KR20200097714A - 세포내 박테리아 감염의 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포내 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이는 감염된 세포(들)를 항박테리아제 및 광감작제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포(들)를 상기 광감작제를 활성화시키는데 효과적인 파장의 광으로 조사하는 단계를 포함하되, 상기 항박테리아제는 세포(들)의 사이토졸로 방출되어, 상기 세포(들)에서 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지한다. 본 발명은 또한 관련된 용도, 및 이를 위한 조성물, 생성물 및 키트도 제공한다.

Description

세포 내 세균 감염 치료를 위한 조성물

방법

본 발명은 박테리아를 사멸하기 위해 항박테리아제를 도입하는 광화학적 내재화 방법을 사용하여 세포내 박테리아 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 감염, 예컨대 생체재료-관련 감염에서 발생하는 것들과 같이 치료가 어려운 치료에서 특별한 유용성을 갖는다.

박테리아 감염원(예를 들어, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli), 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus))의 세포내 생존은, 많은 감염성 질병의 악명 높은 원인이다(Abed & Couvreur, 2014, Int. J. Antimicrob. Ag., 43(6), p485-496; Xiong et al., 2014, Adv. Drug Deliver. Rev., 7, p63-76; Briones et al., 2008, J. Control Release, 125(3), p210-227). 예를 들어, S. 아우레우스는 매우 다양한 피부 또는 조직 감염, 뿐만 아니라 생명을 위협하는 침습성 질병, 예컨대 균혈증(bacteremia), 생체재료-관련 감염, 당뇨성 족부 감염, 심장내막염(endocarditis) 및 골수염(osteomyelitis)을 유발할 수 있다(Lew & Waldvogel, 2004, Lancet, 364(9431), p369-379; Busscher et al., 2012, Sci. Transl. Med., 4(153); von Eiff et al., 2002, Lancet Infect. Dis., 2(11), p677-685; Lipsky et al., 2004, Clin. Infect. Dis., 39(7), p885-910; Saginur & Suh, 2008, Int. J. Antimicrob. Agents., 32 Suppl 1, S21-25; Dhawan et al., 1998, Infect. Immun., 66(7), p3476-3479).

몇몇 시험관내, 생체내 및 임상 연구들에서, 대식세포 및 호중구가 S. 아우레우스가 숙주 면역 방어에서 생존하여 이를 피해 가기 위한 적소(niche)가 될 수 있다는 증거를 제공해왔다(Prajsnar et al., 2008, Cell Microbiol., 10(11), p2312-2325; Tan et al., 2013, Int. Forum Allergy Rh., 3(4), p261-266; Surewaard et al., 2016, J. Exp. Med., 213(7), p1141-1151; and Seral et al., 2003, Antimicrobial agents and chemotherapy, 47(7), p2283-2292). 게다가, 일부 조건 하에서는, 예컨대 의학 장치의 이식 후에는, 통상 감염성이 낮은 공생하는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)조차도, 대식세포에서 세포내 남아있을 수 있고, 건강한 세포 및 비감염된 조직에서 군집을 이룰 수 있다(Riool et al., 2014, Acta Biomater., 10(12), p5202-5212; Broekhuizen et al., 2008, Crit. Care Med., 36(8), p2395-2402; Broekhuizen et al., 2010, Infect. Immun., 78(3), p954-962; and Zaat et al., 2010, Future Microbiol., 5(8), p1149-1151). 그 결과, S. 아우레우스 및 S. 에피더미디스 또는 다른 박테리아 종들의 이들 세포내 저장고는 세포내 감염-관련 질병의 발생 또는 재발을 유발할 수 있다.

추가로 일부 박테리아는 포식소체(phagosome) 내에 있으면서, 이들 포식소체와 리소좀의 융합을 방지하는 것으로 알려져 있다. 이 전략을 채택하는 박테리아의 예는, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(파괴적이고 널리 퍼진 질병인 결핵의 원인) 및 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti)(Q-열병의 원인)를 포함한다.

대다수의 기존의 항생제가 제한된 세포내 활성을 갖기 때문에(Abed & Couvreur, 2014 supra; Xiong et al., 2014, supra; Briones et al., 2008, supra; Tulkens, 1991, Eur. J. Clin. Microbiol., 10(2), p100-106 and Carryn et al., 2003, Infect. Dis. Clin. N. Am., 17(3), p615-634), 세포내 감염은 통상적으로 치료하기가 매우 어렵다. 베타-락탐 항생제 및 아미노글리코시드는 진핵 세포에 대한 침투도가 낮고(Abed & Couvreur, 2014, supra; Tulkens, 1991, supra; Carryn et al., 2003, supra; Seral et al., 2003, J. Antimicrob. Chemoth., 51(5), p1167-1173; and Carryn et al., 2002, Antimicrob. Agents Ch., 46(7), p2095-2103), 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone) 및 마크롤라이드(macrolide)는 진핵 세포 막을 통과할 수 있기는 하지만, 이들은 세포내 보유도가 낮다(Seral et al., 2003, supra; and Seral et al., 2003, Antimicrob. Agents Ch., 47(3), p1047-1051). 리팜피신(Rifampicin)은 양호한 세포내 침투 능력을 갖지만, 단일 항생제로 사용될 때 내성 발생의 빈도가 매우 높아지는 경향이 있다. 따라서, 리팜피신과 다른 항생제의 병용 치료가 필수적이다(Forrest & Tamura, 2010, Clin. Microbiol. Rev., 23(1), p14-34). 그러나, 이러한 병용 치료조차도 세포내 감염을 제거하지 못할 수 있다(Burns, 2006, Scand. J. Infect. Dis., 38(2), p133-136). 낮은 세포내 농도는 감수성이 감소된 박테리아 세포에 대한 선별 조건을 제공하기 때문에(Baharoglu et al., 2013, Plos Genet., 9(4), e1003421), 세포내 감염원은 또한 특정 항생제에 대한 내성을 발생시킬 수도 있다.

리포좀, 중합체 마이크로-/나노입자, 및 세포내 활성이 좋지 않은 상이한 항생제들을 위한 생물학적 비히클에 기초한 몇몇 전달 시스템이 개발되어 왔다(Abed & Couvreur, 2014, supra; Xiong et al., 2014, supra; Lehar et al., 2015, Nature, 527(7578), p323-328; Randhawa et al., 2016, Appl. Microbiol. Biotechnol., 100(9), p4073-4083; and Brezden et al., 2016, J. Am. Chem. Soc., 138(34), p10945-10949). 그러나, 이러한 시스템 및 항생제 접합체를 개발하는 것은 매우 복잡하다.

다중-내성 박테리아에 대한 잠재적인 전략으로서, 항박테리아성 광역학적 치료(PDT)가 국부적인 감염, 예컨대 감염된 피부 상처에 사용되어 왔다(Maisch et al., 2004, Photoch. Photobio. Sci., 3(10), p907-917; and Liu et al., 2015, J. Clin. Transl. Research, 1(3), p140-167).

PDT 치료는 광과 조합한, 광감작성 제제(광감작제, PS)의 이용에 기초한다. PS는 박테리아의 세포질 막에 축적될 수 있고, 치료 부위에 조명을 비출 때 유도된 반응성 산소 반응에 의해 이들을 능동적으로 사멸시킬 수 있다. 그러나, 광감작제에 바로 근접한 박테리아만 사멸된다.

따라서, 세포내 박테리아를 사멸하기 위한 신규한 항생제 및/또는 새로운 기술이 긴급히 요구된다.

본 발명은 광화학적 내재화(PCI) 및 항박테리아제의 용도를 포함하는 세포내 박테리아를 사멸하는 새로운 방법을 제공한다. PCI는 예를 들어 몇몇 유형의 종양 치료를 위해 분자의 내재화를 위해 개발되었다(Selbo et al., 2010, J. Control. Release, 148(1), p2-12; and Hogset A, et al., 2004, Adv. Drug Deliver. Rev., 56(1), p95-115). PCI에서, 광감작제는 특히 식작용(endocytic) 소포의 막에 위치하며, 조명이 비춰질 때 이들 막을 (부분적으로) 파괴하여, 분자의 사이토졸 방출을 유발한다.

놀랍게도, 항박테리아제의 PCI가 세포내 박테리아를 사멸하기 위한 간단한 메커니즘을 제공한다는 것이 현재 밝혀졌다.

PCI 방법은 예를 들어 조명 시간 또는 광감작제 투여량을 감소시킴으로써, 과도한 독성 종 생산을 피하도록 그 방법이 적절히 조절되는 경우, 광범위한 세포 파괴 또는 세포 사멸을 발생시키지 않는 방식으로, 분자를 세포의 사이토졸로 도입하기 위한 메커니즘을 제공한다. 광화학적 내재화(PCI)의 기본적인 방법은, 본원에 참고로 포함된 WO 96/07432 및 WO 00/54802에 기재되어 있다. 이러한 방법에서, 내재화될 분자(본 발명에서는 항박테리아제일 것임), 및 광감작제는 세포와 접촉하게 된다. 광감작제 및 내재화될 분자는 세포 내에서 세포 막-함유 하위 구획(subcompartment)으로 흡수되는데, 즉 이들은 세포내 소포(예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀)로 내포화된다. 적절한 파장의 광에 세포가 노출될 때, 광감작제가 활성화되어, 세포내 소포의 막을 파괴시키는 반응성 산소 종을 직접 또는 간접적으로 생성한다. 이것은 내재화 분자가 사이토졸로 방출되도록 한다. 이러한 방법에서는, 대다수 세포의 기능 또는 생존가능성이 유해하게 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 이 방법은, 이것이 복잡한 방법이 아니고, 다양한 항박테리아제 및 상이한 표적 박테리아와 함께 사용될 수 있으므로 특히 유리하다. 이는 또한 종래의 방법에 필요한 것보다 더 낮은 농도의 항박테리아제의 사용을 허용하지만, 효과적인 항생제 효과를 달성한다. 이는 내성 발생을 방지한다. 추가로, 분자를 방출하는 조사(irradiation)의 타이밍 및 위치는 원하는 효과를 달성하는데 바람직한 시간 및 위치에만 방출되도록 조절될 수 있다. 이와 같이하여, 다양한 요소에 대한 세포의 노출이 최소화되고, 원치 않는 부작용이 최소화된다. 이는 다양한 요소들의 방출 타이밍과 위치를 제어할 수 없고, 고농도의 다양한 요소 및/또는 이들의 담체가 필요한, 항박테리아 치료에 대한 표준 기술과는 대조적이다.

박테리아 감염원의 세포내 생존에 관여하는 감염성 질병은, 인간 신체의 상이한 부위들(예를 들어 피부, 심부 조직, 요로 및 폐)에서 발생 또는 재발할 수 있다. 전문적인 식세포 외에, 비-전문적인(non-professional) 식세포, 예컨대 표피 세포, 내피 세포, 골아 세포 및 섬유 아세포도 또한 세포내 박테리아의 적소가 될 수 있다. 본 발명의 PCI 방법은 감염 부위 또는 세포내 박테리아가 서식하는 세포의 위치에 광을 적용함으로써, 특정부위에서 달성될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 방법은 피부(피하)의 피부 또는 점막 감염/손상, 예컨대 만성 상처, 궤양, 종기 및 당뇨성 족부 감염, 뿐만 아니라 경구 및 비강 감염, 예컨대 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis) 및 치주염(periodontitis)의 치료에 사용될 수 있고, 이 경우 감염 부위는 비교적 광에 접근 가능하다. 내부 장기(예를 들어, 폐) 또는 심부 조직 부위의 감염은, 예를 들어 광섬유 장치에 의해 투여된 광을 사용하여 치료될 수 있다.

본원의 실시예에 기재된 바와 같이, PCI의 사용과 함께 또는 그 부재 하의 세포내 스타필로코쿠스에 대한 항박테리아제의 항균 효능을, 마우스 대식세포에서는 시험관내에서 평가하였고, 스타필로코쿠스 감염을 연구하는데 적합한 전체 동물 시스템인 제브라피쉬 배아 모델을 사용하여 생체내에서 평가하였다(Prajsnar et al., 2008, supra; Veneman et al., 2013, BMC Genomics, 14, p255; and Prajsnar et al., 2012, Cell Microbiol., 14(10), p1600-1619). 본 발명자들의 최선의 상식에서, 이는 전체적으로 새로운 응용 분야, 즉 (세포내) 감염의 항생제 치료에 대한 PCI의 용도에 대한 첫 번째 교시이다.

이론에 구속되고 싶지는 않지만, 세포내 박테리아에 대항하는 항박테리아제의 광화학적 내재화(PCI)의 가능성 높은 메커니즘은, 첫 번째 단계에서, 항박테리아제 및 광감작제(PS) 및 선택적으로 박테리아의 세포내 흡수에 의존한다. PS는 항박테리아제를 함유하는 엔도좀/포식소체의 형성 동안 소포 막에 위치한다. 항박테리아제는 PS의 활성화에 의해(조명 시 엔도좀/포식소체의 막을 파괴함으로써) 사이토졸로 방출되며, 여기에서 이들은 (세포에 공동-내재화에 의해 존재하거나 이미 존재하는) 박테리아와 접촉하게 될 수 있다. PS는 또한 막으로부터 분리되어, 조명 기간 동안 항박테리아제 및/또는 박테리아를 함유할 수 있는 다른 엔도좀/포식소체에 재-국소화되고, 이로 인해 이들 엔도좀/포식소체 내의 박테리아/항박테리아제를 사이토졸로 방출시킬 수 있다. 또한, PCI 동안, 광감작제의 광-활성화에 의해 파괴된 소포들은 비손상된 다른 소포들과 세포내 융합하여, 심지어 추가적인 조명이 없을지라도 비손상된 소포들 또한 누출/파괴될 수 있다. 사이토졸 내에서 항박테리아제와 박테리아의 접촉은, 항박테리아제의 세포내 항박테리아성 작용이 가능하게 한다.

따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 세포내 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이는 감염된 세포(들)를 항박테리아제 및 광감작제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포(들)를 상기 광감작제를 활성화하는데 효과적인 파장의 광으로 조사하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 항박테리아제는 세포(들)의 사이토졸로 방출되어, 상기 세포(들) 내의 박테리아를 사멸, 손상시키거나 그 복제를 방지한다.

이 방법은 시험관내에서 실시될 수 있으나, 바람직하게는 생체내에서 실시되고, 상기 세포(들)는 대상체 내에 존재한다.

바람직하게는, 상기 방법(또는 본원에 기재된 용도)는 박테리아 내성의 발생을 방지한다. 이들은 항박테리아 또는 항생제 내성 박테리아에 대해 사용될 수 있다.

이러한 방법에서, 광감작제 및 항박테리아제는 각각 세포내 소포로 흡수되고; 세포에 조사될 때, 세포내 소포의 막이 파괴되어 분자를 세포의 사이토졸로 방출한다.

상이한 요소들은 서로 동일하거나 서로에 대해 상이한 세포내 소포로 흡수될 수 있다. 광감작제에 의해 생성된 활성 종은 이들이 함유된 소포를 넘어 연장될 수 있고/있거나 소포들이 합체되어, 파괴된 소포와 합체됨으로써 소포의 내용물을 방출시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본원에서 언급된 "흡수(taken up)"는, 흡수된 분자가 소포 내에 전체적으로 함유된다는 것을 의미한다. 세포내 소포는 막으로 경계를 이루며, 이는 내포작용(endocytosis)/식작용(phagocytosis) 이후 생성되는 임의의 이러한 소포, 예를 들어 엔도좀, 리소좀 또는 포식소체일 수 있다.

본원에서 사용된 "파괴된(disrupted)" 구획은, 그 구획에 함유된 분자를 방출하기에 충분한, 그 구획의 막의 무결성의 영구적 또는 일시적인 파괴를 지칭한다.

본원에서 정의된 "치료(treatment)"(또는 치료하는(treating))는, 치료 전의 증상에 비해 치료되는 박테리아 감염의 하나 이상의 증상이 감소, 완화 또는 제거되는 것을 지칭한다. 이러한 증상은 치료된 세포 및/또는 치료된 환자 또는 대상체에 존재하는 박테리아의 풍부성과 관련될 수 있다. 시험관내 방법에서의 치료는 세포(들) 내의 박테리아를 사멸, 손상시키거나, 이의 복제를 방지하는 것을 포함하고, 세포(들) 내의 생존 가능한 박테리아의 풍부성을 평가함으로써 결정될 수 있다. "예방(Prevention)"(또는 예방하는(preventing) 또는 예방(prophylaxis))은, 박테리아 감염의 증상의 발생을 지연 또는 방지하는 것을 지칭한다. 예방은 절대적일 수 있거나(박테리아 감염이 일어나지 않도록), 단지 일부 개체, 또는 세포에만, 또는 제한된 시간 동안만 효과적일 수 있다.

본원에서 언급된 "박테리아 감염(bacterial infection)"은, 그 부위에서 증식하고, 그 세포 또는 조직에 손상을 일으킬 수 있는 박테리아에 의한 세포(들) 또는 신체 조직의 침입이다. "감염된(infected)" 세포는, 그 세포에서 생존하고 잠재적으로 복제될 수 있는 한 종 이상의 세포내 박테리아를 함유한다. 바람직하게는 박테리아 감염은 본원에서 이하 기재된 박테리아, 바람직하게는 마이코박테리움, 슈도모나스, 대장균 및 스타필로코쿠스 속으로부터 선택된 박테리아에 의해 유발된다. 또한, 콕시엘라, 리스테리아(Listeria), 프란시셀라(Francisella) 및 리케차(Rickettsia) 속으로부터 선택된 박테리아에 의한 세포내 박테리아 감염이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 박테리아는 포자를 생산하지 않는다. 추가적인 바람직한 양태에서, 세포 내에서 나타나는 박테리아는 또한 바이오필름으로 존재하지는 않지만, 대안적인 선택 사항에서는 이들은 그렇게 나타날 수 있기도 한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법 및 용도에서, 감염은 뼈, 혈액, 심장, 요로, 폐, 피부 또는 점막 표면 또는 이와 연관된 세포에 존재한다. 따라서 일 양태에서, 치료될 박테리아 감염은 골수염, 균혈증, 결핵, Q-열병 및 심장내막염 및 피부(피하)의 피부 또는 점막 감염/손상, 예컨대 만성 상처, 궤양, 종기 및 당뇨성 족부 감염, 뿐만 아니라 경구 및 비강 감염, 예컨대 만성 비부비동염 및 치주염을 포함한다.

추가적인 바람직한 양태에서, 방법 또는 용도는 생체재료-관련 감염을 치료하기 위한 것이며, 치료될 세포는 대상체에 도입된 생체재료 상에, 또는 이에 인접하여 존재한다. 예를 들어, 생체재료-관련 감염은 임플란트 주위염(peri-implantitis)(치과 임플란트 주위의 감염) 일 수 있다. 생체재료가 대상체로부터 제거된 후 남아있는 세포내 박테리아 감염도 또한 치료될 수 있다. 이들의 삽입 및 관리에 모든 주의를 기울이더라도, 감염은 생체재료, 예컨대 의료 장치의 사용시 빈번한 합병증이다. 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피더미디스에 의한 감염이 특히 만연해있다. 생체재료의 감염은 치료에 대해 강한 내성을 갖는다. 항체의 연장된 적용이 필요하고, 많은 경우 예를 들어 영구 임플란트, 예컨대 보철 관절 또는 심장 판막이 관련된 경우 환자/대상체에 대해 극적인 결과를 가질 수 있는 생체재료는 제거되어야 한다. 심지어 제거된 이후에도, 감염된 부위에 서식하는 박테리아의 박멸은 연장된 항생제 처리(최대 6 개월일 수 있음)를 요구한다. 연구조사는 박테리아가 생체재료를 둘러싼 조직에 남아있다는 것을 보여주었다. 대식세포는 세포내 박테리아의 숙주로서 관여하며, 반복적인 감염을 위한 박테리아의 저장소를 유지한다. 본 발명의 방법 및 용도는 표적이 될 박테리아를 "은신(hiding)"시키는 것을 가능하게 한다.

본원에서 언급된 "생체재료(biomaterial)"는, 치료 목적으로 대상체에 도입될 수 있는 인공 재료 또는 장치이다. 이러한 생체재료는 (예를 들어, 정형외과, 심혈관, 요로, 외과적, 산부인과 또는 치과적 목적을 위한) 의료 장치, 기구, 도구 또는 장비, 보철 또는 재료, 조직 또는 상처 드레싱을 포함한다. 의료 장치는 심장박동 조절기(pacemaker), 심장 판막 및 스텐트를 포함하며, 의료 기구는 카테터를 포함하며, 보철 또는 재료는 인공관절, 임플란트(유방 및 치과 임플란트 포함), 뼈 고정 판 및 나사, 및 스케폴드 재료(예를 들어 외과적 메쉬)를 포함한다. 상처 드레싱은 상처 회복을 위해 사용될 수 있는 석고 및 붕대, 뿐만 아니라 시멘트, 접착제 또는 매트릭스를 포함한다. 본원의 이하에서 논의된 바와 같이, 항박테리아제 및/또는 광감작제는 생체재료 상에 또는 그 내부에 제공될 수 있다(예를 들어, 내부에 매립되거나 이에 침투될 수 있다).

"세포내(intracellular)" 박테리아 감염은, 박테리아가 세포로 흡수되어, 그 세포에서 생존하고 복제할 수 있는 감염을 지칭한다. 박테리아는 세포 외부에서 추가적으로 존재하고, 복제될 수 있다. 이러한 세포내 박테리아는 세포 내부의 어느 위치, 예를 들어 사이토졸 내에 또는 막-함유 하위구획, 예컨대 리소좀, 엔도좀 또는 포식소체에 존재할 수 있다. 본 발명에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 세포내 박테리아 감염의 예는, 마이코박테리움(예를 들어, M. 투베르쿨로시스), 슈도모나스(예를 들어, P. 애루기노사), 대장균(예를 들어, E. 콜리), 및 스타필로코쿠스(예를 들어, S. 아우레우스 또는 S. 에피더미디스)에 의한 감염을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 치료될 대상체는 소이고, 박테리아 감염은 S. 아우레우스 마스티티스(S. aureus mastitis)이다. 관심있는 다른 세포내 박테리아 감염은 리스테리아(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)), 프란시셀라(예를 들어, 프란시셀라 투라렌시스(Francisella tularensis)), 콕시엘라(예를 들어, C. 부르네티(C. burnetti)) 및 리케차에 의한 감염을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "세포(cell)" 또는 "세포들(cells)"은 배양체 또는 조직, 장기 또는 신체 내에 있을 수 있다. 따라서, 세포는 시험관내, 생체외에 제공될 수 있거나, 대상체 또는 생체 내에, 예를 들어 생체내 세포에 있을 수 있다. 용어 "세포"는 모든 진핵 세포(곤충 세포 및 진균 세포 포함)를 포함한다. 대표적인 "세포들"은 따라서 모든 유형의 포유류 및 비-포유류 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 진균 세포 및 원생동물을 포함한다. 그러나, 바람직하게는, 세포는 진핵 생물, 예를 들어 포유류, 파충류, 조류, 곤충 또는 어류 유래이다. 바람직하게는, 세포는 포유류, 특히 영장류, 사육 동물, 가축 또는 실험실 동물 유래이다. 특히 바람직하게는 세포는 포유류, 예를 들어 원숭이, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 유래의 세포이지만, 가장 바람직하게는 인간 유래의 세포이다.

감염된 세포는, 식세포 예컨대 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구일 수 있거나, "비-전문적인" 식세포, 예컨대 표피 세포, 내피 세포, 각질 세포, 골아세포 및 섬유아세포일 수 있다.

"항박테리아제(antibacterial agent)"는 시험관내 조건 하에서, 예를 들어 배양 조건 하에서 직접 접촉할 때, 선택된 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지할 수 있는 능력을 갖는 엔티티(entity)(예를 들어, 분자)이다. 박테리아는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같다. (본원에서 언급된 박테리아는 단수 및 복수형을 모두 지칭한다. 특히 이들은 표적화될 박테리아의 유형(즉, 각 박테리아에 적용될 수 있는 유형, 예를 들어 종)을 정의할 때는 단수형으로 지칭되며, 이들에게 실시될 수 있는 치료(즉, 다중 미생물의 치료)를 지칭할 때는 복수형으로 지칭된다.) 특히, 항박테리아 활성은 한 종 이상의 박테리아에 대한, 예를 들어 스타필로코쿠스 박테리아에 대한 MIC 또는 MBC 값을 결정함으로써 평가된다. 항박테리아 활성은 MIC 값, 최소 저해 농도(MIC)를 참고함으로써 결정될 수 있고, 이는 밤새 배양 이후 특정 액체 배지에서의 미생물의 시각적인 생장을 저해하는 항균제의 최소 농도로서 정의된다. 대안적으로, 항박테리아 활성은 이러한 배양 시기 동안 99.9%의 박테리아를 사멸하는 최소 농도인 최소 살균 농도(MBC)에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 항박테리아제는 바람직하게는 본원에 기재된 박테리아에 대해 50 μg/ml 미만, 바람직하게는 30 μg/ml 미만, 특히 바람직하게는 10, 5 또는 1 μg/ml 미만의 MIC 값을 갖는다.

바람직한 양태에서, 항박테리아제는 항생제이고, 즉 특정 박테리아(속 또는 종)를 선택적으로 치료한다.

항박테리아제는 아미노글리코시드(예를 들어, 아미카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 토브라마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신); 안사마이신(예를 들어, 겔다나마이신, 허비마이신 또는 리팍시민); 카르바세펨(예를 들어, 로라카르베프); 카르바페넴(예를 들어, 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴, 메로페넴); 세팔로스포린(예를 들어, 세파드록실, 세파졸린, 세팔렉신, 세파클로르, 셉프로질, 세푸록심, 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 셉포독심, 세프타지딤, 세프티악손, 세페핌, 세프타롤린 포사밀 또는 세프토비프롤), 글리코펩티드(예를 들어, 테이코플라닌, 반코마이신, 텔라반신, 달바반신 또는 오리타반신); 린코사마이드(예를 들어, 클린다마이신 또는 린코마이신); 리포펩티드(예를 들어, 답토마이신); 마크롤라이드(예를 들어, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 텔리트로마이신, 피닥소마이신 또는 스피라마이신); 모노박탐(예를 들어, 아즈트레오남); 니트로푸란(예를 들어, 푸르졸리돈 또는 니트로푸란토인); 옥사졸리디논(예를 들어, 리네졸리드, 포시졸리드, 라데졸리드 또는 토레졸리드); 페니실린(예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 아졸로실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린(G 또는 V), 피페라실린, 테모실린 또는 티카르실린); 폴리펩티드 (바시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B); 퀴놀론(예를 들어, 시프로플록사신, 엔플록사신, 가티플록사신, 게미플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 그레파플록사신, 스파르플록사신 또는 테마플록사신); 술폰아미드(예를 들어, 마페니드, 술파세타미드, 술파디아진, 실버 술파디아진, 술파디메톡신, 술파메티졸, 술파메톡사졸, 술파닐리미드, 술파살라진, 술피속사졸, 트리메토프림-술파메톡사졸 또는 술폰아미도크리소이딘); 테트라사이클린(예를 들어, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린 또는 테트라사이클린); 및 다른 항박테리아제, 예컨대 클로파지민, 답손, 카프레오마이신, 사이클로세린, 에탐부톨, 에티오나미드, 이소니아지드, 피라진아미드, 리팜피신, 리파부틴, 리파펜틴, 스트렙토마이신, 아르스페나민, 클로람페니콜, 포스포마이신, 푸시드산, 메트로니다졸, 무피로신, 플라텐시마이신, 퀴누프리스틴/달포프리스틴, 티암페니콜, 티게사이클린, 티니다졸 또는 트리메토프림; 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 특성에서, 항박테리아제는 아미노글리코시드(바람직하게는 겐타마이신), 글리코펩티드(바람직하게는 반코마이신) 또는 마크롤라이드(바람직하게는 본원에서 이전에 기재된 바와 같음)이다. 본원에 기재된 방법 및 용도에서, 선택적으로 하나 초과의 항박테리아제, 예를 들어 겐타마이신 및 리팜피신이 사용될 수 있다. 하나 초과의 제제(예를 들어, 둘 또는 세 개의 제제)가 사용될 때, 이들은 본 발명의 방법 및 용도에 대하여 본원에 기재된 바와 같이 동시에, 순차적으로 또는 별도로 사용될(예를 들어, 투여될) 수 있다.

본원에서 언급된 "광감작제(photosensitizing agent)"는, 제제가 적절한 파장 및 강도에서 조명을 받는 경우 활성화되어 활성화된 종을 생성할 때, 흡수광의 에너지를 화학 반응으로 바꿀 수 있는 화합물이다. 이들 공정의 고 반응성 최종 생성물은 세포- 및 맥관 독성을 생성할 수 있다. 편리하게는, 이러한 광감작제는 세포내 구획, 특히 엔도좀, 포식소체 또는 리소좀에 국소화하는 것들일 수 있다.

광감작제는 다양한 메커니즘에 의해 직접 또는 간접적으로 이들의 효과에 작용할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특정 광감작제는 광에 의해 활성화될 때 직접적으로 독성을 갖는 반면, 다른 것들은 독성 종, 예를 들어 산화하는 제제, 예컨대 단체 산소 또는 다른 반응성 산소 종을 생성하는 작용을 하며, 이들은 세포 물질 및 생체 분자, 예컨대 지질, 단백질 및 핵산에 대해 극히 파괴적이다.

이러한 광감작제의 범위는 당업계에 알려져 있고, 본원에 참고로 포함된 WO96/07432을 포함하는 문헌에 기재되어 있고, 본 발명의 방법 및 용도에 사용될 수 있다. 포르피린, 프탈로시아닌 및 클로린을 포함하는 많은 공지의 광감작제들이 있다(Berg et al., 1997, J. Photochemistry and Photobiology, 65, p403-409, 본원에 참고로 포함됨). 다른 광감작제는 박테리오클로린을 포함한다.

포르피린은 가장 널리 연구된 광감작제이다. 이들의 분자 구조는 메틴 다리를 통해 함께 연결된 4 개의 피롤 고리를 포함한다. 이들은 종종 금속-착체를 형성할 수 있는 천연 화합물이다. 예를 들어, 산소 전달 단백질 헤모글로빈의 경우에, 철 원자는 헴 B의 포르피린 코어에 도입된다.

클로린은 코어에서 4 개의 메틴 연결기를 통해 커플링된 3 개의 피롤과 하나의 피롤린으로 이루어진 큰 헤테로사이클릭 방향족 고리이다. 따라서, 포르피린과 달리, 클로린은 큰 방향족이지만, 고리의 전체 원주가 방향족은 아니다.

특히, 세포의 엔도좀, 포식소체 또는 리소좀에 위치하는 광감작제가 바람직하다. 따라서, 광감작제는 바람직하게는 리소좀, 포식소체 또는 엔도좀의 내부 구획으로 흡수되는 제제이다. 바람직하게는 광감작제는 내포작용 또는 식작용에 의해 세포내 구획에 흡수된다. 바람직한 광감작제는 양쪽 친매성 광감작제(예를 들어 디설폰화 광감작제), 예컨대 양쪽 친매성 프탈로시아닌, 포르피린, 클로린, 및/또는 박테리오클로린이고, 특히 설폰화(바람직하게는 디설폰화) 메소-테트라페닐 클로린, 포르피린, 프탈로시아닌 및 박테리오클로린을 포함한다. 바람직한 양태에서, 광감작제는 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 벤조포르피린, 리소좀 친화성 약염기, 나프탈로시아닌, 양이온성 염료, 테트라사이클린, 5-아미노레불린산 및/또는 이의 에스테르, 또는 상기 제제들 중 어느 것의 유도체, 바람직하게는 TPPS₄, TPPS_2a, AlPcS_2a, TPCS_2a, 5-아미노레불린산 또는 5-아미노레불린산의 에스테르, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된다. 특히, TPPS_2a(테트라페닐포르핀 디설포네이트), AlPcS_2a(알루미늄 프탈로시아닌 디설포네이트), TPCS_2a(테트라페닐 클로린 디설포네이트) 및 TPBS_2a(테트라페닐 박테리오클로린 디설포네이트), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 바람직하다. 바람직하게는, 광감작제는 TPCS_2a(디설폰화 테트라페닐 클로린, 예를 들어 Amphinex®)이다.

본원에서 사용된 "및/또는(and/or)"은, 존재하는 하나 또는 둘 다(또는 그 이상)의 언급된 선택사항을 지칭하는데, 예를 들어 A 및/또는 B는 선택사항 i) A, ii) B 또는 iii) A 및 B를 포함한다.

바람직한 광감작제의 구조는 이하에 제공된다:

화살표는 두 분자 간의 구조적 차이점을 나타낸다.

선택적으로, 광감작제는 광감작제의 흡수를 용이하게 하거나 증가시키는 작용을 할 수 있는 하나 이상의 담체 분자 또는 표적화 분자에 접착, 또는 연결 또는 접합될 수 있다. 따라서, 광감작제는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 광감작제는 접합체의 형태, 예를 들어 키토산-계 접합체, 예를 들어 본원에 참고로 포함된 WO2013/189663에 기재된 접합체로 제공될 수 있다.

본원에서 사용된 "접촉하는(contacting)"은, 방법에 사용된 세포(들) 및 다양한 요소들(또는 제제들)이 세포로 내재화 되는 적절한 조건 하에서, 예를 들어 바람직하게는 적절한 영양 배지 중 37℃에서, 예를 들어 25~39℃, 또는 생체내에서 서로 다른 것들과 물리적으로 접촉하게 되는 것을 지칭한다. 세포는 본원에서 정의된 방법에서 순차적으로 또는 동시에 광감작제 및 항박테리아제와 접촉될 수 있다. 편리하게는, 요소들은 세포(들)와 동시에 접촉되며, 바람직하게는 이하에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 세포(들)에 함께 적용된다. 상이한 요소들은 세포(들)에 의해 동일 또는 상이한 세포내 구획으로 흡수될 수 있다(예를 들어, 이들은 공동-이동(co-translocated)될 수 있음). 그러나, 대안적인 구현예에서 요소들은 함께 적용되지 않으며, 즉 상이한 시간에 및/또는 상이한 투여 경로에 의해 적용된다.

세포는 이후 적절한 파장의 광에 노출되어, 이후 세포내 구획 막의 파괴를 유발하는 광감적 화합물을 활성화한다.

(본원에 참고로 포함된) WO 02/44396는, 예를 들어 광감작제가 세포와 접촉하고, 내재화될 분자(항박테리아제의 경우)가 세포와 접촉하기 전에 이것이 조사에 의해 활성화되도록, 방법에서 단계들의 순서가 배열될 수 있는 방법을 기재한다. 이 방법은 조사 시, 내재화될 분자가 동일한 세포내 하위 구획 내에서 광감작제로서 존재할 필요가 없다는 사실을 이용한다.

따라서 일 구현예에서, 본원에서 정의된 상기 광감작제 및 상기 항박테리아제는 함께, 또는 서로 별도로 세포에 적용된다. 이후, 조사는 광감작제 및 항박테리아제가 동일한 세포내 구획에 나타나는 시점에 실시된다. 이것은 "후-조명(light after)" 방법으로도 지칭된다.

대안적인 구현예에서, 상기 방법은 먼저 상기 세포를 광감작제와 접촉시킨 후, 본원에서 정의된 바와 같이 사용될 항박테리아제와 접촉시킴으로써 실시될 수 있고, 조사는 광감작제가 세포내 구획으로 흡수된 후, 그러나 상기 항박테리아제가 상기 광감작제(예를 들어, 이들은 광노출 시 상이한 세포내 구획에 존재할 수 있음)를 함유하는 세포내 구획으로 세포내 흡수되기 전에, 바람직하게는 임의의 세포내 구획으로 세포내 흡수되기 전에, 예를 들어 임의의 세포내 흡수 이전에 실시된다. 따라서, 예를 들어 광감작제가 투여된 후 조사하고, 그 후 항박테리아제를 투여한다. 이것은 소위 "전-조명(light before)" 방법이다.

본원에서 사용된 "내재화(Internalisation)"는, 분자의 세포내, 예를 들어 사이토졸 전달을 지칭한다. 본 건에서, "내재화"는 세포내/막 결합 구획으로부터 세포의 사이토졸로의 분자의 방출 단계를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 "세포내 흡수(cellular uptake)" 또는 "이동(translocation)"은, 세포 막 외부의 분자가 세포에 도입되어, 이들이 예를 들어 세포내 막-제한된 구획, 예를 들어 소포체, 골지체, 리소좀, 엔도좀, 포식소체 등으로의 또는 이와 연관되는 내포작용, 식작용 또는 다른 적절한 흡수 메커니즘에 의해, 외부에 있는 세포막의 내부에서 발견되게 되는 내재화 단계들 중 하나를 지칭한다.

일반적으로, 방법은 이미 박테리아에 감염된 세포(들)에 대해 실시된다. 그러나, 방법은 또한 박테리아에 아직 감염되지 않은 세포(들), 또는 박테리아로 감염되는 과정에 있는 세포(들)에 대해서도 실시될 수 있다(이 경우, 상기 방법은 예방 방법임). 세포(들)가 감염되는 과정에 있을 때, 박테리아는 PCI 방법 동안 광감작제 및/또는 항박테리아제와 함께 흡수될 수 있다. 세포(들)가 아직 감염되지 않았을 때, 세포(들)는 감염의 위험이 있는 것으로 식별된 세포(들)일 수 있다(예를 들어, 세포내 감염의 가능성이 높은 부위에서, 예를 들어 장치가 사용될 때의 생체재료-관련 감염). 이 경우에, 상기 방법은 장치를 배치하기 직전에 관심 부위에서 실시될 수 있다.

세포가 상이한 제제들과 접촉하는 단계는, 임의의 편리하거나 원하는 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 접촉 단계가 시험관내에서 수행되는 경우, 세포는 편리하게는 예를 들어 적절한 세포 배양 배지와 같은 수성 배지에 유지될 수 있고, 적절한 시점에, 다양한 제제들이 적절한 조건 하에, 예를 들어 적절한 농도에서 적절한 시간 동안, 배지에 단순히 첨가될 수 있다. 예를 들어, 세포는 무-혈청 배지(serum-free medium)의 존재 하에서 혈청-함유 배지와 함께 제제와 접촉될 수 있다.

코멘트는 이하에서 세포에 대한 상이한 제제의 적용을 별도로 논의한다. 그러나, 상기 논의한 바와 같이 이들 제제는 함께, 별도로, 동시에 또는 순차적으로 세포에 적용될 수 있다. 본원에서 언급된, 본 발명의 방법 및 용도에 사용된 제제의 적용은 시험관내 또는 생체내에 세포에 대해 실시될 수 있다. 후자의 경우, 그 적용은 본원에서 이하 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 직접(즉 국소화된 또는 국부적인) 또는 간접(즉, 전신 또는 비-국소화된) 투여를 통해 이루어질 수 있다.

광감작제는 통상의 기술을 사용하여 당업계의 숙련자들에 의해 용이하게 결정될 수 있는 적절한 농도 및 적절한 시간 동안 세포와 접촉하게 되며, 사용된 특정 광감작제, 투여 모드, 치료의 과정, 환자/대상체의 연령 및 체중, 의학적 징후, 치료될 신체 또는 신체 부위와 같은 이러한 인자들에 따라 달라질 것이며, 선택에 따라서 변경되거나 조절될 수 있다. 광감작제의 농도는, 편리하게는, 예를 들어 이의 세포내 구획들 중 하나 이상으로 또는 이와 관련되어 일단 세포로 흡수되고 조사에 의해 활성화되면, 하나 이상의 세포 구조가 파괴되고, 예를 들어 하나 이상의 세포내 구획이 용해되거나 파괴되도록 한다.

예를 들어, 본원에 기재된 광감작제는 예를 들어 0.1 내지 50 μg/ml의 농도로 사용될 수 있다. 시험관내 사용을 위하여, 그 범위는 훨씬 더 넓어서, 예를 들어 0.0005~500 μg/ml일 수 있다. 생체내 인간 치료를 위하여, 광감작제는 전신 투여될 때, 0.05~20 mg/kg 체중의 범위에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 0.005~20 mg/kg 체중의 범위가 전신 투여에 사용될 수 있다. 전신 전달을 위하여, 제공된 총 투여량은 1~5000 μg, 예를 들어 10~2500, 25~1000, 50~500, 10~300, 25~200, 또는 100~300 μg의 수준 내에 있을 수 있다. 바람직하게는, 투여량은 100 μg, 150 μg, 200 μg 및 250 μg로부터 선택된다. 바람직하게는, 투여량은 75~125 μg, 예를 들어 100 μg이다. 예를 들어 국부적, 피내 또는 피하 투여에 의하여 국소적으로 투여되는 경우, 투여량은 0.001~500 μg 또는 0.1~500 μg, 예를 들어 0.001~0.1, 0.0025~1, 0.01~50, 0.0025~250, 1~250, 2.5~100, 2.5~40, 5~50, 1~30 또는 10~30 μg의 범위 내에 있을 수 있다. 국소적인 전달을 위하여, 바람직하게는 투여량은 10 μg, 15 μg, 20 μg 및 25 μg로부터 선택된다. 바람직하게는, 투여량은 7.5~12.5 μg, 예를 들어 10 μg이다. 제공되는 투여량은 평균 체중(즉, 70 kg)의 인간에 대한 것이다. 피내 주입을 위하여, 광감작제 투여량은 100 μl~1 ml에 용해될 수 있으며, 즉 농도는 0.01~50000 μg/ml 또는 1~50000 μg/ml의 범위 내에 있을 수 있다. 더 작은 동물에서는 농도 범위가 상이할 수 있고, 비록 국소적으로 투여될 때 상이한 동물들에 대해서 투여량의 변화가 거의 필요하지는 않지만, 이에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본원에서 정의된 항박테리아제의 농도는 또한 사용될 특정 분자, 투여 모드, 치료의 과정, 환자/대상체의 연령 및 체중, 의학적 징후, 치료될 신체 또는 신체 부위에 따라 달라질 것이며, 선택에 따라서 변경되거나 또는 조절될 수 있다.

예를 들어, 본원에 기재된 항박테리아제는 예를 들어 0.01 내지 50 μg/ml의 농도로 사용될 수 있다. 시험관내 사용을 위하여, 그 범위는 훨씬 더 넓어서, 예를 들어 0.0005~500 μg/ml일 수 있다. 생체내 인간 치료를 위하여, 항박테리아제는 전신 투여되는 경우 0.05~100 mg/kg 체중의 범위 내에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 0.005~100 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg의 범위가, 전신투여에 사용될 수 있다. 예를 들어, 국소, 피내 또는 피하 투여에 의해 국소적으로 투여되는 경우, 투여량은 1~50000 μg, 예를 들어 10~25000, 25~10000, 50~5000, 10~3000 또는 100~3000μg의 범위일 수 있다. 바람직하게는 투여량은 1 mg, 1.5 mg, 2 mg 및 2.5 mg로부터 선택된다. 바람직하게는, 투여량은 0.75~1.25 mg, 예를 들어 1 mg이다. 제공되는 투여량은 평균 체중(즉, 70 kg)의 인간에 대한 것이다. 피내 주입을 위하여, 항박테리아제 투여량은 100 μl~1 ml 중에 용해될 수 있어서, 즉 농도는 1~50000 μg/ml의 범위 내에 있을 수 있다. 더 작은 동물에서는 농도 범위가 상이할 수 있고, 비록 국소적으로 투여될 때 상이한 동물들에 대해서 투여량의 변화가 거의 필요하지는 않지만, 이에 따라 적절히 조절될 수 있다.

대부분의 경우에, 광감작제 및 항박테리아제는 함께 투여되지만, 이것은 달라질 수 있다. 따라서, 투여의 상이한 횟수 또는 모드 또는 부위(또는 세포와의 접촉)는, 상이한 요소들 각각에 대하여 고려될 수 있고, 이러한 방법들은 본 발명의 범주 내에 포괄된다.

일 구현예에서, 본원에서 정의된 항박테리아제는 광감작제와는 별도로, 예를 들어 별도의 제형으로, 또는 예를 들어 경구 투여를 통하여 전신으로 투여된다. 따라서, 일 구현예에서 항박테리아제 또는 광감작제는 각각 광감작제 또는 항박테리아제의 투여 전에, 예를 들어 최대 24 또는 48 시간 전에 투여될 수 있다. 바람직하게는 개별 투여들은 48, 24, 12, 8, 4 또는 2 시간 미만으로 나뉜다. 예로서, 광감작제는 먼저(예를 들어, 피부 광감작을 피하기 위해 국소적으로) 투여될 수 있고, 항박테리아제는 이후 전신으로 투여될 수 있다.

세포(들)와 본원에서 정의된 광감작제 및/또는 항박테리아제 간의 접촉은, 편리하게는 15 분 내지 24 (또는 48) 시간(예를 들어 15 또는 30 분 내지 4 시간, 예를 들어 1~2 시간) 동안이다. 접촉은 동시에 또는 순차적일 수 있거나, 별개의 요소들과의 접촉 타이밍이 중복될 수 있다. 접촉 단계는 문제가 된 제제와 세포(들)의 총 접촉 시간을 지칭하며, 그 접촉 시간은 구별되는 별도의 접촉 단계들의 수로 구성될 수 있다. 제제는 조사 단계 전의 기간 동안 세포(들)와의 접촉으로부터 제거될 수 있다. 시험관내 방법에서, 바람직한 양태에서, 각각의 제제에 대한 접촉 단계는 15 (또는 30) 내지 120 분일 수 있다. 생체내에서 유사한 접촉 시간이 사용될 수 있으나, 세포는 투여 직후에는 상기 제제와 접촉하지 않을 수 있고(예를 들어, 전신투여가 사용되는 경우), 이러한 경우에 제제는 조명 전에 충분히 투여될 필요가 있을 것이며, 따라서 상기 제제가 표적 세포에 도달하여, 본원에서 이하 더욱 상세히 논의된 바와 같이 필요한 접촉 시간 동안 이들 세포와 접촉한다.

바람직한 구현예에서, 세포의 초기 배양은 광감작제와 함께 한다. 일 구현예에서, 광감작제와 항박테리아제의 투여 사이의 시간은 겨우 몇 시간이다(a matter of hours). 예를 들어, 광감작제는 조명 전에 16 내지 20 (또는 40 내지 44) 시간, 예를 들어 18 시간 동안 적용될 수 있고, 항박테리아제는 조명 전에 1 내지 3 시간, 예를 들어 2 시간 동안 적용될 수 있다. 따라서, 광감작제와 항박테리아제의 투여 사이의 시간은 15 내지 23 (또는 47) 시간의 범위 내에 있을 수 있다. 이 타이밍은 어떤 제제가 먼저 투여되는지와는 무관하게 적용된다.

편리하게는, 세포(들)는 광감작제/항박테리아제와 접촉한 후 및 조사되기 전에, 광감작제 및 항박테리아제와의 배양 타이밍에 따라서 예를 들어 30 분 내지 4 시간, 예를 들어 1.5 내지 2.5 시간 동안, 광감작제/항박테리아제-불포함 배지에 배치될 수 있다.

생체내에서, 다양한 제제들이 표적 세포와 접촉하게 되는 배양의 적절한 방법 및 시간은, 인자들, 예컨대 투여 모드 및 사용되는 제제들의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 제제들이 처리/조사되거나, 국소적으로 적용될, 조직 또는 장기에 주입되는 경우, 상기 주입 또는 적용 지점 근처의 세포는 상기 제제와 접촉할 것이고, 이 때문에 상기 주입 또는 적용 지점에서 더 먼 거리에 위치하여 상기 제제와 더 나중의 시점에 더 낮은 농도로 접촉할 가능성이 있는 세포보다 더욱 신속하게 상기 제제를 흡수하는 경향이 있다. 편리하게는, 6~24 (또는 6~48) 시간의 시간이 사용될 수 있다.

추가로, 정맥내 주입에 의해 또는 경구적으로 투여되는 제제는 표적 세포에 도달하는데 어느 정도 시간이 걸릴 수 있으며, 따라서 이는 충분한 또는 최적 양의 제제가 표적 세포 또는 조직에 축적되도록 하기 위하여, 투여 후 좀 더 길게, 예를 들어 며칠이 걸릴 수 있다. 따라서, 생체내에서 개별적 세포에 대해 요구되는 투여 시간은 이들 및 다른 변수들에 따라 달라질 가능성이 있다.

그럼에도 불구하고, 비록 생체내 상황이 시험관내보다 더 복잡하기는 하지만, 본 발명의 기본 개념은 여전히 동일하며, 즉 분자가 표적의(즉, 감염된) 세포와 접촉하게 되는 시간은 조사가 일어나기 전에, 적절한 양의 광감작제가 표적 세포에 의해 흡수되었고, 이하의 것들 중 하나가 되도록 해야 한다: (i) 조사되기 전에 또는 그 동안 항박테리아제는 흡수되었거나, 표적 세포들과 충분히 접촉한 후에 세포로, 예를 들어 광감작제와 동일한 또는 상이한 세포내 구획으로 흡수되거나 (ii) 조사 후에, 항박테리아제는 이들이 세포에 흡수되도록 하기에 충분한 기간 동안 세포와 접촉한다.

본원에서 기재된 제제의 생체내 투여를 위하여, 당업계에서 통상적이거나 표준인 임의의 모드의 투여, 예를 들어 경구, 비경구(예를 들어 근육내, 경피적(transdermal), 피하, 경피적(percutaneous), 복강내, 경막내 또는 정맥내), 장내, 구강, 직장 또는 국부적, 내부 및 외부 신체 표면 모두 등이 사용될 수 있다. 생체내 사용을 위하여, 본 발명은 광감작제 함유 화합물 또는 항박테리아제가 국소화되는 세포를 함유하는 임의의 조직(체액 위치 포함), 뿐만 아니라 고형 조직과 관련하여 사용될 수 있다. 모든 조직들은 광감작제가 표적 세포에 의해 흡수되는 한 치료될 수 있으며, 광은 적절하게 전달될 수 있다. 투여의 바람직한 모드는 피내, 피하 또는 국부적인 투여 또는 주입이다. 바람직하게는, 투여는 국부적이다(또한 본원에서 국소 투여라고도 지칭됨).

투여는 치료/예방 방법 시 필요한 제제들을 세포(들)에 적용함으로써 이루어질 수 있거나(예를 들어, 환자/대상체에 대한 투여), 하나 이상의 필요한 제제들이 느린 또는 (요구될 때) 조절된 방출을 허용하는 제형으로 제공될 수 있고, 이후 치료/예방 단계가 뒤따를 수 있다. 예를 들어, 항박테리아제 및/또는 광감작제는 환자/대상체에서 사용될 생체재료 상에 또는 그 내부에 제공될 수 있다(예를 들어 그 내부에 매립되거나 침윤될 수 있다). 이러한 제제는 시간의 경과에 따라 천천히 방출되거나, 요구될 때 방출될 수 있으며, 치료/예방 단계는 (선택적으로, 생체재료 중에/상에 존재하지 않는 경우, 필요한 제제 중 하나의 투여와 함께) 조사에 의해 개시된다. 편리하게는, 타이밍 및 투여량을 평가할 때, 이러한 투여는 국소적 투여로 간주된다.

원하는 결과, 즉 박테리아 감염의 치료 또는 예방을 달성하기 위하여, 방법 또는 이의 일부가 반복될 수 있다. 따라서, 방법은 전체로서 적절한 간격 후에 다수의 횟수(예를 들어, 2 회, 3 회 또는 그 이상의 횟수)로 실시될 수 있거나, 상기 방법의 일부, 예를 들어 본원에서 정의된 항박테리아제 및/또는 광감작제의 추가적인 투여 또는 추가적인 조사 단계가 반복될 수 있다. 예를 들어, 방법 또는 상기 방법의 일부는 이들이 처음 실시된 후 며칠 만에(matter of days), 예를 들어 5 내지 60 일(예를 들어 7, 14, 15, 21, 22, 42 또는 51 일), 예를 들어 7 내지 20 일, 바람직하게는 14 일 후에, 또는 몇 주 만에(matter of weeks), 예를 들어 1 내지 5 주(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 주) 다시 실시될 수 있다. 방법의 모두 또는 일부는 여러 번, 적절한 시간 간격으로, 예를 들어 2 주 또는 14 일마다 반복될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 1 회 반복된다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 2 회 반복된다.

광감작제를 활성화하는 "조사(Irradiation)"는, 본원에서 이하 기재된 바와 같이 직접적으로 또는 간접적으로 광을 투여하는 것을 지칭한다. 따라서, (대상체 내에 존재할 수 있는) 세포(들)는 광원에 의해, 예를 들어 직접적으로(예를 들어, 시험관내 단일 세포 상에서) 또는 간접적으로, 예를 들어 생체내에서 세포가 피부 표면의 아래에 있거나, 이들 모두가 직접적으로 조명된 것은 아닌 세포의 층의 형태인 경우, 즉 다른 세포들의 스크리닝 없이 조명 처리될 수 있다. 세포 또는 대상체의 조명은 본원에서 정의된 방법에서 사용하기 위한 다양한 요소들이 투여된 지 대략 15 분 내지 24 (또는 48) 시간 후에 비춰질 수 있다. 시험관내 방법에서, 조명은 예를 들어 투여 후 15 내지 120 분에 발생할 수 있는 반면, 생체내 방법에서는 대상체 내의 표적 세포와의 접촉 시간이 (투여 경로에 따라) 즉각적이지 않는 경우, 투여 후 더 긴 시간, 예를 들어 투여 후 15 분 내지 24 (또는 48) 시간이 필요할 수 있다.

광감작제를 활성화하기 위한 광 조사 단계는 당업계에 잘 알려진 기술 및 과정을 따라서 일어날 수 있다. 투여량, 파장 및 조명의 지속은, 광감작제를 활성화하기에, 즉 반응성 종을 생성하기에 충분해야 한다.

사용될 광의 파장은, 사용될 광감작제에 따라 선택된다. 적합한 인공 광원은 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 청색(400~475 nm) 또는 적색(620~750 nm) 파장 광을 사용한다. TPCS_2a에 대해서는, 예를 들어, 400 내지 500 nm, 더욱 바람직하게는 400 내지 450 nm, 예를 들어 430~440 nm, 더욱 더 바람직하게는 대략 435 nm, 또는 435 nm의 파장이 사용될 수 있다. 적절한 광감작제, 예를 들어 포르피린 또는 클로린이 녹색 광에 의해 활성화될 수 있는 경우, 예를 들어 KillerRed (Evrogen, Moscow, Russia) 광감작제는 녹색 광에 의해 활성화될 수 있다.

적합한 광원, 예를 들어 PCI Biotech AS 사의 LumiSource® 램프가 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 최대 60 mW의 조절 가능한 출력 전력 및 430~435 nm의 방출 스펙트럼을 갖는 LED-기반 조명 장치가 사용될 수 있다. 적색광에 대해서는, 조명의 적절한 공급원은 PCI Biotech AS 652 nm 레이저 시스템 SN576003 다이오드 레이저이지만, 임의의 적합한 적색광이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법들에서 세포가 광에 노출되는 시간은 달라질 수 있다. 분자가 사이토졸로 내재화되는 효율은, 광에 대한 노출이 그 이상이 되면 세포가 손상되고 이 때문에 세포 사멸이 증가하는 최대치까지 증가함에 따라, 증가된다.

조사 단계에 대한 바람직한 시간의 길이는, 인자들, 예컨대 표적, 광감작제, 표적 세포 또는 조직 내에 축적된 광감작제의 양, 및 광감작제의 흡수 스펙트럼과 광원의 방출 스펙트럼 사이의 중복에 따라 달라진다. 일반적으로, 조사 단계에 대한 시간의 길이는 초 내지 분, 또는 최대 몇 시간(심지어 최대 12 시간)의 수준, 예를 들어 바람직하게는 최대 60 분, 예를 들어 0.25 또는 1 내지 60 분, 예를 들어 5 내지 60 분, 바람직하게는 10 내지 20 분 동안, 바람직하게는 15 분 동안이다. 예를 들어 더 높은 투여량의 광감작제가 사용된 경우, 더 짧은 조사 시간, 예를 들어 1 내지 60 초, 예를 들어 10~50, 20~40 또는 25~35 초도 사용될 수 있다.

적절한 광선량은 당업계의 숙련자들에 의해 선택될 수 있고, 다시 사용된 광감작제 및 표적 세포(들) 또는 조직에 축적된 광감작제의 양에 따라 달라질 것이다. 더 높은 흡광 계수의 가시광 스펙트럼을 갖는 광감작제가 (예를 들어, 사용된 광감작제에 따라서 적색 부위에, 또는 청색광이 사용되는 경우 청색 부위에) 사용될 때는, 광선량은 통상 더 낮다. 최대 60 mW의 조절 가능한 출력 전력 및 430~435 nm의 방출 스펙트럼을 갖는 LED-기반 조명 장치가 이용될 때, 예를 들어, 0.05~20 mW/cm²의 영향 범위, 예를 들어 2.0 mW/cm²에서의 0.24~7.2 J/cm²의 범위의 광선량이 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 LumiSource® 램프가 이용될 경우, 0.1~20(예를 들어, Lumisource®에 의해 제공될 때는 13) mW/cm²의 영향 범위에서의 0.1~6 J/cm² 범위의 광선량이 적절하다. 적색광에 대해서는, 예를 들어 0.3 J/cm², 0.1~5 mW/cm², 예를 들어 0.81 mW/cm²의 영향 범위에서 0.03~1 J/cm², 예를 들어 0.3 J/cm²의 광선량이 사용될 수 있다.

추가로, 세포 생존성이 유지될 경우, 과도한 수준의 독성 종의 생성은 피할 것이고, 관련 변수는 이에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 방법들은 광화학적 치료로 인해, 즉 광감작제의 활성화시 독성 종의 발생을 통한 광역학적 치료 효과에 의하여, 불가피하게 일부 세포에 손상을 일으킬 수 있다. 제안된 용도에 따라, 이러한 세포 사멸은 중요하지 않을 수 있고, 사실 일부 박테리아-감염된 세포를 제거하는데 유리할 수도 있다. 그러나, 대부분의 구현예에서는, 세포 사멸이 회피되어, 예를 들어 항박테리아 효과가 발생하게 된다. 본 발명의 방법들은 변경될 수 있어서, 생존하는 세포의 분율 또는 비율은 광감작제의 농도 또는 투여량과 관련하여 광선량을 선택함으로써 조절된다. 다시, 이러한 기술은 당업계에 알려져 있다.

바람직하게는, (치료된 것들 중) 실질적으로 모든 세포, 또는 상당한 다수(예를 들어, 세포의 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80, 85, 90 또는 95% 이상)는 사멸되지 않는다. PCI 처리 이후의 시험관내 세포 생존성은 당업계에 공지된 표준 기술, 예컨대 MTS 시험에 의해 측정될 수 있다. 하나 이상의 세포 유형의 생체내 세포 사멸은, 투여 지점의 1 cm 반경 내에서 (또는 조직의 특정 깊이에서), 예를 들어 현미경에 의해 평가될 수 있다. 세포 사멸이 즉각적으로 발생하지 않을 수 있으므로, 세포 사멸(%)은 조사 몇 시간 이내(예를 들어, 조사 후 최대 4 시간)에 생존 가능하게 남아있는 세포의 퍼센트를 지칭하지만, 바람직하게는 조사한지 4 시간 이상 후에 생존 가능한 세포(%)를 지칭한다.

PCI는 항박테리아제가 세포(들)의 사이토졸로 방출하도록 허용한다. 제제는 이후 박테리아와 상호작용하여, 박테리아를 사멸 또는 손상시키거나, 이의 복제를 방지할 수 있다.

"사멸(Kill)"은 추가로 복제가 발생할 수 없는 정도로 박테리아가 파괴된 것을 지칭한다. "손상(Damage)"은 박테리아가 정상적으로 기능하는 능력에 영향을 주어, 이것이 사멸하거나 복제를 못하게 할 수 있는 것을 지칭한다. "복제를 방지하는(Preventing replication)"은, 예를 들어 본원에서 이하 기재된 백분율에 따른 박테리아 복제의 부분적 또는 완전한 방지를 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 방법, 처리 또는 용도는 처리가 적용된 박테리아의 적어도 25, 50, 75 또는 90%의 사멸 또는 손상을 발생시키거나, 박테리아 감염이 예를 들어 미처리된 대조군에 비해 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 예방 또는 감소되도록 복제를 방지한다.

상기 방법은 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 실시될 수 있다. 바람직하게는 상기 방법은 생체내에서 사용된다.

시험관내 방법에서 사용될 때, 본 발명의 방법은 대안적으로 세포(들)에서 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지하는 시험관내 방법으로서 기재될 수도 있는데, 이는 세포(들)를 항박테리아제 및 광감작제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포(들)를 광감작제를 활성화시키기에 충분한 파장의 광으로 조사하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 항박테리아제는 세포(들)의 사이토졸로 방출되어, 상기 세포(들)에서 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지한다. 상기 기재된 바람직한 양태들도 또한 이 방법에 적용된다.

생체내에서 사용될 때, "대상체(subject)"는 포유류, 파충류, 조류, 곤충 또는 어류를 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 포유류, 특히 영장류 (바람직하게는 인간), 사육 또는 반려 동물, 가축 또는 실험실 동물이다. 따라서, 바람직한 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 고양이, 개, 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양 및 말을 포함한다.

편리하게는, 광감작제 및 항박테리아제는 조성물 중에 제공될 수 있다. 대안적으로 이들은 별개의 용액 또는 조성물 중에 있을 수 있어서, 투여 또는 적용을 위한 상이한 메커니즘 또는 타이밍이 가능하게 된다. 본원에서 언급된 "병용-투여(co-administration)" 및 "공동-적용(co-application)"은, 동시 사용(타이밍의 관점에서 또는 동일한 조성물 중에서 중 어느 하나)보다는 오히려, 동일한 방법에서의 양쪽 요소의 사용을 지칭한다.

본 발명의 대안적인 기술에서, 본 발명은 또한 대상체에서 세포내 박테리아 감염을 치료하는 용도를 위한, 본원에서 이전에 정의된 항박테리아제, 및 본원에서 이전에 정의된 광감작제, 또는 본원에서 이후 정의된 바와 같은 항박테리아제 및 광감작제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 바람직하게는 상기 용도는 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 바람직하게는 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 방법에 의해 대상체에서 세포내 박테리아 감염의 치료용 약제를 제조하기 위한, 본원에서 이전에 정의된 항박테리아제 및/또는 본원에서 이전에 정의된 광감작제의 용도를 제공한다.

또한, 항박테리아제 및 항박테리아용으로서의 광감작제의 용도도 제공하는데, 여기에서 바람직하게는 상기 제제는 이전에 본원에 기재되었으며, 본원에 기재된 방법에 따라 사용된다.

본 발명은 바람직하게는 치료에 사용하기 위한, 본원에서 이전에 정의된 항박테리아제 및 본원에서 이전에 정의된 광감작제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 조성물은 추가로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물의 형태일 수 있다.

이들 조성물(및 본원에서 이하 기재된 본 발명의 생성물)은, 약학 분야의 선행 기술에 공지된 기술 또는 과정에 의한 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다. 조성물은 느린 또는 지연된 방출 조성물로서 제형화될 수 있다. 본원에서 언급된 "약학적으로 허용가능한(Pharmaceutically acceptable)"은, 조성물(또는 생성물)의 다른 성분들과 양립 가능할 뿐만 아니라 수용체에 대해 생리학적으로 허용가능한 성분을 지칭한다. 조성물의 특성 및 담체 또는 부형제 물질, 투여량 등은, 선택사항, 투여의 원하는 경로, 치료의 목적 등에 따라 통상의 방식으로 선택될 수 있다. 마찬가지로, 투여량은 통상의 방식으로 결정될 수 있고, 분자(또는 조성물 또는 생성물의 요소)의 특성, 치료 목적, 환자/대상체의 연령, 투여의 모드 등에 따라 달라질 수 있다. 광감작제와 관련하여, 조사 시 막을 파괴시키는 효능/능력도 또한 고려되어야 한다.

본 발명은 또한 대상체에서 세포내 박테리아 감염을 치료하기 위해 동시, 별도 또는 순차로 사용하기 위한 조합된 제제로서, 본원에서 이전에 정의된 항박테리아제, 및 본원에서 이전에 정의된 광감작제를 포함하는 생성물을 제공한다.

최종적으로, 본 발명은 대상체에서 세포내 박테리아 감염을 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공하는데, 상기 키트는 이하의 것들을 포함한다

본원에서 이전에 정의된 광감작제를 함유하는 제1 용기; 및

본원에서 이전에 정의된 항박테리아제를 함유하는 제2 용기.

본 발명의 생성물 및 키트는 본원에서 이전에 정의된 바와 같이 세포내 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

실시예에 기재된 방법들은 본 발명의 추가적인 바람직한 양태를 형성한다. 상기 기재된 바람직한 특징들의 모든 조합은, 특히 실시예에 기재된 바와 같이 고려된다. 본 발명은 이하에서 도면에 관하여 비-제한적인 예시의 방식으로 기재될 것이며, 여기에서:
도 1은 Raw 264.7 세포에서, 세포내 S. 에피더미디스의 겐타마이신 처리의 효능에 대한 PCI의 효과를 나타낸다. 세포내 S. 에피더미디스의 초기 수는 식작용(흡수) 직후 10⁶ CFU/웰인 것으로 판단되었다. 식작용 이후, 세포에 0.25 μg/ml TPPS_2a 단독, 1, 10 및 30 μg/ml 겐타마이신(GEN) 단독(-), 또는 각각의 겐타마이신-TPPS_2a 조합(+)을 2 시간 동안 처리하였다. 이어서 세포에 10 또는 15 분 동안 조명을 비추었다. 비-조명된 세포(조명 없음), 및 비-처리된, 조명을 비춘 세포(GEN 없음, TPPS_2a "-")는 대조군으로 사용하였다. 처리 후, 배양 배지는 1 μg/ml 겐타마이신을 함유한 새 배지로 교체하여, 세포외 박테리아의 생장을 억제하였고, 세포는 밤새 배양하였다. GEN 단독 처리 그룹과 각각의 GEN + TPPS_2a 그룹들 간의 차이점은, Sidak의 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(n = 3)를 나타낸다. ***, P < 0.001. 2 번의 독립적인 실험을 실시하고, 이들 중 하나는 도면에 나타내었다. 실험은 매우 유사한 데이터 및 통계적인 유의도를 나타냈다.
도 2는 광감작제를 활성화시키기 위하여 2 분간 조명을 비춘 경우 및 조명이 없는 경우, Raw 264.7 세포에서의 겐타마이신 및 TPCS_2a의 세포내 분포를 나타낸다. 세포는 조명을 비추기 전에 10 μg/ml 겐타마이신(GEN, 청색 형광) 및 1 μg/ml TPCS_2a(적색 형광)를 함유하는 배양 배지로 밤새 배양하였다. 겐타마이신과 TPCS_2a의 세포내 공동-국소화(co-localization)는 합쳐진(merged) 이미지에서 자홍색으로 나타났다. 축적자 = 20 μm.
도 3은 제브라피쉬 배아 감염, 및 S. 아우레우스와 제브라피쉬 식세포의 공동-국소화를 시각화하기 위한 S. 아우레우스의 투여량 결정을 나타낸다. A) 상이한 접종원이 주입된 제브라피쉬 배아에서의 S. 아우레우스의 CFU 수. 배아에 nl당 100 내지 6000 CFU의 S. 아우레우스 현탁액 1 nl을 주입하고, 주입 직후 분쇄하였으며, 생성되는 현탁액은 정량적으로 배양하여, 주입된 S. 아우레우스의 CFU 수를 정량화하였다. 선들은 중간 CFU 수를 나타낸다. B) S. 아우레우스의 상이한 접종원들의, 제브라피쉬 배아 생존에 대한 영향. PBS 주입은 대조군으로 이용하였다. 초기 그룹 크기는 26 내지 38 개의 배아의 범위였다. C) 주입 2 시간 후의, S. 아우레우스와 2 일령 제브라피쉬 배아 식세포의 공동-국소화. 상자는 D 및 E에 나타난 고배율로 기록된 공동-국소화의 부위를 나타낸다. 축적자 = 500 μm. 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 S. 아우레우스와 mCherry 단백질-발현 대식세포 또는 DsRed 단백질-발현 호중구와의 기록된 공동-국소화는, D) 및 E)에 각각 나타나있다. D) 및 E)의 화살표는 공동-국소화를 나타낸다. 축적자 = 100 μm.
도 4는 0.4 ng의 겐타마이신(GEN), 0.1 및 0.05 ng의 GEN을 단독으로, 또는 2.5 * 10^-3 ng TPCS_2a(T)와 조합하여 처리한 S. 아우레우스-감염된 배아의 생존 백분율을 나타낸다. PBS 모의 처리는 대조군으로 사용하였다. 초기 그룹 크기는 31 내지 33 개의 배아의 범위이다. 겐타마이신 단독 또는 겐타마이신-TPCS_2a 처리 그룹의 생존과 PBS 모의 처리 군의 생존 간의 차이, 뿐만 아니라 겐타마이신-TPCS_2a 그룹과 각각의 겐타마이신 단독 그룹의 생존 간의 차이를 로그-순위(Log-rank) 시험을 사용하여 분석하였다. ** p < 0.01. *** p < 0.001.
도 5는 PCI가 대식세포 세포주에서 반코마이신을 식장용 소포(endocytic vesicles)로부터 사이토졸로 재-국소화시킨다는 것을 나타낸다. TPCS_2a 및 BODIPY® FL- Vancomycin의 세포내 국소화를 조명 전(A) 및 후(B)에 형광 현미경에 의해 분석하였다.
도 6은 PCI가 대식세포 내에서 반코마이신의 분해(disaggregation)를 유도한다는 것을 나타낸다. 동일하게 처리된 RAW 264.7 세포는 도 5에 대한 세포와 동일하다. 이 실험에서, 현미경 광 여기 시간은 PCI의 전후의 샘플 둘 다에서 동일하였고, 따라서 형광 강도는 정량적으로 비교될 수 있다.
도 7은 0.4 ng 반코마이신(Vanco)을 단독으로, 또는 2.5 * 10^-3 ng TPCS_2a 및 조명(T)과 조합하여 처리한 S. 아우레우스-감염된 배아의 생존 백분율을 나타낸다. PBS 모의 처리는 대조군으로 사용하였다. 반코마이신 단독 그룹과 반코마이신-TPCS_2a/조명 그룹의 생존 간의 차이를, 로그-순위 시험을 사용하여 분석하였다(* p < 0.05).

실시예 1: PCI에 의한 세포내 스타필로코쿠스 감염에 대한 겐타마이신의 강화된 항박테리아 효능

PCI 응용에 적합한 양쪽 친매성 광감작제로서, 테트라페닐 포르피린 디설포네이트(TPPS_2a) 및 이의 유도체 테트라페닐 클로린 디설포네이트(TPCS_2a)가 이전에 사용되어 왔다. TPPS_2a 및 TPCS_2a은 매우 유사한 물리-화학적 특성들을 갖지만, 단지 TPCS_2a만이 적색광에 의해 활성화될 수 있다. 적색광은 매우 양호한 조직 침투성을 가지며, 이 때문에 TPCS_2a는 넓은 임상 응용에 적합하다. 본 연구에서, 목표는 조명을 비출 때 항생제(항박테리아제)와 조합된 PCI가 항생제의 사이토졸 전달을 증강시킴으로써 세포내 박테리아 감염에 대항할 수 있는지를 평가하는 것이었다. 겐타마이신은 세포내 항균 효능이 낮으므로, PCI의 잠재적 효과를 연구하기 위해 선택하였다.

재료 및 방법

박테리아 균주 및 접종원 제조

S. 에피더미디스 균주 O-47(Riool et al., 2014, supra)은, Raw 264.7 마우스 대식세포(Raw 264.7 세포)와 함께 시험관내 연구를 위해 사용하였다(Xia et al., 2008, Acs Nano, 2(10), p2121-2134). 5% 소태아 혈청(FCS)이 보강된 RPMI 배지(Gibco, Paisley 사, UK)(본원에서 RPMI로 지정됨) 중의 S. 에피더미디스에 대한 겐타마이신(Centrafarm B.V. 사, 네덜란드)의 최소 저해 농도 및 최소 살균성 농도는, 각각 0.04 및 0.33 μg/ml로 확인되었다. S. 아우레우스 균주 ATCC49230는 제브라피쉬 배아 감염에 사용하였다. 먼저 기술된 프로토콜(Riool et al., 2014, supra; and Riool et al., 2017, European Cells & Materials, 33, p143-157)을 따라서 GFP 발현 플라스미드 WVW189를 함유하는 S. 아우레우스 균주 RN4220(S. 아우레우스 RN4220-GFP)이 제조되고, 이것을 제브라피쉬 배아에서의 세포-박테리아 상호작용을 생체내 시각화하기 위해 사용하였다. 먼저 기재된 프로토콜(Riool et al., 2014, supra; and Riool et al., 2017, supra)에 따라서, 상이한 실험들에 대한 원하는 농도를 갖는 (PBS 또는 RPMI 중의) 박테리아 현탁액이 제조된다.

Raw 264.7 세포에 대한 겐타마이신, 및 광감작제 TPPS _2a 단독 또는 S. 에피더미디스와 조합된 세포독성

Raw 264.7 세포는 96-웰 플레이트(폴리스티렌 Nunclon™ 투명 TC 플레이트, 평면 바닥, Greiner 사, 네덜란드)에 1x10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고, (달리 기재된 바 없는 경우) 37℃에서 5% CO₂를 함유하는 습윤 대기 하에 RPMI로 밤새 배양하였다. 세포는 이어서 겐타마이신(15.6 내지 1000 μg/ml)을 함유하는 200 μl의 RPMI 중에 밤새 배양하거나, 광감작제 TPPS_2a(0.1 내지 0.4 μg/ml)(PCI Biotech AS 사, 노르웨이)를 함유하는 RPMI에서 2 시간 동안 배양하고, 이는 추가 2 시간의 배양 전에 비결합된 TPPS_2a를 제거하기 위하여 새로운 RPMI로 교체하였다. 계속 RPMI에 배양된 Raw 264.7 세포는 대조군으로 사용하였다. 세포는 LumiSource(PCI Biotech AS 사, 노르웨이)를 사용하는 15 분의 조명과는 별개로, 알루미늄 포일을 사용하여 광으로부터 보호하였다. 조명을 비춘 후, 세포는 새로운 RPMI에서 24 시간 동안 배양하였다. Raw 264.7 세포의 대사 활성에 대한 겐타마이신 및 TPPS_2a의 효과는, 제조사의 지침에 따라서, 배양 후 24 시간에 MTT를 사용하여, 또는 조명을 비춘 지 24 시간 후에 직접 WST-1 어세이로 각각 시험하였다(Cell MTT 또는 WST-1 어세이 키트, Sigma-Aldrich 사, 네덜란드). Raw 264.7 세포의 생존성에 대한 TPPS_2a의 단독 또는 S. 에피더미디스와 조합한 효과를 시험하기 위하여, 세포는 0.25 μg/ml TPPS_2a를 함유하는 200 μl의 RPMI에서 2 시간 동안 배양하기 전에 45 분 동안 박테리아가 식작용화되도록 허용하거나(식작용 어세이는 이하에 상세히 기재되어 있음), 또는 단지 TPPS_2a 만을 함유하는 200 μl의 RPMI(박테리아 없음)에서 계속 배양하였다. 세포는 이후 새로운 RPMI로 세척하고, 이어서 5, 10 또는 15 분 동안 조명을 비추거나, 비추지 않았다. 단지 조명만 처리한 세포는 대조군으로 사용하였다. 프로피듐 아이오다이드의 유입을 측정하여, 조명을 비춘 직후 또는 24 시간 후에 세포 생존성의 손실을 정량화하였다.

Raw 264.7 세포에 의한 S. 에피더미디스의 식작용

배양 후에, S. 에피더미디스 박테리아는 펠렛화되고, 0.5 ml의 인간 혈청(H1 혈청, Cat N14-402E, Bio Whittaker 사, 네덜란드)과 혼합된 1.5 ml의 PBS에 재현탁되어, 20 분 동안 옵소닌 작용(opsonization)을 위해 배양하였다. 접종원은 RPMI을 사용하여 1.8 x 10⁸ CFU/ml로 조절하였다. 세포의 배지는 40 μl의 박테리아 접종원에 의해 교환되고(40:1의 박테리아 대 세포 비율), 식작용은 45 분 동안 진행되도록 두었다. Raw 264.7 세포는 이후 60 μl로 4 회 가볍게 세척하고, 200 μl의 사전 가열된 PBS(37℃)로 최종 세척하여, 플랑크톤 S. 에피더미디스의 잔재(carry-over)를 방지하여, 항상 세척 단계 후 회수된 세포내 박테리아 수는 0.5 % 미만으로 발견되었다. Raw 264.7 세포는 0.5 mM EDTA를 함유하는 100 μl의 RPMI에서 배양하여 분리하였다. 분리된 세포를 바이알로 옮겨, 5 분 동안 수조 초음파기(Transsonic 460, Elma Schmldbaur GmbH 사, 독일)에서 배양함으로써 40 μl의 1% 사포닌으로 용해하였다. 초음파처리물을 원심분리하고, 펠렛화된 박테리아는 반복하여 세척하고, 일련의 10-배 희석의 정량적 배양 전에 PBS에 재-현탁하였다. Raw 264.7 세포에서의 세포내 생존하는 S. 에피더미디스는 웰당 CFU의 수로 나타낸다.

세포내 항균 활성 어세이

식작용 후에, Raw 264.7 세포는 겐타마이신을 단독 으로(1, 10 또는 30 μg/ml) 또는 TPPS_2a(0.25 μg/ml)와 조합하여 함유하는 200 μl의 RPMI에서2 시간 동안 배양하고, 비-처리된 세포는 대조군으로서 RPMI 또는 단지 TPPS_2a만을 함유하는 RPMI에서 배양하였다. TPPS_2a와 함께 배양된 세포에 대하여, 비결합된 TPPS_2a를 제거하기 위해, 배지는 추가 2 시간의 배양 전에 동일한 농도를 갖는 겐타마이신을 함유하는 새로운 RPMI로 교체하였다. 이후 세포를 1 μg/ml 겐타마이신을 함유하는 새로운 RPMI에서 배양하고, 10 또는 15 분 동안 조명을 비추고, 비-조명된 세포는 대조군으로 사용하였다. 조명을 비춘 후에, 세포를 밤새 배양하고, 생존하는 박테리아의 정량적 배양 이전에 용해시킨다.

형광 표지된 겐타마이신의 제조

(K₂CO₃, pH 9 중의) 과량의 겐타마이신(Sigma-Aldrich 사)를 Alexa Fluor 405 석신이미딜 에스테르(Life Technologies 사)와 혼합하여, 하나 초과의 Alexa Fluor 405 분자를 갖는 개별적인 겐타마이신 분자를 표지할 가능성을 최소화한다. 접합 이후, 상기 반응 혼합물은 C-18 컬럼을 사용하는 역상 크로마토그래피에 의해 분리되어, 상기 접합체를 비접합된 겐타마이신 및 Alexa Fluor 405 분자로부터 정제하였다. 단리된 Alexa Fluor 405 표지된 겐타마이신은 소분하여, 동결건조시키고, 사용시까지 -20℃의 암소에 저장한다.

Raw 264.7 세포에서의 겐타마이신 및 광감작제의 세포내 분포에 대한 공초점 형광 현미경 분석

밤새 배양한 후, 3.0 x 10⁵ 세포/웰 Raw 264.7 세포를 배양 디쉬(MatTek 유리 바닥 배양 디쉬, U.S)의 바닥에 분주하고, 10 μg/ml 겐타마이신을 단독으로 또는 1 μg/ml TPCS_2a(PCI Biotech AS 사, 노르웨이)와 조합하여 함유하는 1 ml의 RPMI 중에서 밤새 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 반복하여 가볍게 세척하고, 2 분 동안 조명을 비추고, 공초점 현미경(SP5, Leica 사, 네덜란드)을 위한 Prolong^® Gold 퇴색방지제(Life technologies 사, 네덜란드)로 커버하였다.

제브라피쉬 관리 및 유지

성체 야생형(WT) 또는 유전자이식(Tg) 제브라피쉬는, 지역 동물 복지 위원회(DEC)에 의해 승인된 지역 동물 복지 규제에 따라 취급하였다. 성체 제브라피쉬 및 그 배아의 유지는 먼저 기재되었다(Zhang et al., 2017, J. Biomed. Mater. Res. A., 105(9), p2522-2532).

제브라피쉬 배아의 혈액 순환으로의 주입

혈도 또는 퀴비에 덕트(the duct of Cuvier)를 통한 제브라피쉬 배아의 혈액 순환으로의 주입(Benard et al., 2012, Journal of visualized experiments : JoVE, 61)은, 먼저 기재된 주입 과정(Zhang et al., 2017, supra)에 따라 수행하였다. 주입당 액체의 부피는 본 연구의 모든 주입에 대하여 1 nl로 조절하였다.

제브라피쉬 배아에서 겐타마이신 단독 또는 TPCS _2a 와 조합된 독성 시험

겐타마이신 또는 TPCS_2a 용액(둘 다 PBS 중에 있음) 또는 혼합물은, 수정 후 32 시간(hpf)에 WT 제브라피쉬 배아에 주입하였다. PBS를 대조군 배아에 주입하였다. 배아는 34 hpf에서, LumiSource를 사용하는 10 분 동안의 조명과는 별도로, 알루미늄 포일을 사용하여 광으로부터 보호하였다. 배아의 생존(심장 박동, 움직임)을 6 dpi가 될 때까지 모니터링하였다.

제브라피쉬 배아 감염을 위한 S. 아우레우스의 투여량 발견

야생형 제브라피쉬 배아에 30 hpf에서 S. 아우레우스 ATCC 49230의 단계화된(graded) 접종원을 주입하고, 200 μl의 E3 배지에 독립적으로 유지하였다. 배지는 매일 다시 채워준다. 주입된 투여량은, 그룹당 5 내지 6 개의 배아의 정량적 배양으로 확인하고, MagNA 용해기(Roche 사, 네덜란드)를 사용하여 빻았다. 생존은 4 dpi가 될 때까지 모니터링하였다.

제브라피쉬 배아에서의 식세포와 박테리아의 공동-국소화의 시각화

S. 아우레우스 RN4220-GFP의 접종원을, 수정 후 2 일 차 (dpf)에, 적색 형광 표지된 호중구를 나타내는 Tg 라인(lyzc:DsRed)(Hall et al., 2007, BMC Dev. Biol., 7, p42), 또는 적색 형광 표지된 대식세포를 나타내는 Tg 라인(fms:Gal4:mCherry)(Gray et al., 2011, Thromb. Haemostasis, 105(5), p811-819)의 제브라피쉬 배아에, 퀴비에 덕트를 통해 정맥내 주입하였다. 주입한 지 2 시간 후에, 이미지는 형광 현미경(LM 80, Leica 사, 네덜란드)를 사용하는 FITC 및 mCherry 필터로, 명시야 하에서 기록하였다.

S. 아우레우스-감염된 제브라피쉬 배아에 대한, 겐타마이신의 단독 또는 TPCS _2a 와 조합한 처리

야생형 제브라피쉬 배아에 30 hpf에 혈도를 통해 적합한 투여량의 S. 아우레우스 ATCC 49230를 정맥내 투여하고, 상이한 처리들을 위해 이들을 무작위로 그룹으로 나뉘었다. 32 hpf에, 겐타마이신을 단독으로(0.05, 0.1 또는 0.4 μg/ml) 또는 이와 0.25 μg/ml TPCS_2a(2.5x10^-3 ng으로 제공됨)를 조합하여 함유하는 1 nl의 PBS 용액을 정맥내 투여하였다. 대조군 배아는 PBS 주입을 받았다. 배아는 34 hpf에, 10 분의 조명과는 별개로 알루미늄을 사용하여 보호하고, 매일 갈아준 E3 배지에 별도로 유지하였다. 생존은 6 dpi가 될 때까지 모니터링하였다.

통계 분석

Raw 264.7 세포에서 시험관내 독성 시험, 뿐만 아니라 세포내 박테리아의 사멸에 대해, 다중 그룹과 비교를 위한 동일 그룹 간의 차이는 Dunnett의 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다. 한 쌍의 비교를 위해 지정된 그룹들 간의 차이는, Sidak의 다중 비교 시험을 사용하여 분석하였다. 배아의 생존 백분율은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 평가하였다. 몇 쌍의 생존 곡선들 간의 차이를 로그 순위 시험을 사용하여 분석하였다. 차이는 P 값 < 0.05에 대해 유의한 것으로 간주하였다. 모든 분석은 Graphpad Prism 7.0을 사용하여 수행하였다.

결과

Raw 264. 7 세포의 대사 활성에 대한 겐타마이신 및 TPPS _2a 의 효과

세포내 사멸 어세이를 실시하기 위하여, Raw 264.7 세포에 대한 겐타마이신 및 TPPS_2a의 허용 농도는, MTT 및 WST-1 어세이에 의해 각각 평가하였다. 최대 250 μg/ml의 겐타마이신 세포외 농도는 24 시간의 배양 후 Raw 264.7 세포의 대사 활성을 감소시키지 않았고, 따라서 이는 추가 실험에서 겐타마이신의 최대 농도로 선택하였다.

광감작제 TPPS_2a에 의한 Raw 264.7 세포의 대사 활성의 가능한 저해는, 바로(T = 0), 또는 15분 동안 조명을 비추고 나서 24 시간 이후(T = 24) 평가하였다. TPPS_2a는 0, 0.1, 0.2, 0.25, 0.3 및 0.4 μg/ml에서 시험하였다. 조명을 비추지 않은 경우, 0.4 μg/ml의 TPPS_2a 최고 시험 농도는, 어느 시점에서도 대사 활성을 감소시키지 않았다. 조명을 비춘 후에, TPPS_2a 최대 0.25 μg/ml의 농도는 어느 시점에서도 Raw 264.7 세포의 대사 활성을 감소시키지 않았다(데이터 미도시). 따라서, 0.25 μg/ml이 추가 실험에서 TPPS_2a의 최대 농도로 선택되었다.

PCI 처리를 단독 또는 감염과 조합된 경우의 세포 생존성에 대한 잠재적으로 부정적인 효과를 조사하기 위하여, Raw 264.7 세포는 TPPS_2a 단독(0.25 μg/ml), 또는 S. 에피더미디스의 존재 하에서의 TPPS_2a로 처리하였고(TPPS_2a + S. 에피더미디스)(40:1의 박테리아 대 세포 비율), 5, 10 또는 15 분 동안 조명을 비추었다. 비-처리되었으나 조명을 비춘 세포는 대조군으로 사용하였다. 프로피듐 아이오다이드의 유입을 측정하여, 생존 가능성의 손실을 바로(T = 0), 그리고 조명을 비춘 지 1 시간 후에(T = 1) 정량화하였다. 이와 같은 조명은 세포 생존성에 영향을 주지 않았다. TPPS_2a로 처리한 경우, 5, 10 또는 15 분 동안 조명을 비출 때 세포 생존성에 유의한 감소를 유발하였다(데이터 미도시). 유사한 결과는 10 또는 15 분 동안 조명을 비춘, TPPS_2a + S. 에피더미디스를 처리한 세포에 대해서도 얻었다(데이터 미도시). 또한, 5 분 동안 조명을 비춘, TPPS_2a + S. 에피더미디스를 처리한 세포의 생존 가능성의 감소가 관찰되기는 했지만, 이는 조명을 비추지 않은 대조군과 실질적으로 상이하지 않았다(데이터 미도시).

PCI에 의한 Raw 264.7 세포에서 겐타마이신에 의한 세포내 S. 에피더미디스의 증가된 사멸

TPPS_2a-PCI가 겐타마이신에 의한 세포내 S. 에피더미디스의 사멸을 증가시켰는지를 조사하기 위하여, S. 에피더미디스-감염된 Raw 264.7 세포는 TPPS_2a 단독(0.25 μg/ml), 겐타마이신 단독(1, 10 또는 30 μg/ml), 또는 각각의 겐타마이신-TPPS_2a 조합에 노출하였다(도 1). 겐타마이신-TPPS_2a 조합은 5 분간 조명을 비춘 경우 세포내 박테리아의 사멸에 대한 영향을 나타내지 않았다(데이터 미도시). 그래서, 세포는 10 또는 15 분 동안 조명 처리하고, 비-조명된 세포, 및 비-처리된, 조명을 비춘 세포는 대조군으로 이용하였다. 조명을 비추지 않은 경우, 어떠한 처리도 비-처리된 그룹에 비해 Raw 264.7 세포에서 세포내 박테리아 수의 감소를 유발하지 않았다. 조명을 비춘 경우, TPPS_2a 단독에 의한 처리는 비-처리된 조명을 비춘 그룹에 비해 S. 에피더미디스의 세포내 생존에 영향을 주지 않았고, 이는 TPPS_2a의 광-촉발된 활성화가 세포내 박테리아를 사멸시키지 않았다는 것을 나타낸다. 겐타마이신 단독에 의한 처리는 또한 겐타마이신 농도 및 조명 시간과는 무관하게 S. 에피더미디스를 세포내 사멸시키지 않았다. 10 분간 조명을 비춘 경우, TPPS_2a-PCI는 30 μg/ml 겐타마이신에 의해 사멸을 유의하게 증가시켰으나(세포내 박테리아 수의 1 log 감소), 10 μg/ml 겐타마이신에 의한 경우 그렇지 않았다. 15 분간 조명을 비춘 경우, 10 및 30 μg/ml 겐타마이신이 TPPS2a와 조합하여 처리된 Raw 264.7 세포에서 세포내 S. 에피더미디스의 사멸이 각각 1 및 2.5 log 감소로 유의하게 증가하였다.

조명을 비춘 경우 및 조명을 비추지 않은 경우, Raw 264.7 세포에서의 겐타마이신 및 TPCS _2a 의 세포내 분포

조명을 비춘 경우에 PCI가 겐타마이신의 세포내-사이토졸 방출을 유발하는지를 조사하기 위해, 조명을 비추거나 조명 없는 경우 Raw 264.7 세포에서의 겐타마이신 및 광감작제 TPCS_2a의 세포내 분포를 시각화하였다(도 2). TPCS_2a는 적색광을 흡수하므로, 생체내 적용에 적합하다. 이 때문에, TPCS_2a는 본 세포 연구 및 제브라피쉬 배아에 의한 생체내 연구들을 위해 선택하였다. 조명을 비추지 않은 경우, 겐타마이신 및 TPCS_2a는 모두 세포 주변의 세포내 구획, 아마도 식작용의 소포 내에 위치한다. 조명을 비춘 후, 양쪽 제제가 사이토졸로 방출되었다. 겐타마이신은 Raw 264.7 세포의 핵에 축적되는 것으로 보인다.

겐타마이신 및 TPCS _2a 의 단독 또는 조합의 제브라피쉬 배아에 대한 독성

제브라피쉬 배아에 대한 이들의 독성을 시험하기 위하여, 겐타마이신(배아당 1 nl의 PBS당 0.16 내지 16 ng 범위의 투여량을 투여하고, 1 nl의 PBS가 대조군으로 사용됨), TPCS_2a(배아당 1 nl의 PBS당 2.5*10^-2, 2.5*10^-3 및 2.5*10^-4 ng의 투여량을 주입하고, 1 nl PBS는 대조군으로 사용됨), 및 겐타마이신-TPCS_2a 조합(1.6 및 0.8 ng GEN의 단독, 또는 (1nl의 PBS 중의) 2.5*10^-3 ng TPCS_2a와 조합된 투여량을 주입하고, 1 nl의 PBS 주입이 대조군으로 사용됨)의 단계별 투여량 주입의 생존에 대한 효과를 평가하였다. 겐타마이신 및 TPCS_2a는 둘 다 각각 2 및 2.5*10^-3 ng/배아의 최대 비-독성 농도를 갖는 투여량-의존적인 독성을 나타내었다(데이터 미도시). 1.6 또는 0.8 ng/배아의 겐타마이신과 2.5*10^-3 ng/배아 TPCS_2a의 조합은, 배아의 생존을 감소시키지 않았다(데이터 미도시). 초기 그룹 크기는 33 내지 36 개의 배아의 범위였다.

제브라피쉬 배아 감염을 위한 S. 아우레우스의 투여량 발견, 및 세포-감염원의 생체내 상호작용의 시각화

제브라피쉬 배아에서의 감염 실험을 위한 S. 아우레우스의 적절한 투여량을 평가하기 위하여, 단계별 접종원을 수정 후 30 시간에 혈액 순환으로 주입하였다. 주입된 S. 아우레우스의 중간 CFU 수는, 100, 500, 3000 및 6000 CFU/배아의 의도된 도전 투여량을 갖는 그룹에 대해, 각각 150, 500, 2750 및 7500 CFU/배아였다. 그룹 내에서 회수된 CFU 수의 변화도 적었다(도 3a). S. 아우레우스-감염된 배아의 사망은 접종원 투여량에 비례하였다(도 3b). 3000 CFU/배아의 투여량은 주입 후 4 일차에 배아의 대략 50% 사망을 유발하였고(도 3b), 이는 항생제 처리의 효능을 평가하기에 적합하여, 추가 실험을 위해 선택하였다.

겐타마이신을 단독으로, 또는 TPCS _2a 와 조합하여 처리한 S. 아우레우스-감염된 배아의 생존

PCI가 생체내에서 스타필로코쿠스 감염에 대한 겐타마이신의 항균 효능을 증강시키는지를 평가하기 위하여, S. 아우레우스-감염된 제브라피쉬 배아에 겐타마이신을 단독으로, 또는 TPCS_2a와 조합하여 처리하였다. 주입된 S. 아우레우스의 중간 CFU 수는 2850 CFU/배아인 것으로 결정되었다(데이터 미도시). 겐타마이신에 의한 모든 처리(TPCS_2a 없이 또는 이와 함께)는, PBS 모의 처리에 비해 생존을 유의하게 개선시켰다(도 4). 0.1 ng 겐타마이신에 TPCS_2a를 첨가하면, 0.1 ng 겐타마이신의 단독 처리에 비해 처리 결과를 유의하게 개선시켜, 0.4 ng 겐타마이신 처리로 얻은 것들과 유사한 생존 수준이 된다. 이것은 PCI가 S. 아우레우스 감염에 대한 겐타마이신의 항균 활성을 증강시키고, 효능에 필요한 투여량을 낮춘다는 것을 보여준다. 그러나, 최소한의 겐타마이신 투여가 TPCS_2a의 증강 효과를 관찰하는데 필요하며, 이는 0.05 ng 겐타마이신을 배아에 처리할 때, TPCS_2a가 효능을 개선시키지 않았기 때문이다(도 4).

결론

PCI는 세포 내에서 제한된 항균 효능을 갖는 항생제인 겐타마이신의 스타필로코쿠스에 대한 세포내 활성을 시험관내 및 생체내 모두에서 개선시키는 것으로 나타났다. Raw 264.7 세포에서, PCI는 조명을 비춘 후에 겐타마이신의 사이토졸 방출을 유도하였고, 식작용화된 S. 에피더미디스의 박멸을 증가시켰다. 식세포에 의해 내재화된 S. 아우레우스를 갖는 제브라피쉬 배아 모델에서, PCI는 (세포내) S. 아우레우스 감염에 대한 겐타마이신 처리의 효능을 개선시키고, 필요한 투여량을 낮추었다. 이들 결과는 PCI가 세포내 박테리아에 관계되는 감염에 대한 항생제의 세포내 활성을 개선시킨다는 것을 입증한 첫 번째 것이다.

본 연구에서, 비록 조명을 비출 때 Raw 264.7 세포에 대한 일부 세포독성이 관찰되기는 하지만, PCI-겐타마이신 조합에 의한 제브라피쉬 배아의 처리는 처리 이후 이들의 생존에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는, PCI가 시험관내에서는 세포에 중간 수준의 손상을 유발할 수 있으나, 생체내에서는 이의 항생제-증강 활성에 필요한 수준에서 제브라피쉬 배아의 사망을 유발하지 않는다는 것을 나타낸다.

이것은 감염된 부위에 조명을 적용할 때, (세포내) 감염의 PCI 매개된 처리의 부위-특이적 적용을 가능하게 한다. 그 결과, 비-조명된 부위에서 정상 조직 및 세포에 대한 광감작제의 잠재적 부작용은 강하게 감소될 수 있다.

보고된 실험에서, Raw 264.7 세포에 의한 시험관내 어세이에서, 처리 후 세포내 사멸을 등록할 수 있기 위하여, 세포가 박테리아의 식작용 이후 살아있을 필요가 있다. 그래서, S. 에피더미디스를 사용하였는데, 이는 이들 박테리아가 대식세포 내에서 시험관내 생존할 수는 있지만 활발히 증식하지는 않기 때문이다(Lemaire et al., 2010, Antimicrob. Agents Ch., 54(6), p2549-2559). 그러나, 제브라피쉬 배아 모델에서, 배아는 항균제 처리에 의하여 급사로부터 구출되어야 하며, 따라서 배아를 죽일 수 있는 박테리아 감염원이 필요하다. S. 에피더미디스는 심지어 배아당 대략 3.8 x 10⁴ CFU의 매우 높은 접종원을 정맥내 주입한 후에도 배아를 죽이지 않았다(데이터 미도시). 그래서, 제브라피쉬 배아에서 빠르게 전파되는 감염을 유발하는 능력으로 알려진 S. 아우레우스(Prajsnar et al., 2008, supra)를 본 생체내 연구에 사용하였다. 제브라피쉬 배아의 초기 발생 단계에서, S. 아우레우스의 클리어런스(clearance)는 주로 대식세포 및 호중구에 의한 식작용에 따라 달라지며(Prajsnar et al., 2008, supra), 이들은 둘 다 수정 후 30 시간에 배아에서 기능을 유지한다(Trede et al., 2004, Immunity, 20(4), p367-379). 제브라피쉬 배아를 사용하는 다른 연구들(Prajsnar et al., 2008, supra; Prajsnar et al., 2012, supra)과 유사하게, S. 아우레우스와 식세포의 공동-국소화는 본 연구에서 주입 후 2 시간이 되자마자 바로 관찰되었고, 이는 이 기간 동안 효과적인 식작용이 발생했다는 것을 암시한다. 이것은 항생제의 세포내 활성을 시험하기 위한 제브라피쉬 배아 감염 모델의 적합성을 뒷받침한다.

세포 내에 축적되는 항생제의 양은 세포내 박테리아의 사멸 효능을 위해 필수적이다(Seral et al., 2003, supra; and Barcia-Macay et al., 2006, Antimicrob. Agents Ch., 50(3), p841-851). 이 때문에, S. 에피더미디스를 에워싼 Raw 264.7 세포의 시험관내 모델에서, 세포는 상대적으로 높은 농도(10 및 30 μg/ml)의 겐타마이신에 2 시간 동안 노출되었다. 심지어 이러한 높은 세포외 농도에서도, 겐타마이신은 세포내 S. 에피더미디스 박테리아를 사멸시키지 않았다. 눈에 띄게도, PCI의 사용과 처리를 조합하면, 겐타마이신의 항균 효능을 유의하게 개선시켰다(도 1). PCI의 유사한 효능-강화 효과는 제브라피쉬 배아 S. 아우레우스 감염 모델에서 생체내 관찰되었다. PCI는 S. 아우레우스-감염된 배아의 겐타마이신 처리의 결과를 유의하게 강화시켰고, 필요한 투여량을 감소시켰다(도 4). 그러나, 최저 투여량의 겐타마이신의 효능에 대한 PCI의 효과는 시험관내 또는 생체내 어디에서도 관찰되지 않았으며, 이는 충분한 양의 세포내 겐타마이신이 필수 요건이라는 것을 나타낸다. 겐타마이신의 흡수시기를 증가시키면, 낮은 항생제 투여량에서도 PCI-증강된 효능을 달성할 수 있을 것으로 기대된다.

흥미롭게도, 자유로워진 겐타마이신 분자는 조명을 비춘 후에 Raw 264.7 세포의 핵에 축적되는 것으로 보였다(도 2). 이 관찰은 겐타마이신이 신장 세포의 핵에 결합할 수 있다는 보고된 결과와 일관된다(Myrdal et al., 2005, Hearing Res., 204(1-2), p156-169). 비록 이론적으로 이러한 결합이 사이토졸 내에서 자유 겐타마이신의 양을 감소시킬 수는 있지만, PCI에 의한 겐타마이신의 강화된 효능은 여전히 관찰되었다. 그래서, PCI에 의한 항생제의 세포내 활성 증강(핵 결합은 나타나지 않음)은, 훨씬 더 유의미할 수 있다.

박테리아 및 항생제 분자의 상이한 세포내 위치도, 또한 항생제의 세포내 활성에 잠재적으로 영향을 미친다(Carryn, 2003, supra). 식작용 이후, 스타필로코쿠스를 포함하는 몇몇 박테리아 종은 포식소체 내에 주로 포획되어, 다른 소포 내의 흡수된 항생제에 의해 효과적으로 박멸되지 않을 수 있다(Seral et al., 2003, supra; Barcia-Macay et al., 2006, supra; and Bernardo and Simons, 2009, Cytom. Part A, 77A(3), p10). 본 연구에서, 항생제를 함유하는 엔도좀을 파괴한 후, 분리된 광감작제(의 일부)는 박테리아를 함유하는 포식소체의 막에 재-국소화되고, 또한 조명 시기 동안 이들 막을 파괴할 수 있는 것으로 생각된다. 그래서, 포식소체 내에 서식하는 적어도 일부의 박테리아는 사이토졸로 방출되고, 겐타마이신에 의해 더욱 신속히 사멸될 수 있다. 또한, PCI 동안, 광감작제의 광-활성화에 의해 파괴된 소포들은 비손상된 다른 소포들과 세포내 융합하여, 심지어 추가적인 조명이 없을지라도 비손상된 소포들 또한 누출/파괴될 수 있다. 그래서, 이러한 융합은 또한 박테리아 및 항생제 둘 다의 사이토졸 방출에 (부분적으로) 기여하여, 세포내 항균 작용을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 이들 실험에 기초하여, PCI는 또한 다른 항생제, 예컨대 반코마이신, 오리타반신 및 다양한 마크롤라이드의 세포내 활성을 개선시킬 것으로 기대된다. 결과적으로 세포내에서 항생제의 허용되는 농도가 낮기 때문에 내성 발생을 방지할 수 있다. 그래서, PCI는 세포내 감염을 성공적으로 치료할 수 있는 항생제의 수를 증가시킬 수 있다. 추가로, 필요한 항생제 투여량은 PCI를 사용하여 감소시킬 수 있다.

본 실험은 PCI가 세포내 감염의 항생제 처리를 개선시키고, 내성 발달을 방지하는데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 2 : PCI에 의한 세포내 스타필로코쿠스 감염에 대한 반코마이신의 증강된 항박테리아 효능

유사한 실험은, 반코마이신이 항박테리아제로 사용된 점을 제외하고는 실시예 1의 것에 비교하여 실시하였다.

방법 및 결과

PCI는 대식세포에서 반코마이신을 식작용의 소포로부터 사이토졸로 재-구소화시킨다.

PCI 처리가 대식세포에서 식작용의 소포로부터 반코마이신을 방출시킬 수 있는지를 조사하기 위하여, 실험은 RAW 264.7 대식세포 세포주를 포함하도록 설정되며, 조명 전후에 형광표지된 반코마이신 및 TPCS_2a의 세포내 국소화를 연구하였다.

대식세포 세포주 RAW 264.7는 1 μg/ml TPCS_2a 및 50 μg/mL BODIPY® FL-Vancomycin(Life Technologies 사)(반코-FL)와 함께 18 h 동안 배양하였다. 세포를 약물-불포함 배지에서 2 회 세척하고, 120 s 동안 LumiSource에 의한 조명을 비추기 전에 약물-불포함 배지에서 4 시간 동안 배양하였다. TPCS_2a 및 BODIPY® FL-Vancomycin의 세포내 국소화는 이하의 필터 셋팅: TPCS_2a: 여기: 대역(Band-pass): 395 내지 440 nm, 이색성 빔 스플리터 460 nm을 사용하여 조명 전(A) 및 후(B)에 형광 현미경으로 분석하였다. 방출: 장-대역(Long-pass) 620 nm. BODIPY: 여기: 대역: 450 내지 490 nm. 방출: 대역 500 내지 550 nm. 결과는 도 5에 나타냈다.

조명 전에(도 5a), 반코마이신 및 TPCS_2a는 둘 다 세포 내에서 식작용의 소포에 상응하는 작은 스폿에 국소화되었고, 반코마이신 및 TPCS_2a는 동일한 소포에 심하게 공동-국소화된 것으로 볼 수 있다("합쳐짐(Merge)" 패널의 밝은 스폿). 조명을 비춘 후에, 반코마이신 및 TPCS_2a는 식작용의 소포로부터 유출되었으며, 이는 전체 세포체에서 구별되는 세포내 스폿의 소멸 및 형광 화합물의 분산된 국소화에 의해 도 5b로부터 명백히 볼 수 있다. 이것은 PCI가 세포내 소포로부터 세포의 사이토졸로 반코마이신을 방출할 수 있다는 것을 나타낸다.

PCI의 효과는 도 6에서 훨씬 더 명확하게 나타나는데, 반코마이신-BODIPY 형광은 또한 PCI의 전후에 정량적으로 비교할 수 있다. PCI는 또한 식작용의 소포로부터 세포 사이토졸로의 반코마이신의 세포내 재-국소화를 유발하는 것 외에, 반코마이신-BODIPY로부터의 형광 신호에서 강한 증가를 유발하는 것으로 보인다. 이것에 대한 개연성 있는 이유는, 반코마이신 분자가 엔도좀 내에서 응집되며, 이들이 사이토졸 내의 훨씬 더 큰 분포 부피로 방출될 때 분해되기 때문이다. 형광 분자의 응집은 형광의 퀀칭을 유도하고, 응집체 내의 형광단으로부터의 형광은 분해 시 실질적으로 증가할 것이라는 사실은 잘 알려져 있다. 응집된 분자는 일반적으로 치료 표적과 상호작용을 할 수 없을 것이기 때문에, PCI 이후 나타나는 분해는 PCI에 의해 달성될 수 있는 항균 활성의 증가에 추가로 더해질 것이다.

PCI는 제브라피쉬 배아에서 반코마이신의 항균 효과를 증강시킨다.

비-감염된 제브라피쉬 배아에 대한 반코마이신(Vanco) 단독, 또는 TPCS_2a 및 조명과 조합한 것(T)의 독성을 평가하였다. 반코마이신(1 nl의 PBS당 0.4, 1.6 또는 6.4 ng), 또는 1 nl의 PBS당 2.5*10^-3 ng TPCS_2a와 조합한 투여량을 배아마다 주입하였다. 주입 후, 제브라피쉬 배아는 E3 배지를 함유하는 페트리-디쉬 내에 그룹-방식으로 유지하였다. 조명 처리될 페트리-디쉬를 Lumisource 조명 장치에 놓고, 배아에 10 분 동안 조명을 비추었다. 초기 그룹 크기는 27 내지 29 개의 배아였다.

비-감염된 배아당 0.4 내지 6.4 ng의 투여량에 의한 반코마이신의 주입은, 제브라피쉬 배아에 대한 투여량-의존적 독성을 나타내며, 주입 후 6 일(dpi)에 대략 5% 내지 20%의 배아 사망을 유발하였다(데이터 미도시). 반코마이신과 TPCS_2a/조명의 조합은 더 강한 독성을 유발하는데, 이는 대략 20 내지 40%의 배아가 6 dpi에서 사망했기 때문이다(데이터 미도시).

PCI가 스타필로코쿠스 아우레우스 감염에 대한 반코마이신의 항균 효능을 증강시키는지 여부를 조사하기 위하여, S. 아우레우스-감염된 제브라피쉬 배아에 반코마이신을 단독(0.4 ng)으로 또는 TPCS_2a(2.5*10^-3 ng)와 조합하여 처리하였다. PBS 모의 처리는 대조군으로 사용하였다. 주입 후, 제브라피쉬 배아는 E3 배지를 함유하는 페트리-디쉬 내에 그룹-방식으로 유지하였다. 페트리-디쉬를 Lumisource 조명 장치에 놓고, 배아에 10 분 동안 조명을 비추었다. 초기 그룹 크기는 29 또는 30 개의 배아였다. 반코마이신 단독 그룹과 반코마이신-TPCS_2a/조명 그룹의 생존 간의 차이를 로그-순위 시험을 사용하여 분석하였다(* p ≤ 0.033).

주입된 S. 아우레우스의 중간 CFU 수는 4300 CFU/배아인 것으로 결정되었다. 반코마이신 단독은 감염된 배아의 생존에 영향을 미치지 않았던 반면, 생존에서의 감염-매개된 감소는 반코마이신 + TPCS_2a/조명(T) 조합에 의해 유의하게 지연된 것으로 나타났다(도 7). 중요하게도, 독성 시험(상기에서 논의됨, 데이터 미도시)에 의하면, 반코마이신+ TPCS_2a/조명 조합은 그 자체로 반코마이신 단독보다 더 많은 배아 사망을 유발하였고(적어도 15 % 더 높음), 이는 반코마이신의 항균 효과에 대한 PCI의 증강 효과가 아마도 도 7에서 명백히 나타난 것보다 훨씬 더 크다는 것을 의미한다.

Claims (24)

1. 세포내 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 감염된 세포(들)를 항박테리아제 및 광감작제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포(들)를 상기 광감작제를 활성화시키는데 효과적인 파장의 광으로 조사하는 단계를 포함하되, 상기 항박테리아제는 세포(들)의 사이토졸로 방출되어, 상기 세포(들)에서 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 생체내에서 실시되고, 상기 세포(들)는 대상체 내에 있는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접촉 단계는 15 분 내지 4 시간, 바람직하게는 1 내지 2 시간 동안 실시되는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광감작제는 양쪽 친매성 포르피린, 클로린, 박테리오클로린 또는 프탈로시아닌인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 광감작제는 TPCS_2a, AlPcS_2a, TPPS_2a 및 TPBS_2a로부터 선택되고, 바람직하게는 TPCS_2a인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 전달을 위한 광감작제의 투여량은 0.0025-250, 바람직하게는 1 내지 250 μg, 바람직하게는 2.5 내지 40 μg, 바람직하게는 10 내지 30 μg, 예를 들어 25μg인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포(들)는 5 내지 60 분 동안, 바람직하게는 10 내지 20 분 동안, 바람직하게는 15 분 동안 조사되는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 국소 전달을 위한 항박테리아제의 투여량은 25 내지 10000 μg, 바람직하게는 50 내지 5000 μg, 바람직하게는 1 mg인, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항박테리아제는 아미노글리코시드(바람직하게는 겐타마이신), 글리코펩티드(바람직하게는 반코마이신), 또는 마크롤라이드인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 감염은 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 대장균(Escherichia) 박테리아에 의해 유발되는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 감염은 생체재료-관련 감염이고, 바람직하게는 상기 생체재료는 의료 장치, 기구, 도구 또는 장비, 보철 또는 재료, 조직 또는 상처 드레싱인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 감염은 골수염(osteomyelitis), 균혈증(bacteremia), 결핵(tuberculosis), Q-열병(Q-fever), 심장내막염(endocarditis), 피부(피하)의 피부 또는 점막 감염/손상(바람직하게는 만성 상처, 궤양, 종기(abscess) 또는 당뇨성 족부 감염(diabetic foot infection)), 경구 및 비강 감염(바람직하게는 만성 비부비동염(chronic rhinosinusitis) 또는 치주염(periodontitis)) 또는 임플란트 주위염(peri-implantitis)인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포(들)는 생체재료, 바람직하게는 의료 장치, 기구, 도구 또는 장비, 보철 또는 재료, 조직 또는 상처 드레싱 상에, 또는 이에 인접하도록 존재하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 항박테리아제 및/또는 상기 광감작제는 생체재료 상에 또는 그 내부에 제공되는, 방법.
15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유류, 바람직하게는 원숭이, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니피그이고, 가장 바람직하게는 대상체는 인간인, 방법.
16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 소이고, 상기 박테리아 감염은 S. 아우레우스 마스티티스(S. aureus mastitis)인, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포(들)는 상기 항박테리아제 및 상기 광감작제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 접촉되며, 상기 방법이 생체내에서 실시될 경우, 바람직하게는 상기 접촉은 상기 항박테리아제 및 상기 광감작제를 국부, 피내, 피하 또는 정맥내 투여함으로써 달성되는, 방법.
18. 세포(들)에서 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지하는 시험관내 방법으로서, 세포(들)를 항박테리아제 및 광감작제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포(들)를 상기 광감작제를 활성화시키는데 효과적인 파장의 광으로 조사하는 단계를 포함하되, 상기 항박테리아제는 세포(들)의 사이토졸로 방출되어, 상기 세포(들)에서 박테리아를 사멸, 손상시키거나 이의 복제를 방지하며, 바람직하게는 상기 접촉 단계는 제3항 또는 제16항에서 정의된 바와 같고, 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 상기 조사는 제7항에서 정의한 바와 같고, 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같고, 상기 박테리아 감염은 제10항, 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 세포(들)는 제13항에서 정의된 바와 같은, 시험관내 방법.
19. 항박테리아제 및 광감작제의 항박테리아용으로의 용도로서, 바람직하게는 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 상기 용도는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 포함하는, 항박테리아제 및 광감작제의 용도.
20. 바람직하게는 치료에 사용하기 위해 항박테리아제 및 광감작제를 포함하는 조성물로서, 여기에서 바람직하게는 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같은, 조성물.
21. 대상체에서 세포내 박테리아 감염을 치료하기 위해 사용되는 항박테리아제 및 광감작제, 또는 제20항에 정의된 바와 같은 항박테리아제 및 광감작제를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같고, 상기 박테리아 감염은 제10항, 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 대상체는 제15항에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 상기 용도는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 방법을 포함하는, 항박테리아제 및 광감작제, 또는 조성물.
22. 대상체에서 세포내 박테리아 감염의 치료용 약물의 제조에 대한 항박테리아제 및/또는 광감작제의 용도로서, 바람직하게는 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같고, 상기 박테리아 감염은 제10항, 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 대상체는 제15항에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 상기 용도는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 방법을 포함하는, 항박테리아제 및/또는 광감작제의 용도.
23. 대상체에서 세포내 박테리아 감염을 치료하는데 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합된 제제로서 항박테리아제 및 광감작제를 포함하는 생성물로서, 여기에서 바람직하게는 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같고, 상기 박테리아 감염은 제10항, 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 대상체는 제15항에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 상기 용도는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 방법을 포함하는, 생성물.
24. 대상체에서 세포내 박테리아 감염을 치료하는데 사용하기 위한 키트로서, 상기 키트는
    광감작제를 함유하는 제1 용기; 및
    항박테리아제를 함유하는 제2 용기를 포함하되,
    바람직하게는 상기 광감작제는 제4항, 제5항 또는 제6항에서 정의된 바와 같고, 상기 항박테리아제는 제8항 또는 제9항에서 정의된 바와 같고, 상기 박테리아 감염은 제10항, 제11항 또는 제12항에 정의된 바와 같고, 및/또는 상기 대상체는 제15항에서 정의된 바와 같고, 바람직하게는 상기 용도는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 방법을 포함하는, 키트.

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