KR20200074785A - 수직 나노갭 전극을 이용한 유전영동 방법에 의한 고효율 바이오연료 생산 균주의 선별방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수직 나노갭 전극을 이용한 유전영동 방법에 의한 고효율 바이오연료 생산 균주의 선별방법 및 상기 선별된 균주로부터의 바이오연료 생산방법에 관한 것이다.

Description

수직 나노갭 전극을 이용한 유전영동 방법에 의한 고효율 바이오연료 생산 균주의 선별방법{Ultra high-throughput screening of efficient biofuel-producing microorganisms by dielectrophoresis using vertical nano-gap electrodes}
본 발명은 수직 나노갭 전극을 이용한 유전영동 방법에 의한 고효율 바이오연료 생산 균주의 선별방법 및 상기 선별된 균주로부터의 바이오연료 생산방법에 관한 것이다.
미래 수송용 에너지원 중 가장 현실적이며 실용적인 대안인 바이오연료는, 2050년 기준 점유율 중 약 27%의 큰 비율을 차지할 것으로 예측되고 있는 바, 이에 대한 경제적인 생산 기술의 확보가 필요하다. 2005년 이후 전 세계적으로 바이오디젤에 대한 수요가 크게 증가하고 있으며, 특히 한국에서도 2018년부터, 바이오디젤의 의무 혼합율을 3%로 규정하는, 신재생에너지 연료 혼합의무화 제도(RFS)가 시행됨에 따라 정책 및 산업적인 측면에서 바이오디젤 생산 기술의 확보는 시급하다.
이러한 바이오디젤 생산 기술로는 지속 가능성 및 경제성이 높은 목질계 바이오매스(bio-mass) 기반의 2세대 바이오디젤 생산 기술이 주목받고 있으며, 특히 2세대 바이오디젤 생산 기술의 핵심인 고효율 바이오디젤 생산 미생물을 확보할 경우 기술 성숙도가 높은 전처리 및/또는 당화 기술과 결합하여 빠른 시간 내에 상업적인 2세대 바이오디젤 생산이 가능할 것으로 판단되며, 점차 2세대 바이오연료 중심으로 변화하고 있는 세계 바이오연료 시장(2011년 기준 827억 달러 규모, 2021년 1,853억 달러 달성 예상)을 선도할 수 있을 것으로 기대된다.
고효율 바이오디젤 생산 균주 확보를 위하여, 다양한 균주 설계 및 대사공학 기법을 적용한 균주 개발이 가속화되고 있지만, 개발 균주 중 고농도로 바이오연료를 생산할 수 있는 우량균주의 선별은 주로 플라스크에 개별 미생물을 배양한 후 지질을 추출하여 기체크로마토그래피 등을 사용하는 기기분석에 의존하고 있으므로, 선별 가능한 균주 후보군의 개체수가 매우 제한적(103 개체 미만)이고, 상기 기기분석을 위해 긴 시간이 소요(50분/개체)되므로, 이는 고효율 바이오연료 생산 미생물을 개발하는 전체적인 속도를 제한한다. 미생물의 경우 확보할 수 있는 균주 후보군의 수가 106 이상으로 높으므로, '고효율의 바이오연료 생산 미생물'을 보다 빠르고 효과적으로 선별할 수 있는 초고속 대량 스크리닝(ultra high-throughput screening; uHTS)을 위한 시스템을 확보할 경우 전체적인 균주 개발 속도가 획기적으로 향상될 수 있다.
한편, 미생물은 보통 수 마이크로미터 크기의 소정의 형태를 입자와 같이 인식될 수 있으므로, 통상의 입자 분리방법을 적용하는 것을 고려할 수 있다. 그러나, 바이오연료 생산 미생물은 유사한 크기를 가지므로 크기에 따른 분리방법을 적용하기 어려우며, 지질 함량에 따라 나타나는 미세한 성질 차이를 이용하여 분리해야 하므로 고감도의 분석기기를 필요로 하며, 세포라는 특성상 상기 성질 차이를 유발하기 위하여 인가되는 자극이나 환경의 변화에 쉽게 손상될 수 있으므로 마일드한 조건에서 고감도의 검출이 가능한 선별방법을 발굴할 필요가 있다.
본 발명자들은 인가되는 외부 에너지에 의한 손상 없이 유전영동법을 적용하여 바이오연료 생산 미생물 중 고지질 함량의 우량균주를 빠르고 간편하게 선별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 연속적인 하나의 전극과 수십 내지 수백 나노미터 두께의 절연체층을 통해 전기적으로 이격되어 있으면서 복수의 홀이 패턴된 어레이를 포함하는 다른 하나의 전극으로 구성되고, 상기 절연체층에는 전극과 동일한 패턴의 홀이 형성되어 있는 전극쌍을 이용하여, 이들 전극쌍에 낮은 전압의 교류를 인가시에도 열을 거의 발생하지 않으므로, 이에 선별하고자 하는 세포 즉, 미생물를 함유하는 유체를 접촉시키고 교류를 인가함으로써, 세포에 열적 및/또는 물리적 손상을 전혀 주지 않거나 최소화하는 수준에서 미생물 자체가 나타내는 지질 함량 차이에 따른 미세한 유전율 차이에 의해 선택적으로 고지질 함량 미생물을 포획 또는 분산시킬 수 있으므로, 대면적의 전극쌍을 이용하여 형광 등 별도의 표지 없이도 동종의 미생물 개체 중 고효율 바이오연료 생산 우량균주를 고용량으로 빠르게 선별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 순차적으로 적층된 제1전도체 전극; 5 내지 1000 nm 범위에서 선택되는 일정한 두께를 갖는 절연체층; 및 제2전도체 전극;을 포함하며 일측 전극은 연속적으로 형성되고 타측 전극은 선택적으로 동일한 패턴으로 형성된 1 이상의 홀을 갖는 유전영동 전극쌍이 교류 전원 공급부와 함께 전기적으로 연결된 회로를 구비하고, 상기 유전영동 전극쌍의 홀이 형성된 전극면이 시료를 포함하는 유체와 접하도록 고안된 장치에 바이오연료 생산 균주 후보군을 함유하는 유체를 투입하여 전극쌍과 접촉시키는 제1단계; 상기 전극쌍에 교류 전압을 인가하는 제2단계; 및 상기 전극쌍의 홀 내에 포획된 세포들을 선택적으로 회수하는 제3단계를 포함하는, 바이오연료 생산 균주의 선별방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 선별방법에 따라 선별한 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 바이오연료의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본 발명은 유전영동 원리를 바이오연료 생산 미생물 중 고지질 함량의 우량균주를 선별하는데 적용함에 있어서, 종래 유전영동 효과를 발휘하기 위하여 높은 전압을 요구하여 이로 인해 수반되는 전해질의 전기분해, 상기 높은 전압을 이용한 반응계에서 발생하는 열에 의한 단백질 변성 및/또는 세포 손상 등으로 인해 바이오 물질에 적용시 분리는 가능하였으나, 회수하여 본래의 목적으로 사용하는 것이 제한되는 단점을 극복하기 위하여, 낮은 전압을 인가하여도 우수한 유전영동 효과를 발휘할 수 있는 규칙적인 패턴으로 형성된 일련의 홀을 포함하는 수직 나노갭 전극 구조물을 적용한 것에 기초한다. 구체적으로, 상기 전극 구조물은 2개 전도체 필름으로 구성된 전극을 구성하되, 양 전극은 수십 내지 수백 나노미터 두께의 절연체층에 의해 이격되어 전기적으로 분리되며, 하나의 전극면과 이와 대응되는 절연체층에만 동일한 패턴의 홀 어레이가 형성된 전극쌍을 고안하여, 상기 양 전극에 교류 전압을 인가하는 경우 각각의 홀에서 유전영동 현상을 발생시킬 수 있도록 하였으며, 서브 V 수준의 낮은 전압을 인가하더라도 주파수를 적절히 조절하여 마이크론 수준의 미생물을 거동을 조절하되, 이의 지질 함량에 따른 미세한 유전율의 차이에 의해, 특정 이상의 지질 함량을 갖는 우량균주만을 선택적으로 홀 내에 포집하거나 유체 내로 분산시켜 저지질 함량 미생물로부터 선별해 내는 것이 본 발명의 특징이다.
상기 본 발명에 따른 유전영동을 이용하는, 지질 함량에 따른 바이오연료 생산 균주의 선별 원리를 도식화하여 도 1에 나타내었다. 유전자 재조합에 의해 증가된 지질 생산능을 갖는 균주는 야생형의 균주와 유사한 크기 및 형태를 가지나, 이에 함유된 지질양의 차이로 인해 미세한 유전율의 차이를 나타내며, 본 발명의 전극쌍을 이용한 유전영동을 통해 이러한 세포 특성 차이에 의한 미생물의 선택적인 포획 나아가 선별이 가능하다. 즉, 전극쌍에 인가하는 주파수를 조절함으로써 이에 인접한 미생물의 거동을 조절할 수 있으며, 적절한 주파수의 교류를 인가하는 경우, 지질 함량이 높은 우량균주를 전극의 홀에 포획하되, 지질 함량이 낮은 균주는 유체 내로 분산시킴으로써 이들 균주를 지질 함량에 따라 분리할 수 있다.
본 발명은 전극쌍으로써, 순차적으로 적층된 제1전도체층; 절연체층; 및 제2전도체층;을 포함하는 층상형 구조물로서, 상기 절연체층은 5 내지 1000 nm 범위에서 선택되는 일정한 두께를 가지며, 상기 제1전도체층은 연속이나, 절연체층 및 제2전도체층은 동일한 패턴으로 형성된 1 이상의 홀을 갖는 것인 층상형 구조물을 이용할 수 있다.
구체적으로, 상기 층상형 구조물은 수 cm2 이상의 대면적으로 제조할 수 있으며, 이에 포함되는 홀의 크기 및 홀 간의 간격을 조절하여 적게는 수 개 내지 수 백개로부터 많게는 수 백만개 이상까지 형성된 홀을 포함하므로, 이를 이용하여 균등 및/또는 균일한 힘으로 미생물을 제어할 수 있고, 나아가 많은 수의 개체를 그 특성에 따라 동시에 포집 및/또는 분산시킬 수 있다.
예컨대, 상기 홀은 각각 독립적으로 50 nm2 내지 10,000 ㎛2의 면적을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 홀은 원형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 홀은 당업계에 공지된 나노제조기술(nanofabrication technology)를 이용하여 달성할 수 있는 다양한 형태로 형성될 수 있다.
상기 "동일한 패턴"으로 형성된다는 의미는 제2전도체층과 이에 상응하는 위치에서 절연체층이 갖는 홀의 형태와 크기가 서로 동일함을 의미할 수 있으며, 전체 홀의 형태와 크기가 동일함을 의미하지는 않는다. 예컨대, 하나의 층상형 구조물에서 1 이상의 홀은 각각 독립적으로 서로 동일하거나, 상이한 모양 및/또는 크기를 가질 수 있다.
상기 제1전도체층 및 제2전도체층은 서로 동일하거나 상이한 전도성 물질로 된 필름일 수 있다.
상기 본 발명의 층상형 구조물은 전기를 통할 수 있는 제1전도체층과 제2전도체층이 소정의 두께를 갖는 절연체층으로 이격된 샌드위치 형태의 구조물로서, 상기 절연체층을 통해 제1전도체층과 제2전도체층은 전기적으로 분리된 평행한 전극으로 작용할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 순차적으로 적층된 제1전도체 전극; 절연체층; 및 제2전도체 전극;을 포함하며 일측 전극에 선택적으로 형성된 홀을 갖는 유전영동 전극쌍으로서, 상기 절연체층은 5 내지 1000 nm 범위에서 선택되는 일정한 두께를 가지며, 상기 제1전도체 전극은 연속적이나, 절연체층 및 제2전도체 전극은 동일한 패턴으로 형성된 1 이상의 홀을 갖는 것인 유전영동 전극쌍을 제공한다.
본 발명의 선별방법에서 상기 교류는 10 KHz 내지 10 MHz 주파수 및 0.1 내지 5 V의 전압으로 인가할 수 있으나, 선택된 조건의 교류를 인가하여 일정 수준 이상의 함량으로 지질을 함유하는 개체를 선택적으로 포획할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 세포를 다루는 특성상 발생하는 열에 의한 손상이 전혀 없거나 최소화될 수 있도록 2℃ 이내의 온도 상승을 유발하는 수준에서 적절히 조합하여 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 홀에 포획되는 세포들은 상대적으로 지질 함량이 높은 균주일 수 있다.
본 발명의 선별방법에 사용되는 바이오연료 생산 균주는 바이오연료 생산 균주는 지질생산 미생물 또는 이의 변이종일 수 있다. 예컨대, 상기 지질생산 미생물은 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 리포마이세스 스타르케이(Lipomyces starkeyi), 트리코스포론 올레아기노수스(Trichosporon oleaginosus)와 같은 지질 생산 이스트 균주; 미세조류(microalgae); 또는 시아노박테리아(cyanobacteria)일 수 있으나, 미생물 자체로서 또는 유전자 조작에 의한 변이종으로서 지질기반의 바이오연료를 생산할 수 있는 균주를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 야로위아 리폴리티카의 변이종은 유전자 조작을 통해 야생종에 비해 바이오연료 생산능이 향상된 야로위아 리폴리티카 polf Δpex10, Δmfe1, DGA1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "야로위아(Yarrowia)"는 디포다스카세아에과(family Dipodascaceae)에 속하는 진균속(fungal genus)의 비병원성(non-pathogenic) 미생물로, 야로위아 리폴리티가(Yarrowia lipolytica) 단일종만을 포함하는 단형속(monotypic genus)의 효모이다. 이는 탄화수소와 같은 특이한(unusual) 탄소원을 이용하며, 특히 특수 지질(specialty lipids) 생산능으로 인해 이의 응용에 대한 응용미생물학적(industrial microbiology) 관심이 높다.
본 발명에서 용어, "유전영동(dielectrophoresis; DEP)"은 불균일한(non-uniform) 전기장(electric field)에 놓였을 때, 유전체(dielectric) 입자에 힘이 가해지는 현상을 의미하는 것으로, 이러한 힘은 입자의 하전을 필요로 하지 않으며, 모든 입자는 전기장 존재 하에 유전영동 활성을 나타낼 수 있다. 이때, 가해지는 힘 즉, 유전영동력(force of dielectrophoresis; FDEP)의 세기는 전기장의 주파수는 물론 입자가 담겨진 매질(medium) 및 입자 자체의 전기적 특성, 입자의 모양과 크기에 의존한다. 따라서, 특정 주파수의 전기장을 이용하여 입자를 조절, 예컨대, 입자의 배향 및/또는 거동을 조절할 수 있다. 상기 유전영동의 원리를 도 2에 도식화하여 나타내었다.
상기 유전영동을 이론적으로 살펴보면, 입자가 주파수, ω의 교류가 인가된 매질, 예컨대, 유체에 놓였을 때 받게 되는 유전영동력(FDEP)은 아래의 식으로 표현될 수 있다.
Figure pat00001
상기 식에서, ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수, εm은 입자를 둘러싼 유체(매질)의 유전율, R은 상기 입자의 반경, E는 전기장의 크기이며, Re(fCM(ω))는 인가되는 교류의 주파수에 대한 클라우시우스-모소티(Clausius-Mossotti; CM) 함수의 실수부이다. 상기 방정식에 있어서, 입자에 가해지는 유전영동력의 부호를 결정하는 인자는 클라우시우스-모소티(Clausius-Mossotti; CM) 함수의 실수부이며, 이는 하기의 방정식으로 계산될 수 있다.
Figure pat00002
이때, ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수, ε* p는 포집하고자 하는 입자의 유전율, ε* m은 유체의 유전율이다.
이는 주파수, ω의 교류 하에서 입자의 유전율이 매질의 유전율보다 큰 경우, 양의 클라우시우스-모소티 값을 갖게 되므로, 즉, Re[fCM]＞0, 이때의 DEP를 양의 DEP라 칭하고, 이러한 상태에서 입자는 전기장의 구배가 큰 쪽으로 움직이게 된다. 이와 반대로, 입자의 유전율이 매질의 유전율보다 작은 경우, 음의 클라우시우스-모소티 값을 갖게 되므로, 즉, Re[fCM]＜0, 이때의 DEP를 음의 DEP라 칭하고, 이러한 상태에서 입자는 전기장의 구배가 적은 쪽으로 움직이게 된다.
본 발명의 선별방법을 적용하는 대상인 이스트 균주는 직경 수 μm의 소정의 형태를 갖는 세포이므로 일종의 입자로 간주될 수 있고, 쌍극자를 발생할 수 있다. 나아가, 상기 유전영동의 특징을 고려할 때, 동일한 크기의 이스트 균주라 할지라도, 지질 함량이 높은 개체와 지질 함량이 낮은 개체는 이러한 특정 성분 구체적으로 지질의 함량 차이로 인해 쌍극자(dipole)가 형성되는 정도의 차이가 발생할 수 있다. 즉, 동일한 종류의 이스트라 하더라도, 유전영동의 관점에서는, 지질 함량이 다른 이스트는 서로 다른 성질의 입자로 구분되므로, 지질 함량에 따른 선별적 포집 및 나아가, 이스트의 지질 함량에 따른 선택적인 위치 제어가 가능할 수 있다.
예컨대, 상기 제1전도체 전극 및 제2전도체 전극은 각각 독립적으로 구리(copper), 금(gold), 은(silver), 백금(platinum) 및 팔라듐(palladium)으로 구성된 군으로부터 선택되는 금속; 구리, 금, 은, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속과 그라파이트, 텔루륨(tellurium), 텅스텐(tungsten), 아연(zinc), 이리듐(iridium), 루테늄(rithenium), 비소(arsenic), 인(phosphorus), 알루미늄(aluminum), 망간(manganese), 실리콘(silicon)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 함유하는 합금(alloys) 또는 복합체; 그라파이트(graphite), 그래핀(graphene) 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 전도성 탄소물질; 또는 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO), 티타늄 산화물(TiO2), 루테늄 산화물(RuO2), 이리듐 산화물(IrO2), 및 백금 산화물(PtO2)로 구성된 군으로부터 선택되는 혼합 금속 산화물(mixed metal oxides)의 소재로 된 필름 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 절연체층은 절연적 특성을 지닌 비전도성 물질을 제한없이 이용하여 형성할 수 있다. 예컨대, 상기 절연체층은 SiO2, Nb2O5, TiO2, Al2O3, 또는 MgO 등의 금속 산화물 또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone; PVP) 등의 폴리머로 형성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 원하는 수준에서 균일한 두께로 형성할 수 있는 한, 소재의 종류 및 형성되는 층의 두께는 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 전극쌍의 형태적 특징상 제조공정에 있어서 절연체층의 선택적인 식각을 필요로 하는 바, 사용하고자 하는 공정에 따라 절연체층의 소재를 선택하거나, 반대로 절연체층의 소재로 특정 물질을 선택한 경우 이에 따라 제조공정을 설계할 수 있다. 예컨대, 절연체층으로 폴리머 필름을 포함하는 경우 폴리머의 종류에 따라 선택되는 부식제 예컨대, 특정 용매로 처리함으로써 손쉽게 식각하여 패턴을 형성할 수 있다.
상기 절연체층의 두께가 5 nm 미만으로 얇은 경우, 이의 양면에 위치한 제1전도체 및 제2전도체 사이의 거리가 가까워져 절연체의 유무와 무관하게 전자가 전달되는 '터널링 효과'에 의해, 상기 층상형 구조물 전체가 하나의 도체와 같이 거동하며 제1전도체층과 제2전도체층은 더이상 개별 전극으로 작동하기 어렵다. 따라서, 절연층의 두께는 터널링 효과를 허락하지 않는 절연체층의 특징에 따라 최소 두께로 결정되며, 이는 선택되는 각 전극 및 절연체층의 소재에 따라 상이할 수 있다. 반면, 상기 절연체층의 두께가 나노 수준을 벗어나 마이크로미터 수준에 도달하면, 예컨대, 절연체층의 두께가 1000 nm를 초과하게 되면, 유효한 입자 포집에 요구되는 가용 전압이 커지게 되어 유체 내에 버블 또는 반응계의 과도한 발열을 유발하여 유전영동 효과 및 효율성 및/또는 민감성이 현저히 저하될 수 있다. 전술한 바와 같이, 유전영동 효과는 불균일한 전기장에 의해 나타나는 현상이며, 본 발명의 전극쌍은 연속적인 평면인 하나의 전극과 nm 수준의 절연체층에 의해 서로 평행하게 이격된 홀이 형성된 다른 하나의 전극 즉, 서로 상이한 형태의 대치되는 전극에 의해 형성되는 불균일한 전기장에 의해 유전영동 효과를 나타내는 것임을 고려할 때, 절연층의 두께가 증가하면 상대적으로 홀에 의한 결함이 작아지므로 이에 따른 유전영동 효과의 감소를 유도할 수 있다. 따라서, 절연체층의 두께 및/또는 홀의 크기는 이에 도입되는 포집 또는 분산시키고자 하는 입자의 크기를 고려하여 상호 유기적으로 조절할 수 있음은 당업자에 자명하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 4 mm×4 mm 면적으로 형성된 40 nm 두께의 ITO 층에, 100 nm 두께의 SiO2 층 및 100 nm 두께의 은 층을 증착시킨 후, 식각하여 직경 30 μm의 홀이 약 60 μm 간격으로 이격된 주기적 패턴의 어레이를 갖는 전극쌍을 사용하였다. 상기 전극쌍에 100 kHz 및 1 V의 교류 전압을 인가하여 약 1600개 홀에서 동시에 유전영동에 의한 바이오연료 생산 균주 선별을 수행하였다. 이때, 분리하고자 하는 바이오연료 생산 균주로는 약 10% 지질 함량의 야생종의 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 유전자 재조합에 의해 지질 생산량이 증가된 약 50% 지질 함량의 야로위아 리폴리티카 polf Δpex10, Δmfe1, DGA1 돌연변이종을 사용하여, 지질 함량이 증가된 돌연변이종의 개체가 선택적으로 홀에 포획되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 전술한 방법으로 선별한 균주를 배양하는 단계를 통해 바이오연료를 생산할 수 있다.
이때, 상기 배양 단계에서 탄소원으로 글루코즈(glucose), 프룩토즈(fructose), 갈락토즈(galactose), 만노즈(mannose)와 같은 당류; 올레산(oleic acid) 등의 지방산; 글리세롤(glycerol), 에탄올 등의 알코올류 및 아세트산 등의 유기산을 공급하여 팔미트산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 헥사데카디엔산(hexadecandienoic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산, 리놀렌산(linolenic acid) 등의 지질을 수득할 수 있으며, 이들 지질은 트랜스에스테르화 반응(transesterification)을 통해 전환되어 바이오연료로 사용되거나, 그 자체로서 화장품 원료 및 식품 소재로 사용될 수 있다.
고효율의 바이오연료 생산을 위하여, 상기 균주로는 미생물 건중량(dry cell weight; DCW) 20% 이상의 지질 생산능을 갖는 선별된 개체를 사용할 수 있다. 구체적으로는 30% 이상, 보다 구체적으로는 40% 이상의 DCW의 생산능을 갖는 개체를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바이오연료 생산방법에 사용되는 균주는 전술한 유전영동을 이용하는 선별방법에 의해 원하는 함량 이상으로 지방을 함유하는 즉, 원하는 수준의 지방 생산능을 갖도록 선별된 개체일 수 있다.
상기 본 발명에 따른 층상형 구조물 및 유전영동 전극쌍은 제1전도체층, 5 내지 1000 nm 범위에서 선택되는 일정한 두께의 절연체층, 제2전도체층, 및 원하는 패턴이 고안된 감광성 수지층을 포함하는 층상형 구조물을 준비하는 제1단계; 에칭에 의해 절연체층, 제2전도체층, 및 감광성 수지층을 고안된 패턴에 따라 선택적으로 식각하는 제2단계; 및 잔류하는 감광성 수지층을 제거하는 제3단계를 포함하는 공정을 통해 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 제조방법은 당업계에 공지된 다양한 소재의 적층 및 식각 방법을 조합하여 수행할 수 있다. 각 단계를 수행하는 구체적인 방법은 선택된 각 층의 소재에 따라 선택할 수 있다.
예컨대, 에칭에 의해 식각하는 단계는 건식 및/또는 습식 에칭방법을 사용하여 수행할 수 있다. 각 구성 층이 기지의 소재 및 두께로 형성된 경우, 건식 에칭방법을 선택할 수 있으며, 이때 수행 시간은 선택된 방법에 따른 각 층의 식각률(etching rate)을 고려하여 결정할 수 있다. 한편, 절연체층으로 PVP 등의 고분자 필름을 포함하는 경우, 특정 용매(etchant)로 처리하는 간단한 방법으로 해당 고분자 필름만을 선택적으로 제거할 수 있는 점을 고려하여, 습식 에칭방법을 선택할 수 있다. 또는 필요에 따라, 제2전도체층은 건식 에칭방법으로, 절연체층은 습식 에칭방법으로 식각하는 복합적인 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 각 구성층의 소재, 당업계에 공지된 식각 방법 및/또는 공정 수행의 편의성과 경제성을 복합적으로 고려하여 식각 방법을 선택할 수 있다.
또한 상기 본 발명에 따른 층상형 구조물 및 유전영동 전극쌍을 제조하는 다른 방법은 제1전도체층, 5 내지 1000 nm 범위에서 선택되는 일정한 두께의 절연체층, 및 패턴이 고안된 감광성 수지층을 포함하는 층상형 구조물을 준비하는 제1단계; 상기 층상형 구조물에 절연체층 및 감광성 수지층에 의해 제1전도체층과 이격되도록 제2전도체층을 형성하는 제2단계; 및 잔류하는 감광성 수지층을 이의 상단에 형성된 제2전도체층과 함께 제거하여, 상기 제1전도체층과 절연체층이 차례로 적층된 층상형 구조물 상에 감광성 수지층의 패턴과 반대 이미지의 패턴으로 형성된 제2전도체층이 추가된 구조물을 형성하는 제3단계를 포함할 수 있다. 이때, 제1단계의 층상형 구조물은 제1전도체층, 절연체층, 및 감광성 수지층 순으로, 또는 제1전도체층, 감광성 수지층, 및 절연체층 순으로 적층된 것일 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 제1단계에서 제1전도체층, 절연체층, 및 감광성 수지층 순으로 적층된 층상형 구조물을 사용하는 경우, 상기 제3단계 이후 에칭에 의해 제2전도체층과 동일한 패턴을 갖도록 절연체층을 선택적으로 식각하는 제4단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 식각 과정에서는 절연체층 상에 형성된 패턴화된 제2전도체층이 마스크로 작용할 수 있다. 상기 제4단계는 당업계에 공지된 건식 또는 습식 에칭방법을 이용하여 수행할 수 있다.
상기 바이오연료 생산 균주의 선별방법에 있어서, 원하는 또는 배제하고자 하는 균주의 선택적인 포집은 하기 방정식 1을 이용하여 포집하고자 하는 균주에 대한, 인가되는 교류 주파수에 따른 클라우시우스-모소티(Clausius-Mossotti; CM) 곡선을 도출하는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 도출한 곡선에서 클라우시우스-모소티의 실수부가 양의 값을 나타내는 범위에서 선택되는 주파수의 교류를 인가하는 제2단계를 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있다:
[방정식 1]
Figure pat00003
상기 방정식에서,
ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수,
ε* p는 포집하고자 하는 균주의 유전율(permittivity),
ε* m은 유체의 유전율임.
또한, 본 발명에 따른, 일측 전극에 선택적으로 형성된 홀을 갖는 유전영동 전극쌍은, 교류 전원 공급부와 함께 전기적으로 연결된 회로를 구비하고, 상기 유전영동 전극쌍의 홀이 형성된 전극면이 시료를 포함하는 유체와 접하도록 고안된 장치를 이용하여, 전술한 입자 포집 방법과 유사한 원리로, 유체 중의 N종의 바이오연료 생산 균주를 포함하는 혼합물(N은 2 이상의 자연수)로부터 특정 바이오연료 생산 균주, 예컨대, 지질 함량이 특정 수준 이상인 균주를 선별 또는 지질 함량이 특정 수준 미만인 균주를 배제하는 데에 사용될 수 있다.
구체적으로, 하기 방정식 1-1을 이용하여 분리하고자 하는 개별 균주 예컨대, 지질 함량이 상이한 바이오연료 생산 균주들의, 주파수에 따른 클라우시우스-모소티 곡선을 도출하는 제1단계; 상기 제1단계로부터 도출된 곡선으로부터 클라우시우스-모소티의 실수부가 일부 바이오연료 생산 균주(들)에 대해서는 양 또는 음의 값을, 이와 분리하고자 하는 다른 입자(들)에 대해서는 이와 반대의 값을 나타내는 주파수를 선택하는 제2단계; 및 상기 제2단계로부터 선택된 주파수의 교류를 인가하는 제3단계를 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있다:
[방정식 1-1]
Figure pat00004
상기 방정식에서,
ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수,
n은 입자의 종류를 구분하는 임의의 숫자로서, 1≤n≤N인 자연수,
ε* pn은 바이오연료 생산 균주 n의 유전율,
ε* m은 유체의 유전율임.
나아가, 본 발명의 바이오연료 생산 균주 선별방법은 상기 제3단계에서 포집 또는 배제된 바이오연료 생산 균주(들)에 대해 제2단계 및 제3단계를 1회 이상 반복하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오연료 생산 균주 선별방법에서 반복되는 단계는 인가되는 교류의 주파수를 변경하여 수행하되, 일차 분리에 사용한 장치를 그대로 이용하거나, 이와 병렬로 연결된 동일한 장치를 이용하여 연속적으로 수행할 수 있다. 예컨대, 일차적인 바이오연료 생산 균주 중 우량 또는 불량의 분리를 수행한 후, 홀 내에 관심 바이오연료 생산 균주를 포함하여 2종 이상의 바이오연료 생산 균주가 잔류하여 이들 바이오연료 생산 균주로부터 관심 바이오연료 생산 균주를 분리하고자 하는 경우에는, 상기 일차 분리 후 홀 내에 포집된 바이오연료 생산 균주들을 제외한 유체 내에 분산된 바이오연료 생산 균주들을 제거한 후, 동일한 유전율의 신선한 유체를 채우고 동일 장치에 일차 분리에서와 상이한 주파수의 교류를 인가하거나, 일차 분리에서와 상이한 유전율을 갖는 유체를 채우고 주파수는 유지한 채로 반복적인 분리를 수행할 수 있다. 또는 분리하고자 하는 관심 바이오연료 생산 균주가 일차 분리에서 홀 내에 포집되지 않고 유체 내에 다른 바이오연료 생산 균주와 함께 분산된 경우에는, 이와 연결된, 본 발명의 유전영동 전극쌍을 구비한 신규한 분리 장치에 관심 바이오연료 생산 균주를 포함하는 유체를 전송시키고 상기 신규한 분리 장치에서 변경된 주파수를 인가하여 동일한 방식으로 혼합 균주를 분리하는 단계를 반복 수행할 수 있다.
본 발명은 하나의 전극에 선택적으로 형성된 일련의 패턴화된 홀을 가지며, 절연체층에 의해 형성된 수직 나노갭에 의해 이격된 전극쌍을 이용함으로써, 상기 형성된 복수의 홀에서 동시에 유전영동 효과에 의해 특정 성질의 입자를 선택적으로 포집할 수 있으므로, 이러한 현상을 토대로 유사한 크기를 갖는 다만 지질 함량이 상이한 고지질 함량 이스트 우량균주를 저지질 함량 이스트로부터 선별해 내는데에 유용하게 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 패턴화된 수직 나노갭 전극을 이용한 유전영동(dielectrophoresis; DEP)에 의한 동종의 미생물 중에서 바이오연료/소재 생산능이 높은 고지질 함량 이스트 균주를 선택적으로 포집하는 원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 방법을 이용하여 수십 mm2의 대면적으로 제조된, 100 nm 두께의 SiO2 층으로 이격되고, 다양한 크기의 패턴으로 형성된 홀을 포함하는 금 전극과 ITO 전극으로 된 수직 나노갭 전극의 형태 및 단면을 육안 및 주사전자현미경(scanning electron microscope; SEM)으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 지질 함량을 조절한 고지질 함량 이스트의 공초점 현미경 이미지(confocal microscope image)를 나타낸 도이다. 현미경 이미지 상에서 육안으로 지질 함량에 따른 이스트 균주의 구분이 가능하도록 하기 위하여, 고지질 함량 이스트와 저지질 함량 이스트를 각기 다른 색의 형광을 나타내도록 표지하였다. 구체적으로, 고지질 함량 이스트는 붉은색의 엠체리 형광단백질을 발현하도록 표지되어 세포 전체가 붉은색을 띄며, 저지질 함량 이스트는 녹색으로 라벨링되어 세포 전체가 녹색을 띈다.
도 4는 (A) 본 발명의 일 실시예에 따른 전도체층으로서 PVP로 이격된 전극쌍(패턴된 금 및 ITO)에서의 전기장 분포 및 (B) 비슷한 크기를 갖는 이스트 균주 모사체로서 폴리스티렌 입자(polystyrene, 직경 7 ㎛)에 대해, 시뮬레이션에 의해 도출한, 주파수에 따른 클라우시우스-모소티 곡선을 나타낸 도이다. 저지질 함량 이스트(10%)와 고지질 함량 이스트(50%)의 2종 세포에 대하여 클라우시우스-모소티 곡선을 도식화하고, 이들 2종 균주의 주파수에 따른 클라우시우스-모소티 값으로부터 각 세포의 운동 방향을 결정할 수 있다. 따라서, 이들 균주가 서로 상이한 운동 방향성을 갖도록 하기 위하여, 각각의 클라우시우스-모소티 값이 음과 양의 영역에 존재하도록 주파수를 선별하여 한다.
도 5는 산출된 곡선의 클라우시우스-모소티 값이 양인 영역과 음인 영역으로 선택된 100 KHz로 주파수로 1 V의 교류 전압을 인가하기 전과 후를 투과모드로 관찰한 현미경 이미지를 나타낸 도이다. 준비된 전극 상에 균일하게 혹은 랜덤하게 부유하던 고지질 함량 이스트(50%)는 교류 전압을 인가함에 따라, 즉시 전극으로 포집되어, 전극 패턴의 에지(edge)부분에 포집된다.
도 6은 본 발명의 제조예에 따라 준비한, 동일한 크기의 상이한 함량으로 지질을 함유(각각 50% 및 10%)하는 2종의 이스트 균주를 동량으로 혼합한 후, 증류수에 OD600 유닛 1(0.5 내지 2×107 세포/mL)이 되도록 희석시켜 전극 상에 분주한 후, 100 KHz의 주파수로 0.5 V의 교류 전압을 인가한 경우에 전극의 홀에 포집된 이스트의 (좌) 광학 이미지와 (우) 이에 상응하는 형광 이미지를 나타낸 도이다. 지질함량의 차이를 형광 표지 여부로 판별하기 위하여, 붉은색 필터(EX 542-582/EM 604-644)를 이용하여 확인된 형광 이미지는 엠체리 형광 표지된 고지질 함량 이스트가 선택적으로 전극에 포집됨을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 일면에 패턴화된 홀을 갖고 양면이 SiO 2 로 이격된 대면적 수직 나노갭 어레이의 제조
1 cm×1 cm 면적으로 패터닝된 유리 기판 상에 40 nm 두께로 ITO 층을 4 mm×4 mm 면적으로 형성한 후, PECVD(plasma-enhanced chemical vapor deposition) 장치를 이용하여 100 nm 두께로 SiO2 층을 증착시켰다. 이후, 열증착기로 100 nm 두께의 은 층을 SiO2 층 상에 형성하였다. 이어서, 감광성 수지(AZ152, Microchemical)를 스핀코팅하고 가열하여 감광성 수지층을 형성하였다. 상기 감광성 수지층이 형성된 면에 일련의 직경 30 μm의 홀이 30 ㎛ 간격으로 배열된 어레이 형태의 패턴을 갖는 포토마스크를 위치시키고 상기 포토마스크 상에 자외선을 조사한 후 현상하여 마스킹된 부분을 제거하였다. 이상과 같이 감광성 수지로 홀 어레이 패턴이 형성된 층상형 구조물에 유도결합플라즈마(inductively coupled plasma; ICP) 에칭을 수행하여 홀 패턴의 하단에 노출된 제2전도체층 및 절연체층을 상기 패턴과 동일한 형태로 식각하였다. 상기 ICP 에칭을 통한 식각시 식각률은 제2전도체층을 구성하는 금 및 절연체층을 구성하는 SiO2에서 상이한 바, 제1절연체층은 유지하되 제2전도체층 및 절연체층을 선택적으로 제거할 수 있도록, 이들 각 층의 두께 및 해당 소재에 대한 식각률을 고려하여 처리 시간을 산출하였다. 구체적으로, ICP 에칭에 의한 SiO2 식각의 경우, 아르곤 가스 15 sccm, CHF3 가스 90 sccm 하에 4 mTorr 압력에서 ICP 2700 W, 바이어스 75 W로 헬륨 5 mTorr 압력으로 약 230 nm/초의 조건으로 식각하였다. 한편, 은 층의 경우, 아르곤 가스 8 sccm, Cl2 가스 4 sccm 하에 0.5 Torr 압력에서 ICP 1000 W, 바이어스 150 W로 헬륨 5 mTorr 압력으로 약 130 nm/초의 조건으로 식각하였다.
제조예 2: 일면에 패턴화된 홀을 갖고 양면이 PVP로 이격된 대면적 수직 나노갭 어레이의 제조
180 nm 두께의 ITO 층이 1 cm×1 cm 면적으로 패터닝된 유리 기판 상에 폴리비닐페놀(polyvinylphenol; PVP) 용액을 스핀코팅하고 가열하여 PVP로 된 110 nm 두께의 절연체층을 형성하였다. 이어서 상기 PVP 층 상에 감광성 수지(AZ1512)를 스핀코팅하고 가열하여 감광성 수지층을 형성하였다. 상기 감광성 수지층이 형성된 면에 일련의 직경 30 μm의 홀이 30 ㎛ 간격으로 배열된 어레이 형태의 패턴을 갖는 포토마스크를 위치시키고 상기 포토마스크 상에 자외선을 조사한 후 현상하여 마스킹된 부분을 제거하였다. 상기 패턴화된 감광성 수지층을 포함하는 적층 구조물 상의 패턴화된 면에 열증착 방식으로 120 nm 두께의 금 박막을 형성하였다. 이후, 아세톤으로 처리하여 잔여 감광성 수지 패턴 및 이의 표면에 형성된 불필요한 금 박막을 제거하고 홀 어레이 형태의 패턴을 갖는 금 박막층을 획득하였다. 나아가, 100 mTorr 압력에서 100 sccm 유속의 산소 가스를 이용한 반응성 이온 식각(reactive ion etching)을 통해 150 W로 2분 15초 동안 처리하여 패턴된 금 박막을 마스크로 사용하여 이에 의해 가리워지지 않은 홀 부분에 노출된 PVP 절연체층의 부분을 선택적으로 제거하였다.
제조예 3: 고효율 바이오연료 생산 균주의 제조
고효율의 바이오연료 생산 균주를 제조하기 위하여, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 기본 균주로 사용하였다. 야생종의 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica POlf, 지질함량 약 10%)를 저지질 함량 미생물로 사용하고, 유전자 재조합에 의해 생산된 돌연변이종(Yarrowia lipolytica polf Δpex10 , Δmfe1, DGA1, 지질함량 약 50%)을 고지질 함량 미생물로 사용하였다. 상기 2종 균주는 글루코스(50 g/L), YNB(yeast nitrogen base, MPbio, 1.7 g/L), 황산암모늄(2.2 g/L) 및 CSM-Leu(complete supplement mixture without uracil, Becton Dickinson and Company, 0.67 g/L)를 포함하는 YSC(yeast synthetic complete) 배지에서 배양하였다.
상기 지질 함량이 상이한 2종 균주의 접종을 위해, 3 mL의 배지에서 48시간 동안 종배양(seed culture)한 후, 500 μL의 종배양액을 신선한 YSC 배지 10 mL에 옮겨 24시간 동안 사전배양(pre-culture)하였다. 본 배양(main culture)을 위하여, 상기 사전배양한 균주를 초기 접종량 OD600 0.2 유닛(1 내지 4×106 세포/mL)으로 25 mL의 YSC 배지가 담긴 250 mL 플라스크에 접종하여 144시간 동안 배양하여 균주에 지질이 축적되도록 하였다. 상기 모든 배양 단계에서 배양기는 200 rpm, 28℃의 조건을 유지하였다. 배양 후, 500 g로 2 분 동안 원심분리하여 균주를 수확하고, 유전영동을 이용한 선별에 적용하기 위하여 증류수로 2회 반복하여 재현탁함으로써 잔류하는 배지 성분을 완전히 제거하였다.
제조예 4: 형광 표지된 이스트 세포의 제조
이후, 본 발명의 어레이를 이용하여 분리한 세포의 정보를 육안으로 확인할 수 있도록 이스트 세포를 형광 표지하였다. 구체적으로, 형광 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드를 제조하여, 이를 발현하도록 하였다. 상기 형광 단백질로는, 587 nm 파장의 빛을 흡수하여 610 nm 파장의 빛을 방출하는, 붉은색 계열의 엠체리(mcherry) 형광 단백질을 선택하였다. 상기 엠체리 형광 단백질의 발현에는 항시발현이 가능한 TEF 프로모터를 사용하였다. 상기 제조한 발현벡터를 고농도 지질 생산 가능한 이스트에 형질전환(transformation)하여 붉은색 형광을 나타내도록 형광 표지된 균주를 획득하였다.
실험예 1: 수직 나노갭 어레이의 형상 분석
상기 제조예 1 및 2에 따라, 각각 수 mm2 및 수 cm2 면적으로 제조된, 절연체로 된 나노갭으로 이격되고, 연속적으로 형성된 하나의 전극과 복수의 홀 어레이 패턴이 형성된 다른 하나의 전극을 포함하는 전극쌍을 도 2에 나타내었다. 이와 같이 제조된 전극쌍의 외형을 육안으로 관찰하고(도 2A), 각기 다른 크기로 패턴된 일 부분을 현미경으로 확대 관찰하였으며(도 2B 내지 2E), 미세 홀 어레이 패턴 및 단면은 SEM으로 확인하여 도 2F 및 2G에 나타내었다.
실시예 1: 유전영동법을 이용한 이스트의 포집 및 분산
본 발명에서는 상기 제조예 1 및 2에 따라 준비한 전극쌍의 생물학적 물질의 검출에 대한 응용 가능성을 확안하고자, 상기 전극쌍에 미생물 이스트를 함유하는 용액을 적용하고, 상기 전극에 의한 이스트의 포집 여부를 확인하였다.
먼저, 실제 실험에 앞서, 시뮬레이션을 통해 유전영동 현상을 예측하였다. 유전영동 현상에 의해 입자에 작용하는 힘은 입자의 이를 둘러싼 물질의 전도도, 유전율 및 인가되는 교류 전압의 주파수에 의해 결정되며, 이는 하기 방정식에 따라 산출할 수 있다.
Figure pat00005
이때, ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수, εm은 입자를 둘러싼 유체의 유전율, R은 사용하는 입자의 반경, E는 전기장의 크기이며, Re(fCM(ω))는 인가되는 교류의 주파수에 대한 클라우시우스-모소티(Clausius-Mossotti; CM) 함수의 실수부이다. 상기 방정식에 있어서, 입자에 가해지는 유전영동력의 부호를 결정하는 인자는 클라우시우스-모소티(Clausius-Mossotti; CM) 함수의 실수부이며, 이는 하기의 방정식으로 계산될 수 있다.
Figure pat00006
이때, ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수, ε* p는 포집하고자 하는 입자의 유전율, ε* m은 유체의 유전율이다. 상기 제조예 1 및 2에 따라 준비된 유전영동 전극쌍에 교류 전압을 인가하였을 때, 발생하는 전기장의 분포를 도 4(A)에, 상기 수식을 통해 이론적으로 도출된 10 μm 크기의 이스트 균에 대한 주파수에 따른 클라우시우스-모소티 함수를 도 4(B)에 나타내었다. 이스트 균의 경우, 문헌 값을 통해 얻어진 값을 대입하여 계산한 클라우시우스-모소티 값은 1 MHz를 기준으로 그 특성이 변화하는 것으로 나타났으며, 구체적으로, 1 MHz 미만의 주파수에서 양의 수치를, 1 MHz 초과의 주파수에서는 음의 수치를 나타내었다.
상기 도 4(B)의 그래프로부터, 상기 2개 방정식을 통해 산출되는 교류 전압 인가 시 입자에 가해지는 유전영동력을 입자의 움직임과 결부시키면, 양의 유전영동력을 받는 입자는 전극을 향하여 이동하는 반면, 음의 유전영동력을 받는 입자는 전극을 등지는 방향으로 이동할 것으로 예상되었다.
상기 이론적 계산으로 예측한 결과가 실제 본 발명의 유전영동 전극쌍을 이용하여 구현 가능한지 확인하기 위하여, 상기 제조예 1 및 2에 따라 제조한 전극쌍의 홀 어레이 패턴이 형성된 면에 직경 10 μm 크기의 이스트 균을 포함하는 유체(18.2 MΩ 이상의 3차 증류수)와 접하도록 장치를 구성하고 전기적으로 연결된 양 전극에 교류 전원을 연결하여 유전영동 현상을 유도한 후 교류의 주파수에 따른 유체 내 입자의 거동을 비디오로 찍어 확인하였다. 구체적으로, 상기 이스트 균을 포함하는 유체와 접촉시킨 제조예 1에 따라 제조된 전극쌍을 구비한 장치에 100 kHz, 1 V의 전압을 인가한 후, 이스트의 거동을 측정하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 양의 클라우시우스-모소티 값을 갖게 되는 100 kHz의 교류가 인가되는 경우, 이스트 균은 전극을 향하는 방향으로 유전영동력을 받아 홀 내에 포집되어 전극과 인접하게 홀의 테두리를 따라 배열되었다.
실시예 2: 유전영동법을 이용한 지방 함량이 이스트의 선별적 분리
나아가, 본 발명에 따른 절연체로 된 나노갭으로 이격되고, 연속적으로 형성된 하나의 전극과 복수의 홀 어레이 패턴이 형성된 다른 하나의 전극을 포함하는 전극쌍을 이용한 지방 함량에 따른 이스트 균의 선별적 분리 가능성을 검증하기 위하여, 저지질함량(15%) 이스트 균과 제조예 3에 따라 엠체리로 표지한 고지질함량(50%) 이스트 균을 동일 비율로 혼합한 후, 3차 증류수에 희석하여 OD600 0.2 내지 1 유닛 사이의 농도로 상기 준비한 전극 상에 가하고, 100 kHz 및 1 V의 전압을 인가한 후, 광학 및 현광 현미경으로 관찰하고 이미지를 획득하였다(도 5 및 도 6). 해당 실험은 직경 30 μm 크기의 홀들이 60 μm 간격으로 이격되어 형성된 어레이 패턴의 전극 상에서 진행되었으며, 4 mm×4 mm의 주기적으로 배열된 홀 패턴을 통해 수직적으로 배열된 두 전극에 100 kHz 및 1 V의 전압을 동시에 인가하여, 약 1600개 홀에서 동시에 작동하도록 하였다.
상기 획득한 광학 및 형광 현미경 이미지를 중첩시켜, 전극쌍의 홀 내부에 포획된 이스트 균의 종류를 확인하였으며, 그 결과, 엠체리로 염색된 고지질함량 이스트 균만이 선택적으로 포획되는 것으로 나타났다. 이는 본 발명에 따라 제조된 전극쌍은 낮은 전압에서 유전영동력에 의한 입자의 포집과 농축 나아가, 상기 원리에 의해 크기 및/또는 지질의 함량에 따른(즉, 그리하여 유전율이 상이한) 이스트 균의 분리 및/또는 정제에 있어 큰 잠재성을 가짐을 나타내는 것이다. 보통 지질의 함량이 클수록 유전영동력에 크게 영향을 받기 때문에, 다양한 지질 함량의 지닌 동종의 이스트 균주로부터, 최고 수준의 이스트 균주를 가지는 우량 이스트 균주를 선택적으로 분리함으로서, 향후 다량의 이스트 균주로부터 정확하고 신속하게 유량 균주를 선발해 낼 수 있는 것을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 순차적으로 적층된 제1전도체 전극; 5 내지 1000 nm 범위에서 선택되는 일정한 두께를 갖는 절연체층; 및 제2전도체 전극;을 포함하며 일측 전극은 연속적으로 형성되고 타측 전극은 선택적으로 동일한 패턴으로 형성된 1 이상의 홀을 갖는 유전영동 전극쌍이 교류 전원 공급부와 함께 전기적으로 연결된 회로를 구비하고, 상기 유전영동 전극쌍의 홀이 형성된 전극면이 시료를 포함하는 유체와 접하도록 고안된 장치에 바이오연료 생산 균주 후보군을 함유하는 유체를 투입하여 전극쌍과 접촉시키는 제1단계;
    상기 전극쌍에 교류 전압을 인가하는 제2단계; 및
    상기 전극쌍의 홀 내에 포획된 세포들을 선택적으로 회수하는 제3단계를 포함하는, 바이오연료 생산 균주의 선별방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 홀은 각각 독립적으로 50 nm2 내지 10,000 ㎛2의 면적을 갖는 것인 선별방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 교류는,
    하기 방정식 1을 이용하여 포집하고자 하는 균주에 대한, 인가되는 교류 주파수에 따른 클라우시우스-모소티(Clausius-Mossotti; CM) 곡선을 도출하고, 상기 도출된 곡선에서 클라우시우스-모소티의 실수부가 양의 값을 나타내는 범위에서 선택되는 주파수를 갖는 것인 선별방법:
    [방정식 1]
    Figure pat00007

    상기 방정식에서,
    ω는 유전영동 전극쌍에 인가되는 교류의 주파수,
    ε* p는 포집하고자 하는 입자의 유전율(permittivity),
    ε* m은 유체의 유전율임.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 교류는 10 KHz 내지 10 MHz 주파수 및 0.1 내지 5 V의 전압으로 인가하는 것인 선별방법.
  5. 제1항에 있어서,
    제3단계에서 홀에 포획되는 세포들은 상대적으로 지질 함량이 높은 균주인 것인 선별방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이오연료 생산 균주는 지질생산 미생물 또는 이의 변이종인 것인 선별방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1전도체 전극 및 제2전도체 전극은 각각 독립적으로 구리(copper), 금(gold), 은(silver), 백금(platinum) 및 팔라듐(palladium)으로 구성된 군으로부터 선택되는 금속; 구리, 금, 은, 백금 및 팔라듐으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 금속과 그라파이트, 텔루륨(tellurium), 텅스텐(tungsten), 아연(zinc), 이리듐(iridium), 루테늄(rithenium), 비소(arsenic), 인(phosphorus), 알루미늄(aluminum), 망간(manganese), 실리콘(silicon)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 함유하는 합금(alloys) 또는 복합체; 그라파이트(graphite), 그래핀(graphene) 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 전도성 탄소물질; 또는 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO), 티타늄 산화물(TiO2), 루테늄 산화물(RuO2), 이리듐 산화물(IrO2), 및 백금 산화물(PtO2)로 구성된 군으로부터 선택되는 혼합 금속 산화물(mixed metal oxides)의 소재로 된 것인 선별방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 절연체층은 SiO2, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone; PVP), Nb2O5, TiO2, Al2O3, 및 MgO로 구성된 군으로부터 선택되는 소재로 된 것인 선별방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 선별한 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 바이오연료의 생산방법.
  10. 제9항에 있어서,
    탄소원으로 글루코즈(glucose), 프룩토즈(fructose), 갈락토즈(galactose), 만노즈(mannose)를 포함하는 당류; 올레산(oleic acid)을 포함하는 지방산; 글리세롤(glycerol), 에탄올을 포함하는 알코올류 및 아세트산을 포함하는 유기산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 공급하면서 팔미트산(palmitic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 헥사데카디엔산(hexadecandienoic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산, 및 리놀렌산(linolenic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지질을 수득하는 것인 생산방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 균주는 미생물 건중량(dry cell weight; DCW) 20% 이상의 지질 생산능을 갖는 것인 생산방법.
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