KR20200069253A

KR20200069253A - 인간 항-antxr 키메라 항원 수용체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200069253A
Application number: KR1020190161756A
Authority: KR
Inventors: 이경미; 전승현; 이백승; 이윤; 이영관
Original assignee: 주식회사 엠제이셀바이오
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2020-06-16
Also published as: KR102156822B1

Abstract

본 발명은 ANTXR(anthrax toxin receptor)을 특이적으로 표적화하는 리간드를 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 ANTXR1(anthrax toxin receptor 1) 또는 ANTXR2(anthrax toxin receptor 2)에 특이적으로 결합하는 PA63 리간드의 도메인 4를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-ANTXR 키메라 항원 수용체(CAR)-T세포를 이용하여 고형암을 치료할 수 있으며, 항암 약물을 투여하는 것이 유효하지 않은 고형암 환자, 특히 췌장암 환자에 대하여 키메라 항원 수용체(CAR)-T세포를 투여함으로써, 약물 투여를 제한하고, 효율적이며 안전한 맞춤형 고형암 예방 또는 치료가 가능하다.

Description

인간 항-ANTXR 키메라 항원 수용체 및 이의 용도{Human anti-ANTXR chimeric antigen receptors and uses thereof}

본 발명은 ANTXR(anthrax toxin receptor)을 특이적으로 표적화하는 리간드를 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 ANTXR1(anthrax toxin receptor 1) 또는 ANTXR2(anthrax toxin receptor 2)에 특이적으로 결합하는 PA63 리간드의 도메인 4를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

탄저균 독소 수용체(anthrax toxin receptor)는 ANTXR1(anthrax toxin receptor 1)과 ANTXR2(anthrax toxin receptor 2)를 포함하며, 이의 리간드로는 탄저균이 분비하는 독소인 탄저균 독소(anthrax toxin)가 알려져 있다. 탄저균 독소는 그람 양성균인 Bacillus anthracis에 의해 분비되며, 3가지 독소 단백질 protective antigen(PA, 83kDa), lethal factor(LF, 90kDa), edema factor(EF, 89kDa)로 구성되어 있다(Morton, N. (2001) New Engl. J. Med. 345:1621-1626). 이 중 PA가 세포 표면의 탄저균 독소 수용체(anthrax toxin receptor, ANTXR)와 결합하면 퓨린(furin) 계열의 단백질 가수분해 효소에 의해 아미노 말단 20kDa(PA20)이 절단된 63kDa(PA63)은 헵타머(heptamer)를 이루게 되며, 그 후 LF가 결합하게 된다(Collier, R.J (2003) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19: 45-70).

ANTXR1은 세포외 기질 단백질이며, 다른 명칭은 TEM8(tumor endothelial marker 8)이다. ANTXR1은 다양한 종양의 내피에서 발현되는 타입 Ⅰ 세포막 단백질(type Ⅰ transmembrane protein)로, 종양의 혈관신생과정(tumor angiogenesis)동안 발현이 증가하는 유전자로 이미 밝혀졌으며(St. Croix et al., (2000) Sciences 289:1197), 종양의 혈관내피세포에서의 세포외 기질 단백질을 매개로 한 세포의 부착이나 이동 등에도 관여한다고 알려져 있다(Bradely et al., (2001) Nature 414:228-229; Nanda et al., (2004) Curr Opin Oncol 16:44-49). ANTXR1은 세포외 리간드(extracellular ligand)에 대한 수용체로 작용하기 때문에, 혈관신생과정의 치료를 위한 타겟이 되고 있으나(Carson-Walter, E. B. et al., (2001) Cancer Res 61:6649), 췌장암 조직에서의 보고는 현재까지 없다. ANTXR2의 다른 명칭은 CMG2(capillary morphogenesis gene 2)이며, ANTXR2는 역시 혈관신생에 관여한다고 알려져 있다. 또한, ANTXR2는 상피세포와 내피세포를 포함한 다양한 종류의 세포 부착(adhesion)과 이동(motility)에도 관여한다고 알려져 있다(Lin Ye et al., (2014) INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 45: 1565-1573).

암의 검출, 예방 및 치료에서 진보가 이루어져 왔지만, 보편적으로 성공한 치료 전략은 아직 실현되지 않았다. 암 치료의 다양한 형태의 반응은 혼합되어 있는데, 화학요법 및 방사선요법을 포함하는 암을 치료하는 종래의 방법은 독성 부작용에 기인하여 유용성이 제한되고 있다. 치료용 항체를 사용한 면역요법은 불량한 약물동태 프로파일, 혈청 프로테아제에 의한 항체의 신속한 제거 및 사구체에서의 여과 및 종양 부위 내로의 제한된 투과 및 종양 세포에 대한 표적 항원의 발현 수준에 부분적으로 기인하여 제한된 성공을 제공한다.

최근 암에 대한 새로운 양자면역 유전자치료로서, 유전자변형 세포 요법이 주목 받고 있다. 이 치료법은 암세포의 표면항원으로의 특이성과 세포의 활성화능을 가지는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 코딩하는 핵산을 T 세포 또는 NK 세포에 도입하고, 수득된 유전자도입 세포를 체외에서 증식시켜서 수주하는 방법이다. 이 방법은 항체의약에 비해서 항암 효과가 보다 강력하고, 효과도 보다 장기간 지속된다고 생각되고 있으며, 그 임상효과에 대단히 기대를 하고 있다.

이에 본 발명자들은 신규한 고형암 치료용 키메라 항원 수용체를 개발하고자 노력한 결과, ANTXR1과 ANTXR2는 정상 조직에서는 거의 발현되지 않으며, 췌장암 조직에서만 특이적으로 발현한다는 것을 확인하였고, ANTXR1과 ANTXR2를 특이적으로 표적화하는 PA63 리간드를 확인하여 한국특허출원 하였다(출원번호: 제10-2018-0087934호). 나아가, 본 발명자들은 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편을 포함하는 CAR가 PA63 리간드를 포함하는 CAR에 비해 췌장암 치료제로서의 효과가 더 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 세포외 결합 도메인(extracellular binding domain), 막횡단 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 코딩하는 핵산으로, 상기 세포외 결합 도메인은 ANTXR(anthrax toxin receptor)을 인지하는 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 세포 및 상기 재조합 세포를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포외 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산으로, 상기 세포외 결합 도메인은 ANTXR을 인지하는 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 세포를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 항-ANTXR 키메라 항원 수용체(CAR)-T세포를 이용하여 고형암을 치료할 수 있으며, 항암 약물을 투여하는 것이 유효하지 않은 고형암 환자, 특히 췌장암 환자에 대하여 키메라 항원 수용체(CAR)-T세포를 투여함으로써, 약물 투여를 제한하고, 효율적이며 안전한 맞춤형 고형암 예방 또는 치료가 가능하다.

도 1은 1차 선발된 6종의 유전자의 정상조직에서의 단백질 발현도를 나타낸 것이다. A는 ANTXR1(Anthrax toxin receptor 1), B는 ANTXR2(Anthrax toxin receptor 2), C는 TMC5(Transmembrane channel-like 5), D는 CLDN18(Claudin 18), E는 MUC13(Mucin 13), F는 MMP14(Matrix metallopeptidase 14)의 발현양을 나타낸 것이다.
도 2는 혈액내 면역세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC), primary 췌장암 조직에서 RT-PCR(real-time RT-PCR)을 통한 ANTXR1, ANTXR2 mRNA 발현도를 분석한 것이다. PBMC는 음성대조군, PANC-1은 양성대조군으로 사용되었으며, #101, #103, #105, #106, #107, #108, #109, #110는 stage2의 췌장암 조직이며, #102는 stage3의 췌장암 조직이다.
도 3은 정상세포(HEK-293세포), MDA-MB 231세포, 췌장암 세포주(AsPC1, Capan2, PANC1, Mia-PaCa2, SNU-213, SNU-324, SNU-2466, SNU-2469, SNU-2485, SNU-2543)에서 RT-PCR(real-time RT-PCR)을 통한 ANTXR1, ANTXR2 mRNA 발현도를 분석한 것이다.
도 4는 Flow cytometry를 이용하여 정상세포(HEK-293세포), MDA-MB-231세포, 췌장암 세포주(AsPC1, PANC1, SNU-213, SNU-2466)의 세포 표면에서의 ANTXR1, ANTXR2 단백질 발현도를 분석한 것이다.
도 5는 정상세포인 HUVEC세포, MDA-MB 231세포, ANTXR1, ANTXR2 mRNA 발현이 매우 증가된 것으로 확인된 췌장암 세포주(AsPC1, Capan2, PANC1, Mia-PaCa2, SNU-213, SNU-324, SNU-2466, SNU-2469, SNU-2485, SNU-2543)에서 ANTXR1, ANTXR2의 ligand인 PA63에 형광을 나타내는 FITC가 conjugation 되어있는 시약을 처리한 뒤, Flow cytometry를 이용하여 세포 표면 단백질인 ANTXR1, ANTXR2의 발현도를 분석한 것이다.
도 6은 본 발명의 ANTXR1 또는 ANTXR2에 특이적인 CAR의 설계를 나타낸 벡터 맵이다. 본 발명의 CAR는 세포외 결합 도메인으로 PA63 리간드의 수용체 결합에 필수적인 domain 4 또는 domain 4를 포함하는 단편, CD8α로부터 유래된 막횡단 도메인과 hinge region, CD3ζ사슬의 1차 신호전달 도메인, CD28 및 CD137을 공자극 신호전달 도메인으로 포함하도록 설계되었다.
도 7은 Cytotocxicity T cell Clone에 CAR를 Transduction하여 발현시킨 것을 Flow cytometry를 이용하여 분석한 것이다.
도 8은 기존 NYESO-1 항원을 인지하여 활성을 나타낼 수 있는 NYESO-1 CTL 및 이에 CAR를 도입하여 NYESO-1과 ANTXR1 또는 ANTXR2를 동시에 타겟 가능한 CAR-T 세포를 나타낸 것을 나타낸 것이다.
도 9는 췌장암 세포주(AsPC1, PANC-1, Mia-PaCa2)에 대한 CAR-T 세포의 항암 세포독성 및 활성을 Flow cytometry를 이용하여 분석한 것이다.
도 10은 췌장암 세포주(PANC-1)에 대한 D4를 포함하는 CAR-T 세포의 항암 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 PBMC에서 분리한 T 세포를 이용하여 제작한 CAR-T 세포의 흑색종(526-mel), 췌장암(PANC-1, Mia-PaCa2) 및 유방암 세포주(SK-BR3, MDA-231, ZR-571)에 대한 항암 세포독성 및 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 PBMC에서 분리한 T 세포를 이용하여 제작한 CAR-T 세포의 췌장암 세포주(PANC-1_RFP)에 대한 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 13은 PBMC에서 분리한 T 세포를 이용하여 제작한 CAR-T 세포의 ANTXR을 발현하는 췌장암 동물 모델에서의 적용 결과를 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명자들은 신규한 고형암 치료용 키메라 항원 수용체를 개발하고자 노력한 결과, ANTXR1과 ANTXR2는 정상 조직에서는 거의 발현되지 않으며, 췌장암 조직에서만 특이적으로 발현한다는 것을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 췌장암 환자로부터 분리한 암 조직과 IPMN 조직, 정상 췌장조직에서의 유전자 변화를 마이크로 어레이 방법을 사용하여 분석하였고, 췌장암 조직에서 발현이 증가된 6종의 유전자를 선별하였다(표 1). 상기 1차 선별된 6종의 유전자 중에서, mRNA 발현양이 '정상 조직(Normal)<IPMN 조직<췌장암(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) 조직'이면서, 발현 단백질이 세포 표면에 존재하며, 정상 조직에서 발현을 거의 볼 수 없는 조건을 모두 만족시키는 유전자는 ANTXR1과 ANTXR2뿐임을 확인하였다. 또한, 본 발명은 ANTXR1과 ANTXR2를 특이적으로 표적화하는 PA63 리간드를 확인하였으며, PA63 리간드의 수용체 결합에 필수적인 domain 4 또는 domain 4를 포함하는 단편을 세포외 결합 도메인으로, CD8α로부터 유래된 막횡단 도메인과 hinge region, CD3ζ사슬의 1차 신호전달 도메인, CD28 및 CD137을 공자극 신호전달 도메인으로 포함하도록 설계된 ANTXR1 또는 ANTXR2에 특이적인 CAR를 개발하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 세포외 결합 도메인(extracellular binding domain), 막횡단 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 코딩하는 핵산으로, 상기 세포외 결합 도메인은 ANTXR(anthrax toxin receptor)을 인지하는 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)"란, 면역 이펙터 세포(effector cell)에서 세포에게 표적 세포 및 세포내 신호 생성을 제공하는 재조합 폴리펩티드 구축물을 의미하는 것이다. CAR는 표적 항원(예: 종양 항원)에 대한 항체-기반 특이성을, 특정 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하기 위해 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 조합하는 분자이다. 본 발명의 용어, "키메라"는 상이한 단백질의 일부 또는 상이한 기원의 DNA로 구성되는 것을 의미한다. CAR는 적어도 세포외 결합 도메인(extracellular binding domain), 막횡단 도메인(transmembrane domain), 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함한다.

본 발명의 용어 "세포외 결합 도메인(extracellular binding domain)"이란, 목적하는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR의 부분을 의미하는 것이다. 세포외 결합 도메인은, 생물학적 분자(예: 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 지질, 다당류, 또는 기타 세포 표면 표적 분자, 또는 이의 성분)를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 결합 도메인은 목적하는 생물학적 분자를 위한 임의의 천연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합에 의해 생성된 결합 파트너를 포함한다.

본 발명의 용어 "특이적으로 결합하는"이란, 배경 결합보다 큰 결합 친화성으로 또 다른 분자에 대한 분자의 결합을 의미하는 것이다. 예를 들면, 세포외 결합 도메인은 약 105M^-1 이상의 친화성 또는 Ka(즉, 1/M의 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수)로 표적 분자에 결합하거나 이와 연합하는 경우, 표적 분자에 대해 특이적으로 결합한다. 또는, 친화성은 M의 단위를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)(예: 10^-5M 내지 10^-13M 또는 그 이하)로 정의될 수 있다.

본 발명에 따른 세포외 결합 도메인 및 CAR의 친화성은 통상의 기술, 예를 들면, 경쟁 ELISA(효소-결합된 면역흡착 검정) 또는 표지된 리간드를 사용하거나 바이아코어(Biacore) T100(이는 뉴저지주 피스카타웨이 바이아코어 인코포레이티드로부터 이용가능함) 등의 표면-플라스몬 공명 장치 또는 각각 코닝(Corning) 및 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 이용가능한 EPIC 시스템 또는 EnSpire 등의 광학 바이오센서 기술을 사용하는 결합 회합 또는 치환 분석에 의해 용이하게 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포외 결합 도메인은 ANTXR을 인지하는 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 PA63 리간드의 도메인 4 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 D1은 PA63 리간드의 도메인 1; D2는 PA63 리간드의 도메인 2; D3는 PA63 리간드의 도메인 3; D4는 PA63 리간드의 도메인 4를 의미한다. D1+D4는 PA63 리간드의 도메인 1 및 도메인 4의 결합; D2+D4는 PA63 리간드의 도메인 2 및 도메인 4의 결합; D3+D4는 PA63 리간드의 도메인 3 및 도메인 4의 결합; D4+D4는 PA63 리간드의 도메인 4 및 도메인 4의 결합; D1+D2+D4는 PA63 리간드의 도메인 1, 도메인 2 및 도메인 4의 결합; D2+D3+D4는 PA63 리간드의 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4의 결합; D1+D3+D4는 PA63 리간드의 도메인 1, 도메인 3 및 도메인 4의 결합; D4+D4+D1는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 1의 결합; D4+D4+D2는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 2의 결합; D4+D4+D3는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 3의 결합; D4+D4+D1+D2는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 1 및 도메인 2의 결합; D4+D4+D1+D3는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 1 및 도메인 3의 결합; D4+D4+D2+D3는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 2 및 도메인 3의 결합; D4+D4+D4는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 4의 결합; D4+D4+D4+D1는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 1의 결합; D4+D4+D4+D2는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 2의 결합; D4+D4+D4+D3는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 3의 결합; D1+D2+D3+D4는 PA63 리간드의 도메인 1, 도메인 2, 도메인 3 및 도메인 4의 결합; D4+D4+D4+D4는 PA63 리간드의 도메인 4, 도메인 4, 도메인 4 및 도메인 4의 결합;으로 각각 정의한다.

상기 PA63 리간드의 도메인 4를 포함하는 단편은 D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4; D1+D3+D4; D4+D4+D1; D4+D4+D2; D4+D4+D3; D4+D4+D1+D2; D4+D4+D1+D3; D4+D4+D2+D3; D4+D4+D4; D4+D4+D4+D1; D4+D4+D4+D2; D4+D4+D4+D3; D1+D2+D3+D4 및 D4+D4+D4+D4로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 PA63 리간드의 도메인 4를 포함하는 단편은 서열번호 2 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "PA63"이란, 탄저균 독소(anthrax toxin) 단백질 중 하나인 protective antigen(PA, 83kDa)의 절단된 63kDa의 부분을 의미하는 것이다. 탄저균 독소는 그람 양성균인 Bacillus anthracis에 의해 분비된다.

일반적으로 탄저균의 병원성은 독소 생성 능력과 협막 형성에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다. 이 중 탄저의 독소 생성 능력에 영향을 주는 단백질은 방어항원(protective antigen, PA), 부종요소(edema factor, EF) 및 치사요소(lethal factor, LF)이다. 이들 각각은 독성을 나타내지 못하나, 방어항원과 부종요소가 결합하여 부종독소(EdTx, edema toxin)를 형성하고, 방어항원과 치사요소가 결합하여 치사독소(LeTx, ethal toxin)를 형성한다.

PA는 대식세포와 같은 감염 세포주 표면의 수용체 단백질(Anthrax toxin receptor)에 결합한 후 단백질 분해효소(furin family protease)에 의해 PA20(20kDa)과 PA63(63kDa)으로 잘리는데, 이 중 PA63이 헵타머화되면서 LF 혹은 EF와 결합하여 이를 세포 내로 운반시키는 독소 단백질 운반체(Toxin delivery channel)의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

이들 복합체는 엔도시토시스 기전으로 세포 내로 들어가고 엔도좀의 pH가 낮아지면 PA63 헵타머에 구조적 변화가 생기며 엔도좀 멤브레인에 기공을 형성하고, 결과적으로 LF 혹은 EF는 세포질로 유리되어 독성 효과를 나타내게 된다(Jiang J. Atomic structure of anthrax protective antigen pore elucidates toxin translocation. Nature. 2015).

본 발명의 실시예에서는 D4를 코딩하는 핵산이 도입된 CAR와 D4+D4를 코딩하는 핵산이 도입된 CAR를 구축하고, 이를 T 세포에 도입한 CAR-T 세포의 췌장암 치료 효능을 확인하였다. PA63 리간드를 코딩하는 핵산이 도입된 CAR-T 세포와 비교하여, D4 또는 D4+D4를 코딩하는 핵산이 도입된 CAR-T 세포의 췌장암 치료 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

따라서, D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4; D1+D3+D4; D4+D4+D1; D4+D4+D2; D4+D4+D3; D4+D4+D1+D2; D4+D4+D1+D3; D4+D4+D2+D3; D4+D4+D4; D4+D4+D4+D1; D4+D4+D4+D2; D4+D4+D4+D3; D1+D2+D3+D4 또는 D4+D4+D4+D4를 코딩하는 핵산을 도입하여 CAR를 구축하는 경우에도 동일 내지 유사한 효과를 나타낼 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다 할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 ANTXR은 ARTXR1(anthrax toxin receptor 1) 또는 ARTXR2(anthrax toxin receptor 2)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "ANTXR1(anthrax toxin receptor 1)"란, 세포외 기질 단백질을 의미하는 것으로, 다른 명칭은 TEM8(Tumor endothelial marker 8)이다. 그의 구체적인 핵산서열은 NCBI에 공지되어 있다(NCBI Reference Sequence: NM_032208.2).

본 발명의 용어 "ANTXR2(anthrax toxin receptor 2)"란, 혈관신생에 관여하는 단밸질을 의미하는 것으로, 다른 명칭은 CMG2(capillary morphogenesis gene 2)이다. 그의 구체적인 핵산서열은 NCBI에 공지되어 있다(NCBI Reference Sequence: NM_058172.5).

또한, 본 발명에서 ANTXR1, ANTXR2와 PA63 리간드간의 친화도는 Kd 170 ~ 780 Pm으로, 기존에 개발된 CAR-T 세포 치료제인 ROR1, EGFR, Her2/neu에 사용되고 있는 항체의 친화도(Kd 값은 1nM)에 비하여 월등한 민감도를 보이고 있다(Karl A. (2010) Nature precedings 5221:1; Heather M. S. (2005) Curr Opin Microbiol. 8:106-112).

본 발명의 용어 "막횡단 도메인(transmembrane domain)"이란, 세포외 결합 부분 및 세포내 신호전달 도메인을 융합시키고 면역 작동 세포의 원형질 막에 CAR를 고정시키는 CAR의 일부이다. 막횡단 도메인은 천연, 합성, 반합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 막횡단 도메인은 링커(linker)를 통해 CAR의 세포외 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 링커는 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커일 수 있으며, 바람직하게는 글라이신(G)-세린(S) 이중체(doublet)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

CAR의 결합 도메인은 일반적으로 하나 이상의 "힌지 도메인(hinge domain)"이 후속한다. 본 발명의 용어 "힌지 도메인"이란, 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하도록 작동 세포 표면으로부터 떨어져 항원 결합 도메인의 위치결정에 중요한 역할을 담당하는 CAR의 일부이다. CAR는 일반적으로 세포외 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 하나 이상의 힌지 도메인을 포함한다. 힌지 도메인은 천연, 합성, 반-합성 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 힌지 도메인은 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역 또는 변화된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "변화된 힌지 영역"은 (a) 최대 30%의 아미노산 변화(예: 최대 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%의 아미노산 치환 또는 결실)을 갖는 천연 발생 힌지 영역, (b) 최대 30% 아미노산 변화(예: 최대 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%의 아미노산 치환 또는 결실)을 갖는 적어도 10개 아미노산(예: 적어도 12, 13, 14 또는 15개 아미노산) 길이의 천연 발생 힌지 영역의 일부, 또는 (c) 코어 힌지 영역(이는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15, 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 길이일 수 있다)을 포함하는 천연 발생 힌지 영역의 일부를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 천연 발생 면역글로불린 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인 잔기는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예: 하나 이상의 세린 잔기)로 치환될 수 있다. 변화된 면역글로불린 힌지 영역은 대안적으로 또는 추가적으로 또 다른 아미노산 잔기(예: 세린 잔기)로 치환된 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 프롤린 잔기를 가질 수 있다. 힌지 도메인은 CD8α, CD4, CD28 및 CD7 등의 유형 1 막단백질의 세포외 영역으로부터 유래하는 힌지 영역을 포함하고, 이는 이들 분자로부터의 야생형 힌지 영역일 수 있거나 변화될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 힌지 도메인을 포함하는 막횡단 도메인은 CD8α로부터 유래된 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)"이란, 작동 세포 기능, 예를 들면, CAR-결합된 표적 세포에 대한 세포독성 인자의 방출을 포함하는 활성화, 사이토카인 생성, 증식 및 세포독성 활성, 또는 CAR의 세포외 결합 도메인에 대한 항원 결합으로 유발된 기타 세포 반응을 유발하기 위해 면역 작동 세포의 내부로 표적 항원에 대한 효과적 CAR 결합의 메시지의 전달에 관여하는 CAR의 부분을 의미하는 것이다. 작동 기능은 세포의 특수한 기능을 지칭하며, 예를 들면, T 세포의 작동 기능은 세포용해 활성일 수 있거나, 사이토카인의 분비를 포함하는 활성을 지원할 수 있거나 활성일 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인은 작동 기능 신호를 전달하고 세포가 특수한 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 의미한다.

T 세포 수용체 단독으로 생성된 신호는 T 세포를 충분하게 활성화할 수 없다고 알려졌기에 공자극 신호가 추가로 요구되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포내 신호전달 도메인의 2개 상이한 부류에 의해 매개된다. 예를 들면, T 세포 수용체를 통한 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 1차 신호전달 도메인 및 2차 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 공자극 신호전달 도메인에 의해 T 세포 활성화가 매개된다. 따라서, 본 발명에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 "1차 신호전달 도메인(primary signaling domain)" 및 "공자극 신호전달 도메인(co-stimulatory signaling domain)"을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어 "1차 신호전달 도메인(primary signaling domain)"이란, T 세포 수용체 복합체의 1차 활성화를 자극 또는 억제 방식으로 조절하는 신호전달 도메인을 의미하는 것이다. 자극 방식으로 작용하는 1차 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티브 또는 ITAM으로 공지되어 있는 신호전달 모티브를 함유할 수 있다. 1차 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM은 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 1차 신호전달 도메인은 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CD3ζ인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "공자극 신호전달 도메인(co-stimulatory signaling domain)"이란, 공자극 분자의 세포내 신호전달 도메인을 의미한다. 공자극 분자는 항원 수용체 또는 항원에 결합시 T 림파구의 효율적 활성화 및 기능에 요구되는 2차 신호를 제공하는 Fc 수용체 이외의 세포 표면 분자이다. 본 발명에 있어서, 상기 공자극 신호전달 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 공자극 신호전달 도메인은 서열번호 11의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CD28 및 서열번호 12의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CD137인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 CAR 설계시 PA63 리간드 또는 그 단편 앞에 signal peptide를 코딩하는 핵산을 삽입하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 signal peptide로는 GM-CSF, CD8 alpha signal peptide 등이 사용되나, 대부분의 CAR 설계에 GM-CSF를 사용하고 있으며, 본 발명의 실시예에서는 GM-CSF를 signal peptide로 사용하였다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"란, 다른 핵산 분자를 전이시키거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 전이된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되는데, 예를 들면, 벡터 핵산 분자 내에 삽입된다. 벡터는 세포에서의 자율적 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 가능하게 하는데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 레트로바이러스벡터인 pMSCV 벡터인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 벡터를 포함하는 재조합 세포에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "재조합 세포"는 암의 치료 등에 사용하기 위해, 본 발명의 CAR를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포를 의미한다. 유전적으로 변형되었다는 것은 세포에서 전체 유전자 재료로 DNA 또는 RNA의 형태로 외부 유전자 재료를 부가하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 CAR를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 세포는 CAR-T 세포(Chimeric Antigne Receptor T Cell) 또는 CAR-NK 세포(Chimeric Antigne Receptor Natural Killer Cell)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte; CTL); 종양 침윤 림프구(Tumor infiltrating lymphocyte; TIL) 및 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 분리한 T 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

바람직하게는 인간 CD8+ T 세포일 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 NYESO-1 T 세포를 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 세포를 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 고형암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 고형암의 발전의 억제, 증상의 경감 또는 제거를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 췌장암 세포에 대한 CAR-T 세포의 항암 세포독성을 확인하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PA63의 세포독성 작용 기전에 따라 본 발명에 따른 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편은 췌장암뿐만 아니라, ANTXR을 발현하는 암 세포 또는 암 조직에 특이적으로 결합할 수 있으며, 본 발명에 따른 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편을 포함하는 CAR 함유 세포는 ANTXR을 발현하는 암에 대하여 세포독성 효과가 있음은 통상의 기술자에게 자명하다.

본 발명의 용어 "고형암"이란, 혈관이나 결합성 조직으로 이루어져 일정한 경도와 형태를 지니는 종양을 의미하는 것으로, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어, 췌장암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암, 난소암 등이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고형암은 ANTXR(anthrax toxin receptor)을 발현하는 췌장암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암 또는 난소암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 ANTXR은 ANTXR1 또는 ANTXR2를 포함한다.

본 발명의 용어 "췌장암"이란, 췌장에 생긴 암세포로 이루어진 종양을 의미하는 것이다. 일반적으로 췌장암의 90% 정도는 췌관세포에서 발생한 췌관 선관암(pancreatic ductal cancers)이 차지하고 있다. 췌장 선관암의 85% 이상이 췌장암 발생에서 활성화시킨 K-ras 유전자 점 돌연변이(point mutation)를 가지고 있다(Li et al. (2004) Lancet 363:1049-1057; Xiong (2004) Cancer Chem Pharm 54:S69-77). 췌장암의 조기 치료를 위해서는 췌장의 전암 병변과 진행과정, 암의 병기 또는 크기에 따른 예후를 이해하는 것이 필요한데, 췌장의 대표적인 전암 병변으로는 췌장의 상피내 종양형성(PanIN), 췌관내 유두상점액종양(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN), 점액낭성종양(mucinous cystic neoplasm, MCN) 등이 알려져 있다(Hruban RH, (2001) Am J Surg Pathol. 25: 579-586; Ottenhof NA, (2009) Arch Pathol Lab Med. 133: 375-381; Sipos B, (2009) Pancreatology 9: 45-54). 특히 IPMN는 최근에 여러 가지 영상 의학적 진단 해상도 발전과 건강검진의 증가로 발견되는 빈도가 증가하고 있다. 이는 저등급의 종양이 악성으로 서서히 진행할 수 있는 췌장암의 전구 병변이고, 이 병변과 떨어진 부위에서 췌장암이 동반될 빈도가 높아 많은 관심이 집중되고 있다.

본 발명의 고형암의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

이러한 약학적으로 허용가능한 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 고형암 예방 또는 치료용 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 고형암에 특이적인 유전자 확인

고형암에 특이적인 유전자를 확인하기 위하여, 고형암 중에서 췌장암과 관련된 조직을 이용하였다. 췌장암 stage1 3명, stage3 89명, stage4 12명의 총 104명의 췌장암 환자로부터 분리한 췌장암 조직을 준비하였다. 그 후, 암 조직, IPMN 조직, 그리고 정상 췌장조직에서의 유전자 변화를 마이크로 어레이(microarray)를 사용하여 분석하였고, 췌장암 조직에서 발현이 증가된 6종의 유전자를 선발하였다(표 1).

1차 선발된 6종의 유전자 중에서, 하기와 같은 3개의 조건을 모두 만족시키는 유전자를 추가로 선발하였다.

1) mRNA 발현양이 '정상 조직(normal) < IPMN 조직 < 췌장암(PDAC) 조직'인 유전자

2) 발현 단백질이 세포 표면에 존재하는 유전자

3) 정상 조직에서 발현을 거의 볼 수 없는 유전자

도 1은 1차 선발된 6종의 유전자의 정상조직에서의 단백질 발현도를 나타낸 것이다. A는 ANTXR1(Anthrax toxin receptor 1), B는 ANTXR2(Anthrax toxin receptor 2), C는 TMC5(Transmembrane channel-like 5), D는 CLDN18(Claudin 18), E는 MUC13(Mucin 13), F는 MMP14(Matrix metallopeptidase 14)의 발현양을 나타낸 것이다.

1차 선발된 6종의 유전자 모두 세포 표면에 발현되어 위의 조건 1) 및 2)를 만족하지만, 도 1에서 확인할 수 있듯이 ANTXR1과 ANTXR2를 제외한 4종의 유전자는 정상 조직에서 발현되므로, 위의 3개의 조건을 모두 만족시키는 유전자는 ANTXR1과 ANTXR2뿐이었다(도 1).

ANTXR1과 ANTXR2의 실제 발현을 추가로 확인하기 위하여, 혈액내 면역세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC), primary 췌장암 조직, 췌장암 세포주를 이용하여 RT-PCR(real-time RT-PCR)을 수행하였다. PBMC는 음성대조군, PANC-1은 양성대조군으로 사용되었다. 구체적으로, 전체 RNA는 Trizol/Chloroform을 이용하여 추출되었다. mRNA의 증폭 후, reverse transciptase를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 표 2의 프라이머를 넣고 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR)을 이용하여 ANTXR1 및 ANTXR2의 mRNA의 발현양을 확인하였다. iTaq universal SYBR Green supermix(Bio-rad)를 사용하여, StepONE plus Real Time PCR system(Applied Biosystems)으로 분석하였다. cDNA의 농도는 0.5μg/μl, 각 프라이머는 10pM을 사용하였다. Denaturation은 95℃에서 15분, Annealing/Extension 각 60℃에서 60초, 40 사이클을 수행하였다.

	정방향 (Forward)	역방향 (Reverse)
ANTXR1	TGCTGCACCACTGGAATGAAATC (서열번호 18)	CTCCTCCTGGCAGAACTTTCTGG (서열번호 19)
ANTXR2	CTTTCATTGTGTTTTCTTCTCAAGCAAC (서열번호 20)	GTTTTCAAGCCTCCTGCTTTCTGAAT (서열번호 21)

그 결과, primary 췌장암 조직에서는 ANTXR1, ANTXR2 mRNA 발현이 매우 증가된 것으로 확인되었다(도 2). 또한, 정상세포인 HUVEC세포, MDA-MB 231세포, 췌장암 세포주(AsPC1, Capan2, PANC1, Mia-PaCa2, SNU-213, SNU-324, SNU-2466, SNU-2469, SNU-2485, SNU-2543)를 분석한 결과, 췌장암 세포주에서는 ANTXR1, ANTXR2 mRNA 발현이 증가되어 있었으며, 특히 SNU-2466, SNU-2469에서는 ANTXR1 mRNA 발현이 유의적으로 증가되어 있었으며, AsPC1에서는 ANTXR2 mRNA 발현이 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였다(도 3).

또한, Flow cytometry를 이용하여 정상세포(HUVEC세포), MDA-MB-231세포, 췌장암 세포주(AsPC1, PANC1, SNU-213, SNU-2466)의 세포 표면에서의 ANTXR1, ANTXR2 단백질 발현도를 분석한 결과, ANTXR1, ANTXR2 단백질 발현이 증가되어 있음을 확인하였다(도 4).

또한, 정상세포인 HUVEC세포, MDA-MB 231세포, ANTXR1, ANTXR2 mRNA 발현이 매우 증가된 것으로 확인된 췌장암 세포주(AsPC1, Capan2, PANC1, Mia-PaCa2, SNU-213, SNU-324, SNU-2466, SNU-2469, SNU-2485, SNU-2543)에서 ANTXR1, ANTXR2의 ligand인 PA63에 형광을 나타내는 FITC가 conjugation 되어있는 시약을 처리한 뒤, Flow cytometry를 이용하여 세포 표면 단백질인 ANTXR1, ANTXR2의 발현양을 간접적으로 재확인 하였으며, 또한 PA63과 ANTXR1, ANTXR2의 결합을 확인하였다(도 5).

실시예 2: ANTXR 특이적 CAR 설계 및 제작

ANTXR1 또는 ANTXR2에 특이적인 CAR는 세포외 결합 도메인, CD8α로부터 유래된 막횡단 도메인과 hinge region, CD3ζ사슬의 1차 신호전달 도메인, CD28 및 CD137을 공자극 신호전달 도메인으로 포함하도록 설계되었다. 세포외 결합 도메인으로는 PA63 리간드의 수용체 결합에 필수적인 D4를 포함하도록 D4; D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4 또는 D1+D3+D4가 각각 도입된 CAR를 설계하고, 도 6에 나타낸 벡터의 PA63 자리에 도입하여 벡터를 제작하였다. 또한, 추가로 D4; D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4 또는 D1+D3+D4 앞에 시그널 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 핵산을 포함하도록 설계하였다.

상기 시그널 펩타이드는 짧은 아미노산 서열로, 합성된 단백질을 ER로 운반하는 중요한 역할을 담당한다. 단백질이 ER에 도착하면 signal peptide는 제거되며, 단백질은 운반체를 통해 골지(Golgi complex)로 운반된다. 이후 세포내 소기관이 아닌 세포 막에 발현되야 하는 단백질의 경우에는 목적지로 운반이 되어야 한다. 본 실시예에서는 합성된 단백질을 목적지로 운반을 하기 위한 시그널 펩타이드로 GM-CSF를 사용하였다.

도 6의 벡터에는 CAR의 발현 여부를 확인하기 위하여 copGFP를 코딩하는 핵산을 도입하였으나, CAR를 실제 체료제로서 사용하기 위해서는 생략할 수 있다.

표 3은 CAR 제조에 필요한 서열을 나타낸 것이다.

CAR 부위	본 발명의 CAR		아미노산 또는 핵산 서열	서열번호
세포외 결합 도메인	D4		FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	1
	D1+D4		STSAGPTVPDRDNDGIPDSLEVEGYTVDVKNKRTFLSPWISNIHEKKGLTKYKSSPEKWSTASDPYSDFEKVTGRIDKNVSPEARHPLVAAFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	2
	D2+D4		YPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHTSEVHGNAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTWAETMGLNTADTARLNANIRYVNTGTAPIYNVLPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQLSQILAPNNYYPSKNLAPIALNAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRLDTDQVYGNIATYNFENGRVRVDTGSNWSEVLPQIQETFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	3
	D3+D4		TARIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPNGNLQYQGKDITEFDFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKRFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	4
	D4+D4		FHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIGFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	5
	D1+D2+D4		STSAGPTVPDRDNDGIPDSLEVEGYTVDVKNKRTFLSPWISNIHEKKGLTKYKSSPEKWSTASDPYSDFEKVTGRIDKNVSPEARHPLVAAYPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHTSEVHGNAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTWAETMGLNTADTARLNANIRYVNTGTAPIYNVLPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQLSQILAPNNYYPSKNLAPIALNAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRLDTDQVYGNIATYNFENGRVRVDTGSNWSEVLPQIQETFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	6
	D2+D3+D4		YPIVHVDMENIILSKNEDQSTQNTDSQTRTISKNTSTSRTHTSEVHGNAEVHASFFDIGGSVSAGFSNSNSSTVAIDHSLSLAGERTWAETMGLNTADTARLNANIRYVNTGTAPIYNVLPTTSLVLGKNQTLATIKAKENQLSQILAPNNYYPSKNLAPIALNAQDDFSSTPITMNYNQFLELEKTKQLRLDTDQVYGNIATYNFENGRVRVDTGSNWSEVLPQIQETTARIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPNGNLQYQGKDITEFDFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKRFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	7
	D1+D3+D4		STSAGPTVPDRDNDGIPDSLEVEGYTVDVKNKRTFLSPWISNIHEKKGLTKYKSSPEKWSTASDPYSDFEKVTGRIDKNVSPEARHPLVAATARIIFNGKDLNLVERRIAAVNPSDPLETTKPDMTLKEALKIAFGFNEPNGNLQYQGKDITEFDFNFDQQTSQNIKNQLAELNATNIYTVLDKIKLNAKMNILIRDKRFHYDRNNIAVGADESVVKEAHREVINSSTEGLLLNIDKDIRKILSGYIVEIEDTEGLKEVINDRYDMLNISSLRQDGKTFIDFKKYNDKLPLYISNPNYKVNVYAVTKENTIINPSENGDTSTNGIKKILIFSKKGYEIG	8
막횡단 도메인	CD8 Hinge region 및 막횡단 도메인		TTCGTGCCTGTGTTCCTGCCTGCCAAGCCTACCACAACACCCGCTCCTAGACCTCCAACACCAGCTCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGAGGCCAGAAGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCTGGAACATGTGGCGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAAC	9
세포내 신호전달 도메인	1차 신호전달 도메인	CD3ζ	AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC	10
	공자극 신호전달 도메인	CD28	AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC	11
	공자극 신호전달 도메인	CD137	CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG	12
시그널 펩타이드	GM-CSF		ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT	13

PA63 리간드의 도메인 1 내지 도메인 4를 코딩하는 핵산은 하기 표 4에 나타내었다.

PA63 리간드 도메인	핵산 서열	서열번호
D1	AGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAGACCGTGACAATGATGGAATCCCTGATTCATTAGAGGTAGAAGGATATACGGTTGATGTCAAAAATAAAAGAACTTTTCTTTCACCATGGATTTCTAATATTCATGAAAAGAAAGGATTAACCAAATATAAATCATCTCCTGAAAAATGGAGCACGGCTTCTGATCCGTACAGTGATTTCGAAAAGGTTACAGGACGGATTGATAAGAATGTATCACCAGAGGCAAGACACCCCCTTGTG	14
D2	GCAGCTTATCCGATTGTACATGTAGATATGGAGAATATTATTCTCTCAAAAAATGAGGATCAATCCACACAGAATACTGATAGTCAAACGAGAACAATAAGTAAAAATACTTCTACAAGTAGGACACATACTAGTGAAGTACATGGAAATGCAGAAGTGCATGCGTCGTTCTTTGATATTGGTGGGAGTGTATCTGCAGGATTTAGTAATTCGAATTCAAGTACGGTCGCAATTGATCATTCACTATCTCTAGCAGGGGAAAGAACTTGGGCTGAAACAATGGGTTTAAATACCGCTGATACAGCAAGATTAAATGCCAATATTAGATATGTAAATACTGGGACGGCTCCAATCTACAACGTGTTACCAACGACTTCGTTAGTGTTAGGAAAAAATCAAACACTCGCGACAATTAAAGCTAAGGAAAACCAATTAAGTCAAATACTTGCACCTAATAATTATTATCCTTCTAAAAACTTGGCGCCAATCGCATTAAATGCACAAGACGATTTCAGTTCTACTCCAATTACAATGAATTACAATCAATTTCTTGAGTTAGAAAAAACGAAACAATTAAGATTAGATACGGATCAAGTATATGGGAATATAGCAACATACAATTTTGAAAATGGAAGAGTGAGGGTGGATACAGGCTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAATTCAAGAAACA	15
D3	ACTGCACGTATCATTTTTAATGGAAAAGATTTAAATCTGGTAGAAAGGCGGATAGCGGCGGTTAATCCTAGTGATCCATTAGAAACGACTAAACCGGATATGACATTAAAAGAAGCCCTTAAAATAGCATTTGGATTTAACGAACCGAATGGAAACTTACAATATCAAGGGAAAGACATAACCGAATTTGATTTTAATTTCGATCAACAAACATCTCAAAATATCAAGAATCAGTTAGCGGAATTAAACGTAACTAACATATATACTGTATTAGATAAAATCAAATTAAATGCAAAAATGAATATTTTAATAAGAGATAAACGT	16
D4	TTTCATTATGATAGAAATAACATAGCAGTTGGGGCTGATGAGTCAGTAGTTAAGGAGGCTCATAGAGAAGTAATTAATTCGTCAACAGAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGATATAAGAAAAATATTATCAGGTTATATTGTAGAAATTGAAGATACTGAAGGGCTTAAAGAAGTTATAAATGACAGATATGATATGTTGAATATTTCTAGTTTACGGCAAGATGGAAAAACATTTATAGATTTTAAAAAATATAATGATAAATTACCGTTATATATAAGTAATCCCAATTATAAGGTAAATGTATATGCTGTTACTAAAGAAAACACTATTATTAATCCTAGTGAGAATGGGGATACTAGTACCAACGGGATCAAGAAAATTTTAATCTTTTCTAAAAAAGGCTATGAGATAGGA	17

CAR의 시그널 펩타이드, 세포외 결합도메인(D4; D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4 또는 D1+D3+D4), 막횡단 도메인(CD8 transmembrane & hinge)과 세포내 신호전달 도메인(CD3, CD134, CD28)을 PCR을 이용하여 증폭하였으며, DNA ligase를 이용하여 TA clonning vector에 삽입하였다.

TA clonning vector를 ligation하여 fusion protein을 발현할 수 있도록 Viral vector(pMSCV, pCDH 521a)에 삽입하였다. CAR 도입용 렌티바이러스 vector를 이용하여 바이러스를 제작하였으며, packaging 세포인 293FT 세포(5X10⁶)에 약 90% 이상의 효율로 렌티바이러스 vector를 유도하였다. 렌티바이러스 vector 유도 4일차에 렌티바이러스가 제작되어 부유되어 있는 cell media를 회수하여, 이를 ultra centrifuge를 이용하여 20,000rpm에서 2시간 동안 농축하였으며, 농축된 렌티바이러스를 293FT 세포에 transduction 하였고, 이를 flow cytometer를 이용하여 농도를 계산해 본 결과 3.4 X 109 IU/ml라는 높은 수율로 CAR 유전자가 도입된 렌티바이러스를 획득할 수 있었다.

실시예 3: CAR-T 세포의 배양

실시예 2에서 제작된 D4; D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4 또는 D1+D3+D4 함유 CAR가 도입된 렌티바이러스를 100 MOI의 농도로 CTL(Cytotoxic T lymphocyte)로부터 분리한 T cell Clone에 각각 Transduction시켜 각각의 CAR-T 세포를 제작하였다.

Flow cytometry를 이용하여 약 47.9%의 효율로 발현을 유도한 것을 확인하였으며, Aria sorter를 이용하여 CAR 발현이 유도된 세포만을 선별하였다. 이를 체외에서 증폭시키는 Rapid expansion protocol(REP)을 시행하여, CAR 세포의 수를 증폭시켰으며, REP 10일차에는 약 98%의 분포로 순수한 CAR-T의 증식이 이루어진 것을 확인하였다(도 7).

본 실시예에서 사용된 CTL은 NYESO-1 CTL(MD anderson cancer center(USA))이다. 도 8은 기존 NYESO-1 항원을 인지하여 활성을 나타낼 수 있는 NYESO-1 CTL 및 이에 CAR를 도입하여 NYESO-1과 ANTXR1 또는 ANTXR2를 동시에 타겟 가능한 CAR-T 세포를 나타낸 것을 나타낸 것으로, NYESO-1 CTL이 타겟팅하는 도면 왼쪽의 cancer cell의 종류로는 악성 흑색종(melanoma)과 활액세포육종(synovial cell sarcoma) 등이 있다. NYESO-1 CTL은 종양 진행을 억제하거나 종양 감소를 유도할 수 있다.

이 외에도 Tumor infilteration lymphocyte(TIL), Peripheral blood mononuclear cell(PBMC)에서 분리한 T 세포를 사용하여 CAR를 유도한 뒤 CAR-T 세포를 제작할 수 있다.

실시예 4: CAR-T 세포의 항암 세포독성 확인

실시예 3에서 제작된 D4 함유 CAR 도입 T 세포와 D4+D4 함유 CAR 도입 T 세포의 항암 세포독성을 확인하기 위하여, 이들을 각각 췌장암 세포주 및 흑색종 세포주에 처리하였다.

췌장암 세포주와 흑색종 세포주를 각각 96 well plate(round bottom)에 1x10⁵개의 세포로 분주한 뒤, wild type(CAR가 도입되지 않은 T cell), empty vector control(D4 또는 D4+D4를 포함하지 않는 벡터를 발현시킨 T cell), D4 함유 CAR-T와 D4+D4 함유 CAR-T를 각각 1x10⁵개의 세포로 6시간 배양하였으며, cytokine의 release를 억제하기 위한 Golgi stop을 처리하였다. 6시간 후 세포내를 염색하기 위하여 fixation 및 permeablization 뒤, CD107a와 IFN gamma 항체를 이용하여 세포를 염색하였다. 그 후 Flow cytometry를 이용하여, granule release를 간접적으로 확인할 수 있는 CD107a 및 CAR-T 세포 활성을 확인할 수 있는 IFN gamma를 확인하였다. CAR가 도입되지 않은 NYESO-1 CTL은 control로 사용하였다.

실시예 4-1: 흑색종 세포주에 대한 항암 세포독성

NYESO-1 CTL은 흑색종 세포주(526-mel)를 target으로 하므로, 본 발명의 CAR 도입 유무에 관계 없이 즉, 흑색종 세포주에 대한 항암 세포독성 및 활성을 나타냈다(도 9).

실시예 4-2: 췌장암 세포주에 대한 항암 세포독성

췌장암 세포주(AsPC1, PANC-1, Mia-PaCa2)에 대한 항암 세포독성을 확인한 결과, wild type과 empty vector control의 T 세포의 경우에는 항암 세포독성 및 활성을 나타내지 않았지만, D4 함유 CAR 도입 T 세포와 D4+D4 함유 CAR 도입 T 세포의 경우에는 항암 세포독성 및 활성을 나타냈다(도 9).

또한, 실시예 2에서 제작된 D4; D1+D4; D2+D4; D3+D4; 또는 D1+D2+D3+D4 함유 CAR가 도입된 렌티바이러스를 100 MOI의 농도로 NYESO-1 T cell clone에 각각 transduction시켜 각각의 CAR-T 세포를 제작하였다.

췌장암 세포주인 PANC-1을 1.5mL tube에 1x10⁶개의 세포를 원심분리하여 모아준 뒤, 50μL의 FBS로 풀어주었으며, Cr⁵¹ 50μL를 섞어 37℃ 인큐베이터에서 1시간 염색하였다.

그 후 Cr⁵¹염색된 PANC-1 세포주를 각각 96 well plate(round bottom)에 1x10⁵개의 세포로 분주한 뒤, Vector control(D4 또는 각 도메인을 포함하지 않는 벡터를 발현시킨 T cell), D4 함유 CAR-T와 D1+D4, D2+D4, D3+D4, D1+D2+D3+D4 함유 CAR-T를 각각 Effector(CAR-T):Target(PANC-1) ratio = 5(5x10⁵):1, 10(1x10⁶):1, 20(2x10⁶):1, 40(4x10⁶):1개의 세포로 4시간 배양하였으며, 이후 각 well의 media를 수거하여 Cr⁵¹의 release를 γ-counter를 이용하여 확인하였다. 그 결과 D1+D4 함유 CAR-T를 제외한 모든 CAR-T의 세포독성이 뛰어난 것을 확인하였으며, 그 중 D4 단독으로 함유된 CAR-T의 세포독성 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 10).

실시예 5: PBMC에서 분리한 T 세포를 이용하여 제작한 CAR-T 세포의 췌장암 및 유방암에 대한 항암 세포독성 확인

실시예 2에서 제작된 D4 함유 CAR가 도입된 렌티바이러스를 3명의 건강한 공여자로부터 분리한 PBMC에 각각 transduction시켜 각각의 CAR-T 세포를 제작하였다. D4 함유 CAR 도입 T 세포의 항암 세포독성을 확인하기 위하여 이들을 각각 흑색종, 췌장암 및 유방암 세포주에 처리하였다.

흑색종, 췌장암 및 유방암 세포주 1x10⁵개를 각각 96 well plate(round bottom)에 분주한 뒤, NT(non transduced) 또는 CAR(D4 함유 CAR-T)를 각각 1x10⁵개의 세포와 함께 24시간 배양하였으며, 이 때 cytokine의 release를 억제하기 위한 Golgi stop을 처리하였다. 24시간 후 세포내 염색을 위하여 fixation 및 permeabilization한 뒤, IFN gamma 항체를 이용하여 세포를 염색하였다. 그 후 Flow cytometry를 이용하여 CAR-T 세포 활성을 확인할 수 있는 IFN gamma를 분석하였다. ANTXR1과 ANTXR2를 발현하지 않는 흑색종(526-mel) 및 유방암 세포주(SK-BR3)는 control로 사용하였다.

ANTXR1과 ANTXR2를 발현하지 않는 흑색종(526-mel) 및 유방암 세포주(SK-BR3)는 표적하지 않으므로, 본 실시예에 따른 CAR 도입 유무에 관계없이 526-mel과 SK-BR3 세포주에 대한 항암활성은 나타내지 않았다(도 11).

반면, ANTXR1 또는 ANTXR2를 발현하는 것으로 보고된 췌장암 세포주(PANC-1, Mia-PaCa2) 및 유방암 세포주(MDA-231, ZR-571)에 대한 항암 세포독성을 확인한 결과, NT(non transduced) T 세포의 경우에는 항암 세포독성 및 활성을 나타내지 않았지만, D4 함유 CAR 도입 T 세포의 경우에는 췌장암 및 유방암 세포주에 대한 항암 세포독성 및 활성을 나타냈다(도 11). 따라서, PA63 리간드를 포함하는 CAR-T 세포의 효과는 ANTXR1 또는 ANTXR2를 발현하는 암세포에서 독성이 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 ANTXR1과 ANTXR2를 발현하는 모든 암종에서 항암효과가 있을 것으로 기대한다.

실시예 6: PBMC에서 분리한 T 세포를 이용하여 제작한 CAR-T 세포의 췌장암에 대한 세포독성 확인

췌장암 세포주인 PANC-1에 형광을 나타낼 수 있도록 RFP 유전자를 도입하여 제작한 세포주(Red Fluorescence Protein(RFP)을 발현하는 PANC-1 세포주; PANC-1_RFP)를 24 well plate에 1x10⁴개 세포 씩 분주한 뒤, 건강한 공여자의 PBMC로 제작된 NT(non transduced) T 세포 또는 CAR(D4 함유 CAR-T)를 각각 Effector(CAR-T):Target(PANC-1) ratio = 5(5x10⁴):1, 10(1x10⁵):1, 20(2x10⁵):1, 40(4x10⁵):1개의 세포로 48시간 공배양하였다. 24 well plate에 남아있는 췌장암 세포주(PANC-1_RFP)를 수거하여 Flow cytometry를 이용하여 RFP positive cell counting하였다.

그 결과, 약 50%(5:1)에서 90%(40:1)까지 췌장암 세포주(PANC-1_RFP)에 대한 세포독성을 확인할 수 있었다(도 12).

실시예 7: CAR-T 세포를 이용한 동물 모델

면역결핍 마우스(Balb/c Nude, female, 5주령)에 췌장암 세포주(Mia-PaCa2)를 1x10⁷cell/100μL로 subcutaneous injection한 25일 뒤, PBS와 건강한 공여자의 PBMC로 제작된 NT(non transduced), GFP only(empty vector), CAR(D4 함유 CAR-T)를 1x10⁷cell/300uL의 농도로 intravenous injection하였다. 세포 주입 약 4주 후, D4 함유 CAR-T의 tumor는 control(PBS, NT, GFP only) 대비 약 80%의 부피가 감소하였다. 이를 통해 ANTXR1 또는 ANTXR2를 발현하는 고형암종을 이용한 동물 모델에서도 CAR T 효능이 우수함을 확인할 수 있었다(도 13).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> MJCELL BIO Co., Ltd. <120> Human anti-ANTXR chimeric antigen receptors and uses thereof <130> P19-B321 <150> KR 2018-0156246 <151> 2018-12-06 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4 <400> 1 Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val 1 5 10 15 Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile 35 40 45 Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg 50 55 60 Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn 85 90 95 Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile 100 105 110 Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys 115 120 125 Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly 130 135 140 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1+D4 <400> 2 Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile 1 5 10 15 Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys 20 25 30 Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly 35 40 45 Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp 50 55 60 Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val 65 70 75 80 Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Phe His Tyr Asp Arg 85 90 95 Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His 100 105 110 Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp 115 120 125 Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp 130 135 140 Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn 145 150 155 160 Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys 165 170 175 Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val 180 185 190 Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu 195 200 205 Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser 210 215 220 Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly 225 230 <210> 3 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D2+D4 <400> 3 Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn 1 5 10 15 Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser 20 25 30 Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn 35 40 45 Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala 50 55 60 Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu 65 70 75 80 Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly 100 105 110 Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly 115 120 125 Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser 130 135 140 Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met 165 170 175 Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu 180 185 190 Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe Glu Asn 195 200 205 Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val Leu Pro 210 215 220 Gln Ile Gln Glu Thr Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly 225 230 235 240 Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser 245 250 255 Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile 260 265 270 Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu 275 280 285 Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln 290 295 300 Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro 305 310 315 320 Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr 325 330 335 Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr 340 345 350 Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile 355 360 365 Gly <210> 4 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3+D4 <400> 4 Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg 1 5 10 15 Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro 20 25 30 Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu 35 40 45 Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp 50 55 60 Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala 65 70 75 80 Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu 85 90 95 Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp 100 105 110 Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala 115 120 125 His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile 130 135 140 Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu 145 150 155 160 Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu 165 170 175 Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys 180 185 190 Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys 195 200 205 Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser 210 215 220 Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe 225 230 235 240 Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly 245 <210> 5 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D4+D4 <400> 5 Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val 1 5 10 15 Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile 35 40 45 Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg 50 55 60 Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn 85 90 95 Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile 100 105 110 Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys 115 120 125 Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly Phe His Tyr Asp 130 135 140 Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala 145 150 155 160 His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile 165 170 175 Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu 180 185 190 Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu 195 200 205 Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys 210 215 220 Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys 225 230 235 240 Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser 245 250 255 Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe 260 265 270 Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly 275 280 <210> 6 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1+D2+D4 <400> 6 Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile 1 5 10 15 Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys 20 25 30 Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly 35 40 45 Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp 50 55 60 Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val 65 70 75 80 Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val His 85 90 95 Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr 100 105 110 Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr 115 120 125 Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala 130 135 140 Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser 145 150 155 160 Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu 165 170 175 Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg 180 185 190 Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr 195 200 205 Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu 210 215 220 Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro 225 230 235 240 Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala 245 250 255 Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe 260 265 270 Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu Arg Leu Asp Thr Asp Gln 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Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu 225 230 235 240 Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu 245 250 255 Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala 260 265 270 Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asp 275 280 285 Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile 290 295 300 Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr Val Leu 305 310 315 320 Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg Asp Lys 325 330 335 Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser 340 345 350 Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly 355 360 365 Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr 370 375 380 Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp 385 390 395 400 Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly Lys Thr 405 410 415 Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser 420 425 430 Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu Asn Thr 435 440 445 Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys 450 455 460 Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly 465 470 475 <210> 8 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1+D3+D4 <400> 8 Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile 1 5 10 15 Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys 20 25 30 Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly 35 40 45 Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp 50 55 60 Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val 65 70 75 80 Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val Ala Ala Thr Ala Arg Ile Ile 85 90 95 Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val 100 105 110 Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys 115 120 125 Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu 130 135 140 Gln Tyr Gln Gly Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln 145 150 155 160 Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr 165 170 175 Asn Ile Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn 180 185 190 Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala 195 200 205 Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile 210 215 220 Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg 225 230 235 240 Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu 245 250 255 Lys Glu Val Ile Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu 260 265 270 Arg Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys 275 280 285 Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala 290 295 300 Val Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr 305 310 315 320 Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr 325 330 335 Glu Ile Gly <210> 9 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain <400> 9 ttcgtgcctg tgttcctgcc tgccaagcct accacaacac ccgctcctag acctccaaca 60 ccagctccaa caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc cagaagcttg tagacctgct 120 gctggcggag ccgtgcatac aagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 180 cctctggctg gaacatgtgg cgttctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtactgcaac 240 caccggaac 249 <210> 10 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primary signaling domain <400> 10 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 11 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> co-stimulatory signaling domain <400> 11 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 12 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> co-stimulatory signaling domain <400> 12 cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60 atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120 gaagaaggag gatgtgaact g 141 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 13 atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc t 51 <210> 14 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1 <400> 14 agtacaagtg ctggacctac ggttccagac cgtgacaatg atggaatccc tgattcatta 60 gaggtagaag gatatacggt tgatgtcaaa aataaaagaa cttttctttc accatggatt 120 tctaatattc atgaaaagaa aggattaacc aaatataaat catctcctga aaaatggagc 180 acggcttctg atccgtacag tgatttcgaa aaggttacag gacggattga taagaatgta 240 tcaccagagg caagacaccc ccttgtg 267 <210> 15 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2 <400> 15 gcagcttatc cgattgtaca tgtagatatg gagaatatta ttctctcaaa aaatgaggat 60 caatccacac agaatactga tagtcaaacg agaacaataa gtaaaaatac ttctacaagt 120 aggacacata ctagtgaagt acatggaaat gcagaagtgc atgcgtcgtt ctttgatatt 180 ggtgggagtg tatctgcagg atttagtaat tcgaattcaa gtacggtcgc aattgatcat 240 tcactatctc tagcagggga aagaacttgg gctgaaacaa tgggtttaaa taccgctgat 300 acagcaagat taaatgccaa tattagatat gtaaatactg ggacggctcc aatctacaac 360 gtgttaccaa cgacttcgtt agtgttagga aaaaatcaaa cactcgcgac aattaaagct 420 aaggaaaacc aattaagtca aatacttgca cctaataatt attatccttc taaaaacttg 480 gcgccaatcg cattaaatgc acaagacgat ttcagttcta ctccaattac aatgaattac 540 aatcaatttc ttgagttaga aaaaacgaaa caattaagat tagatacgga tcaagtatat 600 gggaatatag caacatacaa ttttgaaaat ggaagagtga gggtggatac aggctcgaac 660 tggagtgaag tgttaccgca aattcaagaa aca 693 <210> 16 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D3 <400> 16 actgcacgta tcatttttaa tggaaaagat ttaaatctgg tagaaaggcg gatagcggcg 60 gttaatccta gtgatccatt agaaacgact aaaccggata tgacattaaa agaagccctt 120 aaaatagcat ttggatttaa cgaaccgaat ggaaacttac aatatcaagg gaaagacata 180 accgaatttg attttaattt cgatcaacaa acatctcaaa atatcaagaa tcagttagcg 240 gaattaaacg taactaacat atatactgta ttagataaaa tcaaattaaa tgcaaaaatg 300 aatattttaa taagagataa acgt 324 <210> 17 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D4 <400> 17 tttcattatg atagaaataa catagcagtt ggggctgatg agtcagtagt taaggaggct 60 catagagaag taattaattc gtcaacagag ggattattgt taaatattga taaggatata 120 agaaaaatat tatcaggtta tattgtagaa attgaagata ctgaagggct taaagaagtt 180 ataaatgaca gatatgatat gttgaatatt tctagtttac ggcaagatgg aaaaacattt 240 atagatttta aaaaatataa tgataaatta ccgttatata taagtaatcc caattataag 300 gtaaatgtat atgctgttac taaagaaaac actattatta atcctagtga gaatggggat 360 actagtacca acgggatcaa gaaaatttta atcttttcta aaaaaggcta tgagatagga 420 420 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tgctgcacca ctggaatgaa atc 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctcctcctgg cagaactttc tgg 23 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ctttcattgt gttttcttct caagcaac 28 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gttttcaagc ctcctgcttt ctgaat 26

Claims

세포외 결합 도메인(extracellular binding domain), 막횡단 도메인(transmembrane domain) 및 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 코딩하는 핵산으로, 상기 세포외 결합 도메인은 ANTXR(anthrax toxin receptor)을 인지하는 PA63 리간드의 도메인 4 또는 도메인 4를 포함하는 단편인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
제1항에 있어서, 상기 PA63 리간드의 도메인 4 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항에 있어서, 상기 PA63 리간드의 도메인 4를 포함하는 단편은 D1+D4; D2+D4; D3+D4; D4+D4; D1+D2+D4; D2+D3+D4; D1+D3+D4; D4+D4+D1; D4+D4+D2; D4+D4+D3; D4+D4+D1+D2; D4+D4+D1+D3; D4+D4+D2+D3; D4+D4+D4; D4+D4+D4+D1; D4+D4+D4+D2; D4+D4+D4+D3; D1+D2+D3+D4 및 D4+D4+D4+D4로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제3항에 있어서, 상기 PA63 리간드의 도메인 4를 포함하는 단편은 서열번호 2 내지 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항에 있어서, 상기 ANTXR은 ARTXR1(anthrax toxin receptor 1) 또는 ARTXR2(anthrax toxin receptor 2)인 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인(primary signaling domain) 및 공자극 신호전달 도메인(co-stimulatory signaling domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
제7항에 있어서, 상기 1차 신호전달 도메인은 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제7항에 있어서, 상기 공자극 신호전달 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
제10항에 있어서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제10항의 벡터를 포함하는 재조합 세포.
제12항에 있어서, 상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제13항에 있어서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte; CTL); 종양 침윤 림프구(Tumor infiltrating lymphocyte; TIL) 및 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 분리한 T 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
제12항의 재조합 세포를 포함하는, ANTXR(anthrax toxin receptor)을 발현하는 고형암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 고형암은 췌장암, 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.