KR20200095881A

KR20200095881A - 뇌 조직 투명화를 이용한 시냅스 기능 장애 평가 방법

Info

Publication number: KR20200095881A
Application number: KR1020190013801A
Authority: KR
Inventors: 박영일; 금상일
Original assignee: 주식회사 바이나리
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2020-08-11
Also published as: KR102277657B1; WO2020159264A1; KR102277657B9

Abstract

본 발명은 뇌 조직 투명화를 이용한 시냅스 기능 장애 평가 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 시냅스 기능 장애 평가 방법은 뇌 조직을 투명화 시키는 단계를 포함하며, 상기 단계에서 뇌 조직을 투명화 시킴으로써 뉴런의 선명한 3차원 이미지를 획득할 수 있고, 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 효과적으로 분석하고 정량화하여 시냅스 기능 장애를 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 시냅스 기능 장애 평가 방법은 신경계 질환 동물모델에서 약물의 처리에 따른 뉴런의 스파인 길이 및 분포를 분석함으로써, 신경계 질환 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝 하는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

뇌 조직 투명화를 이용한 시냅스 기능 장애 평가 방법 {Method for evaluating synaptic dysfunction using brain tissue clearing}

본 발명은 뇌 조직 투명화를 이용한 시냅스 기능 장애 평가 방법 등에 관한 것이다.

인간의 수명이 길어짐과 동시에 파킨슨 질환, 근위축성측삭경화증, 다발경화증, 헌팅톤 질환, 알츠하이머, 당뇨망막변증, 다발성경색치매, 원반황반변성 등을 포함하는 신경계 질환의 발생율도 높아지고 있다. 현재 신경계 질환 환자는 전세계적으로 2천4백만명인 것으로 추정된다. 또한 다른 형태의 신경계 질환인 뇌졸중 또는 기타 외상 또는 손상에 의해 야기되는 질환은 해마다 증가추세에 있다.

현재 신경계 질환은 진단 및 치료의 발전에도 불구하고 여전히 이로 인해 장애를 겪고 있는데, 뉴런의 손상은 뇌 기능 장애를 포함하여 흥분과 억제의 불균형을 초래해 간질과 같은 신경계 질환의 발생을 더욱 악화시킬 수 있다. 또한, 뉴런의 수상돌기에 존재하는 spine의 구조적, 기능적 결함은 다수의 신경계 질환의 원인 혹은 결과로 나타나므로, 신경전달의 통로이자 시발점으로써의 시냅스 형성과 시냅스 가소성을 포함하여 뇌의 활동도를 결정하는 특징적인 구조적 최소단위로 spine의 구조와 특징적인 모습들을 연구하는 것은 spine 및 신경계 형성, 나아가 뇌의 인지작용을 이해하기 위해 필수적인 과정이다.

임상적으로 신경계 질환의 연구는 뇌 영상 및 전자현미경을 통한 연구, 신경세포의 사망 기전에 대한 분자 생물학적 연구에 힘입어 새로운 변화들이 알려졌다. 또한, MRI 기술의 발전으로 뇌의 위축등을 쉽게 확인할 수 있으며 전자현미경으로 미세한 시냅스 변화부터 뉴런 사멸의 다양한 기전을 확인할 수 있다.

그러나, 전임상에서의 신약 개발 과정에서 뉴런의 손상 정도를 평가할 수 있는 방법은 슬라이드에 조직을 박리하여 관찰하는 방법이 대부분이며 특히, 동물의 전체 뇌조직에서 신경의 분포, 생존, 형태학적인 연구를 위한 시스템 및 분석 방법은 아직까지 잘 알려진 바가 없는 실정이다.

한편, 조직 투명화 기술은 조직의 손상 없이 구조 및 단백질 발현 등을 확인 할 수 있으므로 최근에 매우 다양한 방법으로 조직을 투명화 할 수 있는 기술이 개발되었다. 기존의 조직 투명화 기술은 유기용매를 이용한 조직 투명화 방법인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT의 경우 90% 이상의 항원 보존성을 가지며, 이는 클라리티(CLARITY)와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하여, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.

최근에 개발된 클라리티(CLARITY)법은 조직 내 hydrogel을 넣어서 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 material 등을 붙잡아 주는 일종의 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다. 클라리티(CLARITY) 및 관류 도움 시약 방출방법(PARS)과 같이 광학적으로 투명하고 고분자 투과가 가능한 이미지를 창출할 수 있는 조직투명성 기술은 매우 향상된 기관계 이미징에 있어서 주요한 진전을 제공하였다.

그러나, 상기 클라리티 방법은 hydrogel 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아 더 조직이 단단해져서 지질의 제거가 어려워 지기 때문에 투명화하는데 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이는 조직 표면에 공기 및 검은 입자의 침착을 야기한다. 또한, 기존의 클라리티 법은 과정이 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 한 조직만 투명화 할 수 있어 경제적, 시간적 손실을 유발하며 항체를 이용한 염색이 불안정한 문제가 있었다.

이에, 본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 다양한 조직의 손상 없이 생체 조직의 투명성을 증가시킬 수 있는 투명화 용액을 이용하여 뇌 조직 전체를 투명화하고, 상기 뇌 조직에서 뉴런을 분석하여 신경계 질환 관련 연구 등에 활용할 수 있는 시냅스 기능 장애 평가 방법을 발명하고자 하였다.

한국공개특허 10-2015-0085578

본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 다양한 조직의 손상 없이 생체 조직의 투명성을 증가시킬 수 있는 투명화 용액을 제조하고, 이를 이용하여 뇌 조직을 투명화 함으로써 선명한 뉴런의 3차원 형광 이미지를 획득하였으며, 상기 뉴런의 길이 및 분포를 분석함으로써 시냅스 기능 장애를 평가하는 방법을 발명하였다.

이에, 본 발명의 목적은 하기 단계를 포함하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법을 제공하는 것이다:

(a) 고정 용액으로 동물의 뇌 조직 시료를 고정시키는 단계;

(b) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 투명화 단계;

(c) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계;

(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계; 및

(e) 상기 (a) 내지 (d) 단계를 거친 뇌 조직 시료에서 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 분석하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 신경계 질환 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:

(a) 신경계 질환 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계;

(c) 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 상기 투명화된 뇌 조직에서 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 분석하여 시냅스 기능을 평가하는 단계; 및

(d) 시냅스 기능이 후보물질을 처리하기 전에 비해 개선된 경우 신경계 질환 예방 또는 치료용 후보물질로 선별하는 단계.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법을 제공한다:

(a) 고정 용액으로 동물의 뇌 조직 시료를 고정시키는 단계;

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 신경계 질환 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 신경계 질환 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계;

본 발명의 일 구현예로서, 상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조직 클리어링 용액은 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution)은 농도가 1%(v/v) 내지 30%(v/v)이고, CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 10%(w/v) 내지 40%(w/v)이고, 상기 우레아(urea)는 농도가 30%(w/v) 내지 70%(w/v)이고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 1%(w/v)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 20%(w/v) 내지 60%(w/v)이고, 상기 우레아(urea)는 농도가 10%(w/v) 내지 50%(w/v)이고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 3%일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (e) 단계는 이마리스(Imaris) 프로그램을 이용하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계는 하기 단계를 포함할 수 있다:

(가) 고정 용액으로 동물의 뇌 조직 시료를 고정시키는 단계;

(나) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 투명화 단계;

(다) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계; 및

(라) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.

본 발명에 따른 시냅스 기능 장애 평가 방법은 뇌 조직을 투명화 시키는 단계를 포함하며, 상기 단계에서 뇌 조직을 투명화 시킴으로써 뉴런의 선명한 3차원 이미지를 획득할 수 있고, 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 효과적으로 분석하고 정량화하여 시냅스 기능 장애를 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 시냅스 기능 장애 평가 방법은 신경계 질환 동물모델에서 약물의 처리에 따른 뉴런의 스파인 길이 및 분포를 분석함으로써, 신경계 질환 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝 하는 데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 용액을 이용하여 뇌 조직을 투명화하고, 면역 염색하여 획득한 뉴런의 3차원 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 방법으로 뇌 조직을 투명화 하였을 경우 획득한 뉴런의 3차원 형광 이미지를 CLARITY 방법으로 뇌 조직을 투명화 하였을 경우 획득한 이미지와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일구현예에 따른 투명화 용액을 이용하여 뇌 조직을 투명화하고, 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법을 제공한다:

(a) 고정 용액으로 동물의 뇌 조직 시료를 고정시키는 단계;

(a) 신경계 질환 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계;

본 발명에서 사용되는 용어 "뉴런(neuron)"은 신경계의 단위로서 신경세포라고도 하고 전기적으로 흥분시킬 수 있으며, 정보를 화학적 혹은 전기적 신호로 바꾸어 전달한다. 뉴런 사이의 신호 전달은 시냅스(synapse)라고 부르는 특화된 연결을 통하여 일어나며, 여러 뉴런이 서로 연결되어 신경망(neural network)을 형성한다. 또한, 뉴런은 크고 동그란 핵을 비롯하여 세포의 기능을 유지하기 위해 필요한 여러 세포소기관(organelle)을 포함하고 있는 신경세포체(cell body, soma), 신경세포체에서 뻗어 나온 것으로 다른 신경세포로부터 정보를 받는 역할을 하는 수상 돌기(dendrite), 및 세포질이 길쭉하게 뻗어 나온 것으로 뉴런이 활동전압이라고 불리는 전기적 신호를 전달하는데 이용하는 축삭(axon)으로 이루어져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "스파인(spine)"은 "수상돌기 가시(dendritic spine)"와 동일한 의미로 사용되며, 상기 수상돌기 가시는 신경세포 수상돌기 표면에 존재하는 0.5-2 μm 길이의 작은 돌출 구조로써, 흥분성 시냅스의 시냅스후로 기능한다. 신경세포에 존재하는 수상돌기 가시의 개수 및 크기와 형태는 매우 다양하며, 신경세포의 발달과정 및 개별 시냅스의 활성 정도에 따라 변화한다. 수상돌기 가시 표면에는 시냅스후의 기능에 필요한 다양한 신경전달물질 수용체(Neurotransmitter receptor)가 위치하며, 내부에는 분자신호전달 및 수상돌기 가시 구조 조절 필요한 수백 종류의 다양한 단백질들이 존재한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "시냅스"는 상기 뉴런이 전기적 또는 화학적 신호를 또 다른 세포로 통과시키는 뉴런의 영역을 나타낸다. 시냅스에서, 신호-통과 뉴런(시냅스 전부 뉴런)의 원형질막은 표적(시냅스 후부) 세포의 막과 거의 동격의 상태가 된다.

본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 신경계 질환 동물모델의 뇌 조직에서 상기 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 분석함으로써 신경계 질환 예방 또는 치료 효능을 확인하기 위한 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미하며, 예컨대 화학물질, 단백질, (폴리)뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA (small interference RNA), 또는 천연물 추출물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 신경계 질환 치료제일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계는 하기 단계를 포함할 수 있다:

(라) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유류라면 그 종류에 특별히 제한이 없으며, 예컨대 비-인간 영장류, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 말, 또는 소일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 동물은 마우스일 수 있고, Thy-1을 과발현시킨 Thy-1 transgenic 마우스를 이용하여 마우스의 뇌 조직 이미지를 더 잘 관찰할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있으며, 상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 수크로오스의 농도를 20%(w/v) 이상으로 하여 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정할 수 있으나, 상기 농도에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 조직 클리어링 용액은 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

이 때, 상기 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution)은 농도가 1%(v/v) 내지 30%(v/v)일 수 있고, CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 10%(w/v) 내지 40%(w/v)일 수 있고, 상기 우레아(urea)는 농도가 30%(w/v) 내지 70%(w/v)일 수 있고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 1%(w/v)일 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution)은 4%(v/v) 또는 15%(v/v), CHAPS는 20%(w/v), 우레아는 50%(w/v)일 수 있고, 염화나트륨은 농도를 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v)로 하여 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 할 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 조직 클리어링 용액을 이용하는 투명화 단계는 4%(v/v)의 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution)을 포함한 조직 클리어링 용액을 이용하는 제 1 투명화 단계, 또는 15%(v/v) 의 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution)을 포함한 조직 클리어링 용액을 이용하는 제 2 투명화 단계를 포함할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 제 1 투명화 단계 이후 세척 단계, 제 2 투명화 단계, 및 세척 단계를 순서대로 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있으며, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v)일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도를 0.1%(w/v)로 하여 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척할 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

이 때, 상기 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 20%(w/v) 내지 60%(w/v)일 수 있고, 상기 우레아(urea)는 농도가 10%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 3%일 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 마운팅 용액의 굴절률을 1.45로 맞추기 위해 상기 CHAPS 및 우레아의 조성은 각각 40%(w/v), 40%(w/v)로 포함할 수 있으며, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.1 내지 1%(w/v)로 포함할 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 이마리스(Imaris) 프로그램을 이용하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, Thy-1 transgenic 마우스의 뇌 조직을 투명화하기 위한 용액을 제조하고, 상기 용액을 사용하여 Thy-1 transgenic 마우스의 뇌 조직을 투명화한 후 면역 염색하여 뉴런의 3차원 면역 염색 이미지를 획득하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 이마리스(Imaris) 프로그램을 이용하여 상기 투명화한 뇌 조직에서 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 관찰하였다(실시예 2 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Thy-1 transgenic 마우스의 뇌 조직 투명화 및 뉴런의 3차원 면역 염색 이미지 획득

1-1. 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액의 제조

뇌 조직을 투명화시키기 위해 먼저 조직 투명화를 위해 필요한 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액을 제조하였으며, 상기 용액의 구성 성분은 하기 표 1에 나타내었다.

구체적으로, 생체조직 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정시키기 위해, 농도가 20%(w/v) 이상인 수크로오스(sucrose)를 구성성분으로 하는 고정 용액(fixing solution)을 제조하였다.

또한, 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 생체조직 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 하기 위해, 4%(v/v) 또는 15%(v/v) 농도의 N-Lauroylsarcosine sodium salt solution, 20%(w/v) CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 50%(w/v) 우레아(urea)에 0.1 내지 0.5%(w/v) 농도의 염화나트륨(NaCl)을 추가하여, 본 발명의 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)을 제조하였다.

이어서, 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척시킬 수 있도록 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 0.1%(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 첨가하여 세척 용액(washing solution)을 제조하였다.

또한, 40%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 40%(w/v) 우레아(urea)로 마운팅 용액(mounting solution)을 제조하여 굴절률을 1.45로 맞추었다.

	구성	구성 성분
1	Fixing solution	Sucrose(20%(w/v)이상)
2	Tissue clearing solution	N-Lauroylsarcosine sodium salt solution(4%(v/v) 또는 15%(v/v)), CHAPS(20%(w/v)), Urea(50%(w/v)), NaCl(0.1 내지 0.5%(w/v))
3	Washing solution	PBS, sodium azied(0.1%(w/v))
4	Mounting solution	CHAPS(40%(w/v)), Urea(40%(w/v)), NaCl(0.1 내지 1%(w/v))

1-2. 뇌 조직 투명화 및 뉴런의 3차원 면역 염색 이미지 획득

뇌 조직의 뉴런 3차원 면역 염색 이미지를 확인하기 위해 상기 실시예 1-1에서 제조한 용액(표 1 참조)을 사용하여 Thy-1 GFP transgenic 마우스의 뇌 조직 시료를 투명화 하였다.

구체적으로, The Jackson Laboratory에서 Thy-1 GFP transgenic 마우스를 구입하였으며, 상기 마우스의 brain 시료를 얻기 위해 마취가스로 이소플루란 (isoflurane)을 이용하여 흡입 마취하고, 100% 산소와 혼합하였다. 또한, 마취 후 개복하여 30 ml PBS(pH 7.2)로 3-5분 동안 cardiac perfusion 하고, 다시 30-50 ml의 4% paraformaldehyde로 20-30분 동안 perfusion 하여 마우스의 뇌 조직 시료를 얻었다.

그리고 나서, 상기로부터 수득한 마우스의 뇌 조직 시료를 고정 용액(fixing solution)에 넣고 4℃/50 rpm에서 침전될 때까지 shaking incubation 하고, 침전된 뇌 조직 시료를 4%(v/v) N-Lauroylsarcosine sodium salt solution을 포함하는 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 36시간 동안 shaking incubation하고, 동일한 조건으로 1회 반복하였다.

상기 반응이 끝난 뇌 조직 시료에 50ml의 세척 용액(washing solution)을 넣고 4℃/50 rpm에서 4시간 동안 shaking incubation한 후(3회 반복), 15%(v/v)의 N-Lauroylsarcosine sodium salt solution을 포함하는 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)에 넣고 상기와 동일하게 shaking incubation 하고, 이를 세척 용액(washing solution)으로 다시 washing하였다.

상기 washing이 끝난 뇌 조직 시료는 마운팅 용액(mounting solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 12시간 shaking incubation 하고, 동일한 조건으로 1회 반복하였다.

그런 다음, 상기 마운팅 용액으로 처리한 뇌 조직 시료를 1200 rpm에서 30분 동안 centrifuge하여 시료 내 bubble을 제거하고, 뇌 조직 시료를 image chamber에서 보관하거나 1X PBS에 4℃에서 보관하였다.

상기 방법으로 투명화가 완료된 뇌 조직의 Thy-1 GFP의 형광량을 lightsheet 현미경을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 방법으로 투명화한 뇌 조직에서 선명한 뉴런의 3차원 형광 이미지를 확인할 수 있었다.

또한, 상기 방법으로 투명화한 뇌 조직과 종래 조직 투명화 방법인 CLARITY 방법으로 투명화한 뇌 조직에서의 뉴런 3차원 면역 염색 이미지를 비교하였으며, 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 기존의 조직 투명화 방법인 CLARITY 방법으로 뇌 조직을 투명화 시켰을 때(도 2의 좌측 이미지)에 비해, 표 1에 나타낸 본 발명의 조직 투명화 용액을 이용하여 뇌 조직을 투명화 시켰을 때(도 2의 우측 이미지), 더 선명한 뉴런의 3차원 형광 이미지를 얻을 수 있었다.

실시예 2. 이마리스 ( Imaris ) 프로그램을 통한 뉴런의 스파인 길이 및 분포 분석

상기 실시예 1-2의 방법으로 뇌 조직을 투명화 시킨 후 이마리스(Imaris) 3D 프로그램을 사용하여 3차원으로 나타난 뉴런의 형광 이미지에서 뉴런의 spine 길이 및 분포를 관찰하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 lightsheet현미경으로 관찰한 3차원 이미지를 Imaris filaments를 이용하여 분석하고자 하는 영역을 설정 후 뉴런의 신경세포체(cell body)와 수상돌기(dendrite)를 구분하였다. 시작점(수상돌기의 지름을 설정)에서 끝나는 지점까지의 선택 영역과 3D 이미지의 매칭을 확인하고, 영상의 형광량을 분석하여 수상돌기의 지름 길이를 정확하게 관찰하였고, 수상돌기의 spine은 도 3에 나타낸 바와 같이 파란색으로 나타나는 것을 확인하였으며, Imaris 프로그램에 내장되어 있는 설정으로 spine의 전체 수, 모양, 분지 등을 분석하였다.

수상돌기 spine은 신경세포의 수상돌기에 존재하는 흥분성 신호를 받아들이는 작은 돌출부로서 크기와 모양이 다양하며, 일반적으로 크기가 큰 spine은 그에 비례하는 큰 시냅스 틀을 형성하고 더 다양한 소기관을 가진다. 시냅스후 치밀질(Postsynaptic density)은 보통 spine head에 위치하는 후시냅스 막 근처의 구조물로서 spine 표면적의 10% 정도를 차지하고 있으며, 이러한 spine head의 크기는 시냅스후 치밀질의 면적, 후시냅스 수용체의 수, 시냅스 낭의 수와 비례하기 때문에 spine의 생성 및 성장 기전이 시냅스의 신호전달의 강도와 밀접한 관계가 있다.

따라서, 상기와 같이 수상돌기 및 spine의 길이, 분포 등을 분석함으로써 시냅스의 기능 장애를 평가할 수 있을 것으로 예상되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법:
(a) 고정 용액으로 동물의 뇌 조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 투명화 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계;
(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계; 및
(e) 상기 (a) 내지 (d) 단계를 거친 뇌 조직 시료에서 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 분석하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제2항에 있어서,
상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제1항에 있어서,
상기 조직 클리어링 용액은 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution), CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제4항에 있어서,
상기 N-라우로일사르코신 나트륨염 용액(N-Lauroylsarcosine sodium salt solution)은 농도가 1%(v/v) 내지 30%(v/v)이고, CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 10%(w/v) 내지 40%(w/v)이고, 상기 우레아(urea)는 농도가 30%(w/v) 내지 70%(w/v)이고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 1%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제1항에 있어서,
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제6항에 있어서,
상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제1항에 있어서,
상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제8항에 있어서,
상기 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)는 농도가 20%(w/v) 내지 60%(w/v)이고, 상기 우레아(urea)는 농도가 10%(w/v) 내지 50%(w/v)이고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 3%인 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
제1항에 있어서,
상기 (e) 단계는 이마리스(Imaris) 프로그램을 이용하는 것을 특징으로 하는, 시냅스 기능 장애 평가 방법.
하기 단계를 포함하는, 신경계 질환 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법:
(a) 신경계 질환 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계;
(c) 이마리스(Imaris) 프로그램을 통해 상기 투명화된 뇌 조직에서 뉴런의 스파인(spine) 길이 및 분포를 분석하여 시냅스 기능을 평가하는 단계; 및
(d) 시냅스 기능이 후보물질을 처리하기 전에 비해 개선된 경우 신경계 질환 예방 또는 치료용 후보물질로 선별하는 단계.
제11항에 있어서,
상기 동물의 뇌 조직을 투명화 시키는 단계는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법:
(가) 고정 용액으로 동물의 뇌 조직 시료를 고정시키는 단계;
(나) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 투명화 단계;
(다) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 단계; 및
(라) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.