KR20200053305A

KR20200053305A - 미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200053305A
Application number: KR1020180136760A
Authority: KR
Inventors: 최준식; 이영화; 박해인
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-05-18
Also published as: KR102156733B1

Abstract

본 발명은 미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 포스포니움 글리콜 키토산 유도체(GC-TPP 및 GME-TPP)는 세포 독성이 거의 없으며, 세포 안으로 이동이 우수하며, 세포 안으로 이동된 후, 특이적으로 미토콘드리아로 이동하는 특징이 있을 뿐만 아니라, 항암제 등의 소수성 약물을 본 발명의 미셀 내부에 용이하게 탑재할 수 있어, 약물전달체로서 우수한 효과가 있는 것이다.

Description

미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도{Self-assembled polymeric micelles of phosphonium glycol chitosan derivatives specifically targeting mitochondria, preparation method and uses thereof}

본 발명은 미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

바이오 의약품은 제약 업계에서 점점 더 중요해지고 있는데, 그 중에서도 약물 전달 시스템을 기반으로 하는 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 약물 전달 시스템(DDS)은 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 극대화하기 위하여, 효과적으로 장기간 혈중 수준을 유지하고, 약물을 타겟 부위로 선택적 전달하는 것이 목표이다. 이전의 화학 요법 치료에서 약물 운반체는 투여 횟수가 증가함에 따라 항암제의 다제 내성(MDR)이 발생하여 계속적인 약물 투여해도 큰 영향을 미치지 않으므로, 이를 극복하기 위한 방법 중 하나로, 장기간 혈액 속에서 유지할 수 있는 나노 크기의 전달체를 제조하여 그 전달체를 통해 약물의 농도를 유지하는 방법이 개시되었고, 또 다른 방법은 질병 부위 즉, 표적 부위로 선택적 전달을 위한 고분자에 약물을 결합시키는 방법이 있다.

한편, 키토산[β-(1-4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루칸]은 키틴의 탈 아세틸화에 의해 생성되는 천연 다당류의 일종이다. 키토산은 독성이 없고, 낮은 면역원성, 항균 효과, 항암 효과 및 생분해성이 있다.

또한, 글리콜 키토산은 일종의 키토산 유도체이며, 표면에 1차 아민기를 가진 양이온성 폴리머로, 모든 pH에서 키토산의 특성이 있으며, 키토산에 비해 용해도가 좋은 장점이 있다. 또한 글리콜 키토산의 2-아민-2-데옥시 모이어티를 통해 다양한 유도체를 만들 수 있으며, 기능성 리간드에 결합하기가 매우 쉽다.

또한, TPP(Triphenylphosphonium)는 포도상구균(Staphylococcus epidermidis)과 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성뿐만 아니라 항암 활성이 있으며, 미토콘트리아 타겟 구조로 잘 알려져 있다. TPP의 독특한 화학 구조인, 페닐기에 의해 친유성기와 양전하의 포스포니움(phosphonium)기를 가지고 있어 미토콘드리아의 외부 수용액에서 비극성 지질 환경인 미토콘드리아 막으로 들어가는 활성화 에너지가 낮아서 쉽게 통과할 수 있다. 최근 연구들에서, TPP는 수용성 고분자를 결합하거나 양 친매성 공중합체를 표적 미토콘드리아에 결합시키는데 사용되어왔다.

한편, 본 발명 관련 기술로는 한국등록특허 제1720458호에 글리콜키토산-디쿠알리니움 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 기술이 개시되어 있으나, 본 발명의 미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것은 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 포스포니움 글리콜 키토산 유도체(GC-TPP 및 GME-TPP)는 세포 독성이 거의 없으며, 세포 안으로 이동이 우수하며, 세포 안으로 이동된 후, 특이적으로 미토콘드리아로 이동하는 특징이 있을 뿐만 아니라, 항암제 등의 소수성 약물을 본 발명의 미셀 내부에 용이하게 탑재할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글리콜 키토산 또는 이의 유도체;와 트리페닐포스포니움;으로 이루어진 중합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 글리콜 키토산 또는 이의 유도체;와 트리페닐포스포니움;으로 이루어진 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀을 포함하는 약물전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약물 전달체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 미토콘드리아 표적형 포스포니움 글리콜 키토산 유도체의 자가조립 중합체 미셀, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 약물전달 시스템은 세포 독성이 없으며, 세로 내로 이동한 후, 특이적으로 미토콘드리아로 이동하는 특징이 있어 미토콘트리아 타겟 약물 전달에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 자가조립 GC-TPP 및 GME-TPP 미셀 및 이의 미토콘드리아 표적 단계를 나타낸 구성도이다.
도 2는 GC-TPP, GC-MA 및 GME-TPP 중합체의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 3은 GC, GC-MA, GC-MA-EDA 및 GME-TPP에 대한 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 GC, GC-TPP, GME-TPP 및 TPP에 대한 FT-IR 스펙트럼이다.
도 5는 FE-SEM(Field Emission Scanning Electron Microscope)으로 측정한 GC-TPP 및 GME-TPP의 형태 및 DLS(dynamic light scattering)으로 측정한 입자의 크기를 나타낸 것으로, (A,C)는 GC-TPP이고, (B,D)는 GME-TPP이다(scale bars= 500nm).
도 6은 유세포 분석기를 이용한 중합체의 세포 결합을 확인한 결과로, AlexaFluor 488 표지된 0.1㎍/㎖의 GC, GME, GC-TPP 및 GME-TPP를 24시간 동안 처리한 HeLa 세포를 아무것도 처리하지 않은 세포(Control)와 비교한 녹색 형광 강도의 변화를 나타낸 히스토그램이다. (A) Control, (B) GC, (C) GME, (C) GC-TPP, (E) GME-TPP (F) GC, GME, GC-TPP 및 GME-TPP를 겹친 그래프이다.
도 7은 HeLa 세포주의 공촛점 레이저 현미경 이미지이다. 핵과 중합체는 Bisbenzimide(Hochest 33342, 청색) 및 Alexafluor 488 (녹색)로 염색하였고, 미토콘드리아는 Mitotracker Red FM으로 염색한 것이다. 노란색 형광은 중합체(녹색)와 Mitotracker (적색)의 형광 이미지를 겹쳐서 나타난 것이다.
도 8은 HEK 293(A), HeLa(B), NIH3T3(C) 및 HepG2(D) 세포의 세포생존율(%)을 확인한 결과이다.
도 9는 HEK 293(A), HeLa(B), NIH3T3(C) 및 HepG2(D) 세포에서의 GC, GC-TPP 및 GME-TPP의 세포독성(cytotoxicity)을 확인한 결과이다.
도 10은 GC-TPP 및 GME-TPP가 HeLa 세포에서 미토콘드리아를 표적화하는 것을 확인한 공초점 이미지이다.

본 발명은 글리콜 키토산 또는 이의 유도체;와 트리페닐포스포니움;으로 이루어진 중합체에 관한 것이다(도 1).

상기 중합체는 미토콘드리아 표적형인 것이 특징이며, 하기 반응식 (1)에 따라 글리콜 키토산(GC)과 트리페닐포스포니움(TPP) 클로라이드를 반응 제1 용매 내에서 반응시켜 제조된 GC-TPP 중합체이거나;

반응 제2 용매 내에서 글리콜 키토산(GC)의 아민기에 메틸아크릴레이트(MA)를 첨가반응시켜 글리콜 키토산-메틸아크릴레이트(GC-MA)를 합성하고, 상기 합성된 GC-MA에 에틸렌디아민(EDA)를 첨가하여 GC-MA-EDA(GME)를 합성하여, 상기 합성된 GME를 트리페닐포스포니움(TPP) 클로라이드와 반응시켜 제조된 GME-TPP 중합체인 것을 특징으로 하는 중합체다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서, n은 독립적으로 1~10,000인 정수이다.

상기 반응 제1 용매 또는 반응 제2 용매는 독립적으로 물, C₁~C₄의 저급알코올, 아세톤, DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethyl sulfoxide), 아세토니트릴 및 THF(Tetrahydrofuran)중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물 및 C₁~C₄의 저급알코올의 혼합물이고, 가장 바람직하게는 메탄올이지만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 반응식 1의 반응온도는 20~60℃가 바람직하며, 더 바람직하게는 30~45℃일 수 있고, 바람직한 반응시간은 1~5일이고, 더 바람직하게는 2~4일이지만 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 글리콜 키토산 또는 이의 유도체;와 트리페닐포스포니움;으로 이루어진 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀에 관한 것이다. 상기 글리콜 키토산-트리페닐포스포니움(GC-TPP) 미셀은 내부에 소수성 약물을 탑재할 수 있으며, 상기 소수성 약물은 항암제인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 독소루비신이지만 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀을 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 약물 전달체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 암은 자궁경부암, 간암, 위암, 유방암, 폐암, 뇌암, 신경교종, 전립선암, 자궁암 또는 피부암인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 약물 전달체 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있고, 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비 경구 투여 시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, '약제학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

1. 재료구입

글리콜 키토산(60% 이상, 탈 아세틸화 정도=91.6%), 메틸 아크릴레이트 (99%), 메탄올(무수, 99.8%), 에틸렌디아민(99%이상), (메톡시카르보닐메틸) 트리페닐포스포늄 브로마이드(98%) 및 나일 레드는 시그마-알드리치에서 구입하였다.

TSKgel G5000pWxl-CP 및 TSKgel G3000PWx1-CP 컬럼을 통해 겔 투과 크로마토 그래피(GPC)를 이용하여 글리콜 키토산 분자량(Mn=198kDa, Mw=490kDa) 및 분산지수(Mw/Mn)=2.47을 확인하였다. EZ-cytox 시약(EZ-cytox enhanced cell viability assay kit)와 EZ-LDH 시약(Cell Cytoxicity Assay Kit)는 대일 랩 서비스(서울, 한국)에서 구입하였다. 소 태아 혈청(FBS), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM) 및 100×항생제-항균제를 깁코(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. Alexafluor488 5-SDP 에스테르(Sulfodichlorophenol Ester)와 MitoTracker^®Red CMXRos는 인비트로젠(Seoul, Korea)에서 구입했다.

2. 세포배양

인간 간암 세포주 HepG₂, 인간배아신장 유래 세포주 HEK 293, 자궁경부암 세포주 HeLa 및 마우스 정상 섬유아세포 NIH-3T3를 10% FBS, 90% DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 및 1% 항생제와 함께 습도 5% CO₂이고,37℃인 조건으로 배양하였다.

실시예 1. 글리콜 키토산( GC )-트 리페닐포스포니움(TPP)의 합성

GC-TPP는 마이클 첨가 반응이라 불리는 화학 반응을 통해 합성하였다(도 2). 먼저, (메톡시카보닐메틸) 트리페닐포스포니움 브로마이드를 250㎖의 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 실온에서 10분 동안 90㎖의 메탄올과 혼합하였다. 그런 다음 증류수 (10㎖)에 용해된 글리콜 키토산을 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 질소 가스를 채우고 140rpm으로 진탕하면서 37℃에서 3일 동안 항온 배양하였다. 3일 후, 메탄올을 증발시키고, 생성물을 분자량 1000Da를 갖는 막을 사용하여 증류수에 대해 3일 동안 투석시켰다. 첫째 날에는 100% 메탄올에서 투석을 하였고, 둘째 날에는 메탄올과 증류수의 혼합물을 투석하였으며, 마지막 날은 100%의 증류수로 투석하였다. 최종 생성물을 진공 하에 동결 건조시켰다.

GC-MA를 얻기 위해, 메틸아크릴레이트 및 90㎖의 메탄올을 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 넣고 교반하였다. 그런 다음 증류수(10㎖)에 용해된 글리콜 키토산을 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 질소 가스를 채우고 140rpm에서 진탕하면서, 37℃에서 3일 동안 항온 배양하였다. 3일 후, 에틸렌디아민을 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 넣고 반응시켰다. 플라스크 내부를 질소 가스로 채운 후, 37℃에서 140rpm으로 3일 동안 진탕 배양기에서 반응시켰다. 3일 후, 메틸아크릴레이트 및 생성물로부터의 메탄올을 증발시켰다. 분자량이 1000Da인 투석막을 사용하여 증류수에서 1일 동안 투석하고 동결 건조하여 GC-MA-EDA를 획득하였다.

GC-MA-EDA를 상기 용액에 용해시키고(메탄올:증류수=9:1, v/v), 250㎖의 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고 교반하였다. 이어서, 메탄올에 용해된 (메톡시카르보닐메틸) 트리페닐포스포니움 브로마이드를 플라스크에 추가하였다. 플라스크를 질소 가스로 채우고 140rpm으로 진탕하면서 37℃에서 3일 동안 항온 처리하였다. 3일 후, 메탄올을 증발시키고, 생성물을 분자량 1000Da를 갖는 막을 사용하여 증류수에 대해 3일 동안 투석시켰다. 첫째 날에는 100% 메탄올에서, 둘째 날에는 메탄올과 증류수로, 마지막 날은 100% 증류수로 투석하였다. 최종 생성물을 진공 하에 동결 건조시켰다.

GC, GC-TPP, GC-MA, GC-MA-EDA 및 GME-TPP는 ¹H 핵자기공명분광분석(AVANCE, 600, FT-NMR, 독일 Bruker) 및 푸리에 변환 적외선 분광분석(FT-IR, Bio-Rad Laboratories Inc., Cambridge, USA)을 통해 평가되었다(도 3 및 4).

GC(Glycol chitosan): ¹H-NMR(600MHz, D₂O, ppm) δ2.0-2.1(NHCOCH₃, acetyl group), 2.6-2.8(deacetylated monomer의 H2), 3.4-3.9(H2~H8, multiplet, D-glucosamine unit 및 hydroxyl ethyl substituents), 4.3-4.5(H1)

GC-TPP(Glycol chitosan-Triphenylphosphonium):¹H-NMR(600MHz, D₂O, ppm) δ2.0-2.1(NHCOCH₃, acetyl group), 2.8-3.0(deacetylated monomer의 H2), 3.2-3.4 (TPP에 있는 methylene의 H9), 3.6-4.0(H2~H8, multiplet, D-glucosamine unit 및 hydroxyl ethyl substituents), 7.5-7.7(TPP에 있는 phenyl rings의 H10)

GC-MA(Glycol chitosan-Methyl acrylate): ¹H-NMR(600MHz, D₂O, ppm) δ2.0-2.1 (NHCOCH₃, acetyl group), 2.4-2.6 (deacetylated monomer의 H2, OCCH₂, H10), 2.8-3.0 (H₂CCH₂N, H9), 3.4-3.9 (H2~H8, multiplet, D-glucosamine unit 및hydroxyl ethyl substituents), 4.3-4.5(H1)

GC-MA-EDA(Glycol chitosan-Methyl acrylate-Ethylenediamine):¹H-NMR(600 MHz, D₂O, ppm) δ2.0-2.1(NHCOCH₃, acetyl group), 2.3-2.5(deacetylated monomer의 H2, OCCH, H10), 2.9-3.1(H₂CCH₂N, H9), 3.2-3.4(CONHCH₂, H11), 3.4-3.9(H2~H8, multiplet, D-glucosamine unit and hydroxyl ethyl substituents), 4.4-4.5 (H1)

GME-TPP(Glycol chitosan-Methyl acrylate-Ethylenediamine-Triphenylphosphonium): ¹H-NMR(600MHz, D₂O, ppm) δ2.0-2.1(NHCOCH₃, acetyl group), 2.5-2.7(deacetylated monomer의 H2, OCCH, H10), 2.8-3.1(HCCHN, H9), 3.2-3.4(TPP에 있는 methylene의 H9, CONHCH₂, H11), 3.4-3.9(H2~H8, multiplet, D-glucosamine unit 및 hydroxyl ethyl substituents), 7.5-8.0(TPP에 있는 phenyl rings의 H13)

실시예 2. GC - TPP 와 GME - TPP 의 TPP 함량 분석

GC-TPP와 GME-TPP의 TPP 함량을 측정하기 위해 자외선/가시광선 분광 광도계 (Optizen POP, Mecasys, Korea)를 사용하였다. 우선, 메탄올과 증류수에 1:1의 부피비로 TPP를 녹여 각 농도별로 제조하였다. 파장 267.6nm에서의 흡광도를 측정하고, 표준 곡선을 작성하였다. 이 후 GC-TPP와 GME-TPP를 메탄올과 증류수에 1:1의 부피비로 녹여 흡광도를 측정하여 표준 곡선과 비교하였다.

그 결과, 표 1에 개시한 바와 같이, GC-TPP의 치환도는 1H-NMR에서 11%, UV-Vis 분광법에서 26%였다. GME-TPP의 경우, 1H-NMR에서 36%, UV-Vis 분광기에서 45%였다.

글리콜 키토산(GC)에 TPP가 치환된 정도

	percentage of grafting ratio(%)
polymers	1H NMR	UV-spectroscopy
GC-TPP	11	26
GME-TPP	36	45

실시예 2. 크기 및 제타 전위 측정

(1) FE- SEM (Field Emission Scanning Electron Microscopy) 및 DLS(dynamic light scattering) 분석

FE-SEM 이미지는 30kV에서 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, ZEISS Merlin Compact, Carl Zeiss Inc., 독일)에 의해 관찰되었다. GC-TPP 및 GME-TPP를 증류수에 용해시키고 30~40℃에서 15~20분 동안 초음파 처리하였다. 시료 10㎕를300 메쉬 copper grid의 표면에 놓고 자연 건조한 상태에서 16시간 동안 건조시킨 후 확인하였다.

평균 직경은 ELS-Z 기기(Photal, Otusuka Electronics, Otsuka, Japan)를 사용하여 25℃에서 DLS(dynamic light scattering) 방법으로 측정하였다. 시료를 증류수에 용해시키고 30~40℃에서 15~20분 동안 초음파 처리하여 확인하였다.

(2) 표면 제타 전위 분석

표면 제타 전위는 Zetasizer Nano-Zs(Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)를 사용하여 25℃에서 측정되었다. 시료는 DLS 시료와 동일하게 준비되었다.

그 결과는 하기 표 2에 개시한 바와 같이, FE-SEM으로 측정한 GC-TPP의 크기는 210nm이고, GME-TPP의 크기는 430nm이며, 물에 녹여 DLS로 측정한 GC-TPP의 입자크기는 590±10nm이고, GME-TPP의 입자 크기는 760±20nm인 것으로 확인되었고(도 5), GC-TPP의 제타 전위는 18.3±1mV이고, GC-TPP의 제타전위는 25.9±4mV로 나타났다.

GC-TPP 및 GME-TPP의 평균 직경 및 제타 전위 값

직경 크기(nm)
	FE-SEM	DLS	제타전위(mV)
GC-TPP	210	590±10	18.3±1
GME-TPP	430	760±20	25.9±4

실시예 4. In vitro 세포 내 흡수 및 분포 확인

HeLa 세포를 사용하여 GC-TPP와 GME-TPP의 세포 내 흡수 및 분포를 조사하였다.

세포를 5.0×10³cells/well의 밀도로 8웰 플레이트(u-slide 8 well, ibidi, Germany)에 도말하고, 5% CO₂를 함유하는 37℃에서 배양하였다. 글리콜 키토산(GC), GC-TPP 및 GME-TPP를 AlexaFluor488 5-SDP 에스테르(Sulfodichlorophenol Ester)로 표지하였다. 24시간 후, 형광 표지된 시료(최종 농도=5㎍/㎖)을 세포에 처리하고 인큐베이터에서 배양하였다. 미토콘드리아를 실온에서 5분 동안 마이토트래커로 처리하였다. 세포의 핵 염색을 Hochest33342(Bisbenzimidetrihydrochloride)로 5분 동안 처리하였다. 세포를 DPBS로 세척한 후 공초점 레이저 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 분석하였다.

GC, GME, GC-TPP 및 GME-TPP의 세포 내 흡수는 HeLa 세포에서 유세포 분석기 (FACS Canto Ⅱ, BD Biosciences)로 형광을 사용하여 분석하였다. 유세포 분석을 위해 약 2.0×10⁵ 세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 24시간 동안 GC, GME, GC-TPP 및 GME-TPP에 AlexaFluor488로 표지한 시료를 각 웰당 0.1㎍/㎕로 처리하였다. 세포를 1500rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 수집하고 DPBS 500㎕에 재 현탁시켰다. 각 세포 시료에 대한 1.0×10⁴ 세포의 형광 강도는 BD Cell Quest Pro Software를 사용하여 수행하였다.

그 결과, 도 6 및 7에 개시한 바와 같이 TPP를 연결하지 않은 GC와 GME는 Control에 비해 약간 증가한 형태로 나타났지만 그 양이 매우 적었다. 이는 GC와 GME 자체로는 세포 안으로 유입이 어려움을 나타내주고 있다. 반면에 TPP를 연결한 GC-TPP와 GME-TPP는 GC와 GME에 비해 많은 양의 나노입자가 유입된 것을 확인할 수 있었다. 또한 GC-TPP보다는 GME-TPP가 더 많이 유입된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. In Vitro 세포 생존률 (%) 분석

세포 독성 평가를 위해, 인간 간암 세포주 HepG₂, 인간배아신장 유래 세포주 HEK 293, 자궁경부암 세포주 HeLa 및 마우스 정상 섬유아세포 NIH-3T3을 96웰 조직배양 플레이트에 1.0×10⁴ 세포/웰의 밀도로 접종하고, 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM상에서 배양하였다.

다음날, 세포를 24시간 동안 각 시료의 다양한 농도(100, 50, 25, 12.5㎍/㎖)로 처리한 후, 10㎕의 EZ-Cytox 및 EZ-LDH 시약을 각 웰에 첨가하였다. 2시간 후, 96웰 마이크로플레이트 판독기(VersaMax, molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm와 590nm에서 EZ-Cytox 및 EZ-LDH를 측정하였다.

Cell viability(%) = [(Absorbance of control - Absorbance of sample)/Absorbance of control]×100

그 결과, 도 8에 개시한 바와 같이, 본 발명에 따른 GC, GC-TPP 및 GME-TPP를 처리해도 세포 생존률은 아무것도 처리하지 않은 경우와 거의 유사하게 나타났으며, 도 9에 개시한 바와 같이 세포독성도 거의 없는 것으로 나타났다.

실시예 6. 공초점 현미경을 통한 GC - TPP 및 GME - TPP 의 미토콘드리아 표적 평가( CLSM )

GC-TPP 및 GME-TPP가 미토콘드리아로 표적화 하는지 여부를 확인하기 위해 투석 방법을 사용해 나일 레드가 포함된 GC-TPP 및 GME-TPP를 제조하였다. 시료 용액을 실온에서 1일 동안 분자량 컷-오프 1,000Da 투석막을 사용하여 4L의 증류수에 대해 투석하였다. 미토콘드리아의 표적은 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰하였다.

HeLa 세포를 웰 당 1.0×10⁴ 세포의 농도로 8웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 다음날 세포를 0.1㎍/㎕의 농도로 나일 레드가 포함된 GC-TPP 및 GME-TPP를 처리하였다. 인큐베이션 후, Hoechst 33342 및 마이토트래커 Red로 5분 동안 세포를 염색하였다. 그런 다음, 세포를 DPBS로 세척하고 Zeiss LSM 5 Live 공초점 레이저 현미경을 사용하여 분석하였다.

그 결과 도 10에 개시한 바와 같이, 본 발명의 GC-TPP 및 GME-TPP가 미토콘드리아로 표적화한다는 것을 확인하였다.

Claims

글리콜 키토산 또는 이의 유도체;와 트리페닐포스포니움;으로 이루어진 중합체.
제1항에 있어서, 상기 중합체는 미토콘드리아 표적형인 것을 특징으로 하는 중합체.
제1항에 있어서, 상기 중합체는 하기 반응식 (1)에 따라 글리콜 키토산(GC)과 트리페닐포스포니움(TPP) 클로라이드를 반응 제1 용매 내에서 반응시켜 제조된 GC-TPP 중합체이거나;
반응 제2 용매 내에서 글리콜 키토산(GC)의 아민기에 메틸아크릴레이트(MA)를 첨가반응시켜 글리콜 키토산-메틸아크릴레이트(GC-MA)를 합성하고, 상기 합성된 GC-MA에 에틸렌디아민(EDA)를 첨가하여 GC-MA-EDA(GME)를 합성하여, 상기 합성된 GME를 트리페닐포스포니움(TPP) 클로라이드와 반응시켜 제조된 GME-TPP 중합체인 것을 특징으로 하는 중합체:
[반응식 1]

상기 반응식 1에서, n은 독립적으로 1~10,000인 정수이다.
제3항에 있어서, 상기 반응 제1 용매 또는 반응 제2 용매는 독립적으로 물, C₁~C₄의 저급알코올, 아세톤, DMF(dimethylformamide), DMSO(dimethyl sulfoxide), 아세토니트릴 및 THF(Tetrahydrofuran)중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 중합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 글리콜 키토산 또는 이의 유도체;와 트리페닐포스포니움;으로 이루어진 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀.
제5항에 있어서, 상기 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀은 내부에 소수성 약물을 탑재하는 것을 특징으로 하는 미셀.
제6항에 있어서, 상기 소수성 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 미셀.
제5항의 GC-TPP 또는 GME-TPP 중합체가 자가조립되어 형성한 미셀을 포함하는 약물전달체.
제8항에 있어서, 상기 약물전달체는 내부에 독소루비신을 탑재한 약물전달체인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
제9항의 약물 전달체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 간암, 위암, 유방암, 폐암, 뇌암, 신경교종, 전립선암, 자궁암 또는 피부암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.