KR20200087721A - 알긴산 나노 입자를 합성하는 방법 및 이 방법으로 제조된 알긴산 나노 입자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알긴산 수용액에 전자빔을 조사하여, 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는, 가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

알긴산 나노 입자를 합성하는 방법 및 이 방법으로 제조된 알긴산 나노 입자{MANUFACTURING METHOD OF ALGINIC ACID NANOPARTICLE AND ALGINIC ACID NANOPARTICLE PREPARED BY THE METHOD}

본 발명은 가교제 없이 생체적합성을 가지며, 순수한 알긴산 가교체인 나노 입자를 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 나노 입자, 그리고 이러한 나노 입자의 활용에 관한 것이다.

알긴산은 카르복실산 그룹을 지닌 다당류로 다시마와 같은 해초류에 함유되어 있는 생체고분자로서 인체에 대한 독성이 매우 낮으며 소화관에서 보호막을 형성하여 위산에 의한 소화관 및 소화벽의 손상을 막는 역할을 하기에 제산제와 병용하여 많이 활용되고 있으나, 현재까지 종양 진단제 및 치료제로서의 활용 가능성에 대한 연구는 활발히 이루어지지 않고 있다.

생체에서 사용가능하고, 생체적합한 순수한 알긴산의 수화겔과 같은 나노입자는 이의 조영제로서의 사용 및 생체 내에 사용에 필수적일 것인데, 통상 수화겔은 고분자 물질에 가교제 및/또는 경화제 등의 화학물질을 첨가하여 가교하는 방법으로 제조되어 왔다.

그러나 상기 가교반응에 사용되는 가교제 및/또는 경화제 자체가 생체에 유해하므로 이러한 가교제 및/또는 경화제를 사용하여 제조된 수화겔이 생체에 사용되는 경우에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 문제가 있을 것이고, 또한, 가교제 및/또는 경화제가 사용되는 경우에는 수화겔 제조 후에 수화겔 내의 잔류 가교제 및/또는 경화제를 제거하여야 하므로 제조공정이 복잡할 뿐만 아니라 비용이 상승되는 문제가 있을 것이다.

한편, 다당류 수용액에 전자빔을 조사함으로써 나노입자를 제조하는 방법이 제공된 바 있으나(한국 등록특허 제10-1893549호), 다당류 수용액의 농도가 높고 전자빔의 세기가 일정 수준 이상인 경우에만 나노입자가 생성이 되는 한계가 있었다.

이에 본 발명은 상기한 종래의 문제점 및 필요를 인식하고, 생체 적합하면서 순수한 알긴산 나노입자 또는 나노겔을 제조하는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 별도의 가교제 없이, 유기용매가 아닌 수용액 상에서, 보다 구체적으로는 산성 수용액에서 알긴산 가교 나노 입자를 형성할 수 있는 방법을 제공하며, 이렇게 가교된 알긴산 나노 입자가 특이적으로 항암제 로딩률이 높고, 종양 선택적 결합 특성을 가질 수 있음을 제시한다. 또한, 나노 입자의 크기를 제어할 수 있는 방법을 제공한다.

일 측면으로서, 본 발명은, 알긴산 수용액에 전자빔을 조사하여, 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는, 가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 나노입자란 크기가 수 내지 수백 나노미터(nm, 10억분의 1미터인 물질)인 입자를 말한다. 본 발명에서 상기 나노입자는 입자의 크기가 1 내지 600nm인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 나노입자란 나노겔 또는 나노하이드로겔도 포함하는 개념으로, 이하에서 나노입자, 나노겔 또는 나노하이드로겔은 모두 본 발명에 따른 나노입자를 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명의 상기 알긴산 수용액은 산성에서 중성임을 특징으로 한다. 산성 수용액을 위해 알긴산 수용액에 산을 첨가할 수 있다. 바람직하게 HClO₄, 질산 및 포름산 중 어느 하나 이상일 수 있다. 이하에서 자세히 설명되고 입증되는 바와 같이, 알긴산 수용액을 산성으로 하거나, 알긴산 수용액에 산이 첨가되는 경우, 그렇지 않는 경우에 비해, 높은 나노입자 합성 효율이 증대됨을 새롭게 제공한다. 또한 pH의 조절 및 산 화합물을 첨가 농도의 조절로 예기치 않게 나노 입자의 크기를 제어할 수 있음을 제공한다.

본 발명의 일 실시양태에서, 상기 알긴산 수용액의 pH는 산성인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 알긴산 수용액의 pH는 1 내지 6일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 1 내지 5일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 pH 2 내지 4일 수 있으며, 가장 바람직하게는 pH 3 내지 4일 수 있다.

상기 알긴산 수용액은 0.1 내지 2.0%(w/v)의 농도인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 알긴산 수용액은 0.1 내지 1.5%(w/v), 더 바람직하게는 0.1 내지 1.0%(w/v), 보다 더 바람직하게는 0.1 내지 0.7%(w/v), 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5%(w/v)의 농도일 수 있다.

상기 수용액은 가교제 및 유기용매를 포함하지 않음을 특징으로 한다.

상기 전자빔을 조사한 이후, 투석 및 동결 건조단계를 추가로 포함한다.

상기 전자빔의 조사선량을 변경하여 알긴산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하며, 상기 전자빔의 조사선량을 늘려 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 전자빔 조사선량은 2 내지 300kGy인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 전자빔 조사선량은 3 내지 200kGy인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 전자빔 총 조사에너지 세기는 0.1MeV 내지 5Mev인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 전자빔의 총 조사에너지 세기는 0.5MeV 내지 3Mev, 가장 바람직하게는 0.5MeV 내지 2.5MeV일 수 있다.

상기 수용액의 pH를 조절하여, 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하며, 상기 수용액의 pH를 낮춰 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 한다.

상기 수용액의 알긴산의 농도를 조절하여, 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하며, 상기 수용액의 알긴산의 농도를 높여 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 증가시킴을 특징으로 한다.

본 발명이 제공하는 알긴산 나노입자 제공방법은 산성의 알긴산 수용액에 전자빔을 조사함으로써, 중성의 알긴산 수용액에서는 나노입자 제조가 불가능한 조건에서도 나노입자를 제조할 수 있는 것을 특징으로 한다.

특히, 낮은 농도(예를 들어, 0.5%(w/v) 이하)의 알긴산 수용액을 산성의 수용액 조건에서 전자빔을 조사할 경우, 전자빔의 조사선량 세기에 따라 나노입자의 크기 조절이 매우 용이하여 목적하는 크기의 나노입자를 매우 정확하게 제조할 수 있다는 이점이 있다.

따라서, 본 발명은 알긴산 나노입자의 크기를 용이하게 조절하기 위해, 알긴산 수용액은 pH가 1 ~ 5, 알긴산의 농도가 1.0%(w/v) 미만이며, 전자빔 조사선량이 2kGy 이상인 것을 특징으로 하는, 가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 알긴산 수용액은 pH가 2~4 , 알긴산의 농도가 0.7%(w/v) 이하이며, 전자빔 조사선량이 3kGy 이상인 것을 특징으로 하는, 가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다. 가장 바람직하게는 pH가 3~4 , 알긴산의 농도가 0.5%(w/v) 이하이며, 전자빔 조사선량이 3kGy 이상인 것을 특징으로 하는, 가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 측면으로서, 제1항에 의해 제조된 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합된 나노 입자를 제공한다.

상기 나노 입자들은 서로 엉겨져 있음을 특징으로 한다.

상기 나노 입자는 팽윤 특성을 가지는 하이드로젤임을 특징으로 한다.

상기 나노 입자는 종양 선택성을 가짐을 특징으로 한다. 상기 나노 입자는 대장암 또는 흑색종 선택성을 가짐을 특징으로 한다. 상기 나노 입자는 대장암종양에 대해서 30배 이상의 종양 대 근육비 및 10배 이상의 종양 대 혈액비를 가짐을 특징으로 하고, 상기 나노 입자는 흑색종에 대해서 16배 이상의 종양 대 근육비 및 5배 이상의 종양대 혈액비를 가짐을 특징으로 한다.

상기 나노 입자는 다른 다당류의 나노입자에 비해 높은 항암제 로딩율을 가짐을 특징으로 한다. 상기 항암제는 독소루비신 또는 시스플라틴임을 특징으로 한다.

다른 측면으로서, 본 발명은, 방사성 동위원소, 유기 형광물질, 무기물질인 양자점, 자기공명영상 조영제, 컴퓨터단층촬영 조영제, 양전자단층촬영 조영제, 초음파 조영제, 형광 조영제 및 상형변환물질로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표지 물질로 표지된 상기한 알긴산 나노 입자를 포함하는 조영제를 제공한다.

상기 나노 입자에 접합된 리간드 화합물 및 상기 리간드 화합물에 배위결합된 방사성 동위 원소를 포함할 수 있다.

상기 리간드 화합물은 NODA-GA-NH₂, DOTA-GA, DOTA, TETA 및 NOTA 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 한다.

상기 방사성 동위 원소는 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ³⁸K, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ¹²⁴I, ⁸⁹Zr, ^99νTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ¹⁷⁷Lu, ²⁰¹Tl, ^117νSn, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁹⁰Y, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, 및 ²¹¹At 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 한다.

다른 측면으로서, 본 발명은, 상기한 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합된 나노 입자 및 상기 나노입자 내에 로딩된 약물을 포함하는, 약물 전달체를 포함하며, 상기 약물은 항암제임을 특징으로 한다.

다른 측면으로서, 본 발명은, 상기 나노입자에 항암제가 탑재된 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성을 제공한다.

상기 항암제는 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신 또는 백금계 항암제일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신 또는 시스플라틴일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 약물을 봉입하고 있는 약물전달체 이외에 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1~90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 생체적합성 고분자 나노입자에 약물이 봉입된 약물 전달체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.01 - 100 mg/kg/day이며, 바람직하게는 0.1 - 20 mg/kg/day이며, 더욱 바람직하게는 5 - 10 mg/kg/day일 수 있다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명은 순수한 알긴산 나노 입자를 가교제 및 유기용매 없이 수용액 상에서 제조할 수 있는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 전자빔만을 사용해서 효율적으로 재현성 있게 나노입자로 전환시킬 수 있는 최적의 전자빔 조사 조건을 확립하였다. 최적화된 전자빔 조건하에서 재현성 있게 수백나노미터 사이즈의 알긴산 나노입자를 균일하게 합성할 수 있었고 방사성 표지를 통해 합성된 알긴산 나노입자의 종양진단 조영제 및 치료제로서의 활용 가능성을 검증하였다.

본 발명의 방법에 의해 가교된 알긴산 나노 입자가 특이적으로 항암제 로딩률이 높고, 종양 선택적 결합 특성을 가진다. 또한, 나노 입자의 크기를 제어할 수 있는 방법을 제공한다.

도 1은 알긴산 고분자가 전자빔에 의해 가교되어 알긴산 입자가 형성됨을 보여주는 개념도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1의 알긴산의 크기 분포를 보여주는 그래프이다.
도 3은 알긴산의 농도가 증가함에 따른 합성되는 입자의 크기를 보여주는 막대 그래프이다.
도 4는 산의 농도와 조사선량에 따른 입자의 크기를 보여주는 막대 그래프이다.
도 5는 산의 농도, 조사선량 및 조사 에너지에 따른 따른 입자의 크기를 보여주는 막대 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 샘플 중 하나의 알긴산 나노입자의 DLS 분석 결과이다.
도 7은 알긴산 나노입자를 대량으로 합성하고 동결건조 과정 이후 파우더 형태로 샘플을 얻은 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 알긴산 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 알긴산 나노 입자의 SEM 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 알긴산 나노 입자의 하이드로젤 특성을 보여주는 실험 결과 사진이다.
도 11은 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노입자에 이중기능킬레이트인 NODA-GA-NH₂를 접합하여 킬레이트 화합물을 제조하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 12는 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노 입자를 Cu-64로 표지하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 13은 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물을 Radio-TLC를 사용하여 방사화학적 순도를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 PBS(Phosphate Buffer Saline)와 혈청(Fetal Bovine Serum)에서의 안정도를 시간별 radio-TLC로 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 정상 마우스에서의 생체분포확인 실험의 결과이다.
도 16은 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노 입자의 대장암종양세포(CT26)를 이용한 종양모델에서 생체분포확인 실험 결과이다.
도 17은 본 발명의 실시예 2의 알긴산 나노 입자의 피부암세포(흑색종/B16F10)를 이용한 종양모델에서 생체분포확인 실험 결과이다.
도 18은 본 발명의 실시예 3의 독소루비신의 로딩의 결과를 보여주는 사진이다.
도 19 내지 21은 본 발명의 실시예 3의 종양 성장 억제효과를 보여준다.
도 22는 본 발명의 실시예 4의 시스플라틴에 대한 표준곡선을 보여준다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

실시예 1: 알긴산 나노젤의 제조

알긴산(140kDa)을 물에 혼합하여 알긴산 수용액을 제조하였고, 상기 알긴산 수용액에 전자빔을 조사하는 방식으로 실험을 수행하였으며, 다양한 알긴산의 농도(w/v%), 다양한 pH 농도, 산의 종류 및 다양한 전자빔의 세기(전자빔의 선량) 조건의 총 1,152개의 샘플을 제조하였고, 이 중 150개의 나노입자가 합성되었다. 알긴산 수용액의 산도, 알긴산의 농도 및 전자빔의 선량 등의 조건에 따라 나노입자 합성이 결정됨을 확인할 수 있었다.

나노입자의 크기 분포 분석

도 2에서와 같이, 합성된 나노입자는 100nm에서 400nm, 주로 200nm의 크기를 보여주었다.

수용액에의 산의 첨가에 따른 합성 분석

산을 첨가 여부에 따른 나노입자의 합성을 분석하였다. 산을 첨가하지 않고 알긴산의 농도 및 전자빔 조사선량을 조절해가며 실험을 진행한 샘플에 대한 나노입자의 형성유무 및 크기를 DLS로 확인하였을 때, 아래 표 1에서 확인되는 바와 같이, 대체로 나노입자 합성이 이루어지지 않았고, 서로 다른 입자의 크기에 대한 여러 개의 피크(Peak)가 관찰되는 경향을 확인하였다.

그러나 0.1%의 산(HClO₄)을 첨가한 후(pH 3.5), 알긴산의 농도 및 전자빔 조사선량을 조절해가며 실험을 진행한 샘플에 대해 그에 대한 입자의 형성 유무 및 크기를 마찬가지로 DLS로 확인하였을 때, 아래 표 2에서 확인되는 바와 같이, 대체로 0.5%의 알긴산 농도에서 나노입자 합성이 용이하게 이루어지며 전자빔 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 작아지는 경향성을 확인하였다.

그러나 0.2% (pH 2.5)와 0.3%(pH 2.0)의 산을 첨가한 후, 0.5% 농도(w/v)의 알긴산을 이용하여 동일한 실험을 진행해보았지만 대체로 나노입자 합성이 이루어지지 않았고, 서로 다른 입자의 크기에 대한 여러 개의 피크가 관찰되는 경향을 확인하였다. 이로써 전자빔 조사 과정에서 적절한 산의 농도를 첨가하는 것이 중요함을 확인할 수 있었고, 그 적절한 산의 농도는 0.2% 미만(pH 2.5 초과)임을 확인하였다.

산의 종류에 따른 분석

HClO₄ 이외에 다른 산(니트르산, 옥살산, 포름산)을 사용하여 동일한 실험을 진행한 샘플에 있어서, 그 결과 옥살산의 경우에는 전자빔 조사를 통한 알긴산 나노입자의 형성에 큰 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

그러나, 질산과 포름산의 경우에는 입자형성에는 적절한 산의 농도가 필요하였지만, 나노입자의 형성에 영향을 주었으며, 전자빔 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기는 감소하는 경향성을 유지하였다.

입자 크기 분석

알긴산 용액을 이용한 실험을 진행하였고, 동일하게 산을 첨가하였을 때 나노입자가 잘 만들어지는 결과를 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 알긴산의 농도(0.5%, 1%, 2%)에 따라 합성되는 입자의 크기가 어떻게 달라지는지 확인해보는 실험을 진행하였다.

그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 알긴산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 입자의 크기가 지속적으로 증가하는 경향성을 확인하였다.

그런 다음 첨가하는 산의 농도(0.1%, 0.2%, 0.3%)를 달리하며 실험을 진행해보았고, 도 4에서 확인되는 바와 같이, 조사선량이 낮을 때는 첨가되는 산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 입자의 크기가 증가되는 경향성을 확인할 수 있었으나 높은 조사선량으로 전자빔을 조사하였을 때에는 입자 크기 형성에 큰 영향을 주지 못함을 확인하였다. 또한 대체로 전자빔 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인하였다.

전자빔 에너지의 세기를 2.5 MeV로 증가한 조건에서도 실험을 진행해보았고, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 1 MeV에서와 마찬가지로 첨가되는 산의 농도가 증가함에 따라 합성되는 입자의 크기가 증가되는 경향성을 확인할 수 있었으며, 전자빔 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인하였다.

실시예1에서 합성된 샘플 중 하나의 DLS로 입자의 크기를 측정하였고, 도 6에서와 같이 156.8nm 였다.

알긴산 나노입자를 대량으로 합성하였고, 도 7의 사진과 같이, 동결건조 과정 이후 파우더 형태로 샘플을 얻을 수 있었다.

나노입자의 광학 분석

상기 합성된 알긴산 나노입자는 DLS를 통해 나노입자의 크기를 측정할 뿐만 아니라 투과전자현미경(TEM)을 통해 실제로 합성된 나노입자의 형태학적 모양을 직접 확인해보는 연구를 진행하였다.

각 나노입자를 카본이 코팅된 구리 그리드 위에 2~3방울 정도 떨어뜨리고, 우라닐 아세테이트를 사용해서 염색 과정을 거친 후 충분한 시간을 두고 수분을 완전히 건조한 후에 TEM을 이용해 분석하였고, 이를 도 8에 제시하였다. 뾰족한 가시가 돌출된 형태를 주로 이루고 있음을 확인할 수 있었고, 대부분 서로 엉겨서 DLS에서의 결과보다 입자의 크기가 큰 결과를 보여준다.

동일한 알긴산 나노입자를 사용하여 TEM을 대신해서 주사전자현미경(SEM)을 이용해서 한 번 더 입자의 크기 및 모양을 확인해보는 연구를 진행하였고, 이를 도 9에 제시하였다. TEM에서의 결과와 마찬가지로 대체로 입자들 간에 서로 엉겨있는 모습을 반복해서 확인해볼 수 있었고, 이와 같은 결과를 통해서 다른 다당류 기반 나노입자 샘플들과는 다르게 알긴산 나노입자는 서로 엉기는 힘이 더 강력함을 확인할 수 있었다.

하이드로젤 특성 분석

합성된 나노입자가 실질적으로 물을 잘 머금는(Swelling) 하이드로젤의 특징을 지니고 있는지를 확인하는 실험을 진행해보았고, 대조군으로는 순수한 물과 전자빔을 조사하지 않은 알긴산을 사용하여 실험을 진행하였다.

동일한 양의 알긴산 나노입자와 대조군을 각각 500μL의 물에 녹인 후, 분리막을 가진 원심여과기를 사용하여 원심분리를 진행하여 각각의 튜브 바닥에 떨어진 물의 양을 확인해보았고, 그 차이가 잘 보이도록 하기 위하여 튜브 아래로 떨어진 물을 초록색의 잉크로 염색시킨 후 사진을 찍었다. 도 10에 제시하였다.

그 결과를 확인해보았을 때, 전자빔을 조사하여 얻어진 나노입자 샘플에서 원심분리 과정 이후 튜브 바닥으로 떨어지는 물의 양이 보다 적고, 상층액부분에 더 많은 용액이 남겨져 있음을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 통하여 전자빔 조사를 통해 합성된 알긴산 나노입자가 대조군보다 물을 잘 머금으며 하이드로젤로서의 특징을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 알긴산 나노젤의 활용

도 11의 개략적 설명과 같이, 이중기능킬레이트인 NODA-GA-NH₂를 사용해서 알긴산 나노입자에 접합하는 실험을 진행하였고, 알긴산 나노입자를 피리딘에 녹여준 후 토실 클로라이드(Tosyl chloride)를 한 방울씩 천천히 떨어뜨려주며 밤새 반응을 진행하였다. 이후, NODA-GA-NH₂를 추가한 후 높은 열을 가해주며 하루정도 반응을 진행한 후, NODA-GA-NH₂와 접합반응이 이루어진 알긴산 나노입자를 원심여과기로 회수하였다. 동결건조 과정을 통하여 파우더 형태의 NODA-GA가 접합된 알긴산 나노입자를 얻었다.

방사 표지된 나노입자의 안정성 분석

마찬가지로 도 12에서 개략적으로 보여주는 바와 같이, Cu-64를 이용한 방사성 표지를 진행해보았고 pH가 6.8인 버퍼에 NODA-GA-알긴산 나노입자를 넣고 적정 온도 및 시간에서 ⁶⁴CuCl₂와 반응한 후, 원심여과기를 통하여 Cu-64가 표지된 알긴산 나노입자를 정제한 후 Radio-TLC를 사용하여 방사화학적 순도를 확인하였다.

그 결과 도 13에서 확인되는 바와 같이, 방사화학적 순도가 거의 100%로 Cu-64와 우수하게 표지 반응이 이루어짐을 확인할 수 있었다.

방사 표지된 나노입자의 안정성의 경우, 방사선분해(Radiolysis)를 확인해보는 방식으로 실험을 진행하였고 PBS (Phosphate Buffer Saline)와 혈청(Fetal Bovine Serum)을 이용하여 시간별로 radio-TLC로 분석하며 나노입자의 안정성을 확인해보고자 하였다.

그 결과, 도 14에서의 결과와 같이, 1시간과 4시간까지 높은 안정성을 보여줌을 확인할 수 있었고, 24시간에 대한 결과에서도 동일하게 95% 이상의 뛰어난 안정성을 보였기에 마우스 내에서도 충분히 그 안정성을 유지할 수 있을 것으로 예측해볼 수 있었다.

정상 마우스에서 생체분포확인 실험

Cu-64와 표지 반응이 이루어진 나노입자를 사용하여 정상 마우스에서 생체분포확인 실험을 진행하며 장기들에 대한 분포 및 체외로 배출 경로를 확인하였다.

합성된 나노입자를 종양 조영제 개발 연구에 활용하도록 나노입자가 충분히 종양을 타겟팅할 수 있는 시간을 두고 실험을 진행하였고, 그에 따라 나노입자를 주사한 후 4시간 및 24시간 후에 각 장기에 대한 분포를 확인하는 방법으로 실험을 하였다.

4시간과 24시간에 대한 결과를 비교해보며 결과를 분석해보았을 때, 도 15에 결과와 같이, 시간이 지날수록 혈액 내의 방사능량이 점차 감소하는 경향을 확인해볼 수 있고, 간에서 가장 높은 섭취를 보여주었는데 시간이 지남에 따라 간을 경유(Route)로 이용하여 체외로 배출됨을 확인해볼 수 있었다.

일부 심장 및 폐에 대한 섭취 정도가 시간이 지남에 따라 다소 증가하기는 하였지만 그 이외의 다른 장기들에 대한 섭취 정도는 거의 동일한 것을 확인해볼 수 있었고, 종양 모델에 대하여 24시간 후에 생체분포확인 실험을 진행하고자 하였다.

종양 모델에서 생체분포확인 실험

Cu-64와 표지 반응이 이루어진 나노입자를 사용하여 종양모델에 대하여 생체분포확인 실험을 진행하였고, 주사한지 24시간 후에 각 장기에 대한 분포를 확인하여 종양에 대한 섭취정도를 확인하였다.

먼저 대장암종양세포(CT26)를 이용하여 종양모델을 준비하였고, 6-8 mm로 적절한 크기로 종양이 자랐을 때 종양모델에 대한 생체분포확인 실험을 진행하였고, 도 16에서 확인되는 바와 같이, 간에 대해서 2.7%ID/g로 높은 섭취를 보였으며 종양에는 0.73 %ID/g의 섭취로 타 장기들에 비해 높은 섭취를 보여주었다. 종양 대 근육비(Tumor to muscle ratio)는 32.8배, 종양 대 혈액비(Tumor to blood ratio)는 11.9배로 우수하게 종양을 진단할 수 있음을 확인하였다.

또한 피부암세포(흑색종/B16F10)를 이용하여서도 종양모델을 준비하였고, 적절한 크기로 종양이 자랐을 때 동일하게 24시간 후에 대한 시간에 맞춰서 생체분포확인 실험을 진행하였고, 도 17에서 확인되는 바와 같이, 그 결과 신장과 간에 대해서 각각 4.3%ID/g, 3.4%ID/g로 높은 섭취를 보여주었고 종양에는 1.7%ID/g로 높은 섭취를 보였다. 종양 대 근육비(Tumor to muscle ratio)는 16배, 종양 대 혈액비(Tumor to blood ratio)는 5.2배로 우수하게 종양을 진단할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3: 항암제를 탑재한 알긴산 나노젤의 항암효능

종양 치료제로 활용하기 위한 연구도 진행하였고, 독소루비신이 로딩된 알긴산 나노입자가 종양의 성장을 저해할 수 있는 치료제로 사용될 수 있을지 그 능력을 비교 확인해보는 실험을 진행하였다.

실시예에서 제조된 알긴산 나노입자에 항암제로 널리 사용되고 있는 독소루비신(doxorubicin)을 로딩하여 실험을 진행하였고, 알긴산 나노입자 1mg/mL과 독소루비신(1mg/mL)을 넣어주고 상온에서 1시간 동안 교반시켜주는 방법으로 반응을 진행하였다.

반응 후 10,000rpm에서 30분 동안 원심분리를 진행하면 독소루비신이 로딩된 알긴산 나노입자는 바닥에 펠렛을 형성하게 되는데, 상층액과 펠렛을 분리하였다.

분리한 상층액의 흡수스펙트럼을 측정하여, 나노입자에 결합되지 못한 독소루비신의 양을 확인할 수 있으며, 독소루비신에 대하여 흡수극대를 나타내는 481nm의 파장에서 흡광도를 측정하였고, 그 값을 미리 준비해둔 481nm의 파장에서의 독소루비신에 대한 표준 곡선(standard curve)에 대입하여 상층액에 남아있는 독소루비신의 양을 확인하는 방법으로, 반응에 사용한 독소루비신의 양과 상층액에 남아있는 독소루비신의 양을 아래의 공식에 넣어 알긴산 나노입자에 독소루비신이 얼마나 로딩 되었는지 확인해본 결과, LE(Loading efficiency)(%)가 98.5%로 거의 모두 로딩되며 상층액에는 도 18에서 확인 되는 바와 같이, 붉은 독소루비신 색상이 거의 남지 않았음을 확인하였다.

항암 치료제로서의 성능 분석

실험에 사용된 종양모델로는 유방암 마우스 종양모델(EMT6 tumor model)을 사용하였고, 종양이 발생함을 확인한 후 실험에 사용하였다. PBS를 처리하는 대조군 그룹, 독소루비신을 처리한 Doxorubicin 그룹, 독소루비신이 로딩된 알긴산 나노입자로 처리하는 그룹(Dox@Algi-NP)으로 이렇게 3개의 그룹에 마우스 종양 모델을 무작위로 선별하여 실험을 시작하였다. 각 그룹에 해당하는 마우스의 수는 3마리였고, 각각을 3일 간격으로 2번 정맥 주사를 통하여 마우스 종양 모델에 처리하였고, 이때 처리한 독소루비신의 양은 200μg로 일정하게 하였다.

24일에 걸쳐서 종양모델에서의 종양의 크기 및 마우스의 무게를 확인해보았고, 그 결과를 확인 및 비교해보았을 때, DOX@Algi-NP를 처리한 그룹에서 가장 종양의 성장이 저해되며 종양의 크기가 2000cm³로 다른 두 그룹에 비해 확실히 작은 것을 확인하였다. 도 19에서 확인된다.

떼어낸 종양의 무게를 측정해보았을 때도 도 20에서 참조되는 바와 같이, 동일하게 DOX@Algi-NP를 처리한 그룹에서 가장 종양의 성장이 저해되며 종양의 무게가 다른 두 그룹에 비해 확실히 적음을 확인하였다.

또한 각 그룹에서 종양모델의 체중은 도 21에서 참조되는 바와 같이, 급격하게 감소되거나 변동되지 않음을 확인할 수 있었고, 이러한 결과를 통하여 DOX@Algi-NP가 확실히 종양 모델에 큰 독성을 주지 않으며 종양의 성장을 저해할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 알긴산 나노젤의 항암제 탑재능

독소루비신 이외에 시플라틴(Cisplatin)이라는 다른 항암제도 로딩하는 실험을 하였다. 시플라틴의 로딩을 위해, Aquated cisplatin([Pt(NH₃)₂(H₂O)₂]²⁺)을 준비하였다. 시플라틴(10mg, 1당량)과 질산은(11mg, 2당량)을 증류수 10mL에 넣고 빛을 차단한 상태로 35°C에서 24시간동안 반응하였다. 반응과정동안 뿌연 흰색 침전물(Silver chloride)이 형성되었고, 이후 10,000rpm으로 원심분리를 통하여 침전물을 제거하고 Aquated cisplatin([Pt(NH₃)₂(H₂O)₂]²⁺) 만을 얻어서 알긴산 나노입자에 로딩하는데 사용하였다.

알긴산 나노입자 5mg을 녹여준 후, 35°C에서 30분동안 교반시켜주며 반응을 진행하였다. 이후, 상기 얻어진 Aquated cisplatin 1mg을 추가한 후, 빛을 차단한 상태로 35°C에서 24시간 동안 반응시키고, 분리막을 가진 원심여과기를 사용하여 원심분리를 진행하여 반응하지 않은 Aquated cisplatin을 제거하였다.

OPD(ortho-Phenylenediamine)는 시스플라틴과 반응하여 OPD-Pt 착물(complex)을 형성하며 705nm의 파장에서 높은 흡광도를 보이는데, 이를 이용하여 최종적으로 얻은 샘플에 OPD를 처리한 후, 100°C에서 2시간동안 반응한 후 705nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 값을 미리 준비해둔 705nm의 파장에서의 시스플라틴에 대한 표준곡선(standard curve)에 대입하여 최종적으로 얻은 샘플의 시스플라틴의 양을 확인하였다. 도 22에서 확인된다.

이와 같은 방법으로 반응에 사용한 시스플라틴의 양과 최종 샘플에 남아있는 시스플라틴의 양을 비교하여 알긴산 나노입자에 시스플라틴이 얼마나 로딩 되었는지 확인해본 결과, LE(Loading efficiency)가 89.7%로 높은 수율로 로딩됨을 확인하였다.

Claims (20)

1. 알긴산 수용액에 전자빔을 조사하여, 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 알긴산 수용액은 산성임을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 알긴산 수용액은 pH 1 내지 6인 것을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 알긴산 함유 용액에 HClO₄, 질산 및 포름산 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 알긴산 수용액은 0.1 내지 2%(w/v)의 농도인 것을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 전자빔은 2 내지 300kGy의 조사량으로 조사되는 것을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 전자빔의 조사선량을 변경하여 알긴산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 전자빔의 조사선량을 늘려 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 방법은 알긴산 수용액은 pH가 1~6 , 농도가 1.0%(w/v) 미만이며, 전자빔 조사선량이 2kGy 이상인 것을 특징으로 하는,
   가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 조절하여, 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하는,
    가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
11. 제1항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 낮춰 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 하는,
    가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
12. 제1항에 있어서,
    상기 수용액의 알긴산의 농도를 높여 상기 알긴산 나노 입자의 크기를 증가시킴을 특징으로 하는,
    가교된 알긴산 나노 입자를 제조하는 방법.
13. 제1항에 의해 제조된 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합만으로 형성된 나노 입자로서, 상기 나노 입자는 종양 선택성을 가짐을 특징으로 하는, 알긴산 나노 입자.
14. 방사성 동위원소, 유기 형광물질, 무기물질인 양자점, 자기공명영상 조영제, 컴퓨터단층촬영 조영제, 양전자단층촬영 조영제, 초음파 조영제, 형광 조영제 및 상형변환물질로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표지 물질로 표지된 제9항의 알긴산 나노 입자를 포함하는 조영제 및 치료제.
15. 제14항에 있어서,
    상기 나노 입자에 접합된 리간드 화합물 및
    상기 리간드 화합물에 배위결합된 방사성 동위 원소를 포함하는,
    조영제 및 치료제.
16. 제15항에 있어서,
    상기 리간드 화합물은 NODA-GA-NH₂, DOTA-GA, DOTA, TETA 및 NOTA 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는,
    조영제 및 치료제.
17. 제15항에 있어서,
    상기 방사성 동위 원소는 ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ¹⁸F, ³⁸K, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb, ¹²⁴I, ⁸⁹Zr, ^99νTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ¹⁷⁷Lu, ²⁰¹Tl, ^117νSn, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ⁶⁷Cu, ⁸⁹Sr, ⁹⁰Y, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, 및 ²¹¹At 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는,
    조영제 및 치료제.
18. 제1항에 의해 제조된 알긴산의 분자간 또는 분자내 가교결합된 나노 입자; 및 상기 나노입자 내에 로딩된 약물을 포함하는,
    약물 전달체.
19. 제18항에 있어서,
    상기 약물은 항암제임을 특징으로 하는,
    약물 전달체.
20. 제13항의 나노입자에 항암제가 탑재된 약물전달체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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