 내분비 호르몬(예를 들어, 인슐린)을 분비할 수 있는 말단 분화된 세포를 생성할 수 있다. 초기 췌장 선조는 만능성인데, 이는 이러한 것이 적어도 췌장 내분비 세포 및 췌장 외분비 세포를 형성할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포"는 특수 세포(예를 들어, 인슐린-생성 췌장 세포)로 분화할 수 있는 미분화 세포를 나타낸다. 본 출원의 목적을 위하여, 용어 "줄기세포"는 3가지 배아층(즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 전구 세포를 생성할 수 있는 배아전, 배아, 또는 수정 후 태아 조직으로부터 유래된 만능 세포; 3가지 배아층 모두의 전구 세포를 생성할 수 있는 유도 만능 세포(즉, 재프로그래밍 유전자로 형질도입된 세포); 및 단지 하나 또는 2개의 배엽으로 분화할 수 있거나 특정 배엽으로 우선적으로 분화하는(예를 들어, 외배엽 또는 내배엽 세포 타입으로 우선적으로 분화하는 재프로그래밍된 세포) 재프로그래밍된 세포(즉, 재프로그래밍 유전자로 형질도입된 세포)와 같은 다능성 세포를 포함할 수 있다. 이러한 용어는 기술되는 방식으로 만능성 또는 다능성인 다양한 부류의 확립된 줄기세포주(1차 조직으로부터 수득된 세포를 포함함) 모두를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도 만능 세포" 또는 "유도 만능 줄기세포"("iPS 세포")는 표준 기술로 인정된 방법(예를 들어, 체세포 핵 전달, 재프로그래밍 유전자로 형질도입, 화학적 유도(문헌[De Los et al., Cell Research, 23: 1337-1338 (2013); Federation et al., Trends in Cell Biology, 24: 179-187 (2013) 등] 참조) 후, 성인 체세포, 생식 세포, 만능 세포, 또는 다른 세포 타입의 재프로그래밍에 의해 유래된 만능 세포를 나타낸다. 이러한 용어는 확립된 유도 만능 줄기세포, 및 기술된 방식으로 만능성인 1차 조직으로부터 수득된 세포 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "비-만능성 재프로그래밍된 세포" 또는 "다능성 재프로그래밍된 세포"는 재프로그래밍 유전자의 형질도입/발현 및 상기에 논의된 다른 방법과 같은 공지된 재프로그래밍 방법으로, 성인 체세포, 생식 세포, 만능 세포, 또는 다른 세포 타입의 재프로그래밍에 의해 유래된 세포를 나타낸다. 유도 만능 세포와는 달리, "비-만능성 재프로그래밍된 세포" 또는 "다능성 재프로그래밍된 세포"는 단지 하나 또는 2개의 배엽으로 분화하거나 특정 배엽으로 분화하는 선호를 지닐 수 있다(예를 들어, 외배엽 또는 내배엽 세포 타입으로 우선적으로 분화하지만, 중배엽 세포로 효율적으로 분화할 수 없는 재프로그래밍된 세포). 이러한 용어는 확립된 유도 만능 다능성 세포(예를 들어, SR1423), 및 기술된 방식으로 다능성이도록 재프로그래밍된 1차 조직으로부터 수득된 세포 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재프로그래밍 유전자"는 분화된 세포에서 만능성 또는 다능성을 유도하기 위해 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 공지된 유전자 및 전사인자를 나타낸다. 예시적인 재프로그래밍 유전자는 Oct4(즉, Oct-3/4 또는 Pou5f1); Sox 패밀리 전사인자, 예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 및 Sox18; Klf 패밀리 전사인자, 예를 들어, Klf4, Klf1, Klf2 및 Klf5; Myc 패밀리 전사인자, 예를 들어, C-myc, N-myc 및 L-Myc; Nanog; LIN28; 및 Glis1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업자는 개시된 재프로그래밍 유전자뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 재프로그래밍 유전자가 만능성 또는 다능성을 유도하기 위해 다양한 방식으로 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 문헌[Yu et al., Science, 318(5858): 1917-20 (2007)]에서는 LIN28, Oct4, Sox2 및 Nanog의 조합이 iPS 세포를 생성시키기 위해 생성될 수 있다는 것이 입증되었으며, 문헌[Maekawa et al., Nature, 474(7350): 225-29 (2011)]에서는 Glis1, Oct-3/4, Sox2 및 Klf4의 조합이 iPS 세포를 생성시키기 위해 사용될 수 있다는 것이 입증되었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화하다" 또는 "분화"는 덜 특정 세포에서 더욱 특정 세포로의 세포 타입의 변화를 나타낸다. 예를 들어, 만능성 상태에서 빠져나오고 규정된 생식 계열을 향한 발달 경로를 따라 진행된 임의의 세포는 분화를 겪었다. 용어 "분화된"은 상대적인 용어이며, 이에 따라, 분화 세포는 성숙한 기능성 세포 타입을 향한 이의 발달 경로 동안 상이한 단계에 있을 수 있다. 이에 따라, 발달 진행의 후기 단계의 세포는 초기 단계의 세포보다 더욱 분화된다고 할 수 있다.
본 개시내용에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 "분화 유도 인자"는 본 발명의 배양 시스템에서 줄기세포의 분화를 섬 계통의 분화된 세포(전구 세포 및 말단 분화 세포를 포함함)로 유도하는 데 사용되는 화합물의 집단 중 하나를 지칭한다. 화합물의 작용 모드에 대한 제한이 의도되지 않는다. 예를 들어, 제제는 표현형의 변화를 유도하거나 지원하거나, 특정 표현형을 갖는 세포의 성장을 촉진하거나, 다른 표현형의 성장을 지연시킴으로써 분화 과정을 도울 수 있다. 이는 또한, 배지 중에 존재할 수 있거나 분화를 원치 않는 세포 타입으로 경로를 따라 내려 가게 하는 세포 집단에 의해 합성될 수 있는 다른 인자에 대한 저해제로서 역할을 할 수 있다. "분화 유도 인자"의 카테고리 내에서, 당업자는 특정 인자가 분화 과정 전반에 걸쳐 특정 단계를 유도하는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 "내배엽-유도 인자"가 액티빈-A, 및/또는 보르트만닌을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 유사하게, "내분비-유도 인자"는 레티노산 및/또는 사이클로파민을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
세포-기반 요법/이식체에서 사용되는 외래 치료 세포의 생존 및 기능화와 관련하여 사용될 때 본 명세서에서 사용되는 "장기간"은 적어도 6개월 이상의 기간을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 어구 "치료학적 유효량"은 세포가 이식되는, 즉 인슐린을 생산하고 혈당을 조절하는 특정 약리학적 효과를 제공하는 대상체에게 이식된 캡슐화된 세포의 양을 의미한다. 이러한 농도가 당업자에 의해 치료학적 유효량인 것으로 간주되더라도, 캡슐화된 세포의 치료학적 유효량이 제공된 대상체에서 당뇨병을 치료하는 데 항상 효과적인 것은 아니라는 것이 강조된다. 단지 편의상, 예시적인 양이 하기에 제공된다.
당업자는 특정 대상체를 치료하기 위해 요구되는 표준 실무에 따라 이러한 양을 조정할 수 있다. 치료학적 유효량은 이식 부위, 대상체의 연령 및 체중, 및/또는 대상체의 질환의 중증도, 대상체의 식이요법 및/또는 대상체의 전체 건강을 포함하는 대상체의 상태를 기초로 하여 달라질 수 있다.
당뇨병과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 고혈당증 및 저혈당증, 심장병, 신장병, 간 질환, 망막병증, 신경병증, 치유되지 않는 궤양, 치주 질환과 같은 당뇨병의 하나 이상의 증상 또는 합병증을 감소, 개선 또는 제거시키는 것; 혈당을 조절하기 위해 대상체의 외인성 인슐린에 대한 의존도를 감소시키는 것, 외인성 인슐린을 사용하지 않고 대상체의 혈당을 조절하는 것; 대상체의 글리코실화된 헤모글로빈의 백분율 또는 HbA1C 수준을 감소시키는 것; 및/또는 인슐린 민감제, 글루코스 배설의 인핸서, 및 당해 분야에 공지된 치료 양식과 같은 다른 약제학적 개입에 대한 대상체의 의존도를 감소시키는 것 중 하나 이상을 지칭한다.
용어 "개체", "대상체", 및 "환자"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되고, 임의의 개개 포유류 대상체, 예를 들어, 비-인간 영장류, 돼지, 소, 개, 고양이, 말 또는 인간을 지칭한다.
II. 세포-기반 요법을 위한 세포의 동정
기존 세포-기반 요법의 하나의 한계는 상이한 세포가 성숙한 세포 타입으로 분화하는 상이한 경향을 갖는다는 것이다. 예를 들어, 출발 세포 집단의 후생적 특징(epigenetic signature)이 재프로그래밍된 세포에서 지속할 수 있는 것으로 보고되었으며, 이는 "후생적 기억(epigenetic memory)"으로 불리는 현상이다. 결과적으로, iPS 세포 및 다른 재프로그래밍된 세포는 유래된 것과 동일한 배엽에 속하는 세포로 우선적으로 분화할 수 있다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, 인슐린-생성 세포를 생성하는 개시된 방법에서 사용되는 줄기세포는 만능성 또는 다능성 줄기세포로 재프로그래밍된 성숙한 내배엽 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시된 방법에서 사용되는 줄기세포는 재프로그래밍된 인간 췌장 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 도너 췌장 세포는 당뇨병 치료받는 대상체(즉, 자가 도너) 또는 당뇨병 치료받지 않는 사람(즉, 동종이계 도너)에서 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개시된 방법에서 사용되는 줄기세포는 동의된 건강한 성인 도너 췌장의 랑게르한스 섬으로부터 재프로그래밍된 1차 세포일 수 있다(예를 들어, 도 1A 참조).
세포 배양물에서 성장된 1차 세포는 가능하게, 인공 배양 조건에 대한 적응 또는 유전 변이(genetic drift)의 결과로서, 시간에 따라 균질해지고 기능적 성숙 특성을 잃을 수 있다. 이에 따라, 1차 세포가 출발 세포 집단으로서 사용될 때, 1차 세포를 예를 들어, 세포 수확 또는 단리 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 또는 1일 내에 재프로그래밍하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 단리된 1차 세포는 세포 수확 5일 내에 재프로그래밍 유전자로 형질도입될 수 있다.
당업자는 1차 세포가 재프로그래밍 유전자를 사용하여 재프로그래밍될 때, 사용될 수 있는 재프로그래밍 유전자의 여러 조합이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 1차 세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 L-Myc로의 형질도입을 통해 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1차 세포는 Oct4, Sox2, Klf4 및 C-Myc로의 형질도입을 통해 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1차 세포는 LIN28, Oct4, Sox2 및 Nanog로의 형질도입을 통해 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1차 세포는 Glis1, Oct-3/4, Sox2 및 Klf4로의 형질도입을 통해 재프로그래밍될 수 있다. 이러한 예시적인 조합은 재프로그래밍 유전자의 다른 조합이 당해 분야에 공지되어 있고 개시된 방법의 목적을 위해 사용될 수 있기 때문에 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시형태에서, 개시된 분화 및 치료 방법에서 사용되는 세포는 다른 생식 계통보다 하나의 생식 계통으로 분화하기 위한 선호도를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1차 세포 또는 줄기세포(예를 들어, SR1423)는 외배엽 또는 내배엽 계통으로 효율적으로 분화시킬 수 있지만, 중배엽 계통으로 실질적으로 분화하지 못할 수 있다. 이는 예를 들어, 분화 프로토콜 또는 키트를 이용하여 줄기세포를 특정 생식 계열로 나아가게 하지만, 생식 계열 마커(예를 들어, 외배엽의 경우 OTX2, 내배엽의 경우 Sox17, 또는 중배엽의 경우 브라큐리를 감지하지 못함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽 계통을 따라 우선적으로 분화하는 줄기세포 또는 1차 세포는 특정 분자 마커에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 내배엽 계통을 따라 우선적으로 분화하는 줄기세포 또는 1차 세포는 만능성(예를 들어, 도 3A 참조) 및 정상 핵형(예를 들어, 도 3B 참조)의 통상적인 마커를 발현시킬 수 있지만, 만능성의 통상적인 마커가 발현되더라도, 줄기세포는 다능성 또는 전능성일 수 있고, 이에 따라, 만능성에 대해 허용되는 기준에 적합하지 않다.
내배엽 계통을 따라 우선적으로 분화하는 줄기세포 또는 1차 세포는 또한, 독특한 유전자 발현 프로파일을 지닐 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 내배엽 계통을 따라 우선적으로 분화하는 줄기세포 또는 1차 세포는 대조군 수준 또는 대조군 세포에 비해 BHMT2, Cox7A1 및 HSPB2의 발현을 하향-조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 내배엽 계통을 따라 우선적으로 분화하는 줄기세포 또는 1차 세포는 대조군 수준 또는 대조군 세포에 비해 NAP1L1의 발현을 상향-조절할 수 있다. 추가적으로, 내배엽 계통을 따라 우선적으로 분화하는 세포는 대조군 세포에 비해 GLIS2, CCDC58 및 MTX3의 발현을 상향-조절할 수 있고 C7orf29의 발현을 하향-조절할 수 있다. 발현 수준은 qRT-PCR 또는 마이크로어레이 분석과 같은, 당해 분야에 공지된 임의의 방식에 의해 결정될 수 있으며, 비교 표준으로서 사용되는 대조군 세포는 NIH 레지스트리에서 발견된 표준 배아 줄기세포주와 같이, 내배엽 계통에 대한 우선 분화를 나타내지 않거나 중배엽 계통으로 분화하기에 실질적인 불능을 나타내는 만능 세포를 포함할 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 적어도 BHMT2 및 NAP1L1이 DNA 변형에서 역할을 하고 후생적 기억에 기여할 수 있는 것으로 사료된다.
일부 실시형태에서, BHMT2, Cox7A1, HSPB2 및/또는 NAP1L1의 차등 발현은 내배엽 계통에 대한 우선 분화를 나타내지 않고 중배엽 계통, 또는 만능성에 대한 표준 기준을 충족하는 줄기세포로 실질적으로 분화할 수 없는 만능 세포에 비해 적어도 약 1 log, 적어도 약 2 log, 또는 적어도 약 3 log 증가(BHMT2, Cox7A1 및 HSPB2의 경우) 또는 감소(NAP1L1의 경우)될 수 있다.
개시된 발현 프로파일로 줄기세포를 동정하는 것은 내배엽 계통 및 이후에 인슐린-생성 세포로 분화하기 위한 선호도를 나타낸다. 특정 배엽에 대한 분화 선호도를 직접 시험하는 것은 특정 운명에 치우친 세포주를 생성시키는 효율을 증가시키고, 이에 따라, 세포-기반 요법에 적합하다.
III. 인슐린 생성 베타 세포를 생성하기 위한 프로토콜
포유류 줄기세포(예를 들어, iPS 세포, 배아 줄기세포 및 재프로그래밍된 세포)가 배아 췌장 발달을 모방함으로써 인슐린-생성 베타 세포로 분화될 수 있다는 것이 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Borowiak M. et al. Curr Opin Cell Biol., 21:727-32 (2009)] 참조). 만능 세포는 단계적으로 췌장 세포로 분화한다. 제1 단계는 내배엽 계통으로의 분화이다. 내배엽 세포는 다능성 췌장 전구 세포로 추가로 분화되며, 이는 이후에 섬 세포로 분화될 수 있으며, 이후에 섬 세포는 글루코스 노출 시에 인슐린을 생산하는 베타 세포로 분화될 수 있다. 현 분화 프로토콜은 시험관 내에서 이러한 단계를 모방하려고 한다. 그러나, 이러한 분화 프로토콜의 임상 적응의 효율성 및 성공은 상당히 다양하다(예를 들어, 문헌[Pagliuca FW, et al. Cell, 154(2): 428-439 (2014)] 참조). 실제로, 현 분화 프로토콜은 종종 적용되는 개별 세포에 따라 조정되어야 한다. 이는 지금까지 보편적이고 표준화된 분화 프로토콜의 확립을 방해하였다. 실제로, 현 분화 프로토콜로부터의 일부 일관된 지침은 상이한 유전적 배경으로부터 줄기세포주의 분화를 억제할 수 있다. 본 명세서에 개시된 개선된 방법은 당해 분야에서의 이러한 결함을 해결한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 개시된 프로토콜은 세포-특이적일 수 있는 다른 분화 프로토콜과는 대조적으로, 다양한 세포 공급원으로부터 인슐린-생성 베타 세포를 강력하게 생성할 수 있다.
인슐린 생성 세포를 생성하는 통상적인 수단은 줄기세포를 배양하고 분화하는 것을 포함한다. 개시된 프로토콜의 경우에, 세포 공급원은 인간 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 비-만능성 재프로그래밍된 세포(예를 들어, SR1423), 및 당해 분야에 공지된 다른 통상적인 세포 공급원을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
줄기세포로부터 인슐린-생성 세포를 생성시키는 개시된 방법은 내배엽 분화가 먼저 개시되고, 이후에, 췌장 계통으로 분화되고, 내분비 계통으로 분화되고, 마지막으로, 인슐린-생성 세포로 성숙 과정이 수행되는 다단계 공정을 포함한다. 내배엽 분화는 통상적으로, 줄기세포를 내배엽-유도제, 예를 들어, 액티빈-A 또는 보르트만닌 또는 이들의 조합물과 접촉시킴으로써 개시된다. 충분한 수의 내배엽 세포에 도달하였을 때, 세포는 세포를 췌장 전구 세포로 추가로 분화시키기 위해 내분비-유도제, 예를 들어, 레티노산 또는 사이클로파민 또는 이들의 조합물과 접촉된다. 하기에서 더욱 상세히 논의되는, 인자를 추가로 분화시키기 위한 노출을 통해, 췌장 전구 세포는 당뇨병을 치료하는 세포-기반 요법을 위해 사용될 수 있는 인슐린-생성 세포로 성숙될 수 있다.
일부 실시형태에서, 줄기세포는 내배엽-유도제를 포함하는 제1 배지에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 내배엽-유도제는 적어도 액티빈-A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내배엽-유도제는 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 방법은 Wnt 신호전달의 활성제, 예를 들어, CHIR-99021(Wnt 신호전달의 소분자 활성제) 및/또는 성장 인자 Wnt3A를 사용하거나 이의 사용을 포함하지 않는다. 내배엽-유도제에 대한 줄기세포의 노출은 세포의 내배엽 세포로의 분화를 초래한다.
인슐린-생성 세포를 수득하는 통상적인 방법과는 상반되게, 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법은 Wnt 신호전달의 활성제를 사용하지 않는다. 통상적인 방법과는 상반되게, 일부 실시형태에서, 개시된 분화는 세포를 레티노산(RA)에 장기간 노출시킨다. 통상적인 방법과는 상반되게, 일부 실시형태에서, 개시된 분화 프로토콜은 세포를 사이클로파민 또는 화학적 유사체에 장기간 노출시킨다. 통상적인 방법과는 상반되게, 일부 실시형태에서, 개시된 분화 프로토콜은 부착 배양물의 해리 및 부유 상태로 세포의 재응집을 통한 3차원 현탁 배양물의 생성을 사용하지 않는다.
일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법은 줄기세포를 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출시키지 않는다. KFG는 오랫동안 췌장 전구 세포로부터 베타 세포의 분화를 촉진시키기 위한 필수적인 성분으로 여겨졌다(예를 들어, 문헌[Movassat J., Diabetologia, 46: 822-829 (2003)] 참조). KGF는 생체내에서, 특히 태아 췌장 조직에서 베타-세포의 분화를 촉진시키는 것으로 보고되었으며, 여기서, 췌장관 세포는 KGF 및 노긴의 존재 하에서 형성된다. 이에 따라, 배양물에서 내배엽 분화의 초기 단계 동안 KGF의 적용은 이전 프로토콜의 개발에서 합리적인 가정이었다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법은 줄기세포를 KGF에 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
그러나, 여기서, 본 발명자는 KGF가 효과적이게 하기 위해 췌장 전구 세포가 레티노산(RA) 신호전달을 통해 확립되어야 한다는 것을 예상치 못하게 발견하였다. 실제로, 다른 인자의 부재 하에서 KGF로의 처리가 베타-세포 분화에 부정적인 영향을 생산하였다는 것으로 확인되었다. 마찬가지로, 본 개시내용은 초기 내배엽 단계에서 KGF를 배제하고 후기 췌장 선조 단계에서 KGF를 첨가하는 것이 다양한 세포 공급원으로부터 베타 세포 생산을 개선시키고 인슐린-생성 세포의 거의 균질한 배양물의 생산을 초래함을 나타낸다. 이에 따라, 일 양태에서, 본 개시내용은 줄기세포가 내배엽-유도제 전에 또는 동시에 KGF와 접촉되지 않는, 인슐린-생성 세포를 수득하는 신규한 분화 방법을 제공한다. 오히려, 세포는 분화의 후기 단계에서 오로지 KGF와 접촉된다. 예를 들어, KGF는 세포가 RA와 접촉됨과 동시에 또는 이후 배양 단계에서 세포에 도입될 수 있지만, 그 전에는 도입되지 않을 수 있다.
이에 따라, 일부 실시형태에서, 분화 세포는 세포가 내분비 세포로 분화된 후와 같이, 내배엽 분화의 후기 단계에서 단지 KGF와 접촉된다. 이러한 단계 이전에, 줄기세포는 KGF와 접촉되지 않아야 한다. 이에 따라, 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키기 위해 사용되는 배지는 액티빈-A 및/또는 보르트만닌을 포함할 수 있지만, 이는 KGF를 포함하지 않아야 한다. 일부 실시형태에서, 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키기 위해 사용되는 배지는 액티빈-A, 보르트만닌, 및/또는 Wnt 신호전달의 활성제, 예를 들어, CHIR-99021(Wnt 신호전달의 소분자 활성제) 및/또는 성장 인자 Wnt3A, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이는 KGF를 포함하지 않아야 한다.
일부 실시형태에서, 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계는 KGF와 함께 또는 이의 없이 액티빈-A, 보르트만닌, 및 이들의 조합을 포함하는 배지에서 1 내지 4일 동안 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 줄기세포는 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 4일 동안 이러한 내배엽-유도제의 존재 하에서 배양되어, 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 줄기세포는 약 1 내지 약 200 ng/㎖, 약 25 내지 약 175 ng/㎖, 약 50 내지 약 150 ng/㎖, 또는 약 75 내지 약 125 ng/㎖의 농도의 액티빈 A의 존재 하에서 내배엽 세포로 분화된다. 예를 들어, 액티빈 A 농도는 약 1 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 100 ng/㎖, 약 110 ng/㎖, 약 120 ng/㎖, 약 130 ng/㎖, 약 140 ng/㎖, 약 150 ng/㎖, 약 160 ng/㎖, 약 170 ng/㎖, 약 180 ng/㎖, 약 190 ng/㎖, 또는 약 200 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 줄기세포는 약 0.1 내지 약 2.0uM, 약 0.25 내지 약 1.75uM, 약 0.5 내지 약 1.5uM, 또는 약 0.75 내지 약 1.25uM의 농도의 보르트만닌의 존재 하에서 내배엽 세포로 분화된다. 예를 들어, 보르트만닌 농도는 약 0.1uM, 약 0.5uM, 약 1.0uM, 약 1.5uM, 또는 약 2.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키기 위해 사용되는 배지는 KGF를 포함할 수 있지만, 일부 실시형태에서, 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키기 위해 사용되는 배지는 KGF 없이 레티노산, 노긴, 또는 사이클로파민 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계는 KGF와 함께 또는 이의 없이 레티노산, 사이클로파민, 및/또는 노긴을 포함하는 배지에서 1 내지 5일 동안 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 내배엽 세포는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5일 동안 이러한 내분비-유도제의 존재 하에서 배양되어, 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 적어도 이십(20)일 동안 약 0.05uM, 약 0.1uM, 약 0.5uM, 약 1.0uM, 약 1.5uM, 또는 약 2.0uM의 농도의 레티노산의 존재 하에서 분화된다.
일부 실시형태에서, 세포는 적어도 이십(20)일 동안 약 0.05uM, 약 0.1uM, 약 0.25uM, 또는 약 0.5uM의 농도의 사이클로파민의 존재 하에서 분화된다.
일부 실시형태에서, 세포는 약 0.05uM, 약 0.1uM, 약 0.25uM, 또는 약 0.5uM의 농도의 사이클로파민 SANT-1((4-벤질-피페라진-1-일)-(3,5-디메틸-1-페닐-1H-피라졸-4-일메틸렌)-아민)의 화학적 유사체의 존재 하에서 분화된다.
일부 실시형태에서, 내배엽 세포는 약 1.0 내지 약 10.0uM, 약 2.0 내지 약 8.0uM, 또는 약 3.0 내지 약 5.0uM의 농도의 레티노산의 존재 하에서 내분비 세포로 분화된다. 예를 들어, 레티노산 농도는 약 1.0uM, 약 1.5uM, 약 2.0uM, 약 2.5uM, 약 3.0uM, 약 3.5uM, 약 4.0uM, 약 4.5uM, 약 5.0uM, 약 5.5uM, 약 6.0uM, 약 6.5uM, 약 7.0uM, 약 7.5uM, 약 8.0uM, 약 8.5uM, 약 9.0uM, 약 9.5uM, 또는 약 10.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽 세포는 약 0.1 내지 약 1.0uM 또는 약 0.25 내지 약 0.75uM의 농도의 사이클로파민의 존재 하에서 내분비 세포로 분화된다. 예를 들어, 사이클로파민 농도는 약 0.1uM, 약 0.2uM, 약 0.25uM, 약 0.3uM, 약 0.4uM, 약 0.45uM, 약 0.5uM, 약 0.55uM, 약 0.6uM, 약 0.7uM, 약 0.75uM, 약 0.8uM, 약 0.9uM, 또는 약 1.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽 세포는 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 노긴의 존재 하에서 내분비 세포로 분화된다. 예를 들어, 노긴 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내배엽 세포는 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 KGF의 존재 하에서 내분비 세포로 분화된다. 예를 들어, KGF 농도는 약 1 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포가 내배엽 세포에서 내분비 세포로 분화된 후까지 세포는 KGF에 노출되지 않는다.
일부 실시형태에서, 내분비 세포는 내분비 세포를 췌장 전구 세포 및 이후에 최종적으로 인슐린-생성 세포로 분화시키기 위해 추가적인 성장 인자 및/또는 호르몬의 존재 하에서 추가로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내분비 세포는 레티노산 및/또는 사이클로파민과 같은 내분비-유도제에 노출된 후에 KGF를 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있고, 이에 의해 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 내분비 세포는 레티노산 및/또는 사이클로파민과 같은 내분비-유도제에 노출된 후에, KGF, 노긴, 및/또는 표피 성장 인자(EGF) 또는 이들의 조합을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계는 KGF, 노긴, 및/또는 표피 성장 인자(EGF) 또는 이들의 조합을 포함하는 배지 중에서 1 내지 5일 동안 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계는 KGF, 노긴, 및/또는 표피 성장 인자(EGF) 또는 이들의 조합을 포함하고 레티노산 및/또는 사이클로파민(예를 들어, 사이클로파민 KAAD)을 더 포함하는 배지 중에서 1 내지 5일 동안 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 내배엽 세포는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5일 동안 이러한 제제의 존재 하에서 배양될 수 있고, 이에 의해 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 내분비 세포는 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 KGF의 존재 하에서 췌장 전구 세포로 분화된다. 예를 들어, KGF 농도는 약 1 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내분비 세포는 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 노긴의 존재 하에서 췌장 전구 세포로 분화된다. 예를 들어, 노긴 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내분비 세포는 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 EGF의 존재 하에서 췌장 전구 세포로 분화된다. 예를 들어, EGF 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 내분비 세포는 약 1 내지 약 200 ng/㎖, 약 50 내지 약 200 ng/㎖, 또는 약 75 내지 약 125 ng/㎖의 농도의 레티노산의 존재 하에서 췌장 전구 세포로 분화된다. 예를 들어, 레티노산 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 약 100 ng/㎖, 약 105 ng/㎖, 약 110 ng/㎖, 약 115 ng/㎖, 약 120 ng/㎖, 약 125 ng/㎖, 약 130 ng/㎖, 약 135 ng/㎖, 약 140 ng/㎖, 약 145 ng/㎖, 약 150 ng/㎖, 약 155 ng/㎖, 약 160 ng/㎖, 약 165 ng/㎖, 약 170 ng/㎖, 약 175 ng/㎖, 약 180 ng/㎖, 약 185 ng/㎖, 약 190 ng/㎖, 약 195 ng/㎖, 또는 약 200 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태, 내분비 세포는 약 0.1 내지 약 1.0uM 또는 약 0.25 내지 약 0.75uM의 농도의 사이클로파민의 존재 하에서 췌장 전구 세포로 분화된다. 예를 들어, 사이클로파민 농도는 약 0.1uM, 약 0.2uM, 약 0.25uM, 약 0.3uM, 약 0.4uM, 약 0.45uM, 약 0.5uM, 약 0.55uM, 약 0.6uM, 약 0.7uM, 약 0.75uM, 약 0.8uM, 약 0.9uM, 또는 약 1.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 췌장 전구 세포를 췌장 계통으로, 및 최종적으로 인슐린-생성 세포로 분화시키기 위해 추가적인 성장 인자 및/또는 호르몬의 존재 하에서 추가로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, Alk5i II, 및/또는 T3 및 이들의 조합을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, Alk5i II, 및/또는 T3 및 이들의 조합을 포함하고 레티노산 및/또는 사이클로파민(예를 들어, 사이클로파민 KAAD)을 더 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, T3은 이러한 분화 단계에서 배양 배지에 포함되지 않을 수 있다. 예를 들어, 췌장 전구 세포는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5일 동안 이러한 제제의 존재 하에서 배양될 수 있고, 이에 의해 췌장 전구 세포를 췌장 계통으로 분화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 노긴의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 노긴 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 EGF의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, EGF 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 0.1 내지 약 2.0uM, 약 0.25 내지 약 1.75uM, 약 0.5 내지 약 1.5uM, 또는 약 0.75 내지 약 1.25uM의 농도의 γ-세크레타아제 저해제 XXI의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, γ-세크레타아제 저해제 XXI 농도는 약 0.1uM, 약 0.5uM, 약 1.0uM, 약 1.5uM, 또는 약 2.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1.0 내지 약 50.0uM, 약 5 내지 약 25uM, 또는 약 10 내지 약 20uM의 농도의 Alk5i II의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, Alk5i II 농도는 약 0.1uM, 약 1.0uM, 약 5.0uM, 약 10uM, 약 20uM, 약 30uM, 약 40uM, 또는 약 50uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 0.1 내지 약 2.0uM, 약 0.25 내지 약 1.75uM, 약 0.5 내지 약 1.5uM, 또는 약 0.75 내지 약 1.25uM의 농도의 T3의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, T3 농도는 약 0.1uM, 약 0.5uM, 약 1.0uM, 약 1.5uM, 또는 약 2.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1 내지 약 200 ng/㎖, 약 50 내지 약 200 ng/㎖, 또는 약 75 내지 약 125 ng/㎖의 농도의 레티노산의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 레티노산 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 약 100 ng/㎖, 약 105 ng/㎖, 약 110 ng/㎖, 약 115 ng/㎖, 약 120 ng/㎖, 약 125 ng/㎖, 약 130 ng/㎖, 약 135 ng/㎖, 약 140 ng/㎖, 약 145 ng/㎖, 약 150 ng/㎖, 약 155 ng/㎖, 약 160 ng/㎖, 약 165 ng/㎖, 약 170 ng/㎖, 약 175 ng/㎖, 약 180 ng/㎖, 약 185 ng/㎖, 약 190 ng/㎖, 약 195 ng/㎖, 또는 약 200 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태, 췌장 전구 세포는 약 0.1 내지 약 1.0uM 또는 약 0.25 내지 약 0.75uM의 농도의 사이클로파민의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 사이클로파민 농도는 약 0.1uM, 약 0.2uM, 약 0.25uM, 약 0.3uM, 약 0.4uM, 약 0.45uM, 약 0.5uM, 약 0.55uM, 약 0.6uM, 약 0.7uM, 약 0.75uM, 약 0.8uM, 약 0.9uM, 또는 약 1.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 최종적으로 세포를 인슐린-생성 세포로 분화시키기 위해 추가적인 성장 인자 및/또는 호르몬의 존재 하에서 추가로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 Alk5i II, T3, 및/또는 레티노산 및 이들의 조합을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 Alk5i II, T3, 및/또는 레티노산 및 이들의 조합을 포함하고 사이클로파민(예를 들어, 사이클로파민 KAAD)을 더 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, T3은 이러한 분화 단계에서 배양 배지에 포함되지 않을 수 있다. 예를 들어, 췌장 전구 세포는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5일 동안 이러한 제제의 존재 하에서 배양될 수 있고, 이에 의해 췌장 세포를 인슐린-생성 세포 타입으로 분화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 1.0 내지 약 50.0uM 약 5 내지 약 25uM, 또는 약 10 내지 약 20uM의 농도의 Alk5i II의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, Alk5i II 농도는 약 0.1uM, 약 1.0uM, 약 5.0uM, 약 10uM, 약 20uM, 약 30uM, 약 40uM, 또는 약 50uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 0.1 내지 약 2.0uM, 약 0.25 내지 약 1.75uM, 약 0.5 내지 약 1.5uM, 또는 약 0.75 내지 약 1.25uM의 농도의 T3의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, T3 농도는 약 0.1uM, 약 0.5uM, 약 1.0uM, 약 1.5uM, 또는 약 2.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 1 내지 약 200uM, 약 25 내지 약 175uM, 약 50 내지 약 150uM, 또는 약 75 내지 약 125uM의 농도의 레티노산의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 레티노산 농도는 약 1uM, 약 10uM, 약 20uM, 약 40uM, 약 50uM, 약 60uM, 약 70uM, 약 80uM, 약 90uM, 약 100uM, 약 110uM, 약 120uM, 약 130uM, 약 140uM, 약 150uM, 약 160uM, 약 170uM, 약 180uM, 약 190uM, 또는 약 200uM일 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1 내지 약 200 ng/㎖, 약 50 내지 약 200 ng/㎖, 또는 약 75 내지 약 125 ng/㎖의 농도의 레티노산의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 레티노산 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 약 100 ng/㎖, 약 105 ng/㎖, 약 110 ng/㎖, 약 115 ng/㎖, 약 120 ng/㎖, 약 125 ng/㎖, 약 130 ng/㎖, 약 135 ng/㎖, 약 140 ng/㎖, 약 145 ng/㎖, 약 150 ng/㎖, 약 155 ng/㎖, 약 160 ng/㎖, 약 165 ng/㎖, 약 170 ng/㎖, 약 175 ng/㎖, 약 180 ng/㎖, 약 185 ng/㎖, 약 190 ng/㎖, 약 195 ng/㎖, 또는 약 200 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태, 췌장 전구 세포는 약 0.1 내지 약 1.0uM 또는 약 0.25 내지 약 0.75uM의 농도의 사이클로파민의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 사이클로파민 농도는 약 0.1uM, 약 0.2uM, 약 0.25uM, 약 0.3uM, 약 0.4uM, 약 0.45uM, 약 0.5uM, 약 0.55uM, 약 0.6uM, 약 0.7uM, 약 0.75uM, 약 0.8uM, 약 0.9uM, 또는 약 1.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 최종적으로 세포를 인슐린-생성 세포로 분화시키기 위해 추가적인 성장 인자 및/또는 호르몬의 존재 하에서 추가로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 Alk5i II, T3, 니코틴아마이드, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I, 및/또는 BMP4 및 이들의 조합을 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 Alk5i II, T3, 니코틴아마이드, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I, 및/또는 BMP4 및 이들의 조합 및 이들의 조합을 포함하고 레티노산 및/또는 사이클로파민(예를 들어, 사이클로파민 KAAD)을 더 포함하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, T3 및/또는 BMP4는 이러한 분화 단계에서 배양 배지에 포함되지 않을 수 있다. 예를 들어, 췌장 전구 세포는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10일 동안 이러한 제제의 존재 하에서 배양될 수 있고, 이에 의해 췌장 세포를 인슐린 생성 세포로 분화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 1.0 내지 약 50.0uM 약 5 내지 약 25uM, 또는 약 10 내지 약 20uM의 농도의 Alk5i II의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, Alk5i II 농도는 약 0.1uM, 약 1.0uM, 약 5.0uM, 약 10uM, 약 20uM, 약 30uM, 약 40uM, 또는 약 50uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 0.1 내지 약 2.0uM, 약 0.25 내지 약 1.75uM, 약 0.5 내지 약 1.5uM, 또는 약 0.75 내지 약 1.25uM의 농도의 T3의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, T3 농도는 약 0.1uM, 약 0.5uM, 약 1.0uM, 약 1.5uM, 또는 약 2.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 1.0 내지 약 50.0mM 약 5 내지 약 25mM, 또는 약 10 내지 약 20mM 농도의 니코틴아마이드의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 니코틴아마이드 농도는 약 0.1mM, 약 1.0mM, 약 5.0mM, 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM, 또는 약 50mM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1 내지 약 100 ng/㎖, 약 25 내지 약 75 ng/㎖, 또는 약 60 내지 약 70 ng/㎖의 농도의 IGF-I의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, IGF-I 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 또는 약 100 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 세포는 약 1.0 내지 약 50.0 ng/㎖ 약 5 내지 약 25 ng/㎖, 또는 약 10 내지 약 20 ng/㎖의 농도의 BMP4의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, BMP4 농도는 약 0.1 ng/㎖, 약 1.0 ng/㎖, 약 5.0 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 또는 약 50 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 췌장 전구 세포는 약 1 내지 약 200 ng/㎖, 약 50 내지 약 200 ng/㎖, 또는 약 75 내지 약 125 ng/㎖의 농도의 레티노산의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 레티노산 농도는 약 1 ng/㎖, 약 5 ng/㎖, 약 10 ng/㎖, 약 15 ng/㎖, 약 20 ng/㎖, 약 25 ng/㎖, 약 30 ng/㎖, 약 35 ng/㎖, 약 40 ng/㎖, 약 45 ng/㎖, 약 50 ng/㎖, 약 55 ng/㎖, 약 60 ng/㎖, 약 65 ng/㎖, 약 70 ng/㎖, 약 75 ng/㎖, 약 80 ng/㎖, 약 85 ng/㎖, 약 90 ng/㎖, 약 95 ng/㎖, 약 100 ng/㎖, 약 105 ng/㎖, 약 110 ng/㎖, 약 115 ng/㎖, 약 120 ng/㎖, 약 125 ng/㎖, 약 130 ng/㎖, 약 135 ng/㎖, 약 140 ng/㎖, 약 145 ng/㎖, 약 150 ng/㎖, 약 155 ng/㎖, 약 160 ng/㎖, 약 165 ng/㎖, 약 170 ng/㎖, 약 175 ng/㎖, 약 180 ng/㎖, 약 185 ng/㎖, 약 190 ng/㎖, 약 195 ng/㎖, 또는 약 200 ng/㎖일 수 있다.
일부 실시형태, 췌장 전구 세포는 약 0.1 내지 약 1.0uM 또는 약 0.25 내지 약 0.75uM의 농도의 사이클로파민의 존재 하에서 추가로 배양된다. 예를 들어, 사이클로파민 농도는 약 0.1uM, 약 0.2uM, 약 0.25uM, 약 0.3uM, 약 0.4uM, 약 0.45uM, 약 0.5uM, 약 0.55uM, 약 0.6uM, 약 0.7uM, 약 0.75uM, 약 0.8uM, 약 0.9uM, 또는 약 1.0uM일 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 비트로넥틴 및/또는 라미닌 및/또는 콜라겐을 포함한 부착 기질 상에서 분화된다. 일부 실시형태에서, 3차원 구조를 자발적으로 및 자연적으로 형성하는 세포는 수집되고 현탁 배양물로 옮겨진다.
일부 실시형태에서, 세포는 하이드로겔 내에 캡슐화되며, 세포가 하이드로겔 내에 캡슐화되는 동안 분화는 추가로 진행될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 분화 프로토콜은 캡슐화되지 않은 세포와 동일하다(즉, 분화 프로토콜은 개시된 분화 방법과 동일한 시약 및 인큐베이션 시간을 포함할 수 있다). 즉, 하이드로겔 내에 캡슐화된 후에도, 세포는 인슐린-생성 세포를 생산하기 위해 개시된 배지 중에서 여전히 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포를 캡슐화하는 하이드로겔은 나트륨 알기네이트를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 대략 분화 12일에 하이드로겔 내에 캡슐화된다. 예를 들어, 세포는 분화 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15일에 하이드로겔 내에 캡슐화될 수 있다. 이에 따라, 세포는 이러한 것이 노긴 및/또는 EGF를 포함하는 배지(즉, 본 명세서에 개시된 바와 같이 "제3 배지") 중에서 인큐베이션된 후에 하이드로겔에서 캡슐화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 그러한 세포는 대략 14일, 대략 16일, 대략 18일, 대략 20일, 대략 22일, 대략 24일, 대략 26일, 또는 대략 28일에 분화의 후기 단계에서 하이드로겔 내에 캡슐화된다.
일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 췌장 1차 조직으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 배아 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 유도 만능 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 비-만능성 재프로그래밍된 세포이다. 일부 실시형태에서, 줄기세포는 인간 줄기세포이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 재프로그래밍 유전자를 세포의 게놈에 도입하지 않으면서 세포에서 재프로그래밍 유전자를 발현시킴으로써 세포를 재프로그래밍하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 형질도입된 유전자가 예를 들어, 에피솜 발현 플라스미드를 사용하여 그러한 유전자를 게놈에 도입하지 않으면서 세포에서 발현될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 재프로그래밍 유전자는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 적어도 4개 이상의 에피솜 발현 플라스미드 상에서 발현될 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 여러 재프로그래밍 유전자는 당해 분야에 공지되어 있고, 개시된 방법의 목적을 위해 사용될 수 있지만, 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 유전자는 Oct4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 포함한다.
일부 실시형태에서, 줄기세포로부터의 세포를 인슐린-생성 세포로 분화시키기 위해 요구되는 총 배양 시간은 약 30일 이하일 수 있다. 예를 들어, 세포는 약 30일, 약 29일, 약 28일, 약 27일, 약 26일, 약 25일 또는 그 미만 동안 배양될 수 있다.
당업자는 또한, 각 분화 단계에서 총 배양 시간이 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포를 배양하여 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 인간 세포는 Wnt3a에 노출되지 않았고 선택적으로, 내배엽 세포로 분화 전에 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는 단계; (b) 레티노산 및 사이클로파민을 포함하고 선택적으로 KGF를 포함하는 제2 배지 중에서 단계 (a)로부터의 내배엽 세포를 배양하여, 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계; (c) KGF를 포함하는 제3 배지 중에서 단계 (b)로부터의 내분비 세포를 배양하여, 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계; (d) 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, Alk5i II, 및 T3을 포함하는 제4 배지 중에서 단계 (c)로부터의 췌장 전구 세포를 배양하는 단계; (e) Alk5i II, T3, 및 레티노산을 포함하는 제5 배지 중에서 단계 (d)로부터의 세포를 배양하는 단계; 및 (f) Alk5i II, T3, 니코틴아마이드, 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I, 및 BMP4를 포함하는 제6 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린-분비 췌장 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포를 배양하여 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 인간 세포가 Wnt3a에 노출되지 않았고 내배엽 세포로 분화 전에 선택적으로 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는 단계; (b) 레티노산, 노긴 및 사이클로파민을 포함하고 선택적으로 KGF를 포함하는 제2 배지 중에서 단계 (a)로부터의 내배엽 세포를 배양하여 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계; (c) KGF, 노긴, 레티노산, 및 사이클로파민을 포함하는 제3 배지 중에서 단계 (b)로부터의 내분비 세포를 배양하여, 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계; (d) 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, Alk5i II, 레티노산, 및 사이클로파민을 포함하는 제4 배지 중에서 단계 (c)로부터의 췌장 전구 세포를 배양하는 단계; (e) Alk5i II, T3, 레티노산, 및 사이클로파민을 포함하는 제5 배지 중에서 단계 (d)로부터의 세포를 배양하는 단계; 및 (f) Alk5i II, 니코틴아마이드, IGF-I, 레티노산, 및 사이클로파민을 포함하는 제6 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린-분비 췌장 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제6 배지는 글루카곤을 포함할 수 있으며, 이는 인슐린 및 글루카곤을 공동-발현시키는 내분비 세포의 비율을 감소시키는 데 유익한 효과를 갖는다. 글루카곤의 농도는 예를 들어, 약 40 ng/L, 약 70 ng/L, 약 110 ng/L, 또는 약 140 ng/L일 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (a) 내지 단계 (f)를 위한 총 배양 시간은 30일 이하일 수 있다. 예를 들어, 세포는 약 30일, 약 29일, 약 28일, 약 27일, 약 26일, 약 25일, 또는 그 미만 동안 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 1 내지 3일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (b)는 4 내지 7일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (c)는 8 내지 11일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (d)는 12 내지 15일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (e)는 16 내지 19일의 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (f)는 20 내지 28일 배양을 포함할 수 있다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, 단계 (a)는 1 내지 4일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (b)는 1 내지 5일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (c)는 1 내지 5일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (d)는 1 내지 5일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (e)는 1 내지 5일 배양을 포함할 수 있으며, 단계 (f)는 1 내지 10일 배양을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 더 초기 내배엽 단계에서 분화 세포를 KGF에 노출시키는 것은 인슐린 생성 베타 세포의 생성을 방해할 수 있으며, 이에 따라, 이러한 성분의 첨가는 선택적이고, 정밀한 프로토콜에 따라 달라질 수 있다. 이에 따라, 인슐린-생성 세포를 제조할 목적을 위해, 일부 실시형태에서, 내배엽 분화의 초기 단계로부터 또는 적어도 분화 세포가 레티노산에 노출된 배양물에서 적어도 1회까지 KGF를 배제하는 것이 유익하다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포를 배양하여 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 인간 세포는 Wnt3a에 노출되지 않는 단계; (b) 적어도 이십(20)일 동안 후속 배양 단계 동안 세포를 레티노산에 노출시키는 단계; (c) 적어도 이십(20)일 동안 후속 배양 단계 동안 세포를 사이클로파민 또는 화학적 유사체에 노출시키는 단계; (d) 부착 기질 상에서 세포 배양을 개시하는 단계; 및 (e) 3차원 구조를 자연적으로 및 자발적으로 형성하는 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계; 및 선택적으로 (f) 글루카곤의 존재 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린-분비 췌장 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 부착 상태로 포유류 줄기세포를 배양하여, 포유류 줄기세포가 3차원 구조를 자발적으로 형성할 수 있게 하는 단계; 및 부유 상태로 3차원 구조를 배양하는 단계를 포함하며, 배양 단계는 레티노산 및 사이클로파민에 대한 적어도 20일 노출을 포함하고, 3차원 구조의 줄기세포를 Wnt3A를 노출시키는 것을 포함하지 않는, 포유류 인슐린-분비 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는 제1 배지 중에서 부착 기질 상에서 포유류 줄기세포를 배양하는 단계로서, 포유류 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는, 상기 배양하는 단계; 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 배지 중에서 세포를 추가로 배양하는 단계; 및 세포가 3차원 세포 구조를 형성할 때 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계를 포함하되, 세포는 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되는, 인슐린-분비 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 내배엽 계통으로 우선적으로 분화하거나 이에 대한 분화의 소인이 있는 출발 줄기세포 또는 비-만능성 전구 세포를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 더 단순한 분화를 허용할 수 있고, 전통적인 방법에 비해 더 순수하고 더욱 성숙한 인슐린-분비 세포의 배양을 달성할 수 있다.
본 개시된 방법의 목적을 위해, 세포가 부착 상태로 초기에 성장되거나 배양물이 부착 기질(예를 들어, 양으로 하전된 표면 또는 비트로넥틴 또는 마트리겔로 코팅된 표면) 상에서 개시될 때 인슐린-분비 세포의 생산이 최적화되고, 이에 따라, 세포가 자연적으로 및 자발적으로 3차원 구조(예를 들어, 세포의 응집물)를 형성할 수 있게 한다는 것이 결정되었다. 부착된 세포로 구성된 이러한 3차원 구조는 이후에 개시된 방법의 기간 동안 부유 상태로 배양될 수 있다.
이에 따라, 일부 실시형태에서, 출발 줄기세포 집단은 부착 상태로 성장되며, 배양의 후기 단계는 부유 상태로 일어난다. 본 개시내용의 목적을 위해, 어구 "부착 상태로 성장된" 또는 "부착 상태로 배양된"은 세포가 배양 접시의 표면에 부착하는 표준 세포 배양을 지칭한다. 일부 경우에, 배양 접시는 부착력을 증진시키기 위해 기질로 코팅될 수 있으며, 일부 경우에, 접시에는 부착력을 증진시키기 위해 전체 양 전하가 제공될 수 있다. 일반적으로, iPS 세포와 같은 줄기세포의 배양은 부착 기질을 필요로 하며, 다양한 부착력-증진 기질은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 하나의 비트로넥틴 또는 마트리겔은 부착력을 증진시키기 위해 세포 플라스크에 적용될 수 있지만, 마트리겔은 마우스 육종 세포로부터 수확되고, 이에 따라, 임상 사용에 바람직하지 않다. 일부 실시형태에서, 분화는 출발 줄기세포 집단을 내배엽-유도 배지와 함께 배양함으로써 시작되고, 부착 상태로 성장된다. 기질/플레이트 상에서 3D 구조(예를 들어, 분화된/분화하는 세포의 응집물)의 형성은 분화가 진행함에 따라 점진적으로 일어날 수 있다. 약 15일이 되면, 3D 구조는 플레이트로부터 탈착되기 시작되며, 이러한 3D 구조는 부착 기질(예를 들어, 비트로넥틴)로 코팅되지 않은 용기로 옮겨질 수 있으며, 이에 따라, 3D 구조는 자유-부유 현탁액 중에서 배양되도록 한다. 부착 상태에서의 배양에서 부양 상태에서의 배양으로의 이러한 전이는 신규하고, 인슐린-분비 세포로 더욱 자연스러운 분화시킬 수 있다.
또한, 통상적인 실무과는 달리, 배양을 개시하기 위해 사용되는 줄기세포가 분화를 촉진시키기 위해 Wnt3a와 접촉될 필요가 없다는 것이 확인되었다. 실제로, Wnt3a는 개시된 방법에서 임의의 포인트에서 요망되지 않는다.
마지막으로, 인슐린-분비 세포를 생산하는 과정 전반에 걸쳐 다양한 분화 배지가 교체되더라도, 세포가 적어도 약 20일 동안 적어도 일부 농도의 레티노산 및 사이클로파민과 접촉될 때 분화가 가장 효율적인 것으로 나타나는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포는 바람직하게는, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일, 적어도 약 26일, 적어도 약 27일 또는 적어도 약 28일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출된다. 일부 실시형태에서, 레티노산 및 사이클로파민에 대한 이러한 지속적인 노출은 출발 줄기세포 집단이 내배엽 계통 쪽으로 강제된 후에, 예를 들어, 출발 줄기세포 집단이 약 1, 약 2, 약 3, 약 4 또는 약 5일 동안 액티빈 A 및 보르트만닌의 존재 하에서 배양된 후에 시작될 수 있다.
당업자는 개시된 방법이 일반적으로 인간 및 비-인간 영장류 줄기세포와 같은 포유류 줄기세포에 적용될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 그러나, 추가적인 포유류 세포, 예를 들어, 돼지, 소, 말, 양, 개 또는 고양이 줄기세포는 또한, 개시된 방법에 따라 분화될 수 있다. 추가적으로, 당업자는 개시된 방법이 예를 들어 부착 배양물 및/또는 현탁 배양물을 포함하는 다양한 형태의 세포 배양물을 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
인슐린-생성 세포를 생성시키기 위한 개시된 프로토콜은 인간 배아 줄기세포 및 재프로그래밍된 췌장 조직 둘 다로부터 인슐린-생성 베타 세포의 수율을 향상시켰다. 인슐린 생성 세포를 생산하는 보편적인 방법과는 상반되게, 본 명세서에 개시된 프로토콜은 인슐린-생성 세포의 거의 균질한 집단을 산출한다. 균질한 세포 집단을 생산하는 것은 줄기세포가 이식될 때 기형종을 형성하고 종양형성 가능성을 가질 수 있기 때문에, 치료 효능뿐만 아니라 안전성에도 중요하다. 개시된 분화 방법에 의해 제공된 높은 수준의 분화 및 균질성은 유용한 세포 요법의 개발에서 필수적인 종양형성 가능성을 갖는 세포가 적다는 것을 의미한다.
개시된 분화 방법을 이용하기 전에, 내배엽 세포로 우선적으로 분화하는 줄기세포는 본 출원의 섹션 II에 개시된 방법에 따라 동정될 수 있다. 이는 인슐린-생성 세포의 수율을 증가시킬 뿐만 아니라 분화 과정의 전체 효율을 증가시킬 수 있다.
IV. 세포-기반 조성물 및 치료 방법
본 명세서에 개시된 인슐린-생성 세포는 이를 필요로 하는 대상체에서 당뇨병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 인슐린-의존성 당뇨병을 갖는 포유동물, 예를 들어, 인간 대상체이다.
본 개시내용은 당뇨병을 치료하기 위해 세포-기반 조성물 내에 도입될 수 있는 실질적으로 균질한 인슐린-생성 세포의 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 이에 따라, 본 명세서에는 이를 필요로 하는 인간 대상체에 이식하기 위한 적합한 운반체 및 대리 췌장 세포의 집단을 포함하며, 적어도 66%의 세포가 인슐린-생성 췌장 세포인, 당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 인슐린-생성 췌장 세포를 포함할 수 있다.
치료 세포를 이식하기 위한 적합한 운반체는 당해 분야에 공지되어 있고, 하이드로겔, 천연 및 합성 폴리머 스캐폴드, 세포외 매트릭스(예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 등을 포함할 수 있음), 히알루론산, 생체모방 스캐폴드, 폴리락타이드(PLA) 스캐폴드, 폴리글리콜라이드(PGA) 스캐폴드, PLA-PGA 코폴리머(PLGA) 스캐폴드뿐만 아니라 하이드록시아파타이트 스캐폴드 및 거대-다공성 크리오겔을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 이식을 위해 적합한 운반체는 매크로-캡슐, 예를 들어, 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 글루코만난, 또는 이들의 조합물을 포함하는 매크로-캡슐에 인슐린-생성 세포를 캡슐화하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 66%의 대리 췌장 세포는 NeuroD1을 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%의 대리 췌장 세포는 NeuroD1을 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 적어도 68%의 대리 췌장 세포는 Nkx6.1을 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%의 대리 췌장 세포는 Nkx6.1을 발현시킨다.
당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 조성물은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포-기반 조성물의 인슐린-생성 췌장 세포는, 예를 들어, (a) 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포의 집단을 배양하여, 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 인간 줄기세포는 내배엽 세포로의 분화 전에 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는, 상기 분화시키는 단계; (b) 내분비-유도 인자를 포함하는 제2 배지 중에서 단계 (a)로부터의 내배엽 세포를 배양하여, 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계; (c) KGF를 포함하는 제3 배지 중에서 단계 (b)로부터의 내분비 세포를 배양하여, 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계; 및 (d) 갑상선 호르몬을 포함하는 제4 배지 중에서 단계 (c)로부터의 췌장 전구 세포를 배양하여, 췌장 전구 세포를 인슐린-생성 췌장 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물의 인슐린-생성 췌장 세포는 예를 들어, (a) 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포의 집단을 배양하여, 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 인간 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는, 상기 분화시키는 단계; (b) 적어도 이십(20)일 동안 레티노산에 후속 배양 동안의 세포를 노출시키는 단계; (c) 적어도 이십(20)일 동안 사이클로파민 또는 화학적 유사체에 후속 배양 단계 동안의 세포를 노출시키는 단계; (d) 부착 기질 상에서 세포 배양을 개시하는 단계; 및 (e) 3차원 구조를 자연적으로 및 자발적으로 형성하는 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계를 포함하는 방법에 따라 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물의 인슐린-생성 췌장 세포는 예를 들어, 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 부착 기질 상에서 인간 줄기세포의 집단을 배양하는 단계로서, 포유류 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는 단계; 및 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 배지 중에서 부유 상태로 세포를 추가로 배양하는 단계로서, 세포는 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되는 단계를 포함하는 방법에 따라 유도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내배엽-유도 인자는 액티빈-A 및/또는 보르트만닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 추가적인 배지는 KGF, 노긴, EGF, 및/또는 갑상선 호르몬, 예를 들어, T3을 포함할 수 있다.
액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 내배엽-유도 인자가 당해 분야에 공지되어 있다. 마찬가지로, 레티노산 및 사이클로파민을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 내분비-유도 인자가 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 제2 배지는 KGF를 포함하며, 일부 실시형태에서, 세포는 단계 (b) 후까지 KGF와 접촉되지 않는다. 일부 실시형태에서, KGF는 단계 (a)의 배지 중에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제3 배지는 노긴 및/또는 표피 성장 인자(EGF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 배지는 레티노산 및/또는 사이클로파민을 포함한다. 그리고, 일부 실시형태에서, 갑상선 호르몬은 T3일 수 있다.
개시된 세포-기반 조성물을 제조하기 위해 사용되는 줄기세포의 공급원은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 본 명세서에 개시된 바와 같이, 내배엽 계통으로 우선적으로 분화하는 세포/세포주를 선택하는 것은 인슐린-생성 세포의 수율을 증가시키고, 분화 효율을 증가시킬 수 있다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물을 제조하기 위한 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 췌장 1차 조직으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 배아 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 유도 만능 줄기세포이다. 일부 실시형태에서, 개시된 분화 방법에서 사용되는 줄기세포는 비-만능성 재프로그래밍된 세포이다. 일부 실시형태에서, 줄기세포는 인간 줄기세포이다.
본 개시내용의 목적을 위하여, 당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 조성물 내에 도입하기 위한 인슐린-생성 세포를 제조할 때, 세포의 게놈 내에 재프로그래밍 유전자를 도입하지 않고 세포에서 재프로그래밍 유전자를 발현시킴으로써 세포를 재프로그래밍하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 형질도입된 유전자가 예를 들어, 에피솜 발현 플라스미드를 사용하여 게놈 내에 그러한 유전자를 도입하지 않고 세포에서 발현될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 재프로그래밍 유전자는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 적어도 4개 이상의 에피솜 발현 플라스미드 상에서 발현될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 다수의 재프로그래밍 유전자는 당해 분야에 공지되어 있고, 개시된 방법의 목적을 위해 사용될 수 있지만, 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 유전자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 L-Myc를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 예를 들어, 마이크로-캡슐 또는 매크로-캡슐에 캡슐화된다.
본 개시내용은 또한, 개시된 세포-기반 조성물을 사용하여 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 당뇨병을 치료하는 방법은 일반적으로, 이를 필요로 하는 대상체에 캡슐화된 치료학적 유효량의 인슐린-생성 세포를 이식하는 것을 포함한다. 치료학적 유효량의 인슐린-생성 세포는 세포-기반 조성물, 예를 들어, 마이크로-캡슐화되거나 매크로-캡슐화된 대리 췌장 세포의 집단의 형태를 가질 수 있다.
이에 따라, 일부 실시형태에서, 본 방법은 이를 필요로 하는 개체 내에 매크로-캡슐에 캡슐화된 치료학적 유효량의 인슐린-생성 세포를 이식하는 것을 포함한다. 매크로-캡슐의 조성물은 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 다양한 물질이 인슐린-생성 세포를 캡슐화하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 예를 들어, 캡슐은 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 글루코만난, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 매크로-캡슐은 외부 배리어가 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난을 포함하는 적어도 하나의 배리어를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 매크로-캡슐은 알기네이트의 내부 캡슐 및 셀룰로스 설페이트 및 글루코만난의 외부 캡슐을 포함하는 실린더형 튜브의 형상으로 형성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 이를 필요로 하는 개체 내에 치료학적 유효량의, 개시된 매크로-캡슐에 캡슐화된 인슐린-생성 세포를 약 1년에 1회, 2년에 1회, 3년에 1회, 4년에 1회, 5년에 1회, 또는 그 이상 이식하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이식된 세포는 이식 후 적어도 6개월 동안 생존할 것이다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, 대상체는 단지 하나의 이식체를 필요로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개월마다 1회, 1, 2, 3, 4 또는 5년 이상마다 1회 또는 대상체가 재발 고혈당증을 가지거나 당뇨병 상태로 돌아갈 때까지 교체해야 할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 대상체의 더 큰 장막 내에 이식될 수 있다. 더 큰 장막(또한 큰 장막, 대망, 위결장 대망, 그물막, 또는 대망막으로서 공지됨)은 위 아래에 늘어지고 후복벽에 도달하기 전에 횡행결장으로 올라가기 위해 위의 더 높은 곡률부로부터 연장하는 장측복막의 큰 아프론-유사 주름이다. 이에 따라, 세포-기반 조성물은 장막으로부터 외과적으로 형성된 낭 내에 이식될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 복막강 내에 이식된다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 복막강 내에 이식되고 장막에 고정된다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 장막낭(omentum pouch)에 이식된다.
인슐린-생성 세포의 예시적인 용량은 치료되는 개체의 크기 및 건강에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 개시된 세포-기반 조성물에서 캡슐화된 세포의 예시적인 이식체는 체중 1Kg당 5백만 개의 세포 내지 1천만 개의 세포를 포함할 수 있다.
또한, 개시된 치료 방법은 캡슐화된 치료 세포 이외에 제2 치료제의 투여를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 추가적인 치료 화합물은 인슐린 주사제, 메트포르민, 설포닐우레아, 메글리티나이드, 티아졸리딘다이온, DPP-4 저해제, GLP-1 수용체 효능제 및 SGLT2 저해제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
인슐린-생성 세포를 포함하는 세포-기반 조성물을 이식하는 것을 포함하는 특별한 치료 요법은 제공된 환자의 결과를 개선시키는 지의 여부에 따라 평가될 수 있으며, 이는 대상체의 혈당 수준을 안정화시키거나 정상화시키거나 저혈당증의 에피소드, 글리코실화된 헤모글로빈의 상승된 수준(HbA1C 수준), 심장병, 망막병증, 신경병증, 신장병, 간 질환, 치주 질환 및 치유되지 않은 궤양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당뇨병과 관련된 증상 또는 합병증의 위험 또는 발생을 감소시키는 데 도움을 주는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 조성물은 예를 들어, 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 글루코만난, 또는 이들의 조합물을 포함하는 캡슐에서 캡슐화될 것이다.
이에 따라, 본 개시내용의 목적을 위해, 대상체는 요망되는 임상 결과를 포함하는 하나 이상의 유익하거나 요망되는 결과가 얻어지는 경우에 치료된다. 예를 들어, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 당뇨병으로 인한 하나 이상의 증상 감소, 당뇨병으로 고통 당하는 환자의 삶의 질 증가, 당뇨병을 치료하기 위해 요망되는 다른 약제의 용량 감소, 당뇨병과 관련된 합병증의 지연 또는 예방, 및/또는 개체의 생존의 연장.
또한, 본 방법의 대상체가 일반적으로 당뇨병을 갖는 대상체이지만, 환자의 연령이 제한되지 않는다. 개시된 방법은 모든 연령 그룹 및 코호트에 걸쳐 당뇨병을 치료하는데 유용하다. 이에 따라, 일부 실시형태에서, 대상체는 소아 대상체일 수 있으며, 다른 실시형태에서, 대상체는 성인 대상체일 수 있다.
당업자는 본 개시가 목적을 수행하고 언급된 목적 및 장점뿐만 아니라 이에 내재된 장점을 얻기 위해 잘 적응된다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 이의 변형 및 다른 용도가 당업자에게 일어날 것이다. 이러한 변형은 본 개시내용의 사상 내에 포함된다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예의 특정 조건 또는 세부사항으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1 - 물질 및 방법
섬 수확: 적절하게 동의하고 익명화된 전체 인간 췌장을 등록된 장기 기증으로부터 수득하였다. 엽(lobe)에 섬 단리 용액(0.35g NaHCO3/L 및 1% 인간 혈청 알부민(Roche A9731)을 함유한 행크 평형 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution)(Invitrogen #14065-056)) 중에 1.4 ㎎/㎖로 재현탁된 콜라게나제 P(Roche #1129 002 001)를 주사하였다. 팽창된 엽을 약하게 교반하면서 37℃에서 15 내지 25분 동안 인큐베이션하였다. 소화물을 냉각된 섬 단린 용액으로 희석시키고, 5분 동안 1500RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 격렬하게 분쇄하면서 냉각된 섬 단리 용액 중에서 세척하였다. 용액을 420㎛ e시브(sieve)(Bellco Glass, Inc, Cat# 1985-00040)를 통해 여과하고, 원심분리하였다. 펠릿을 1.100 g/㎖ Histopaque(Sigma #10771, Sigma #11191) 중에서 재현탁시키고, 30분 동안 1200 RPM으로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 섬 단리 용액 중에서 2배로 희석시키고, 5분 동안 1500 RPM으로 원심분리하였다. 펠릿을 섬 단리 용액 중에서 세정하고, 원심분리하고, 37℃ 및 5% CO2에서 습윤화된 인큐베이터에서 E8 배지(Gibco #A1517001) 중에서 배양하였다. 다음날에, 섬을 5분 동안 1500 RPM으로 원심분리하고, 희석되지 않은 TryplE Select 10X(Life Technologies #A12177) 중에 재현탁시키고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 해리된 섬을 E8 배지 중에서 희석시키고, 원심분리하고, 100 ng/㎖ 하이드로코르티손(hydrocortisone)(Sigma #H0135), 1 U/㎖ 트롬빈(Sigma #T9326), 및 100 ng/㎖ EGF(Sigma E5036)가 보충된 E8 중에 재현탁시켰다. 세포를 제조업체 설명서에 따라 비트로넥틴(vitronectin)(Life Technologies # A14700)으로 코팅된 접시 상에서 배양하였다.
재프로그래밍: 세포를 PBS(Gibco #14190144)로 세정하고, 37℃에서 5분 동안 TryplE select 1X 중에서 인큐베이션하였다. 소화를 E8 배지로 정지시키고, 세포를 5분 동안 1000 RPM으로 원심분리하였다. 세포를 BTX 전기천공 용액(VWR #89130-542) 중에서 2E6개 세포/200㎕로 재현탁하고, 20㎍의 재프로그래밍 플라스미드를 갖는 전기천공 큐벳에 첨가하였다. CMV 프로모터의 제어 하에서 EBNA 에피솜 발현 서열, 암피실린 내성, 및 재프로그래밍 유전자 Oct4, Sox2, Klf4 및 L-Myc를 포함하는 2개의 재프로그래밍 플라스미드를 사내에서 작제화하였다. 전기천공 큐벳을 유전자 펄스 XL(Bio-Rad)를 이용하여 펄스화하였다. 세포를 100 ng/㎖ bFGF(Life Technologies # PHG6015) 및 1uM 하이드로코르티손이 보충된 E6 배지(Life Technologies # a1516401) 중에서 비트로넥틴-코팅된 접시로 옮겼다. 세포를 5% CO2를 갖는 습윤화된 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다. 24시간 후에, 배지를 100 ng/㎖ bFGF, 및 1uM 하이드로코르티손, 및 100uM 나트륨 부티레이트(Sigma # P1269)가 보충된 E6로 교체하고, 격일마다 교체하였다. 줄기세포 콜로니를 수작업으로 분리하고, E8 배지 중에서 비트로넥틴-코팅된 접시로 옮겼다. 두 도너의 1차 조직으로부터 생성된 73개의 세포주를 초기에 내배엽-유도제 액티빈-A 및 보르트만닌에 4일 노출 후 내배엽 마커를 발현시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 내배엽 마커를 발현시키는 가장 비율의 세포를 갖는 배양물을 선택하였다. 제1 스크린을 통과한 24개의 세포주를 후속하여 12일 췌장 분화 프로토콜에 노출 후 췌장 마커를 발현시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 가장 높은 비율의 췌장 세포를 지속적으로 생성한 세포주는 SR1423으로 불리워졌고, 이는 뱅킹되었고, 모든 후속 실험을 위해 사용되었다.
세포주 특징분석: SR1423은 만능 세포(도 3A)의 통상적인 마커를 발현시켰고, 정상 핵형(도 3B)을 갖는다. SR1423의 DNA STR 프로파일은 도너 조직과 매칭되는 단일 세포주임을 확인하였다(도 3C). 추가적으로, SR1423은 만능성 세포주의 통상적인 속도로 성장한다(도 3D). 동일한 도너 및 재프로그래밍 실험으로부터의 다른 유도 만능 줄기세포(하기에서 "iPSC로 불리워짐)주가 또한 우선 분화를 나타낸 것으로 관찰되었다. iPSC 세포주 "B"는 또한 내배엽으로 잘 분화되었으며, 세포주 "C" 및 "D"는 내배엽 계통에 대한 분화에 대해 선호도를 나타내지 않았다(데이터는 미도시됨). 유전자 발현 프로파일과 특정 계통으로 분화하는 iPSC의 불능 간의 상관관계가 존재하지의 여부를 결정하기 위해, 세포주 B, C 및 D뿐만 아니라 SR1423의 발현된 유전자의 전체-게놈 마이크로어레이 프로파일링을 수행하였다(예를 들어, 문헌[Koyanagi-Aoi M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (2013)] 참조). 적어도 Log2의 배수 변화 발현을 기초로 한 자율 계층적 클러스터링 분석은 SR1423이 세포주 B와 함께 클러스터링되지만 C 및 D와 함께 클러스터링되지 않음을 나타내었다. 이는 내배엽 계통에 대한 강건한 및 우선 분화와 상관 관계가 있는 유전자 발현 패턴을 확인하였다(도 4A). 10개의 가장 차별되게 발현된 유전자 중에서, BHMT2, Cox7A1, HSPB2, 및 NAP1L1은 qRT-PCR 측정을 이용하여 내배엽을 형성하는 능력과 유의미하게 상관 관계가 있다(도 4B).
줄기세포 배양: 미분화된 iPS 세포를 제조업체 설명서에 따라 비트로넥틴 XF(Stem Cell Technologies #07180) 또는 17㎍/㎠ Geltrex(Life Technologies #A1413301)가 코팅된 6-웰 조직 배양 플레이트(Greiner Bio-One #657160)에서 유지시키고, E8 배지를 매일 공급하였다. 배양물을 0.5mM EDTA(Life Technologies #15575)로 3 내지 5일마다 75 내지 85% 컨플루언스로 계대배양하고, 7×103개의 세포/㎠로 시딩하였다.
분화: SR1423 세포의 제1 배치를 2.3×104개의 세포/㎠로 시딩하고, 18 내지 24시간 동안 성장시켰다. 이후에, 세포를 dPBS(-Mg2+/-Ca2+)로 세척하고, 배지를 하기와 같이 6개의 배지를 포함한 28일 스케쥴에 따라 교체하였다: 1, 2, 3일: DMEM/F-12 배지(Life Technologies #10565018), 0.2% HSA, 1XB27 보충물(Life Technologies #A1486701), 100 ng/㎖ 액티빈 A 및 1uM 보르트만닌; 4, 5, 6, 7일: DMEM(Life Technologies #10567014), 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 4uM 레티노산, 50 ng/㎖ KGF, 50 ng/㎖ 노긴, 0.25uM 사이클로파민 KAAD; 8, 10일: DMEM, 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 50 ng/㎖ KGF, 50 ng/㎖ 노긴, 50 ng/㎖ EGF; 12, 14일: DMEM, 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 50 ng/㎖ 노긴, 50 ng/㎖ EGF, 1uM γ-세크레타아제 저해제 XXI, 10uM Alk5i II, 1uM T3; 16, 18일: DMEM, 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 10uM Alk5i II, 1uM T3, 100nM 레티노산; 20, 22, 24, 26, 28일: CMRL(Life Technologies #11530037), 0.2% HSA, 1X B27 보충물, 1X 글루타맥스(Life Technologies # 35050061), 10uM Alk5i II, 1uM T3, 10mM 니코틴아마이드, 50 ng/㎖ IGF-I, 10 ng/㎖ BMP4. KGF를 사용하는 제2 스테이지의 추가적인 분화를 위해, 4, 5, 6일에 DMEM, 0.2% BSA, 1XB27 보충물, 및 50 ng/㎖ KGF를 갖는 배지를 3일 후에 나머지 스테이지를 이동하는 스케쥴에 삽입하였다. 이러한 실시형태의 프로토콜은 분화 28일까지 내분비 췌장 세포의 고순도 집단을 생성하였다(도 5A). 대표적인 이미지의 정량화는 하기와 같은 세포를 포함한 집단을 나타내었으며, 여기서 68%는 내분비 췌장 마커 Nkx6.1를 발현시키며(도 5A, 5E에서 정량화됨), 66.8%는 후기-단계 췌장 마커 NeuroD1을 발현시키며(도 5B, 5E에서 정량화됨), 66.5%는 인슐린을 발현시킨다(도 5D, 5E에 정량화됨). 분화 내배엽 세포로부터 KGF를 배제하는 이러한 방법은 췌장 유래 줄기세포 및 확립된 인간 배아 줄기세포 둘 다의 수율을 개선시켰다. 도 6.
SR1423 세포의 제2 배취를 전술한 바와 같이 6.3×104개로 시딩하고, 18 내지 24시간 동안 성장시켰다. 이후에, 세포를 dPBS(-Mg2+/-Ca2+)로 세척하고, 배지를 하기와 같이 6개의 배지 포뮬레이션을 포함하는 28일 스케쥴에 따라 교체하였다: 1, 2, 3일: DMEM/F-12 배지(Life Technologies #10565018), 0.2% HSA, 1XB27 보충물(Life Technologies #A1486701), 100 ng/㎖ 액티빈 A(PeproTech #AF-120-14E) 및 1μM 보르트만닌(Sigma #W3144); 4, 5, 6, 7일: DMEM(Life Technologies #10567014), 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 2μM 레티노산(Sigma #R2625), 50 ng/㎖ KGF(PeproTech #AF-100-19), 50 ng/㎖ 노긴(PeproTech #120-10C), 0.25μM 사이클로파민 KAAD(Millipore #239804); 8, 10일: DMEM, 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 50 ng/㎖ KGF, 50 ng/㎖ 노긴, 50 ng/㎖ EGF(PeproTech #AF-100-15), 100nM 레티노산(Sigma #R2625), 0.25μM 사이클로파민 KAAD(Millipore #239804); 12, 14일: DMEM, 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 50 ng/㎖ 노긴, 50 ng/㎖ EGF, 1μM γ-세크레타아제 저해제 XXI(Millipore #565790), 10μM Alk5i II(Axxora, #ALX-270-445), 100nM 레티노산(Sigma #R2625), 0.25μM 사이클로파민 KAAD(Millipore #239804); 16, 18일: DMEM, 0.2% HSA, 1XB27 보충물, 10μM Alk5i II, 100nM 레티노산, 0.25μM 사이클로파민 KAAD(Millipore #239804); 20, 22, 24, 26, 28일: CMRL(Life Technologies #11530037), 0.2% HSA, 1X B27 보충물, 1X 글루타맥스(Life Technologies # 35050061), 10μM Alk5i II, 10mM 니코틴아마이드(Sigma #N0636), 50 ng/㎖ IGF-I(PeproTech #100-11), 100nM 레티노산(Sigma #R2625), 0.25μM 사이클로파민 KAAD(Millipore #239804)), 및 글루카곤(Sigma #G2044).
글루코스 자극된 인슐린 분비의 시험: 세포를 글루코스 용액에 노출하기 전 2시간 동안 1g/㎗ 글루코스, 10uM Alk5i II + 1uM T3 + 10mM 니코틴아마이드 + 50 ng/㎖ IGF-I + 10 ng/㎖ BMP4를 함유한 CMRL, 0.2% HSA, 1X B27 보충물, 1X 글루타맥스(Life Technologies # 35050061) 중에서 배양하였다. 세포를 30분 동안 KREBS(Alfa Aesar # J67591-AP) 중 2mM 글루코스 중에서 인큐베이션하고, 상청액을 수집하였다. 완충제를 30분 동안 KREBS 중 20mM 글루코스에 대해 교체하고, 상청액을 수집하였다. 완충제를 30분 동안 KREBS 중 20mM 글루코스, 30mM KCl에 대해 교체하고, 상청액을 수집하였다. 각 상청액에서 C-펩타이드의 농도를 초민감성 C-펩타이드 또는 글루카곤 ELISA(Mercodia #10-1141-01) 및 GENios 마이크로플레이트 판독기(TECAN)를 이용하여 결정하였다. 흡광도 판독값을 Magellan 소프트웨어(TECAN)를 이용하여 2회 측정하였다. 이러한 절차 후에, SR1423으로부터 분화된 세포가 인슐린에 대한 대리물로서 C-펩타이드(도 7) 및 글루카곤(미도시됨)을 사용하여 인슐린을 분비한다는 것이 관찰되었다.
실시예 2 - 결과
세포주 유도. 재프로그래밍 유전자를 성숙한 세포의 핵 내에 도입함으로써 iPSC 세포주를 생성하였다. 이러한 유전자, 통상적으로, OCT4, Sox2, KLF4, 및 c-Myc는 배아 줄기세포의 유전자 발현 패턴, 모폴로지 및 거동을 채택하도록 세포의 서브세트를 유도하였다. 출발 세포 집단의 후생적 특징이 재프로그래밍된 세포, "후생적 기억"으로 불리는 현상에서 지속하는 것으로 보고되었지만, 이러한 효과의 기간이 알려져 있지 않는다. 췌장 계통으로 효율적으로 분화하는 iPSC 세포주를 생성시키는 잠재력을 최대화하기 위해, 동의된 건강한 성인 도너 췌장의 랑게르한스 섬으로부터의 1차 세포(도 1A)를 재프로그래밍을 위해 선택하였다.
세포 배양물에서 성장된 1차 세포는 가능하게, 인공 배양 조건에 대한 채택의 결과로서, 시간에 따라 균질화되고 기능적 성숙 특성을 잃을 수 있다. 출발 세포 집단에서 유전적 다양성의 손실을 피하기 위해, 프로그래밍 유전자는 세포 수확 후 5일 이내였다. 재프로그래밍 유전자 Oct4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 2개의 에피솜 발현 플라스미드의 전기천공을 통해 1차 세포에 도입하였다. 발암 유전자를 도입할 가능성을 감소시키기 위해 C-Myc보다 L-Myc를 선택하였다. 두 도너의 1차 조직으로부터 생성된 73개의 세포주를 초기에 내배엽-유도제 액티빈-A 및 보르트만닌에 대한 4일 노출 후 내배엽 마커를 발현시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 가장 높은 비율의 내배엽 마커를 발현시키는 세포를 갖는 배양물을 선택하였다. 제1 스크린을 통과한 24개의 세포주를 후속하여 12일 췌장 분화 프로토콜에 노출 후 췌장 마커를 발현시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 가장 높은 비율의 췌장 세포를 지속적으로 생성한 세포주는 SR1423으로 불리워졌고, 뱅킹되었고, 모든 후속 실험을 위해 사용되었다. 이러한 세포주는 최종 내배엽(도 1B), 및 췌장 전구 세포(도 1C)의 거의 균질한 배양물을 생성하였다. 특히, SR1423은 외배엽 및 내배엽(각각 OTX2 및 Sox17로 지시된 바와 같음)으로 분화하는 강력한 능력을 나타내었지만, 상업적 키트를 이용하여 분화될 때 중배엽 마커 브라큐리를 발현하지 못하였다(도 2). 모두 3개의 배엽이 달성되지 않았기 때문에, SR1423은 iPSC에 대한 만능성의 허용되는 기준에 맞지 않고, 대신에 다능성 또는 비-만능성으로 간주될 수 있다.
세포주 특징분석. SR1423은 만능 세포의 통상적인 마커를 발현시키고(도 3A), 정상 핵형을 갖는다(도 3B). 이의 DNA STR 프로파일은 도넌 조직과 매칭하고(도 3C) NIH, ATCC 및 DSMZ 데이터베이스에서 모든 지문으로부터 독특한 단일 세포주를 확인한다. 추가적으로, SR1423은 만능성 세포주의 통상적인 속도로 성장한다(도 3D). 동일한 도너 및 재프로그래밍 실험으로부터의 다른 iPSC 세포주가 또한 우선 분화를 나타낸다는 것이 관찰되었다. iPSC 세포주 "B"는 또한 내배엽으로 잘 분화되었으며, iPSC 세포주 "C" 및 "D"는 내배엽 계통으로의 분화에 대한 선호를 나타내지 않았다(데이터는 미도시됨). 발현된 유전자의 전체-게놈 마이크로어레이 프로파일링을 세포주 B, C 및 D뿐만 아니라 SR1423에 대해 수행하였다. 이러한 비교로, 도너 또는 재프로그래밍 방법으로 인한 유전자 발현의 차이를 제거하였다. 적어도 Log2의 배수 변화 발현을 기초로 한 자율 계층적 클러스터링 분석은 SR1423이 세포주 B와 함께 클러스터링되지만, C 및 D와 상이하게 클러스터링됨을 나타낸다. 이는 내배엽 계통으로 강력한 및 우선 분화와 상관 관계가 있는 유전자 발현 패턴을 확인한다(도 4A). 10개의 차별적으로 발현된 유전자 중에서, BHMT2, Cox7A1, HSPB2 및 NAP1L1은 qRT-PCR 측정을 이용하여 내배엽을 형성하는 능력과 유의미하게 상관 관계가 있었다(도 4B). 이러한 결과는 규정된 유전자의 서브세트의 유전자 발현이 치료 유용성을 갖는 특정 iPSC 세포주를 확인하기 위해 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
세포 분화. 만능성 줄기세포 집단으로부터 췌장 세포의 생산을 보고하는 다른 그룹은 독특한 줄기세포 집단과 조합하여 독특한 세포 배양 프로토콜을 사용한다. 이는, 각 프로토콜이 특정 출발 세포 집단에 맞게 조정되어, 출발 세포 집단이 분화 잠재력의 주요 결정 인자라는 개념에 대한 신뢰를 빌리는 것을 의미한다.
대부분의 방법에서, 베타 세포의 생성은 배아 췌장 발달의 공지된 단계를 통해 만능 세포의 점진적인 분화에 의해 발생한다. 이러한 진행은 내배엽의 형성으로 시작하고, 이후에 췌장 전구 세포, 내분비-수용 췌장으로 전이되고, 최종적으로 호르몬-발현 췌장 세포로 전이한다. 통상적으로, Sox17 및 HNF3beta를 발현시키는 최종 내배엽 세포의 생산은 포유동물에서 내배엽 패턴화에서 연관된 신호전달 분자인 액티빈 A 및 Wnt3a에 대한 노출에 의해 달성되었다. 췌장 십이지장 호메오박스-1(Pdx1)의 발현에 의해 동정된, 췌장 전구 세포는 레티노산으로 HOX 유전자의 활성화 후에 발생하며, 사이클로파민으로 해지호그 신호전달을 억제한다. Pdx1 및 Nkx6.1 둘 다를 발현시키는 내분비 세포는 패턴화 단백질 노긴의 존재 하에서 췌장관 세포의 형성과 연관된 KGF 신호전달의 활성화에 의해 췌장 전구 세포로부터 형성된다. 호르몬 발현 표현형으로의 성숙은 갑상선 호르몬에 의해 촉진된다. 분화 프로토콜에서 사용된 성장 인자 및 호르몬을 소분자로 대체하기 위해 상당한 노력이 있었다.
개시된 방법은 SR1423 및 다른 줄기세포의 베타 세포 표현형으로의 분화를 유도할 수 있다. 개시된 프로토콜은 분화 28일까지 내분비 췌장 세포의 고순도 집단을 생성하였다(도 5A). 대표적인 이미지의 정량화는 하기와 같은 세포를 포함하는 집단을 나타내었으며, 여기서, 68%는 내분비 췌장 마커 Nkx6.1을 발현시켰으며, 66.8%는 후기-단계 췌장 마커 NeuroD1을 발현시켰으며, 66.5%는 인슐린을 발현시켰다(도 5B).
본 프로토콜은 Wnt3A에 대한 최종 내배엽 세포의 노출을 제공하지 않고, 선택적으로, 배양 4 내지 7일에 TGFβ RI 키나제 억제와 함께 또는 이의 없이, KGF(FGF7)에 최종 내배엽을 노출시키지 않는다. 분화 초기 단계에서의 KGF의 영향이 시험되었고, 췌장 및 인슐린-생성 세포의 생산에서 상당한 감소를 나타내었다(도 6A). 이러한 결과가 SR1423 세포주에 대해 특이적인 지를 결정하기 위해, 개시된 프로토콜을 매칭되는 결과는 갖는 참조 배아 줄기세포주 BGO1V를 사용하는 공지된 프로토콜과 비교하였다(도 6B, 도 6C에서 정량화됨). 병렬로 사용하는 경우, 개시된 프로토콜은 이러한 세포주에 대해 더 많은 인슐린-생성 세포를 생성하였다.
개시된 프로토콜에 따른 SR1423으로부터 분화된 세포는 인슐린(도 7) 및 글루카곤(미도시됨)을 배지로 분비한다. SR1423의 순차적인 분화는 일관되고 재현 가능한 높은 수준의 C-펩타이드 검출(도 7)을 그리고 본 출원의 프로토콜로 분화될 때 더 높은 수준으로 나타난다. 이러한 세포는 글루코스-반응 방식으로 인슐린을 분비할 수 있다(도시되지 않음). 결과적으로, 이러한 호르몬-분비 세포는 세포 대체 요법에 대한 이상적인 후보물질일 수 있다. 또한, 배양 배지에 글루카곤을 첨가함으로써 성숙한 인슐린 및 글루카곤-발현 세포의 최적의 균형을 달성하는 것이 가능하며, 이는 인슐린 및 글루카곤을 공동-발현하는 세포의 양을 감소시키는 이점을 갖는다(도 10A 내지 도 10C).
실시예 3 - 동물 모델에서 개시된 치료 세포로의 당뇨병 치료
알기네이트 캡슐화: SR1423의 분화된 평면 배양물을 세포 리프터를 이용하여 수작업으로 방출시키고, 6-웰 현탁액 배양 접시에서 95 RPM으로 밤새 흔들었다. 형성된 클러스터를 130mM NaCl, 10mM MOPS, pH 7.4에서 세정하고, 2% Pronova UP MVG 알기네이트(Novamatrix)에서 2E6개의 세포/㎖의 밀도로 재현탁하였다. 알기네이트/세포 혼합물을 시린지에 로딩하고, 0.24㎛ 노즐을 이용하여 4 ㎖/분 및 7 kV에서 Nisco 정전기 액적 생성기를 통해 공급하거나 20mM BaCl2, 130mM NaCl, 10mM MOPS의 중합 배스에 수작업으로 떨어뜨렸다. 비드를 4회 세정하고, 이식할 때까지 분화 배지로 돌려보내었다.
마우스에서 당뇨병의 유도: 스트렙토조토신(STZ, VWR # 102515-840)으로 당뇨병을 유도하기 위해 8 내지 10주령의 면역-적격 CD1 마우스를 사용하였다. STZ를 마우스 내에 복강내로(200 ㎎/㎏) 주사하였다. STZ-유도된 당뇨병은 혈당 수준을 측정함으로써 확인되었다.
알기네이트 캡슐화된 분화된 SR1423 세포의 이식: STZ 유도 당뇨병 마우스를 20 ㎎/㎏ 트라이보로메탄올(Sigma # 776557888)로 마취하고, 이의 복부를 면도하고 이소프로판올로 멸균하였다. 흉골 아래 복부 중앙을 수직으로 절개하였다. 알기네이트 비드를 복막에 이식하고, 절개부를 봉합사로 봉합하였다. 수술후, 마우스에 3일 동안 케토프로펜(2.5 ㎎/Kg, ThermoFisher #P08D009)을 제공하였다. 마우스는 이식 후 정기적으로 관찰되었다. 상업용 혈당측정기를 이용하여 꼬리 정맥으로부터 소량의 혈액을 채취함으로써 혈당 수준을 1주에 2회 모니터링하였다. 낮은 혈당은 이식 48시간 내에 명백하였고, 수 주 동안 유지되었다(도 8).
동물 모델에서 당뇨병의 역전. 이식을 위한 섬 세포를 면역-보호하는 일반적인 방법은 알기네이트-함유 마이크로비드 내에 세포를 임베딩하는 것이다. 알기네이트 내에 임베딩되고 복막에 이식된 대리 췌장 세포는 당뇨병의 단기 역전을 나타낼 수 있고, 양호한 개념 증명의 기초를 제공할 수 있다. 섬유증을 자극하는 경향이 낮은 개질된 알기네이트로 형성된 마이크로비드는 최대 6개월 동안 정상 설치류에서 당뇨병을 역전시킬 수 있었다. 면역-보호 디바이스 내에서 당뇨병을 역전시키기는 SR1423-생성 세포의 능력을 입증하기 위해, 본 발명자는 알기네이트 비드 내에 분화된 세포를 임베딩하였고, 화학적으로 유도된 당뇨병을 갖는 정상 마우스의 복막에 이를 이식하였다. 낮은 혈당은 이식 48시간 이내에 명백하였고, 수주 기간 동안 유지되었다(도 8).
실시예 4 - 개시된 방법을 이용한 비-인간 영장류 세포의 배양
만능성 줄기세포를 단리시키고 줄기세포를 인슐린-생성 췌장 계통으로 효율적으로 분화시키기 위한 개시된 방법은 또한, 비-인간 조직으로 시작하고 비-췌장 조직으로 시작할 때 효과적이다. 섬유아세포를 종 래서스 원숭이의 3마리 비-인간 영장류(NHP)의 피부 생검으로부터 수확하였고, 인간 세포에 대해 기술된 바와 같이 동일하게 배양하였다(즉, 실시예 1의 배양 및 분화 단계). 재프로그래밍 유전자 Oct4, Sox2, Klf4 및 L-Myc를 2개의 에피솜 발현 플라스미드의 전기천공을 통해 1차 섬유아세포에 도입하였다. NHP 도너의 1차 조직으로부터 생성된 줄기세포주는 만능성 마커 Oct4, SSEA4, Tra-1-80 및 Tra-1-60을 발현시켰다. 이러한 세포주를 내배엽-유도제 액티빈-A 및 보르트만닌에 대한 4일 노출 후 내배엽 마커를 발현시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. NHP 도너 각각으로부터의 내배엽 마커를 발현시키는 최고 비율의 세포를 갖는 배양물이 선택되고, 후속하여, 12일 췌장 분화 프로토콜에 노출 후에 췌장 마커를 발현시키는 능력에 대해 스크리닝되었다. 모두 3개의 NHP 도너로부터의 조직은 기술된 12일 분화 프로토콜에 대한 노출 시에 췌장 내배엽 세포를 효율적으로 생성한 적어도 하나의 줄기세포주를 수득하였다. 도 9는 NHP 도너로부터 유래된 이러한 세포주 중 하나의 대표적인 예를 도시한 것이다.
실시예 5 - 개시된 치료 세포로의 인간 성인에서의 당뇨병의 치료
본 실시예는 인간 성인에서 제I형 당뇨병을 치료하기 위한 치료 세포를 생성하기 위해 개시된 프로토콜을 이용하는 방법을 예시한 것이다.
인슐린-의존성 당뇨병을 갖는 성인 인간 대상체는 대상체의 장막낭 또는 복막강 내에 치료학적 유효량의, 개시된 매크로-캡슐화된 인슐린 생성 세포를 포함하는 조성물을 포함하는 이식체를 수용한다. 대상체는 혈당 수준에 대해 평가된다. 대상체는 대상체의 혈당 수준이 안정화되었는지를 확인하기 위해 치료학적 유효 수의 매크로-캡슐화된 세포의 이식 후에 모니터링된다. 대상체는 글리코실화된 헤모글로빈, 및 당뇨병의 합병증을 시간에 따라 추가로 스크리닝된다.

Claims (71)

  1. 포유류 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 부착 상태로 포유류 줄기세포를 배양하여, 상기 포유류 줄기세포가 3차원 구조를 자발적으로 형성시킬 수 있게 하는 배양 단계; 및
    b. 부유 상태로 상기 3차원 구조를 배양하는 배양 단계를 포함하되,
    상기 배양 단계들은 레티노산 및 사이클로파민에 대한 적어도 20일 노출을 포함하고, Wnt3A에 상기 3차원 구조의 줄기세포를 노출시키는 것을 포함하지 않는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 인간 줄기세포인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 비-인간 영장류 줄기세포인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 세포주로부터 유래된 것인, 방법.
  5. 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 액티빈-A(Activin-A) 및 보르트만닌(Wortmannin)을 포함하는 제1 배지 중에서 부착 기질 상에서 포유류 줄기세포를 배양하는 단계로서, 상기 포유류 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는, 상기 배양하는 단계;
    b. 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계; 및
    c. 상기 세포가 3차원 세포 구조를 형성할 때 상기 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계를 포함하되,
    상기 세포는 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 상기 부착 기질 상에 배양될 때 3차원 구조를 형성하는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 인간 줄기세포인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 비-인간 영장류 줄기세포인, 방법.
  9. 포유류 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 포유류 줄기세포를 배양하여 상기 포유류 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계; 및
    b. 내분비-유도 인자를 포함하는 제2 배지 중에서 상기 단계 a로부터의 내배엽 세포를 배양하여 상기 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계를 포함하되,
    상기 포유류 줄기세포는 내배엽 세포로의 분화 전에 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 인간 줄기세포인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 비-인간 영장류 줄기세포인, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내배엽-유도 인자가 액티빈-A를 포함하는, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배지가 보르트만닌을 포함하는, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배지가 Wnt3A를 포함하지 않는, 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 제1 배지 중에서 1 내지 3일 동안 배양되는, 방법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내분비-유도 인자가 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는, 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 배지가 노긴(noggin)을 포함하는, 방법.
  18. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 배지가 KGF를 포함하는, 방법.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 제2 배지 중에서 1 내지 4일 동안 배양되는, 방법.
  20. 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, KGF를 포함하는 제3 배지 중에서 상기 내분비 세포를 배양하여 상기 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제3 배지가 노긴 및 표피 성장 인자(EGF)를 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제3 배지가 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 제3 배지 중에서 1 내지 4일 동안 배양되는, 방법.
  24. 제20항에 있어서, 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI 및 Alk5i II를 포함하는 제4 배지 중에서 상기 췌장 전구 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제4 배지가 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포가 상기 제4 배지 중에서 1 내지 4일 동안 배양되는, 방법.
  27. 제24항에 있어서, Alk5i II 및 레티노산을 포함하는 제5 배지 중에서 상기 췌장 전구 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제5 배지가 사이클로파민을 포함하는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포가 상기 제5 배지 중에서 1 내지 5일 동안 배양되는, 방법.
  30. 제27항에 있어서, Alk5i II, 니코틴아마이드 및 인슐린-유사 성장 인자(IGF)-I을 포함하는 제6 배지 중에서 상기 췌장 전구 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제6 배지가 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 세포가 상기 제6 배지 중에서 1 내지 9일 동안 배양되는, 방법.
  33. 제9항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 췌장 1차 조직으로부터 유래된 것인, 방법.
  34. 제9항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 인간 배아 줄기세포인, 방법.
  35. 제9항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 유도 만능 줄기세포인, 방법.
  36. 제9항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 줄기세포가 만능성이 아닌 재프로그래밍된 세포인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포가 췌장 1차 조직으로부터 유래된 것인, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포가, 상기 세포의 게놈 내에 재프로그래밍 유전자를 도입하지 않고 재프로그래밍 유전자를 발현시킴으로써 재프로그래밍되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 재프로그래밍 유전자가 적어도 하나의 에피솜 발현 플라스미드 상에서 인코딩되는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 재프로그래밍 유전자가 Oct4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 포함하는, 방법.
  41. 제9항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 30일 이하 동안 배양되는, 방법.
  42. 인슐린-분비 세포를 생성하는 방법으로서,
    a. 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는 제1 배지 중에서 인간 줄기세포를 배양하여, 상기 인간 줄기세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계로서, 상기 인간 줄기세포는 내배엽 세포로의 분화 전에 케라티노사이트 성장 인자(KGF)에 노출되지 않는 것인, 상기 분화시키는 단계; 및
    b. 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 제2 배지 중에서 상기 단계 a로부터의 내배엽 세포를 배양하여, 상기 내배엽 세포를 내분비 세포로 분화시키는 단계;
    c. KGF, 노긴, 및 EGF를 포함하는 제3 배지 중에서 상기 단계 b로부터의 내분비 세포를 배양하여, 상기 내분비 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계;
    d. 노긴, EGF, γ-세크레타아제 저해제 XXI, 및 Alk5i II를 포함하는 제4 배지 중에서 상기 단계 c로부터의 췌장 전구 세포를 배양하여, 상기 췌장 전구 세포를 인슐린-생성 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제2 배양 배지가 KGF를 더 포함하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 제3 배지 및 제4 배지가 레티노산 및 사이클로파민을 더 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d로부터의 인슐린 생성 세포가 Alk5I II 및 레티노산, 및 선택적으로 사이클로파민을 포함하는 제5 배지 중에서 추가로 배양되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, Alk5i II, 니코틴아민, IGF-I, 및 선택적으로 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 제6 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 배양 시간이 30일 미만인, 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 췌장 1차 조직으로부터 유래된 것인, 방법.
  49. 당뇨병을 치료하기 위한 세포-기반 조성물로서, 당뇨병의 치료를 필요로 하는 인간 대상체 내에 이식하기 위한 적합한 운반체(carrier) 및 대리 췌장 세포(surrogate pancreatic cell)의 집단을 포함하며, 상기 세포의 적어도 66%는 인슐린-생성 췌장 세포인, 세포-기반 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 대리 췌장 세포의 적어도 66%가 NeuroD1을 발현시키는, 세포-기반 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 대리 췌장 세포의 적어도 68%가 Nkx6.1을 발현시키는, 세포-기반 조성물.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린-생성 췌장 세포가,
    a. 내배엽-유도 인자를 포함하는 제1 배지 중에서 부착 기질 상에서 인간 줄기세포의 집단을 배양하는 단계로서, 상기 포유류 줄기세포는 Wnt3a에 노출되지 않는, 상기 배양하는 단계;
    b. 레티노산 및 사이클로파민을 포함하는 적어도 하나의 추가적인 배지 중에서 상기 세포를 추가로 배양하는 단계;
    c. 상기 세포가 3차원 세포 구조를 형성할 때 상기 세포를 현탁 배양물로 옮기는 단계
    를 포함하는 방법에 따라 유래된 것이고,
    상기 세포가 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되며,
    상기 세포가 적어도 20일 동안 레티노산 및 사이클로파민에 노출되는 것인, 세포-기반 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 내배엽-유도 인자가 액티빈-A 및 보르트만닌을 포함하는, 세포-기반 조성물.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 췌장 1차 조직으로부터 유래된 것인, 세포-기반 조성물.
  55. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 인간 배아 줄기세포인, 세포-기반 조성물.
  56. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 유도 만능 줄기세포인, 세포-기반 조성물.
  57. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 만능성이 아닌 재프로그래밍된 세포인, 세포-기반 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포가, 상기 세포의 게놈 내에 상기 재프로그래밍된 유전자를 도입하지 않고 재프그래밍 유전자를 발현시킴으로써 재프로그래밍된, 세포-기반 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 재프로그래밍 유전자가 적어도 하나의 에피솜 발현 플라스미드 상에서 인코딩되는, 세포-기반 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 재프로그래밍 유전자가 Oct4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 포함하는, 세포-기반 조성물.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 운반체가 매크로-캡슐을 포함하는, 세포-기반 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 매크로-캡슐이 알기네이트, 셀룰로스 설페이트, 글루코만난, 또는 이들의 조합물을 포함하는, 세포-기반 조성물.
  63. 내배엽 계통으로 우선적으로 분화하는 미분화 세포를 동정하는 방법으로서, 미분화 세포에서 BHMT2 및 NAP1L1의 발현을 평가하는 단계, 및 BHMT2 발현이 대조군 세포에 비해 하향-조절되고 NAP1L1 발현이 대조군 세포에 비해 상향-조절되는 경우 내배엽 계통으로 분화하는 것에 대한 선호도(preference)를 갖는 것으로서 상기 세포를 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 미분화 세포에서 Cox7A1 및 HSPB2의 상기 발현을 평가하는 단계, 및 Cox7A1 및 HSPB2 발현 둘 다가 대조군 세포에 비해 하향-조절되는 경우 내배엽 계통으로 분화하는 것에 대한 선호도를 갖는 것으로서 상기 세포를 동정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 대조군 세포가 상기 내배엽 계통에 대한 우선 분화(preferential differentiation) 또는 상기 중배엽 계통으로 분화하는 실질적인 무능력을 나타내지 않는 만능 세포(pluripotent cell)인, 방법.
  66. 제63항에 있어서, BHMT2 발현이 상기 대조군 세포에 비해 적어도 2 로그 하향-조절되며, NAP1L1 발현이 상기 대조군 세포에 비해 적어도 2 로그 상향-조절되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, Cox7A1 및 HSPB2 발현 둘 다가 상기 대조군 세포에 비해 적어도 2 로그 하향-조절되는, 방법.
  68. 제63항 또는 제64항에 있어서, GLIS2, CCDC58, MTX3 및 C7orf29의 발현을 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, GLIS2, CCDC58 및 MTX3 발현이 상기 대조군 세포에 비해 상향-조절되며, C7orf29 발현이 상기 대조군 세포에 비해 하향-조절되는, 방법.
  70. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 발현 수준이 Q-PCR에 의해 평가되는, 방법.
  71. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 발현 수준이 마이크로어레이 분석에 의해 평가되는, 방법.
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