KR20200111501A - 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법으로 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출할 경우 기존에 소장액으로부터의 추출에 국한되었던 헤파린 추출이 간, 폐, 심장, 위, 소장, 대장 등 다양한 부위에서도 가능함을 확인하였으며, 기존의 방법보다 추출 소요 시간을 1/4 이상 감소시키고, 저렴한 효소를 사용하여 유사한 양의 헤파린을 추출함으로써 경제적이면서도 효율적으로 헤파린을 추출할 수 있어 현재 판매되는 의료용 헤파린의 원가를 절감할 수 있는 효과를 가진다. 또한, 본 발명에 따른 헤파린 추출 방법은 탈지 및 탈수 과정에서 시약의 처리를 통해 내장 부산물의 부피를 줄이고 수분을 제거하여 보관 및 취급을 용이하게 하고, 사용 가능한 유통 기한을 증가시킬 수 있으며, 헤파린 추출 과정에서 조지방 및 단백질 등이 함께 추출됨으로써 헤파린 뿐만 아니라 다른 고부가가치 물질을 생산하여 더 많은 경제적 이익을 창출해 낼 수 있을 것으로 기대된다.

Description

돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법 {Method for extraction of heparin derived from by-product of pork}

본 발명은 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법에 관한 것이다.

헤파린은 복합탄수화물의 일종으로서 항응고제의 목적으로 널리 사용되고 있으며, 1916년 존스홉킨스 대학의 McLean이 심장에서 혈청의 응고 시간을 연장시키는 인자를 발견한 후 Howell과 Holt가 여러 조직에서 유사한 물질을 분리하여 인 성분을 제거할 수 있었고, 그 중간에서 분리한 물질이 제일 활성을 띄어 헤파린이라고 명명하게 되었다. 또한 1950년대에 안티트롬빈(antithrombin)의 활성이 헤파린에 의해 가속된다는 것을 확인하였다.

이러한 헤파린은 반복되는 이당류로 구성된 긴 분자가 없는 다당 체인으로서, α-1,4 결합으로 반복되는 이당류의 두 가지 잔기 중 하나는 항상 아미노당(N-acetylglucosamine)이며, 대부분 황산 구조를 가지고 있다. 두 번째 당은 보통 우론산(glucuronic of iduronic)이다. 헤파린은 glycosaminoglycan 계열에 속한 탄수화물이지만 생합성이 불완전하기 때문에 이당류의 단일성을 유지하기 쉽지 않다. 이러한 헤파린의 구조를 이해하기 까지는 30년 이상이 소요되었는데, 그 이유는 헤파린이 다른 다당류처럼 크기가 다른 다당류들이 섞여 있고, sulfate기의 치환 정도와 uronic산이 다르기 때문이다

헤파린은 혈액의 응고를 방지하는 가장 대표적인 항응고제(혈액 희석제)이며, 강한 음전하를 띄는 glycosaminoglycans (GAG) 계열의 polysaccharide로 세포 표면과 세포 외 기질에서 발견되는 산성 복합 다당체이다. 헤파린은 고등 동물의 폐, 간, 혈액 및 장 조직 등 각종 조직에 넓게 분포하며, 특히 비만 세포(mast cell)에 많이 존재한다. 헤파린은 항응고 활성(anticoagulant activity)뿐만 아니라, 항염증 작용 및 혈관 신생 억제 효과도 가지고 있으며, 큰 분자량 및 음성 전하 (negative charge)로 인하여 위장관 내(GI tract)에서 흡수되기 어려우며, 헤파린의 친수성에 따른 상피막 (epithelial membrane)의 극성 그룹의 반발 작용 및 낮은 투과율로 인하여 상피 세포 (epithelial cells)의 투과가 어렵다고 알려져 있다, 실험실이나 임상에서 사용되는 헤파린은 일반적으로 소의 심장이나 돼지의 소장 점막에서 추출하여 효소 및 화학적 처리를 거쳐 칼슘염 또는 나트륨염으로 만들어 사용하고 있다. 이와 같이 헤파린은 주로 소의 폐나 돼지의 장에서 추출하여 제조되고 있었지만, 광우병 파동 이후 의약품으로서 헤파린의 기원은 대부분이 돼지 소장 점막에서 유래하고 있다. 통상 헤파린의 제조 방법은 수용액에 돼지 소장 점막을 현탁시켜 단백질의 소화 과정을 거친 뒤, 흡착제 등을 첨가하여 헤파린과 다른 mucopolysaccharide(주로 콘드로이친황산 패밀리, 헤파란 황산)를 복합체로서 추출하여 조원료 사용하고 있다.

한편, 현재 한국 축산업은 사료 곡물 가격의 인상, 경기 불황, 수입 축산물, 한국 돼지 사육 두수의 과잉으로 인한 가격 폭락, 구제역과 같은 가축 질병, 선호 부위와 비선호 부위 간의 심각한 가격 편차, 비선호 부위의 재고 축적 등으로 인한 어려움에 처해있으며, 이러한 부산물의 경우 주산물에 비하여 수요가 더 적기 때문에 소비를 통한 이익보다 폐기를 진행하는데 드는 비용이 더 발생하고 있다.

우리나라의 양돈 사육 동향을 살펴보면 국민 소득이 증가함에 따라 육류 소비량 또한 함께 증가하면서, 2014년 1,000만두를 돌파한 이후 지속적으로 증가하는 모습을 보이고 있다. 사육 농가 수의 경우, 사육이 전문적인 성향을 띰에 따라 전체 농가 수는 감소하여 2017년에는 4천 4백 호의 양돈 농가가 운영되었다. 이렇게 양돈업의 규모가 점점 증가하면서 국내 연간 돼지 도축 두수 또한 증가하여 2017년에는 약 1,600만두 수의 돼지가 도축되고 있다. 이는 폐기되는 부산물의 양 또한 꾸준히 증가하고 있다는 뜻으로, 폐기 및 재고 보관에 의한 축산농가의 부담을 줄이기 위해서는 이를 해결하기 위한 대안이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 잉여 및 폐기되고 있는 돼지 내장 부산물을 이용하여, 기존에 사용한 돼지의 소장액뿐만 아니라 간, 폐, 심장, 위, 소장, 대장 등의 부위로부터 헤파린을 추출하는 방법을 발명하여 도축 부산물 시장을 활성화 시키고, 기존 방법에 비해 추출 공정을 단순화하고 비용을 절감하여 수입에 의존하고 있는 국내 헤파린의 공급을 대체할 수 있는 방안을 마련하고자 하였다.

한국등록특허 제1313894호

본 발명자들은 현재 수요가 적어 폐기되고 있는 많은 양의 돈육 부산물의 가치를 제고하고, 축산농가의 소득 증가 및 폐기 비용 부담을 절감하여 국가 경제에 이바지할 수 있는 생산 공정을 구축할 수 있는 방법으로서, 돈육 부산물로부터 저비용의 효소를 이용하여 헤파린을 추출하는 방법에 대해 개발하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 (a) 돈육 부산물을 세척하여 자가분해 시키는 단계;

(b) 자가분해된 돈육 부산물을 탈지 처리하여 조지방을 제거하고 탈수 처리하여 돈육 부산물 분말을 획득하는 단계;

(c) 돈육 부산물 분말에 포화 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 수산화나트륨(NaOH) 용액을 첨가하여 추출하는 단계;

(d) 추출한 용액에 황산을 넣어 황산암모늄 침전물을 제거하는 단계;

(e) 황산암모늄 침전물을 제거한 용액에 알코올을 넣어 침전되는 침전물을 수득하는 단계;

(f) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (e) 단계에서 수득한 침전물의 단백질을 분해하고 제거하는 단계; 및

(g) 상기 단백질이 제거된 용액에 알코올을 첨가하여 침전되는 침전물을 세척하고 건조하여 헤파린을 수득하는 단계를 포함하는, 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돈육 부산물을 세척하여 자가분해 시키는 단계;

(b) 자가분해된 돈육 부산물을 탈지 처리하여 조지방을 제거하고 탈수 처리하여 돈육 부산물 분말을 획득하는 단계;

(c) 돈육 부산물 분말에 포화 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 수산화나트륨(NaOH) 용액을 첨가하여 추출하는 단계;

(d) 추출한 용액에 황산을 넣어 황산암모늄 침전물을 제거하는 단계;

(e) 황산암모늄 침전물을 제거한 용액에 알코올을 넣어 침전되는 침전물을 수득하는 단계;

(f) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (e) 단계에서 수득한 침전물의 단백질을 분해하고 제거하는 단계; 및

(g) 상기 단백질이 제거된 용액에 알코올을 첨가하여 침전되는 침전물을 세척하고 건조하여 헤파린을 수득하는 단계를 포함하는, 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 돈육 부산물은 돼지의 간, 폐, 심장, 위, 소장, 및 대장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계에서 자가분해는 20℃ 내지 30℃에서 20 내지 30시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계에서 탈지는 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)을 2:1(v/v)로 혼합한 용액을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 추출은 50℃ 내지 70℃에서 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (f) 단계에서 효소는 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 첨가하여 pH 9 내지 11 조건에서 12 내지 16시간 동안 50℃ 내지 60℃에서 반응시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출할 경우 기존에 소장액으로부터의 추출에 국한되었던 헤파린 추출이 간, 폐, 심장, 위, 소장, 대장 등 다양한 부위에서도 가능함을 확인하였으며, 기존의 방법보다 추출 소요 시간을 1/4 이상 감소시키고, 저렴한 효소를 사용하여 유사한 양의 헤파린을 추출함으로써 경제적이면서도 효율적으로 헤파린을 추출할 수 있어 현재 판매되는 의료용 헤파린의 원가를 절감할 수 있는 효과를 가진다. 또한, 본 발명에 따른 헤파린 추출 방법은 탈지 및 탈수 과정에서 시약의 처리를 통해 내장 부산물의 부피를 줄이고 수분을 제거하여 보관 및 취급을 용이하게 하고, 사용 가능한 유통 기한을 증가시킬 수 있으며, 헤파린 추출 과정에서 조지방 및 단백질 등이 함께 추출됨으로써 헤파린 뿐만 아니라 다른 고부가가치 물질을 생산하여 더 많은 경제적 이익을 창출해 낼 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 과정을 간략하게 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물의 전처리 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물의 탈지 및 탈수 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물의 탈지 및 탈수 과정을 통해 획득한 건물량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 방법을 통해 추출된 부위별 헤파린 추출량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 방법에서 단백질 추출 온도에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 방법에서 단백질 분해 효소량에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6d는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 방법에서 단백질 분해 효소 작용시 pH에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6e는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 방법에서 단백질 분해 효소 반응 시간에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6f는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물 유래 헤파린 추출 방법에서 단백질 분해 효소 반응 온도에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물로부터 추출한 헤파린을 HPLC를 통해 분석한 결과를 나타낸 것으로, 도 7a는 표준 헤파린의 표준 검량선을 나타낸 도면이고, 도 7b는 부위별로 헤파린 1g당 순수한 헤파린의 양을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a 및 8b는 본 발명의 일구현예에 따른 돈육 부산물로부터 추출한 헤파린을 COATEST^® heparin을 통해 분석한 결과를 나타낸 것으로, 도 8a는 포준 헤파린의 표준 검량선을 나타낸 도면이고, 도 8b는 부위별로 헤파린 1mg당 헤파린 unit의 양을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 (a) 돈육 부산물을 세척하여 자가분해 시키는 단계;

(b) 자가분해된 돈육 부산물을 탈지 처리하여 조지방을 제거하고 탈수 처리하여 돈육 부산물 분말을 획득하는 단계;

(c) 돈육 부산물 분말에 포화 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 수산화나트륨(NaOH) 용액을 첨가하여 추출하는 단계;

(d) 추출한 용액에 황산을 넣어 황산암모늄 침전물을 제거하는 단계;

(e) 황산암모늄 침전물을 제거한 용액에 알코올을 넣어 침전되는 침전물을 수득하는 단계;

(f) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (e) 단계에서 수득한 침전물의 단백질을 분해하고 제거하는 단계; 및

(g) 상기 단백질이 제거된 용액에 알코올을 첨가하여 침전되는 침전물을 세척하고 건조하여 헤파린을 수득하는 단계를 포함하는, 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 돈육 부산물은 돼지의 간, 폐, 심장, 위, 소장, 및 대장으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "헤파린(heparin)"이란 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)의 일종으로 주로 황산기 및 아세트산기로 이루어진 이당류가 선형적으로 반복되어 이루어져 음의 전하를 띠는 고분자를 말한다. 이 고분자는 혈장중의 안티트롬빈 III(antithrombin III)와 결합해서 트롬빈(thrombin)을 불활성화 함으로서 혈액응고 저지작용을 가진다.

본 발명에 있어서, "자가분해"란 외부로부터 물질의 첨가 없이 자발적으로 일어나는 가수분해를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서는 20℃ 내지 30℃에서 20 내지 30시간 동안 자가분해를 수행하여 헤파린 추출의 효율성을 높일 수 있으나, 상기 온도 및 시간 조건에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, "조지방"이란 에테르 추출물의 총칭으로 보통 속슬레 추출기를 사용해서 에테르로 지방을 추출하고 그 중량을 구해 정량한 것을 말한다. 조지방 중에는 지방 이외에 색소(클로로필, 카로티노이드 등), 왁스, 지질, 유기산 등이 포함되어 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 탈지는 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)을 2:1(v/v)로 혼합한 Folch Ⅰ 용액을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 Folch Ⅰ 용액을 넣고 섞은 다음 여과된 용액에 NaCl을 첨가하여 조지방을 추출할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 돈육 부산물을 전처리하고(실시예 1 참조), 탈지 및 탈수 과정을 통해 돈육 부산물 분말을 제조하여 획득한 건물량을 확인하였으며(실시예 2 참조), 돈육 부산물 분말로부터 헤파린을 추출하였다(실시예 3-1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출하는 방법에 있어서, 단백질 추출 온도에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과, 단백질 추출을 위한 적정 추출 온도는 50℃ 내지 70℃인 것으로 확인하였다(실시예 3-3 참조).

이에, 본 발명에 있어서 상기 (c) 단계에서의 추출은 50℃ 내지 70℃에서 수행할 때 헤파린 추출량이 높아 바람직할 수 있으나, 추출이 가능한 온도라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서는 황산을 첨가하여 남아있는 미량의 황산암모늄(ammonium sulfate)의 침전물을 생성하였으며, 이 과정에서 발생한 단백질은 고부가가치 물질 추출에 사용이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 및 (g) 단계에서의 알코올은 에틸알코올(ethyl alcohol)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출하는 방법에 있어서, 단백질 분해 효소 alkaline-AK^® 의 양에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과, 적은 양으로도 헤파린을 추출할 수 있는 0.01 내지 0.05%(w/w)를 적정 효소량으로 확인하였다(실시예 3-4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출하는 방법에 있어서, 단백질 분해 효소 작용시 pH에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과, 알칼리 조건에서 헤파린이 추출됨을 확인하여, 알칼리 조건 형성을 위해 첨가하는 NaOH의 양을 고려했을 때 pH 9 내지 11을 적정 pH로 확인하였다(실시예 3-5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출하는 방법에 있어서, 단백질 분해 효소 반응 시간에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과, 12-16시간일 때 가장 많은 양의 헤파린이 추출된 것을 확인하여, 12 내지 16시간을 적정 시간으로 확인하였다(실시예 3-6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출하는 방법에 있어서, 단백질 분해 효소 반응 온도에 따른 헤파린 추출량을 확인한 결과, 50 내지 70℃에서 가장 많은 양의 헤파린이 추출된 것을 확인하여, 적정 효소 반응 온도는 최소한의 가열을 통해 헤파린을 추출할 수 있는 50 내지 60℃인 것으로 확인하였다(실시예 3-7 참조).

이에, 본 발명에 있어서 상기 (f) 단계에서의 효소는 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 첨가하여 pH 9 내지 11 조건에서 12 내지 16시간 동안 50℃ 내지 60℃에서 반응시킬 때 헤파린 추출량이 높아 바람직할 수 있으나, 상기 효소의 반응이 가능한 조건이라면 이에 제한되지 않는다.

이 때, 상기 (f) 단계의 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소는 Alkaline-AK^®일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 돈육 내장 부산물의 부위별, 효소별 헤파린 추출량을 확인한 결과, 전체 돈육 내장 부산물에서 alkaline-AK^®를 사용하여 추출할 수 있는 헤파린 양이 trypsin을 사용하였을 때에 비해 다소 높은 것을 확인하였다(실시예 3-2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 돈육 부산물로부터 추출한 헤파린을 HPLC를 통해 분석하여 순수한 헤파린의 양을 확인한 결과, alkaline-AK^® 효소를 이용하여 헤파린을 추출할 경우 저렴한 비용으로 기존에 이용했던 trypsin 효소와 유사한 양의 헤파린을 추출할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 돈육 부산물로부터 추출한 헤파린을 COATEST^® heparin을 통해 분석한 결과, trypsin보다 alkaline-AK^®로 추출한 헤파린에 더 많은 양의 unit이 포함되어 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).

상기와 같이, 본 발명에 따른 돈육 부산물로부터 헤파린을 추출하는 방법에 있어서, 단백질 분해 효소로 alkaline-AK^®를 사용할 경우 기존에 사용하던 trypsin을 사용하는 경우에 비해 효율적이고 경제적으로 헤파린을 추출할 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돈육 부산물 전처리

헤파린 추출을 위한 돈육 부산물의 전처리 단계로서, 당일 아침 도축한 돼지의 간, 폐, 심장, 위, 소장 및 대장 샘플은 아이스 박스에 낮은 온도를 유지한 채로 운반되었으며, 이를 깨끗한 실험실에 옮긴 후 불순물을 제거하기 위한 세척을 진행하였다. 세척을 진행하기 전 폐와 연결된 기관지, 그 위에 연결된 식도 등을 제거하였다. 간, 폐 및 심장은 표면에 묻은 이물질을 수돗물을 이용하여 세척하였고, 위, 소장 및 대장의 경우 표면뿐만 아니라 내장 내부에 물을 흘려 넣어 배출되지 않은 소화물들을 세척하였다. 세척이 완료된 내장은 물기를 제거하고, chopper를 이용하여 분쇄한 뒤 적정량으로 소분하여 -4℃에서 냉동 보관하였다. 상기 과정은 도 2에 순서대로 나타내었다.

실시예 2. 돈육 부산물의 탈지, 탈수 및 이를 통해 획득한 건물량 확인

2-1. 돈육 부산물의 탈지 및 탈수

상기 실시예 1에서 세척과 소분을 마치고 냉동 보관한 돈육 내장 부산물 1 kg을 해동한 뒤 25℃에서 24시간 자가분해 시켰다. 그런 다음 자가분해한 돈육 부산물 샘플의 5배에 해당하는 Folch Ⅰ 용액(Cloroform:methanol = 2:1(v/v))을 넣고 호모게나이저(SciLab-brand®, SHG-15D-Set, Korea)를 이용하여 균질화 하였다. 이 후 3시간 동안 냉장 보관하며 30분에 한번씩 저어주어 용액과 내장 조직을 분리해 주었으며, 거즈를 이용하여 건더기를 여과하였다. 이 때 여과된 용액에 0.85% NaCl 용액을 첨가하고 하룻밤 동안 방치시켜 층 분리를 발생시켰으며, 지방이 침전된 하층의 chloroform 층을 모아 건조시켜 조지방을 획득할 수 있었다. 상기와 같이 조지방을 제거한 내장 부산물 건더기에 다시 500 mL acetone을 넣어 지방을 한 번 세척한 뒤 다시 건더기만을 여과하여 낮은 온도에서 완전히 건조한 후 분쇄하고 냉동 보관하였다.

이러한 방법은 batch processing을 통해 한 가지 샘플에서 다양한 성분을 동시에 추출할 수 있는 방법 중 하나로 판단되고 있다. 상기와 같이 헤파린을 추출하는 과정 속에서 조지방과 단백질을 획득함으로써 돈육 부산물에 존재하는 다른 고부가가치 물질을 추출할 수 있었다. 상기 돈육 부산물의 탈지 및 탈수 과정은 도 3에 순서대로 나타내었다.

2-2. 돈육 부산물의 건물 획득량 확인

상기 실시예 2-1의 방법으로 탈지 및 탈수 과정을 거친 돈육 부산물의 건물 획득량은 내장별로 큰 차이를 나타내었다. 구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이 간, 폐 및 심장과 같은 적내장의 경우 평균 약 19.5%의 탈지 건물을, 상대적으로 수분을 많이 함유한 위, 소장 및 대장과 같은 백내장의 경우 10.7%의 탈지 건물을 획득할 수 있었다. 이를 기준으로 한 평균 출하 체중의 돼지에서 발생하는 부산물의 양에 따른 탈지 건물량은 간 420g, 허파 162g, 심장 83g, 위 105g, 소장 161g, 및 대장 40g으로 계산할 수 있었다. 이는 도축 후 발생하는 여섯 가지 부위의 돼지 내장 부산물 총량인 6 kg의 약 16%를 차지하며 (Hansard et. al., 1951), 이렇게 만들어진 탈지 건물은 내장 부산물의 지방과 수분을 제거함으로써 부패를 지연시켜 부산물의 저장 기간을 연장시키고, 샘플의 부피를 감소시킴으로써 보관 장소를 줄여 보관에 필요한 비용을 감소시킬 수 있는 이점을 가질 수 있다.

실시예 3. 돈육 부산물 분말로부터 헤파린 추출 및 헤파린 추출량 확인

3-1. 돈육 부산물 분말로부터 헤파린 추출

상기 실시예 2-1의 방법으로 탈지 및 탈수 과정을 거친 돈육 부산물 분말로부터 헤파린을 추출하기 위한 방법은 상기 돈육 부산물 분말의 양을 기준으로 진행되었다.

1) 헤파린 추출 단계: 상기 돈육 부산물 분말 100 g에 1,460 mL 0.5 N NaOH, 174 mL 포화 ammonium sulfate 용액을 넣고, 60℃ water bath에서 30분 동안 추출한 다음, 거즈를 이용하여 큰 건더기를 걸러준 뒤 용액을 모아주었다.

2) 중화 단계: 상기 용액에 7 N Sulfuric acid를 첨가하여 용액 pH 2가 될 때까지 적정하고 남아있는 미량의 황산암모늄(ammonium sulfate)의 침전물을 생성하였으며, 이렇게 발생한 단백질은 고부가가치 물질 추출에 사용이 가능하다. 상기 침전물을 제거하고 용액만을 모아준 뒤, 원심분리기(Hanil Scientific In.c, Combi 514R, Korea)를 3500 rpm 조건에서 30분간 처리하여 생성된 침전물을 제거하였다.

3) 헤파린과 단백질 복합체 침전 단계: 그리고 나서 남은 상층액에 200 mL 95% ethyl alcohol을 넣어 실온에서 20시간 동안 추출하였다. 이를 다시 원심분리기를 이용해 3,500 rpm 조건에서 20분간 처리하여 상층액을 제거하였다.

4) 단백질 제거 단계: 상기 상층액을 제거하고 남은 침전물에 150 mL alkaline water (pH 10)를 넣었다. 여기에 돈육 부산물 분말 샘플의 0.05%(w/w)만큼 alkaline-AK^® (AK)와 300㎕ xylene을 첨가한 뒤, 12시간 동안 60℃ water bath에서 반응시켰다(AK 대신 trypsin의 경우, 돈육 부산물 분말 샘플의 0.025%(w/w)만큼의 효소를 37℃ 조건에서 진행).

5) 헤파린 침전 단계: 상기 과정을 거쳐 단백질 분해가 진행된 용액에 다시100 mL 95% ethyl alcohol과 10 mL 0.01M HCl을 넣고 20시간 방치하였다. 이때 생성된 침전물은 원심분리기를 3,500 rpm 조건에서 30분간 처리하여 수집하였다.

6) 헤파린 세척: 상기 수집한 침전물을 50 mL alkaline water (pH 10)에 용해시켰다. 여기에 추가로 50 mL acetone 및 10 mL 0.01M HCl을 넣어 충분히 교반하고 원심분리기를 3,500 rpm 조건에서 30분간 처리하여 상층액을 제거하였다. 그 다음, 다시 침전물에 50 mL 95% ethyl alcohol를 넣고 충분히 교반하여 세척을 진행한 뒤, 침전물을 동결 건조하여 헤파린을 획득하였다.

상기와 같은 헤파린 추출 과정은 도 5에 순서대로 나타내었다.

3-2. 돈육 부산물 부위별, 효소별 헤파린 추출량 확인

돈육 부산물의 부위별 헤파린 추출율은 탈지 건물을 제조하기 전 내장 부산물의 무게를 기준으로 작성되었으며, 부산물의 부위별 헤파린 추출율을 확인한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 헤파린은 간과 심장에서 가장 높은 비율로 추출되었으며, 폐에서 상대적으로 낮은 비율로 추출되었다.

또한, 부산물의 부위에 따라 효소별 추출량의 차이를 통계 분석을 통해 확인한 결과, 하기 표 1(돈육 부산물 1kg 당 헤파린 추출량)에 나타낸 바와 같이 모든 부위에서 효소에 따른 돈육 부산물 1kg당 헤파린 추출량의 유의적 차이는 없는 것으로 확인되었다.

Organ	Heparin extracted, mg
	Trypsin	Alkaline-AK®
Liver	453 ± 102	473 ± 22
Lung	118 ± 11	132 ± 13
Heart	344 ± 115	491 ± 26
Stomach	308 ± 86	281 ± 79
Small intestine	195 ± 64	224 ± 58
Large intestine	194 ± 44	256 ± 34

상기와 같은 결과를 토대로 돈육 부산물 1kg 당 헤파린의 추출량을 나타냈을 때, 가장 많은 양의 헤파린을 추출하였던 간과 심장의 경우 각각 약 463 mg, 418 mg의 헤파린을 추출할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 이러한 표 1의 결과를 기준으로, 전체 돈육 부산물에서 각각의 효소를 이용하여 추출할 수 있는 헤파린의 양을 계산해 보면 trypsin의 경우 약 1,718mg, alkaline-AK^®의 경우 약 1,905mg인 것으로 확인되었다(Hansard et. al., 1951).

따라서, alkaline-AK^® 효소를 사용하였을 때 헤파린 추출량이 더 높은 것을 확인하였다.

3-3. 단백질 추출 온도에 따른 헤파린 추출량 확인

상기 실시예 3-1의 방법으로 헤파린을 추출하는 과정 중 1) 헤파린 추출 단계의 단백질 제거 단계에서, 단백질 추출 온도에 변화를 주어, 단백질 추출 온도에 따른 돈육 간 건물 20g당 헤파린의 추출량(mg)을 확인하였다.

그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 40℃에서 추출한 헤파린의 경우 추출이 제대로 이루어지지 않아 단백질과 함께 헤파린이 다량 제거되었으며, 최대로 온도를 증가시킨 70℃에서는 50℃로 추출한 헤파린과 유사한 양의 헤파린이 추출되는 것을 확인한 바, 단백질 추출을 위한 적정 추출 온도는 50 내지 70℃인 것으로 확인되었다.

3-4. 단백질 분해 효소량에 따른 헤파린 추출량 확인

상기 실시예 3-1의 방법으로 헤파린을 추출하는 과정 중 4) 단백질을 제거하는 단계에서 추가하는 효소의 양에 변화를 주어, 효소량에 따른 돈육 간 건물 20g당 헤파린의 추출량(mg)을 확인하였다.

그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이 건물 대비 0.01% 내지 0.1%(w/w)의 효소를 첨가한 처리구들에서 비슷한 양으로 헤파린이 추출되는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 적은 양으로도 헤파린을 추출할 수 있는 0.01 내지 0.05%(w/w)를 적정 효소량으로 확인하였다.

3-5. 단백질 분해 효소 작용시 pH에 따른 헤파린 추출량 확인

상기 실시예 3-1의 방법으로 헤파린을 추출하는 과정 중 4) 단백질을 제거하는 단계에서 추가하는 효소를 작용시키기 위한 pH 조건에 변화를 주어, pH에 따른 돈육 간 건물 20g당 헤파린의 추출량(mg)을 확인하였다.

그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이 산성(pH 4), 중성(pH 7) 조건에서는 단백질 분해가 거의 이루어지지 않았으며, 알칼리 조건(pH 10, pH 13)에서 단백질 분해가 진행되었음을 확인하였다. 이에, 알칼리 조건 형성을 위하여 첨가하는 NaOH의 양을 고려하여, pH 9 내지 11을 적정 pH로 확인하였다.

3-6. 단백질 분해 효소 반응 시간에 따른 헤파린 추출량 확인

상기 실시예 3-1의 방법으로 헤파린을 추출하는 과정 중 4) 단백질을 제거하는 단계에서 추가하는 효소의 반응 시간에 변화를 주어, 효소 반응 시간에 따른 돈육 간 건물 20g당 헤파린의 추출량(mg)을 확인하였다.

그 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이 효소를 8시간 반응시킬 경우 단백질의 분해가 거의 일어나지 않았으며, 12-16시간일 때 가장 많은 양의 헤파린이 추출된 것을 확인하여, 적정 효소 반응 시간은 12-16시간인 것으로 확인하였다.

3-7. 단백질 분해 효소 반응 온도에 따른 헤파린 추출량 확인

상기 실시예 3-1의 방법으로 헤파린을 추출하는 과정 중 4) 단백질을 제거하는 단계에서 추가하는 효소의 반응 온도에 변화를 주어, 효소 반응 온도에 따른 돈육 간 건물 20g당 헤파린의 추출량(mg)을 확인하였다.

그 결과, 도 6f에 나타낸 바와 같이 37℃에서 효소 반응시 단백질의 분해가 거의 일어나지 않았으며, 50 내지 70℃에서 가장 많은 양의 헤파린이 추출된 것을 확인하였고, 최소한의 가열을 통해 헤파린을 추출하기 위하여 적정 반응 온도를 50-60℃로 설정하였다.

실시예 4. High performance liquid chromatography ( HPLC )를 통한 헤파린 분석

Quantification of antibiotics by high-performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 위한 헤파린 표준 시약으로 Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa (192 USP unit/mg, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였으며, 추출한 헤파린을 확인하기 위해서 Arumugam & Shanmugam (2004)의 방법을 참고하였다. HPLC 분석 조건은 하기 표 2에 나타내었으며, 분석에는 HPLC (HP Agilent 1100, Hewlett Packard Co., CA, USA) 기기를 이용하였고 fortis H₂O column (250 × 4.6 mm, 3-μm internal diameter)을 사용하였다. 또한, HPLC 등급의 D.W.를 용매로 사용하고, 유속 1.2 mL/min, 주입량 20 ul의 조건에서 분석한 뒤 210 nm의 파장에서 측정하였다.

Parameter	Condition
HPLC model	HP Agilent 1100, Hewlett Packard Co., CA, USA
Column	Fortis H2O C18 (150*4.6 mm id, 5 μm)
Mobile phase	D.W.
Injection volume	20 μL
Flow rate	1 mL/min
Column temperature	30℃
Detector	UV 210 nm

분석을 위한 모든 샘플은 MCE 0.45 μm syringe filter (Hyndai micro, Korea)를 이용하여 여과한 뒤, HPLC column에 적용하였다. 표준 물질 용액은 D.W.에 녹여 0.625-10 mg/mL로 농도별 표준 용액을 제조하였으며, 이에 따른 peak의 area 값을 기준으로 하여 표준 곡선을 작성하였다. 상기 실시예 3-1에서 추출한 헤파린의 경우, 2 mg/mL의 농도로 HPLC 분석을 진행하였으며, 분석 결과 값을 표준 곡선에 대입하여 헤파린 함유량을 계산하였다.

상기 방법을 통해 standard calibration curve를 작성한 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같았으며, 상관계수 R²이 0.9982로 높은 정확도를 확인할 수 있었고, 헤파린의 HPLC 분석 결과, 표준 헤파린은 평균 1.41분에 확인되었다.

또한, 상기 데이터를 바탕으로 상기 실시예 3-1에서 추출한 헤파린의 HPLC 분석을 진행한 결과, 추출된 헤파린의 분석 결과도 모두 동일한 시간대에 확인할 수 있었으며, 이 값을 수식에 대입한 결과 추출한 헤파린 내에 들어있는 순수한 헤파린의 비율을 계산할 수 있었다. 순수한 헤파린의 비율을 확인한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 추출한 헤파린 1g 속에 가장 많은 양의 순수한 헤파린이 들어있는 부위는 소장으로 확인되었으며, 심장과 위에서 비교적 적은 양의 순수한 헤파린이 확인되었다. 이는 소장에서는 고순도의 헤파린이, 심장과 위에서는 상대적으로 저순도의 헤파린이 추출되었음을 나타내었다.

또한, 통계 분석을 통해 부산물 각각의 부위에서 효소별 순수한 헤파린의 양이 유의적인 차이를 보였는지 확인하였다. 그 결과, 간에서는 AK(alkaline-AK^®) < Tr(trypsin), 폐에서는 AK < Tr, 심장에서는 AK < Tr, 소장에서는 AK < Tr, 대장에서는 Tr < AK 순으로 고순도의 헤파린을 얻을 수 있었음이 확인되었으며, 상기 경우에는 모든 효소에서 비슷한 순도의 헤파린을 얻을 수 있었다.

따라서, 평균적인 효소별 헤파린의 추출량을 확인하였을 때, trypsin을 이용하였을 때가 alkaline-AK^®을 이용하여 추출할 때에 비해 비슷하거나 다소 많은 양의 헤파린이 추출된 것을 확인할 수 있었으나, alkaline-AK^® 효소가 trypsin에 비해 약 130만배 비용이 저렴한 것을 고려했을 때, alkaline-AK^® 효소를 이용하여 헤파린을 추출할 경우 추출 비용은 약 2.5배 감소시키면서 기존에 이용했던 trypsin 효소와 유사한 양의 헤파린을 추출할 수 있을 것으로 확인되었다.

실시예 5. COATEST ^® heparin을 이용한 헤파린 분석

헤파린 unit분석을 위한 헤파린 표준 시약으로 Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa (192 USP unit/mg, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였으며, COATEST^® Heparin (Chromogenix, USA) 제품을 통해 정량 분석을 진행하였다.

제조한 표준 헤파린과 상기 실시예 3-1에서 추출한 헤파린에 buffer, antithrombin, plasma를 첨가하여 적절한 농도로 다시 한번 희석하였다. COATEST^® Heparin 분석 조건은 하기 표 3에 나타내었으며, 희석된 검액을 37℃에서 4분간 가온하고, 미리 실온상태로 보관한 factor Xa를 첨가한 뒤, 다시 37℃에서 30초간 가온하였다. 이 용액에 미리 37℃에서 가온한 S-2222 시약을 첨가한 뒤, 다시 37℃에서 3분간 가온하고 반응 정지를 위해 20% acetic acid를 첨가하였다. 이렇게 제조한 검액의 색은 약 4시간 동안 안정하며, 이를 96 cell culture plate (SPL, Korea)에 100 ul씩 분주하여 405 nm의 파장에서 microplate reader (=ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay) (Molecular Device, Spectramax190, USA)를 이용하여 측정하였다.

표준 물질은 D.W.에 녹여 0.2 IU/mL (1 μg/9.6 mL)의 농도로 제조하였으며, 이에 따른 흡광도 측정값을 기준으로 하여 표준 곡선을 작성하였다. 상기 실시예 3-1에서 추출한 헤파린은 0.2 μg/mL의 농도로 분석을 진행하였으며, 분석 결과 값을 표준 곡선에 대입하여 헤파린 함유량을 계산하였다.

본 실시예에서는 분석법을 검증하기 위해서 표준 헤파린을 0.2-0.08 unit/mL의 농도로 제조하여 사용하였으며, 상기 방법을 통해 standard calibration curve를 작성한 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같았으며, 상관계수 R²이 0.9567로 높은 정확도를 확인할 수 있었다.

또한, 상기 결과를 토대로 측정된 상기 실시예 3-1에서 추출한 헤파린의 흡광도 값을 대입하여, 추출된 헤파린에 함유된 unit의 양을 확인하였다. 그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 추출된 헤파린의 mg 당 함유한 헤파린 unit의 양은 부산물의 거의 모든 부위에서 비슷하게 나타났으나, 심장에서 추출한 헤파린의 경우 가장 많은 양의 unit을 함유하는 것으로 확인되었다.

또한, 통계 분석을 통해 부산물 각각의 부위에서 효소별 unit의 양이 유의적인 차이를 보였는지 확인하였다. 그 결과, 간에서는 trypsin보다 alkaline-AK^®로 추출한 헤파린이 더 많은 양의 unit을 가진 것으로 나타났으며, 다른 부위에서도 효소별 unit의 양에 차이가 있었다. 내장 부산물 총량에서 효소별 unit 양의 평균을 확인하였을 때, trypsin보다 alkaline-AK^®로 추출한 헤파린에 더 많은 양의 unit이 포함되어 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (6)

1. (a) 돈육 부산물을 세척하여 자가분해 시키는 단계;
   (b) 자가분해된 돈육 부산물을 탈지 처리하여 조지방을 제거하고 탈수 처리하여 돈육 부산물 분말을 획득하는 단계;
   (c) 돈육 부산물 분말에 포화 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 수산화나트륨(NaOH) 용액을 첨가하여 추출하는 단계;
   (d) 추출한 용액에 황산을 넣어 황산암모늄 침전물을 제거하는 단계;
   (e) 황산암모늄 침전물을 제거한 용액에 알코올을 넣어 침전되는 침전물을 수득하는 단계;
   (f) 바실러스 메틸로트로피쿠스(bacillus methylotrophicus)를 접종하여 발효시킨 대두박에서 추출한 효소를 이용하여 상기 (e) 단계에서 수득한 침전물의 단백질을 분해하고 제거하는 단계; 및
   (g) 상기 단백질이 제거된 용액에 알코올을 첨가하여 침전되는 침전물을 세척하고 건조하여 헤파린을 수득하는 단계를 포함하는, 돈육 부산물 유래 헤파린의 추출 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 돈육 부산물은 돼지의 간, 폐, 심장, 위, 소장, 및 대장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계에서 자가분해는 20℃ 내지 30℃에서 20 내지 30시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 탈지는 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)을 2:1(v/v)로 혼합한 용액을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계에서 추출은 50℃ 내지 70℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 (f) 단계에서 효소는 0.01%(w/w) 내지 0.05%(w/w) 첨가하여 pH 9 내지 11 조건에서 12 내지 16시간 동안 50℃ 내지 60℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는, 방법.

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