KR20200077393A - 플라티코돈 사포닌 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 플라티코돈 사포닌 조성물은, 플라티코돈 사포닌을 포함하는 플라티코돈 추출물을, 리파아제를 포함하는 효소에 의하여 생전환시켜 제조된 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 도라지 추출물에 관한 것으로서, 더 자세하게는 플라티코돈 사포닌을 포함하는 플라티코돈 추출물을 효소에 의해 생전환시킨 플라티코돈 사포닌 조성물에 관한 것이다.
플라티코디 라딕스(Platycodi-Radix; 이하, 'Platycodon')는 초롱과(Campanulaceae) 식물인 도라지(Platycodon grandiflorum A. DC.)의 뿌리로, 한국에서는 길경(Kilkyoung; 桔梗), 중국에서는 지겡(Jiegeng), 일본에서는 기쿄(Kikyo)로 불리우며, 전통적인 동양 의약품으로 사용되어 왔다. 플라티코돈은 한방의학에서 배농·거담·기관지염·천식·소염 등의 호흡기계 질환에 사용되어온 생약제로서, 도라지가 배합되어 있는 한방 처방은 동의보감에 273건, 방약합편에 49건이 수록되어 있을 정도로 다양한 약리작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 플라티코돈의 주요 약리성분은 플라티코돈 사포닌으로, 약 40여종의 5환성 올레아난(oleanane)형 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponin)을 약 2% 함유하고 있으며, 이 외에 이눌린(inulin), 베툴린(betulin), 스티그마스테롤(stigmasterol) 등이 주요 성분으로 함유되어 있다.
플라티코돈 사포닌은 기본적으로 배당체의 4번 위치에 알코올기의 결합유무에 따라 플라티코디게닌(platycodigenin)을 배당체로 하는 플라티코딘 계열의 사포닌과, 폴리갈라식산(polygalacic acid)을 배당체로 하는 폴라갈라신 계열의 사포닌들로 구성되어 있고, 이들 사포닌의 3번과 28번 탄소에 결합되어 있는 당들의 종류와 수에 따라 여러 플라티코돈 사포닌들이 최근까지 보고되었다(Lu Qiu et al., Journal of Asian Natural Products Research., (2018):Platycosides P and Q, two new triterpene saponins from Platycodon grandiflorum). 이 중에서, 플라티코딘(platycodin) D, 플라티코사이드(platycoside) E, 폴리갈라신(polygalacin) D가 함량적으로 길경의 주성분이다.
특히, 플라티코딘 D는 도라지(Platycodon grandiflorum A. DC.)의 주요 약리성분을 가지는 사포닌으로서, 항세포 사멸(anti-apoptosis, 대한민국 등록번호 제10-0564927호), 항비만(anti-obesity, 대한민국 등록번호 제10-0750333호), 항염증(anti-inflammation, 대한민국 등록번호 제10-0696647호)의 효능이 알려져 있어, 약물학적가치가 큰 단일성분(Hahn J., Nutr., 130, p.2760, 2000)으로 알려져 있다. 특히, 플라티코딘 D의 지방세포 분화억제 효과를 극대화하기 위하여, 플라티코딘 D가 다량 함유된 길경 사포닌 분획물을 효소에 의하여 생전환시키는 방법이 개발된 바 있다(특허등록 제1083045호).
그러나, 플라티코돈의 우수한 약리효과와 효능에도 불구하고, 도라지의 맛은 구조적인 식감과 향 이외에 아린맛, 쓴맛 및 단맛이 복합적으로 포함되어 있다. 오래된 도라지는 약효가 좋으나, 목과 혀에 통증처럼 아린맛을 주기 때문에, 녹차, 귤피차 등과 같이 차나 건강음료로서 이용되지 못하고 있다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하고자 한 것으로서, 플라티코돈의 맛에 대한 한계성을 해결하여 기호도를 높이고 동시에, 종래에 사용되었던 효소와는 달리 플라티코돈 사포닌의 분자구조에서 3번 탄소의 글리코시드 결합을 절단하면서도, 28번 탄소에 연결되어 있는 당사슬은 그대로 보존함으로써, 플라티코돈의 약리적 효능을 충분히 발휘할 수 있는, 플라티코돈 사포닌 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 플라티코돈 사포닌 조성물은, 플라티코돈 사포닌을 포함하는 플라티코돈 추출물을, 리파아제를 포함하는 효소에 의하여 생전환시켜 제조된 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 플라티코돈 추출물은 플라티코돈 강화분획일 수 있다. 아울러, 상기 플라티코돈 추출물은 플라티코돈을 열수추출하여 형성될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상술한 플라티코돈 사포닌 조성물을 유효성분으로 하는, 약학조성물 또는 건강기능식품으로 구현될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 플라티코돈 사포닌 조성물의 제조방법은, 플라티코돈으로부터 플라티코돈 사포닌을 포함하는 플라티코돈 추출물을 수득하는 제1 단계; 및 상기 플라티코돈 추출물을 리파아제를 포함하는 효소와 반응시키는 제2 단계;를 포함하고, 상기 플라티코돈 추출물에 포함된 플라티코돈 사포닌이 상기 리파아제에 의해 생전환된 것을 특징으로 한다.
플라티코돈 사포닌(길경 사포닌)에 효소로서 리파아제를 처리하였을 때, 당 가수분해에 의해 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D의 함량 증가를 확인할 수 있었다. 리파아제를 사용하여 플라티코돈 사포닌들을 효소처리하게 되면, 28번 탄소에 위치한 당사슬은 그대로 유지하면서 3번 탄소에 위치한 당사슬들만 선택적으로 절단하게 된다. 결과적으로, 리파아제로 효소 처리한 플라티코돈 사포닌 조성물을 이용하면, 플라티코딘 D의 함량 증가를 통해 지방축적 억제효과를 향상시키면서, 동시에 당사슬의 단순화에 따른 쓴맛 및 아린맛을 개선할 수 있다.
도 1은 리파아제의 함량을 달리한 플라티코돈 사포닌 조성물을 HPLC로 분석한 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 플라티코딘 D의 표준품에 대하여 실시예에 사용된 효소 및 비교예에 사용된 효소의 생전환 효과를 확인한 HPLC-ELSD 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 폴리갈라신 D의 표준품에 대하여 실시예에 사용된 효소 및 비교예에 사용된 효소의 생전환 효과를 확인한 HPLC-ELSD 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 표준품 플라티코딘 D와 대비하여, 실시예 및 비교예에 의해 충분히 생전환된 플라티코돈 사포닌 조성물에 대해 질량분석기를 이용하여 ESI EIC를 행한 결과를 나타낸다.
도 5는 표준품 폴리갈라신 D와 대비하여, 실시예 및 비교예에 의해 충분히 생전환된 플라티코돈 사포닌 조성물에 대해 질량분석기를 이용하여 ESI EIC를 행한 결과를 나타낸다.
도 6은 플라티코딘 계열의 사포닌이 효소전환되는 과정을 개요적으로 설명한 도면이다.
도 7은 PD, PD3 및 PE의 지방세포 분화억제 효과를 대조군을 기준으로 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 8에는 비만세포에 대해 플라티코딘 D 및 디아피-플라티코딘 D를 각각 1.25μM을 처리한 후 광학현미경으로 촬영한 이미지를 나타낸다.
도 9는 효소처리하지 않은 도라지청(시료 1) 및 리파아제로 효소처리한 도라지청(시료 2)에 대한 관능평가 결과를 나타낸다.
도 2는 플라티코딘 D의 표준품에 대하여 실시예에 사용된 효소 및 비교예에 사용된 효소의 생전환 효과를 확인한 HPLC-ELSD 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 폴리갈라신 D의 표준품에 대하여 실시예에 사용된 효소 및 비교예에 사용된 효소의 생전환 효과를 확인한 HPLC-ELSD 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 표준품 플라티코딘 D와 대비하여, 실시예 및 비교예에 의해 충분히 생전환된 플라티코돈 사포닌 조성물에 대해 질량분석기를 이용하여 ESI EIC를 행한 결과를 나타낸다.
도 5는 표준품 폴리갈라신 D와 대비하여, 실시예 및 비교예에 의해 충분히 생전환된 플라티코돈 사포닌 조성물에 대해 질량분석기를 이용하여 ESI EIC를 행한 결과를 나타낸다.
도 6은 플라티코딘 계열의 사포닌이 효소전환되는 과정을 개요적으로 설명한 도면이다.
도 7은 PD, PD3 및 PE의 지방세포 분화억제 효과를 대조군을 기준으로 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 8에는 비만세포에 대해 플라티코딘 D 및 디아피-플라티코딘 D를 각각 1.25μM을 처리한 후 광학현미경으로 촬영한 이미지를 나타낸다.
도 9는 효소처리하지 않은 도라지청(시료 1) 및 리파아제로 효소처리한 도라지청(시료 2)에 대한 관능평가 결과를 나타낸다.
본 발명의 발명자는, 플라티코딘 D의 지방세포 분화억제 효과를 극대화하기 위하여, 플라티코딘 D가 다량 함유된 길경 사포닌 분획물을 효소에 의하여 생전환시키는 방법을 개발한 바 있다(한국 특허등록 제1083045호). 이 방법에서는, 길경 추출물을 생전환시키기 위한 효소로서, 글루코시다제(Glucosidase), 셀룰라아제(Cellulase), 락타아제(Lactase), 만노시다제(Mannosidase), 글리코시다제(Glycosidase), 갈라토시다제(Galactosidase), 나린지나제(Naringinase), 헤스페리디나제(Hesperidianase), 또는 글루크로니다제(Glucuronidase)를 사용하였다.
그러나, 종래에 사용된 효소들 중 셀룰라아제는 28번 탄소에 결합된 당사슬을 분해함에 따라, 효소반응이 진행되면서 플라티코딘 D의 함량이 감소함을 알게 되었다. 또한, 다른 효소들은 3번 또는 28번 탄소에 위치한 당 사슬 절단활성이 낮음을 확인하였다.
본 발명의 발명자는, 길경 사포닌에 대한 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 발명자는 사포닌의 생전환을 위한 효소로서 리파아제를 사용하는 경우, 약리 효능이 우수한 플라티코돈 사포닌의 함량은 증가시키면서도, 3번 탄소에 결합된 당 분자들을 선택적으로 제거하여 도라지의 맛을 개선시킬 수 있음을 알게 되었다. 이를 통해, 이하에서 설명할 본 발명에 따른 플라티코돈 사포닌 조성물 및 그 제조방법을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 폴라티코돈 사포닌 조성물은, 플라티코돈 사포닌을 포함하는 플라티코돈 추출물을, 리파아제를 포함하는 효소에 의하여 생전환시켜 제조된 것을 특징으로 한다. 아울러, 상기 플라티코돈 추출물은, 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출, 가열추출 등의 추출방법으로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 열수추출법을 이용할 수 있다. 열수추출법을 이용하는 경우, 용매로서 물, 에탄올, 메탄올 등을 이용할 수 있다. 또한, 상기 플라티코돈 추출물은 플라티코돈 사포닌을 포함하는 강화분획을 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 플라티코돈 사포닌 조성물은, 이를 유효성분으로 포함하는 약학조성물 또는 건강기능식품 등으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
[I. 플라티코돈 추출물의 제조]
1. 열수추출물의 제조
세절 및 건조된 2년산 길경 1kg을 5L 반응조에 넣고, 여기에 여과된 식수 3L를 투입한 후, 90℃에서 5시간 가열하여 추출한 후, 종이필터를 이용하여 여과하여 얻어진 여과액을 감압증류기를 이용하여 진공농축함으로써 농축액을 얻었다. 이렇게 하여 길경 열수추출액으로서 당도 60brix인 200g의 농축액을 얻었다.
2. 강화분획의 제조
세절 및 건조된 2년산 길경 1kg을 메탄올을 이용하여 추출하고, 수득된 메탄올 추출액 300g을 감압건조한 다음, 증류수에 용해시켜서 고분자 합성수지(Diaion-HP20)가 충진된 컬럼(100cm x 10cm)에 흡착시키고, 물:메탄올 용매계를 이용한 크로마토그래피를 통해, 다당체를 비롯한 수용성 물질을 제거하였다. 이 과정을 통해 얻어진 분획을 감압증류기 및 동결건조기를 사용하여 감압 농축함으로써, 길경 사포닌이 다량 함유된 분말 형태의 강화분획 3.5g을 얻었다.
[II. 효소처리된 플라티코돈 사포닌 조성물의 제조]
[실시예 1]
I-1에서 얻은 60brix의 플라티코돈 농축액 5g에 대하여 pH 5.5의 식수 25mL로 희석한 후, 효소로서 리파아제(Lipase)를 투입하여, 배양기에서 55℃의 온도에서 24시간 동안 효소반응시킨 후, 다시 효소불활성화를 위하여 80℃의 수조(water bath)에서 3분간 반응시켜, 최종적인 플라티코돈 사포닌 조성물을 얻었다. 참고로, 여기에 사용된 리파아제는 SIGMA-ALDRICH에서 구입한 검정곰팡이(Aspergillus niger)에서 추출된 분말형태의 효소로서, 1g당 165.4unit의 활성도를 가지고 있다.
[실시예 2]
I-2에서 얻은 플라티코돈 강화분획 10mg을 pH 5.5의 증류수 5mL에 녹인 후, 리파아제를 투입하여, 배양기에서 55℃의 온도에서 24시간 동안 효소반응시킨 후, 다시 효소불활성화를 위하여 80℃의 수조(water bath)에서 3분간 반응시켜, 최종적인 플라티코돈 사포닌 조성물을 얻었다.
[비교예 1]
위 실시예 1에서와 동일한 방법으로 길경사포닌 조성물을 제조하되, 실시예 1에서 효소로 사용된 리파아제와의 효능 비교를 위하여, 종래에 사용된 효소인 글루카나아제(Glucanase), 크실라나아제(Xylanase), 셀룰라아제(Cellulase), 및 헤미셀룰라아제(Hemicellulase)를 포함하는 효소로서 비스코짐 L(Viscozyme L)을 사용하여 비교예 1을 제조하였다.
[비교예 2]
위 실시예 2에서와 동일한 방법으로 길경사포닌 조성물을 제조하되, 실시예 2에서 효소로 사용된 리파아제와의 효능 비교를 위하여, 종래에 사용된 효소인 글루카나아제(Glucanase), 크실라나아제(Xylanase), 셀룰라아제(Cellulase), 및 헤미셀룰라아제(Hemicellulase)를 포함하는 효소로서 비스코짐 L(Viscozyme L)을 사용하여 비교예 2를 제조하였다.
[III. 분석결과]
[1. 효소처리에 따른 플라티코돈 사포닌의 성분분석결과]
플라티코돈 사포닌의 성분분석을 위하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; High Performance Liquid Chromatography)을 수행하였다. 분석장비로서 에이질런트 1100시리즈(Agilent 1100 series)를 이용하였고, HPLC 분석에 사용된 모든 시약은 J.T.Baker(USA)의 HPLC용 용매를 구입하여 사용하였다. 용매로는 물(0.1% 포름산) 및 아세토니트릴(0.1% 포름산)을 사용하되, 경사법(Gradient) 방식으로 아세토니트릴의 함량을 리텐션 타임(Retention Time) 60분 동안 20% 내지 100%까지 변화시키면서 0.9mL/min으로 흘려주고, 분석컬럼으로서 INNO C18 컬럼(250mm, 4.6mm i.d., 파티클사이즈 5㎛ )를 사용하여, 상온에서 HPLC 분석을 수행하였다. 검출기로는 증기광산란검출기(ELSD; Evaporative Light Scattering Detector, Sedex 60LT, France)를 사용하였고, ELSD 시스템 조건은 60℃, 12.0 gain, 네뷸라이저 N2가스 2.5bar로 설정하였다.
도 1에는 실시예 1에 따라 리파아제의 함량을 달리한 플라티코돈 사포닌 조성물을 HPLC로 분석한 크로마토그램을 도시하였다. 도 1은, 열수추출에 의해 제조된 플라티코돈 농축액 5g(60brix)에 대하여 리파아제의 투입량을 0mg(A), 50mg(B), 100mg(C), 150mg(D) 및 200mg(E)으로 변화시키면서 분석한 결과를 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 효소반응에 사용된 리파아제의 중량이 증가함에 따라, 주어진 효소반응 조건(pH 5.5, 55℃, 24시간)하에서는, A 내지 D의 경우 리텐션 타임 10분 내지 20분 사이에 잔존하는 피크(peak)(점선 박스로 표시한 영역)로 보아 사포닌 성분들이 완전히 생전환되지 않은 것으로 확인되었다. 반면에, E의 경우에는, 리텐션 타임 10분 내지 20분 사이의 피크들(점선 박스로 표시한 영역)이 모두 사라진 것을 확인할 수 있으며, 따라서 효소전환이 충분히 이루어졌음을 알 수 있다.
한편, 실시예 2 및 비교예 2의 차이를 확인하기 위하여, 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D의 표준품(Reference Standard)을 이용하여 HPLC 분석을 행하였다. 여기서, 분석에 사용된 표준품은 항류분배 크로마토그래피(Countercurrent Chromatography)에 의해 분리하였다.
도 2에는 플라티코딘 D의 표준품에 대하여 실시예 2에 사용된 효소 및 비교예 2에 사용된 효소의 생전환 효과를 확인한 크로마토그램을 도시하였다. 도 2에서 보듯이, 실시예 2와 같이 리파아제로 효소 처리한 경우(B), 분자량(Molecular weight)이 1224.5인 플라티코딘 D에 해당하는 피크(1)가 그대로 유지됨에 비추어, 리파아제에 의해 플라티코딘 D의 효소전환이 이루어지지 않음을 알 수 있다. 반면에, 비교예 2와 같이 비스코짐 L을 처리한 경우(C)에는, 플라티코딘 D에 해당하는 피크(1)가 완전히 소멸되고, 새로운 피크 2, 3, 및 4가 생성되었음을 확인하였다. 이 중에서 피크 3은 28번 탄소에 결합되어 있는 당사슬 중 말단의 아피오즈가 절단된 형태인 디아피오-플라티코딘 D임을 질량분석기를 이용하여 확인하였다. 따라서, 플라티코딘 D에 대하여 비스코짐 L을 처리한 경우, 당분해가 이루어져 여러가지 피크들로 갈라지는 것을 알 수 있다. 참고로, 도 2의 A는 플라티코딘 D 표준품에 대한 크로마코그램을 나타낸다.
마찬가지로, 도 3에서 보듯이, 폴리갈라신 D의 표준품에 대하여 실시예 2에 사용된 효소 및 비교예 2에 사용된 효소의 생전환 효과를 확인한 크로마토그램을 통해, 실시예 2와 같이 리파아제로 효소 처리한 경우(B), 분자량(Molecular weight)이 1208.6인 폴리갈라신 D에 해당하는 피크 1이 그대로 유지됨에 비추어, 리파아제에 의해 폴리갈라신 D의 효소전환이 이루어지지 않음을 알 수 있다. 반면에, 비교예 2와 같이 비스코짐 L을 처리한 경우(C)에는, 폴리갈라신 D에 해당하는 피크 1이 완전히 소멸되고, 피크 2를 포함한 새로운 피크들이 생성되었음을 확인하였다. 따라서, 폴리갈라신 D에 대하여 비스코짐 L을 처리한 경우에도, 당분해가 이루어져 여러가지 피크들로 갈라지는 것을 알 수 있다. 참고로, 도 3의 A는 폴리갈라신 D 표준품에 대한 크로마코그램을 나타낸다.
도 2 및 도 3에서 보듯이, 리파아제로 효소처리한 경우에는 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D의 효소전환이 이루어지지 않는 않는 반면에, 비스코짐 L로 효소처리한 경우에는 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D가 효소전환되는 것을 알 수 있다. 이는, 비스코짐 L로 효소처리한 경우, 플라티코딘 D 또는 폴리갈라신 D의 28번 탄소에 결합된 당사슬이 분해되어 여러가지 피크들로 갈라지기 때문으로 이해될 수 있다.
추가적으로, 실시예 2 및 비교예 2에 의해 효소반응이 중간정도 진행된 상태에서의 플라티코돈 사포닌 조성물에 대해 질량분석(Mass Spectrometry; ESI-EIC, Negative mode, 이온화에너지 180v)을 행한 결과를 도 4 및 도 5에 도시하였다. 여기서, 도 4 및 도 5의 A는 강화분획으로부터 추출한 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D의 효소반응 전 크로마토그램을 나타내고, B는 리파아제로 효소처리한 경우를 나타내며, C는 비스코짐 L로 효소처리한 경우를 나타낸다. 리파아제로 효소처리한 경우(B)는, 효소처리하지 않은 경우(A)에 비해, 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D에 대한 시그널이 모두 증가함을 알 수 있다. 한편, 비스코짐 L로 효소처리한 경우(C)도, 효소처리하지 않은 경우(A)에 비해, 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D에 대한 시그널이 증가하였으나, 리파아제에 의해 효소처리한 경우(B)에 비하여, 상대적으로 시그널이 낮음을 알 수 있다. 이는 비스코짐 L이 플라티코딘 D(또는 폴리갈라신 D)를 추가적으로 분해함에 따른 것으로 해석된다. 참고로, 도 4 및 도 5에서 각각의 크로마코그램 내에 기재된 수치는 해당 피크의 면적값을 나타낸다.
도 6을 통해 설명하면, 리파아제로 효소 처리한 경우, 플라티코딘 계열의 사포닌인 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3, 플라티코딘 D2의 3번 탄소에 결합된 글루코오즈(Glucose)들의 배당결합(Glycosidic bond)이 절단되어, 최종적으로 3번 탄소에 글루코오즈 1분자가 결합된 플라티코딘으로 생전환되기 때문이다. 이때, 리파아제에 의해 충분히 생전환되더라도, 28번 탄소에 결합된 아라비노스(Ara; Arabinose), 람노스(Rha; Rhamnose), 자일로스(Xyl; Xylose) 및 아피오스(Api; Apiose)의 당사슬이 그대로 유지되므로, 플라티코딘 D는 효소전환이 이루어지지 않는다. 이로 인해, 리파아제로 효소 처리한 경우, 길경의 열수추출물에 존재하는 플라티코딘 계열의 사포닌들이 모두 플라티코딘 D로 효소전환됨에 따라, 충분히 효소반응이 이루어진 경우 최종 조성물에 존재하는 플라티코딘 D의 함량이 증가하게 된다. 그러나, 비스코짐 L에 의해 효소처리한 경우, 플라티코딘 계열의 사포닌의 3번 탄소에 결합된 당 뿐만 아니라 28번 탄소에 결합된 당 사슬도 절단하게 된다. 즉, 비스코짐 L에 의해 충분히 효소처리된 경우, 플라티코딘 D의 28번 탄소에 존재하는 아피오스 분자를 절단하여 디아피-플라티코딘 D(Deapi-Platycodin D)를 거쳐서 아피오스 이외의 당 분자, 즉 자일로스, 아라비노스, 람노스 또한 절단됨에 따라 최종 조성물에서 플라티코딘 D가 사라지게 된다.
[2. 지방축적 억제효과 실험결과]
플라티코돈 사포닌들에 따른 지방합성 억제효과를 확인하기 위하여, 오일 레드 O 염색(Oil Red O Staining)을 수행하였다. 길경화합물 유도체들 중에서 저농도에서 생리활성을 포이는 플라티코돈을 타겟으로 하여, 지방세포에서의 지방합성에 대한 일차적인 스크리닝을 하고, 지방축적이 억제됨을 형태학적으로 확인하였다. 우선, 지방세포에서 플라티코돈을 처리한 후 지방합성에 관련된 단백질인 PPARγ 및 cEBPα의 발현정도를 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 통해 확인하였다. 아울러, 비교를 위하여, 플라티코딘 D3, 플라티코사이드 E에 대하여도 동일한 방법으로 지방축적 억제효과를 확인하였다.
도 7에는 지방세포유도물질을 처리한 비만세포(대조군)에 대해 플라티코딘 D(PD), 플라티코딘 D3(PD3) 및 플라티코사이드 E(PE)를 각각 5μM을 처리한 후, 대조군(DM)의 지방정도를 100%로 기준하여, PD, PD3 및 PE의 오일 레드 O 염색결과에 따른 지방세포분화의 억제효과를 수치화하여 나타낸 그래프이다. 도 7에서 보듯이, PD의 경우, 지방세포분화의 억제효과가 탁월함을 알 수 있다.
또한, 도 8에는 비만세포에 대해 플라티코딘 D 및 디아피오-플라티코딘 D를 각각 1.25μM을 처리한 후 광학현미경으로 촬영한 이미지를 나타내었다. 도 8에서 보듯이, 대조군(지방세포)에 대한 지방세포분화 억제효과는 디아피-플라티코딘 D에 비하여 플라티코딘 D가 더 뛰어남을 알 수 있다.
이러한 실험결과로부터, 리파아제에 의해 플라티코딘 계열의 사포닌을 모두 플라티코딘 D로 효소전환하면, 3번 탄소에 결합된 당 분자들이 제거됨에 따라 활성이 증가함을 확인할 수 있다. 나아가, 비스코짐 L에 의해 28번 탄소에 결합된 당사슬의 말단에 위치한 아피오스가 절단되면, 오히려 지방억제효과가 현저히 저하됨을 알 수 있다.
[3. 플라티코돈 사포닌 조성물의 관능평가]
열수추출물을 20brix로 희석하여 500ml로 만든 뒤, 희석액 100중량부에 대하여 리파아제 20중량부를 처리하여 55℃에서 24시간 교반 후, 80℃에서 10분간 효소를 불활성화한 다음 이를 여과하여 최종적인 관능평가를 위한 시료를 준비하였다. 플라티코돈 사포닌 조성물의 맛에 대해 "(주)식품환경연구센터"를 통해 관능평가를 수행하였다. 관능검사방법은 9점 평점법(여기서, 1점은 "대단히 약함", 9점은 "대단히 강함"을 의미하며, 1점 단위로 단계적으로 평점함)을 사용하였으며, 맛에 대한 평가속성은 "단맛(Sweet taste)", "쓴맛(Bitter taste)" 및 "아린맛(Acrid taste)"으로 구분하여 검사하였다. 특히, "아린맛"에 대한 평가는 시료를 삼킨 후 6~8초 후 느껴지는 상태에 대하여 평가하도록 하였고, 검사 중 패널간의 소통을 금하게 하여 객관적인 평가를 할 수 있도록 유도하였으며, 패널들이 충분한 시간 동안 시료를 평가할 수 있도록 하였다.
도 9에는 효소처리하지 않은 도라지청(시료 1) 및 리파아제로 효소처리한 도라지청(시료 2)에 대한 관능평가 결과를 나타내었다. 평가결과, 시료 1과 대비할 때, 시료 2는 단맛의 강도는 더 향상되면서 동시에 쓴맛 및 아린맛의 강도는 저하됨을 알 수 있다. 참고로, 도 9의 관능평가는, PASWStatistics18 프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석 후, Duncan의 사후검정을 실시하였으며, 신뢰수준은 95%(p<0.05)로 나타났으며, 여기서 확률값 p가 0.05보다 작으면 유의적 차이가 있음을 의미한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 플라티코돈 사포닌(길경 사포닌)에 효소로서 리파아제를 처리하였을 때, 당 가수분해에 의해 플라티코딘 D 및 폴리갈라신 D의 함량 증가를 확인할 수 있었다. 이와 달리, 종래에 효소적 전환에 사용되는 당 분해효소인 글루카나아제, 크실라나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제는, 길경사포닌의 3번 탄소에 위치한 당 뿐만 아니라 28번 탄소에 결합된 당 사슬도 절단한다. 반면에, 리파아제의 경우, 3번 탄소에 위치한 당 분자들의 글리코시드 결합의 절단하여 최종적으로 1개의 글루코스 분자만 잔존시키면서도, 동시에 28번 탄소에 결합된 당 사슬에는 영향을 주지 않는다. 즉, 종래의 효소들과 달리, 리파아제를 사용하여 플라티코돈 사포닌들을 효소처리하게 되면, 28번 탄소에 위치한 당사슬은 그대로 유지하면서 3번 탄소에 위치한 당사슬들만 선택적으로 절단하게 된다. 결과적으로, 리파아제로 효소 처리한 플라티코돈 사포닌 조성물을 이용하면, 플라티코딘 D의 함량 증가를 통해 지방축적 억제효과를 향상시키면서, 동시에 당사슬의 단순화에 따른 단맛의 향상과 함께 쓴맛 및 아린맛을 개선하는 효과를 가진다.
지금까지 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위 내에서 변형된 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그러므로 여기서 설명한 본 발명의 실시예는 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 하고, 본 발명의 범위는 상술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (5)
- 플라티코돈 사포닌을 포함하는 플라티코돈 추출물을, 리파아제를 포함하는 효소에 의하여 생전환시킴으로써, 플라티코사이드 E, 플라티코딘 D3 및 플라티코딘 D2 중 적어도 하나를 포함하는 플라티코딘 계열의 사포닌이 28번 탄소에 결합된 당사슬은 유지되고 3번 탄소에 결합된 당사슬만 선택적으로 제거되어 플라티코딘 D로 효소전환된 것을 특징으로 하는, 플라티코돈 사포닌 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 플라티코돈 추출물은 플라티코돈 강화분획인 것을 특징으로 하는, 플라티코돈 사포닌 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 플라티코돈 추출물은 플라티코돈을 열수추출하여 형성된 것을 특징으로 하는, 플라티코돈 사포닌 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플라티코돈 사포닌 조성물을 유효성분으로 하는, 약학조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플라티코돈 사포닌 조성물을 유효성분으로 하는, 건강기능식품.
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| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL NUMBER: 2022101002196; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20221129 Effective date: 20230412 |
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| GRNO | Decision to grant (after opposition) | ||
| GRNT | Written decision to grant |