KR20200110767A

KR20200110767A - 빅테그라비르의 대사물

Info

Publication number: KR20200110767A
Application number: KR1020207023543A
Authority: KR
Inventors: 하오룬 진; 현-정 편; 빌 제이. 스미스; 라주 수브라마니안; 지안홍 왕
Original assignee: 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-09-25
Also published as: AU2019209594B2; JP7068474B2; CA3087359A1; JP2021511313A; CN111615391A; WO2019144015A1; US20190224206A1; EP3740209A1; AU2019209594A1; KR102497051B1; US20220249499A1; US11253524B2; CA3087359C; CN111615391B

Abstract

본 발명은 HIV의 예방 및/또는 치료 뿐만 아니라 빅테그라비르의 투여와 관련된 분석 방법에 유용한, 조성물 및 그의 염을 포함한, 항바이러스 약물 빅테그라비르의 대사물을 제공한다.

Description

빅테그라비르의 대사물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 특허 출원은 2018년 1월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/619,478의 우선권의 이익을 청구한다. 이 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

HIV/AIDS 범유행은 수백만 명의 목숨을 앗아갔고, 현재 수백만 명 이상이 감염되었다. 항레트로바이러스 요법에 의해 HIV 감염이 만성적인, 관리가능한 질환으로 바뀌었지만; 그러나, HIV에 대한 치유법이 아직은 없다. 환자는 그의 일생 동안 계속해서 요법을 받아야 하므로, 약물 내성이 해결해야 할 문제로 대두되었다. 추가적으로, 환자가 나이가 들수록, 다른 질환 및 병태에 대한 병용 치료가 보다 더 일반적이 되어서, HIV 항바이러스 치료와의 약물-약물 상호작용의 가능성이 증가한다. 따라서, 신규 항바이러스 약물 및 조합 요법의 지속적인 개발이 HIV 치료제 분야에서 우선순위에 있다.

인테그라제 가닥 전달 억제제 (INSTI)는 필수 HIV 단백질 인테그라제가 바이러스 DNA 게놈을 숙주 세포의 염색질로 삽입하는 것을 억제함으로써 작용하는 항레트로바이러스 약물 클래스이다. INSTI의 예로는, 엠트리시타빈 (FTC) 및 테노포비르 알라페나미드 (TAF)와 조합되어 인간 임상 시험에서 현재 시험 중인 빅테그라비르 (BIC)가 있다. 빅테그라비르는 하기 나타낸 분자 구조를 가지며, WO 2014/100212에 기재되어 있다.

만연한 HIV 감염과 약물 내성 및 약물-약물 상호작용을 극복함에 있어서의 난제를 고려하면, 신규 개선된 항바이러스제에 대한 요구가 계속 존재한다. 본원에 기재된 빅테그라비르의 대사물, 뿐만 아니라 그의 조성물 및 사용 방법은 이러한 요구를 만족시키는데 맞추어져 있다.

본 발명은 실질적으로 단리된, 하기로부터 선택된 화합물:

또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제제를 추가로 제공한다.

본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 인간에게 투여함으로써 인간에서 HIV 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 확인하는 것을 포함하는, 환자에 대한 빅테그라비르의 투여를 검출 또는 확증하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 본 발명의 화합물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 빅테그라비르의 대사 속도를 측정하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 본 발명의 화합물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, HIV 감염의 치료에서의 빅테그라비르에 대한 환자의 예방적 또는 치료적 반응을 결정하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 본 발명의 화합물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, 빅테그라비르를 사용한 치료를 필요로 하는 환자에 대한 빅테그라비르의 용량을 최적화하는 방법을 추가로 제공한다.

도 1은 건강한 남성 성인 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 100 μCi/100 mg 경구 용량 이후 인간 혈장, 소변 및 분변에서의 빅테그라비르의 대사물의 제시된 구조 및 생체변환 경로를 나타낸다.
도 2는 표준 용액 M15의 분석으로부터의 M15의 추출 이온 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 남성 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량 (100 mg, 100 μCi) 후에 수득된 8-시간 풀링된 혈장 샘플의 분석으로부터의 대사물 M15의 라디오크로마토그램 및 추출 이온 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 M15의 표준 용액의 개별 주입 및 남성 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량 (100 mg, 100 μCi) 후에 수득된 8-시간 풀링된 혈장 샘플과의 공동-주입으로부터의 추출 이온 크로마토그램을 나타낸다.
도 5a는 M15의 표준 용액의 분석으로부터의 M15의 MS 선구 및 MS/MS 생성 이온 질량 스펙트럼 (m/z 626)을 나타낸다.
도 5b는 M15의 제시된 구조 및 제시된 조각화 패턴을 나타낸다.
도 6은 남성 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량 (100 mg, 100 μCi) 후에 수득된 8-시간 풀링된 혈장 샘플의 분석으로부터의 대사물 M15의 MS 선구 및 MS/MS 생성 이온 질량 스펙트럼 (m/z 626)을 나타낸다.
도 7은 M20의 표준 용액의 분석으로부터의 추출 이온 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 남성 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량 (100 mg, 100 μCi) 투여 후에 수득된 8-시간 풀링된 혈장 샘플의 분석으로부터의 추출 이온 크로마토그램 및 라디오크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 M20의 표준 용액의 개별 주입 및 남성 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량 (100 mg, 100 μCi) 투여 후에 수득된 8-시간 풀링된 혈장 샘플과의 공동-주입으로부터의 추출 이온 크로마토그램을 나타낸다.
도 10a는 M20의 표준 용액의 분석으로부터의 M20의 생성 이온 (m/z 546) 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 10b는 M20의 제시된 구조 및 제시된 조각화 패턴을 나타낸다.
도 11은 남성 인간 대상체에 대한 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량 (100 mg, 100 μCi) 투여 후에 수득된 8-시간 풀링된 혈장 샘플의 분석으로부터의 M20의 생성 이온 (m/z 546) 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 시험관내에서 확인된 BIC 대사물 M465a, M465b, M465c, M305, M625, M641 및 M611의 제시된 구조를 나타낸다.

본 발명은 빅테그라비르의 대사물 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 대사물은 (1) 글루쿠로니드화, (2) 탈수소화, (3) 히드록실화, (4) 플루오라이드의 상실을 동반한 히드록실화, (5) 히드록시-빅테그라비르의 술페이트화 또는 글루쿠론산 접합, (6) 데스플루오로-히드록시-빅테그라비르의 술페이트화 또는 글루쿠론산 또는 시스테인 접합, 또는 (7) 그의 조합이 진행된 빅테그라비르이다. 일부 실시양태에서, 대사물은 M15, M58, M51, M52, M21, M23, M54, M55, M22, M53, M20, M35, M12, M59, M45, M56, M16, M57, M9 및 M37로부터 선택된다 (도 1 참조). 일부 실시양태에서, 대사물은 M465a, M465b, M465c, M305, M625, M641 및 M611로부터 선택된다 (도 12 참조).

일부 실시양태에서, 대사물은 M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물이다:

일부 실시양태에서, 대사물은 M15 및 M20으로부터 선택된 화합물이다. 일부 실시양태에서, 대사물은 M15이다. 일부 실시양태에서, 대사물은 M20이다. 일부 실시양태에서, 대사물은 M23이다.

본 발명은 본 발명의 대사물의 염, 예컨대 제약상 허용되는 염을 추가로 포함한다. 염은 일반적으로 개시된 화합물의 유도체로서, 여기서 모 화합물이 존재하는 산 또는 염기 모이어티의 그의 염 형태로의 전환에 의해 변형된 것을 지칭한다. 제약상 허용되는 염은, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 부합하면서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉되어 사용하기에 적합한 것이다. 제약상 허용되는 염의 예는 염기성 잔기 예컨대 아민의 미네랄 또는 유기 산 염; 산성 잔기 예컨대 카르복실산의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 제약상 허용되는 염은, 예를 들어, 비-독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된, 모 화합물의 통상적인 비-독성 염을 포함한다. 본 발명의 제약상 허용되는 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 통상적인 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 적합한 염의 목록은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418] 및 [Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)]에서 확인되며, 이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 하나의 특정한 실시양태에서, 제약상 허용되는 염은 나트륨 염이다.

일부 실시양태에서, 대사물 화합물 또는 그의 염은 실질적으로 단리된다. "실질적으로 단리된"이란, 대사물 화합물 또는 그의 염이 그의 형성 또는 검출 환경으로부터 적어도 부분적으로 또는 실질적으로 분리된 것을 의미한다. 부분적 분리는, 예를 들어, 본 발명의 화합물이 풍부화된 조성물을 포함할 수 있다. 실질적 분리는 중량 기준으로 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 99%의 대사물 또는 그의 염을 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, M15, M20 및 M23은 실질적으로 단리된다.

본 발명의 대사물 또는 그의 염은 조성물로 존재할 수 있으며, 여기서 조성물은 대사물 이외의 다른 화합물을 적어도 1종 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1종 초과의 본 발명의 대사물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 본 발명의 대사물 또는 그의 염, 및 빅테그라비르 또는 그의 염을 포함한다. 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염, 및 1종 이상의 용매, 기질, 담체 등을 함유하는 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 25 중량% 초과의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 50 중량% 초과의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 75 중량% 초과의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 80 중량% 초과의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 85 중량% 초과의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 90 중량% 초과의 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 약 95 중량% 초과의 양으로 포함한다.

본 발명의 대사물 또는 그의 염의 제제는 화학적 합성에 의해 또는 생물학적 샘플로부터의 대사물의 단리에 의해 제조될 수 있다. 제제는 순도가 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과인 순도를 가질 수 있다. 순도는 임의의 통상적인 수단에 의해, 예컨대 크로마토그래피 방법 또는 NMR, MS, LC-MS 등과 같은 분광학적 방법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 대사물은 비대칭이다 (예를 들어, 1개 이상의 입체중심을 가짐). 달리 지시되지 않는 한, 모든 입체이성질체, 예컨대 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 의도된다. 라세미 혼합물의 분해 또는 입체선택적 합성에 의한 것과 같은, 광학 활성 출발 물질로부터 광학 활성 형태를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 대사물은 또한 대사물에서 발생하는 원자의 모든 동위원소를 포함한다. 동위원소는 동일한 원자 번호를 갖지만, 상이한 질량수를 갖는 원자를 포함한다. 예를 들어, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대사물은 적어도 1개의 중수소를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "화합물" 또는 "대사물"은 도시된 구조의 모든 입체이성질체, 기하 이성질체, 호변이성질체 및 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "대사물"은 (1) 글루쿠로니드화, (2) 탈수소화, (3) 히드록실화, (4) 플루오라이드의 상실을 동반한 히드록실화, (5) 히드록시-빅테그라비르의 술페이트화 또는 글루쿠론산 접합, 및 (6) 데스플루오로-히드록시-빅테그라비르의 술페이트화 또는 글루쿠론산 또는 시스테인 접합으로부터 선택된 1종 이상의 변환 과정이 진행된 유도체를 포함한, 빅테그라비르의 임의의 및 모든 대사 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 대사물은 1종 이상의 대사 변환이 이미 진행된 빅테그라비르의 유도체의 대사 변환을 포함한, 1종 초과의 변환 과정이 진행되었다.

빅테그라비르가 투여되면 대사적으로 변환되어 본 발명의 대사물을 제공하기 때문에, 화합물 빅테그라비르가 또한 본 발명의 대사물의 전구약물 (예를 들어, 대사물 M15, M20, M23 등의 전구약물)로서 간주될 수 있다. 따라서, 빅테그라비르는, 예를 들어, 인간에서 HIV 감염을 예방 또는 치료하기 위해 인간에게 본 발명의 대사물을 제공하는 수단으로서 인간에게 투여될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 미국 식품 의약품국에 의해 인간 또는 가축에서의 사용에 대해 허용되는 것으로 승인받은, 임의의 아주반트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 안정화제, 등장화제, 용매 또는 유화제를 지칭하는 것으로 의도된다.

방법

본 발명은 추가로 치료 유효량의 본 발명의 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 인간에게 투여함으로써 인간에서 HIV 감염 (예를 들어, HIV-1 및/또는 HIV-2)을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 인간은 감염되어 있을 수 있거나 또는 감염될 위험이 있을 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 HIV 감염의 증상을 완화하거나 또는 제거하고/거나 환자에서의 바이러스 로드를 감소시키기 위한 본 발명에 따른 대사물, 그의 조성물 또는 그의 제제의 투여를 의미하는 것으로 의도된다.

용어 "예방" 또는 "예방하는"은 인간의 바이러스에의 노출-후이지만, 질환 증상의 출현 전 및/또는 혈액 중 바이러스의 검출 이전의 본 발명에 따른 대사물, 그의 조성물 또는 그의 제제의 투여를 지칭한다. 상기 용어는 또한 질환 증상의 출현의 예방 및/또는 바이러스가 혈액 중에서 검출가능한 수준에 이르는 것을 예방하는 것을 지칭한다. 상기 용어는 노출-전 예방, 뿐만 아니라 노출-후 예방 둘 다를 포함한다. 상기 용어는 또한 출산 전의 산모 및 생후 1일 이내의 유아에게 투여하는 것에 의한, 산모에게서 아기로의 HIV의 주산기 감염의 예방을 지칭한다.

용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은, 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 화합물이 유용성을 갖는 질환-상태, 병태 또는 장애에 대한 치료를 유효하게 하기에 충분한 본 발명에 따른 대사물의 양을 지칭한다. 이러한 양은 연구원 또는 임상의가 원하는 조직계 또는 환자의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하기에 충분할 것이다. 치료 유효량으로 여겨지는 본 발명에 따른 대사물의 양은 화합물 및 그의 생물학적 활성, 투여에 사용된 조성물, 투여 시간, 투여 경로, 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 치료할 질환-상태 또는 장애의 유형 또는 그의 중증도, 본 발명의 화합물과 조합되어 또는 동시에 사용되는 약물, 및 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식습관과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 이러한 치료 유효량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 그들의 지식, 최신 기술, 및 본 개시내용을 고려하여 상용적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 투여는 유사한 유용성으로 활용되는 작용제의 임의의 허용되는 투여 방식을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 적절한 제약상 허용되는 담체와 조합함으로써 제조될 수 있고, 구체적 실시양태에서, 고체, 반고체, 액체 또는 기체상 형태의 제제로, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔, 마이크로구체 및 에어로졸로 제제화된다. 이러한 제약 조성물의 예시적인 투여 경로는, 비제한적으로, 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질 및 비강내를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 정제이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 주사제 (근육내 (IM) 또는 복강내 (IP))이다. 본 발명의 제약 조성물은 그 중에 함유된 활성 성분이 조성물의 환자에게의 투여 시 생체이용가능하도록 제제화된다. 대상체 또는 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위 형태를 취하며, 여기서 예를 들어, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 발명의 화합물의 용기는 복수의 투여 단위를 보유할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있거나 또는 명백할 것이고; 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)]을 참조한다. 투여될 조성물은, 어느 경우이든, 본원에 기재된 교시에 따른 관심 질환 또는 병태의 치료를 위한 치료 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유할 것이다.

본 발명은 추가로 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 본 발명의 대사물 또는 그의 염을 확인하는 것을 포함하는, 환자에 대한 빅테그라비르의 투여를 검출 또는 확증하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 혈장, 소변 또는 분변으로부터 유래된다.

본 발명은 추가로 빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 대사물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 빅테그라비르의 대사 속도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 본 발명의 대사물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, HIV 감염의 치료에서의 빅테그라비르에 대한 환자의 예방적 또는 치료적 반응을 결정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 본 발명의 대사물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, 빅테그라비르를 사용한 치료를 필요로 하는 환자에 대한 빅테그라비르의 용량을 최적화하는 방법에 관한 것이다. 대사물의 양은 환자가 빅테그라비르를 대사하는 속도에 대한 지표일 수 있다. 빅테그라비르를 다른 환자보다 더 빠르게 또는 더 효과적으로 대사하는 환자는, 빅테그라비르를 보다 천천히 대사하는 환자와 비교하여, 보다 다량의 대사물을 형성할 수 있고 잠재적으로 보다 고용량의 빅테그라비르 또는 추가의 투약을 요구할 수 있다. 빅테그라비르를 다른 환자보다 덜 빠르게 또는 덜 효과적으로 대사하는 환자는, 빅테그라비르를 보다 빠르게 대사하는 환자와 비교하여, 보다 소량의 대사물을 형성할 수 있고 잠재적으로 보다 저용량의 빅테그라비르 또는 보다 적은 투약을 요구할 수 있다. 따라서, 빅테그라비르의 용량을 최적화하는 방법은 대사물의 측정된 양이 평균보다 더 높은지 또는 더 낮은지를 결정하고, 그에 상응하게 빅테그라비르의 투여량을 조정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

환자에서 대사물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하고, 샘플에서의 대사물 또는 그의 염의 양을 측정함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 혈장이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 소변이다. 다른 실시양태에서, 샘플은 분변이다.

용어 "환자"는 바이러스 감염, 예컨대 HIV 감염에 대한 치료적 또는 예방적 처치를 필요로 하는 인간 또는 다른 포유동물 예컨대 실험 동물 및 가정용 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼) 및 비-가축 동물 예컨대 비-인간 영장류, 포유류 야생동물 등을 지칭하는 것으로 의도된다.

조합 요법

1종 이상의 추가의 제약 작용제가 HIV 감염 (예를 들어, 인간 환자에서)을 예방 또는 치료하기 위해 본 발명의 화합물, 염 및 조성물과 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 1 내지 3종의 추가의 치료제 (예를 들어, 1 내지 3종의 항-HIV 작용제)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 치료제는 항-HIV 작용제이다.

상기 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-HIV 작용제일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 HIV 프로테아제 억제제, HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 인테그라제 억제제, HIV 비-촉매 부위 (또는 알로스테릭) 인테그라제 억제제, 진입 억제제 (예를 들어, CCR5 억제제, gp41 억제제 (즉, 융합 억제제) 및 CD4 부착 억제제), CXCR4 억제제, gp120 억제제, G6PD 및 NADH-옥시다제 억제제, HIV 캡시드를 표적으로 하는 화합물 ("캡시드 억제제"; 예를 들어, 캡시드 중합 억제제 또는 캡시드 교란 화합물 예컨대 WO 2013/006738 (길리애드 사이언시즈(Gilead Sciences)), US 2013/0165489 (펜실베니아 대학교(University of Pennsylvania)) 및 WO 2013/006792 (파마 리소시스(Pharma Resources))에 개시된 것들), 약동학적 인핸서, 및 HIV를 치료하기 위한 다른 약물, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-HIV 작용제는 HIV 프로테아제 억제제, HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제, 약동학적 인핸서, 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 항-HIV 작용제는 HIV 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제, 또는 그의 조합이다.

추가의 실시양태에서, 추가의 치료제는 하기 중 1종 이상으로부터 선택된다:

(1) 암프레나비르, 아타자나비르, 포삼프레나비르, 인디나비르, 로피나비르, 리토나비르, 넬피나비르, 사퀴나비르, 티프라나비르, 브레카나비르, 다루나비르, TMC-126, TMC-114, 모제나비르 (DMP-450), JE-2147 (AG1776), L-756423, RO0334649, KNI-272, DPC-681, DPC-684, GW640385X, DG17, PPL-100, DG35 및 AG 1859로 이루어진 군으로부터 선택된 HIV 프로테아제 억제제;

(2) 카프라비린, 에미비린, 델라비리딘, 에파비렌즈, 네비라핀, (+) 칼라놀리드 A, 에트라비린, GW5634, DPC-083, DPC-961, DPC-963, MIV-150, TMC-120, 릴피비린, BILR 355 BS, VRX 840773, 레르시비린 (UK-453061), RDEA806, KM023 및 MK-1439로 이루어진 군으로부터 선택된 HIV 비-뉴클레오시드 또는 비-뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제;

(3) 지도부딘, 엠트리시타빈, 디다노신, 스타부딘, 잘시타빈, 라미부딘, 아바카비르, 암독소비르, 엘부시타빈, 알로부딘, MIV-210, ±-FTC, D-d4FC, 엠트리시타빈, 포스파지드, 포지부딘 티독실, 아프리시티빈 (AVX754), KP-1461, GS-9131 (길리애드 사이언시즈) 및 포살부딘 티독실 (이전 HDP 99.0003)로 이루어진 군으로부터 선택된 HIV 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제;

(4) 테노포비르, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트, 테노포비르 알라페나미드 (길리애드 사이언시즈), GS-7340 (길리애드 사이언시즈), GS-9148 (길리애드 사이언시즈), 아데포비르, 아데포비르 디피복실, CMX-001 (키메릭스(Chimerix)) 또는 CMX-157 (키메릭스)로 이루어진 군으로부터 선택된 HIV 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제;

(5) 랄테그라비르, 엘비테그라비르, 돌루테그라비르, 카보테그라비르, 쿠르쿠민, 쿠르쿠민의 유도체, 키코르산, 키코르산의 유도체, 3,5-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일퀸산의 유도체, 아우린트리카르복실산, 아우린트리카르복실산의 유도체, 카페인산 페네틸 에스테르, 카페인산 페네틸 에스테르의 유도체, 티르포스틴, 티르포스틴의 유도체, 퀘르세틴, 퀘르세틴의 유도체, S-1360, AR-177, L-870812 및 L-870810, BMS-538158, GSK364735C, BMS-707035, MK-2048, BA 011 및 GSK-744로 이루어진 군으로부터 선택된 HIV 인테그라제 억제제;

(6) BI-224436, CX0516, CX05045, CX14442, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2009/062285 (베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)), WO 2010/130034 (베링거 잉겔하임), WO 2013/159064 (길리애드 사이언시즈), WO 2012/145728 (길리애드 사이언시즈), WO 2012/003497 (길리애드 사이언시즈), WO 2012/003498 (길리애드 사이언시즈)에 개시된 화합물을 비제한적으로 포함한, HIV 비-촉매 부위, 또는 알로스테릭, 인테그라제 억제제 (NCINI);

(7) 엔푸비르티드, 시푸비르티드, 알부비르티드, FB006M 및 TRI-1144로 이루어진 군으로부터 선택된 gp41 억제제;

(8) CXCR4 억제제 AMD-070;

(9) 진입 억제제 SP01A;

(10) gp120 억제제 BMS-488043;

(11) G6PD 및 NADH-옥시다제 억제제 이뮤니틴;

(12) 아플라비록, 비크리비록, 마라비록, 세니크리비록, PRO-140, INCB15050, PF-232798 (화이자(Pfizer)) 및 CCR5mAb004로 이루어진 군으로부터 선택된 CCR5 억제제;

(13) 이발리주맙 (TMB-355) 및 BMS-068 (BMS-663068)로 이루어진 군으로부터 선택된 CD4 부착 억제제;

(14) 리토나비르, 코비시스타트 및 SPI-452로 이루어진 군으로부터 선택된 약동학적 인핸서; 및

(15) BAS-100, SPI-452, REP 9, SP-01A, TNX-355, DES6, ODN-93, ODN-112, VGV-1, PA-457 (베비리마트), HRG214, VGX-410, KD-247, AMZ 0026, CYT 99007A-221 HIV, DEBIO-025, BAY 50-4798, MDX010 (이필리무맙), PBS 119, ALG 889 및 PA-1050040 (PA-040)으로 이루어진 군으로부터 선택된 HIV를 치료하기 위한 다른 약물,

및 그의 조합.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 2종, 3종, 4종 또는 그 초과의 추가의 치료제와 조합된다. 2종, 3종, 4종 또는 그 초과의 추가의 치료제는 동일한 클래스의 치료제로부터 선택된 상이한 치료제일 수 있거나, 또는 이들은 상이한 클래스의 치료제로부터 선택될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 HIV 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제 및 HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제와 조합된다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 HIV 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제 및 HIV 프로테아제 억제 화합물과 조합된다. 추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 HIV 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제 및 HIV 프로테아제 억제 화합물과 조합된다. 추가의 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 HIV 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제 및 약동학적 인핸서와 조합된다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물이 상기 기재된 바와 같은 1종 이상의 추가의 치료제와 조합되는 경우에, 조성물의 성분은 동시적 또는 순차적 레지멘으로서 투여된다. 순차적으로 투여되는 경우에, 조합은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물은 환자에게의 동시적 투여를 위한 단일 투여 형태로, 예를 들어 경구 투여를 위한 고체 투여 형태 (예를 들어, 고정 용량 조합 정제)로서 1종 이상의 추가의 치료제와 조합된다.

특정 실시양태에서, 본원에 개시된 대사물은 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 투여된다. 본원에 개시된 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 1종 이상의 추가의 치료제와의 공동-투여는 일반적으로 치료 유효량의 대사물 및 1종 이상의 추가의 치료제가 둘 다 환자의 체내에 존재하도록 하는, 본원에 개시된 화합물 및 1종 이상의 추가의 치료제의 동시적 또는 순차적 투여를 지칭한다.

공동-투여는 단위 투여량의 1종 이상의 추가의 치료제의 투여 전 또는 후의 단위 투여량의 본원에 개시된 대사물의 투여, 예를 들어, 1종 이상의 추가의 치료제의 투여로부터 수초, 수분 또는 수시간 이내의 본원에 개시된 대사물의 투여를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단위 용량의 본원에 개시된 대사물이 먼저 투여되고, 이어서 수초 또는 수분 이내에 단위 용량의 1종 이상의 추가의 치료제가 투여된다. 대안적으로, 다른 실시양태에서, 단위 용량의 1종 이상의 추가의 치료제가 먼저 투여되고, 이어서 수초 또는 수분 이내에 단위 용량의 본원에 개시된 대사물이 투여된다. 일부 실시양태에서, 단위 용량의 본원에 개시된 대사물이 먼저 투여되고, 이어서 수시간 (예를 들어, 1-12시간)의 기간 후에 단위 용량의 1종 이상의 추가의 치료제가 투여된다. 다른 실시양태에서, 단위 용량의 1종 이상의 추가의 치료제가 먼저 투여되고, 이어서 수시간 (예를 들어, 1-12시간)의 기간 후에 단위 용량의 본원에 개시된 대사물이 투여된다.

제약 제제 및 투여 형태

본원에 개시된 제약 조성물은 제약 기술분야에 널리 공지된 방법론에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 주사에 의해 투여되도록 의도되는 제약 조성물은 본 발명의 대사물을 멸균 증류수와 조합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 계면활성제가 균질 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 첨가된다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서의 화합물의 용해 또는 균질한 현탁을 용이하게 하도록 본 발명의 화합물과 비-공유적으로 상호작용하는 화합물이다.

본 발명의 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 치료 유효량으로 투여될 수 있으며, 이는 이용된 특정한 화합물의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간; 환자의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별 및 식습관; 투여 방식 및 시간; 배출 속도; 약물 조합; 특정한 장애 또는 병태의 중증도; 및 요법을 진행하는 대상체를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.

본 발명은 구체적인 실시예에 의해 더욱 상세히 기재될 것이다. 하기 실시예는 예시적 목적으로 제공된 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본질적으로 동일한 결과를 산출하도록 변화 또는 변형될 수 있는 다양한 비임계적 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.

실시예

실시예 1: 건강한 대상체에서의 빅테그라비르의 약동학, 대사 및 배출을 평가하기 위한 1상 연구의 결과

연구 설계

본 연구의 목적은: (1) 방사성표지된 탄소-14 ([¹⁴C])빅테그라비르의 단일 경구 용량의 투여 이후 빅테그라비르의 물질 균형을 결정하고; (2) 빅테그라비르 및 가능한 경우에 그의 대사물(들)의 약동학 (PK)을 평가하고; (3) 방사성표지된 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량의 투여 이후 인간에서의 빅테그라비르의 대사물 프로파일을 결정하고; (4) 빅테그라비르의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다.

이는 건강한 대상체에서의 방사성표지된 [¹⁴C]빅테그라비르의 단일 경구 용량의 투여 이후 빅테그라비르의 PK, 대사 및 배출을 평가하기 위한 1상, 개방-표지, 단일 기관, 물질-균형 연구였다. 총 8명의 환자가 등록되었다. 대상체는 예정된 제1 용량에 앞서 28일 이내에 수행된 스크리닝 평가에서 조사자에 의해 결정된, 19 내지 30 kg/m2 (언급된 종점 포함)의 체질량 지수 (BMI), 정상 12-유도 심전도 (ECG), 정상 신장 기능을 갖고, 유의한 병력이 없으며, 양호한 전반적 건강 상태에 있는 18세 내지 45세 (언급된 종점 포함)의 건강한 남성 비흡연자였다.

치료는 단일 경구 용량에 이어서, 6- 내지 21-일의 샘플 수집 기간을 수반하며, 그의 정확한 지속기간은 방사성표지된 약물의 회수에 기반한다. 용량은 대략 40-mL 에탄올성 용액 (4:6 [v/v] 물:에탄올, pH가 HCl로 조정됨)으로서 경구로 투여된 100 mg 빅테그라비르 (99 mg의 방사성표지되지 않은 빅테그라비르 [나트륨 염 형태로서] + 대략 100 μCi [1 mg]의 방사성표지된 [¹⁴C]빅테그라비르)였다. 투여 이후에, 투약 용기를 2회 헹구는데, 각각 대략 50 mL의 크랜베리 주스로 헹구어, 대상체에게 투여하였다. 전체 연구 약물 용액 및 크랜베리 주스 헹굼액 (총 대략 140 mL)을 10분 창 이내에 취하였다.

소변, 대변 및 두 샘플 모두에서 회수된 총 [¹⁴C]-방사선량의 백분율 및 누적 백분율에 대한 개별 데이터 및 요약 통계가 샘플링 시간당 제공되었다. 소변, 대변 및 두 샘플 모두에서 회수된 총 [¹⁴C]-방사선량의 개별, 평균 (표준 편차 [SD]), 및 중앙값 (제1 사분위수 [Q1], 제3 사분위수 [Q3]) 누적 백분율 대 시간 프로파일이 시간 선형 및 반-대수 스케일로 제시되었다.

총 [¹⁴C]-방사능에 대한 샘플링 시간당 혈장, 전혈, 소변 및 대변 샘플의 개별 대상체 농도 데이터 및 요약 통계가 제시되었다. 총 [¹⁴C]-방사능 농도의 전혈-대-혈장 비가 각각의 대상체에 대해 결정되었고 기술 통계에 의해 표로 제시되었다. 추가로, 빅테그라비르에 대한 샘플링 시간당 혈장 및 소변 샘플의 개별 대상체 농도 데이터 및 요약 통계가 제시되었다.

혈장, 소변 및 분변에서의 [¹⁴C]빅테그라비르 대사물 프로파일링

빅테그라비르의 총 20종의 대사물이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)-MS/탑카운트 방법에 의한 대사물 프로파일링 결과에서 확인되었다. 이들 대사물은 직접적인 글루쿠로니드화 (M15 및 M58), 탈수소화 (M51 및 M52), 히드록실화 (M21, M23, M54 및 M55), 플루오라이드의 상실을 동반한 히드록실화 (M22 및 M53), 히드록시-빅테그라비르의 술페이트화 또는 글루쿠론산 접합 (M20, M35, M12, M59 및 M45), 데스플루오로-히드록시-빅테그라비르의 술페이트화 또는 글루쿠론산 또는 시스테인 접합 (M56, M16, M57, M9 및 M37)을 포함한, 여러 생체변환 경로를 통해 생성되었다 (도 1).

혈장: 혈장에서의 대사물 프로파일링 및 정량화를 투약후 0 내지 144시간에 개별 대상체에 대해 풀링된 샘플로 수행하였다. 빅테그라비르 및 13종의 대사물이 인간 혈장에서 확인되었다. [¹⁴C]빅테그라비르가 주요 순환 방사성 성분이었고 M20 (히드록시-빅테그라비르-술페이트) 및 M15 (빅테그라비르-글루쿠로니드)가 혈장에서의 주요 대사물이었으며, 이들은 각각 총 방사능의 혈장 AUC0-72 h (농도 시간 곡선하 면적)의 67.9%, 20.1% 및 8.6%를 차지하였다. 총 방사능 대비 부차적 대사물 M21 (히드록시-빅테그라비르), M52 (탈수소화 생성물) 및 M23/M51 (히드록시-빅테그라비르/탈수소화 생성물)의 AUC0-72h 비는 각각 2.0%, 0.6% 및 0.2%였다. 모든 대사물은 투약 후 144시간이 지나면 BLQ (정량 한계 미만)가 되었는데, 이는 대사물의 수명이 길지 않음을 지시한다.

소변: 소변에서의 대사물 프로파일링 및 정량화를 투약후 0 내지 96시간의 기간 이내에 개별 대상체에 대해 풀링된 샘플로 수행하였다. 빅테그라비르 및 20종의 대사물이 인간 소변에서 확인되었다. M15 (M58과 공동-용출됨, 둘 다 빅테그라비르-글루쿠로니드)가 투여된 용량의 21.4%를 차지하는, 소변에서의 주요 방사성 성분이었다. 부차적이거나 또는 미량인 수준의 대사물 (도 1 참조)은 용량의 2.2% 미만이었다. 회수된 변화없는 빅테그라비르는 소변에서 낮았으며 (용량의 3.6%), 이는 빅테그라비르의 LC/MS/MS 결과와 일치한다.

분변: 분변에서의 대사물 프로파일링 및 정량화를 개별 대상체에 대해 풀링된 분변 샘플로 수행하였다. 변화없는 모 화합물, M9 (데스플루오로-히드록시-빅테그라비르-시스테인 접합체), M21/M22 (공동-용출되는 히드록시-빅테그라비르/데스플루오로-히드록시-빅테그라비르) 및 M23 (히드록시-빅테그라비르)이 평균적으로 각각 투여된 용량의 30.6%, 13.0%, 8.1% 및 3.6%를 차지하였다 (투약후 0 내지 144시간 이내에 8명의 대상체로부터 평균한 정량화).

대사물의 확인: 대사물은 LC-MS/탑카운트 방법에 의해 확인되었다. 첫 번째로, 진정한 빅테그라비르 및 [¹⁴C]빅테그라비르 참조 표준물의 생성 이온 질량 스펙트럼을 LTQ 이온 트랩 질량 분광계 및 LTQ 오르비트랩 고분해능 질량 분광계로 획득하였다. 이어서, 그의 주요 조각화 패턴을 제시하였고, 상응하는 조각 이온의 원소 조성을 확증하였다. 두 번째로, LC-라디오-크로마토그램에서 관찰된 대사물의 체류 시간을 전체 스캔 양성 이온화 모드로 작동된 LC-MS 크로마토그램에서의 상응하는 체류 시간과 비교하였고, 대사물의 분자상 이온을 결정하였다. 이어서, 잠재적 대사물의 분자상 이온에 대한 생성 이온 질량 스펙트럼을 획득하였다. 정확한 질량 스펙트럼을 또한 LTQ 오르비트랩 고분해능 질량 분광계로 획득하여 제시된 분자상 이온 및 그의 생성 이온의 화학식을 확증하였다. 타당해 보이는 조각화 경로 및 추정 대사물 구조가 제시되었다 (도 1).

대사물 M15 및 M58은 LC-MS 크로마토그램에서 ~25.74 및 25.44 min에 용출되었고, m/z 626의 분자상 이온을 가지고 있었다. 이들 이온의 정확한 질량 측정이 0.02 내지 0.2 ppm의 질량 오차로 C₂₇H₂₇F₃N₃O₁₁ ⁺의 화학식을 제공하였으며, 이는 모 분자상 이온에 대한 C₆H₈O₆ 모이어티의 첨가를 시사하였다. 이들 분자상 이온의 CID는 유사한 조각화를 초래하였고, 분자상 이온으로부터 -176 Da의 중성 손실에 상응하는 m/z 450에서 주요 이온을 나타냈다. m/z 450의 이온의 MS3은 빅테그라비르의 참조 표준물과 매칭되는 스펙트럼을 나타냈고, 이는 M15 및 M58이 빅테그라비르의 글루쿠로니드임을 지시한다.

대사물 M54, M21 및 M23은 LC-MS 크로마토그램에서 각각 ~31.40, 33.18 및 33.97 min에 용출되었고, 모두 m/z 466의 분자상 이온을 가지고 있었다. 이들 이온의 정확한 질량 측정이 0.2 내지 0.4 ppm의 질량 오차로 C₂₁H₁₉F₃N₃O₆ ⁺의 화학식을 제공하였으며, 이는 모 분자상 이온에 대한 O 원자의 첨가 (+16 Da)를 시사하였다. M23의 분자상 이온의 CID는 m/z 448, 423, 307 및 289에서 주요 이온을 생성하였다. M21 및 M54의 분자상 이온의 CID는 m/z 448, 423, 323, 305 및 289에서 주요 이온을 생성하였다. 이들 생성 이온의 정확한 질량 측정이 그의 화학식을 확증하였다. MS 스펙트럼은 M23, M21 및 M54가 빅테그라비르의 모노 히드록실화 대사물임을 시사하였다.

대사물 M20은 LC-MS 크로마토그램에서 29.92 min에 용출되었고, m/z 546의 분자상 이온을 가지고 있었다. 이 이온의 정확한 질량 측정이 0.3 ppm의 질량 오차로 C₂₁H₁₉F₃N₃O₉S⁺의 화학식을 제공하였으며, 이는 모 분자상 이온에 대한 SO₄ 모이어티의 첨가를 시사하였다. 이 분자상 이온의 CID는 모 분자상 이온으로부터 SO₃ 모이어티의 중성 손실 (-80 Da)에 상응하는 m/z 466에서 주요 이온을 생성하였다. MS3 스펙트럼은 m/z 448, 423, 307 및 289에서 조각 이온을 생성하였다. M20의 질량 스펙트럼은 이것이 빅테그라비르의 히드록실화 생성물의 술페이트 접합체임을 시사하였다.

대사물 정량화: 풀링된 혈장, 소변 및 분변 샘플의 LC-라디오-크로마토그램을 입수하였다. [¹⁴C]-빅테그라비르 및 그의 대사물의 정량화는 라디오-크로마토그램에서의 상응하는 피크의 적분 및 상응하는 샘플에서 회수된 방사능 농도/방사선량에 기반하였다. 배설물에서의 빅테그라비르 및 그의 대사물의 농도는 투여된 용량의 퍼센트로 보고되었다. 혈장 샘플에서 측정된 농도는 ng 등가 빅테그라비르/mL로 보고되었다.

방사능 회수: 분변 균질물 및 혈장으로부터의 평균 추출 회수는 각각 95.5% 및 100.4%였다. 건조된 분변 및 혈장 추출 잔류물로부터의 평균 재구성 회수는 각각 99.9% 및 100.3%였다. 소변 원심분리 과정으로부터의 회수는 100.8%였다. 소변 농축 과정으로부터의 회수는 100.6%였다. HPLC 칼럼으로부터의 방사능 회수는 99.3%였다.

풀링된 분변에서의 M21 및 M22 대사물의 분리 및 정량화

액체 크로마토그래피를 사용하여 풀링된 분변 샘플에서의 M21 (히드록시-빅테그라비르) 및 M22 (데스플루오로-히드록시-빅테그라비르)를 분리하였는데, 이는 이들 2종의 대사물이 대사물 프로파일링 과정 동안 공동-용출되었기 때문이다. M22는 단일 피크로서 용출되었고 방사능이 정량화되었지만, 그러나 M21은 M23과 공동-용출되었다. M21의 퍼센트는 M21/M22 혼합물로부터 M22를 차감하여 계산하였다.

M21 및 M22는 개별 대상체마다 풀링된 분변 샘플에서 투약후 144시간까지 평균적으로 각각 용량의 4.8% 및 3.3%를 차지하였다. 수집 간격마다 풀링된 분변 샘플에서, M21 및 M22는 투약 후 144시간까지 각각 용량의 2.9% 및 4.1%를 차지하였다. 이들 분석은 히드록시-빅테그라비르 (M21) 및 데스플루오로-히드록시-빅테그라비르 (M22)의 수준이, 용량의 대략 3% 내지 4% 범위에서 유사함을 지시하였다.

결과의 요약

약동학 결과: 본 물질 균형 연구는 빅테그라비르가 소변에 비해 주로 분변으로부터 회수됨을 입증하였다. 대사는 인간에서의 빅테그라비르의 주요 클리어런스 경로이다. 빅테그라비르의 총 20종의 대사물이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)-MS/탑카운트 방법에 의해 확인되었다. 직접적인 글루쿠로니드화, 히드록실화, 탈플루오린화, 탈수소화 및 산화된 대사물의 II상 접합이 빅테그라비르의 주요 대사 경로였다.

인간 혈장에서는, [¹⁴C]빅테그라비르가 주요 순환 방사성 성분이었고 M20 (히드록시-빅테그라비르의 술페이트) 및 M15 (빅테그라비르의 글루쿠로니드)가 혈장에서의 주요 대사물이었으며, 이들은 각각 총 방사능의 혈장 AUC0-72h의 대략 67.9%, 20.1% 및 8.6%를 차지하였다. 인간 소변에서는, M15 (M58과 공동-용출됨, 둘 다 빅테그라비르의 직접적인 글루쿠로니드)가 주요 대사물 (용량의 21.4%)이었다. 시간 간격별로 및 개별 대상체에 대해 풀링된 분변 샘플에서의 방사능은 주로 빅테그라비르 (용량의 31% 내지 34%), 데스플루오로-히드록시-빅테그라비르의 시스테인 접합체 (용량의 10% 내지 13%), 데스플루오로-히드록시-빅테그라비르와 공동-용출된 히드록시-빅테그라비르 (공동-용출된 피크에 대해 용량의 7% 내지 8%), 및 미량의 산화 생성물이 차지하였다. M21 (히드록실-빅테그라비르) 및 M22 (데스플루오로-히드록시-빅테그라비르)의 수준은 유사하였으며, 평균적으로 각각 인간으로부터의 분변에서 M21/M22 혼합물로 용량의 대략 3% 내지 4%의 범위에 있었다.

실시예 2: M15, M20 및 M23의 합성 및 특징화

M15의 제조

아세트산 중 33% HBr을 사용한 1의 아노머 브로민화로 브로마이드 2를 70%의 결정화 수율로 제공하였다. 60℃에서 아세토니트릴 중 Ag₂CO₃의 존재 하에 페놀 3을 브로마이드 2로 처리하여 역상 크로마토그래피 후에 75%의 수율로 화합물 4를 생성하였다. 메탄올/물 중 트리에틸아민을 사용한 4의 탈보호로 글루쿠론산 5 (M15)로의 완전한 전환을 제공하였다. 반응에서 존재하는 3의 양이 증가하기 시작했기 때문에 반응을 90% 전환에서 정지시켰다. 혼합물을 크로마토그래피 용매 중 0.1% TFA를 사용하여 역상 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 유리 산이 동결건조 후에 단리되었지만, 그러나 이는 상당량의 3을 함유하였다. 유리 산 5는 중성 또는 산성 조건에서 불안정하다는 것이 발견되었다. M15 (5)의 트리에틸아민 염은 안정한 것으로 보였다. 또 다른 배치를 상기와 동일한 방법을 사용하여 정제하나, 단, TFA를 동결건조 전에 트리에틸아민으로 중화시켰다. 화합물은 상기 조건에 안정적이었지만, 다량의 트리에틸암모늄 트리플루오로아세테이트를 함유하였다. 모든 염이 제거되지는 않았다. 물질을 역상 크로마토그래피에 의해, 그러나 용매 중 TFA 없이 정제하였다. 동결건조 후에 M15 (5)의 트리에틸아민 염은 고순도 및 24%의 전체 수율로 단리되었다.

M20의 제조

단계 1.

테트라히드로푸란 (10 mL) 중 화합물 6 (333 mg, 0.70 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (85 mg, 0.70 mmol) 및 트리에틸아민 (0.2 mL, 1.44 mmol)의 용액을 실온에서 교반하며, 그 동안 테트라히드로푸란 (2.5 mL) 중 2,2,2-트리클로로에틸 술푸로클로리데이트 (218 mg, 0.88 mmol)의 용액을 ~2 min에 걸쳐 첨가하였다. 3.5 h 후에, 추가의 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.72 mmol) 및 2,2,2-트리클로로에틸 술푸로클로리데이트 (100 mg, 0.40 mmol)를 첨가하였다. 첨가 이후로 1.5 h 후에, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 희석하고, 물 (x 1), 10% 시트르산 (x 1), 물 (x 1) 및 염수 (x 1)로 세척하였다. 수성 분획을 에틸 아세테이트 (x 1)로 추출한 후에, 유기 분획을 합하여, 건조시키고 (MgSO₄), 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중 0-10% 메탄올로 용출하여 콤비플래쉬 (40 g 칼럼)에 의해 정제함으로써 458 mg (95%)의 화합물 7을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 10.40 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 6.86 (td, J = 9.4, 2.2 Hz, 1H), 5.37 - 5.30 (m, 2H), 4.95 (s, 2H), 4.67 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 4.63 (s, 1H), 4.19 (dd, J = 12.7, 3.9 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.98 (dd, J = 12.7, 9.2 Hz, 1H), 2.13 - 1.95 (m, 4H), 1.83 (qd, J = 8.7, 7.6, 3.5 Hz, 1H), 1.57 (ddd, J = 12.3, 4.1, 2.9 Hz, 1H). ¹⁹F NMR (376 MHz, 클로로포름-d) δ -110.32 (dt, J = 9.7, 5.3 Hz), -122.76 (dd, J = 9.9, 5.6 Hz), -125.40 (d, J = 4.7 Hz). LCMS-ESI⁺ (m/z): [M+H]⁺ C₂₄H₂₂Cl₃F₃N₃O₉S에 대한 계산치: 690.01; 실측치: 690.27.　

단계 2.

아세토니트릴 (3 mL) 중 화합물 7 (255 mg, 0.37 mmol)의 용액을 실온에서 교반하며, 그 동안 브로민화마그네슘 (180 mg, 0.98 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 50℃ 조에서 교반하였다. 30 min 후에, 반응 혼합물을 0℃에서 교반하며, 그 동안 0.1 N HCl을 불용성 물질이 용해될 때까지 여러 방울 첨가하였다. 생성된 용액을 물 (30 mL)로 희석한 후에, 생성물을 디클로로메탄 (25 mL x 3)으로 추출하였다. 합한 추출물을 건조시키고 (Na₂SO₄), 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중 0-15% 메탄올로 용출하여 콤비플래쉬 (40 g 칼럼)에 의해 정제함으로써 178 mg (71%)의 화합물 8을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.46 (s, 1H), 10.44 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.63 (td, J = 10.5, 9.9, 2.0 Hz, 1H), 5.43 (dd, J = 9.5, 4.0 Hz, 1H), 5.36 (s, 2H), 5.09 (s, 1H), 4.72 - 4.48 (m, 4H), 4.01 (dd, J = 12.7, 9.5 Hz, 1H), 1.93 (s, 4H), 1.83 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 1.62 - 1.50 (m, 1H). ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d ₆ ) δ -110.83 (dd, J = 9.8, 5.2 Hz), -124.08 (dd, J = 10.9, 5.5 Hz), -126.44. LCMS-ESI⁺ (m/z): [M+H]⁺ C₂₃H₂₀Cl₃F₃N₃O₉S에 대한 계산치: 675.99; 실측치: 676.26.

단계 3.

메탄올 (2.5 mL) 중 화합물 8 (50 mg, 0.074 mmol)의 용액을 실온에서 교반하며, 그 동안 중탄산암모늄 (721 mg, 9.12 mmol) 및 아연 분말 (217 mg, 3.32 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 18 h 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 농축시키고, 잔류물을 30 min 동안 진공에서 건조시켰다. 잔류 고체를 ~2 min 동안 초음파처리 하에 0.01 N 중탄산암모늄 (50 mL)으로 연화처리하고, 생성된 슬러리를 30 min 동안 실온에서 정치해 둔 후에 셀라이트를 통해 여과하였다. 플라스크 및 셀라이트 패드를 추가의 0.01 N 중탄산암모늄 (10 mL)으로 세척한 후에, 합한 여과물 및 세척액을, 사전에 ~50% 수성 아세토니트릴 중 0.01 M 중탄산암모늄 ~200 mL에 이어서, 100% 물 중 0.01 M 중탄산암모늄으로 평형화한 역상 콤비플래쉬 칼럼 (15.5 g) 상에 로딩하였다. 칼럼을 용매 A 중 0-45% 용매 B로 용출하는 콤비플래쉬로 용출하였고 (용매 A: 100% 물 중 0.01 M 중탄산암모늄; 용매 B: 물 중 80% 아세토니트릴 중 0.01 M 중탄산암모늄), 생성물 함유 분획을 합하여 동결 건조시킴으로써 암모늄 염으로서 31 mg (75%)의 화합물 9 (M20)를 얻었다. LCMS-ESI ^- (m/z): [M-H]^- C₂₁H₂₂Cl₃F₃N₃O₉S에 대한 계산치: 690.01; 실측치: 690.27.　

M23의 제조

단계 1.

에탄올 (60 mL) 중 2,4,6-트리플루오로-3-메톡시벤즈알데히드 (10, 2990 mg, 15.7 mmol), 히드록실아민 히드로클로라이드 (1352 mg, 19.5 mmol) 및 아세트산나트륨 (1598 mg, 19.5 mmol)의 현탁액을 2.5 h 동안 실온에서 격렬하게 교반하였다. 현탁액을 물 (60 mL)로 희석하고, 1 h 동안 빙조에서 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고, 차가운 50% 수성 에탄올로 세척하고, 진공에서 밤새 건조시켜 2942 mg (91%)의 화합물 11을 수득하였다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.86 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.38 (td, J = 11.0, 2.2 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H). ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d ₆ ) δ -117.25 (dd, J = 10.9, 3.5 Hz), -125.34 (ddd, J = 11.9, 8.6, 3.6 Hz), -128.35 (dd, J = 8.5, 2.2 Hz). LCMS-ESI⁺ (m/z): [M+H]⁺ C₈H₇F₃NO₂에 대한 계산치: 206.04; 실측치: 206.00.

단계 2.

아세트산 (6 mL) 중 화합물 11 (601 mg, 0.98 mmol)의 용액을 65℃에서 교반하면서, 아연 분말 (1500 mg, 7.65 mmol)을 30 min에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 첨가 후에, 혼합물을 65℃에서 교반하였다. 1.5 h 후에, 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축 건조시켰다. 잔류물을 물 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 (x 1)로 세척하였다. 유기 분획을 2 방울의 아세트산이 함유된 물로 추출한 후에, 2종의 수성 분획을 합하여, 중성이 될 때까지 포화 수성 NaHCO₃으로 희석하고, 에틸 아세테이트 (~25 mL x 5)로 추출하였다. 추출물을 합하여, 건조시키고 (MgSO₄), 농축시켜 440 mg (79%)의 상응하는 조 아민 12를 얻었다. LCMS-ESI⁺ (m/z): [M+H]⁺ C₈H₉F₃NO에 대한 계산치: 192.06; 실측치: 191.86.

단계 3.

디클로로메탄 (1.5 mL) 중 상기 아민 12 (440 mg, 2.30 mmol)의 용액을 실온에서 교반하며, 그 동안 디클로로메탄 중 1 M 삼브로민화붕소 (7 mL, 7 mmol)를 첨가하였다. 2 h 후에, 추가의 디클로로메탄 중 1 M 삼브로민화붕소 (1 mL, 1 mmol)를 용액에 첨가하였다. 첨가 이후로 2 h 후에, 반응 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 메탄올 (15 mL)을 천천히 첨가하였다. 용액을 농축시키고, 잔류 오일을 메탄올 (~15 mL)로 용해시킨 다음 농축시키며, 이를 4회 반복하였다. 생성된 잔류물을 메탄올 중에 용해시키고, 빙조에서 교반한 후에, 트리에틸아민 (1.5 mL, 10.76 mmol)에 이어 디-tert-부틸 디카르보네이트 (593 mg, 2.72 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2 h 동안 0℃에서, 이어서 밤새 실온에서 교반하였다. 생성된 용액을 농축시킨 후에, 잔류물을 에틸 아세테이트 (~30 mL) 및 물 (~30 mL) 중에 용해시키고, 10% 시트르산으로 산성화시켰다. 2종의 분획을 분리하였고, 수성 분획을 에틸 아세테이트 (x 1)로 추출하였다. 유기 분획을 염수 (x 1)로 세척한 후에, 합한 유기 분획을 건조시키고 (MgSO₄), 농축시켰다. 잔류물을 헥산 중 0-100% EA로 용출하여 콤비플래쉬 (40 g 칼럼)에 의해 정제함으로써 530 mg (83%)의 화합물 13을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 6.70 (ddd, J = 10.3, 9.4, 2.3 Hz, 1H), 5.62 (br, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.37 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H). ¹⁹F NMR (376 MHz, 클로로포름-d) δ -125.17 - -126.42 (m, 1F), -132.92 - -134.28 (m, 1F), -137.39 (m, 1F). LCMS-ESI⁺ (m/z): [M-C₄H₈+H]⁺ C₈H₇F₃NO₃에 대한 계산치: 222.04; 실측치: 221.95.

단계 4.

디클로로메탄 (4.8 mL) 중 화합물 13 (530 mg, 1.91 mmol)의 용액을 0℃에서 교반하며, 그 동안 디옥산 중 4 M HCl (4.8 mL, 19.2 mmol)을 첨가하였다. 첨가 후에, 혼합물을 실온에서 교반하였다. 1.75 h 후에, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류 백색 고체를 톨루엔 (~20 mL x 2)과 함께 공증발시킨 다음에, 진공에서 밤새 건조시켜 399 mg (98%)의 조 아민 히드로클로라이드 염을 수득하였다.

디클로로메탄 (12 mL) 중 산 14 (600 mg, 1.87 mmol), 상기 아민 HCl 염 (399 mg, 1.87 mmol) 및 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 748 mg, 1.97 mmol)의 현탁액을 실온에서 교반하며, 그 동안 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.65 mL, 9.47 mmol)을 첨가하였다. 15 min 후에, 추가의 HATU (712 mg, 1.87 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (1.65 mL, 9.47 mmol) 및 DMF (3 m)를 혼합물에 첨가하였다. 첨가 이후로 15 min 후에, 용액을 농축시켜 대부분의 디클로로메탄을 제거하고, 잔류물을 메탄올 (25 mL)로 희석하였다. 생성된 용액을 1 h 동안 실온에서 교반한 후에, 이를 농축시켜 대부분의 메탄올을 제거하고, 에틸 아세테이트 (~70 mL)로 희석한 다음에, 수성 염화암모늄 (x 2), 수성 NaHCO₃ (x 2) 및 염수 (x 1)로 세척하였다. 수성 분획을 에틸 아세테이트 (~75 mL x 1)로 추출한 후에, 유기 분획을 합하여, 건조시키고 (MgSO₄), 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중 0-11% 메탄올로 용출하여 콤비플래쉬 (80 g 칼럼)에 의해 정제함으로써 647 mg (72%)의 화합물 6을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 10.32 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.65 (ddd, J = 10.7, 9.4, 2.2 Hz, 1H), 5.36 (dd, J = 9.6, 3.7 Hz, 2H), 4.68 - 4.53 (m, 3H), 4.25 (dd, J = 12.8, 3.8 Hz, 1H), 4.02 (dd, J = 13.0, 9.9 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H), 2.14 - 1.93 (m, 4H), 1.91 - 1.78 (m, 1H), 1.61 - 1.52 (m, 1H). ¹⁹F NMR (376 MHz, 클로로포름-d) δ -125.85 (d, J = 9.2 Hz), -132.78 (t, J = 10.6 Hz), -136.03 (d, J = 10.7 Hz). LCMS-ESI⁺ (m/z): [M+H]⁺ C₂₂H₂₁F₃N₃O₆에 대한 계산치: 480.14; 실측치: 480.27.　

단계 5.

아세토니트릴 (~10 mL) 중 화합물 6 (300 mg, 0.63 mmol)의 용액에 브로민화마그네슘 (299 mg, 1.63 mmol)을 실온에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 20 min 동안 50℃ 조에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 물 (100 mL) 및 디클로로메탄 (100 mL)으로 연화처리하였다. 현탁액을 빙조에 있는 동안 교반하고, 1 N HCl을 첨가하여 혼합물을 강산성 (pH, ~2)으로 만들었다. 불용성 생성물을 여과한 후에, 2종의 분획을 분리하고, 수성 분획을 디클로로메탄 (~100 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 분획을 건조시키고 (MgSO₄), 농축시키고, 디클로로메탄 중 0-20% 메탄올로 용출하여 콤비플래쉬 (24 g 칼럼)에 의해 정제하였다. 수득된 생성물을 이전에 수득된 고체 생성물과 합하여, 메탄올 중에 용해시키고, 여과하여 파편을 제거하고, 농축시켜 무정형 고체를 얻었다. 무정형 고체를 아세토니트릴 (~10 mL) 중에서 결정화시키고, 형성된 결정을 여과하고, 차가운 아세토니트릴로 세척하고, 진공에서 건조시켜 209 mg (72%)의 화합물 15 (M23)를 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.44 (s, 1H), 10.33 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 10.11 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.27 - 7.01 (m, 1H), 5.44 (dd, J = 9.6, 4.1 Hz, 1H), 5.09 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.67 (dd, J = 12.9, 4.1 Hz, 1H), 4.60 (s, 1H), 4.59 - 4.43 (m, 2H), 4.02 (dd, J = 12.7, 9.6 Hz, 1H), 1.93 (d, J = 5.1 Hz, 4H), 1.84 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 1.57 (dt, J = 12.2, 3.5 Hz, 1H). ¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d ₆ ) δ -127.13, -131.52 (t, J = 11.2 Hz), -134.59 (d, J = 11.4 Hz). LCMS-ESI⁺ (m/z): [M+H]⁺ C₂₁H₁₉F₃N₃O₆에 대한 계산치: 466.12; 실측치: 466.26.　

실시예 3: M15의 화학 구조의 확증

일반적 방법

모든 시간, 원심분리 속도, 온도 및 부피는 실험실 장비의 정상적인 정확도 제약으로 인해 근사치이다. 달리 나타내지 않는 한, 원심분리는 하기 표에 약술된 바와 같이 수행되었다.

표 1.

혈장

본 실시예에서 사용되는 혈장 샘플은 분석 전후에 대략 -70℃에서 보관되었다. 투약-후 8시간에 남성 인간 대상체로부터 수득된 혈장 샘플을 풀링하였으며, 중량 기준으로 0.4 g의 각각의 샘플을 포함하였다. 풀링된 샘플에서의 방사능을 액체 섬광 계수법 (LSC)에 의해 결정하였다.

대략 1 g의 풀링된 혈장 샘플을 3 mL의 아세토니트릴 (ACN) 중 0.2% (v/v) 포름산 (FA)과 합하고, 초음파처리하고, 볼텍스 혼합하고, 원심분리하여, 상청액을 제거하였다. 추출을 반복하였고, 각각의 상청액을 합하였다. 이중으로 분취물을 LSC에 의해 분석하여 추출 회수를 결정하였고, 이는 96.6%였다.

합한 상청액을 질소 하에 증발 건조시키고, 350 μL의 역삼투 물: 아세토니트릴 (ACN) 중 0.2% (v/v) 포름산 (FA): 메탄올: (4:1:2, v:v:v) 중에 재구성하였다. 샘플을 초음파처리하고, 볼텍스 혼합하고, 원심분리하여, 이중으로 분취물을 LSC에 의해 분석함으로써 재구성 회수를 결정하였고, 이는 104%였다. 재구성된 샘플을 LC-MS에 의해 분석하며, 용출액 분획을 고체 섬광체를 함유하는 96-웰 플레이트에 10초 간격으로 수집하였다. 각 웰에서의 방사능을 탑카운트 분석을 사용하여 결정하였고, 방사능 카운트에 기반하여 방사화학 프로파일을 생성하였다.

혈장 샘플과 M15 표준물의 코-크로마토그래피

40 μL의 풀링된 8시간 혈장 샘플을 40 μL의 M15의 표준 용액 (500 ng/mL)과 합하여 추가의 혈장 샘플을 제조하였다. 샘플을 하기 기기 및 조건을 사용하여 LC-MS에 의해 분석하였다:

대사물 확인

인간 혈장의 샘플을 LC-MS를 사용하여 분석하였고, 대사물 M15가 표준물과 동일한 성분인 것으로 확증되었다. 혈장 샘플의 분석으로부터의 M15의 구조, 모 질량 및 특징적 생성 이온이 표 2에 제시되어 있다. 대표적인 정확한 질량 데이터의 요약이 표 3에 제시되어 있다.

표준 용액 중 M15에 대한 추출 이온 크로마토그램이 도 2에 제시되어 있다. 풀링된 혈장 샘플 중 M15에 대한 라디오크로마토그램 및 추출 이온 크로마토그램이 도 3에 제시되어 있다. 표준물, 풀링된 혈장 샘플 및 공동-주입 샘플을 비교하는 추출 이온 크로마토그램이 도 4에 제시되어 있다. M15 및 표준물 M15가 동일한 성분임을 확증하기 위해, M15 표준 용액 및 인간 혈장 샘플을 별도로 분석하고, 공동-주입하였다. M15의 체류 시간은 개별적으로 분석될 때 M15 표준 용액 및 인간 혈장 샘플에서 각각 26.24 및 26.28분이었다 (도 1 및 도 2). M15 표준 용액 및 혈장 샘플이 공동-주입되었을 때, 도 4에 나타나 있는 바와 같이, 단일 피크가 26.28분의 체류 시간으로 관찰되었다.

M15의 표준 용액의 분석으로부터 입수된, M15의 대표 MS 선구 및 MS/MS 생성 이온 질량 스펙트럼이 도 5에 나타나 있다. MS 선구 이온 질량 스펙트럼은 m/z 626에서 양성자화된 분자상 이온을 나타낸다. MS/MS 생성 이온 질량 스펙트럼은 m/z 450, 289, 261 및 145에서 조각 이온을 나타낸다. 연구 샘플의 분석으로부터 입수된, 대사물 M15의 대표 MS 선구 및 MS/MS 생성 이온 질량 스펙트럼이 도 6에 나타나 있으며, MS/MS 생성 이온 질량 스펙트럼은 표준물의 것과 실질적으로 동일하다. 대사물 M15의 원소 조성이 정확한 질량 분석을 사용하여 확증되며, 표 3에 나타나 있다.

표 2.

표 3.

실시예 4: M20의 화학 구조의 확증

모든 시간, 원심분리 속도, 온도 및 부피는 실험실 장비의 정상적인 정확도 제약으로 인해 근사치이다. 달리 나타내지 않는 한, 원심분리는 실온에서 10분 동안 대략 2800 x g의 속도로 수행되었다.

용액

하기 용액이 샘플 제조 절차에 사용되었다.

혈장

투약-후 8시간에 남성 인간 대상체로부터 수득된 혈장 샘플을 풀링하였으며, 200 μL의 각각의 샘플을 포함하였다. 각각의 풀링된 샘플에서의 방사능을 액체 섬광 계수법 (LSC)에 의해 결정하였다.

풀링된 혈장 샘플을 3 mL의 아세토니트릴 (ACN) 중 0.2% (v/v) 포름산 (FA)과 합하고, 초음파처리하고, 볼텍스 혼합하고, 원심분리하여, 상청액을 제거하였다. 추출을 반복하였고, 각각의 상청액을 합하였다. 이중으로 분취물을 LSC에 의해 분석하여 추출 회수를 결정하였고, 이는 98.6%였다. 합한 상청액을 질소 하에 증발 건조시키고, 350 μL의 역삼투 물:메탄올:ACN 중 0.2% (v/v) FA (4:2:1, v:v:v) 중에 재구성하였다. 샘플을 초음파처리하고, 볼텍스 혼합하고, 원심분리하여, 이중으로 분취물을 LSC에 의해 분석함으로써 재구성 회수를 결정하였고, 이는 100%였다. 재구성된 샘플을 LC-MS에 의해 분석하며, 용출액 분획을 고체 섬광체를 함유하는 96-웰 플레이트에 10초 간격으로 수집하였다. 각 웰에서의 방사능을 탑카운트 분석을 사용하여 결정하였고, 방사능 카운트에 기반하여 방사화학 프로파일을 생성하였다.

혈장 샘플과 M20 표준물의 코-크로마토그래피

100 μL의 재구성된 8-시간 풀링된 혈장 샘플을 50 μL의 M20의 표준 용액과 합하여 추가의 샘플을 제조하였다. 생성된 샘플은 대략 1:1 비의 빅테그라비르:M20을 함유하였다. 샘플을 하기 기기 및 조건을 사용하여 LC-MS에 의해 분석하였다.

대사물 확인

표준물로서의 및 혈장 샘플에서의 M20의 구조, 모 질량 및 특징적 생성 이온이 표 5에 제시되어 있다. 대표적인 정확한 질량 데이터의 요약이 표 6에 제시되어 있다.

표준 용액 중 M20에 대한 추출 이온 크로마토그램이 도 7에 제시되어 있다. 풀링된 혈장 샘플 중 M20에 대한 추출 이온 크로마토그램 및 라디오크로마토그램이 도 8에 제시되어 있다. 표준물, 풀링된 혈장 샘플 및 공동-주입 샘플을 비교하는 추출 이온 크로마토그램이 도 9에 제시되어 있다. 표준 용액의 M20 및 M20이 동일한 성분임을 확증하기 위해, M20 표준 용액 및 인간 혈장 샘플을 별도로 분석하고, 공동-주입하였다. M20의 체류 시간은 개별적으로 분석될 때 M20 표준 용액 및 인간 혈장 샘플에서 각각 36.96 및 37.94분이었다 (도 9). M20 표준 용액 및 혈장 샘플이 공동-주입되었을 때, 단일 피크가 37.29분의 체류 시간으로 관찰되었다.

M20의 양성자화된 분자상 이온이 m/z 546에서 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). M20의 표준 용액의 분석으로부터 입수된, M20의 대표 생성 이온 질량 스펙트럼이 도 10에 나타나 있다. 질량 스펙트럼은 m/z 466 (SO₃의 상실), 307 (m/z 289 + 물), 289 및 161에서 생성 이온을 나타냈다. 인간 혈장 샘플로부터 입수된, M20의 대표 생성 이온 질량 스펙트럼이 도 11에 나타나 있으며, 표준물의 것과 실질적으로 동일하다. M20의 원소 조성이 표 6에 나타나 있는 바와 같이, 정확한 질량 분석을 사용하여 확증되었다.

표 5.

표 6.

실시예 5: BIC, M15, M20 및 M23의 인간 MRP2 억제 잠재력의 시험관내 평가

검정 방법론

빅테그라비르 및 그의 대사물 (M15, M20 및 M23)에 의한 간 유출 수송체 다중약물-내성 단백질 2 (MRP2; ABCC2)의 억제가 하기 검정에서 연구되었다. 수송체 억제 검정을 위한 세포 및 실험 조건은 하기 표 7에 요약되어 있다. BIC는, 예를 들어, WO 2014/100212에 기재된 절차에 따라 합성할 수 있다. M15, M20 및 M23은 본원에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 모든 다른 물질은 솔보 바이오테크놀로지(SOLVO Biotechnology)에서 구입하였고, 실험은 그의 인증된 ISO 9001:2008 시스템의 솔보 표준 작업 절차 (SOP)에 따라 수행하였다. 로트 및 제품 정보는 솔보 바이오테크놀로지에 의해 보고되었다.

표 7.

(E₂17βG) 에스트라디올-17베타-글루쿠로니드

막 소포에서의 수송의 억제

시험 화합물 및 양성 대조군을 막 소포 제제 (총 단백질: 50 μg/웰) 및 모델 기질과 함께 ATP의 부재 또는 존재 하에 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 15분 동안 사전인큐베이션하였다. 반응을, 별도로 사전인큐베이션한 25 μL의 12 mM MgATP 또는 AMP 검정 완충제 (배경 대조군용)의 첨가에 의해 시작하였다. 반응을 5 min 후에 200 μL의 빙냉 세척 완충제의 첨가에 의해 정지시키고, 96-웰 플레이트에 장착된 유리 섬유 필터 (필터 플레이트)를 통해 즉각적으로 여과하였다. 필터를 세척하고, 건조시키고, 여과된 소포 내부의 기질의 양을 액체 섬광에 의해 결정하였다. 양성 대조군 억제제도 병행하여 시험하였다. 수송체 발현이 결여된 대조군 막을 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 검정은 이중으로 수행하였다.

분율 수송 활성을 하기 방정식으로부터 계산하였다:

활성 % = (A-B) / (C-D) x 100

여기서 A는 TA 및 ATP의 존재 하에 전위된 기질의 양이고, B는 TA의 존재 하에 전위된 기질의 양이고, C는 용매 및 ATP의 존재 하에 전위된 기질의 양이고, D는 용매의 존재 하에 전위된 기질의 양이다.

수송체 검정에서의 IC₅₀ 결정

IC₅₀은 최대 수송체 특이적 수송을 50% 억제하는데 필요한 시험 물품 농도로서 정의된다. IC₅₀ 값은 그래프패드 프리즘 5 (캘리포니아주 샌디에고 소재의 그래프패드 소프트웨어 인크.(GraphPad Software Inc.))를 사용한 변수 힐 계수를 갖는 S자형 곡선에 대한 % 억제 대 농도의 비-선형 피팅을 사용하여 계산되었다. 시험된 최고 농도에서의 % 억제가 50% 미만이라면, IC₅₀은 결정되지 않았다. <20%의 상대 억제 결과 및 시험된 최고 농도 이하에서 농도 의존성 수송이 관찰되지 않는 경우에 대해서는 억제가 관찰되지 않음 (NIO)으로 보고된다.

억제 데이터가 표 8에 요약되어 있다. 각각의 검정에서 양성 대조군 벤즈브로마론은 200 μM에서 ≥ 99%의 억제를 나타냈다. BIC는 100 μM 이하의 농도에서 MRP2-매개 E₂17βG의 억제를 나타내지 않았다. M15 및 M20은 각각 256 μM 및 45 μM의 계산치 IC₅₀ 값으로, E₂17βG의 MRP2 매개 수송의 용량 의존성 억제를 나타냈다. M20의 경우에는 검정 완충제 중 300 μM의 최고 조사 농도에서 침전이 관찰되었다. M23은 100 μM의 최고 시험 농도에서 MRP2 매개 수송의 43% 억제를 나타냈다.

표 8.

실시예 6: BIC, M15, M20 및 M23의 인간 OATP 억제 잠재력의 시험관내 평가

검정 방법론

BIC 및 그의 대사물 (M15, M20 및 M23)에 의한 인간 흡수 수송체 유기 음이온-수송 폴리펩티드 1B1, 1B3 및 2B1 (OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1; SLC)의 억제가 하기 검정에서 연구되었다.

수송체 억제 검정을 위한 세포 및 실험 조건은 하기 표 9에 요약되어 있다. BIC는, 예를 들어, WO 2014/100212에 기재된 절차에 따라 합성할 수 있다. M15, M20 및 M23은 본원에 기재된 절차에 따라 제조하였다.

표 9.

(HEK293FT) SV40 거대 T 항원으로 형질전환된 급속 성장 인간 배아 신장 세포

(E₂17βG) 에스트라디올-17베타-글루쿠로니드

(E3S) 에스트론-3-술페이트

(MDCKII) 마딘 다르비 카닌 신장(Madin Darby Canine Kidney) 서브클론 II

프로브 기질로서 플루오-3을 사용하는 OATP1B1 및 OATP1B3 억제 검정

야생형이거나 또는 인간 OATP1B1 또는 OATP1B3을 코딩하는 유전자로 형질감염된, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 1,000 mg / L D-글루코스, L-글루타민, 25 mM HEPES 완충제 및 110 mg/L 피루브산나트륨, 1% Pen/Strep, 10% 태아 소 혈청, 0.05 mg / mL L-프롤린 및 0.5 mg / mL의 제네티신 G-418을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) 중에 유지하였다. 세포를 37℃, 90% 습도 및 5% CO₂로 설정된 인큐베이터에서 유지하였다. OATP1B1 또는 OATP1B3을 과다발현하는 CHO 세포를 바이오코트 폴리-D-리신 코팅된, 투명 바닥을 갖는 96 웰 블랙 세포 배양 플레이트에 1 x 10⁵개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 단백질 발현 수준을 증가시키기 위해 부티르산나트륨 (10 mM)을 OATP1B1 및 OATP1B3 세포에 첨가하고, 세포를 밤새 전면생장에 이르기까지 성장시켰다. 검정 완충제는 142 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 1.2 mM MgSO₄, 1.5 mM CaCl₂, 5 mM 글루코스 및 12.5 mM HEPES (pH 7.4)를 함유하였다. 배지의 제거 후 및 시험 화합물의 첨가 전에, 세포를 37℃ 검정 완충제로 2회 세척한 다음에, 검정 완충제와 함께 0.5 h 사전-인큐베이션하였다. 시험 화합물을 최종 시험 농도의 250배로 DMSO로 연속 희석하여 화합물 스파이킹 용액을 생성하였다. 이어서, 화합물을 2 μM 플루오-3을 함유하는 검정 완충제에 스파이킹하고, 1 h 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 플루오-3 및 시험 화합물을 함유하는 검정 완충제의 제거 이후, 세포를 200 μl의 빙냉 검정 완충제로 3회 세척한 다음, 1 mM CaCl₂ 용액 중 0.05% SDS를 함유하는 용해 완충제로 15분 동안 실온에서 용해시켰다. 기질 축적을 485 nm의 여기 및 530 nm의 발광에서의 플루오-3 형광으로 결정하였다.

프로브 기질로서 ³H-E₂17βG를 사용하는 OATP1B1 및 OATP1B3 억제 검정

HEK293FT-모의 및 OATP-형질감염된 세포 (각각 1x10⁵개 세포)를 검정 전 24 hr에 시딩하였다. 사전에 헹군 세포를 다양한 농도의 시험 화합물 또는 양성 대조군 리팜피신의 존재 하에 HK 완충제 중에 1 μM ³H-E₂17βG와 함께 3분 동안 인큐베이션하였다. 실험 후에 세포를 크렙스-헨셀라이트 완충제로 헹구고, 0.1 M NaOH로 용해시켰다. 세포 내부의 기질의 양을 액체 섬광 판독기에 의해 결정하였다.

OATP2B1 억제 검정

MDCKII-모의 및 OATP2B1-형질감염된 세포 (각각 1x10⁵개 세포)를 검정 전 24 hr에 시딩하였다. 사전에 헹군 세포를 다양한 농도의 시험 화합물 또는 양성 대조군 플루바스타틴의 존재 하에 HK 완충제 중에 0.2 μM ³H-E3S와 함께 2분 동안 인큐베이션하였다. 실험 후에 세포를 크렙스-헨셀라이트 완충제로 헹구고, 0.1 M NaOH로 용해시켰다. 세포 내부의 기질의 양을 액체 섬광 판독기에 의해 결정하였다.

OATP 억제 검정을 위한 데이터 분석

퍼센트 억제를 하기 방정식에 따라 계산하였다:

% 억제 = [1 - {[OATP]i - [WT]ni} / {[OATP]ni-[WT]ni}]*100

여기서:

[OATP]i는 OATP1B1, OATP1B3 또는 OATP2B1 세포에 대한 시험 화합물의 존재 하에서의 기질 축적을 나타내고;

[OATP]ni는 OATP1B1, OATP1B3 또는 OATP2B1 세포 각각에 대한 시험 화합물의 부재 하에서의 기질 축적을 나타내고;

[WT]ni는 야생형 세포 또는 모의 세포 각각에 대한 시험 화합물의 부재 하에서의 기질 축적을 나타낸다.

수송체 검정에서의 IC₅₀ 결정

IC₅₀은 실시예 5에 기재된 절차에 따라 결정되었다. 각각의 수송체에 대한 양성 대조군 억제제는 각각의 검정에서 >80%의 억제를 나타냈다. 검정된 BIC, M15, M20 및 M23의 최고 농도는 각각 100, 100, 300 및 100 μM이었다. IC₅₀은 <20%의 억제를 나타내거나 또는 용량 의존성 억제가 관찰되지 않는 화합물에 대해서는 결정되지 않았다. 그 결과는 NIO (상호작용이 관찰되지 않음)로서 보고된다.

BIC는 100 μM의 최고 시험 농도에서 OATP1B1-매개 에스트라디올-17베타-글루쿠로니드 (E₂17βG) 수송의 억제를 나타내지 않았다. BIC는 최고 시험 농도 100 μM에서 OATP2B1 세포에 의한 에스트론-3-술페이트 흡수의 17%를 억제하였다. BIC에 대한 데이터가 표 10에 요약되어 있다.

표 10.

M15는 100 μM의 최고 시험 농도에서 OATP1B1-매개 플루오-3 수송의 39% 억제를 나타냈고 OATP1B3-매개 수송의 억제는 나타내지 않았다. M15에 대한 데이터가 표 11에 요약되어 있다.

표 11.

M20은 100 μM의 최고 시험 농도에서 OATP1B1-매개 에스트라디올-17베타-글루쿠로니드 (E₂17βG) 수송의 12% 억제를 나타냈고 OATP1B3-매개 수송의 49% 억제를 나타냈다. M20은 100 μM에서 90.1 μM의 IC₅₀ 값으로 OATP1B1-매개 플루오-3 수송을 억제하였고, OATP1B3-매개 플루오-3 수송의 18%를 억제하였다. M20은 100 μM의 최고 시험 농도에서 OATP2B1 세포에 의한 에스트론-3-술페이트 흡수의 26%를 억제하였다. M20에 대한 데이터가 표 12에 요약되어 있다.

표 12.

*시험 화합물의 침전이 검정 완충제 중 300 μM 시험 농도에서 관찰되었다. 300 μM에서의 데이터는 IC₅₀ 값의 결정에 사용되지 않았다.

M23은 100 μM의 최고 시험 농도에서 99.9 μM의 IC₅₀ 값으로 OATP1B1-매개 플루오-3 수송을 억제하였고, 플루오-3 수송의 OATP1B3-매개 수송의 20%를 억제하였다. M23에 대한 데이터가 표 13에 요약되어 있다.

표 13.

종합하면, BIC는 100 μM 이하의 농도에서 OATP1B1, OATP1B3 및 OATP2B1-매개 수송에 대해 용량 의존성 억제를 나타내지 않았다. M15, M20 및 M23은 각각 >100, 90.1 및 99.9 μM의 IC₅₀으로 OATP1B1-매개 플루오-3 수송을 억제하였다. M15, M20 및 M23은 100 μM 이하의 농도에서 OATP1B3-매개 플루오-3 수송을 최소한 내지 0으로 억제를 나타냈다. M20은 OATP1B1-매개 E₂17βG 수송의 용량 의존성 억제를 나타내지 않았지만, OATP1B3-매개 E₂17βG 수송 및 OATP2B1-매개 에스트론-3-술페이트 수송 둘 다를 >100 μM의 IC₅₀으로 억제하였다. 최고 시험 농도에서의 ≤ 20%의 억제에 대해서는, IC₅₀ 값이 보고되지 않았다.

실시예 7: 인간 간 마이크로솜 빌리루빈 글루쿠로니드화에 대한 빅테그라비르 및 그의 대사물의 억제 잠재력의 시험관내 평가

본 실시예에서는, 빌리루빈 글루쿠로니드화에 의해 검정된, 인간 간 마이크로솜 UGT1A1의 촉매 활성을 감소시키는 빅테그라비르 및 그의 대사물 M15, M20 및 M23의 잠재력이 결정되었다. 본 검정에서, 빌리루빈 기질로부터의 효소-특이적 대사물 형성 속도가 빅테그라비르 및 그의 대사물의 존재 및 부재 하에 정량화되고, 그의 IC50 값이 결정되었다. 본 연구는 빅테그라비르 및/또는 그의 대사물이 다른 약물 및 내인성 화합물과 약동학적 상호작용을 진행할 잠재력이 있는지의 여부를 평가하는데 있어서 유용하다. 본 검정에서, 빌리루빈의 접합을 담당하는, 주요 인간 글루쿠로니드화 효소인 우리딘 디포스페이트 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1 (UGT1A1)의 활성에 대한 빅테그라비르 및 그의 대사물의 억제 효과가 시험관내에서 IC50 값을 결정하려는 의도로 평가되었다.

물질

BIC는, 예를 들어, WO 2014/100212에 기재된 절차에 따라 합성할 수 있다. M15, M20 및 M23은 본원에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 검정에 사용된 다른 시약은 아타자나비르 (온타리오주 노스 요크 소재의 토론토 리서치 케미칼스(Toronto Research Chemicals))를 제외하고는, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) (매사추세츠주 워번 소재)로부터 구입하였다. 인간 간 마이크로솜 분획은 비디 바이오사이언시스 (매사추세츠주 워번 소재)에 의해 제공되었다. 빌리루빈 기질은 검정을 시작하기 직전에 새로 제조하였다.

효소 억제 검정

빌리루빈은 UGT1A1에 의해 대사되어 2개의 아실 모노글루쿠로니드 및 아실 디글루쿠로니드를 생성한다. 표적 프로피오네이트 (C8 또는 C12) 중 어느 것이 먼저 대사되는지에 대한 뚜렷한 우선성은 없다. 아타자나비르가 이러한 활성의 강력한, 선택적 억제제인 것으로 입증되었으므로, 따라서 적절한 양성 대조군이다. 검정을 위한 조건은 마이크로솜 단백질 농도 및 인큐베이션 시간과 관련하여 선형으로 결정되었다. 검정 조건 하에 빌리루빈 모노글루쿠로니드 형성에 대한 K_M은 0.98 μM인 것으로 결정되었고, 여기서 사용된 0.8 μM의 기질 농도는 ≤ K_M이다. 마이크로솜 UGT1A1 활성은 이중으로 결정되었다. 최종 반응 혼합물은 0.2 mg/mL 간 마이크로솜 단백질, 100 μg 알라메티신/mg 마이크로솜 단백질, 5 mM UDP-글루쿠론산, 5 mM 염화마그네슘, 5 mM D-사카르산 1,4-락톤 (SACLAC), 0.8 μM 빌리루빈 및 0.1 M 인산칼륨 완충제 pH 7.4로 구성되었다. 희석된 마이크로솜 분획을 얼음 상에서 15분 동안 알라메티신, 염화마그네슘 및 SACLAC와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 기질 및 억제제를 첨가하고, 혼합물을 0.5분 동안 37℃로 가온하였다. 반응을 인산칼륨 완충제 중 UDP 글루쿠론산의 첨가에 의해 개시하였다. 인큐베이션을 진탕 하에 광 노출 없이 2분 동안 37℃에서 계속하였다. 반응을 내부 표준물로서 200 nM 2-(N-(2-에틸페닐)메틸술폰아미도)-N-(2-(피리딘-2-일티오)에틸)아세트아미드를 함유하는, 메탄올 중 200 mM 아스코르브산의 1 부피의 첨가에 의해 종결시켰다. 샘플을 4℃에서 5분 동안 3600 rpm으로 원심분리하고, 상청액의 분취물을 LC-MS/MS에 적용하여 빌리루빈으로부터의 모노글루쿠로니드 형성을 모니터링하였다.

액체 크로마토그래피 - 질량 분광측정법 (LC-MS)

분석을 위해 시마즈 UFLC XR UPLC 시스템을 사용하였다. 사용된 칼럼은 60℃에서 유지된 써모-하이퍼실 골드 1.9 μm C18 칼럼 (30 x 2.1 mm)이었다. 이동상 A는 0.1% (v/v) 포름산을 함유하는 물이고, 이동상 B는 0.1% (v/v) 포름산을 함유하는 아세토니트릴이며, 0.7 mL/분으로 펌핑되었다. 용출은 2분에 걸쳐 일련의 선형 구배에 의해 달성되었다. 질량 분광계는 양이온 모드로 작동하는 전기분무 인터페이스를 갖는 어플라이드 바이오사이언시스(Applied Biosciences) SCIEX QTRAP 5500 삼중 사중극자 질량 분광계였다. 정량화는 대사물/내부 표준물 피크 면적 비 (PAR)에 의해 이루어졌다. 오토샘플러에 보관되어 있는 추출된 샘플은 빌리루빈 글루쿠로니드 신호의 불안정성을 나타냈다. 손실은 ~0.1%/min이었다.

데이터 분석

LC-MS/MS 분석

빌리루빈 글루쿠로니드 표준물이 상업적으로 입수가능하지 않으므로, 빌리루빈 모노글루쿠로니드 및 디글루쿠로니드 피크는 그의 MS 특성에 의해 확인되었다. 모노글루쿠로니드 및 디글루쿠로니드에 대해 각각 m/z 761.2 / 475.1 및 937.2 / 475.1에서 MS/MS 전이 ([M+H]+)가 있다. 2개의 모노글루쿠로니드에 대한 PAR 값은 정량화를 위해 합하였다. 억제제의 존재 하에서의 PAR 값을 비히클 대조군 (빅테그라비르, M15, M20, M23 부재, 또는 양성 대조군 억제제)과 비교하였고, 활성을 유지된 대조군 활성의 백분율로서 나타내었다.

IC₅₀ 결정

반응 속도를 대사물의 형성 속도로부터 계산하여, 비히클 대조군 (100% 활성)으로 관찰된 것과 비교하였다. IC₅₀ 값은 그래프패드 프리즘 7.03 및 S자형 3 파라미터 억제 모델을 사용하여 비-선형 회귀에 의해 계산되었다. 시험 화합물에 의한 약한 억제는 유의미한 IC₅₀ 값을 생성하기 위해 모델의 하위 플래토 값 (UGT1A1이 완전히 억제될 때의 잔존 활성)을 제한할 필요가 있었다. 시험 기간 동안 아타자나비르의 억제 효력을 4회 결정하며, 각각의 결정에서 이중으로 각각의 농도를 시험하였다. 모든 실행으로부터의 데이터를 풀링하고, 전반적 피팅을 수행하여 하위 플래토 값을 결정하였다. 최적-피팅 값은 10.96% (표준 오차 2.94%) 활성 유지였다. 빅테그라비르 및 그의 대사물의 IC₅₀ 값을, 하위 플래토를 이 값으로 제한하여 비-선형 회귀에 의해 계산하였다. 아타자나비르의 경우에, 4회의 이중 실행으로부터의 IC₅₀ 값을 조합하여 상기 양성 대조군 억제제에 대한 요약 기하 평균 및 승법적 표준 편차를 생성하였다.

결과

인간 간 마이크로솜 빌리루빈 모노글루쿠로니드화의 활성에 대한 빅테그라비르, M15, M20 및 M23의 억제 효과가 평가되었다. 억제 효력 및 양성 대조군 억제제인 아타자나비르에 대한 것의 요약이 표 14에 제시되어 있다. 양성 대조군 억제제인 아타자나비르는 UGT1A1 활성을 예상된 바와 같이 감소시켰고, 이는 검정에서의 만족스러운 인큐베이션 조건을 확증한다 (표 1). 4회의 실행에 걸쳐 입수된 아타자나비르의 기하 평균 IC₅₀ 값은 1.2 μM이었다. 300 μM 이하의 빅테그라비르 및 그의 글루쿠로니드 대사물 (M15)의 농도는 UGT1A1 활성에 대한 억제 효과를 거의 또는 전혀 나타내지 않았다 (< 2%의 억제). 이들 2종의 시험 화합물의 고농도에서 효소 활성의 약간의 자극이 있었는데, 200 μM 빅테그라비르에서 76% 및 200 μM M15에서 21%의 피크 증가를 달성하였다. 빅테그라비르 대사물 M20 및 M23은 각각 153 및 256 μM의 IC₅₀ 값을 갖는 인간 간 빌리루빈 글루쿠로니드화의 약한 억제제였다.

표 14.

NIO 억제가 관찰되지 않음 (0 - 300 μM의 농도 범위에 걸쳐 < 2%의 억제)

a. 이중 실행으로의 4회 결정에서의 기하 평균 및 승법적 표준 편차.

b. 피팅이 수렴하지 않았다. 시험된 최대 농도는 300 μM이었다.

c. 8개의 이중 데이터포인트를 사용한 최적-피팅 값

300 μM 이하의 농도에서는 인간 간 마이크로솜 빌리루빈 글루쿠로니드화 (UGT1A1에 의해 촉매되는 활성)에 대한 빅테그라비르 또는 M15의 억제 효과가 거의 또는 전혀 없었다. M20 및 M23은 각각 153 μM 및 256 μM의 계산치 IC₅₀ 값을 갖는 약한 억제제였다.

실시예 8: 상이한 종으로부터의 동결보존된 간세포에서 검출된 BIC의 대사물

동결보존된 간세포를 방사성표지된 BIC와 함께 4시간 동안 인큐베이션하여, 대사물을 확인하고, 그의 존재비를 결정하며, 비임상 종과 인간을 비교하였다. 동결보존된 간세포에서의 [¹⁴C]BIC (20 μM)와의 인큐베이션 이후 모 약물 및 확인된 대사물의 백분율이 표 15에 요약되어 있으며, 그의 제시된 정체가 도 12에 나타나 있다. 대사 경로는 히드록실화 (3종의 변형체), N-탈알킬화 및 직접적인 글루쿠로니드화를 포함하였다. 모든 인간 대사물은 또한 비임상 종에서도 관찰되었다. 전 범위의 간 대사 효소가 대표되는 간세포 시스템을 사용하면, BIC의 대사가 원숭이 및 개에서는 광범위하지만, 래트 및 인간에서는 보다 적은 것으로 나타났다.

표 15.

^a 분석물 대사물 확인 번호는 그의 분자량에 상응하며, 예를 들어, M305 = 305 Da의 분자량을 갖는 대사물이다.

실시예 9. 상이한 종에서의 생체내 BIC 대사

마우스, 래트, 원숭이 및 인간에게 [¹⁴C]BIC를 단일 경구 투여한 이후에 빅테그라비르 대사를 결정하였다. [¹⁴C]BIC의 생체내 경구 투여 이후에 수득된 풀링된 혈장, 소변, 담즙 및 분변 샘플을 프로파일링하였고, 트랜스제닉 마우스, 위스타-한 래트, 원숭이 및 건강한 인간 대상체에서 확인된 대사물의 포괄적 목록을 제공하였다. 조합된 결과는 BIC가 주로 간 대사에 의해, 그 다음으로 분변 및 소변으로의 배출에 의해 제거된다는 것을 입증한다. 대사 경로는 히드록실화, 산화성 탈플루오린화, 직접적인 글루쿠로니드화 및 산화 후의 II상 접합을 포함하였다. 원숭이에서, BIC는 래트 및 인간과 비교하여 보다 높은 정도로 산화성 경로를 통해 대사되었다. [¹⁴C]BIC의 경구 투여 이후의 혈장 프로파일의 결과가 하기 표 16에 나타나 있다.

표 16.

ND = 검출되지 않음

^a AUC 풀링된 혈장 = 트랜스제닉 마우스의 경우에는 투약 후 제0 시점부터 48시간까지, 래트의 경우에는 투약 후 제0 시점부터 168시간까지, 원숭이의 경우에는 투약 후 제0 시점부터 72시간까지, 또한 인간 대상체의 경우에는 투약 후 제0 시점부터 72시간까지의 혈장 ¹⁴C 농도-시간 곡선하 면적.

^b 기타 = 기타 대사물의 합계; 각각의 성분이 마우스에서는 < 1%; 래트, 원숭이 및 인간에서는 < 1.5%임.

^c M51과 공동-용출됨.

공개, 특허 및 특허 문헌을 포함한 모든 참고문헌은 개별적으로 참조로 포함된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용은 다양한 실시양태 및 기술에 대한 참조사항을 제공한다. 그러나, 본 개시내용의 취지 및 범주 내에 유지되면서 많은 변경 및 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

실질적으로 단리된, M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 약 25 중량% 초과의 양으로 조성물에 존재하는 것인 조성물:
제2항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 약 50 중량% 초과의 양으로 조성물에 존재하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 약 75 중량% 초과의 양으로 조성물에 존재하는 것인 조성물.
약 95% 초과의 순도를 갖는, M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 제제:
M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물:
제6항에 있어서, 1 내지 3종의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
제7항에 있어서, 1 내지 3종의 추가의 치료제가 항-HIV 작용제인 제약 조성물.
제8항에 있어서, 1 내지 3종의 추가의 치료제가 각각 HIV 프로테아제 억제제, HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
치료 유효량의 M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 HIV 감염을 예방 또는 치료하는 방법:
제10항에 있어서, 치료 유효량의 1 내지 3종의 추가의 치료제를 인간에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 1 내지 3종의 추가의 치료제가 항-HIV 작용제인 방법.
제12항에 있어서, 1 내지 3종의 추가의 치료제가 HIV 프로테아제 억제제, HIV 비-뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오시드 리버스 트랜스크립타제 억제제, HIV 뉴클레오티드 리버스 트랜스크립타제 억제제, 및 HIV를 치료하기 위한 다른 약물, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염을 확인하는 것을 포함하는, 환자에 대한 빅테그라비르의 투여를 검출 또는 확증하는 방법:
제14항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장, 소변 또는 분변으로부터 유래되는 것인 방법.
빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, 환자에서의 빅테그라비르의 대사 속도를 측정하는 방법:
제16항에 있어서, 화합물의 양이 혈액 샘플로부터 측정되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 화합물의 양이 혈장으로부터 측정되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 화합물의 양이 소변 샘플로부터 측정되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 화합물의 양이 분변 샘플로부터 측정되는 것인 방법.
빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, HIV 감염의 치료에서의 빅테그라비르에 대한 환자의 예방적 또는 치료적 반응을 결정하는 방법:
빅테그라비르의 투여 후 1회 이상의 시점에 환자에서 M15, M20 및 M23으로부터 선택된 화합물 또는 그의 염의 양을 측정하는 것을 포함하는, 빅테그라비르를 사용한 치료를 필요로 하는 환자에 대한 빅테그라비르의 용량을 최적화하는 방법: