KR20200095874A - 암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 암 연관 섬유아세포 리프로그래밍 방법에 의하면, 짧은 기간 내에 높은 수득률로 대식세포를 제조할 수 있고, 암 연관 섬유아세포를 제거함으로써 종양 미세환경을 억제할 뿐만 아니라 암 세포를 소멸하는 대식세포로 분화시킬 수 있기 때문에 항암제, 항암 보조제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법{Composition and kit for differentiating cancer associated fibroblasts to macrophage, and method using the same}
암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
최근 항암 면역치료제가 크게 주목을 받으면서 다양한 암 면역치료 기법들이 실제로 임상에 적용되고 있으나, 그 치료성적은 치료환자의 20% 내외로 저조하다. 이러한 한계의 가장 큰 원인으로는 생체 내·외에서 활성화된 면역세포의 성공적인 종양 내 침투가 전제되어야 하기 때문이다. 따라서, 종양 미세환경을 극복하고 암 면역치료 효과를 확장시킬 수 있는 보다 진보되고 다각화된 형태의 암 발생부위 특이적인 종양면역치료 기술이 요구된다.
종양 미세환경(tumor　microenvironment)은 다양한 생물질로 구성되는데, 종양을 둘러싸고 있는 두껍고 치밀하게 축적된 세포외기질(extracellular matrix: ECM)과 암세포의 성장에 도움을 주는 종양 지지형 세포들(cancer supporting cells), 그리고 암세포의 성장을 억제하거나 소멸하는 종양 억제형 세포들 (cancer suppressive cells) 등이 있다. 이들 중 암세포의 성장과 증식을 도와주는 주요 세포는 암-연관 섬유 아세포 (cancer associated fibroblast: CAF), 종양 유관 대식세포 (Tumor associated macrophage: TAM)등이 있는데, 암세포뿐 아니라 이러한 종양 지지형 세포들을 함께 소멸하는 것이 중요하다. 특히, 암의 두껍고 치밀한 세포외기질을 만들어 종양 내 약물이나 면역 치료제의 침투를 방해하는 주요 세포는 CAF인데, CAF는 이러한 역할 이외에도 다양한 사이토카인을 분비하여 암 주변의 혈관 생성, 약물 저항성, 면역 억제를 돕는 것으로 알려져 있다. CAF는 정상 섬유아세포, 정상 혈관세포, 정상 중간엽 줄기세포, 정상 지방세포 등이 종양 미세환경에서 암세포가 분비하는 다양한 사이토카인들에 의해 리프로그래밍되어 만들어진 새로운 종류의 세포이다.
따라서, 종양 지지형 세포의 일종인 CAF를 리프로그래밍 하여 종양 억제형 세포의 일종인 대식세포로 분화한다면, 종양 미세환경을 바꿀 뿐 아니라 대식세포에 의한 암 치료 효과까지도 기대할 수 있다. 특히 종양 미세환경을 파괴함으로써, 기존의 면역치료제 혹은 면역세포들의 침투를 도울 수 있어, 이미 개발된 면역항암치료제들의 효과를 더욱 증강시킬 수 있을 것으로 기대된다.
일 양상은 암 연관 섬유아세포(CAF)에서 Oct4 및 Sox2의 발현을 강화시키고, 배지에서 배양하여 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계; 상기 유도만능줄기세포를 배지에서 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계; 및 상기 조혈모세포를 배지에서 배양하여 대식세포로 분화시키는 단계를 포함하는 암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 대식세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 대식세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 암 연관 섬유아세포(CAF)에서 Oct4 및 Sox2의 발현을 강화시키고, 배지에서 배양하여 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계; 상기 유도만능줄기세포를 배지에서 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계; 및 상기 조혈모세포를 배지에서 배양하여 대식세포로 분화시키는 단계를 포함하는 암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 방법에 의하면, 종양 지지형 세포의 일종인 CAF를 리프로그래밍(reprogramming) 하여 종양 억제형 세포의 일종인 대식세포로 분화할 수 있다. CAF를 리프로그래밍 하게 되면 CAF에 의한 ECM 생성, 혈관생성 촉진, 암 성장 및 전이를 막을 뿐 아니라 대식세포는 주변의 암세포를 직접 죽일 수 있으므로, 암 미세환경을 바꿀 뿐 아니라 암 치료의 효과도 기대할 수 있다. 또한 종양의 미세환경을 파괴함으로써, 기존의 면역치료제 혹은 면역세포들의 침투를 도울 수 있어, 이미 개발된 면역항암치료제들의 효과를 더욱 증강시키는 항암치료 보조제로서 활용할 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "섬유아세포(fibroblast)"는 섬유성 결합조직의 성분을 이루는 세포로 포유류의 결합조직의 세포를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "암 연관 섬유아세포(Cancer-Associated Fibroblast: CAF)"는 암의 종양 기질 내에 존재하는 세포 종류를 의미하고, 대부분의 암에서 종양의 성장, 종양 혈관 생성, 종양세포의 침윤 및 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다.
상기 암 연관 섬유아세포는 암 조직 시료에서 분리된 것일 수 있다. 용어, "세포의 분리"는 처리하지 않은 조직 속에서 분리하고자 하는 세포와 정상적으로 결부되어있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 한 조직에서 얻은 세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 조직 속에서 그 세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다. 본 명세서에서 "분리된"은 자연적으로 발생하는 조직, 또는 세포 내의 환경과는 다른 환경에 존재하는 조직, 또는 세포를 의미할 수 있다. 예를 들면, 세포는 자연적으로 다세포 기관에서 발생하고, 상기 세포가 다세포 기관으로부터 제거되었다면 세포는 "분리된" 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 암 연관 섬유아세포는 정상 섬유아세포에 비하여 암 연관 섬유아세포 마커, 예를 들면 α-SMA, FSP-1, VEGF 및/또는 MMP2의 발현이 증가된 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 암 연관 섬유아세포에서 Oct4 및 Sox2의 발현을 강화시키고, 배지에서 배양하여 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에서 용어 "Oct4(octamer binding trascription factor 4) 및 Sox2(SRY-box2)의 발현 강화"는 암 연관 섬유아세포에 Oct4 및 Sox2 유전자 또는 단백질의 발현을 대조군 암 연관 섬유아세포에 비해서 증가되도록 조작하는 공지된 행위를 지칭할 수 있다. 상기 대조군 암 연관 섬유아세포는 상기 유전자의 발현이 강화되기 전, 예를 들면 야생형 암 연관 섬유아세포일 수 있다. 상기 발현 강화는 예를 들어, 바이러스 벡터를 통한 형질도입, 단백질 주입, Oct4 또는 Sox2를 발현하는 것으로 알려진 chemical cocktail의 처리, Oct4 및/또는 Sox2의 발현을 증가시킬 수 있는 miRNA를 처리에 의해 수행될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 발현 강화는 Oct4 및 Sox2 유전자를 암 연관 섬유아세포에 형질도입시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 형질도입은 예를 들면 렌티 바이러스 벡터를 사용한 공지된 방법에 의하여 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, Oct4 및 Sox2 발현이 강화된 암 연관 섬유아세포를 배지에서 배양하여 유도만능줄기세포로 분화시킬 수 있다. 또한, 상기 방법에 있어서, miR125b 발현을 추가적으로 강화시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어 "만능줄기세포"는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 세포이다. 만능세포는 수정란세포와 함께 초기 배아단계의 세포들을 포함한다. 전분화능은 전형적으로 분열된 배반포의 내세포덩이(intermal cell mass)로부터 얻어지는 배아줄기세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세 가지 배엽 세포 모두로 분화할 수 있는 줄기세포를 말한다. 본 명세서에서 용어 "유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cell: iPSC)"는 특정한　유전자를 인위적으로 발현시켜 비만능세포인 성체체세포를 유도하여 인공적으로 만들어진 만능줄기세포를 지칭할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 암 연관 섬유아세포를 혈청 대체물, β-메르캅토에탄올, bFGF(basic fibroblast growth factor), 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다. 상기 혈청 대체물은 녹아웃 혈청 대체물일 수 있다.
상기 혈청 대체물의 농도는 전체 배지 중 약 1 내지 20 질량%, 약 2 내지 18 질량%, 약 5 내지 15 질량%, 약 6 내지 14 질량%, 약 7 내지 13 질량%, 약 8 내지 12 질량%일 수 있다. 상기 β-메르캅토에탄올의 농도는 약 0.05 내지 1.5 mM, 약 0.06 내지 1.4 mM, 약 0.07 내지 1.3 mM, 약 0.08 내지 1.2 mM, 또는 약 0.09 내지 1.1 mM일 수 있다. 상기 bFGF의 농도는 약 1 내지 20 ng/ml, 약 2 내지 18 ng/ml, 약 5 내지 15 ng/ml, 약 6 내지 14 ng/ml, 약 7 내지 13 ng/ml, 약 8 내지 12 ng/ml일 수 있다.
상기 배지는 글루타민, 비필수아미노산, 페니실린, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 배지는 DMEM/F-12 배지일 수 있다.
상기 배양은 부착 배양일 수 있다. 부착 배양 시, 상기 세포는 geltrex가 코팅된 세포 지지체, 예를 들면 플레이트에서 부착 배양되는 것일 수 있다.
상기 배양은 약 10 내지 20일, 약 11 내지 19일, 약 12 내지 18일, 약 13 내지 17일, 약 14 내지 16일 동안 지속되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 암 연관 섬유아세포에서 Oct4 및 Sox2의 발현을 강화시키거나 또는 선택적으로 miR125b의 발현을 추가적으로 강화시키고, 배지에서 배양함으로써 암 연관 섬유아세포가 전분화능을 획득하여 유도만능줄기세포로 분화할 수 있다. 상기 유도만능줄기세포는 전분화능 마커인 Oct4, Sox2 및 Nanog를 발현하는 세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 유도만능줄기세포를 배지에서 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에 있어서 용어 "조혈모세포(hematopoietic stem cell)"는 조혈모세포는 골수에서 자가 복제 및 분화를 통해 백혈구, 적혈구 및 혈소판 등의 혈액세포를 만들어 내는 세포를 지칭할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 유도만능줄기세포를 β-메르캅토에탄올, FCS(fetal calf serum), 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
상기 β-메르캅토에탄올의 농도는 약 0.05 내지 1.5 mM, 약 0.06 내지 1.4 mM, 약 0.07 내지 1.3 mM, 약 0.08 내지 1.2 mM, 또는 약 0.09 내지 1.1 mM일 수 있다. 상기 FCS의 농도는 전체 배지 중 약 10 내지 30 질량%, 12 내지 28 질량%, 약 15 내지 25 질량%, 약 17 내지 23 질량%, 약 16 내지 22 질량%일 수 있다.
상기 배지는 비필수아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 배지는 KnockOut DMEM 배지일 수 있다.
상기 배양은 비부착 배양일 수 있다. 상기 비부착 배양에 따라, 세포가 구형을 형성하면서 배양될 수 있다.
상기 배양은 약 10 내지 20일, 약 11 내지 19일, 약 12 내지 18일, 약 13 내지 17일, 약 14 내지 16일 동안 지속되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 유도만능줄기세포를 상기 배지에서 배양함으로써 유도만능줄기세포가 혈액세포로의 분화능을 획득하여 조혈모세포로 분화할 수 있다. 상기 조혈모세포는 CD34 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 CD34 단백질의 발현을 확인하는 방법은 공지된 방법인 유세포 분석에 의하여 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, Sox2 및 Oct4, 또는 선택적으로 miR125b를 강화한 암 연관 섬유아세포로부터 유도된 유도만능줄기세포를 일 양상에 따른 방법에 의하여 조혈모세포로 분화시킨 경우, CD34, CD45 단백질의 발현이 가장 높게 확인되었다.
또한 일 구체예에 있어서, Sox2 및 Oct4, 또는 선택적으로 miR125b를 강화한 암 연관 섬유아세포로부터 유도된 유도만능줄기세포를 일 양상에 따른 방법에 의하여 조혈모세포로 분화시킨 경우, 중배엽 계열 마커인 GATA2 및/또는 Brachy의 발현이 가장 높게 확인되었다.
또한 일 구체예에 있어서, Sox2 및 Oct4, 또는 선택적으로 miR125b를 강화한 암 연관 섬유아세포로부터 유도된 유도만능줄기세포를 일 양상에 따른 방법에 의하여 조혈모세포로 분화시킨 경우, EB 형성능이 우수한 것을 확인하였다.
일 양상에 따른 방법에 의해 획득된 조혈모세포는 대식세포로의 분화능을 갖는다.
상기 방법에 있어서, 조혈모세포를 배지에서 배양하여 대식세포로 분화시키는 단계에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에 있어서 용어 "대식세포(macrophage)"는 종양 억제형 세포의 일종으로, 면역을 담당하는 세포를 지칭할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 상기 조혈모세포를 IL-4, M-CFS, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
상기 IL-4의 농도는 약 1 내지 20 μg/ml, 약 2 내지 18 μg/ml, 약 5 내지 15 μg/ml, 약 6 내지 14 μg/ml, 약 7 내지 13 μg/ml, 약 8 내지 12 μg/ml일 수 있다. 상기 M-CFS의 농도는 전체 배지 중 약 1 내지 20 μg/ml, 약 2 내지 18 μg/ml, 약 5 내지 15 μg/ml, 약 6 내지 14 μg/ml, 약 7 내지 13 μg/ml, 약 8 내지 12 μg/ml일 수 있다.
상기 배지는 FBS를 더 포함할 수 있다.
상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 배지는 RPMI 1640 배지일 수 있다.
상기 배양은 부착 배양일 수 있다.
상기 배양은 약 5 내지 10일, 약 6 내지 9일, 약 7 내지 8일 동안 지속되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 조혈모세포를 상기 배지에서 배양함으로써 조혈모세포가 대식세포 기능성을 획득하여 대식세포로 분화할 수 있다. 상기 대식세포는 대식 작용을 하는 것일 수 있다. 상기 대식세포에 의해서 암 예방 또는 치료 효과가 나타날 수 있다.
일 구체예에 있어서, 일 양상에 따른 방법에 의해 분화된 대식세포는 다른 방법에 의해 분화된 대식세포에 비해서 C/EBPα, PU.1, MXIL1 및/또는 GATA1의 발현이 증가된 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 대식세포를 제공한다.
상기 방법에 대하여는 상술한 바와 같다.
상기 대식세포는 암 연관 섬유아세포로부터 제조되는 것일 수 있으므로, 암 연관 세포를 암 미세환경으로부터 제거하는 효과를 나타낼 수 있다. 암 미세환경 내의 상호작용을 촉진하여 암 세포의 침윤을 증가시켜 암 세포의 악성도를 증가시키는 등, 종양의 성장, 종양 혈관 생성, 종양세포의 침윤 및 전이에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로, 상기 대식세포를 활용함으로써 암 미세환경을 제거하여 항암제 또는 면역항암제의 보조제로 활용할 수 있다.
또한 상기 대식세포는 암세포를 직접적으로 사멸, 억제시키는 효과를 나타내는 것일 수 있으므로, 항암제로 활용할 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 대식세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 대식세포의 암 예방 또는 치료를 위한 세포치료제로서의 용도를 제공한다.
상기 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및 /또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 암 연관 섬유아세포 리프로그래밍 방법에 의하면, 짧은 기간 내에 높은 수득률로 대식세포를 제조할 수 있고, 암 연관 섬유아세포를 제거함으로써 종양 미세환경을 억제할 뿐만 아니라 암 세포를 소멸하는 대식세포로 분화시킬 수 있기 때문에 항암제, 항암 보조제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 암 연관 섬유아세포에서 암 연관 섬유아세포 마커인 α-SMA, FSP-1, VEGF, MMP2의 발현 정도를 qRT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 2a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포를 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포를 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포에서 전분화능 표지자인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 3b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포에서 전분화능 표지자인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 4는 일 양상에 따른 방법에 의해 암 연관 섬유아세포로부터 획득된 유도만능줄기세포가 EB 형성능을 갖는지 확인한 결과이다.
도 5a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포의 막 단백질인 CD34의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 5b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포의 막 단백질인 CD34의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 6a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포에서 GATA2 및 Brachy의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 6b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포에서 GATA2 및 Brachy의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 7a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 막 단백질인 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 7b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 막 단백질인 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 8a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 C/EBPα, PU.1, MXIL1 및 GATA1의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 8b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 C/EBPα, PU.1, MXIL1 및 GATA1의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 9a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 대식세포의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 9b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 대식세포의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 10은 암 연관 섬유아세포로부터 대식세포를 제조하기 위한 모식도이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 암 연관 섬유아세포로부터 대식세포의 제조
암 연관 섬유아세포로부터 대식세포를 제조하기 위해, 먼저 암 연관 섬유아세포에 분화 인자를 형질도입하여 만능줄기세포를 제조하고, 이를 조혈모세포로 분화시킨 후 조혈모세포로부터 대식세포로 분화시켰다. 암 연관 섬유아세포로부터 대식세포를 제조하기 위한 모식도는 도 10과 같다.
1.1. 세포주 및 벡터의 준비
인간의 대장암에서 유래한 암 연관 섬유아세포(Cancer Associated Fibroblast: CAF, Catalog # CAF05)를 Neuromics (USA)에서 구입하였다. 대조군으로 폐 정상 섬유아세포인 MRC5를 ATCC(USA)에서 구입하여 사용하였다.
섬유아세포에 형질도입할 분화 인자는 Oct4, Sox2, 및/또는 miR125b이고, 이들의 발현을 위한 렌티 바이러스 벡터 (pLM-mCitrin-Sox2, pLM-vexGFP-Oct4, pMG-MIR-125b-1)는 Addgene에서 구입하였고, LPP-mCherry-HmiR125b는 macrogen 에서 제작하였다.
사용한 섬유아세포의 특성을 확인하기 위해, CAF 마커로 보고된 α-SMA, FSP-1, VEGF, MMP2P의 발현 양상을 qRT-PCR로 확인하였다. Trizol을 이용하여 세포 내 RNA를 분리하고, 1μg의 RNA를 기반으로 cDNA를 합성, 표 1의 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 암 연관 섬유아세포에서 CAF 마커의 발현 정도를 정상 섬유아세포에서 상기 CAF 마커의 양을 1로 하여 상대적으로 나타내었다.
유전자 이름 5'-> 3' 서열 비고
a-SMA 정방향 CACTGCCGCATCCTCATC 서열번호 1
역방향 TGCTGTTGTAGGTGGTTTCAT 서열번호 2
FSP1 정방향 TGTCCTGCATCGCCATGATGT GTA 서열번호 3
역방향 TGAACTTGCTCAGCATCAAGCACG 서열번호 4
VEGF 정방향 AGGAGGAGGGCAGAATCATCA 서열번호 5
역방향 CTCGATTGGATGGCAGTAGCT 서열번호 6
MMP2 정방향 GCGGCGGTCACAGCTACTT 서열번호 7
역방향 CACGCTCTTCAGACTTTGGTTCT 서열번호 8
OCT4 정방향 CTGAAGCAGAAGAGGATCAC 서열번호 9
역방향 GACCACATCCTTCTCGAGCC 서열번호 10
SOX2 정방향 AACGTTTGCCTTAAACAAGACCAC 서열번호 11
역방향 CGAGATAAACATGGCAATCAAATG 서열번호 12
NANOG 정방향 CGAAGAATAGCAATGGTGTGACG 서열번호 13
역방향 TTCCAAAGCAGCCTCCAAGTC 서열번호 14
GATA2 정방향 GGGCTAGGGAACAGATCGACG 서열번호 15
역방향 GCAGCAGTCAGGTGCGGAGG 서열번호 16
Brachy 정방향 ATGAGCCTCGAATCCACATAGT 서열번호 17
역방향 TCCTCGTTCTGATAAGCAGTCA 서열번호 18
C/EBPa 정방향 CTAGAGATCTGGCTGTGGGG 서열번호 19
역방향 TCATAACTCCGGTCCCTCTG 서열번호 20
PU.1 정방향 ACGGATCTATACCAACGCCA 서열번호 21
역방향 GGGGTGGAAGTCCCAGTAAT 서열번호 22
MIXL1 정방향 AGTTGGACTGCCTTGGTCACTT 서열번호 23
역방향 ACAAACCTCCGCCTTTCCTCTACA 서열번호 24
GATA1 정방향 GGGATCACACTGAGCTTGC 서열번호 25
역방향 ACCCCTGATTCTGGTGTGG 서열번호 26
GAPDH 정방향 GAAAYCCCATCACCAATCTTCCAGG 서열번호 27
역방향 GCAATTGAGCCCCAGCCTTCTC 서열번호 28
도 1은 암 연관 섬유아세포에서 암 연관 섬유아세포 마커인 α-SMA, FSP-1, VEGF, MMP2의 발현 정도를 qRT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 사용된 CAF에서 정상 섬유아세포에 비해 CAF 마커로 보고된 마커의 발현이 과발현되어 있음을 확인하였다.
1.2. 암 연관 섬유아세포로부터 유도만능줄기세포의 제조
Oct4, Sox2, miR125b 유전자 발현을 위한 렌티 바이러스 벡터를 암 연관 섬유아세 (CAF) 에 형질도입하여 만능줄기세포를 제조하였다. 구체적으로, 바이러스 입자 형성에 사용될 packaging DNA (TAKARA) 와 pLM-mCitrin-Sox2, pLM-vexGFP-Oct4 및 LPP-mCherry-HmiR125b 각각의 바이러스 벡터를 3:1 비율로 조합한 후 숙주 세포인 HEK293T 세포에 도입하였다. 도입 48시간 후, 바이러스가 포함되어있는 숙주세포의 배지를 0.45μm 크기의 필터로 여과하여 세포 부유물을 제거함으로써 바이러스를 획득하였다.
CAF와 정상 섬유아세포를 6-웰 플레이트에 배양하여 90% 이상 성장하였을 때, 폴리브렌을 이용하여 상기에 획득한 렌티 바이러스를 CAF와 정상 섬유아세포를 감염시키도록 유도하였다. 렌티 바이러스를 각 세포에 2회 감염시키고 약 48시간마다 배지를 교체하면서 약 14일 동안 부착 배양하여 섬유아세포가 전분화능을 획득하여 유도만능줄기세포가 되도록 유도하였다. 이때, 단백질인 geltrex가 코팅된 플레이트에서 부착 배양하였다.
렌티 바이러스를 통해 섬유아세포에 형질 도입된 유전자 조합은 다음과 같다.
- Oct4
- Sox2
- Oct4/Sox2
- miR125b
- Sox2/miR125b
사용된 배지 조성은 다음과 같다:
DMEM/F12 + 10% 녹아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement: KSR) + 1% NEAA + 1mM L-글루타민 + 1% 페니실린 스트렙토마이신(P/S) + 0.1 mM β메르캅토에탄올 + 10 ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor) + 30 ng/ml IGFII(insulin-like growth factor 2)
1.3. 유도만능줄기세포로부터 조혈모세포의 분화
상기 획득된 유도만능세포로부터 조혈모세포를 제조하기 위해, 상기 배양에 의해 콜로니가 확인되면, 부착형 세포배양에서 poly-hema가 코팅된 배양기에서의 비부착 세포배양 방법으로 변경하였다. 비부착 세포배양 방법으로 변경함에 따라 세포가 구형(sphere 형태)으로 성장할 수 있다. 약 48시간에 한번씩 배지를 바꿔주면서 약 14일간 배양하였다. 구체적으로는, 처음 약 7일 동안은 배지를 첨가하고 나머지 기간 동안에는 이틀에 한번씩 배지를 바꿔 조혈모세포 분화를 유도하였다. 사용된 배지 조성은 다음과 같다:
KnockOut DMEM (KO-DMEM) + 20% FCS(fetal calf serum) + 1% 페니실린 스트렙토마이신 (P/S) + 1% NEAA + 1mM L-글루타민 + 0.1 mM β메르캅토에탄올
1.4. 조혈모세포로부터 대식세포의 분화
상기 분화된 조혈모세포로부터 대식세포로의 분화를 유도하기 위해, 상기 배양에 의해 확보된 구 형태의 조혈모세포를 accutase를 이용하여 단일 세포로 분리한 후, 부착배양을 진행하였다. 대식세포 분화 유도를 위해 배지를 격일로 교체하며 약 일주일 동안 배양하였다. 사용된 배지 조성은 다음과 같다:
RPMI1640 + 10% FBS + 1% (P/S) + 10 μg/ml IL-4 + 10 μg/ml M-CSF
실험예 1. 암 연관 섬유아세포로부터 제조된 유도만능줄기세포의 검증
상기 실시예 1.2.에서 획득된 유도만능줄기세포의 세포 모양 및 유전자 도입에 의한 단백질 변화를 확인기 위해, 형광을 이용하였다. 구체적으로, Sox2는 mCitrin 단백질 형광, Oct4는 GFP 단백질 형광, miR125b은 mCherry 단백질 형광을 통해 확인하였다. 세포 모양 관찰을 위해 Nikon Eclipse Ts2P 형광 현미경을으로 이미징 하였다. GFP 형광은 470 nm 파장으로 여기한 후 39002 filter set (Chroma)로 검출하였고, mCitrin과 mCherry는 525 nm 의 파장으로 여기한 후, 39004 filter set (Chroma)로 검출하였다.
도 2a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포를 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포를 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, CAF 및 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2 및/또는 miR125b의 형질도입에 의한 과발현 유도에 따라 유도된 유도만능줄기세포는 배아줄기세포의 모양과 같은 줄기세포 콜로니를 형성하는 것을 확인하였다. 또한 형질도입된 유전자의 발현에 따른 형광이 발현되는 것을 확인하였다.
따라서, CAF 및 정상 섬유아세포에 형질도입에 의한 Oct4, Sox2 및/또는 miR125b 유전자가 과발현 되었고, 이에 따라 제조된 세포는 줄기세포 콜로니를 형성하므로, 유도만능줄기세포로 잘 분화된 것을 알 수 있다.
또한 Oct4, Sox2 및/또는 miR125b의 단일 또는 복합 유전자 도입에 의해 전분화능 표지자인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현이 증가하는지 확인하기 위해, qRT-PCR을 수행하였다.
도 3a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포에서 전분화능 표지자인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 3b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포에서 전분화능 표지자인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 암 연관 섬유아세포에서 Oct4 혹은 Oct4와 Sox2를 모두 과발현시킨 경우 Oct4, Sox2, Nanog의 발현정도가 유사하게 나타났으나, 정상 섬유아세포의 경우 Oct4만 과발현시킨 경우에도 Sox2의 발현정도가 Sox2를 과발현 시킨 경우만큼 나타나는 것을 확인하였다. 이는 정상 섬유아세포의 경우 Oct4 하나의 과발현으로도 조혈모세포의 분화가 가능하다는 종래 연구결과를 뒷받침한다. 한편, 암 연관 섬유아세포에서 Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 과발현시킨 경우 Oct4, Sox2, Nanog의 발현정도가 유사한 것으로 나타났고, 정상 섬유아세포의 경우도 세가지 모두 유사한 결과를 보였다. 또한, 암 연관 섬유아세포의 경우 miR125b가 과발현 되면 Nanog의 발현율이 상대적으로 높은것으로 나타났다.
따라서, 상기 방법에 의해 획득한 유도만능줄기세포가 성공적으로 분화되었고,암 연관 섬유아세포와 정상 섬유아세포를 동일한 분화 방법에 의해 유도만능줄기세포로 분화시킨 경우에도, 분화된 유도만능줄기세포는 서로 다른 세포 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.
실험예 2. 조혈모세포의 검증
상기 실시예 1.3.에서 획득된 조혈모세포가 분화 능력을 갖는지 확인하기 위해, 줄기세포의 특성인 embryonic body(EB) 형성능을 확인하였다. 구체적으로, 유전자 도입으로 형성된 콜로니를 단일 세포로 분리한 후에 poly-hema가 코팅된 배양기에 배양하여 매일 현미경으로 확인하였다.
줄기세포 능력을 획득한 세포는 3차원 구형으로 비부착 상태에서 세포 성장이 가능하지만, 줄기세포 능력이 없는 세포는 3차원 세포 성장이 불가능하다.
도 4는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포가 EB 형성능을 갖는지 확인한 결과이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입한 모든 경우 획득된 유도만능줄기세포가 3차원 구형으로 비부착 상태에서 세포 성장을 하였으므로, EB 형성능을 갖는 것을 확인하였다. 또한 상기 방법에 의해 제조된 유도만능줄기세포의 EB로부터 조혈모세포로의 분화를 유도하였다.
따라서, 상기 방법에 의해 제조된 유도만능줄기세포는 전분화능 줄기세포의 특성을 갖는 것을 확인하였다.
또한, 상기 유도만능줄기세포의 조혈모세포 및 혈액세포로의 분화능을 확인하기 위해서 유세포분석법을 이용하여 조혈모세포 세포막 표지자인 CD34 단백질 발현 정도를 확인하였다. 우선, 세포를 Accutase (gibco) 처리하여 단일 세포로 분리한 후, 1% FBS/PBS 용액 세척 및 차단(blocking) 후 APC 접합 항체로 항원-항체 결합 반응시켰다. CD34 단백질의 발현을 확인하기 위해 BD사의 APC Mouse Anti-Human CD34를 사용하였고, 대조군으로 APC Mouse IgG1-Isotype을 사용하여 유세포분석을 시행하였으며 데이터는 flowjo 프로그램을 이용하여 분석하였다.
도 5a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포의 막 단백질인 CD34의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 5b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포의 막 단백질인 CD34의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, CAF에서 유래된 조혈모세포의 경우 Oct4와 Sox2를 동시에 처리한 경우(Oct4/Sox2) CD34의 발현이 가장 증가됨을 확인하였다. 정상 섬유아세포의 경우 Sox2, miR125b 단독 혹은 Oct4와 Sox2를 동시에 처리한 경우 모두 유사한 결과를 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 상기 세포가 중배엽 분화능을 갖는 것을 확인하기 위해, qRT-PCR을 통해 중배엽 계열(mesodermal lineage) 마커인 GATA2와 Brachy 발현을 확인하였다.
도 6a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포에서 GATA2 및 Brachy의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 6b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 조혈모세포에서 GATA2 및 Brachy의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, CAF로부터 분화된 조혈모세포의 경우 miR125b가 있는 경우 Brachy (T)가 확연히 증가하였으나, 정상 섬유아세포로부터 분화된 조혈모세포는 그 변화가 뚜렷하지 않았다.
또한, 획득된 조혈모세포가 대식세포로의 분화 능력을 갖는지 확인하기 위해, 상기 형성된 EB를 단일세포로 분리하여 배양하였다. 7일간 macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)와 사이토카인을 반응시킨 후, 혈구세포/단핵세포의 세포막 표현형인 CD45의 발현을 항원-항체반응을 이용하여 유세포분석으로 분석하였다.
도 7a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 막 단백질인 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 7b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 막 단백질인 CD45의 발현을 유세포분석으로 확인한 결과이다.
도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, CAF에서 유래된 조혈모세포의 경우 Oct4와 Sox2를 동시에 처리한 경우 CD45의 발현이 가장 증가됨을 확인하였다.
또한, 획득된 조혈모세포가 대식세포로의 분화 능력을 갖는지 확인하기 위해, 조혈모세포에서 C/EBPα, PU.1, MXIL1 및 GATA1의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인하였다. C/EBPα는 혈액세포 분화/발달에서 핵심 인자 중 하나이고, PU.1은 단핵세포/대식세포 분화 및 발달 유도인자로 알려져 있다. 또한, MXIL1과 GATA1은 중배엽 계열 및 혈구/단핵세포 분화 유도에 기여하는 인자이다. 이 유전자들은 조혈모세포-줄기세포 특성을 가진 세포보다 분화되면서 혈액세포의 특성을 결정하고 이의 기능을 발달시키는 역할을 하는 것으로 보고되었다.
도 8a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 C/EBPα, PU.1, MXIL1 및 GATA1의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 8b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 조혈모세포에서 C/EBPα, PU.1, MXIL1 및 GATA1의 발현 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과이다.
도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 대식세포의 분화/발달에 있어 핵심인자인 C/EBPα의 발현이 크게 증가되었고, 단핵세포 분화 및 발달 유도인자인 PU.1 발현 또한 대식세포 분화 후 증가됨이 확인되었다. 또한 중배엽 계열과 단핵세포 분화 유도에 기여하는 MXIL1과 GATA1 발현이 Oct4, Sox2 단독 도입보다는 동시발현 유도하였을 때 증가함을 확인하였다. 정상 섬유아세포에서 유래된 혈구세포의 경우 Oct4의 역할 보다는 Sox2, miR125b 단독 혹은 Oct4와 동시 처리한 경우에 CD45의 발현이 증가됨을 확인하였다. Sox2 도입은 C/EBPα의 발현을 증가시켰으며, 이는 Oct4와 같이 유도하였을 때 가장 발현이 큰 것을 확인하였다. 또한 단핵세포 분화/발달 기여인자인 PU.1과 MXIL1의 경우에도 Sox2 도입 정상섬유아세포 유래 혈구세포에서 발현이 증가되었다.
실험예 3. 대식세포의 기능성 평가
상기 실시예 1.4.에서 획득된 대식세포가 기능성을 갖는지 확인하기 위해, 대식작용 평가를 수행하였다. 구체적으로, 1μm 크기의 라텍스 비드를 사용하였다. 일주일간 조혈모세포로부터 대식세포의 분화를 유도한 후, 세포 배양 배지에 안정화시킨 1μm 사이즈의 라텍스 미드(sigma)를 세포 배양에게 첨가하여 90분간 반응시켰다. 차가운 phosphate-buffered saline (PBS)으로 세척 후, 4% paraformaldehyde 액으로 고정하여 세포 모양 및 대식과정을 현미경으로 관찰하였다.
도 9a는 암 연관 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 대식세포의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 9b는 정상 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Oct4/Sox2, miR125b, Sox2/miR125b를 형질도입하여 획득한 대식세포의 대식작용을 평가한 결과이다.
도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, CAF와 정상 섬유아세포 유래 대식세포를 라텍스 비드와 동시 배양을 하였을 때, 세포 내로 라텍스 비드가 흡수(uptake)되는 것을 확인하였다. 또한 세포의 모양도 대식세포와 유사하게 변화함을 확인하였다.
따라서, 일 양상에 따른 방법에 의해 제조한 CAF, 정상 섬유아세포 유래 대식세포가 대식 작용을 하는 기능성있는 대식세포로 분화되었음을 확인하였다.
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Claims (16)

  1. 암 연관 섬유아세포(CAF)에서 Oct4 및 Sox2의 발현을 강화시키고, 배지에서 배양하여 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계;
    상기 유도만능줄기세포를 배지에서 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계; 및
    상기 조혈모세포를 배지에서 배양하여 대식세포로 분화시키는 단계를 포함하는 암 연관 섬유아세포의 대식세포로의 분화 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계에서 상기 암 연관 섬유아세포에서 miR125b의 발현을 추가적으로 강화시키는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계에서 상기 암 연관 섬유아세포를 혈청 대체물, β-메르캅토에탄올, bFGF(basic fibroblast growth factor), 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계에서 상기 배양은 부착 배양인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 유도만능줄기세포로 분화시키는 단계에서 10 내지 20일 동안 배양하는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 조혈모세포로 분화시키는 단계에서 상기 유도만능줄기세포를 β-메르캅토에탄올, FCS(fetal calf serum), 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 조혈모세포로 분화시키는 단계에서 상기 배양은 비부착 배양인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 조혈모세포로 분화시키는 단계에서 10 내지 20일 동안 배양하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 대식세포로 분화시키는 단계에서 상기 조혈모세포를 IL-4, M-CFS, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 대식세포로 분화시키는 단계에서 상기 배양은 부착 배양인 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 대식세포로 분화시키는 단계에서 5 내지 10일 동안 배양하는 것인 방법.
  12. 청구항 3에 있어서, 상기 혈청 대체물의 농도는 전체 배지 중 1 내지 20 질량%이고, 상기 β-메르캅토에탄올의 농도는 0.05 내지 1.5 mM 이고, 상기 bFGF의 농도는 1 내지 20 ng/ml인 것인 방법.
  13. 청구항 6에 있어서, 상기 β-메르캅토에탄올의 농도는 0.05 내지 1.5 mM이고, 상기 FCS의 농도는 전체 배지 중 10 내지 30 질량%인 것인 방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 IL-4의 농도는 1 내지 20 μg/ml이고, 상기 M-CFS는 1 내지 20 μg/ml인 것인 방법.
  15. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 대식세포.
  16. 청구항 1의 방법에 의해 제조된 대식세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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