KR20200055722A - 약물 내성 신경아교종의 치료 - Google Patents

약물 내성 신경아교종의 치료 Download PDF

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르힐 에이. 타우너
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오클라호마 메디컬 리써치 화운데이션
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Abstract

본 개시내용은 테모졸로마이드 약물 내성 신경아교종의 치료에 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)의 사용을 개시한다. 2,4-ds-PBN은 신경아교종 발생, 재발, 확산, 성장, 전이, 및 혈관형성을 감소시키고, 테모졸로마이드 저항의 전개를 억제하기 위해, 테모졸로마이드를 포함한 다른 화학- 및 방사선요법 및 수술과 조합되어 사용될 수 있다.

Description

약물 내성 신경아교종의 치료
본원은 하기에 대한 우선권의 이점을 주장한다: 미국가출원 일련 번호62/561,002로 2017년 9월 20일 출원되고, 그 전체 내용은 이로써 참고로 편입된다.
1. 분야
본 개시내용은 일반적으로 종양학 및 화학요법의 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 약물 내성 신경아교종을 치료하기 위한 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
신경아교종은 뇌의 정상 “신경교" 세포 및/또는 그것의 전구체 세포로부터 생기는 다양한 뇌종양의 그룹이다. 신경아교종에 대한 생존의 가장 중요한 결정인자는 신경아교종의 “등급"이다. 생존의 이차 결정인자는 진단시 연령, 수행 상태, 및 수술의 범위이다. 저-등급 신경아교종 환자는 일반적으로 긴 생존 시간을 갖는 장기 천연 이력을 가지는 반면, 고등급 신경아교종 환자는 성공적으로 치료하기가 훨씬 더 어렵고 더 짧은 생존 시간을 갖는다. 모든 신경아교종은 신경아교종의 위치 및 크기에 주로 관련된 특이적 징후 및 증상을 갖는다.
측두엽 신경아교종은, 예를 들어, 발작, 언어 장애 및/또는 기억 상실을 유발할 수 있다. 전두엽 신경아교종은 발작, 행동 변화, 신체 반대편의 팔 또는 다리의 약화 및/또는 언어 장애를 유발할 수 있다. 후두 신경아교종은 시력 손실을 유발할 수 있다. 두정 신경아교종은 공간적 방향의 상실, 신체 반대편의 줄어든 감각, 및/또는 일단 친숙한 물체 또는 사람을 인식하는 것에 대한 무능을 유발할 수 있다.
별아교세포종은 별아교세포로 불리는 뇌 세포 또는 그것의 전구체으로부터 생기는 신경아교종 종양이다. 별아교세포는 뉴런 기능을 지지하는 중추신경계에서의 세포이다. 별아교세포종은 별아교세포종, 역형성 별아교세포종, 또는 다형상 교모세포종으로의 증가하는 악성종양을 나타내는 조직학적 특징에 의해 등급이 매길 수 있다. 역형성 별아교세포종 및 다형상 교모세포종은 고-등급 신경아교종으로 간주되는 반면 별아교세포종은 저-등급 신경아교종인 것으로 간주된다. 고-등급 종양은 빠르게 성장하고 그리고 뇌를 통해 쉽게 침투하고 퍼질 수 있다. 저-등급 별아교세포종은 또한 뇌에 침투할 수 있지만 일반적으로 보다 국소화되고 장기간에 걸쳐 느리게 성장한다. 고-등급 종양은 훨씬 더 공격적이고 매우 강렬한 요법을 필요로 한다. 소아에서 다수의 성상세포 종양은 저-등급인 반면에 성인에서는 대부분 고-등급이다. 별아교세포종은 뇌 및 척수에서 어디든지 일어날 수 있으나, 그러나 다수는 대뇌반구에 위치한다.
희소돌기아교세포종은 또한 신경아교종이다. 그것은 희소돌기교세포 및/또는 그것의 세포 전구체로부터 생긴다. 정상 희소돌기교세포는 뇌 및 척수에서 신경 축색돌기를 덮고 신경이 전기 자극을 보다 효율적으로 전도하도록 하는 지방 물질인 수초를 제공한다. 희소돌기아교세포종은 저등급 희소돌기아교세포종 (덜 공격적임) 및 역형성 희소돌기아교세포종 (보다 공격적임)으로 분류된다. 순수한 희소돌기아교세포종보다 더 일반적인 것은 별아교세포종 및 희소돌기아교세포종의 혼합물 ("희소돌기별아교세포종")인 저등급 및 역형성 종양이다.
역형성 희소돌기아교세포종 및 혼합된 희소돌기별아교세포종은 별아교세포종보다 세포독성 화학요법에 대해 더 민감하다. PCV (프로카바진 (마툴란), CCNU (로무스틴), 빈크리스틴) 화학요법에 대한 반응의 높은 비율은 이 레지멘의 사용을, 이들 종양에 대한 관리기준이 아닌 경우에, 적어도 매우 일반적인 치료로 만들었다. 저등급 희소돌기아교세포종은 또한 화학요법에 민감하고, PCV는 저등급 종양이 성정하기 시작하는 경우 수술/방사선 요법 이전임에도 불구하고 사용될 수 있다.
잠재적 항-신경아교종 약물 로서 페닐-tert-부틸-니트론 (PBN)의 효율은 하기 랫트의 전-처리에서 나타났다: C6 신경아교종 이식 모델 (Doblas et al., 2008). 치료되지 않은 랫트로부터의 MRI 결과는 일부 연관된 혈관신생을 갖는, C6 신경아교종의 확산성 침입을 나타냈다. 전처리로 PBN 투여는 성장률에서의 감소 및 종양 퇴화뿐만 아니라 혈관신생 방지를 분명히 유도하는 것이 밝혀졌다. 그러나, PBN의 후처리는 하기를 가졌다: 전-처리와 비교하여 (>80%의 종양이 성장이 감소되었음) 종양 퇴행에 감소된 효과 (~50%의 종양이 종양 성장이 감소되었음). MRI 발견은 조직학 및 혈관신생 마커 면역염색 평가로부터의 것들에 필적하였다.
보다 최근 연구에서, 본 발명자는 PBN의 구조 유사체인, 2,4-ds-PBN이, 종양 부피들을 감소시켰고 종양 성장률을 지연시켰다는 것을 밝혀냈다. 2,4-ds-PBN 후-처리는 또한 생존율 증가에서 상당히 효과적이다. 이 결과는 PBN의 설폰화된 유도체가 혈액-뇌-장벽 (BBB)을 쉽게 가로 지르는 것으로 알려지지 않았기 때문에 예기치 못한 놀라운 것이었다. 모 니트론인, PBN은 BBB를 쉽게 침투하는 것으로 이전에 밝혀졌다 (Wang & Shuaib, 2007). 2,4-디설포닐 PBN (2,4-ds-PBN)은 모 화합물 PBN에 구조적으로 관련되지만, 이것을 훨씬 더 수용성으로 만드는 2개의 설포닐기를 함유한다. 증가된 수용성의 결과로 2,4-디설포닐 PBN은 PBN에 비해 초기에 BBB를 쉽게 통과하지 못하는 것으로 생각되었다 (Wang & Shuaib, 2007). 본 발명자는 그러나 2,4-디설포닐 PBN은 BBB를 쉽게 통과할 수 있음을 실증했다 (Coutinho de Souza et al., 2015). 이상적으로, 항-신경아교종 요법로서 사용될 약물은 다수의 종양 세포에 도달하기 위해 BBB의 내피성 접합부를 통과해야 하지만 (Cao et al., 2005), 악성 신경아교종은 가용성 인자를 분비함으로써 융합막을 활동적으로 분해하는 능력을 획득하여, 결국 침입된 뇌 조직 내에서 BBB 파괴를 초래하는 것이 가능하다 (Schneider et al., 2004). 구체적으로, 2,4-디설포닐 PBN은 신경아교종 조직에 대한 단일요법으로 상당한 효능을 나타냈다.
따라서, 본 개시내용에 따르면, 대상체에서 테모졸로마이드-저항성 신경아교종을 치료하는 방법으로서 상기 신경아교종의 혈관형성, 성장 또는 확산을 억제하는데 효과적인 용량의 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 투여는 장관, 정맥내, 또는 동맥내와 같은 혈액 뇌 장벽을 가로 질러 2,4-ds-PBN의 후속적인 통과를 요하는 경로를 통해 될 수 있다.
상기 대상체는 재발성 또는 전이성 신경아교종을 가질 수 있고, 또는 이전에 하나 이상의 항-신경아교종 요법에 실패했을 수 있다. 2,4-ds-PBN의 효과적인 용량은 일당 약 5 내지 약 150 mg/체중(kg)일 수 있다. 장관 투여는 음식 성분의 식이 보충을 통해 이루어질 수 있거나, 장관 투여는 알약 또는 액체의 형태일 수 있다. 상기 대상체는 인간일 수 있다.
상기 방법은 이차 항-신경아교종 요법, 예컨대 방사선, 수술, 또는 화학요법, 예컨대 테모졸로마이드, 로무스틴, 빈크리스틴, 마툴란, PCV, BCNU, CCNU 및/또는 DFMO를 추가로 포함할 수 있다. 이차 항-신경아교종 제제는 테모졸로마이드일 수 있고, 테모졸로마이드의 효과적인 용량은 테모졸로마이드의 표준 단일요법 용량보다 낮을 수 있다.
2,4-ds-PBN의 유효량은 투여되는 다이어트의 약 0.005 w/w % 내지 약 0.1 w/w% 일 수 있다. 신경아교종은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 또는 다형상 교모세포종, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 TGF-β1-, MGMT- 및/또는 APGN-발현 형태일 수 있다.
상기 방법은 2,4-ds-PBN으로 치료 전후 리포사카라이드 결합 단백질의 발현을 측정함으로써 치료적 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 LBP의 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 처리되지 않은 대조군과 비교하여 감소된 LBP 수준은 개선된 예후를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 대상체에서 신경아교종 테모졸로마이드 저항의 발달을 억제하는 방법으로서 (a) 신경아교종을 갖는 대상체를 확인하는 단계 및 (b) 상기 대상체에게 상기 신경아교종에서 테모졸로마이드 저항의 발달을 억제하는데 효과적인 용량의 (i) 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN), 및 (ii) 테모졸로마이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 투여는 장관, 정맥내, 또는 동맥내와 같은 혈액 뇌 장벽을 가로 질러 2,4-ds-PBN의 후속적인 통과를 요하는 경로를 통해 될 수 있다.
상기 대상체는 재발성 또는 전이성 신경아교종을 가질 수 있고, 또는 이전에 하나 이상의 항-신경아교종 요법에 실패했을 수 있다. 2,4-ds-PBN의 효과적인 용량은 일당 약 5 내지 약 150 mg/체중(kg)일 수 있다. 장관 투여는 음식 성분의 식이 보충을 통해 이루어질 수 있거나, 장관 투여는 알약 또는 액체의 형태일 수 있다. 상기 대상체는 인간일 수 있다.
상기 방법은 이차 항-신경아교종 요법, 예컨대 방사선, 수술, 또는 화학요법, 예컨대 테모졸로마이드, 로무스틴, 빈크리스틴, 마툴란, PCV, BCNU, CCNU 및/또는 DFMO를 추가로 포함할 수 있다. 이차 항-신경아교종 제제는 테모졸로마이드일 수 있고, 테모졸로마이드의 효과적인 용량은 테모졸로마이드의 표준 단일요법 용량보다 낮을 수 있다.
2,4-ds-PBN의 유효량은 투여되는 다이어트의 약 0.005 w/w % 내지 약 0.1 w/w %일 수 있다. 신경아교종은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 또는 다형상 교모세포종, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 TGF-β1-, MGMT- 및/또는 APGN-발현 형태일 수 있다. 상기 방법은 LBP의 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 처리되지 않은 대조군과 비교하여 감소된 LBP 수준은 개선된 예후를 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 신경아교종 재발을 억제하는 방법으로서 (a) 신경아교종을 갖는 대상체를 확인하는 단계 및 (b) 상기 대상체에게 상기 신경아교종의 재발을 억제하는데 효과적인 용량의 (i) 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN), 및 (ii) 테모졸로마이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 투여는 장관, 정맥내, 또는 동맥내와 같은 혈액 뇌 장벽을 가로 질러 2,4-ds-PBN의 후속적인 통과를 요하는 경로를 통해 될 수 있다.
상기 대상체는 재발성 또는 전이성 신경아교종을 가질 수 있고, 또는 이전에 하나 이상의 항-신경아교종 요법에 실패했을 수 있다. 2,4-ds-PBN의 효과적인 용량은 일당 약 5 내지 약 150 mg/체중(kg)일 수 있다. 장관 투여는 음식 성분의 식이 보충을 통해 이루어질 수 있거나, 장관 투여는 알약 또는 액체의 형태일 수 있다. 상기 대상체는 인간일 수 있다.
상기 방법은 이차 항-신경아교종 요법, 예컨대 방사선, 수술, 또는 화학요법, 예컨대 테모졸로마이드, 로무스틴, 빈크리스틴, 마툴란, PCV, BCNU, CCNU 및/또는 DFMO를 추가로 포함할 수 있다. 이차 항-신경아교종 제제는 테모졸로마이드일 수 있고, 테모졸로마이드의 효과적인 용량은 테모졸로마이드의 표준 단일요법 용량보다 낮을 수 있다.
2,4-ds-PBN의 유효량은 투여되는 다이어트의 약 0.005 w/w % 내지 약 0.1 w/w %일 수 있다. 신경아교종은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 또는 다형상 교모세포종, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 TGF-β1-, MGMT- 및/또는 APGN-발현 형태일 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체에서 신경아교종 형성에 대해 스크리닝하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 2,4-ds-PBN으로 치료 전후 리포사카라이드 결합 단백질의 발현을 측정함으로써 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 LBP의 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 처리되지 않은 대조군과 비교하여 감소된 LBP 수준은 개선된 예후를 나타낸다.
더욱 또 다른 구현예에서, (a) 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계; 및 (b) 상기 샘플에서 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 수준을 평가하는 단계로, 여기서 비교할만한 정상 대조군 샘플로부터의 것보다 더 높은 LBP 수준은 상기 대상체에서 교모세포종의 존재를 나타내는, 단계를 포함하는 교모세포종을 검출하는 방법이 제공된다. LBP 수준을 평가하는 것은 면역적 평가 또는 핵산 평가, 예컨대 ELISA, RIA, 웨스턴 블랏, 또는 면역조직화학으로부터 선택된 면역적 평가, 또는 RT-PCR, 노던 블랏, RNA-Seq 또는 마이크로어레이로부터 선택된 핵산 평가를 포함할 수 있다. 샘플은 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있다.
추가의 구현예는 (a) 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플에서 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 수준을 평가하는 단계; 및 (c) 두 번째 시점에서 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계로, 여기서 단계 (b)에 비교할 때 단계 (c)에서 더 높은 LBP 수준은 상기 대상체에서 교모세포종의 진행을 나타내는, 단계를 포함하는 교모세포종 진행을 모니터링하는 방법을 포함한다. LBP 수준을 평가하는 것은 면역적 평가 또는 핵산 평가, 예컨대 ELISA, RIA, 웨스턴 블랏, 또는 면역조직화학으로부터 선택된 면역적 평가, 또는 RT-PCR, 노던 블랏, RNA-Seq 또는 마이크로어레이로부터 선택된 핵산 평가를 포함할 수 있다. 샘플은 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있다.
또 추가의 구현예는 (a) 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계; (b) 상기 샘플에서 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 수준을 평가하는 단계; (c) 저, 중 및/또는 고등급 교모세포종에 대한 대조군 샘플과 단계 (b)의 LBP 수준을 비교하는 단계, 및 (d) 상기 대상체에서 상기 교모세포종에 대한 등급을 할당하는 단계를 포함하는 교모세포종을 단계화하는 방법을 포함한다. LBP 수준을 평가하는 것은 면역적 평가 또는 핵산 평가, 예컨대 ELISA, RIA, 웨스턴 블랏, 또는 면역조직화학으로부터 선택된 면역적 평가, 또는 RT-PCR, 노던 블랏, RNA-Seq 또는 마이크로어레이로부터 선택된 핵산 평가를 포함할 수 있다. 샘플은 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있다.
추가의 구현예는 교모세포종이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서 상기 대상체에게 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 표적 제제에 연결된 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. LBP 표적 치료제는 항체, ScFv, Fab 또는 F(ab')2 또는 펩타이드일 수 있다. 치료제는 화학치료제, 방사선요법 제제, 면역치료제 또는 생물 제제일 수 있다. 화학치료제는 테모졸로마이드 또는 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)일 수 있다. 교모세포종은 약물 내성, 예컨대 테모졸로마이드 내성일 수 있다. 교모세포종은 테모졸로마이드 및/또는 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)으로 이전에 치료되었을 수 있다. 교모세포종은 재발성 및/또는 전이성일 수 있다. LBP에 대한 치료제의 연결은 절단가능할 수 있다. 상기 방법은 상기 환자 또는 상기 교모세포종에서 LBP 발현을 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한 추가의 구현예는 대상체에서 교모세포종 경계를 확인하는 방법으로서 (a) 리포사카라이드 결합 단백질에 연결된 조영제를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상체에서 교모세포종 부위를 이미지형성하는 단계를 포함하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 대상체에게 ELTD1, Slit-3 또는 스폰딘-1에 연결된 조영제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 조영제는 염료, 방사선표지, 형광 표지, 화학발광 표지, MRI 표지 또는 근적외선 표지일 수 있다. 상기 방법은, 선택적으로 절제 후 상기 교모세포종 부위를 재-이미지형성하는 단계를 추가로 포함는, 이미지형성 후 상기 교모세포종을 절제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
더욱 추가의 구현예는 대상체로부터 조직 샘플에서 교모세포종 세포를 확인하는 방법으로서 (a) 상기 대상체로부터 조직 샘플을 획득하는 단계 (b) 리포사카라이드 결합 단백질에 연결된 표지와 상기 조직 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 조직 샘플에 결합된 상기 표지-LBP 콘주게이트를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 조직 샘플을 상기 대상체에 연결된 표지인 ELTD1, Slit-3 또는 스폰딘-1에 연결된 이미지 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 표지는 염료, 방사선표지, 형광 표지, 화학발광 표지, MRI 표지 또는 근적외선 표지일 수 있다. 조직 샘플은 고정되지 않은 신선한 생검 샘플일 수 있다. 조직 샘플은 고정된 생검 샘플일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 시행될 수 있는 것으로 고려된다.
청구 범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 공조하여 사용될 때 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", “적어도 하나" 및 “하나 또는 하나 초과"의 의미와 또한 일치한다.
본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물에 관하여 시행될 수 있고 그 반대도 가능하다는 것이 고려된다. 게다가, 본 발명의 조성물 및 키트는 본 발명의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
본원 전반에 걸쳐, 용어 “약"은 값이 디바이스에 대한 고유한 오차의 변동, 값을 결정하기 위해 사용되는 방법 또는 연구 대상체들 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
용어들 “포함하다" (및 포함하다의 임의의 형태, 예컨대 “포함한다" 및 “포함하는"), “갖는다" (및 갖는다의 임의의 형태, 예컨대 “가진다" 및 “갖는"), “함유하다" (및 함유하다의 임의의 형태, 예컨대 “함유한다" 및 “함유하는"), 및 “포괄하다" (및 포괄하다의 임의의 형태, 예컨대 “포괄한다" 및 “포괄하는")은 개방형 연결 동사이다. 그 결과, 하나 이상의 요소를 “포함하거나", “갖거나", “함유하거나" 또는 “포괄하는" 디바이스 또는 방법은 이들 하나 이상의 요소를 보유하지만, 단지 이들 하나 이상의 요소 또는 단계를 보유하는 것에만 한정되지 않는다. 마찬가지로, 하나 이상의 특징을 “포함하거나", “갖거나", “함유하거나" 또는 “포괄하는" 디바이스 또는 방법의 요소는 이들 하나 이상의 특징을 보유하지만, 단지 이들 하나 이상의 특징을 보유하는 것에만 한정되지 않는다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에서 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상에 대해 참고로 하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1: 미처리된, 및 TMZ-, OKN-007 및 조합된 OKN-007과 TMZ-처리된 G55 신경아교종-담지 마우스에 대한 동물 생존 퍼센트 카플란-마이어 곡선.
도 2: 종양의 MRI 검출 (>5 mm3) 후 19-22일째에 수득된 생체내 종양 부피 (mm3).
도 3: 각각의 처리 그룹 (TMZ, OKN-007 (OKN), 조합된 OKN-007과 TMZ (Comb), 또는 미처리된 것 (UT)에 대한 중간-종양 영역에서의 종양 (최대 종양)을 묘사하는 MR 이미지.
도 4: 각각의 처리 그룹 (UT, TMZ, OKN 또는 병용 처리)에 대한 마지막 MRI 시점에서 수득된 종양 부피.
도 5a: 각각의 처리 그룹 (UT: 쇄선을 갖는 흑색 개방된 원; TMZ: 파선을 갖는 청색 개방 정사각형; OKN: 점선을 갖는 녹색 개방 상향 삼각형; 조합: 실선을 갖는 적색 폐쇄된 하향 삼각형)에 대한 다중 시점에서 수득된 종양 부피 (평균 ±S.D.). 처리 윈도우는 최대 ≥50 일 동안 종양이 ≥10 mm3일 때 개시되었다.
도 5b: UT, TMZ, OKN 또는 조합 처리된 G55 신경아교종-담지 마우스에서 정규화된 (반대측 또는 정상 뇌 조직에 대해 정규화된) rCBF 값에서의 변화 (종양 검출 후 21-22 일에서 종양에서의 rCBF 마이너스 초기 종양 검출에서 rCBF).
도 6: UT, TMZ, OKN 또는 조합 처리된 G55 신경아교종-담지 마우스로부터 수득된 종양 조직 용해물에서 ELISA로부터 측정된 생체외 LBP 수준.
도 7: UT, TMZ, OKN 또는 조합된 처리된 G55 신경아교종-담지 마우스로부터 수득된 혈액 혈청에서 ELISA로부터 측정된 생체외 LBP 수준.
도 8: OKN-007과 조합된 TMZ-저항성 (T98G, G55) 및 TMZ-민감성 (U251) GBM 세포주의 시험관내 IC50 평가.
도 9: 신경아교종-담지 랫트 종양에서 LBP에 대한 OKN-007 효과.F98 신경아교종-담지 동물로부터의 조직 용해물에 대해 수행된 LBP의 ELISA 평가는 OKN-007로의 요법 동안 발현 차이를 나타냈다. 종양 담지 동물에서 LBP의 수준은 비-종양 대조군 그룹에 비교하여 상당히 상승되었고, OKN-007 처리는 비-종양 대조군에 근접한 LBP의 수준을 초래했다.
도 10: 신경아교종-담지 랫트 혈청에서 LBP에서의 OKN-007 효과.도 9로부터 동일한 동물로부터의 혈청을 사용한 LPB의 ELISA 평가는 LPB가 신경아교종에서 OKN-007의 요법 결과를 예측할 수 있는 혈청 바이오마커로서 작용할 수 있음을 확인했다.
도 11a-c: 종양 등급에 의한 LBP 수준. LBP 수준은 저-등급 신경아교종으로 분류된 종양과 비교하여 고-등급 인간 환자 신경아교종에서 상승된다. 고-등급 신경아교종: 다형상 교모세포종 (도 11a), 및 저-등급 별아교세포종 (도 11b)에서 LBP에 대한 대표적인 면역조직화학 염색.(도 11c) 고-등급 (GBM-교모세포종, AA-역형성 별아교세포종, AO-역형성 희소돌기아교세포종; 94 환자 조직 샘플) 및 저-등급 (LGA-저등급 별아교세포종, 올리고-양성 희소돌기아교세포종; 45 환자 조직 샘플) 인간 신경아교종에서 LBP 발현의 면역조직화학 (IHC) 점수 평균. 그레이딩 기준: 0:0%; 1:0 내지 <25%; 2:25 내지 <50%; 3:50 내지 <75%; 4:75-100% 검출의 IHC 얼룩.
도 12: OKN 효능에 대한 마커로서 LBP. 각각의 처리 그룹에 대해, LBP 수준은 연구의 종단에서 혈액 및 종양 조직 샘플로부터의 ELISA에 의해 평가되었다. 모든 처리는 G55 신경아교종을 갖는 UT 마우스에 비교하여 혈액에서 LBP를 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. OKN 및 병용 처리는 G55 신경아교종을 갖는 UT 마우스에 비교하여 종양 조직에서 LBP를 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 종양 조직 또는 혈액에서, LBP 수준에 대한 OKN 또는 조합된 요법 사이에 차이가 없는 것으로 보였다.
도 13a-b: (도 13a) 미처리된 (UT), 및 TMZ-, OKN-007 및 조합된 OKN-007과 TMZ-처리된 G55 신경아교종-담지 마우스에 대한 동물 생존 퍼센트 카플란-마이어 곡선.모든 처리 그룹은 UT G55-신경아교종-담지 마우스에 비교하여 상당히 더 높은 생존 (p<0.05 또는 그 초과)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 병용 처리 그룹은 TMZ-처리된 그룹보다 상당히 더 높은 생존 퍼센트 (p<0.01)를 갖는 것으로 밝혀졌다. (도 13b) 종양의 MRI 검출 (>5 mm3) 후 19-22일째에 수득된 생체내 종양 부피 (mm3). 모든 처리 그룹은 UT 그룹에 비교하여 상당히 낮은 종양 부피 (p<0.01 또는 그 초과)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
도 14(ai-diii): 종양 검출 19-22일째에 (도 14a) 미처리된 (UT), 또는 각각의 처리 그룹 (도 14b) TMZ, (도 14c) OKN-007 (OKN), 또는 (도 14d) 조합된 OKN-007과 TMZ (Comb)에 대한 중간-종양 영역에서 종양 (최대 종양)을 묘사하는 대표적인 MR 이미지.“i" 라벨링된 이미지에 대해, 종양은 종양 경계를 묘사하기 위해 희미한 선으로 강조된다. 패널 “ii" 또는 “iii"에서의 이미지는 처리 그룹 A-D에서의 다른 예로, UT 그룹에서의 점조도 또는 처리 그룹에서의 가변성 중 어느 하나를 묘사한다. 이 시점 범위에서 처리에 따른, OKN-007- 또는 조합된-요법 그룹에 대한 도 14ciii 또는 도 14diii에서 검출가능한 종양은 없었다.
도 15(ai-e):(도 15a) UT, (도 15b) TMZ, (도 15c) OKN 또는 (도 15d) 조합된 처리된 G55 신경아교종-담지 마우스에 대한 정규화된 (반대측 또는 정상 뇌 조직에 대해 정규화된) rCBF 값에서 관류 MRI [종양 검출 후 21-22 일에서 종양에서의 rCBF (상대적인 뇌 혈류) 마이너스 초기 종양 검출에서의 rCBF]에 의해 묘사된 바와 같은 혈관 변화.“i" 라벨링된 이미지의 최상부 패널은 각각의 처리 그룹에 대한 대표적인 T2-계량된 형태적 MR 이미지이고, 반면에 “ii" 라벨링된 이미지는 각각의 처리 그룹에 대한 대표적인 관류 맵이다. (도 15e) UT 및 TMZ-, OKN-, 또는 병용 요법-처리된 G55 신경아교종-담지 마우스에서 정규화된 rCBF에서의 변화의 정량적 평가.모든 처리 그룹은 UT 그룹에 비교하여 정규화된 rCBF에서 상당히 낮은 (p<0.05 또는 그 초과) 변화를 가졌다.
도16: LN18 GBM 세포에서 TMZ 단독 처리 그룹에 대해 TMZ+OKN을 비교할 때 유전자-배수 변화.
도 17: LN229 GBM 세포에서 TMZ 단독 처리 그룹에 대해 TMZ+OKN을 비교할 때 유전자-배수 변화.
도 18: 미처리된 (UT), 또는 OKN-007 (OKN), TMZ 또는 둘 모두 OKN + TMZ으로 처리된, 라미닌으로 코팅된 PDMS (폴리디메틸실록산) 마이크로-채널에서, 처리-후 22, 28 및 46 h에서 G55 GBM 세포의 이동 속도.UT 세포 (*)와 22 및 28 h에서 OKN 또는 OKN + TMZ으로 처리된 것들 사이에, 그리고 46h에서 모든 처리 그룹에 유의차가 있었다. 22 및 28h에서 TMZ과 OKN + TMZ 그룹 (†) 사이에 유의차가 있었다. *(†) p<0.05, **(††) p<0.01, *** p <0.001.
도 19: 도식적 네트워크 경로에서 미처리된 그룹 (n=4)에 비교하여 처리된 그룹 (n=4)에서 다운-조절된 유전자 (녹색; >2-배수 변화)를 나타내는, OKN-007-처리 및 미처리된 랫트 F98 신경아교종-담지 종양으로부터의 mRNA 샘플의 마이크로어레이 분석.영향을 받은 주요 다운-조절된 유전자 경로는 TGFβ1, PDGFBB, P38 MAPK, NFκB, 일부 MMP (특히 MMP12), DCN (데코린), SERPINB2, LUM, LBP (리포폴리사카라이드 결합 단백질), 및 몇 개의 콜라겐을 포함한다.
도 20: 랫트 F98 처리된 신경아교종 대 미처리된 종양에서 OKN-007에 의한 57개의 다운-조절된 유전자의 마스터 조절인자로서 TGFβ1. (업스트림 조절인자 분석, IPA). OKN-007은 콜라겐, MMP12 (조직 리모델링), SERPINB2 (세르핀 펩티다아제 억제제), IGFBP5 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질)를 포함한 57개 유전자를 하향-조절한다.
도 21a-c: (도 21a) 미처리되거나, 또는 (도 21b) OKN-007로 처리된 랫트 F98 동소이식 종양 (중간-종양 영역)의 TGFβ1 IHC. (도 21c) F98 종양 조직 용해물로부터 미처리 (UT) 또는 OKN-007 (OKN)-처리된 것에서 ELISA TGFβ1 단백질 수준 (pg/mL).
예시적 구현예의 설명
다형상 교모세포종으로 진단된 환자의 예후는 조기 및 정확한 진단의 어려움 및 현재 효율적인 치료적 화합물의 결여에 기인하여 매우 불량하다. 또한, 약물에 대해 초기에 민감한 신경아교종은 경시적으로 내성으로 될 수 있어, 그것에 의해 이 고도로 치명적인 형태의 암을 치료하는 데 추가적인 과제를 제시할 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, PBN의 구조 유사체인, 2,4-ds-PBN은 종양 부피를 감소시킬 수 있었고 그리고 하기의 지연: 종양 성장률로 신경아교종이 있는 동물의 것, 및 또한 생존율을 상당히 증가시켰다. 그러나, 2,4-ds-PBN이 신경아교종 세포에서 TMZ-내성의 예방 및 극복을 포함한, 테모졸로마이드 (TMZ)-기반 요법의 결과에 긍정적으로 영향을 줄 수 있는지 여부는 알려지지 않았다. TMZ 처리의 관리 기준 상태 및 TMZ 내성 유병률을 고려할 때, 이와 같은 이점은 TMZ로 치료를 받는 환자에게 상당한 유의성이 있을 것이다.
따라서, 본 발명자는 TMZ 내성 및 공동-요법의 맥락에서 2,4-ds-PBN의 효과를 조사하고자 하였다. 시험관내 세포 데이터는 2,4-ds-PBN이 TMZ으로 처리된 TMZ-내성 GBM 세포의 세포 생존력을 상당히 감소한다는 것을 분명히 나타낸다. 생체내 데이터는 조합된 2,4-ds-PBN 및 TMZ 치료가 TMZ-내성 신경아교종 이종이식 누드 마우스 모델에서 실질적으로 동물 생존을 증가시키고 종양 부피를 감소시킨다는 것을 분명히 보여준다. 이들 예기치 못한 결과는 신경아교종에 대한 강력한 신규한 치료 레지멘으로서 2,4-ds-PBN 및 TMZ의 조합된 사용에 대해 지적한다.
본 개시내용의 이들 및 다른 양태가 아래에 상세히 기재된다.
2. 역형성 신경아교종 계층
A. 임상 특징
역형성 신경아교종은 저 (국소화된, 느린 성장성) 및 다형상 교모세포종 (빠르게 성장하고 고도로 침습성) 사이에 분류된 - 중간 등급 침윤성 신경아교종이다. 역형성 별아교세포종 (AA)은 별아교세포로 불리는 뇌 세포 및/또는 그것의 전구체로부터 생기는 종양이다. 별아교세포는 중추신경계의 지지 세포이다. 소아에서 다수의 성상세포 종양은 저-등급인 반면에 성인에서는 대부분 고-등급이다. 이들 종양은 뇌 및 척수에서 어디든지 일어날 수 있다.
희소돌기아교세포종은 희소돌기교세포 및/또는 그것의 전구체로부터 유래된 신경아교종이다. 뇌에서 수초화 뉴런의 구조 및 기능에서 역할을 하는 희소돌기교세포.역형성 희소돌기아교세포종 (AO)은 희소돌기아교세포종보다 더 공격적이지만, 또한 역형성 별아교세포종보다 화학요법에 대해 더 민감하다. PCV (프로카바진, CCNU, 빈크리스틴) 화학요법의 사용에 대한 높은 반응 속도는 조사에 따른 방사선 요법 전에 및/또는 종양 재발 및 진행에서 PCV 화학요법의 공동의 사용을 이끌었다. 또 다른 신경아교종은 희소돌기아교세포종 및 별아교세포종 종양 형태 둘 모두의 조직학적 혼합물로 나타나고 희소돌기별아교세포종으로 불린다. 희소돌기별아교세포종은 저-등급일 수 있는 반면, 다수의 혼합된 희소돌기별아교세포종은 역형성 희소돌기별아교세포종 (AOA)이다.
마지막 신경아교종 하위그룹은 뇌실막세포종이다. 악성 뇌실막세포종의 하나의 아형은 역형성 뇌실막세포종 (AE)이고; 이들 종양은 심실로 불리는 뇌척수액 통로인 뇌실막 세포 및/또는 그것의 전구체로부터 생긴다. 이들 종양은 천막상 (머리의 최상부 일부) 또는 천막하 (머리의 뒤쪽)로 분류된다.
신경아교종에 의해 생산된 임상 특징 및 증상은 종양의 위치 및 환자의 연령에 따라 달라진다. 신경아교종에 대한 가장 흔한 위치는 성인에서는 대뇌반구이고 소아에서 소뇌, 뇌간, 시상하부, 및 시상이다. 척수 신경아교종은 뇌의 신경아교종보다 훨씬 덜 일반적이다. 이들 종양이 있는 환자는 뇌 또는 척수에서 위치에 다양하게 의존하는 증상을 갖는다. 이들은 두통, 발작, 메스꺼움 및 구토, 팔다리 약화, 편측성 감각 변화, 인격 변화, 및 걷기에서의 불안정함의 증상을 유발할 수 있다.
B. 분류
역형성 별아교세포종. 역형성 별아교세포종의 조직학적 특징은 저-등급 별아교세포종의 것들과 유사하지만 이들 특징은 보다 풍부하고 과장된다. 이들 종양은 WHO 등급 III이다 (Kleihues et al., 1993; Kleihues and Cavenee, 2000). 세포질은 핵 및 세포 다형성과 마찬가지로 더욱 증가한다. 이들 특징은 백투백 세포 및 기괴한, 과색성 핵으로 극단적일 수 있다. 세포질은 역형성을 나타내는 핵 결각 및 확장으로 부족할 수 있다. 유사분열 활성은 대부분의 역형성 별아교세포종에서 쉽게 인식되지만, 하기에서는 불가해하게 없을 수 있다: 팽대세포가 있는 영역.
이 등급에서의 역형성의 범위는 광범위하며, 일부 예는 유사분열 특징이 적은 낮은 세포질 및 다형성을 나타내고, 다른 예는 빈번한 유사분열로 높은 세포질 및 다형성이며, 교모세포종의 조직학적 진단에 필요한 괴사 만이 없다. 이러한 이유로, 보다 객관적인 행동 지표를 갖는 것이 유용하고, 세포 증식의 일부 마커는 예후를 보다 정확하게 예측하기 위한 시도로 사용되어왔다. 여기서 대부분의 사용된 마커는 브로모데옥시우리딘 (BrdU) 및 Ki-67에 대한 항체였다 (Davis et al., 1995). BrdU의 세포 편입은 세포 주기의 DNA 합성 단계의 특이적 마커이고, 반면에 Ki-67 항체는 G0를 제외한 세포 주기의 모든 단계에서 존재하는 항원을 표지한다. 양 항체는 파라핀-포매된 조직 절편에서 면역조직화학 염색에 의해 확인될 수 있다. 일반화로서, 역형성 별아교세포종에 대한 더 높은 라벨링 비율은 불량한 예후와 연관된다 (Hoshino et al., 1993; Davis et al., 1995; Lamborn et al., 1999).
다형상 교모세포종. 다형상 교모세포종으로도 알려져 있는, 교모세포종은 WHO 등급 IV인 악성종양의 최고 등급을 갖는 신경아교종이다 (Kleihues and Cavenee, 2000). 이는 15% 내지 23%의 두개내 종양 및 약 50%-60%의 별아교세포종을 나타낸다. 신경교 원섬유성 산성 단백질이 세포의 세포질에서 확인될 수 있기 때문에 대부분의 예는 일반적으로 별아교세포로부터 발생하는 것으로 간주된다. 그러나, 일부 예는 명백하게 다른 신경교 계열, 예컨대 희소돌기교세포로부터 생긴다. 교모세포종은 보다 빈번하게 발행하는 별아교세포종이다. 부검 및 연속 생검 연구는 일부 별아교세포종은 저-등급에서 역형성 별아교세포종으로 교모세포종으로의 전환과 함께 악성종양의 등급을 통해 진행되는 것을 나타냈다 (Muller et al., 1977). 그러나, 교모세포종의 일부 예는 그렇지 않으면 정상적인 환자에서 빠르게 발생하는 것으로 보이고 이들이 작을 때 인식되기 때문에, 이 다양한 교모세포종은 또한 낮은 등급의 악성종양을 통과하지 않으면서 별아교세포 전구체 세포의 악성 전환으로부터 직접적으로 발생할 수 있다고 생각된다 (Kleihues and Ohgaki, 1997; 1999).
종양 괴사는 역형성 별아교세포종으로부터 교모세포종을 구별하는 특징적인 총체적인 특징이다 (Nelson et al., 1983; Burger et al., 1985; 1991). 독특하고 진단적인 또 다른 미세한 특징은 종양 내에서 증식성 혈관 변화의 존재이다. 이들 변화는 내피성 세포 (혈관 내피상 과다형성 또는 증식) 또는 혈관벽 자체의 세포 (혈관 벽화 세포 증식)에서 발생할 수 있다. 두 유형의 변화는 때때로는 함께 미세혈관 증식으로 간주된다. 교모세포종 세포질은 일반적으로 극도로 높다. 개별 세포는 높은 핵:세포질 비로 작거나, 또는 풍부한 호산구 세포질로 매우 크고 기괴할 수 있다. 이들 동일한 소세포는 종양 괴사의 영역 주위에 줄로 응축되는 것으로 나타나, 특징적인 유사 울타리를 형성할 수 있다. 교모세포종 종양은 뇌에 광범위하게 침투하여, 먼 위치까지 퍼지고 다초점 신경아교종의 모습을 나타내는 경향이 있다. 일부 예는 실제로 다초점 (즉, 다중 동시 원발 부위에서 발생)인 반면 많은 이들 다초점 종양은 부검에서 뇌 전체가 검사될 때 조직학적 연결성을 나타낸다.
희소돌기아교세포종. 별아교세포종과 마찬가지로, 희소돌기아교세포종은 그것의 추정된 기원 세포의 조직학을 모방한다. 이들은 또한 주로 백질에서 발생하지만 유사한 등급의 악성종양의 별아교세포종보다 대뇌겉질에 더 침투하는 경향이 있다. 별아교세포종과 마찬가지로, 조직학적 악성종양의 등급화 체계는 희소돌기아교세포종에 대해 사용되었지만, 이들은 별아교세포종에 대해 사용된 것들보다 예후와 덜 관련된다 (Burger et al., 1987; Bigner et al., 1998; Daumas-Duport et al., 1997). 희소돌기아교세포종를 등급화하기 위해 사용된 많은 조직학적 특징은 별아교세포종에 대해 사용된 것들인: 세포질, 다형성, 유사분열 활성, 혈관 변화, 및 괴사에 유사하다. 저-등급 희소돌기아교세포종은 미소낭포를 가질 수 있다. 모든 조직학적 등급의 희소돌기아교세포종은 쉽게 피질에 침투하고 아연뇌막 영역, 뉴런 주위 및 혈관 주위에서 신생물성 세포의 클러스터를 형성하는 경향이 있다. 일반적으로, 희소돌기아교세포종의 세포는 둥근, 규칙적 핵 및 깨끗한 세포질이 있는 뚜렷한 세포질 경계를 가질 수 있다. 또 다른 상당히 독특하고 진단적으로 도움이 되는 특징은 종양이 별개의 소엽으로 분할할 수 있는 “치킨-와이어" 혈관으로 지칭되는 희소돌기아교세포종의 혈관 패턴이다. 역형성이 증가함에 따라, 희소돌기아교세포종은 고도로 세포 및 다형성이 될 수 있어, 괴사의 존재와 함께 다형성 교모세포종의 출현에 접근할 수 있다. 이들을 역형성 희소돌기아교세포종으로 분류하는 것이 올바르지만, 임의의 고-등급 신경교 신생물에서 괴사가 확인되면 일부는 용어 교모세포종을 사용한다. 성상세포 교모세포종으로부터 역형성 희소돌기아교세포종을 분리하는 것에 대한 하나의 정당성은 이 최고 등급의 악성종양에서도 전자의 약간 더 나은 예후이다. 일부 저자들은 >3%-5%의 MIB-1 라벨링 지수가 희소돌기아교세포종에서 더 나쁜 예후를 예측한다는 것을 보고했다 (Heegard et al., 1995; Kros et al., 1996; Dehghani et al., 1998).
희소돌기별아교세포종. 대부분은 아니지만, 많은 희소돌기아교세포종은 별아교세포종의 영역 또는 친밀한 세포 혼합물로 발생한다. 혼합된 신경아교종의 진단을 위해, 각각의 비율이 실질적이어야 하지만, 저자들은 정확한 숫자에 대해 다른 의견을 가지고 있다; 일반적으로 소량 원소의 10% 내지 25% 범위의 혼합물이 혼합된 신경아교종을 진단하는데 사용된다. 희소돌기별아교세포종 및 역형성 희소돌기별아교세포종은 각각 WHO 등급 II 또는 등급 III에 상응한다 (Kleihues and Cavenee, 2000). 역형성의 조직학적 특징은 어느 한 성분에 존재할 수 있으며 예후에 부정적으로 영향을 줄 것이다. 이러한 특징은 현저한 세포 다형성, 높은 세포질, 및 높은 유사분열 속도를 포함한다. 미세혈관 증식 및 괴사가 또한 관찰될 수 있다. 요법에 대한 예후 및 반응은 희소돌기아교세포 대 성상세포 성분의 비율에 의존하는 것으로 보이지 않고 (Shaw et al., 1994), 그렇지만 역설적으로, 희소돌기신경교세포 성분의 BrdU LI는 성상세포 성분보다 생존에 대해 보다 더 예측적이고 (Wacker et al., 1994) 훨씬 진전된 종양 진행은 성상세포 성분에 의해 지배된다.
3. 페닐 N-tert-부틸 니트론 (PBN) 및 테모졸로마이드 (TMZ)
A. PBN's
화합물 페닐 N-tert-부틸 니트론 (PBN)은 먼저 1950년대에 합성되었지만, 1968년에 화학 반응에서 자유 라디칼을 포획하고 안정화하는데 아주 유용한 것이 발견되었고 따라서 스핀-트랩으로 명명되었다 (Janzen, 1971). PBN은 원형 스핀-트랩이지만, 몇 개의 다른 니트론이 합성되었고 화학 반응에서 자유 라디칼을 포획하고 특성화하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 이들 스핀 트랩은 화학 반응에 먼저 사용되었지만, 1970년대 중반에는 생화학 및 생물학적 시스템에서 자유 라디칼을 포획하는데 사용되기 시작했다 (Poyer et al., 1978). 약동학적 연구는 PBN은 모든 조직에 거의 동등하게 쉽고 빠르게 분포되며, 약 132분의 랫트에서 반감기를 가지며 대부분 소변에서 제거된다는 것을 나타냈다. 상대적으로 적은 대사 연구가 수행되었지만, 화합물의 (주로 파라 위치에서) 일부 고리 하이드록실화는 간에서 발생한다는 것이 알려져 있다.
Novelli가 처음 PBN이 실험 동물을 패혈성 쇼크로부터 보호하는데 사용될 수 있음을 보여 주었고 (Novelli et al., 1986), 사실상 이것은 다른 그룹에 의해 확인되었다 (Pogrebniak et al., 1992). 약리학제로서 PBN 및 유도체의 사용은 PBN이 실험적 뇌졸중 모델에서 신경보호성 활성을 가짐을 보여준 1988년에서의 발견 후에 시작되었다 (Floyd, 1990; Floyd et al., 1996; Carney et al., 1991). 이들 결과는 반복되고 연장되었다 (하기 참고: Clough-Helfman et al., 1991; Cao et al., 1994; Folbergrova et al., 1995; Pahlmark et al., 1996). 다른 사람들은 PBN 및 유도체에 대한 광범위한 신경보호성 약리적 연구 노력을 요약하였다 (Floyd, 1997; Hensley et al., 1996). 신경퇴행성 질환에 부가하여, PBN은 당뇨병 및 많은 다른 증상을 포함한, ROS-매개된 과정이 관여되는 다른 병리 상태를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 실험 뇌졸중 및 몇 개의 다른 신경퇴행성 모델에서 왜 PBN 및 그것의 일부 유도체가 그렇게 신경보호성인지에 대한 기계론적인 근거는 아직 완전히 설명되지 않았다. 그러나, 명백하게는, 그것의 작용은 자유 라디칼을 포획하는 그것의 능력으로 간단히 설명될 수는 없다는 것이 분명하다.
PBN에 대한 일반 식은 다음과 같다:
Figure pct00001
식 중:
X는 페닐 또는
Figure pct00002
이고,
R은 H,
Figure pct00003
, 또는 Z; 또는
Figure pct00004
이고,
그리고 n은 1 내지 5의 전체의 정수이거나; 또는
Figure pct00005
Y는 하나 이상의 위치 상에서 하이드록실화 또는 아세틸화될 수 있는 tert-부틸 기; 페닐이거나; 또는
Figure pct00006
이고,
여기서 W는
Figure pct00007
또는 Z이고; 그리고 Z는 C1 내지 C5 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이다.
B. 암에서 PBN's
미국특허 5,569,902 (본 명세서에 참고로 편입됨)는 암의 치료를 위한 니트론 자유 라디칼 포착제의 사용을 개시한다. 구체적으로, PBN 및 관련된 화합물은 항-발암원성 다이어트의 제조 및 이와 같은 보충된 다이어트의 제조에 유용한 것으로 기재되었다. 니트론을 유익하게 수용하기에 가장 공산이 큰 이들 대상체는 하기를 포함한다:(1) 사전종양 검사가 종양의 존재의 높은 개연성을 나타내는 이들, (2) 매우 강력한 발암원성 환경에 노출되고 그것의 종양 진행의 개연성이 높은 이들, 및 (3) 유전적 소인이 그것의 종양 발달의 가능성을 높게 하는 이들.
미국특허 공보 2007/0032453 (본 명세서에 참고로 편입됨)은 MRI 기술을 사용하여 신경아교종에 대한 항-염증성 페닐 N-tert-부틸 니트론 (PBN)의 효과를 기술한다. PBN 자체는 대상체에게 종양 이식 전, 그 시점 또는 후에 제공될 때 종양 발달을 제어할 수 있었다. 따라서, 신경아교종의 치료제로서 PBN, 및 관련된 니트론 자유 라디칼 포착제를 사용하는 것이 제안되었다.
C. 2,4-디설포닐 페닐 N-tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)
미국특허 5,488,145 (본 명세서에 참고로 편입됨)는 2,4-디설포닐 페닐-tert-부틸 니트론 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 개시한다. 이들 물질은 뇌졸중에서 발생하는 것으로 급성 중추신경계 산화 또는 진행성 중추신경계 기능 손실로 그 자체로 나타날 수 있는 점진적인 중추신경계 산화를 앓고 있는 환자에게 경구 또는 정맥내 투여를 위한 유용한 약제학적 제제로 기재되었다.
Figure pct00008
2,4-디설포닐 PBN (또한 일명 OKN-0007)
2,4-디설포닐 PBN의 두 설포네이트기는 개선된 수용성을 나타내는 것이 기대되었지만, 또한 그것의 소유성 특성으로 인해 혈액/뇌 장벽을 가로 질러 불량한 이송을 나타내는 것으로 기대되었다. 그러나, 본 화합물이 제조되고 생체내 시험되었을 때, 이는 PBN과 비교하여 예기치 못한 효능에서의 증가를 나타냈다. 효능에서의 이 증가는 PBN과 비교하여 효력에서의 증가와 함께 발생하였다. 효력 및 효능에서의 이 현저한 증가와 직접 대조적으로, PBN과 비교하여 독성에서 현저하고 아주 상당한 감소가 있었다.
특정 정의된 화합물의 계열 내에서 구조/활성 관계에 대한 일반적인 문헌에서 치료적 효력은 전형적으로 독성과 함께 변하기 때문에 이들 결과는 예기치 못하였다. 따라서, 대부분의 관련된 화합물은 그것의 치료적 효력 대 독성의 비율을 유지한다. 그에 반해서, 본 발명의 화합물은 밀접하게 관련된 유사체에 비해 그것의 효력 증가되고 그것의 독성 줄어들 때 이러한 기대된 관계로부터 벗어난다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 PBN-디설포닐 화합물 및 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 제2 양태에서, 본 발명은 활성 성분으로 이 화합물 또는 그것의 염을 갖는 정맥내로- 및 경구로-투여가능한 약제학적 조성물을 제공한다.
2,4-ds PBN은 더 높은 pH에서 하기 이온화된 염 형태로 존재할 수 있다:
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
여기서 X는 약제학적으로 허용가능한 양이온이다. 가장 통상적으로, 이 양이온은 1가 물질 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 암모늄이지만, 이것은 또한 단독으로 다가 또는 약제학적으로 허용가능한 1가 음이온, 예를 들어 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 하이드록실, 니트레이트, 설포네이트, 아세테이트, 타르트레이트, 옥살레이트, 석시네이트, 팔모에이트 등 음이온을 갖는 칼슘; 이와 같은 음이온을 갖는 마그네슘; 이와 같은 음이온을 갖는 아연 등과 조합한 양이온일 수 있다. 다가 양이온과 1가 음이온의 이들 조합이 구조식에서 설명되는 경우, 본 명세서에서, 1가 음이온은 “Y"로 확인된다.
이들 물질 중에서, 유리 산 및 간단한 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 염이 가장 바람직하고 칼슘 및 마그네슘 염도 어느 정도 덜 그렇지만 또한 바람직하다.
2,4-ds PBN은 2-단계 반응 순서에 의해 제조될 수 있다. 제1 단계에서, 상업적으로 입수가능한 삼차 부틸 니트레이트 (2-메틸-2-니트로프로판)이 적합한 촉매 예컨대 활성화된 아연/아세트산 촉매 또는 알루미늄/수은 아말감 촉매를 사용하여 상응하는 n-하이드록실 아민으로 전환된다. 이 반응은 액체 반응 매질 예컨대 아연 촉매의 경우에는 알코올/물 혼합물 또는 알루미늄 아말감 촉매의 경우에는 에테르/물 혼합물에서 약 15-100℃의 온도에서 0.5 내지 12 시간 및 특히 약 2 내지 6 시간 또는 등으로 수행될 수 있다.
제2 단계에서, 새롭게 형성된 하이드록실아민은 전형적으로 어느 정도 과잉으로 사용된 아민으로 4-포르밀-1,3-벤젠디설폰산과 반응된다. 이 반응은 유사한 온도 조건에서 수행될 수 있다. 이 반응은 일반적으로 10 내지 24 시간 내에 완료된다.
그렇게 형성된 생성물은 유리 산이고 89 g/몰의 분자량을 특징으로 한다. 이것은 가열에 의해 분해되는 백색 분말성 물질이다. 이것은 1 그램/ml 초과의 물에서의 용해도 및 8.048 ppm (dd, 8.4, 1.7 Hz); 8.836 ppm (d, 8.4 Hz); 8.839 ppm (d, 1.7 Hz); 8.774 ppm (들)의 D2 O에서의 1H NMR 스펙트럼을 특징으로 한다.
다양한 염은 수성 매질 중 유리 산을 2 당량의 적절한 염기, 예를 들어 칼륨 염에 대한 KOH 및 기타 동종의 것과 혼합함에 의해 용이하게 형성될 수 있다.
일 합성은 하기에 의한 연구에 기초된다: R.H.Hinton 및 E.G.Janzen (J. Org.Chem.57:2646-2651, 1992). 이것은 하이드록실아민과 알데하이드의 축합을 포함한다. 하이드록실아민은 불안정하며 그리고 활성화된 아연 촉매를 사용하여 사용하는 날에 신선하게 제조된다. 합성은 아래와 같다.
표 1 - 필수 화학물질
1. 95% 에탄올
2. 2-메틸-2-니트로프로판
3. 아연 분진
4. 빙초산
5. 디에틸 에테르
6. 포화된 염화나트륨
7. 황산마그네슘, 무수 고체
8. 4-포르밀-1,3-벤젠설폰산 (MW 310.21 g/몰), 디나트륨 염, 수화물
9. 메탄올
10. 디클로로메탄
표 2 - N-t-부틸하이드록실아민의 제조
1. 500 mL 3구 둥근바닥 플라스크에 자석 교반 막대, 온도계 어댑터, 온도계, 및 투입 깔때기를 장착한다.
2. 95% 에탄올 (350 mL)을 플라스크에 첨가하고 빙욕에서 10℃로 냉각시킨다.
3. 2-메틸-2-니트로프로판 (6.18 g, 0,060 몰), 및 아연 분진 (5.89 g, 0,090 몰)을 단일 부분으로 첨가했다.
4. 빙초산 (10.8 g, 0,180 몰)을 투입 깔때기에 넣었고 격렬한 교반과 함께 온도를 15℃ 아래로 유지하는 속도로 적가하였다.
5. 빙욕을 제거하고 혼합물을 3시간 동안 실온에서 교반하였다.
6. 용매를 혼합물로부터 박리하여, t-부틸하이드록실아민, 아연 아세테이트, 및 물을 제거한다.
7. 디클로로메탄 (50 mL)을 첨가하고 혼합물을 부크너 깔때기를 통해 여과한다.
8. 여과지 상에 남겨진 아연 아세테이트 케이크를 2X 25 mL 디클로로메탄으로 세정한다.
9. 물을 분별 깔때기에서 여액으로부터 분리하고 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시킨다.
10. 황산마그네슘을 피리 여과지를 통해 여과하여 제거하고, 그 다음 디클로로메탄을 회전식 증발로에 의해 박리하였다.
11. 점성 액체인 생성물 (100% 수율=5.34 g)을 하기 사용을 위해 메탄올 (50 mL)에 용해시켰다.
표 3 - 2,4-디설포닐페닐-N-t-부틸니트론의 제조
1. 3-구 250 ml 둥근바닥 플라스크에 교반 바, 가스 분산 튜브, 투입 깔때기, 및 재순환 빙수로 냉각된 프리드리히 콘덴서를 설치하였다.
2. 플라스크에 200 mL의 메탄올, 4-포르밀-1,3-벤젠디설폰산 (9.31 g, 30 mmol) 및 N-t-부틸하이드록실아민 (A 부분으로부터의 25 mL의 메탄올 용액, 이론적으로 30 mmol)을 첨가하였다.
3. 반응물을 교반하면서 질소로 반응을 거품 발생시키면서 가열 맨틀로 환류 가열하였다.
4. 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다.
5. 상기로부터 나머지의 하이드록실아민을 첨가했다.
6. 환류는 질소 거품발생으로 적어도 18시간 동안이지만 24시간 이하로 계속했다.
7. 고온 반응 혼합물을 부크너 깔때기 상에서 여과하고 고온 메탄올로 고체를 세정하였다.
8. 메탄올은 회전식 증발로에서 황색, 점성 오일로 박리되었다.
9. 고온 1:1 에탄올:아세톤 (200 mL)을 첨가하고 혼합물을 가열하여 오일을 용해시켰다.
10. 용액을 냉각시켜 생성물을 결정화하였다.
11. 생성물을 부크너 깔때기 상에 수집하고 진공하에서 밤새 건조시켰다.
12. 반응은 전형적으로 75% 수율의 백색 분말을 제공한다.
다른 합성 방법도 또한 선행기술에 개시되어 있다.
D. 테모졸로마이드
테모졸로마이드 (TMZ; 브랜드명 Temodar® 및 Temodal® 및 Temcad®)는 경구 화학요법 약물이다. 이것은 일부 뇌암의 치료; 별아교세포종에 대한 2차 치료 및 다형상 교모세포종에 대한 1차 치료로 사용된 알킬화제이다. TMZ는 알킬화제 다카바진의 전구약물 및 이미다조테트라진 유도체이다. 그것의 승인된 징후는 니트로소우레아- 및 프로카바진-내성 역형성 별아교세포종, 및 새로 진단된 다형상 교모세포종을 포함한다. TMZ는 1999년 8월 이래로 미국에서 그리고 2000년대 초기 이래로 다른 국가에서 이용가능하였다.
TMZ로부터의 가장 흔한 부작용은 골수 억제이다. 테모졸로마이드와 연관된 가장 흔한 비-혈액학적 역효과는 메스꺼움 및 구토로, 이것은 자체-제한적이거나 또는 표준 항구토제 요법으로 쉽게 제어된다. 이들 후자의 효과는 일반적으로 경도 내지 중간 정도 (등급 1 내지 2)이다. 심각한 메스꺼움 및 구토의 발병률은 각각 대략 4%이다. 심각한 구토의 이전 존재 또는 이력이 있는 환자는 테모졸로마이드 치료를 시작하기 전에 항구토제 요법이 필요할 수 있다. 테모졸로마이드는 적어도 식사 한 시간 전의 공복 상태에서 투여되어야 한다. 항구토제 요법은 테모졸로마이드의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 테모졸로마이드는 그것의 성분 또는 다카바진에 대해 과민증이 있는 환자에게 사용금지된다. 테모졸로마이드의 사용은 심각한 골수억제가 있는 환자에서는 권고되지 않는다. 테모졸로마이드의 표준 경구 용량은 매일 150 mg/m2이고, 유지를 위해 매일 200 mg/m2로 증가된다. 보다 낮은 수준은, 예를 들어 125 mg/m2, 100 mg/m2, 75 mg/m2, 또는 50 mg/m2를 포함하여, 표준 투약 미만의 임의의 것일 수 있다.
테모졸로마이드는 유전독성, 기형발생 및 태아독성이고 임신 중에는 사용되지 않아야 한다. 수유 여성은 모유로 분비될 위험 때문에 약물을 투여받는 동안 수유를 중단해야 한다. 일 연구는 수반되는 출산력 보전 조치없이 테모졸로마이드를 복용한 여성은 생의 후반에서 임신을 더 적은 비율로 달성하는 것을 나타냈지만, 본 연구는 테모졸로마이드는 여성 불임의 위험을 부여할 것이라는 가설에서 통계적 유의성을 나타내기에는 너무 작다. 남성 환자에서, 테모졸로마이드는 유전독성 효과를 가질 수 있다. 테모졸로마이드 요법에 기인한 비가역적 불임의 가능성이 있기 때문에, 남성은 치료 동안 또는 최대 6개월 후까지 아이를 낳지 말고 치료 전에 정자의 동결보존에 관한 조언을 구해야 한다. 매우 드물게 테모졸로마이드는 급성 호흡 부전 또는 간 손상을 야기할 수 있다.
테모졸로마이드의 치료적 이점은 구아닌 잔기의 N-7 또는 O-6 위치에서 가장 흔하게 발생하는, DNA를 알킬화/메틸화하는 그것의 능력에 좌우된다. 이 메틸화는 DNA를 손상시키고 종양 세포의 사망을 촉발시킨다. 그러나, 일부 종양 세포는 이러한 유형의 DNA 손상을 회복할 수 있고, 따라서 O-6-메틸구아닌-DNA 메틸전달효소 (MGMT) 유전자에 의해 인간에서 인코딩된 단백질 O6-알킬구아닌 DNA 알킬전달효소 (AGT)를 발현함에 의해 테모졸로마이드의 치료적 효능을 감소시킨다. 일부 종양에서, MGMT 유전자의 후성유전적 침묵화는 이 효소의 합성을 방지하고, 결과적으로 이러한 종양은 테모졸로마이드에 의한 사멸에 보다 민감하다. 반대로, 뇌종양에서 AGT 단백질의 존재는 테모졸로마이드에 대한 불량한 반응을 예측하고, 이들 환자는 테모졸로마이드로의 화학요법으로부터 이점을 거의 받지못한다.
실험실 연구 및 임상시험은 테모졸로마이드를 다른 약리제와 배합시킴에 의해 그것의 항암 효력을 증가시키는 가능성을 조사했다. 예를 들어, 임상시험은 클로로퀸의 첨가가 신경아교종 환자의 치료에 유익할 수 있음을 나타냈다. 실험실 연구는 테모졸로마이드가 녹차의 성분인 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCG)가 첨가된 경우 보다 효율적으로 뇌 종양 세포를 사멸시키는 것을 밝혔다; 그러나, 이 효과의 효능은 뇌-종양 환자에서 확인되지는 않았다. 테모졸로마이드 및 방사선 요법과 조합될 때 신규한 산소 확산-향상시키는 화합물 트랜스 나트륨 크로세티네이트 (TSC)의 사용에서의 조사 및 임상시험에 대한 2010년에 보고된 전임상 연구는 2015년 8월 현재부로 진행중이었다.
상기 언급된 접근법은 테모졸로마이드와 다른 제제의 조합이 치료적 결과를 개선할 수 있는지 여부를 조사하는 한편, 테모졸로마이드 분자의 변경 자체가 그것의 활성을 증가시킬 수 있는지 여부를 연구하는 노력을 또한 개시했다. 하나의 이러한 접근법은 뇌암 환자에서 실증된 치료적 활성을 갖는 천연 화합물인 페릴릴 알코올을 테모졸로마이드 분자에 영구적으로 융합시켰다. NEO212 또는 TMZ-POH로 불리는, 수득한 신규한 화합물은 그것의 두 모체 분자인, 테모졸로마이드 및 페릴릴 알코올 중 어느 하나의 것보다 상당히 큰 항암 활성을 나타냈다. 비록 2016년 부로 NEO212는 인간에서 시험되지 않았지만, 신경아교종, 흑색종 및 삼중-음성 유방암의 뇌 전이의 동물 모델에서 우수한 암 치료 활성을 보여 주었다.
MGMT 유전자를 발현하는 종양 세포는 테모졸로마이드의 영향에 대해 보다 저항성이기 때문에, 연구자들은 AGT 억제제인 O 6-벤질구아닌 (O 6-BG)의 봉입이 이 저항성을 극복할 수 있고 약물의 치료적 유효성을 개선할 수 있는지 여부를 조사하였다. 실험실에서, 이 조합은 사실상 시험관내 종양-세포 배양 및 생체내 동물 모델에서 증가된 테모졸로마이드 활성을 나타냈다. 그러나, 뇌-종양 환자로 최근에 완료된 페이스-II 임상시험은 혼합된 결과를 산출하였다; O 6-BG 및 테모졸로마이드가 테모졸로마이드-저항성 역형성 신경아교종이 있는 환자에게 제공될 때 일부 개선된 치료적 활성이 있는 반면에, 테모졸로마이드-저항성 다형상 교모세포종이 있는 환자에서 테모졸로마이드 감수성의 상당한 회복은 없는 것으로 보였다.
4. 조합 치료
일 구현예에서, 2,4-ds-PBN 요법 (선택적으로 TMZ를 포함함)은 또 다른 신경아교종 요법, 예컨대 방사선, PCV, DFMO, CCNU 또는 BCNU와 공조하여 사용될 수 있다. 이들 조성물은 세포의 증식을 사멸시키거나 억제하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 것이다. 이 과정은 세포를 제제와 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 세포를 두 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리적 제형과 접촉시키거나, 또는 세포를 2개의 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있으며, 여기서 하나의 조성물은 2,4-ds-PBN을 포함하고 다른 하나는 제2 제제를 포함한다.
대안적으로, 2,4-ds-PBN 요법은 수분 내지 수주의 범위인 간격으로 다른 제제 치료에 선행하거나 후속할 수 있다. 다른 제제 및 2,4-ds-PBN이 세포, 조직 또는 유기체에 별도로 적용되는 구현예에서, 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 상당한 시간이 만료되지 않도록 하여 제제가 여전히 세포에 대해 유익하게 조합된 효과를 발휘할 수 있게 하는 것을 보장할 수 있다. 그와 같은 사례에서, 서로 약 12-24시간 내에, 그리고 더 바람직하게는 서로 약 6-12시간 내에 두 방식으로 세포를 접촉시킬 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 치료를 위한 기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있지만, 그러나, 여러 날짜 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 여러 주일 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)의 각각의 투여 사이에 경과한다.
각각의 제제의 다중 투여가 고려된다. 예를 들어, 2,4-ds-PBN 요법 (선택적으로 TMZ 또는 다른 AGT 억제제를 포함함)이 “A"이고 2차 제제 또는 요법이 “B"인 경우 하기가 고려된다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자는 종양과 무관한 것으로 간주된 신경적 변화에 대해 평가될 것이고 NCI 공통 독성 기준 (신경독성)을 사용하여 등급이 매겨진다. 기준선 청력측정 검사 외에, 신경적 시험에 의해 청력 상실의 증거 또는 청력 상실의 진행이 있는 환자에 대한 의사의 재량에 따라 귀독성에 대한 반복적 청력측정 시험이 수행된다. 또한, 혈액 계수는 격주로 수행되고, 혈청 크레아티닌, 알칼리성 포스파타제, 빌리루빈 및 알라닌 아미노-전달효소 테스트는 각각의 주기 전에 수행된다. 용량은 주로 중성구 및 혈소판 수 (빈크리스틴, 로무스틴 및 마툴란) 또는 귀독성 (DFMO)에 기초하여 치료의 과정 도중에 변형될 수 있다. 가끔, DFMO 용량 감소가 설사에 대해 필요하다.
A. PCV
PCV는 3가지 상이한 제제 - 하이드라진 유도체인, 마툴란, 니트로소우레아인, 로무스틴, 및 튜불린 상호작용제인, 빈크리스틴을 사용하는 약물 조합 요법이다. 그것은 수많은 임상시험에서, 가장 현저히는 본 발명자에 의해 고-등급 신경아교종 및 수모세포종 종양에 대해 그것의 효과를 평가하는데 사용되었다. PCV로 관측된 주요 부작용은 용량- 제한 골수독성이었다. PCV의 각각의 성분은 하기에 기재되어 있다.
본 발명은 CCNU (로무스틴)보다는 BCNU의 사용을 포함할 수 있는데 이는 둘 모두가 니트로소우레아이기 때문이다는 것에 유의해야 한다. 빈크리스틴은 일반적으로 PCV 조합에서 약물의 활성이 가장 적은 것으로 간주되기 때문에 빈크리스틴 없이 CCNU 및 프로카바진 또는 BCNU 및 프로카바진을 사용할 수 있는 것이 또한 고려된다.
하이드라진 및 니트로소우레아 둘 모두는 알킬화제이다. 그룹으로서, 알킬화제는 세포 DNA, RNA 및 단백질 분자와 그리고 더 작은 아미노산, 글루타티온 및 유사한 화학물질과 공유 화학적 부가물을 형성한다. 일반적으로, 이들 알킬화제는 핵산, 단백질, 아미노산, 또는 글루타티온에서 아미노, 카복실, 포스페이트, 설프하이드릴 기와 같은 세포 구성성분에서 친핵성 원자와 반응한다. 암 요법에서 이들 알킬화제의 기전 및 역할은 잘 이해되지 않는다. 하이드라진 및 니트로소우레아에 부가하여, 알킬화제는 하기를 포함한다: 트리아젠 예컨대 다카라브진 및 테모졸로마이드, 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 사이클로포스파마이드, 이소파미드, 메클로르에타민, 멜팔란, 우라실 머스타드; 아지리딘 예컨대 티오테파; 메탄설포네이트 에스테르 예컨대 부설판; 백금 착물 예컨대 시스플라틴, 카보플라틴; 생체환원 알킬화제, 예컨대 미토마이신 및 알트레테민.임의의 이들 화합물은 본 발명의 화합물과 조합하여, 함께 또는 개별적으로 사용될 수 있다.
i. 하이드라진 및 트리아젠 유도체
하이드라진 및 트리아젠 유도체는 자발적으로 분해하거나 또는 대사작용되어 DNA를 알킬화하는 알킬 카보늄 이온을 생산한다는 점에서 니트로소우레아에 유사하다. 이러한 부류의 화합물은 마툴란, 다카바진 및 테모졸로마이드를 포함한다.
마툴란에서 활성 성분은 프로카바진 하이드로클로라이드 (N-이소프로플-알파-(2-메틸히드라지노)-p-톨루아미드 모노하이드로클로라이드)이다. 이것은 Roche Laboratories, Inc로부터 이용가능하다. 이것은 호지킨 질환의 치료를 위해 1969년에 승인되었다. 전형적인 형태는 하이드로클로라이드로 50 mg 프로카바진을 함유하는 경구 캡슐이다. 투약량은 프로카바진이 다른 항암 약물과 조합 약물로 사용되는지 또는 단일 치료제로 사용되는지 여부에 따라 다양하다. 단일 제제 사용에 대해 PDR당 제안된 지침은 14일 동안 매일 2회 100 mg이다.
마툴란의 정확한 작용 방식은 명확하지 않다. 약물이 단백질, RNA 및 DNA 합성의 억제에 의해 작용한다는 일부 증거가 있다. 이것은 주로 간 및 신장에서 대사작용을 받고 과산화수소의 방출로 아조 유도체로 자가-산화되는 것으로 나타난다. 아조 유도체는 하이드라존으로 이성질화되고 그리고 가수분해에 따라, 벤질알데하이드 유도체 및 메틸하이드라진으로 분리된다. 메틸하이드라진은 CO2 및 CH4, 그리고 가능하게는 하이드라진으로 추가로 분해되고, 반면에 알데하이드는 소변으로 배출되는 산으로 산화된다.
마툴란은 모나민 옥시다제 억제 활성 (MAOI)을 나타내고, 그래서 높은 타이라민 함량을 함유한 식품을 제한하는 다이어트가 따라야 한다. 요법 동안 피해야 하는 약물은 항히스타민제, 교감신경모방, 바르비투레이트, 마약, 저혈압 제제 또는 페노티아진, 및 에틸 알코올을 포함한다. 일부 식품 예컨대 자연적으로 에이징된 치즈, 초콜릿, 견과류, 및 바나나는 이론적으로 일부 환자에서 고혈압 합병증으로 이어질 수 있기 때문에 프로카바진 동안에 또한 피해야 한다. 또한, 마툴란이 신장 및/또는 간 기능의 손상이 있는 환자에게 사용된 경우 허용될 수 없는 독성이 발생할 수 있다. 치료는 중추신경계 징후 또는 증상 예컨대 지각이상증, 신경병증 또는 혼란; 호중구감소증 (절대적인 중성구 수 1500/㎕ 미만), 혈소판감소증 (혈소판 100,000/㎕ 미만), 과민증 반응, 구강 주변의 궤양 또는 쓰라림의 지속적 반점, 설사 또는 무른 대변, 출혈 또는 출혈 경향의 경우에 단축될 수 있다.
부정적이지만 기대된 반응은 백혈구감소증, 호중구감소증, 빈혈, 및 혈소판감소증을 포함한다. 통상적으로 보고된 급성 부작용은 용량 투여 동안 또는 직후 메스꺼움 및 구토이다.
ii. 니트로소우레아
니트로소우레아는 치료적 알킬화 제제의 군을 대표한다. 이러한 부류의 화합물은 로무스틴, 카무스틴, 세무스틴, 스텝토조신, 및 니무스틴을 포함한다.
(a) 로무스틴
로무스틴은 1-(2-클로로에틸)-3-사이클로헥실-1-니트로소우레아의 화학명을 가지는, CCNU로도 알려져 있는 합성 알킬화제이다. 이것은 뇌종양 및 호지킨 질환의 치료를 위해 1977년에 승인되었다. 이것은 경구 캡슐로 Bristol Myers Squibb으로부터 이용가능하고, 10 mg, 40 mg 및 100 mg 형태로 이용가능하다. 투약량은 로무스틴이 단일 제제 또는 다른 화학치료제에 첨가하여 조합으로 사용되는지 여부에 의존하여 다양할 수 있다. 이전에 미처리된 환자에서 단일 제제로, PDR당 권고된 투약량은 6주 마다 단일 경구 용량으로 130 mg이다. 로무스틴은 혈액 뇌 장벽을 가로지른다.
CCNU는 DNA 및 RNA를 알킬화하는 것으로 여겨진다. 이것은 다른 니트로소우레아 및 일부와 교차-저항성이지만 모든 알킬화제와 그렇지는 않다. 이것은 또한 단백질에서 아미노산의 카바모일화에 의해 몇 개의 핵심 효소 과정을 억제할 수 있다.
가장 흔하고 심각한 독성 부작용은 혈소판감소증 및 백혈구감소증으로 이어지는 골수 억제이고, 이것은 출혈 및 감염에 기여할 수 있다. 골수 독성은 누적적이고 따라서 투약량 조정은 이전 용량으로부터 최저점 혈액 계수를 기준으로 고려되어야 한다.
(b) 카무스틴
N,N'-비스(2-클로로에틸)-N-나이트로수레아의 화학명을 가지고, BCNU로도 알려져 있는, 카무스틴은 1977년 FDA에 의해 승인된 나이트로수레아 알킬화제이다. 카무스틴은 여러 해 동안 원발성 뇌 종양의 치료를 위해 사용되었고 신경아교종의 치료를 위해 사용되고 있다. 카무스틴은 10 mg 카무스틴의 바이알 및 i.v. 주사에 의한 전달을 위한 3 ml 멸균 희석제를 함유하는 패키지로 Bristol Meyers Squibb으로부터 이용가능하다. 단일 제제로 카무스틴은 6주 마다 약 150-200 mg/m2 으로 투여된다. 조합 레지멘에서, 카무스틴은 로무스틴에 유사한 방식으로 주어질 수 있다. 대안적인 전달 방식은 종양 부위 안으로 직접적으로 이식된 웨이퍼 (Gliadel® 웨이퍼)에 의한다.
잠제적인 부작용은 골수 억제, 빈혈, 설사, 낮은 백혈구 및 혈소판 수, 폐 독성 및 삼키기 어려움을 포함한다.
iii. 튜불린 상호작용제
튜불린 상호작용제는 세포 미세소관을 형성하도록 중합되는 단백질인 튜불린 상의 특정 부위에 결합함에 의해 세포 분열을 방해한다. 미세소관은 중요한 세포 구조 단위이다. 본 상호작용제가 단백질 상에 결합하는 경우, 세포는 적절하게 미세소관을 형성할 수 없다. 튜불린 상호작용제는 빈크리스틴 및 빈블라스틴, 알칼로이드 및 탁산 둘 모두, 예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다.
빈크리스틴은 Eli Lilly & Company로부터 OncovinTM으로, 그리고 Faulding으로부터 빈크리스틴 설페이트로 이용가능하다. 또한 소위 빈카류코블라스틴인, 22-옥소-, 설페이트 (1:1) (염)으로 알칼로이드의 염은 일반적인 개화 허브인 빈카 식물로부터 수득했다. 이것은 정맥내 주사에 의해 전달된다. 이것은 표지상에 유잉 육종, 횡문근육종, 윌름스 종양, 신경교세포종, 호지킨 질환 및 백혈병에 대한 것으로 1963년에 승인되었다.
작용 기전은 조사 하에 있지만; 그러나, 유사기 상태에서 분열 세포의 정지를 초래하는 유사분열 스핀들에서의 미세소관 형성의 억제가 관여된다는 조짐이 있다. 간은 주요 배설 장기이다. 빈크리스틴의 대부분의 정맥내 용량은 신속한 조직 결합 후 담즙으로 배출된다. 빈크리스틴은 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것으로 보이지 않는다.
빈크리스틴은 항발작 약물의 혈중 농도를 감소시키고 발작 활성을 증가시키는 것이 보고되었다. 가장 흔한 역반응은 탈모이다. 백혈구감소증, 신경증의 통증 및 변비가 발생하지만, 일반적으로 7일 미만 동안이다.
B. DFMO
수많은 고도로 증식성 암의 유형은 암이 있는 포유동물의 혈액 및 소변과 종양 조직에서 폴리아민 푸트레신, 스페르미딘, 및 스페르민의 증가된 수준과 연관된다. 연구는 이것이 속도-제한 효소인, 오르니틴 탈탄산효소 (ODC)에 의한 폴리아민 합성 증가와 관련될 수 있음을 보여주었다. 폴리아민 합성에 대한 경로는 L-오르니틴으로 시작한다. 이 천연 아미노산은, 비록 정상적으로 단백질 안으로 편입되지는 않지만, 아르기닌을 오르니틴 및 우레아로 대사작용하는 요소 대사의 일부이다. 오르니틴은 오르니틴 탈탄산효소 (ODC)에 의해 푸트레신 및 CO2로 전환되고 폴리아민의 생산에서 속도-제한 단계인 것으로 간주된다. S-아데노실메티오닌으로부터 증여된 프로필아민의 첨가로, 푸트레신은 스페르미딘으로 전환된다. 스페르미딘은 그 다음 스페르민 합성효소에 의해 스페르민으로 전환되고, 다시 S-아데노실메티오닌의 탈카복실화와 회합한다. 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민은 포유동물 조직에서 3가지 주요 폴리아민을 나타낸다. 폴리아민은 동물 조직 및 미생물에서 발견되고 세포 성장 및 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 세포 성장 및 증식에서 폴리아민의 역할의 정확한 기전은 알려져 있지 않지만, 폴리아민이 거대분자적 과정 예컨대 DNA, RNA, 또는 단백질 합성을 촉진할 수 있는 것으로 보인다. 폴리아민 수준은 고환, 복부 전립선, 및 가슴샘에서, 건선성 피부 병변에서, 그리고 신속한 성장 과정에 있는 다른 세포에서 높은 것으로 알려져 있다.
종양 조직의 신속한 증식은 폴리아민 수준의 비정상 상승에 의해 현저하게 된다는 것이 또한 잘 알려져 있다. 그러므로, 폴리아민은 또한 종양 성장의 유지에서 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, ODC 억제제, 예컨대 DFMO는 폴리아민의 형성을 차단하고, 그것에 의해 종양 조직의 증식 및 전이를 늦추거나, 차단하거나, 또는 중단시킴에 의해 그것의 치료 효과를 발휘할 수 있다.
DFMO (α-디플루오로메틸오르니틴, 에플로니틴, Ornidyl®)은 아미노산 L-오르니틴의 구조 유사체이고 화학식 C6H12N2O2F2을 갖는다. DFMO는 D- 및 L-거울상이성질체의 라세미 (50/50) 혼합물, 또는 D- 및 L-이성질체의 혼합물로서 본 발명의 방법에서 이용될 수 있고 여기서 D-이성질체는 L-이성질체에 비하여 풍부하고, 예를 들어, L-이성질체에 비하여 D-이성질체의 중량으로 70%, 80%, 90% 또는 그 초과이다. 이용된 DFMO는 또한 L-거울상이성질체가 실질적으로 없을 수 있다.
DFMO의 용량 제한 독성 효과는 환자의 약 50%에서 발생하는 혈소판감소증 (혈액에서 비정상적으로 적은 혈소판), 백혈구감소증 (비정상적으로 적은 백혈구), 또는 빈혈이다. 이 독성 효과는 상대적으로 무해하고 가역적이며 약물의 철회에 의해 중단된다.
빠르게 증식하는 종양 조직의 성장률의 제어에 대한 ODC 억제제의 효과는 표준 동물 종양 모델에서 평가되었다. 예를 들어, DFMO의 항종양 효과는 하기 동물 종양 모델에서 실증되었다: 마우스에서 L1210 백혈병, Balb/C 마우스에서 EMT6 종양, 랫트에서 7,12-디메틸벤즈안트라센-유도된 (DMBA-유도된) 유선 종양, 및 버팔로 랫트에서 DFMO Morris 7288C 또는 5123 간종양. 또한, 다양한 세포독성 약물과 조합한 DFMO의 항종양 효과는 아래와 같이 실증되었다: (a) 빈데신 또는 아드리아마이신과의 조합으로 마우스에서 L1210 백혈병, 버팔로 랫트에서 Morris 7288C 간종양, 및 마우스에서 EMT6 종양, (b) 시토신 아라비노시드와의 조합으로 마우스에서 L1210 백혈병, (c) 메토트렉세이트와의 조합으로 마우스에서 L1210 백혈병, (d) 사이클로포스파마이드와의 조합으로 마우스에서 EMT6 종양 및 마우스에서 DMBA-유도된 종양, (e) BCNU와의 조합으로 마우스 신경아교종 26 뇌종양, 및 (f) MGBG와의 조합으로 마우스에서 L1210 백혈병, 버팔로 랫트에서 Morris 7288C 간종양, 마우스에서 P388 림프구성 백혈병, 및 마우스에서 S-180 육종.
비록 DFMO가 효과적으로 종양 푸트레신 생합성을 차단할 수 있지만, 수득한 항종양 효과는 세포증식억제이고, 세포독성이 아니다. 예를 들어, DFMO는 MCA 육종의 성장률을 감시시키지만, 종양 퇴화를 생성하지 않는다. 이 발견은 DFMO가 세포증식억제제이다는 것을 나타낸 다른 조사자의 보고서와 일치한다. 그러나, 연구는 DFMO 제제에 대해 중요한 역할이 존재할 수 있으며, DFMO를 포함하는 조합 화학요법적 레지멘의 미래 개발을 허용한다는 것을 나타낸다.
다양한 신조직형성의 치료에 사용하기위한 치료적 ODC 억제제로서 DFMO의 초기 약속은 비록 DFMO가 사실상 ODC 활성을 비가역적으로 억제하지만, DFMO로 생체내 처리된 세포는 하기에 기재된 바와 같이 그것의 외인성 푸트레신의 흡수를 현저하게 증가하기 때문에 어느 정도 암울했다: 미국특허 4,925,835. 세포의 세포간 수송 메커니즘은 세포외 환경으로부터 푸트레신을 입수함에 의해 DFMO-손상된 ODC 활성 주위에서 "최종 실행"을 수행한다. 따라서, 생체내 DFMO의 효과는 시험관내보다 훨씬 나쁘다. 따라서, DFMO 처리는 세포내 푸트레신 신생을 효과적으로 억제하는 한편, 세포외 푸트레신의 증가된 흡수를 또한 초래하고 그것에 의해 그것의 ODC 억제성 효과를 상쇄시킨다.
이 문제는 푸트레신이 대략 400 ppm의 푸트레신을 함유하는 자몽 쥬스와 같은 많은 일반적인 식품에 존재한다는 사실에 의해 구성된다. 이것은 환자에게 푸트레신이 없는 영양학적으로 충분한 식이를 제공하는 것을 사실상 불가능하게 만든다. 따라서, DFMO-처리된 세포는 세포 분열을 지지하기에 충분한 양의 세포외 푸트레신을 입수할 수 있다.
DFMO를 인간 환자에게 보다 허용가능하게 만드는 전략은 하기에서 기재되어 있다: 미국특허 4,859,452 (참고로 편입됨). DFMO-유도된 독성을 감소시키는데 도움이 되도록 아르기닌 또는 오르니틴 중 어느 하나와 조합하여 필수 아미노산을 포함하는 DFMO의 제형이 기재되어 있다.
C. O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜퍼라제 억제제
O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜퍼라제 (AGT)는 억제성 약물 예컨대 테모졸로마이드에 대한 표적이다. 다른 AGT 억제제가 또한 개시된 방법에 따라 유용한 것으로 입증될 수 있다.
D. 방사선
DNA 손상을 유발하고 암 요법에 광범위하게 사용되고 그리고 통상적으로 종양 세포로의 γ-선, X-선 및/또는 방사성 동위원소의 지향된 전달로 알려진 것들을 포함하는 인자.다른 형태의 DNA 손상 인자 예컨대 마이크로웨이브 및 UV-조사가 또한 고려된다. 이들 인자의 모두는 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 회복, 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 미칠 공산이 가장 크다. X-선의 투약 범위는 장기적인 기간 (3 내지 4 wk) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 일일 용량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성 동위원소의 투약 범위는 광범위하며 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물성 세포에 의한 흡수에 의존한다. 세포에 적용될 때 용어들 “접촉된" 및 “노출된"은 치료적 작제물 및 화학요법적 또는 방사선요법 제제가 표적 세포로 전달되거나 표적 세포와 직접적인 병치로 배치되는 과정을 설명하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 달성하기 위해, 양 제제는 세포를 사멸시키거나 세포가 분열하는 것을 방지하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.
E. 수술
암 환자의 대략 60%가 예방적, 진단 또는 병기결정, 치료 및 일시적 처방 수술을 포함한 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 암 치료로서 치료적 수술은 다른 요법, 예컨대 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대안적인 요법과 공조하여 사용될 수 있다. 치료적 수술은 암성 조직의 모두 또는 일부가 물리적으로 제거, 절단, 및/또는 파괴되는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제에 부가하여, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 냉동외과수술, 전기외과수술, 및 현미경적으로 제어된 수술 (Mohs의 수술)을 포함한다. 본 발명은 표면 암, 전암, 또는 부수적 양의 정상 조직의 제거와 공조하여 사용될 수 있는 것이 추가로 고려된다.
5. 리포사카라이드 결합 단백질
A. LBP
리포폴리사카라이드 결합 단백질은 인간에서 LBP 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. LBP는 박테리아 리포폴리사카라이드 (또는 LPS)에 결합하여 CD14 및 TLR4로 불리는 중요한 세포 표면 패턴 인식 수용체에 LPS를 제시함으로써 면역 반응을 유도하는 가용성 급성기 단백질이다. 이 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 급성기 면역적 반응에서 그램-음성 박테리아 감염에 대해 관여된다. 그램-음성 박테리아는 그것의 외부 세포벽 상에 당지질인, 리포폴리사카라이드 (LPS)를 함유한다. 살균 투과도-증가 단백질 (BPI)과 함께, 인코딩된 단백질은 LPS에 결합하고 CD14 수용체와 상호 작용하여, 아마도 LPS-의존적 단핵구 반응을 조절하는데 역할을 한다. 마우스에서의 연구는 인코딩된 단백질이 LPS에 대한 신속한 급성기 반응에 필요하지만 순환으로부터 LPS의 청소능에는 필요하지 않다는 것을 시사한다. 이 단백질은 BPI, 혈장 콜레스테릴 에스테르 운반 단백질 (CETP), 및 인지질 운반 단백질 (PLTP)을 포함한 구조적으로 그리고 기능적으로 관련된 단백질 계열의 일부이다. 이 유전자는 BPI 유전자의 바로 다운스트림에서 염색체 20 상에서 발견된다. 리포폴리사카라이드-결합 단백질은 CD14, TLR2, TLR4 및 공-수용체 MD-2와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.
B. LBP 콘주게이트 및 이미지형성
본 발명자들에 의해 여기에서 처음 보고된 바와 같이, LBP 수준은 저-등급 신경아교종으로 분류된 종양과 비교하여 고-등급 인간 환자 신경아교종에서 상승된다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 진단 방법에 따라 사용하기 위한 LBP 콘주게이트는 형광 라벨, 방사성 라벨 및 조영제에 연결된 LBP의 진단 콘주게이트를 포함한다. 이들 콘주게이트는 대상체에게 투여될 수 있고 신체 내, 특히 신경아교종 부위에서 그것의 존재는 소형 형광 스캐너, 근적외선 스캐너, MRI 디바이스, 및 PET 스캐너를 사용하여 결정될 수 있다. 이 접근법은 또한 치료적 이점을 나타내는 LBP 수준에서의 감소로 치료의 효능을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
6. 약제학적 제형
본 발명은 본 발명의 특정 양태에서 동물에게 투여되는 수많은 조성물을 개시한다. 예를 들어, 2,4-ds-PBN뿐만 아니라 다양한 이차 화학치료제가 투여를 위해 제형화될 것이다. 임상 적용이 고려되는 경우, 이들 화합물 및 조성물의 약제학적 조성물을 의도된 적용에 적합한 형태로 제조할 필요가 있을 것이다. 일반적으로, 이것은 본질적으로 발열원이 없는 조성물뿐만 아니라 인간 또는 동물에게 유해할 수 있는 다른 불순물을 제조하는 것을 수반할 것이다.
일반적으로 제제를 환자에게 도입하기에 적합하게 하는 적절한 염 및 완충액을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 수성 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해 또는 분산된 제제의 유효량을 포함한다. 어구 “약제학적으로 또는 약리적으로 허용가능한"은 동물 또는 인간에게 투여될 때 부정적이거나, 알러지성, 또는 다른 유해한 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 및 기타 동종의 것을 포함한다. 약제학적으로 활성 서브스턴스에 대한 이와 같은 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본 발명의 벡터 또는 세포와 양립불가능한 것을 제외하고, 치료적 조성물에서의 그것의 사용이 고려된다. 보충의 활성 성분, 예컨대 다른 항암제가 또한 조성물에 편입될 수 있다.
유리 염기 또는 약리적으로 허용가능한 염으로서 활성 성분의 용액은 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충물을 포함한다. 보존제는 항미생물제, 산화방지제, 킬레이트제 및 불활성 가스를 포함한다. 약제에서 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘-알려진 파라미터에 따라 조정된다.
제제의 유효량은 의도된 목표에 기초하여 결정된다. 용어 “단위 용량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 그의 투여, 즉, 적절한 경로 및 치료 레지멘과 조합하여 원하는 반응을 생성하도록 계산된 치료적 조성물의 사전결정된 양을 함유한다. 치료의 횟수 및 단위 용량 둘 모두에 따라 투여되는 양은 치료될 대상체, 대상체의 상태 및 원하는 보호에 따라 좌우된다. 치료적 조성물의 정밀량은 또한 종사자의 판단에 의존하고 각각의 개체에 대해 기이하다.
A. 장관 투여
본 발명의 활성 화합물은 유익하게는 장관 투여를 위해 제형화될 수 있고, 예를 들어, 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 약제학적 형태는 정제 알약 및 캡슐을 포함한, 섭취가능 조성물의 즉석 제조를 위해 참께 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜; 및 멸균 분말을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 작용제는 식품 첨가물의 형태로 제공될 수 있고 매일 식이 프로그램에 포함될 수 있다는 것이 고려된다. 이들 모든 형태는 일반적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균되고 안정되도록 선택된다.
활성 화합물은 중성 또는 염 형태인 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 (단백질의 유리 아미노기로 형성된) 그리고 무기 산 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산, 및 기타 동종의 것으로 형성된 산 부가 염을 포함한다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기 예컨대, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 제이철 하이드록사이드, 및 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 및 기타 동종의 것으로부터 유래될 수 있다.
담체는 또한 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타 동종의 것), 적합한 이들의 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유체성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에 요구된 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균성 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 및 기타 동종의 것에 의해 초래될 수 있다. 많은 사례에서, 등장제, 예를 들어, 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주입가능 조성물의 장기적인 흡수는 조성물에 흡수를 지연하는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
멸균 주입가능 용액은 적절한 용매에서 요구된 양의 활성 화합물을, 요구되는 바와 같이, 상기에 열거된 다양한 다른 성분과 혼합하고 이어서 여과 멸균함에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산매 및 상기 열거된 것으로부터 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함에 의해 제조된다. 멸균 주입가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 특정한 제조 방법은 진공-건조 및 냉동-건조 기술이며, 이는 활성 성분의 분말에 더하여 이전에 이들의 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 생성한다.
B. 다른 투여 경로
장관 투여를 위해 제형화된 화합물에 부가하여, 정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구 제형이 구상된다. 투여는 또한 비강, 볼, 직장, 질 또는 국소일 수 있다. 대안적으로, 투여는 진피내, 피하, 또는 복강내 주사에 의할 수 있다. 또한 카테터를 통한 연속적 관류가 고려된다. 이러한 조성물은 상기 기재된 약제학적으로 허용가능한 조성물로 정상적으로 투여될 수 있다.
7. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예들을 입증하기 위해 포함된다. 이어지는 실시예에서 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 그것의 실시를 위해 구체적으로 고려되는 방식을 구성하는 것으로 간주 될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는, 본 개시내용에 비추어, 개시된 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 같거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 인정해야 한다.
실시예 1 - 도입 및 연구 설계
누드 마우스에서 동소이식 G55 인간 GBM 이종이식은 발명자가 이전의 공개물에서 사용하였던 확립된 GBM 모델이고 그 그룹에서 사용을 계속한다. 이 모델은 매우 공격적인 GBM에 필적한다. 이 모델에 대해, 본 발명자는 미처리된 동물, 뿐만 아니라 TMZ-처리된 동물에 대한 동물 생존, 종양 부피 및 혈관 관류 데이터에 대한 이전의 데이터를 가지고 있다. 그는 또한 G55 세포가 TMZ-저항성인 것을 나타내는 예비 데이터를 가지고, 따라서 이 발견은 TMZ-저항성에 대한 이상적인 이종이식 모델로서 이들 세포의 사용을 추가로 지지한다.
본 발명자는 4개 처리 그룹으로 연구 수행했다. 두 그룹의 경우, 본 발명자는 그룹당 최소 5마리 동물을 필요로 했다. 이들은 OKN 단독, 및 OKN + TMZ 그룹이었다. 다른 두 그룹 (미처리된 그리고 TMZ 단독)의 경우, 본 발명자는 각각에 대해 5마리의 그룹을 구성하는 기존의 데이터를 포함하였고, 수행된 연구에 2마리의 미처리 및 2마리의 TMZ를 포함시켰다. 　
본 발명자는 치료 반응을 평가하기 위해 사용된 종양 부피를 수득하기 위해 MRI 사용하였다. 또한 종양 혈관질에 대한 치료의 효과를 평가하기 위해 혈관 관류 데이터를 수득했다. 종양 혈관 관류 속도 (상대적인 뇌 혈류 또는 rCBF로 측정됨)는 관류 이미지로부터 계산된다. 종양 혈관 관류 속도는 혈관신생에 기인한 비조직된 맥관구조로 인해 미처리된 종양에서 줄어든다. rCBF에서 정규화된 차이로부터, 이것은 rCBF에서 실질적인 변화를 초래할 것이다. 항-암 치료를 통한 종양 혈관 관류 속도의 회복은 항-혈관신생 효과를 나타낼 수 있다. rCBF에서 정규화된 변화로부터, 치료 효과가 종양 맥관구조에 영향을 미친 경우 이것은 rcBF에서 비교적 작은 차이를 초래할 것이다. 본 발명자는 또한 동물 생존 퍼센트를 평가했다. MRI 연구에 대해, 그는 초기에 최소 3개의 시점이 미처리된 그룹에 대해 필요하고, 처리된 동물이 MRI로 종양 성장 및 혈관 변화를 평가하기 위해 적어도 5개의 시점이 필요한 반면, 실제로는 본 발명자는 양성 처리 반응으로 인해, 미처리된 마우스에 대해 적어도 5개 시점 및 처리된 마우스에 대해 10개 이상의 시점을 수득했다는 것을 나타냈다.
본 발명자는 또한 랫트 F98 신경아교종-담지 랫트 (ELISA에 의해 평가됨)의 종양, 및 GBM 인간 조직 샘플 (면역조직화학에 의해 평가됨)에서 상승된 잠재적 바이오마커인, LBP (리포폴리사카라이드 결합 단백질)를 발견했다. 이 바이오마커는 미처리된 종양이 높은 수준의 LBP를 갖는 랫트 F98 신경아교종 모델로부터의 마이크로어레이 데이터로부터 발견되었고, 그리고 OKN-007 처리는 LBP에 대한 유전자 발현에서 >2-배수 감소를 가졌다. 또한 랫트 F98 신경아교종 모델에서, OKN-007은 미처리된 종양-담지 동물에 비교할 때 종양 조직 (p<0.0001) 및 혈청 (p<0.001) 둘 모두에서 LBP 단백질 수준 (ELISA에 의해 평가됨)을 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자는 LBP에 대한 ELISA 키트를 사용하여 미처리되거나 또는 TMZ, OKN-007 또는 TMZ + OKN-007로 처리된 종양 조직 및 혈청 둘 모두에서 G55-종양-담지 마우스 양자에서 효능 마커로서 이 바이오마커를 평가하였다.
실시예 2 - 방법
세포 배양. G55 세포는 하기로부터 수득했다: Dr. Michael E.Sughrue (오클라호마 대학 보건 과학 센터). G55 세포는 10% 코스믹 송아지 혈청 (CCS; HyClone, Logan, UT) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM (LifeTechnologies, Waltham, MA)에서 배양하였다.
마우스 및 처리. 동물 연구는 NIH 지침에 따르는 OMRF IACUC (동물실험 윤리 위원회)에 따라 수행되었다. 2-월령 수컷 누드 마우스 (Hsd: 무흉선 누드-Foxn1nu 마우스; Harlan Inc., Indianapolis, IN)를 1% 아라고스 용액의 세포 배양 배지 내 4 μL에 현탁된 mL 당 인간 G55 이종이식 세포 (1 x 107)로 뇌 내로 이식하였다. 종양이 10-15 mm3 (MRI를 통해 결정됨)에 도달되면, 마우스를 OKN-007 (150 mg/kg; 계속해서 음용수를 통함) 또는 TMZ (30 mg/kg 매 3 일 위관영양법을 통함) 중 어느 하나로 매 3 일 처리했다. TMZ을 멸균 염수에서 5% DMSO 및 5% 솔루톨-15에 용해시켰다. 마우스는 MRI에 의해 종양이 100-150 mm3에 도달될 때까지 또는 종양이 검출된 후 (>5 mm3) 총 최대 60일 동안 처리되었다.
MRI. MRI 실험은 Bruker Bio-spec 7.0 Tesla/ 30-cm 수평-보어 자석 이미지형성 시스템 상에서 수행되었다. 동물은 1.5-2.5% 이소플루란 및 0.8 L/min O2를 사용하여 고정시키고 신호 전송을 위해 72-mm 직교 용적 코일에 배치하고, 표면 마우스-헤드 코일을 신호 수신을 위해 사용하였다. T2-계량된 이미지형성을 수득하고, 종양 부피는 MRI 데이터세트로부터 계산하였다.
관류 영상. 종양 모세관과 연관된 미세혈관 변경을 평가하기 위해, 관류 영상 방법, 동맥 스핀 표지화 (ASL)가 사용되었다. 관류 지도는 종양이 최대 단면을 갖는 로스트로-꼬리 축의 지점에 위치한 뇌의 단일 축 슬라이스에서 수득되었다. 종양 주위에 5개 관심 영역 (ROI)이 수작업으로 설명되고, 비교하기 위해 뇌의 반대쪽 측면으로부터 적절한 ROI를 또한 취하였다. rCBF 값에서 차이를 계산하기 위해, 종양 rCBF 값은 나중 (미처리된 마우스에 대한 세포의 뇌내 이식 후 18-26일째) 및 초기 (세포 이식 후 10-13일째) 종양 단계에서 수득되어 지고, 상응하는 동물의 반대측 뇌 영역에서의 rCBF 값으로 정규화되었다.
리포폴리사카라이드 결합 단백질 (LBP) ELISA 검정. LBP ELISA 키트 (Antibodies-Online.com; ABIN370808)는 혈청, 혈장 및 조직 샘플에서 마우스 LBP 수준에 대해 특이적이다. 이것은 450/620 nm에서 흡광도의 측정을 위한 마이크로 플레이트 리더에서 판독된 비색계 검정이다. LBP 농도는 표준 곡선으로부터 계산하고 적절한 희석 인자를 곱하였다.
통계적인 분석. 생존 곡선은 카플란-마이어 곡선을 사용하여 분석하였다. 종양 부피, 정규화된 rCBF에서의 변화, 및 LBP 수준은 다중 비교로 2-웨이 ANOVA로 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타냈으며, *0.05, **0.01, ***0.001, 및 ****0.0001 중 어느 하나의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 3 - 결과
동물 생존 (도 1 참고). 동물 생존 퍼센트 데이터는 병용 요법 (OKN-007 + TMZ)-처리된 마우스의 60%가 종양 검출 후 60일 동안 살아 남았고 50일 이상 동안 처리된 것으로 나타났다. OKN-007-처리된 마우스 중 하나 (처리된 마우스 중 20%)가 또한 종양 검출 후 60일 동안 살았다. 통계적인 분석은 모든 처리된 마우스 (OKN-007 단독, TMZ 단독 또는 병용 요법)는 미처리된 (UT) G55 신경아교종-담지 마우스에 비교할 때 생존 퍼센트에서 유의미한 증가가 있는 것으로 밝혀졌다는 것을 나타냈다. 병용 요법 마우스는 TMZ-처리된 마우스보다 상당히 더 긴 생존을 하였다는 것이 또한 밝혀졌다. OKN-007-처리와 병용 요법 마우스 사이에는 유의성이 없었다. 동물 그룹 수가 더 컸다면, 이들 두 그룹 사이에 p-값이 0.07이므로, OKN-007-처리와 병용 요법 마우스 사이에 유의차가 수득될 수 있다.
종양 부피 (도 2-4 참고). 종양 부피는 UT 마우스가 안락사될 때, 즉, 종양 부피가 150 mm3 또는 그 초과에 도달했을 때 (종양 검출 후 19-22일차)에 동일한 기간뿐만 아니라 각각의 처리 그룹에 대해 마지막 시점에서 비교하였다. 종양 검출 후 19-22일차에서, TMZ, OKN-007 또는 병용 요법으로 처리된 마우스는 UT 마우스와 비교할 때 종양 부피가 상당히 감소된 것으로 전부 밝혀졌다 (도 2). 처리된 마우스 중 어느 것도 종양 부피에서 서로 유의하게 다른 것으로 밝혀지지 않았지만, 병용 요법은 TMZ- 또는 OKN-007-처리된 마우스와 비교할 때 가장 낮은 종양 부피 평균을 가졌다. 샘플 크기가 작기 때문에 (n=5), 동물 수가 증가하면 처리 그룹 간에 유의한 차이가 있을 수 있다. TMZ 그룹은 본 발명자가 그가 수행한 다른 두 가지 연구에서도 관찰했던 큰 차이를 가졌다. 종양 (중간-종양 영역)을 묘사하는 대표적인 MR 이미지는 또한 조사된 각각의 처리 그룹에 대해 나타나 있다 (도 3). 각각의 처리 그룹에 대한 마지막 시점에서, TMZ 및 병용 요법 그룹에 대한 종양 부피는 UT 마우스와 비교할 때 상당히 더 작은 것으로 밝혀졌다 (도 4). OKN-007-처리된 그룹에서 큰 차이로 인해, UT 마우스 또는 임의의 다른 처리된 그룹 (TMZ 단독 또는 병용 요법)과 비교할 때 종양 부피에서 유의미한 차이는 없었다. 다중 시점에서 수득된 종양 부피는 하기 그래프에 묘사되어 있다 (도 5a). 처리 윈도우가 묘사되어 있고, 여기서 종양이 ≥10 mm3에 도달할 때 종양은 치료된다.
종양 맥관구조 관류 속도 (rCBF에서 정규화된 차이) (도 5b 참고). 종양 rCBF에서 정규화된 차이는 UT 마우스에 비교하여 모든 처리된 마우스에서 상당히 감소하는 것으로 밝혀졌다. 그룹당 적은 수의 동물에 기인하여 처리된 그룹 간에 유의차는 없었지만, 병용 요법 및 OKN-007-처리된 그룹 둘 모두는 TMZ 처리에 비교하여 그것의 종양에서 보다 정규화된 관류 속도를 갖는 것으로 보였다. 대표적인 형태적 MR 이미지 및 그것의 상응하는 관류 맵이 각각의 처리 그룹에 대해 도시되어 있다.
LBP ELISA 검정 (도 6 및 7 참고). OKN-007-처리된 또는 병용 요법 마우스에서 LBP 수준은 UT 마우스에 비교하여 종양 조직에서 상당히 더 적었다 (도 6). 종양 조직에서, TMZ-처리된 그룹 LBP 수준은 UT 마우스 종양에 상당히 상이한 것으로 밝혀지지 않았다. 종양 LBP 수준에서의 병용 요법으로부터 OKN-007-처리된 그룹 사이에는 유의차가 없었다. 본 효과는 주로 OKN-007의 효과에 의해 기여될 수 있었다. 혈청 LBP 수준은 UT 마우스 샘플에 비교하여 모든 처리 그룹에서 상당히 더 낮은 것으로 밝혀졌으며, 이는 일반적인 치료 반응을 나타낸다 (도 7).
시험관내 IC 50 평가로 OKN-007과 조합된 TMZ-저항성 및 TMZ-민감한 GBM 세포주에 대한 것 (도 8). OKN-007은 교모세포종 (GBM) 전-임상 모델에서 항종양 활성을 갖는 것으로 본 발명자들에 의해 이전에 밝혀졌다. 시험관내 데이터는 OKN-007은 이들이 함께 조합될 때 TMZ (테모졸로마이드)-저항성 GBM 세포주 (T98G 및 G55)를 감소할 수 있다는 것을 입증한다.
리포사카라이드 결합 단백질 (LBP). OKN-007 작용의 기전을 평가하는 상세한 연구 동안, 전사 마이크로어레이를 사용하여 랫트 F98 신경아교종 모델에서 OKN-007 치료와 관련된 특정한 유전자 변이를 설명하였다. LBP는 OKN-처리된 랫트 F98 신경아교종 (미처리된 것 비교됨)에서 하향-조절되었고, TGF-β1과 연관된다. 27년 전에 발견되었고 후에 LPS에 결합하는 능력으로 명명된 LPB (리포폴리사카라이드-결합 단백질)는 감염에 대항하기 위해 필요하고, 선천성 및 적응성 면역력에 관여된다. LBP의 주요 작용 기전은 여전히 명확하지 않다.
LPB에 대한 OKN-007 효과 (도 9 및 10). 미처리된 (종양) 및 OKN-007- 처리된 (OKN-처리된 종양) F98 신경아교종 담지 랫트의 종양 조직에서 단백질 LBP의 수준이 도 9에 도시되어 있다. 정상 뇌 조직을 미처리된 (대조군) 및 OKN-007-처리된 (대조군+OKN) 랫트로부터 수득했다. 미처리된 것에 비교하여 OKN-007-처리된 신경아교종에서 LBP 수준에서 상당한 감소가 있었다 (p<0.0001). 대조군 조직 (미처리된 또는 처리된 것)은 또한 상당히 낮았다 (p<0.0001)
미처리된 (종양) 및 OKN-007- 처리된 (OKN-처리된) F98 신경아교종 랫트의 혈청 내 단백질 LBP의 수준이 도 10에 도시되어 있다. 정상 랫트 (대조군)로부터의 혈청을 또한 수득하였다. LBP의 혈청 수준은 정상 랫트 대 미처리된 종양-담지 (p<0.0001), 또는 정상 랫트 대 OKN-007-처리된 신경아교종-담지 랫트 (p<0.05)에서, 미처리된 종양-담지 랫트 (p<0.001)에 비교하여 OKN-처리된 F98 신경아교종-담지 랫트에서 상당히 낮았다.
저등급 신경아교종 (도 11b)에 비교하여 고등급 신경아교종 (도 11a)에서 LBP의 면역조직화학 수준은 고등급 신경아교종에서 LBP에서의 유의미한 증가를 나타낸다 (도 11c). LBP는 미처리된 종양에 비교하여 종양 조직 (왼쪽 그래프) 및 혈청 (오른쪽 그래프) 둘 모두에서 누드 마우스에서 G55 인간 GBMV 이종이식에서의 OKN-007에 의해 또는 조합된 OKN-007 + TMZ 처리에 의해 상당히 저하되는 것으로 밝혀졌다. 도 12.
결론. 병용 요법 (OKN-007 + TMZ)은 종양 조직 및 혈청 둘 모두에서 증가된 동물 생존, 줄어든 종양 부피, rCBF에서 줄어든 변화, 및 LBP의 줄어든 수준에서 전체적인 양호한 반응을 갖는 것으로 보였다. 3개의 처리 그룹 (TMZ 단독, OKN-007 단독 및 병용 요법)을 비교할 때 동물 수의 증가는 동물 생존, 종양 부피 및 rCBF에서의 변화에서 유의차를 보일 것이다는 것이 가능하다. 또한 또 다른 TMZ-저항성 모델 (또 다른 TMZ-저항성 GBM 세포주의 이종이식 모델, 또는 TMZ 치료에 실패한 환자로부터의 GBM 세포를 사용한 환자-유래된 이종이식 모델)에서 연구를 수행하는 것이 유리할 것이다. 결론적으로, 데이터는 조합된 OKN-007과 TMZ 처리는 TMZ 또는 OKN-007 단독 처리에 비교하여 전체적인 개선을 나타내는 것을 뒷받침하고, 임상 조사에 대해 고려되어야 한다. 그러나, 공보에 관한 다른 암 연구자들을 설득하기 위해, 동물 수의 증가, 그리고 아마도 또 다른 이종이식 모델을 사용하는 것이 전체적인 결과를 강화시킬 것이다.
실시예 4 - 물질 및 방법
생체내 연구
마우스 및 처리.동물 연구는 NIH 지침에 따르는 OMRF IACUC (동물실험 윤리 위원회)에 따라 수행되었다. F98 랫트 신경아교종 세포 이식 모델의 경우, F98 세포 (10-μl 용적 내 105)가 총 15마리 Fischer 344 랫트 (수컷 200-250 gm)에서 정위방법의 디바이스 (정수리점에 대해 2 mm 측면 및 2 mm 전측, 및 3 mm 깊이)로 뇌내로 이식되었다. 종양이 (MRI에 의해 결정될 때) 용적에서 10-20 mm3에 도달하면 동물을 하기 두 그룹으로 분할하였다:OKN-007 처리된 (n = 8) 및 미처리된 (UT) (n = 7) 그룹. 랫트는 종양이 용적에서 200-250 mm3에 도달할 때까지 또는 총 4-6주 동안 처리되었다. G55 GBM 세포 이식 모델의 경우, 2-월령 수컷 누드 마우스 (Hsd:무흉선 누드-Foxn1nu 마우스; Harlan Inc., Indianapolis, IN)를 1% 아가로스 용액의 세포 배양 배지 내 4 μL에 현탁된 mL 당 인간 G55 이종이식 세포 (1 x 106)로 뇌 내로 이식하였다. 종양이 10-15 mm3 (MRI를 통해 결정됨)에 도달되면, 음용수 내 마우스를 OKN-007 (150 mg/kg; 20g 마우스에 대해 0.20% w/v)로 매일, 또는 TMZ (30 mg/kg)으로 매 3일 중 어느 하나로 처리했다. OKN-007은 물에 용해시키고 2일마다 신선하게 제조하였다. 물 병을 칭량하고, 마우스 당 소비된 OKN-007의 양을 결정하였다. 이들 마우스에서 OKN-007의 액체 흡수의 용적에서 상당한 편차가 관찰되지 않았다. OKN-007의 평균 섭취량은 대략 140-150 mg/kg/일/마우스였다. TMZ를 멸균 염수에서 5% DMSO 및 5% 솔루톨-15에 용해시키고 위관영양법을 통해 투여하였다. 종양이 100-150 mm3에 도달할 때까지 또는 총 4-6주 동안 마우스를 처리하였다. 치료의 개시 전에 종양 크기가 유사하게 되는 것을 확실히 하도록 모든 그룹을 계층화하였다.
자기 공명 영상 (MRI). MRI 실험은 Bruker Bio-spec 7.0 Tesla/ 30-cm 수평-보어 자석 이미지형성 시스템 상에서 수행되었다. 동물은 1.5-2.5% 이소플루란 및 0.8 L/min O2를 사용하여 고정시키고 신호 전송을 위해 72-mm 직교 용적 코일에 배치하고, 표면 랫트-헤드 코일 또는 마우스-헤드 코일을 신호 수신을 위해 사용하였다. T2-계량된 형태적 이미지형성은 13분의 총 수집 시간 동안, 0.5 mm의 슬라이스 두께, 랫트에 대해 4 × 5 cm2 또는 마우스에 대해 2 × 2 cm2의 FOV, 랫트에 대해 150 μm 및 마우스에 대해 80 μm의 근사치 면내 분할, 3000 ms의 반복 시간 (TR) 및 63 ms의 에코 시간 (TE)으로 수득되었다. 종양 부피는 Amira v5.6.0 (FEI) (Zhao et al., 2018; Tang et al., 2011; Tang et al., 2016)을 사용하여 MRI 데이터세트를 부여한 3D MRI 슬라이스로부터 계산되었다.
관류 영상. 종양 모세관과 연관된 미세혈관 변경을 평가하기 위해, 관류 영상 방법, 동맥 스핀 표지화 (ASL)가 이전에 기재된 바와 같이 (Ziegler et al., 2017) 사용되었다. 관류 지도는 종양이 최대 단면을 갖는 로스트로-꼬리 축의 지점에 위치한 뇌의 단일 축 슬라이스에서 수득되었다. 종양 주위에 5개 관심 영역 (ROI)이 수작업으로 설명되고, 비교하기 위해 뇌의 반대쪽 측면으로부터 적절한 ROI를 또한 취하였다. rCBF 값에서 차이를 계산하기 위해, 종양 rCBF 값은 나중 (미처리된 마우스에 대한 세포의 뇌내 이식 후 18-26일째) 및 초기 (세포 이식 후 10-13일째) 종양 단계에서 수득되어 지고, 상응하는 동물의 반대측 뇌 영역에서의 rCBF 값으로 정규화되었다. 종양 부피를 형태적 이미지 데이터 세트로부터 바꿔 놓았다.
RNA 단리 및 제조. 랫트 F98 신경아교종 연구를 위해, 모든 랫트를 마지막 MRI 시험 후 안락사시켰다. 각각의 동물의 뇌를 제거하고, -80 ℃ 냉동고에서 저장 전에 액체 질소에서 급속 냉동하였다. 모든 처리 그룹으로부터 모든 종양 조직으로부터의 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)로 정제하고, 분광광도계 (Nanodrop)에 의해 정량화하였다. cDNA는 SuperScript IV 역전사효소 키트 (Invitrogen)를 사용하여 합성되었다.
마이크로어레이 분석. Illumina TotalPrep™ RNA 증폭 키트는 이전에 기재된 바와 같이 (Griffitts et al., 2009) cRNA (Ambion, Austin, TX)를 라벨링하기 위해 사용되었다. Affymetrix RaGene-1_0-st-v1 마이크로어레이를 사용하여 4 x 4 처리/미처리된 샘플을 프로파일링하였다. 엑손-수준-요약된 측정치를 변위치-정규화하고 하기의 유의성 분석을 사용하여 차별적인 발현에 대해 시험하였다: 마이크로어레이 (SAM, [PMID:11309499])로 잘못된 발견 수준 (FDR) <40% 및 배수 변화 <1.5. 기능성 강화 분석은 Ingenuity 경로 분석 (IPA) (Ingenuity® Systems, world-wide-web at ingenuity.com)을 사용하여 수행되었다.
조직학 및 면역조직화학 (IHC). 모든 마우스는 마지막 MRI 시험 후 안락사시켰다. 관류 고착 (꼬리-정맥 주사를 통해 투여된 10% 중성 완충 포르말린)을 마취된 (이소플루란) 마우스에 대해 사용하였고, 각각의 동물의 뇌 전체를 제거하고, 10% 중성 완충 포르말린에 추가로 보존하고, 일상적으로 가공하였다. 파라핀-포매된 조직은 5 μm 절편으로 절단하고, 슈퍼 프로스트 플러스® 유리 슬라이드 상에 실장하고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고, 그리고 광학 현미경검사로 검사했다. 항-TGFβ1 항체 (토끼 항-TGFβ1, cat. No. 250876, 1 mg/mL, ABBIOTEC, San Diego, CA)로 염색 조직 샘플에 의한 TGFβ1 수준을 확립하기 위해 면역조직화학 (IHC)을 수행하였다. TGFβ1 IHC의 경우, 절편을 쌀 찜통에서 20분 동안 항원 회수 용액 (시트레이트 완충액, pH 6, Vector Laboratories, Burlingame CA)에서 인큐베이션하고, 이어서 탈이온수에서 20분 동안 냉각시켰다.
통계적인 분석. 생존 곡선은 카플란-마이어 곡선을 사용하여 분석하였다. 종양 부피, 정규화된 rCBF에서의 변화, 및 종양 혈액량은 다중 비교로 2-웨이 ANOVA로 비교하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타냈으며, *0.05, **0.01, ***0.001, 및 ****0.0001 중 어느 하나의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 마이크로어레이 데이터의 경우, 각각의 유전자에 대한 랜덤 변동 t-통계가 사용되었다 (Wright and Simon, 2003).
시험관내 연구
세포 및 배양 배지. 대부분의 GBM 세포는 미국 조직 배양 수집 (ATCC; Manassas, VA, USA) (U-138 - ATCC (CRL-HTB-16) 교모세포종; LN-18 - ATCC (CRL-2610) 교모세포종; LN-229 - ATCC (CRL-2611) 교모세포종; 및 T-98G - ATCC -(CRL-1690)로부터 수득되었다. U-251 GBM 세포는 Sigma-Aldrich (이전에 U-373 MG (ATCC® HTB-17)로 또한 알려진 N#09063001)로부터 수득되었다. G55 세포는 샌프란시스코 캘리포니아 대학에 상주하는 Dr. Michael Sughrue로부터 수득되었다 (본래 세포를 특성규명하는 C. David James (미국 캘리포니아주 UCSF의 신경 수술 부서)로부터 수득됨).
세포는 37℃에서 5% CO2 하에서 표준 가습된 인큐베이터 내에서 10% 우태 혈청 (Gibco)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Gibco BRL, Crand Island, NY, USA)에서 배양되었다.
IC 50 농도 - TMZ 감수성 결정을 위한 프로토콜. TMZ에 대한 6개 신경아교종 세포주의 감수성이 미처리된 대조군과 비교하여 50% 성장 억제에 필요한 농도 (IC50; GI50으로도 알려져 있음)로부터 평가되었다 (Wang et al., 2017). 간단히, 세포를 1 x 104 세포/웰로 24-웰의 편평한 바닥 플레이트로 분주하고 24시간 동안 배지로 인큐베이션하였다. 세포를 후속적으로 배지로 2회 세정하고 신선한 배지 (대조군) 또는 0.1 - 1,000 μM의 TMZ를 함유하는 배지로 추가로 인큐베이션하였다. +/- TMZ를 갖는 성장 배지를 함유한 각각의 플레이트마다 1mM OKN을 함유하는 배지를 갖는 플레이트가 있었다. 72시간 동안 다양한 농도의 TMZ에 노출 후, 세포는 트립신화에 의해 탈착되고 수가 카운트되었다. 실험은 각각의 농도에서 적어도 4회 반복되었다.
RNA 제조. 하기에서 인공 공급원으로부터의 기여를 피하기 위해: 실험적으로 측정된 발현 패턴, 각각의 세포주는 4개의 독립적인 배양물에서 성장되었고, 전체 공정은 각각의 배양물에서 추출된 mRNA에 대해 독립적으로 수행되었다.
세포주 LN-18 및 LN-229는 4개의 그룹: 세포, TMZ를 갖는 세포, TMZ-OKN 병용 처리를 갖는 세포, OKN을 갖는 세포에 대한 그것의 유전자 발현 프로파일의 평가를 거쳤다. 추출된 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)로 정제하고 분광광도계 (Nanodrop)로 정량화하였다.
HIF-1a, MPG 및 MGMT에 대한 실시간 정량적 RT-PCR에 의한 mRNA의 정량화.모든 처리를 갖는 모든 세포주로부터의 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)로 정제하고, 분광광도계 (Nanodrop)에 의해 정량화하였다. cDNA는 SuperScript IV 역전사효소 키트 (Invitrogen)를 사용하여 합성되었다.
표적 유전자 mRNA가 증폭되고 Bio-Rad CFX96™ 실시간 시스템에 의해 측정되었다. 유전자 발현은 SYBR 셀렉트 마스터 믹스 (Applied Biosystems)를 사용하여 결정되었다. PCR 생성물의 농도에 비례하는 형광 신호는 각각의 주기의 말단에서 측정되고 즉시 컴퓨터 스크린 상에 표시되어 PCR의 실시간 모니터링이 가능하다. 상기 반응은 고정된 수의 주기 후에 축적된 PCR 생성물의 양보다는 PCR 생성물의 증폭이 처음 검출될 때 사이클링 동안의 점을 특징으로 한다. 템플레이트의 개시 양이 높을수록 형광에서의 유의미한 증가가 관찰된다. 역치 사이클은 형광이 기준선 위의 고정된 역치를 통과하는 단편적인 사이클 수로 정의된다. 형광 데이터는 마이크로소프트 엑셀로 내보내어 진 사이클 역치 측정치로 전환되었다. 글리세르알데하이드-3-포스파타제 탈수소효소 (GAPDH) mRNA 발현 수준은 정량적 내부 대조군으로 사용되었다. 정확한 정량화를 위해, 각각의 샘플의 mRNA 발현 수준은 GAPDH 유전자의 발현을 사용하여 정규화되었다.
모든 프라이머는 통합된 DNA 기술에 의해 합성되었다. 사용된 프라이머는 하기와 같다:
HIF-1α:F 5'-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3'
R 5'-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3'.
MGMT 경우:
F 5'-GGGTCTGCACGAAATAAAGC-3',
R 5'-CTCCGGACCTCCGAGAAC-3' [6],
5'-GTC CTA GTC CGG CGA CTT CC-3', 및
5'-CTT GTC TGG GCA GGC CCT TTG C-3'
상기가 사용되어 MPG [9]의 603-bp 전사체를 증폭하였다.
HIF-1a, MPG 및 MGMT에 대한 ELISA. 단백질 발현을 모든 4개의 치료 그룹 (세포 단독, TMZ를 갖는 세포, OKN을 갖는 세포, 조합된 OKN 및 TMZ를 갖는 세포)에 대해 모두 6개의 신경아교종 세포주에서 평가하였다. 세포는 분석 전에 용해시켰다. 간단히 말해서, 세포를 차가운 PBS로 부드럽게 세정한 다음, 트립신으로 탈착하고, 1,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 그런 다음, 세포를 차가운 PBS에서 3회 세정한 다음, 신선한 세포용해 버퍼에 현탁시켰다. 용해물을 1,500×g에서 10분 동안 2-8℃에서 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다.
본 검정은 샌드위치 ELISA 원리에 기초한다. 공급된 미세적정 플레이트의 각각의 웰은 표적 특이적 포획 항체로 미리 코팅되었다. 표준 또는 샘플을 웰에 첨가하고 표적 항원을 포획 항체에 결합시킨다. 미결합된 표준 또는 샘플은 세정된다. 바이오틴-접합된 검출 항체가 그 다음 첨가되어 포착된 항원에 결합한다. 미결합된 검출 항체는 세정된다. 아비딘-홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 콘주게이트가 그 다음 첨가되어 바이오틴에 결합한다. 미결합된 아비딘-HRP 콘주게이트는 세정된다. TMB 기질이 그 다음 첨가되어 HRP 효소와 반응하여 발색을 초래한다. 황산 정지 용액을 첨가하여 발색 반응을 종결시키고 그 다음 웰의 광학 밀도 (OD)를 450 nm ± 2 nm의 파장에서 측정한다. 알려지지 않은 샘플의 OD는 그것의 항원 농도를 결정하기 위해 알려진 항원 농도를 사용하여 생성된 OD 표준 곡선에 비교될 수 있다.
ELISA로부터 결정된 항원 농도는 그룹들 간의 비교를 하기 위해 각각의 세포 용해물의 총 단백질 농도로 정규화되었다. N-메틸퓨린 DNA 글리코실라제 (MPG) 및 저산소증 유도성 인자 1 알파 (HIF1a)를 위한 ELISA 키트는 CLOUD-CLONE CORP.(CCC)으로부터 구매되었고 그리고 인간 MGMT용은 LifeSpan Biosciences, Inc으로부터 되었다.
RNA-seq. RNA-seq 분석 이전에 품질관리 측정이 시행되었다. RNA의 농도는 Thermo Fisher Qubit 형광측정기에 대한 형광분석을 통해 확인되었다. RNA의 전체적인 품질은 Agilent Tapestation 기기를 사용하여 확인되었다. 초기 QC 단계에 따라 서열분석 라이브러리는 제조자 프로토콜에 따라 Lexogen Quantseq FWD 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성되었다. 간단히, 5'-태깅된 폴리-T 올리고머 프라이머를 사용하여 cDNA의 제1 가닥을 생성하였다. RNase 소화에 이어, cDNA의 제2 가닥을 5'-태깅된 랜덤 프라이머를 사용하여 생성하였다. 추가의 프라이머를 갖는 후속적인 PCR 단계가 초기 5' 태그에 완전한 어댑터 서열을 첨가하고, 샘플의 다중화를 위한 독특한 지수를 첨가하고 라이브러리를 증폭했다. 각각의 샘플에 대한 최종 라이브러리는 Agilent Tapestation에서 적절한 크기와 양에 대해 분석되었다. 이들 라이브러리는 그 다음 형광 분석을 통해 확인된 바와 같은 등몰 양으로 풀링되었다. 최종 풀은 Kapa Biosystems Illumina 라이브러리 정량화 시약이 있는 Roche LightCycler 480 기기상에서 qPCR을 사용하여 절대적으로 정량화되었다. 서열분석은 높은 출력 화학 및 75bp 단일-종료된 판독을 갖는 Illumina Nextseq 500 기기상에서 수행되었다.
원 서열분석 파일은 폴리 A 테일 및 어댑터 서열의 bbduk (Kmers를 사용하여 오염제거) (Bushnell, 2014) 트리밍으로 가공되었다. Fastqc (Andrews, 2010) 및 multiQC (Ewels et al., 2016)를 사용하여 얻어진 fastq 파일의 품질을 확인했다. 33-36의 높은-품질 점수 (프레드 점수)가 각각 9.3 +/- 1.3 백만 판독으로 모든 샘플에 존재하였다. GRCh38 게놈에 대해 Tophat2 (Trapnell et al., 2009)으로 정렬된 분류된 bam 파일이 그 다음 각각의 패키지로부터 강력한 반응을 분석하기 위해, 병렬적으로 2개의 별개의 파이프라인에 그 다음 제공되었다. 계수 및 차별적인 유전자 발현은 ‘게노믹얼라인먼트' 기능 ‘서머라이즈어버랩' 및 음수 이항식 일반화된 선형 모델링 패키지 DESeq2 (Love et al., 2014)를 사용하여 R로 수득되었다.
세포 이동. 이동 연구를 위해, 내부에 PDMS (폴리디메틸실록산) 마이크로-채널을 갖는 6-웰 챔버를 각각의 웰에 10 μg/ml의 라미닌 (Sigma-Aldrich)으로 코팅하였다. G55 세포를 100 μl에 씨딩 (50 x 103)하고 각각의 웰에 2ml의 배지를 보충하였다. 챔버를 계획된 시점까지 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 일부 챔버를 OKN-007, TMZ 또는 TMZ와 조합된 OKN-007으로 처리하고 (OKN-007 및 TMZ 둘 모두뿐만 아니라 두 개가 조합된 경우에 대해 1 μL/mL 배지), 각각의 처리 그룹에 대해 하나의 웰은 대조군으로 미처리로 남겼다. 마이크로채널 내부 세포의 이미지를 10x 미만의 Olympus CK40 도립 현미경 (일본)을 사용하여 촬영하고, 씨딩 후 22시간, 28시간 및 46시간에 이동된 동일한 세포의 거리를 측정하고, 세포 이동 속도 (μm/h)를 계산하였다. 각각의 처리는 적어도 3회 반복하였고 데이터는 평균 ± S.D로 나타냈다.
통계적인 분석. RT-PCR 유전자 및 ELISA 단백질 수준, 및 세포 이동을 분석하고 다중 비교로 2-웨이 ANOVA에 의해 비교했다. RNA-seq 데이터는 DESeq2 (Love et al., 2014; Benjamini and Hochberg, 1995; Robinson et al., 2010)에 의해 제공된 Benjamini-Hochberg FDR 값으로부터 FDR<0.05를 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타냈으며, *0.05, **0.01, ***0.001, 및 ****0.0001 중 어느 하나의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 5 - 결과
생체내 G55 동소이식 이종이식 GBM 모델. 동물 생존 퍼센트 데이터는 병용 요법 (OKN-007 + TMZ)-처리된 마우스의 60%가 종양 검출 후 60일 동안 살아 남았고 50일 이상 동안 처리된 것으로 나타났다 (도 13a). OKN-007-처리된 마우스 중 하나 (처리된 마우스 중 20%)가 또한 종양 검출 후 60일 동안 살았다. 통계적인 분석은 모든 처리된 마우스 (OKN-007 단독, TMZ 단독 또는 병용 요법)는 미처리된 (UT) G55 신경아교종-담지 마우스에 비교할 때 생존 퍼센트에서 유의미한 증가가 있는 것으로 밝혀졌다는 것을 나타냈다. 병용 요법 마우스는 TMZ-처리된 마우스보다 상당히 더 긴 생존을 하였다는 것이 또한 밝혀졌다. OKN-007-처리와 병용 요법 마우스 사이에는 유의성이 없었다.
종양 부피는 UT 마우스가 안락사될 때, 즉, 종양 부피가 150 mm3 또는 그 초과에 도달했을 때 (종양 검출 후 19-22일차)에 동일한 기간뿐만 아니라 각각의 처리 그룹에 대해 마지막 시점에서 비교하였다. 종양 검출 후 19-22일차에서, TMZ, OKN-007 또는 병용 요법으로 처리된 마우스는 UT 마우스와 비교할 때 종양 부피가 상당히 감소된 것으로 전부 밝혀졌다 (도 13b). 처리된 마우스 중 어느 것도 종양 부피에서 서로 유의하게 다른 것으로 밝혀지지 않았지만, 병용 요법은 TMZ- 또는 OKN-007-처리된 마우스와 비교할 때 가장 낮은 종양 부피 평균을 가졌다. 종양 (중간-종양 영역)을 묘사하는 대표적인 MR 이미지는 또한 조사된 각각의 처리 그룹에 대해 나타나 있다 (도 14).
종양 rCBF에서 정규화된 차이는 UT 마우스와 비교할 때 모든 처리된 마우스에서 상당히 감소하는 것으로 밝혀졌다 (도 15e). 그룹당 적은 수의 동물에 기인하여 처리된 그룹 간에 유의차는 없었지만, 병용 요법 및 OKN-007-처리된 그룹 둘 모두는 TMZ 처리에 비교하여 그것의 종양에서 보다 정규화된 관류 속도를 갖는 것으로 보였다. 대표적인 형태적 MR 이미지 (도 15-Di) 및 그것의 상응하는 관류 맵 (도 15a-Dii)이 각각의 처리 그룹에 대해 도시되어 있다.
시험관내 GBM 세포 연구, 시험관내 GBM 세포 성장 곡선으로부터, 대부분의 세포가 100 μM 또는 그 미만의 TMZ 농도로 50% 초과가 사멸되었다는 것이 TMZ-감수성 세포 (U251, LN229)로부터 확립되었다 (표 4). TMZ-저항성 GBM 세포 (T98, LN18, U138, G55)의 경우, 병용 요법의 효과는 100 μM 미만의 TMZ 농도에서 실질적이었다. 병용 요법의 효능은 상당하였다.
표 4 - TMZ 단독 (0, 0.1, 1, 10, 100 또는 1000 μM) 또는 OKN과 조합된 TMZ (1 mM)로 처리된 인간 GBM 세포에 대한 IC 50 값.
Figure pct00011
1 mM OKN의 농도는 일부 세포 (LN229, U138, G55)의 2mM 농도에 비교하여 세포 생존율을 줄이는데 꽤 효과적인 것으로 밝혀졌다. 다른 세포 (U251, T98, LN18)에서 2 mM OKN는 1 mM 농도에 비교하여 세포 생존율을 줄이는데 약간 더 효과적인 것으로 밝혀졌다.
HIF-1α, MGMT 및 MPG. RT-PCR (표 5)은 HIF-1α 유전자-배수 변화가 모든 TMZ-처리된 및 OKN-007 + TMZ-처리된 세포에서 증가했음을 나타냈다. OKN-007은 줄어든 유전자-배수 변화를 갖는 T98 세포를 제외하고 모든 세포에서 HIF-1α 유전자-배수 변화를 증가시켰다. MGMT 유전자-배수 변화는 TMZ 또는 OKN-007로 처리된 LN18 세포에서 줄어든다. OKN-007은 T98 세포에서 MGMT 유전자-배수 변화를 감소시켰다. MGMT 유전자-배수 변화는 TMZ, OKN-007 또는 병용 치료에 이어 U251 세포에서 증가된다. MGMT 유전자-배수 변화는 LN18 병용 치료에서 약간 증가된다. MPG 유전자-배수 변화는 OKN-007-처리된 G55 및 U138 세포에서 TMZ 처리에 따른 대부분의 세포에서, 그리고 TMZ와 조합된 OKN-007로 처리된 G55, LN18 및 U138 세포에 대해 증가된다. LN18, T98, U251 및 LN229 세포에 대해 OKN-007-처리로, 그리고 또한 OKN-007 + TMZ으로 처리된 T98 및 LN229 세포에 대해 MPG 유전자-배수 변화에서의 감소가 있었다.
표 5 - TMZ, OKN 또는 조합된 OKN+TMZ로 처리되거나, 또는 미처리된 (UT) TMZ-저항성 및 TMZ-민감한 인간 GBM 세포에서 HIF-1α, MGMT 및 MPG에 대한 RT-PCR 유전자-배수 변화
Figure pct00012
각각의 세포 치료 그룹에 대한 N=2.
ELISA 확립된 단백질 수준 (표 6)은 TMZ 또는 병용 치료로 처리된 대부분의 세포에서 HIF-1α가 상승되었음을 나타냈다. OKN-007은 U138 세포에서 HIF-1α 수준을 약간 감소시킨, 반면에 모든 다른 세포에서 이 단백질은 이 처리 그룹에서 약간 상승되었다. MGMT는 TMZ 또는 병용 치료로 처리된 G55, T98 및 U251 세포에서 상승되었다. OKN-007은 G55 및 LN18 세포에서 MGMT를 약간 감소시켰다. MPG는 TMZ 또는 TMZ와 조합된 OKN-007로 처리된 U251 세포에서만 주로 상승되었다. OKN-007은 LN229 세포에서 MPG 수준을 감소시켰다.
표 6 - TMZ, OKN 또는 조합된 OKN+TMZ로 처리되거나, 또는 미처리된 (UT) TMZ-저항성 및 TMZ-민감한 인간 GBM 세포에서 HIF-1α, MGMT 및 MPG에 대한 ELISA 단백질 수준 (ng/mg 세포 용해물) 변화.
Figure pct00013
각각의 세포 치료 그룹에 대한 N=4.
RNA-seq 데이터. 도 17은 LN18 세포가 TMZ 단독 그룹에 비교하여 TMZ+OKN 그룹에서 37개 상향조절된 유전자, 및 3개의 하향-조절된 유전자를 가졌다는 것을 나타낸다. 샘플 25에 대해 유전자는 이 칼럼에서 모두 상향조절된 것으로 보인다. 이것은 다른 조합된 OKN + TMZ LN18 샘플과 상이한 역치에 설정되어 있는 것으로 보인다. 역치가 감소된 경우 패턴은 칼럼 26 또는 28에서의 것에 유사할 것이다 (다른 조합된 OKN-007 + TMZ 처리된 LN18 세포).
도 16은 LN18 세포가 TMZ 단독 그룹에 비교하여 TMZ+OKN 그룹에서 37개 상향조절된 유전자, 및 3개의 하향-조절된 유전자를 가졌다는 것을 나타낸다. 샘플 25에 대해 유전자는 이 칼럼에서 모두 상향조절된 것으로 보인다. 이것은 다른 조합된 OKN + TMZ LN18 샘플과 상이한 역치에 설정되어 있는 것으로 보인다. 역치가 감소된 경우 패턴은 칼럼 26 또는 28에서의 것에 유사할 것이다 (다른 조합된 OKN-007 + TMZ 처리된 LN18 세포). 도 17은 LN229 세포가 TMZ 단독 그룹에 비교하여 TMZ+OKN 그룹에서 21개 상향조절된 유전자, 및 19개의 하향-조절된 유전자를 가졌다는 것을 나타낸다.
시험관내 세포 이동 연구. G55 GBM 세포 이동 연구는 OKN-처리된 세포에 대한 세포 이동 속도가 미처리된 (UT) 세포에 비교하여 처리 후 22시간 및 46시간에 상당히 감소되었음을 나타냈다. TMZ로 처리된 세포는 UT 세포에 비교하여 처리 후 28시간 및 46시간에 상당히 감소되는 것으로 밝혀졌다. 조합된 OKN + TMZ 처리는 TMZ 단독과 비교하여 처리 후 22시간 및 28시간에 세포 이동을 상당히 감소시켰다는 것이 또한 밝혀졌다.
UT 또는 OKN-007로 처리된 랫트 F98 신경아교종으로부터 마이크로어레이 데이터.
마이크로어레이 분석은 OKN 처리 후 유전자의 우세한 하향조절을 확인하였다. 384개 유전자는 상당히 하향조절된 적어도 하나의 엑손을 가진 반면에 단지 3는 상향조절되었다 (데이터 도시되지 않음). 경로 분석은 OKN-처리된 F98 종양이 세포외 기질 (ECM)과 연관된 몇 개의 유전자 (예를 들어, 콜라겐 및 MMP 유전자)를 모두 TGFβ1에 연결로 하향조절하였다는 것을 나타냈다.
RT-PCR은 UT F98 종양에 비교하여 몇 개의 ECM 유전자가 OKN-처리로 하향조절되었음을 확인할 수 있었다 (표 7).
표 7 - 유전자 발현에서 2-, 5- 또는 10-배수 변화를 갖는 F98 미처리된 및 OKN-007-처리된 종양으로부터 단리된 RNA의 RT-PCR.
Figure pct00014
Figure pct00015
업스트림 조절인자 분석은 TGFβ1을 57개 하향조절된 유전자를 제어하는 가장 현저하게 억제된 업스트림 조절인자로 확인하였다 (도 20). TGFβ1은 자체로 거의 2-배 하향조절되었다.
면역조직화학은 UT 종양에 비교하여 OKN-처리된 F98 신경아교종에서 TGFβ1 단백질 수준이 실질적으로 감소됨을 보여주었다 (도 21a-b). TGFβ1 단백질 수준의 감소는 또한 ELISA를 사용하여 확인되었으며, 이는 UT 종양에 비교하여 OKN-처리된 F98 신경아교종에서 TGFβ1 단백질 발현의 상당히 줄어든 (p<0.001) 수준을 나타낸다 (도 21c).
실시예 6 - 논의
본 발명자들은 TMZ와 조합될 때 OKN-007이 TMZ-민감성 GBM 세포에서 TMZ의 효과를 확대시킬 수 있을 뿐만 아니라 TMZ-저항성 GBM 세포를 TMZ에 보다 민감하게 하고 및/또는 종양 세포 성장에 대해 OKN-007의 효과를 부여할 수 있다는 것을 확립할 수 있었다. OKN-007 자체가 TGF-β1을 통해 세포외 기질과 연관된 몇 개의 유전자를 하향-조절할 수 있고 또한 세포 이동에 대해 효과적일 수 있음을 확립할 수 있었다. 이전에 OKN-007이 효과적으로 세포 증식을 억제할 수 있고, 혈관신생과 연관되고 또 세포자멸사를 증가시키는 HIF-1α 및 VEGFR2를 감소시킬 수 있음을 발견하였다.
OKN-007이 TMZ와 조합될 때, 이것은 시험관내 TMZ-민감성 및 TMZ-저항성 GBM 세포 둘 모두에 대해 효과적일 수 있고, 종양 부피를 상승작용으로 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 생체내 G55 동소이식 이종이식 GBM 모델에서 동물 생존 및 정상 혈관형성을 증가시킬 수 있다.
최근에 조사된 다른 TMZ 조합된 요법은 하기를 포함한다: 헤지혹 신호전달과 연관되고, 구체적으로 신경아교종-유사 줄기 세포 (U87-MG, T98G)에 영향을 미치는, GLI1 침묵화 (Melamed et al., 2018); 알데하이드 탈수소효소 동형체 3A1 (ALDH3A1)의 발현을 하향조절하는, Wnt/β-카테닌 신호전달 억제 (Suwala et al., 2018); 전사 3 (STAT3)-매개된 자가포식의 신호 변환체 및 활성제를 표적화함에 의해 종양 억제인자로서 miR-519a가 기능하는, miR-519a 유사체 사용, 및 TMZ-유도된 자가포식 (U87-MG/TMZ) 증진 (Li et al., 2018); TMZ에 대해 GBM 세포를 감작시키는 PI3K 억제 (Haas et al., 2018); TMZ-감수성을 고양하기 위해 SOX9/CA9 (탄산탈수소효소 9)-매개된 종양발생 경로 억제 (Xu et al., 2018); 및 폴리(ε-카프로락톤) (PCL), 폴리(에틸렌이민) (PEI) 및 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 나노캐리어 작제물의 폴레이트-접합된 트리블록 공중합체 (Fa-PEG-PEI-PCL, Fa-PEC)를 사용하여 BCL-2 유전자를 표적화하는 TMZ 및 siRNA의 공동-전달 (Peng et al., 2018). TMZ와 조합된 모든 요법은 TMZ의 효과를 확대시키고 및/또는 TMZ-저항성 GBM 세포에 효과를 미치기 위해 사용된다.
모든 세포에 대해 연구의 IC50 성분에 대해, OKN-007은 TMZ IC50 농도를 감소시키는데 실질적인 효과가 있어서, GBM 세포 모두가 TMZ-민감성 (또는 이들이 이미 있는 경우 더욱 TMZ-민감성)이 되었다. G55 세포로 TMZ-저항을 평가하는 것에 관하여 주의를 해야 한다. 본 발명자들은 저-계대 G55 세포주는 실제로 TMZ-저항성이고, 반면에 고-계대 G55 (>30 계대)는 TMZ-민감성이 될 수 있음을 확립했다. 생체내 G55 이종이식 데이터의 경우, 본 발명자들은 발명자들의 시험관내 연구에 사용된 것들에 유사한 계대인 저-계대 G55 세포주 (<10 계대)를 사용했다.
OKN-007의 가변 농도로부터, 1 mM OKN의 농도는 일부 세포주 (예를 들어, LN229, U138, G55)에 대한 2 mM 농도에 비교하여 세포 생존율을 감소하는데 꽤 효과적이었고, 반면에 다른 세포주 (예를 들어, U251, T98, LN18)에 대해 2 mM OKN은 1 mM 농도에 비교하여 세포 생존율을 감소하는데 약간 더 효과적이었다는 것으로 귀결되었다.
단백질 수준은 TMZ가 모든 세포에서 HIF-1α를 증가시키고, 대부분의 세포 (LN229 제외)에서 MGMT를 증가시키고, T98 및 U251 세포에서만 MPG를 증가시키는 것으로 보인다. 대부분의 세포에서 OKN-007은 (미처리된 세포와 비교하여) HIF-1α 단백질에 영향을 미치지 않는 것으로 보이며, OKN-007 그것만으로는 (미처리된 세포와 비교하여; LN18 제외) MGMT의 단백질 수준에 영향을 미치지 않는 것으로 보이고, MPG는 OKN 처리 단독으로 T98 세포에서 여전히 상승하였다. 중요한 것은, HIF-1a가 U251, U138 및 T98 세포에서 TMZ에 의해 유도되었고 그 다음 OKN-007에 의해 감소되었다. 조합된 TMZ+OKN은 HIF-1α를 상승되게 유지한 것으로 보이며 (U138 세포 제외), MGMT 단백질 수준은 결합된 TMZ+OKN 처리로 실질적으로 변화되지 않았고, MPG는 조합된 TMZ+OKN 처리로 U251 세포에서는 여전히 상승한 반면에 다른 세포는 실질적으로 (TMZ, OKN 또는 조합된 TMZ+OKN 처리로부터) 영향을 받지 않는다. 구체적으로, U251, T98, 및 G55 세포에서, OKN-007의 처리가 아닌 TMZ에 기인하여 증가된 MGMT의 수준은 MGMT의 발현을 억제하지 않았다.
유전자 수준에서, TMZ-처리된 세포의 경우, 모든 세포에서 (미처리된 세포에 비교하여) HIF-1α 유전자-배수 변화가 증가한다. 조합된 TMZ+OKN 처리는 TMZ 단독에서보다 더 HIF-1α 유전자-배수 변화를 증가하는 일부 세포 (예를 들어, LN229, LN18, U138 및 G55)를 초래하지만, 무엇보다, 병용 치료로 HIF-1α에 대한 어떤 실질적인 감소 효과는 없는 것으로 보인다. T98에서의 병용 치료로 인해 감소된 HIF-1α 유전자 발현이 관찰되었지만, 상당하지는 않았다. OKN 단독은 미처리된 세포에 비교하여 T98 GBM 세포에서 HIF-1α 유전자-배수 변화만을 감소시키는 것으로 보인다. U138 및 U251에 대한 OKN 처리에서 HIF-1α 유전자-배수 변화는 (미처리된 세포에 비교하여) 여전히 증가하는 것으로 보인다. 단백질 수준과 달리, 유전자 수준에서 OKN-007에 의한 HIF-1α에서의 감소는 없다. T98 세포에서만 OKN-007의 감소 효과가 있었다. HIF-1α 유전자-배수 변화는 세포에서의 정상산소 상태에 비교하여 보다 저산소 환경, 예컨대 종양 (생체내)에서 상이할 수 있다.
검출가능한 수준을 갖는 단지 3개 세포주 (U251, T98, LN18)에서 TMZ 단독 또는 조합된 TMZ+OKN에 대한 MGMT 유전자-배수 변화에서 단지 보통의 증가만이 있었다. OKN 처리 단독은 U251 세포에서 MGMT 유전자-배수 변화를 약간 증가시켰지만, 반대로 (미처리된 세포에 비교하여) LN18 및 T98 세포에서는 MGMT 유전자-배수 변화를 감소시켰다. OKN과 관련하여, 이들 결과는 OKN 단독이 MGMT 유전자 발현을 감소시킬 수 있고, 이는 GBM 세포에 대한 저항성을 감소시킬 수 있음을 나타낼 수 있다.
TMZ 처리된 세포에서 (단백질 수준과 달리) MPG 유전자-배수 변화는 3개 세포주 (G55, LN18 및 U138)에서 2-배 초과로 상승되었다. 병용 요법으로, 4개 세포주 (G55, LN229, LN18 및 U138)가 (미처리된 세포에 비교하여) 상승된 MPG 유전자-배수 변화를 가졌다. 흥미롭게, OKN 처리 단독은 2개 세포주 (G55 및 U138)에 대해 MPG 유전자-배수 변화가 계속 상승하였고, 2개의 다른 세포주 (LN18, T98)에 대해서는 (미처리된 세포에 비교하여) 약간 감소하였다. 여기서 OKN-007에 의한 MGT에서의 감소는 관측되지 않았다.
LN18 GBM 세포에 대한 RNA-seq 데이터로부터, 흥미로운 상향조절된 유전자는 다음과 같다: RNF149 (세포 주기를 정지시키기 위해 p53 반응을 증폭시키는 스트레스 센서 유전자), IDO-1 (인간 신경아교종에 관여됨) 및 SLC14a2 (내인성 막관통 단백질 mTORC2-의-업스트림 (UT2)은 STAT3의 활성화를 부정적으로 조절함). 흥미로운 다운-조절된 유전자는 하기를 포함한다: SUMO2 (뇌 허혈 및 저산소증과 같은 조건에서 SUMO의 과발현은 세포 생존을 증가시킬 수 있는, 반면에 SUMO 발현의 녹다운은 세포에 독성인 것으로 입증되었음; 그리고 저항성 신경아교종 세포에서 TGFβ1과 연관됨 (Yoshino et al., 2010), HIST1H1C/H1.2 (히스톤 HIST1H1C의 녹다운은 높은 글루코스 유도된 염증 및 세포 독성을 억제함), 및 PFN1 (프로파일링-1 인산화는 인간 신경아교종에서 종양 공격성과 연관됨) (Liu et al., 2012).
LN229 세포에 대한 RNA-seq 데이터의 경우, 흥미로운 다운-조절된 유전자는 다음과 같다: EGR1 (종양이 ER 양성 및 HER2 양성인 환자에서 더 짧은 질환-없는 생존과 연관됨; IGF1R 신호전달 경로는 약물 내성에 매우 관련됨), XIST (증가된 수준은 더 짧은 생존 및 보다 불량한 예후와 연관됨), 및 PRKDC (유방암 환자에서 화학내성에 대한 예후 바이오마커). 흥미로운 상향조절된 유전자는 다음을 포함한다: ZC3H12A (염증의 결정적인 음성 조절인자), RN7SK (잠재적 항-증식성 및 종양-억제성 기능), SUN-2, 및 KLHL21.
추가의 생물정보학 분석으로부터, FOS는 가장 강력한 하향-조절을 가지며, 이는 모든 세포주 및 모든 치료 조건 TMZ, OKN 및 TMZ+OKN에 걸쳐서 OKN 효과로서뿐만 아니라 데이터가 각각의 치료 조건 또는 세포주로 별도로 분리될 때에도 관찰될 수 있다. FOS는 또한 세포 생존력을 감소시키고 방사선을 통한 DNA 손상에 대해 교모세포종을 감작시키기에 충분한 것으로 관찰되었고, 그래서 이것은 TMZ가 또한 DNA 손상을 유발하는데 도움이 될 수 있다는 것이 가능하다 (Liu et al., 2016).
MGMT는 많은 조건에서 유의미하지 않은 변화를 가졌지만; 그러나, LN229에 대해, log2 배수 변화는 ~0.057의 p-값으로 ~3이었다.
TMZ-저항과 연관될 수 있고 조합된 OKN + TMZ 요법이 영향을 받을 수 있는 다른 MOA는 TGF-β1 (Yoshino et al., 2010; Wang et al., 2017), 및 또한 가능하게는 Akt (Fan et al., 2014), 및 대식세포 (Zeng et al., 2017)를 포함한다. OKN으로 처리된 F98 랫트 신경아교종의 본 발명자들의 마이크로어레이 평가에서, TGF-β1은 통상적으로 TGF-β1에 연결된 57개 유전자를 하향-조절함에 의해 OKN 효능에 대한 MOA에서 주요한 역할을 수행하였다. 아마 조합된 OKN + TMZ 요법에서, OKN은 TGF-β1에 영향을 미치고 TMZ-저항성 세포에 대한 반응을 이끌어낸다.
OKN-007-처리된 대 미처리된 랫트 F98 신경아교종 RNA의 마이크로어레이 분석으로부터, 하향조절된 유전자는 주로 세포외 기질 1 및 세포 유착이 풍부한 인테그린 및 콜라겐 계열의 구성원을 포함한다는 것이 확립되었다. OKN-007로 처리된 종양 조직의 세포 생존력은 감소한 반면에 세포사는 ANGPT2, DLL4, HPX, IGF1 및 TGFB1 유전자의 하향조절을 통해 증가되었다. “혈관신생"도 또한 OKN-007-처리된 샘플에서 감소되었다. 몇 개의 면역 반응 유전자는 현저하게 하향 조절되었고, LBP (리포폴리사카라이드 결합 단백질)가 가장 하향조절되었다.
하향조절된 마지막 엑손인, TGFB1은 57개 유전자의 마스터 조절인자였다. 이것은 상기에 언급된 거의 모든 과정에 참여하므로 OKN-007에 의해 하향조절된 주요 업스트림 조절인자로 간주될 수 있다.
인테그린 및 콜라겐에 부가하여, 주목할 만한 그룹의 세포외 기질 당단백질, 예컨대 루미칸 (LUM), 피브릴린1 및 5 (FBN1), 라미닌 (LAMA2)이 있다. 그것 중 모두가 하향조절되었지만, 그러나, 모든 상기 언급된 단백질을 분해하는 효소인, 매트릭스 메탈로펩티다아제 3 (MMP3), ADAMTS9 및 PRSS2, 다른 펩티다아제가 또한 하향조절된다. 정상 혈관에서가 아닌 악성 종양의 혈관 내피성 세포에서 발현된 CD248은 하향조절된다. 이는 세포외 기질 유지 및 리모델링이 미처리된 신경아교종 샘플에서 활성화되고 OKN-007 처리에 의해 정규화됨을 시사한다.
TGFB1 및 다른 기능 중에서 세포 유착 및 이동을 조절하는 TGF-베타 단백질 LTBP2 (잠재 변환 성장 인자 베타 결합 단백질)의 구성원이 또한 하향조절된다. 유사하게, 다른 세포 유착-관련된 분자, 예컨대 POSTN (페리오스틴) 및 LUM (루미칸)이 하향조절된다. 면역글로불린 상과 유전자 구성원인 F11r (F11 수용체)는 세포 유착, 세포-세포 상호작용, 및 융합막의 형성의 중요한 조절인자이고, 또한 하향조절된다. 집합적으로, 세포 유착이 하향조절된다는 것이 시사된다.
LBP (리포폴리사카라이드 결합 단백질)은 가장 강력한 하향조절된 면역-관련된 유전자이고, 그것의 엑손의 다수가 하향조절된다. 이 유전자는 그램-음성 8 박테리아 감염에 대한 급성기 면역적 반응에 관여된다. DMBT1 (악성 뇌종양 1에서 삭제됨)은 종양 세포와 면역계의 상호작용에서 역할을 한다. IL6 및 IL31AR로 이종화되는 온코스타틴 M 수용체 (OSMR)인, 사이토카인 수용체 IL1R1, 인터페론 (알파, 베타 및 오메가) 수용체 1 (IFNAR1), 및 F11 수용체 모두는 하향조절된다.
전반적으로, 하향조절된 유전자에 의해 과대발현된 과정은 미처리된 신경아교종 샘플과 달리, 이들이 비정상적으로 조절되는, 정상 상태로 되돌아온 것으로 보인다. 예를 들어, 단일-엑손 CD248 유전자는 악성 종양 (및 본 연구로부터의 미처리된 신경아교종 샘플)에서 고도로 발현된다. CD248은 OKN-007 처리된 샘플에서 하향조절되었으며, 이는 종양 세포가 정상 상태로 다시 역전됨을 시사한다.
신경아교종은 고도로 침습성 종양이므로, 본 발명자들은 또한 미세유체 챔버를 사용하여 OKN-007이 세포 증식, 혈관신생을 억제하고 세포자멸사를 증가시키고 (Towner et al., 2013), 뿐만 아니라 신경아교종 세포 이동/침습을 억제하는 역할을 한다 (Szopa et al., 2017)는 것을 알아보았다. 본 발명자들은 OKN-007이 이동 속도를 상당히 감소시켰음을 보여주었다. 신경아교종 세포 침입은 신경아교종 세포와 상이한 다운스트림 이동 경로를 자극하는 세포외 기질 성분 예컨대 파이브로넥틴, 콜라겐 IV, 테나스신-C 및 파이브로넥틴 사이의 상호작용에 의존적이다 (Demuth and Berens, 2004).
TGF-β1은 TMZ-저항에서 중요한 역할을 하므로 (Yoshino et al., 2010; Wang et al., 2017), OKN-007은 TGF-β1을 표적화함에 의해 실제로 TMZ-저항에 영향을 줄 수 있다. 　 LN18 RNA-seq 데이터에서의 추가의 지지적 데이터는 OKN이 (TMZ 단독에 비교하여) TMZ와 조합될 때, TGF-β1 TMZ-저항과 연관된 SUMO2가 또한 녹다운되었음을 나타낸다.
미래 연구를 위해, 시험관내 조합된 OKN-007 + TMZ 처리 연구에 기초하여, 하기 바이오마커인, HIF-1α, TGFβ1, c-FOS, PFN-1, SUMO2 모두는 TMZ와 조합될 때 TMZ-저항에 상승작용으로 영향을 미치는데 OKN-007이 수행을 할 수 있는 역할에 관여될 수 있는 잠재적 핵심 분자 성분으로 추가로 추구되어야 할 필요가 있다.
U251 및 U87 세포주에 대한 이전의 연구에서, 조직 배양으로부터 생성된 유전자 발현 프로파일은 피하 (s.c.) 이식된 종양으로부터 생성된 것과 상당히 상이하였으며, 이는 뇌내로 (i.c.)로 성장된 것과 상당히 상이하였다는 것에 유의해야 한다. i.c 유전자 발현 프로파일과 s.c. 이종이식에서 생성된 프로파일 사이의 격차는 생체내 성장 환경이 유전자 발현을 조절하는 반면에, 동소이식 성장 조건은 상이한 변형의 세트를 유도한다는 것을 시사한다 (Camphausen et al., 2005). 이는 종양 미세환경 (TME)을 정확하게 표현하기 위해 적절한 모델을 사용하는 것의 중요성을 암시할 수 있다.
결론적으로, OKN-007은 세포외 기질 및 세포 침입과 연관된 주요 유전자의 하향조절을 통해 종양형성 TGFβ1 경로를 표적화함에 의해 그 자체적으로 효과적일 수 있을뿐만 아니라, TMZ-저항 GBM 세포/조직에 대한 효과를 유도할 수 있는 흥미로운 항-신경아교종 제제이다. 조합된 OKN-007 + TMZ 요법과 연관된 MOA는 HIF-1α, MGMT 또는 MPG를 통해 발생하는 것으로 보이지 않는다. OKN-007 자체는 일부 GBM 세포에 대한 이들 유전자 및 단백질의 일부를 감소시켰지만, 대수의 GBM 세포는 OKN-007 또는 조합된 처리 그룹 둘 모두로 영향을 받지 않았거나 증가된 수준을 가졌다. RNA-seq 분석은 OKN-007이 TMZ와 조합될 때 TMZ-저항에 어떤 역할을 하는지에 관한 다른 가능한 MOA에 대한 일부 통찰력을 제공했으며, 이들은 추가로 추구될 것을 요할 것이다. TMZ와 OKN-007을 조합하는 것은 TMZ-저항성 GBM 세포가 증식하는 것을 예방하고 가능하게는 TMZ의 효과를 확장시킬 수 있는 유망한 치료 전략처럼 여겨진다.
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본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험과정 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 변동이 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에서 기재된 조성물 및 방법에 그리고 단계 또는 단계의 순서로 적용될 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 더 구체적으로, 화학적 및 생리학적 둘 모두로 관련된 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있으면서 본 명세서에서 기재된 제제로 치환될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 모든 그와 같은 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구항들에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기 참고문헌은 이들이 본 명세서에 제시된 것들에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부사항을 제공하는 한, 본 명세서에 구체적으로 참고로 편입된다.
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Claims (75)

  1. 대상체에서 테모졸로마이드-저항성 신경아교종을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 신경아교종의 혈관형성, 성장 또는 확산을 억제하는데 효과적인 용량의 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 투여는 혈액 뇌 장벽을 가로 질러 2,4-ds-PBN의 후속적인 통과를 요하는 경로를 통하는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 경로는 장관, 정맥내, 또는 동맥내인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 재발성 또는 전이성 신경아교종을 갖는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 이전에 하나 이상의 항-신경아교종 요법을 실패한, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 2,4-ds-PBN의 효과적인 용량은 약 5 내지 약 150 mg/체중(kg)/일인, 방법.
  7. 청구항 2에 있어서, 장관 투여는 음식 성분의 식이 보충을 통해서 되는, 방법.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 장관 투여는 알약 또는 액체의 형태로 되는, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 이차 항-신경아교종 요법을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 이차 항-신경아교종 요법은 방사선, 수술, 또는 화학요법, 예컨대 테모졸로마이드, 로무스틴, 빈크리스틴, 마툴란, PCV, BCNU, CCNU 및/또는 DFMO인, 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 이차 항-신경아교종 제제는 테모졸로마이드인, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 테모졸로마이드의 효과적인 용량은 테모졸로마이드의 표준 단일요법 용량보다 낮은, 방법.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 유효량은 투여되는 식이의 약 0.005 w/w % 내지 약 0.1 w/w %인, 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 신경아교종은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 또는 다형상 교모세포종, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 TGF-β1-, MGMT- 및/또는 APGN-발현 형태인, 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 2,4-ds-PBN으로 치료 이전 및 후에 리포사카라이드 결합 단백질의 발현을 측정함에 의해 치료적 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 하기 단계를 포함하는 대상체에서 신경아교종 테모졸로마이드 저항의 전개를 억제하는 방법: (a) 신경아교종이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 (b) 상기 대상체에게 하기의 용량을 투여하는 단계:
    (i) 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN), 및
    (ii) 테모졸로마이드
    상기 신경아교종에서 테모졸로마이드 저항의 전개를 억제하기에 효과적인 용량.
  17. 청구항 16에 있어서, 투여는 혈액 뇌 장벽을 가로 질러 2,4-ds-PBN의 후속적인 통과를 요하는 경로를 통하여 되는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 경로는 장관, 정맥내, 또는 동맥내인, 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 효과적인 용량은 약 5 내지 약 150 mg/체중(kg)/일인, 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 장관 투여는 음식 성분의 식이 보충을 통해 되는, 방법.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 장관 투여는 알약 또는 액체의 형태로 되는, 방법.
  22. 청구항 20에 있어서, 상기 2,4-ds-PBN의 효과적인 용량은 투여되는 식이의 약 0.005 w/w % 내지 약 0.1 w/w %인, 방법.
  23. 청구항 16에 있어서, 상기 신경아교종은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 또는 다형상 교모세포종, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 TGF-β1- 또는 MGMT-발현 형태인, 방법.
  24. 청구항 16에 있어서, 이차 항-신경아교종 요법을 추가로 포함하는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 이차 항-신경아교종 요법은 방사선, 수술, 또는 화학요법, 예컨대 테모졸로마이드, 로무스틴, 빈크리스틴, 마툴란, PCV, BCNU, CCNU 및/또는 DFMO인, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 이차 항-신경아교종 제제는 테모졸로마이드인, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 테모졸로마이드의 효과적인 용량은 테모졸로마이드의 표준 단일요법 용량보다 낮은, 방법.
  28. 청구항 16에 있어서, 2,4-ds-PBN으로 치료 이전 및 후에 리포사카라이드 결합 단백질의 발현을 측정함에 의해 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. (a) 신경아교종이 있는 대상체를 확인하는 단계 및 (b) 상기 대상체에게 하기의 용량을 투여하는 단계를 포함하는 신경아교종 재발을 억제하는 방법:
    (i) 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN), 및
    (ii) 테모졸로마이드
    상기 신경아교종의 재발을 억제하기에 효과적인 용량.
  30. 청구항 29에 있어서, 투여는 혈액 뇌 장벽을 가로 질러 2,4-ds-PBN의 후속적인 통과를 요하는 경로를 통하여 되는, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 경로는 장관, 정맥내, 또는 동맥내인, 방법.
  32. 청구항 29에 있어서, 상기 신경아교종은 별아교세포종, 희소돌기아교세포종, 다형상 교모세포종 또는 전술한 것 중 임의의 것의 TGF-β1- 또는 MGMT-발현 형태인, 방법.
  33. 청구항 29에 있어서, 상기 2,4-ds-PBN의 효과적인 용량은 약 5 내지 약 150 mg/체중(kg)/일인, 방법.
  34. 청구항 29에 있어서, 신경아교종 발생을 억제하는 제2 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 이차 항-신경아교종 요법은 방사선, 수술, 또는 화학요법, 예컨대 테모졸로마이드, 로무스틴, 빈크리스틴, 마툴란, PCV, BCNU, CCNU 및/또는 DFMO인, 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 이차 항-신경아교종 제제는 테모졸로마이드인, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 테모졸로마이드의 효과적인 용량은 테모졸로마이드의 표준 단일요법 용량보다 낮은, 방법.
  38. 청구항 29에 있어서, 상기 대상체에서 신경아교종 형성에 대하여 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 청구항 1, 16 또는 29에 있어서, LBP의 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 미처리된 대조군에 비교하여 감소된 LBP 수준은 개선된 예후를 나타내는, 방법.
  40. 청구항 29에 있어서, 2,4-ds-PBN으로 치료 이전 및 후에 리포사카라이드 결합 단백질의 발현을 측정함에 의해 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 교모세포종을 검출하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계; 및
    (b) 상기 샘플에서 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 수준을 평가하는 단계를 포함하며,
    비교할만한 정상 대조군 샘플로부터의 것보다 더 높은 LBP 수준은 상기 대상체에서 교모세포종의 존재를 나타내는, 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, LBP 수준을 평가하는 단계는 면역적 평가 또는 핵산 평가를 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 면역적 평가는 ELISA, RIA, 웨스턴 블랏, 또는 면역조직화학을 포함하는, 방법.
  44. 청구항 42에 있어서, 핵산 평가는 RT-PCR, 노던 블랏, RNA-Seq 또는 마이크로어레이를 포함하는, 방법.
  45. 청구항 41에 있어서, 상기 샘플은 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변인, 방법.
  46. 교모세포종 진행을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 수준을 평가하는 단계; 및
    (c) 두 번째 시점에서 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계를 포함하며,
    단계 (b)에 비교하여 단계 (c)에서 더 높은 LBP 수준은 상기 대상체에서 교모세포종의 진행을 나타내는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, LBP 수준을 평가하는 단계는 면역적 평가 또는 핵산 평가를 포함하는, 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 면역적 평가는 ELISA, RIA, 웨스턴 블랏, 또는 면역조직화학을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 47에 있어서, 핵산 평가는 RT-PCR, 노던 블랏, RNA-seq 또는 마이크로어레이를 포함하는, 방법.
  50. 청구항 46에 있어서, 상기 샘플은 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변인, 방법.
  51. 교모세포종을 단계화하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 샘플을 획득하는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 수준을 평가하는 단계;
    (c) 저, 중 및/또는 고등급 교모세포종에 대한 대조군 샘플과 단계 (b)의 LBP 수준을 비교하는 단계, 및
    (d) 상기 대상체에서 상기 교모세포종에 대한 등급을 할당하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 청구항 46에 있어서, LBP 수준을 평가하는 단계는 면역적 평가 또는 핵산 평가를 포함하는, 방법.
  53. 청구항 47에 있어서, 면역적 평가는 ELISA, RIA, 웨스턴 블랏, 또는 면역조직화학을 포함하는, 방법.
  54. 청구항 47에 있어서, 핵산 평가는 RT-PCR, 노던 블랏, RNA-seq 또는 마이크로어레이를 포함하는, 방법.
  55. 청구항 46에 있어서, 상기 샘플은 종양 샘플, 전혈, 혈청, 혈장 또는 소변인, 방법.
  56. 교모세포종이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에게 리포사카라이드 결합 단백질 (LBP) 표적 치료제에 연결된 치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 LBP 표적 치료제는 항체, ScFv, Fab 또는 F(ab')2 또는 펩타이드인, 방법.
  58. 청구항 56에 있어서, 상기 치료제는 화학치료제, 방사선요법 제제, 면역치료제 또는 생물 제제인, 방법.
  59. 청구항 56에 있어서, 상기 화학치료제는 테모졸로마이드 또는 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)인, 방법.
  60. 청구항 56에 있어서, 상기 교모세포종은 약물 내성인, 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 교모세포종은 테모졸로마이드 저항성인, 방법.
  62. 청구항 56 또는 60에 있어서, 상기 교모세포종은 테모졸로마이드 및/또는 2,4-디설포닐 페닐 tert-부틸 니트론 (2,4-ds-PBN)으로 이전에 처리된, 방법.
  63. 청구항 56에 있어서, 상기 교모세포종은 재발성 및/또는 전이성인, 방법.
  64. 청구항 56에 있어서, LBP에 상기 치료제의 연결은 절단가능한 것인, 방법.
  65. 청구항 56에 있어서, 상기 환자 또는 상기 교모세포종에서 LBP 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  66. 대상체에서 교모세포종 경계를 확인하는 방법으로서,
    (a) 리포사카라이드 결합 단백질에 연결된 조영제를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 대상체에서 교모세포종 부위를 이미지형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 대상체에게 ELTD1, Slit-3 또는 스폰딘-1에 연결된 조영제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 청구항 66에 있어서, 상기 조영제는 염료, 방사선표지, 형광 표지, 화학발광 표지, MRI 표지 또는 근적외선 표지인, 방법.
  69. 청구항 66에 있어서, 이미지형성에 이어 상기 교모세포종을 절제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 절제하는 단계 후 상기 교모세포종 부위를 재-이미지형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  71. 대상체로부터 조직 샘플에서 교모세포종 세포를 확인하는 방법으로서,
    (a) 상기 대상체로부터 조직 샘플을 획득하는 단계
    (b) 리포사카라이드 결합 단백질에 연결된 표지와 상기 조직 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 조직 샘플에 결합된 상기 표지-LBP 콘주게이트를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 조직 샘플을 상기 대상체에 연결된 표지인 ELTD1, Slit-3 또는 스폰딘-1에 연결된 이미지 제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 청구항 71에 있어서, 상기 표지는 염료, 방사선표지, 형광 표지, 화학발광 표지, MRI 표지 또는 근적외선 표지인, 방법.
  74. 청구항 71에 있어서, 상기 조직 샘플은 고정되지 않은 신선한 생검 샘플인, 방법.
  75. 청구항 71에 있어서, 상기 조직 샘플은 고정된 생검 샘플인, 방법.
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