KR20200048119A - 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GDF-15(Growth Differentiation Factor-15) 단백질을 포함하는, 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating pulmonary fibrosis}

본 발명은 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

폐 섬유증(pulmonary fibrosis)은 폐조직이 굳어서 심각한 호흡 장애를 불러일으키는 호흡기 질환이다. 폐가 굳는다 함은 섬유질 결합조직의 과다누적을 의미하며 이 과정을 섬유화라고 한다. 폐의 섬유화가 진행됨에 따라 여러가지 합병증이 나타나는데, 폐활량 감소와 산소 확산 장애로 발생하는 전신성 저산소증, 섬유조직이 수축함에 따라 폐 동맥 및 모세혈관이 눌려 발생하는 폐고혈압, 폐순환 장애로 우심실에 혈액이 고여 유발되는 심부전, 그 외에도 혈전증, 폐렴 등이 있다. 또한 염증과 섬유화로 인해 폐암 발병률이 증가할 수 있다.

폐 섬유증은 독성물질의 흡입이나 지속적인 염증이 원인인 경우도 있으나, 특정 원인을 밝힐 수 없는 특발성 폐섬유증도 있다.

폐섬유증으로 인해 섬유화가 진행된 폐조직을 복구할 수 있는 방법은 아직 없으며, 진단 후 평균 생존기간이 2~3년 정도로 치명적인 질환이다. 현재는 염증반응을 억제하는 스테로이드 제제와 면역억제제를 폐섬유증 치료제로 사용하고 있다. 그러나 병의 경과가 염증반응 이후 섬유화 반응이 진행되고, 대부분의 환자들은 호흡곤란으로 병원에 내원하기 때문에 이미 염증반응 시기를 지나 섬유화 반응시기부터 치료가 시작된다. 따라서 항염증치료의 효과를 기대하기는 어렵다는 문제점이 있다.

한국등록특허 제10-0860903호

본 발명은 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 폐 섬유증의 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. GDF-15(Growth Differentiation Factor-15) 단백질을 포함하는, 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 GDF-15 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

3. 위 1 또는 2의 조성물을 인간 이외의 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 섬유증의 치료방법.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 폐 섬유증을 치료하는 새로운 전략으로서 섬유아세포를 표적하여 치료할 수 있다. 폐 섬유증은 섬유아세포의 과다 활성화 및 폐포 상피의 해체를 수반하는 비정상적인 상처 회복으로 인한 것으로, 섬유아세포를 표적으로 하는 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 항염증 치료제보다 폐 섬유증의 예방 또는 치료 효과가 우수하다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 단백질을 유효성분으로 하기 때문에, 전통적인 화학적 합성 의약품보다 부작용이 적고 임상 시험 성공률도 높다.

도 1은 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 증식, 세포 사멸 및 괴사 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 α-SMA과 콜라겐-1α의 면역 블로팅 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 열 처리된 상피세포 HaCaT 유래 인자의 섬유아세포의 성장 억제 효과 및 섬유아세포의 증식, 세포 사멸 및 괴사 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 트립신 처리된 상피세포 HaCaT 유래 인자의 섬유아세포의 성장 억제 효과 및 상피세포 HaCaT 유래 인자를 포함한 배지를 분획한 2개의 분획물의 섬유아세포의 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 상피세포 HaCaT 및 폐암세포 A549 세포로부터 수집된 조건화배지에 포함된 사이토카인의 프로파일링 결과이다.
도 7은 상피세포 HaCaT 및 폐암세포 A549 세포로부터 수집된 조건화배지에 포함된 사이토카인의 프로파일링 결과를 수치환 한 것이다.
도 8은 상피세포 HaCaT-조건화배지에 풍부한 사이토카인과 섬유아세포를 억제하는 사이토카인 후보 물질을 나타낸 것이다.
도 9 CST3, GDF-15 또는 IL-1α의 siRNA로 각각 형질감염된 상피세포 HaCaT로부터 얻은 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 CST3 또는 GDF-15의 siRNA로 각각 형질감염된 상피세포 HaCaT로부터 얻은 조건화된 배지에서의 배양 시간별 면역블로팅 결과 및 CST3 또는 GDF-15의 다른 mRNA를 녹다운시키는 siRNA에 대한 면역블로팅 결과를 나타낸 것이다.
도 11의 (a)는 CST3 또는 GDF-15의 siRNA로 각각 형질감염된 상피세포 RPMI2650로부터 얻은 조건화배지의 면역블로팅 결과 및 섬유아세포의 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 11의 (b) 및 (c)는 CST3 또는 GDF-15의 siRNA로 각각 형질감염시키거나 또는, CST3 및 GDF-15 siRNA로 동시에 형질감염시킨 상피세포 HaCaT로부터 얻은 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 증식, 세포 사멸 및 괴사 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 CST3 및 GDF-15 단백질의 섬유아세포 증식 억제 및 ECM 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 CST3, GDF-15 또는 CST3+GDF-15 단백질과 함께 처리된 섬유아세포의 α-SMA과 콜라겐-1α의 면역 블로팅 결과 및 mRNA 발현 수준을 수치환 결과를 나타낸 것이다.
도 14의 (a)는 FBS(Serum) 존재 하에 CST3 또는 GDF-15 단백질과 함께 처리된 섬유아세포의 Smad2 및 Smad3의 인산화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 14의 (b)는 TGF-β1으로 자극 시에 CST3 또는 GDF-15 단백질과 함께 처리된 섬유아세포의 TGF-β 수용체, Smad2 및 Smad3의 인산화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 15의 (a) 및 (b)는 TGF-β1으로 자극에 의해 증가한 섬유아세포의 성장 및 ECM 생산에 대한 CST3 및 GDF-15 단백질의 효과를 나타낸 것이다.
도 15의 (c)는 TGF-Smad 신호 전달 경로에 대한 CST3 및 GDF15의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 16은 폐 섬유증 동물 모델로 사용된 마우스에 블레오마이신 및 펩티드 주입 실험 계획을 나타낸 것이다.
도 17은 CST3 및 GDF15 투입된 마우스의 몸무게 및 생존율을 나타낸 것이다.
도 18은 대조군과 블레오마이신 처리된 폐 및 조직 절편을 염색하여 폐 섬유증 정도를 확인한 결과이다.
도 19는 대조군과 블레오마이신 처리된 폐에서의 CST3 및 GDF-15에 대한 면역블로팅 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 블레오마이신 처리된 폐에 CST3, GDF-15 또는 CST3+GDF-15 단백질 투여 시 섬유화 개선 효과를 나타낸 것이다.
도 21은 블레오마이신 처리된 폐에 CST3, GDF-15 또는 CST3+GDF-15 단백질 투여 시, α-SMA과 콜라겐-1α에 대한 면역 조직 화학 염색 결과 및 이를 수치화한 그래프를 나타낸 것이다.
도 22는 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 세포 주기 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 세포 증식 주기 및 세포 사멸 주기의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 열 처리된 상피세포 HaCaT 유래 인자의 섬유아세포의 세포 증식 주기 및 세포 사멸 주기의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 GDF-15 또는 IL-1α의 siRNA로 각각 형질감염된 폐암세포 A549로부터 얻은 조건화된 배지에서의 섬유아세포의 성장 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 26은 CST3, GDF-15, CST3+GDF-15의 siRNA로 각각 형질감염된 상피세포-조건화된 배지에서의 섬유아세포의 세포 증식 주기 및 세포 사멸 주기의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 CST3 및 GDF-15 단백질의 상피세포 HaCaT 및 암세포 A549의 증식 억제 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구체적인 실시형태를 설명하기로 한다. 그러나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 GDF-15(Growth Differentiation Factor-15) 단백질을 포함하는, 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 폐 섬유증은 특발성 폐 섬유증(IPF, idiopathic pulmonary fibrosis)을 의미한다. 특발성 폐 섬유증은 과도한 세포외 기질 침착(deposition)과 폐 실질 구조(lung parenchymal architecture)의 붕괴와 연관된 만성 진행성 폐 질환으로, 2~4년의 생존율을 보이는 심각한 호흡 기능 부전으로 이어진다.

특발성 폐 섬유증의 섬유성 특징은 활성화된 섬유아세포의 과증식에 기인한 것이다. 대부분의 조직에서, 상피-중간엽 항상성(epithelial-mesenchymal homeostasis)은 정상적인 구조와 기능을 위해 유지되어야 한다. 상피가 손상되면 상피세포, 섬유아세포 및 혈관 세포를 비롯한 다양한 세포는 깨진 장벽을 복구하기 위해 협력하여 조화롭게 작용하며, 적절한 회복을 위해 상처 치유 과정은 세 과정을 완료해야 한다. 염증기(inflammatory phase) 동안 손상된 상피세포는 면역 세포 및 섬유아세포를 자극하는 다양한 사이토카인을 방출한다. 증식 단계(proliferation phase) 동안 상주 섬유아세포(resident fibroblasts)는 증식하고 공격적 근섬유아세포(aggressive myofibroblasts)로 전이 분화되어 콜라겐 및 기타 매트릭스 단백질을 생성하여 조직 구조를 빠르게 회복시킨다. 또한 상피는 장벽 기능을 복원하기 위해 스스로 재구성된다. 마지막으로, 성숙 단계(maturation phase)에서 모든 활성화된 신호는 상피-중간엽의 항상성의 회복을 허용하기 위해 중단된다. 특히, 긴급 치유에 필요한 섬유성 부담을 줄이기 위해 근섬유아세포는 세포 사멸을 겪고 복구된 조직에서 제거된다.

특발성 폐 섬유증은 현재 염증의 직접적인 결과보다는 상처 치유 동안의 상피-중간엽의 항상성의 장애로 이해된다. 손상된 상피가 섬유화 진행을 유발하는 이유를 설명하기 위한 몇 가지 가설이 제안되어 왔다. 손상에 대한 반응으로, 상피세포는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)을 분비하고, 상피-중간엽 전이를 거쳐 섬유아세포-자극성 사이토카인(fibroblast-stimulating cytokines)을 생성한다. 반복된 상처 재생 후, 상피세포는 스스로 재생할 수 있는 잠재력을 잃어버린다. 결과적으로, 상피의 완전성이 복구되지 않기 때문에 상처 치유 과정을 중지할 수 없고 섬유아세포 자극이 계속된다. 또한, 근섬유아세포는 상피세포 사멸을 유도하고 상피 복구 과정을 방해한다. IPF 조직에서 손상된 상피세포와 성장한 근섬유아세포는 양성 피드백 루프를 활성화시켜 막대한 섬유화와 폐포 파괴를 일으킨다.

IPF의 발병 기전을 이해하기 위한 많은 노력에도 불구하고, 상피-중간엽의 항상성 유지에 있어서 섬유아세포에 대한 상피세포 조절의 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 섬유아세포-조절 사이토카인(fibroblast-controlling cytokines)을 확인하는 것은 IPF 치료를 위한 새로운 펩티드 약물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 GDF-15 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것으로서(표 1), 구체적으로는 112개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

서열번호	아미노산 서열
2	ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

또한, 상기 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 단백질은 폐 섬유증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 한 상기 서열의 말단 부위에서 하나 이상의 아미노산이 첨가 또는 제거되거나, 상기 서열의 일부 아미노산이 변이된 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다. 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 상기 서열과 90% 이상, 구체적으로는 96% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더 구체적으로는 99% 이상 동일한 아미노산 서열로서, 폐 섬유증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 단백질 역시 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 따른 단백질은 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 또는/및 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가 되어 변형된 형태일 수 있다. 특히, 화학적으로 합성한 단백질의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화(acetylation) 또는/및 C-말단을 아미드화(amidation) 할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 단백질은 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여, 융합파트너 및 본 발명의 단백질을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 이를 숙주 세포에 형질전환시킨 후, 융합 단백질 형태로 발현하고, 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 단백질을 절단, 분리하여 원하는 단백질을 생산할 수 있다. 이를 위하여 예를 들어 Factor Xa나 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합파트너와 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 GDF-15 단백질은 TGF-Smad 신호 전달 경로를 비활성화 할 수 있다. 또한 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 GDF-15 단백질은 섬유아세포의 성장 또는 활성을 억제할 수 있다. 섬유아세포의 성장 및 활성화는 TGF-Smad 신호 전달 경로에 크게 의존한다. 구체적으로, GDF-15 단백질은 TGF-β 수용체와 Smad2/3를 비활성화할 수 있다 (도 14a, 14b). 상기 GDF-15 단백질은 TGF-β 수용체에 대한 부분 아고니스트(agonist)로서 작용할 수 있다. 일반적으로, 약한 아고니스트는 완전한 아고니스트가 없을 때 수용체를 자극할 수 있지만, 완전한 아고니스트 존재 하에서 수용체와 결합하도록 경쟁함으로써 수용체 신호 전달을 비활성화시키는 작용을 한다. IPF 폐에서 TGF-β가 풍부한 환경을 고려하면, GDF-15는 섬유 형성(fibrogenesis)의 억제제로서 작용할 수 있다. 따라서, 상기 GDF-15 단백질은 TGF-Smad 신호 전달 경로를 비활성화 할 수 있고, TGF-Smad 신호 전달 경로의 비활성화를 통해 섬유아세포의 성장 또는 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서 TGF-Smad 신호 전달 경로는 TGF-β신호 전달 경로의 일부이다. TGF-β 신호 전달 경로는 광범위한 생체 시스템에서 세포 성장, 분화 및 발달 조절에 결정적인 역할을 한다. TGF-β 신호 전달 경로를 요약하면 다음과 같다. TGF-β 수퍼 패밀리 리간드는 타입 II 수용체에 결합하며, 타입 II 수용체는 타입 I 수용체를 모집하고 인산화시킨다. 타입 I형 수용체는 수용체-조절(receptor-regulated) SMADs(R-SMADs)를 인산화시키고, 이것은 이제 coSMAD SMAD4를 결합시킬 수있다. R-SMAD/coSMAD 복합체는 전사 인자로서 표적 유전자의 프로모터에 접근하여 유전자 전사를 유도한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테롤 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 폐 섬유증의 예방제 또는 치료제는, 매일 투여 또는 간헐적으로 투여할 수 있고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것도 가능하다. 또한 본 발명의 조성물은 폐 섬유증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 GDF-15는 단백질로, 이러한 단백질은 의약품으로 개발되어 실용화 될 경우 질병에 대해 특이적으로 작용하기 때문에, 전통적인 화학적 합성 의약품보다 부작용이 비교적 적고 임상 시험 성공률도 높다고 알려져 있다. 이에 비하여 유전자 치료 기술은 이론적 측면이나 실험적 배경이 확립되지 않아 악직 임상적 사용에 많은 제한이 있다. 또한 유전자를 주입하는 방법은 다른 유전자의 배열을 망가뜨리는 위험성을 가진다. 이러한 면에서 단백질로 특정 질병에 치료제로 개발하는 것이 안정성인 측면이나 기술적인 측면에서 가장 상용 가능성이 높다.

본 발명은 상기 조성물을 인간 이외의 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐 섬유증의 치료방법을 제공한다.

상기 "개체"란, 폐 섬유증 예방 또는 치료가 피룡한 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 상기 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭 또는 인간을 포함하는 포유류 전체를 의미하나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정된 것은 아니다. 구체적으로 상기 개체는 인간을 제외한 개체일 수도 있다.

상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여인 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 또는 경구 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 투여 횟수는 상기 기재한 바와 같다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

실시예 1. 섬유아세포 억제 인자를 생성하는 세포 확인

섬유아세포 억제 인자를 생성하는 세포를 결정하기 위해, 3개의 정상 세포주(HaCaT, RPMI 2650 및 hNEC)와 2개의 암종 세포주(A549 및 HCT116)를 포함하는 다양한 상피유래 세포로 조건화된 배지(conditioned-media, CM)에서, 섬유아세포 세포주 CCD-18Lu와 MEF를 배양하였다.

세포 배양 및 조건화된 배지(CMs)의 제조 방법은 다음과 같다.

ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA)으로부터 인간 세포주 CCD-18Lu (정상 폐 섬유아세포), RPMI2650 (정상 상기도 상피 세포), A549 (폐암) 및 HCT116 (대장암)을 구매하였고, HaCaT(인간 피부 상피)과 MEF(마우스 배아 섬유아세포) 세포주를 한국 세포주 은행(서울, 한국)으로부터 구매하였다. 10% 열-비활성화 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum)을 포함한 EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium) 배지 또는 RPMI 1640 배지(GIBCO)에서 세포를 배양하였다. 조건화된 배지(CMs)를 제조하기 위해, 세포를 100-mm 디쉬에 80%의 밀집도(confluency)로 파종하고 24시간 동안 배양하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 세척하고 신선한 무혈청 배지에서 배양하였다. 배지 교환 후 2일 또는 3일에 배지를 2,000 x g에서 5 분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 0.20-μm 주사기 필터(Corning, Corning, NY)로 걸러냈다.

세포 증식 어세이(cell proliferation assay) 과정은 다음과 같다. CCD-18Lu 세포와 MEF 세포를 24-웰 플레이트에 2×10⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하고 밤새 두었다. 다음 날, 조건화된 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 트립신 및 EDTA를 사용하여 분리하고 트립판 블루로 염색하였다. 염색되지 않은 생존 세포를 혈구측정기(hemocytometer)를 사용하여 계수하였다.

CCD-18Lu는 암세포-조건화된 배지(CMs)에서 잘 자랐지만, 상피세포-CMs에서는 어떠한 것도 자랄 수 없었다 (도 1a, *는 CCD-18Lu CM 대비 P <0.05). 마찬가지로, MEF는 HaCaT-CM에서 성장을 멈췄다 (도 1b, *는 HCT116 또는 A549 CM 대비 P <0.05). CMs 간에 세포주기 단계의 차이가 없었음에도 불구하고 (도 22), 세포 죽음을 뜻하는 하위 G1(sub-G1) 그룹은 HaCaT-CM과 함께 배양된 CCD-18Lu 세포에서 눈에 띄게 높았다 (도 1c, *는 CCD-18Lu 또는 A549 CM 대비 P <0.05). 이 실험에서, CCD-18Lu-CM은 CCD-18Lu의 정상적인 세포주기 패턴에 대한 기준으로 사용되었다. 결과에 따르면, 정상 상피세포는 섬유아세포 증식에 맞서는 몇 가지 인자를 방출할 가능성이 있다.

실시예 2. 증식, 세포 사멸 또는 괴사성 섬유아세포의 계수

2-1. 세포 주기 분석 및 BrdU ( bromodeoxyuridine ) 혼입 어세이를 이용한 세포 증식 분석

CCD-18Lu 세포를 40% 밀집도(confluency)로 60-mm 디쉬에 도말했다. 다음날, 새로운 배지와 조건화된 배지의 혼합물(v:v, 1:1)에 세포를 배양하였다. 세포를 -4℃에서 밤새 70% 에탄올에 고정시키고, 실온에서 30분 동안 20 ㎍/ml의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)로 염색하였다. 염색된 세포를 BD FACSCanto II 유세포분석기(BD Biosciences)에 적용하고, 세포주기 단계를 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

세포 증식을 검사하기 위해, 50% 조건화된 배지를 함유한 배지 혼합물에서 배양한 CCD-18Lu 세포를 10 μM BrdU로 1 시간 동안 처리하고 수확하였다. 세포를 고정시키고, 투과성으로 만들고, DNase로 처리하고, FITC-접합된 안티-BrdU(BD Biosciences)로 염색하였다. 전체 DNA 및 복제 DNA는 각각 7-AAD 및 FITC-BrdU로 표시하고, 유세포분석기로 분석하였다. S단계에서 BrdU로 표시된 세포 그룹은 증식하는 세포 집단으로 간주되었다.

2-2. 세포 사멸 및 괴사 분석

세포 사멸 및 괴사는 annexin V-FITC/PI 세포 사멸 검출 키트(BD Biosciences)를 사용하여 결정하였다. 1×10⁵/웰의 밀도의 세포를 1.25 ㎕의 annexin V-FITC와 50 ㎍/ml의 PI로 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 염색하였다. 샘플을 BD FACSCanto II(BD Biosciences) 및 CellQuest 소프트웨어로 분석하였다. 오른쪽 아래 사분면 패널과 왼쪽 위 사분면 패널의 세포는 각각 세포 사멸 및 괴사로 간주되었다.

섬유아세포 성장 중지의 특성을 이해하기 위해, 증식, 세포 사멸 또는 괴사성 CCD-18Lu 세포를 계수하였다. S 단계에서 BrdU에 양성인 세포가 증식성으로 간주됨을 고려해볼 때 (도 23(a)), HaCaT-CM에서 CCD-18Lu 세포의 증식은 중단되었다 (도 2a, *는 CCD-18Lu 또는 A549 CM 대비 P <0.05). annexinV 및 PI(propidium iodide)로 함께 염색하여 세포 죽음을 평가하였고 (도 23(b)), HaCaT-CM은 CCD-18Lu 세포에서 세포 사멸 또는 괴사를 유발함을 발견했다 (도 2b, 2c, *는 CCD-18Lu 또는 A549 CM 대비 P <0.05).

다음으로 활성 근섬유아세포의 대표 마커인 α-평활근 액틴(smooth muscle actin, α-SMA)과 콜라겐-1α의 세포 수준을 분석했다. 두 마커 모두 배양 기간을 의존적으로 증가시켰음을 고려하면, CCD-18Lu 세포는 소태아혈청 및 CM 하에서 자발적으로 활성화되었다. 그러나, 이 섬유아세포 활성화는 HaCaT-CM에서 일어나지 않았다 (도 3).

실시예 3. 섬유아세포 억제 인자의 폴리펩티드 여부 확인

HaCaT-유래 인자가 폴리펩티드로 구성되어 있는지를 조사하기 위해 HaCaT-CM을 가열하여 폴리펩티드를 변성시켰다. 단백질의 열 비활성화를 위해, HaCaT-CM를 95℃에서 30분 동안 배양하고 1,000 × g에서 5분 동안 원심분리시켰다.

가열 후, HaCaT-CM은 섬유아세포 성장을 억제하는 능력을 거의 완전히 상실했다 (도 4a, *는 naive CM 대비 P <0.05). 대조적으로, 순수한(naive) 암세포-CM과 열-비활성화 암세포-CM 사이에는 섬유아세포 성장에 유의한 차이가 없었다. 더욱이, CCD-18Lu 세포는 naive CM보다 열-비활성화된 HaCaT-CM에서 더 적극적으로 분화되었다 ((도 4b, *는 naive CM 대비 P <0.05), (도 24(a)). 또한, 열-비활성화된 CM에서 세포 사멸 및 괴사가 현저히 감소되었다 ((도 4c, *는 naive CM 대비 P <0.05), 도24(b)).

HaCaT-유도 인자를 추가로 특징화하기 위해, 폴리펩티드를 절단(digestion)시키기 위해 CM을 트립신과 예비 배양한 다음, 잔류 트립신이 세포 성장에 미치는 영향을 배제하기 위해 트립신 억제제로 처리하였다.

단백질의 트립신 처리(tryptic digestion)를 위해, CM을 37℃에서 8시간 동안 200 ㎍/ml의 트립신(1 mM HCl에 용해)으로 처리하였다. 트립신 처리를 멈추기 위해 400 ㎍/ml의 트립신 억제제(Sigma-Aldrich)를 배지에 첨가했다. 미생물을 제거하기 위해 모든 배지를 0.20-μm 멤브레인으로 여과했다.

트립신 절단은 HaCaT-CM의 섬유아세포 억제 효과를 없앴다 (도 5a, *는 naive CM 대비 P <0.05). HaCaT-유래 인자의 크기를 대략적으로 결정하기 위해, 30kDa Centricon® 필터를 통해 CM을 여과하고, 새로운 배지를 첨가하여 잔류 배지의 부피를 원래의 배지의 부피로 조정하였다. HaCaT-CM의 2개의 분획물 중 잔류물(retentate)은 원래의 배지와 동일한 섬유아세포 억제 효과를 나타냈으나, 여액(filtrate)은 그렇지 않았다 (도 5b, *는 naive CM 대비 P <0.05). 이러한 결과는 섬유아세포-억제 인자가 폴리펩티드로 구성된다는 것을 강하게 나타낸다.

실시예 4. 섬유아세포-억제 사이토카인의 확인(identification)

4-1. 사이토카인 후보 물질

CM에서 펩티드 기반의 사이토카인을 확인하기 위해, HaCaT 및 A549 CM을 Human XL 사이토카인 어레이 키트로 시험하였다. 사이토카인 프로파일링 과정은 다음과 같다.

사이토카인 프로파일링은 R&D Systems에서 제공한 proteome profiler Human XL 사이토카인 어레이 키트(# ARY022)를 사용하여 수행했다. 세포를 무혈청 배지에서 3일 동안 배양하고, 조건화된 배지를 위에서 전술한 바와 같이 제조하였다. 배지를 니트로셀룰로오스-기반 어레이 멤브레인에 적용하고 밤새 4℃에서 배양하였다. 어레이 멤브레인을 검출 항체 칵테일(R&D Systems)로 1시간 동안 처리하고, 스트렙타비딘-HRP 용액으로 30분 동안 처리하였다. 면역 복합체(immune complex)를 Chemi-Reagent Mix 키트를 사용하여 가시화하고 어레이를 X선 필름에 노출시켰다. 각 조건화된 배지에서의 단백질 농도는 세포 수에 의해 정규화(normalized)되었고, 니트로셀룰로오스 기반 어레이 멤브레인의 기준점(reference dots)은 각각의 조건화된 배지는 유사한 분량의 단백질을 함유한다는 증거였다.

빨간색 상자 (1~10)는 A549-CM보다 HaCaT-CM에서 더 풍부한 사이토카인을 나타낸다 (도 6). ImageJ 프로그램의 픽셀에서 정량된 사이토카인 수치는 막대 그래프로 표시된다 (도 7, *는 A549 CM 대비 P <0.05). HaCaT-CM에서 풍부한 사이토카인은 도 8에 요약되어있다. 섬유아세포-억제 사이토카인으로서 3가지 후보 물질을 결정하였다: cystatin C (CST3), 성장분화인자 15 (GDF15), 인터루킨 1α(IL-1α).

4-2. 사이토카인 후보 중 섬유아세포 성장 억제하는 사이토카인 선별

후보 중 어느 것이 섬유아세포 성장을 억제하는지를 조사하기 위해, 우리는 각 사이토카인이 녹다운(knocked-down)된 HaCaT 세포로부터 CM을 준비했다.

각 사이토카인이 녹다운된 세포를 제조하기 위해 RNAi-MAX 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 50% 밀집도(confluency)의 세포를 siRNA로 형질감염(transfection)시켰다. 48시간 동안 안정화시킨 후, 세포를 지시된 실험에 적용시켰다. siRNA는 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)에 의해 합성되었으며, 그 서열(5 '에서 3')은 표 2와 같다.

서열번호	시료명	염기서열 (5'-3')
3	CST3#1	GCACAAUGACCUUGUCGAAAUCCAC
4	CST3#2	CCUAUCACCUCUUAUGCACACCUCC
5	CST3#3	CGCCCGCAAGCAGAUCGUAGCUGGG
6	GDF15#1	GCUGGGAAGAUUCGAACACCGACCT
7	GDF15#2	AGACUCCAGAUUCCGAGAGUUGCGG
8	GDF15#3	CGGAUACUCACGCCAGAAGUGCGGC
9	IL-1α#1	GCACAAUAGCAGUUGAAACAAGAAG
10	IL-1α#2	AGAGGAUCAAGACUUCUUUGUGCTC

CST3- 또는 GDF15-녹다운된 HaCaT로부터의 CM은 CCD-18Lu 성장을 억제하지 않았지만, IL-1α-녹다운된 HaCaT로부터의 CM은 효과적으로 성장을 억제하였다 (도 9, *는 열-비활성화, 대조군 CM 대비 P <0.05, #은 대조군 CM 대비 P <0.05). CCD-18Lu의 성장이 CST3 및 GDF15 siRNA로 형질감염된 A549의 CM에서는 증가하지 않음을 고려하면 (도 25), CM에 남아있는 siRNAs 그 자체는 CCD-18Lu의 성장에 영향을 주지 않는다.

면역블로팅으로 siRNA의 효율을 평가했다. 면역블로팅의 과정은 다음과 같다. 세포를 변성 SDS 샘플 버퍼에 용해시켰다. 세포 용해물의 단백질은 SDS/10-15% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리되어 Immobilon-P 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인을 5% 스킴밀크(skim milk)로 30분간 예비 배양하여 비특이적 반응을 차단하고, 4℃에서 1차 항체(1:1000 희석)로 밤새 배양한 후, 3회 세척하고, HRP-결합 2차 항체(1:5000)로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. SuperSignal West Femto 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 면역 복합체(immune complex)를 시각화하였다.

절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3), PARP, Smad2, p-Smad2, Smad3 및 p-Smad3 항체는 Cell Signaling Tech. (Danvers, MA)로부터 구입하였고; caspase-9 및 TGFβR1 항체는 Santa Cruz Biotech (Dallas, TX)로부터 구입하였고; α-SMA, collagen-1α 및 p-TGFβR1 항체는 Abcam (Cambridge, MA)로부터 구입하였고; anti-CST3는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 구입하였고; anti-GDF15는 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)로부터 구입하였다.

면역블로팅 분석에서 CST3과 GDF15는 HaCaT-CM에서 시간에 따라 축적되었지만 A549-CM에서는 무시할 수 있었다 (도 10a). siRNA의 부작용을 배제하기 위해, 각 mRNA의 다른 부위를 타겟팅하는 CST3와 GDF15 siRNA의 섬유아세포 억제 효과를 평가하고 확인했다 (도 10b, *는 열-비활성화, 대조군 CM 대비 P <0.05, #은 대조군 CM 대비 P <0.05).

우리는 이미 다른 상피 세포주인 RPMI 2650이 HaCaT만큼 효과적으로 CCD-18Lu의 성장을 억제한다는 것을 보여주었기 때문에 (도 1a), RPMI 2650 세포가 이들 사이토카인을 통해 섬유아세포 성장을 조절했는지 여부를 테스트했다. CST3과 GDF15는 모두 RPMI 2650-CM에서 검출되었고, 녹다운된 각각의 사이토카인은 CM에 의해 저지된 CCD-18Lu 성장을 구제하였다 (도 11a, *는 열-비활성화, 대조군 CM 대비 P <0.05, #은 대조군 CM 대비 P <0.05). 두 사이토카인이 모두 녹다운되었을 때, 세포 증식과 생존 모두 부가적으로 향상되었다 ((도 11b, 11c, *는 열-비활성화, 대조군 CM 대비 P <0.05, #은 대조군 CM 대비 P <0.05), (도 26a, 26b)). 이러한 결과는 CST3 및 GDF15가 정상 상피세포로부터 분비되고 섬유아세포 성장의 억제에 관여함을 시사한다.

실시예 5. 재조합 CST3 및 GDF15의 섬유아세포 성장 및 활성 억제 ( in vitro )

CST3 및 GDF15의 섬유아세포 성장에 대한 작용을 확인하기 위해, CCD-18Lu를 인간 CST3 (rCST3) 및 인간 GDF15 (rGDF15)의 재조합 펩티드로 처리하고, 24시간 후에 세포 수를 세었다.

두 펩티드는 농도 의존적으로 CCD-18Lu 세포의 수를 감소시켰다 (도 12a). IC₅₀ (반수 최대 억제 농도) 값에 근거하면, rGDF15 및 rCST3은 유사한 효능을 갖는 것으로 보인다. 대조적으로, 펩티드는 HaCaT 및 A549에서 세포 성장을 억제하지 못했고 (도 27), 이들 펩티드의 섬유아세포 특이적 작용을 지지한다. rCST3와 rGDF15의 시너지 효과를 테스트하기 위해, 우리는 각 펩티드 1 ng/mL의 섬유아세포 억제 효과와 두 펩티드의 절반 농도(0.5 + 0.5 ng/mL) 조합과 비교했다. 조합은 각 펩티드의 단일 처리 (도 12b)보다 더 큰 (> 2 배) 효과를 나타냈다. 이는 투여된 펩티드의 총량이 모든 경우에 동일하기 때문에, 두 펩티드의 상승 작용을 강하게 나타낸다.

성장 억제를 제외하고, 두 펩티드 모두 콜라겐-1α 및 α-SMA 단백질과 mRNA 수준을 하향 조절하였다 (도 13a, 13b, *는 비처리군(Ctrl) 대비 P <0.05, #은 CST3 또는 GDF15만 처리군 대비 P <0.05). 이러한 결과는 펩티드가 폐 섬유증을 예방하는 데 적용 가능한지 여부를 조사하도록 권장했다.

총 RNA는 TRIzol 키트 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 CCD-18Lu 세포에서 추출하였다. M-MLV 역전사 효소 (Promega, San Luis Obispo, CA)를 사용하여 2 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA를 SYBR Green (엔지노믹스, 대전, 한국)으로 증폭시키고 7900HT 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 정량화하였다. 각 PCR에서, mRNA 수준은 18S ribosomalRNA의 양으로 정규화(normalized)되었다. 각 시료는 세 번 측정하였고, 각 실험 조건에 대해 최소 3개의 독립적인 샘플을 분석하였다. PCR 프라이머의 염기 서열은 표 3에 나타내었다.

서열번호	증폭 대상	염기서열 (5'-3')
11	α--SMA	정방향	cccttgagaagagttacgag
12		역방향	tgtaggtggtttcatggatg
13	콜라겐 1α	정방향	tacaaaaccaccaagacctc
14		역방향	agtttacaggaagcagacag
15	18S rRNA	정방향	gttaattccgataacgaacg
16		역방향	cacagacctgttattgctca

실시예 6. 재조합 CST3 및 GDF15의 TGF 신호 전달 경로 억제 효과 평가

섬유아세포의 성장 및 활성화가 TGF-Smad 경로에 크게 의존한다는 것을 고려하여, 우리는 먼저 CST3 및 GDF15가 신호 전달 경로를 억제하는지를 확인했다.

루시퍼라아제 리포터 어세이의 과정은 다음과 같다. 세포를 Lipofectamine 3000 시약(Invitrogen)을 사용하여 SBE-루시퍼라아제 및 CMV-β-갈락토시다 아제 플라스미드와 함께 형질감염(transfection)시켰다. DNA의 총 농도(1 ㎍/100 mm 디쉬)는 pcDNA로 조정 하였다. SBE-Luc 리포터 작제물(construct)은 Kim SG(서울대학교, 서울)박사로부터 받은 9개의 반복되는 Smad 결합 요소(Smad binding elements, SBEs)를 포함하고 있다. 하룻밤 동안 안정화시킨 후, 형질감염된 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 더 배양하였다. 세포를 재조합 펩타이드와 함께 2시간 동안 배양하고, TGF-β1로 24시간 동안 처리하고, 루시퍼라아제 활성을 결정하기 위해 용해시켰다. 형질감염 효율을 정규화(normalize)하기 위해, o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)를 사용하여 β-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 어세이는 4회, 각 실험을 3 회 반복했다.

예상대로, CCD-18Lu의 Smad2/3는 FBS의 존재 하에 인산화(또는 활성화)되었다. 흥미롭게도, 인산화는 재조합 CST3 및/또는 GDF15에 의해 약화되었다 (도 14a). TGF 신호 전달 경로가 TGF-β1에 의해 자극되었을 때, TGF-β 수용체와 Smad2/3는 CST3 및/또는 GDF15에 의해 비활성화되었다 (도 14b).

CCD-18Lu 성장 (도 15a) 및 ECM 생산 (도 15b)은 TGF-β1에 의해 자극되었고, 이는 재조합 펩티드에 의해 억제되었다. 우리는 SBE-루시퍼라제 리포터를 사용하여 TGF/Smad 의존성 유전자 발현을 평가하였고, TGF-Smad 신호 전달 경로에 대한 CST3 및 GDF15의 억제 작용을 확인하였다 (도 15c, *는 대조군 대비 P <0.05, #은 TGF- β 1만 처리된 그룹 대비 P <0.05).

실시예 7. 재조합 CST3 및 GDF15의 폐섬유증 개선 효과 평가

폐 섬유증을 유도하기 위해, C57/B6 마우스에게 기관지 점적(bronchial instillation)을 통한 블레오마이신의 일방 유발(a single challenge)을 실시하였다. 6일 후, 마우스에게 PBS, rCST3 (100 ㎍/kg), rGDF15 (100 ㎍/kg) 또는 두 펩티드 (50 ㎍/kg)를 매주 2회 전신 주사 하였다. 블레오마이신 처리 후 21 일에 폐 조직을 절제하고 조직학적 분석을 수행하였다. 실험 프로토콜은 도 16에 나타냈다.

블레오마이신-유도된 폐 섬유화는 잠재적 IPF 치료제를 시험하기 위한 동물 모델에서 흔하다. 블레오마이신은 폐 염증을 정확히 모방한 다음, 폐 섬유증의 만성적인 진행으로 이어진다. 섬유화의 분자적 특징으로, IL-1, IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인은 블레오마이신으로 처리된 폐 조직의 초기 단계에서 증가한다. 나중에 피브로넥틴(fibronectin), 프로콜라겐-1 및 TGF-β와 같은 전섬유성(pro-fibrotic) 마커는 조직에서 서서히 증가하며 블레오마이신 처리 후 약 2주 후에 최고치에 도달한다. 염증과 섬유화 단계 사이의 전환은 블레오마이신 처리 후 9일경에 발생한다. 예방적 치료를 위해, 항염증제는 초기 단계에서 투여되기 시작하였으나, 항섬유화 화합물은 질병 진행과 상관없이, 특히 "섬유성" 단계에서 투여하는 경우 효과적일 것으로 제안되었다. 실제로 호흡기 증상이 나타나고 방사선학적 증거가 발견된 이후에 폐 섬유증을 진단할 수 있으므로, 급성 염증기의 치료는 병원에서 실용적이지 않을 수 있다. 따라서 섬유화 단계에서 치료가 시작될지도 모른다. 실제 치료 기간을 고려하여, 블레오마이신 처리 6일 후에 재조합 펩티드를 주입하기 시작했다. 비록 폐 섬유증이 이미 시작되었지만, 펩티드는 질병 진행을 멈추게 할 만큼 충분히 효과적이었다 (도 17 내지 21). 그러므로 사이토카인 치료는 이미 폐 섬유증으로 진단받은 환자에게 효과적일 것으로 기대된다.

자세한 실험과정은 다음과 같다. C57BL/6J 마우스(수컷, 11 주)는 중앙 실험 동물㈜ (Central Laboratory Animal Inc., 서울, 대한민국)에서 구입하여 무균실에서 보관했다. 마우스를 틸레타민(tiletamine)/졸라제팜(zolazepam) (30 mg/kg)과 자알라진(xylazine) (10 mg/kg)의 혼합물로 마취시키고, 식염수 또는 블레오마이신 황산염(bleomycin sulfate) (2 mg/kg, MBcell, CA, USA)을 총 부피는 50 ㎕로 기관내 주입하였다. 블레오마이신 투여 후 6 일, 9 일, 12 일, 15 일, 18 일에 CST3/GDF15 펩티드 (각각 50 ㎍/kg) 또는 PBS를 마우스에 복강내 주입하였다. 성숙한 CST3 (aa. 27-146, NM_000099) 및 성숙한 GDF15 (aa. 195-308, NM_004864)의 재조합 펩티드는 Abcam and Sino Biological Inc. (중국 베이징)에서 각각 구입했다. 21일에 폐 조직을 마우스에서 제거하고 2개의 엽(lobe)으로 나누었다. 왼쪽 엽은 4% 파라포름 알데히드로 고정시키고 오른쪽 엽은 액체 질소에 저장하였다. 모든 절차는 서울대학교 동물실험윤리위원회(SNU-141006-3)의 승인을 받았다.

마우스의 체중을 지속적으로 측정하여 겉보기 건강 상태를 모니터링했다. 마우스 몸무게는 21일 동안 점진적으로 감소했지만 조합된 펩티드에 의해 유의하게 회복되었다 (도 17a, *는 대조군 대비 P <0.05, #은 Bleo-PBS 군 대비 P <0.05). 마우스 생존율도 조합에 의해 향상되었다 (도 17b).

폐 섬유증의 정도를 평가하기 위해 21일에 마손-트리크롬(Masson's trichrome)과 헤마톡실린/에오진(hematoxylin/eosin)으로 마우스에서 제거한 폐 시료를 염색하였다 (도 18). 폐의 파라핀 절편 (4 μm)을 탈파라핀화하고 다시 수화하여, 웨이거트의 철 헤마톡실린(Weigert's iron hematoxylin)과 비에브리치 스칼렛-산 푹신(biebrich scarlet-acid fuchsin)으로 10분간 염색하였다. 마지막으로, 절편을 10 분간 2.5% 아닐린 블루(aniline blue)로 염색하고 3분 동안 1% 빙초산으로 탈색하였다. 현미경 사진은 조직 절편의 무작위로 4개의 부분에서 찍은 것이다.

예상대로, 블레오마이신은 두꺼워진 폐포 중벽(inter-alveolar septa)으로 폐포낭(alveolar sacs)의 막힘을 유도하였고, 폐 간질에 과도한 콜라겐 축적을 유도하였다.

더욱이, CST3와 GDF15는 모두 대조군 폐와 비교하여 블레오마이신-처리된 폐에서 현저하게 하향 조절되었다 (도 19, *는 대조군 대비 P <0.05). 블레오마이신에 의한 이들 사이토카인의 억제는 폐 섬유증 치료를 위한 사이토카인을 회복시키는 이론적 근거를 제공한다.

CST3 또는 GDF15 펩티드의 투여는 블로마이신-처리된 폐에서 기도 공간 및 섬유화를 감소시켰고, 절반 투여량의 이들 펩티드의 조합은 임의의 단일 투여보다 효과적이었다 (도 20a). 섬유성 변화를 정량화하기 위해, Masson의 trichrome 염색 시료에 대한 섬유성 부위와 Ashcroft 점수를 측정하였다. Ashcroft 점수는 간질 섬유증(interstitial fibrosis)의 중증도(0~8)에 대한 평가로 Ashcroft 섬유증 점수 시스템(Ashcroft fibrosis scoring system)에 기초하여 평가되었다.

섬유성 변화를 정량화하기 위해, 폐 조직에서의 하이드록시프롤린 수치를 생화학적으로 분석했다 (그림 20b, 20c, 20d, *는 대조군 대비 P <0.05, #은 Bleo-PBS 군 대비 P <0.05).

하이드록시프롤린 어세이 과정은 다음과 같다. 얼린 오른쪽 폐를 증류수(100 ㎕/10 mg 조직)에서 균질화시켰다. 균질액을 95℃에서 3시간 동안 배양하고, 16,000 × g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액의 콜라겐 함량은 BioVision(Milpitas, CA)에서 제공한 하이드록시프롤린 비색 분석 어세이 키트(hydroxyproline colorimetric assay kit)를 사용하여 측정하였다. 하이드록시프롤린의 수준은 560 nm에서 흡광도에 근거하여 분광광도계로 측정하였다.

이러한 섬유화 파라미터의 결과는 rCST3와 rGDF15의 조합이 블레오마이신에 의한 폐 섬유화를 약화시킨다는 가설을 뒷받침했다. 다음으로 우리는 α-SMA와 콜라겐-1α 수준을 분석하여 섬유아세포 활성화 정도를 평가했다.

항원을 회수하기 위해 폐 조직의 파라핀 절편 (4 μm)을 탈파라핀화하고, 다시 수화하고, 100 mM 시트르산 완충액 (pH 6.0)에서 121℃로 10 분간 멸균하였다. 3% 과산화수소로 10분간 처리한 후, 비특이적 상호 작용을 차단하기 위해 절편을 실온에서 10% 소혈청에서 1시간 동안 배양하였다. 4에서 밤새 콜라겐-1α (1:250 희석; Abcam) 또는 α-SMA (1:500; Abcam)에 대한 항체와 Vector Laboratories(Burlingame, CA)에서 제공한 비오틴 2차 항체 (1:500)와 함께 배양하였다. 면역 복합체는 VECTASTAIN ABC Kit (Vector laboratories)를 이용하여 가시화하였다. 염색 부위를 분석하기 위해 ImageJ 프로그램 (NIH, Bethesda, MD)을 사용하여 각 섹션에서 네 개의 고전력 필드를 무작위로 선택했다.

두 마커 모두 블레오마이신으로 처리된 폐에서 짙게 염색되었지만 펩티드로 처리된 폐에서는 덜 명확했다 (도 21, *는 대조군 대비 P <0.05, #은 Bleo-PBS 군 대비 P <0.05).

상처 치유는 상피세포와 섬유아세포 사이의 조화로운 상호 작용을 포함하는 역동적이고 복잡한 과정이다. 조직이 재생 된 후에 자란 섬유아세포는 보통 비활성화되고 감소한다. 그러나, 이 과정이 일어나지 않으면, 조직은 병리학적 섬유증(pathologic fibrosis)을 겪는다. 폐 섬유증를 일으키는 메커니즘이 제대로 밝혀지지 않아, 질병을 예방하거나 치료하기가 어려우나, 본 발명에서는 폐 섬유증을 완화시킬 수 있는 상피-유도 된 사이토카인을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

염증이 섬유증을 일으킨다는 가정 하에, 다양한 항염증제는 IPF 치료제로서 테스트되었으나, 항염증 치료제는 임상 시험에서 IPF의 사망률을 낮추지 못하고 부작용을 유발했다. IPF는 간질 섬유아세포의 과다 활성화 및 폐포(alveolar) 상피의 해체를 수반하는 비정상적인 상처 회복으로 인한 것으로 여겨진다. 이 개념을 바탕으로, IPF를 치료하는 새로운 전략으로서 섬유아세포-표적 치료법에 초점을 맞추어, 섬유아세포-억제 신호 전달 경로(fibroblast-suppressive signaling pathways)를 강화시키는 쪽으로 항섬유화 전략을 세웠다. 상피-중간엽의 항상성 이론에 따르면, 폐 상피는 상처 회복 완료 후에 활성 섬유아세포를 억제하는 본질적인 능력을 갖는다. 따라서 본 발명자들은 정상 상피세포에서 2개의 섬유아세포 억제 사이토카인인 시스타틴 C(CST3)와 GDF-15를 발견하고 블레오마이신으로 유도된 폐 섬유증 마우스 모델에서 치료 효과를 입증했다.

CST3은 대부분의 포유 동물 세포에서 발현되며, 그 절단 형태(cleaved form)는 혈액 및 체액에서 편재하여 검출된다. 간섬유화 과정에서 시스테인 프로테아제인 카텝신(cathepsin)은 별세포(stellate cell)를 자극하여 섬유 형성을 촉진시키고, 카텝신 B를 억제함으로써 콜라겐 침착을 억제할 수 있다. 또한 폐섬유화 과정에서도 카텝신 B는 폐 섬유아세포의 TGF-β-유도 분화를 촉진하여 세포외 기질 침착을 증가시킴으로써 섬유 형성을 자극하고, 이러한 카텝신 B의 작용은 CST3에 의한 억제된다. 카텝신 활성에 대한 작용과는 독립적으로, TGF-β 경로에 직접적으로 길항하여 CST3 그 자체로 섬유 형성을 방해한다. CST3는 물리적으로 TGF-β 수용체에 결합하여 TGF-β가 그의 수용체와 상호 작용하는 것을 억제한다. CST3가 CCD-18Lu에서 TGF 신호를 약화시킨다는 결과는 이 메커니즘을 뒷받침한다.

GDF-15는 유해한 스트레스 직후에 유도되는 TGF-β 계열 구성원이다. GDF-15는 미세환경 변화(microenvironmental changes)에 대한 세포 반응과 관련이 있다고 여겨지나, 그 생물학적 기능은 명확하게 밝혀지지 않았다. GDF-15 과발현은 대장암, 전립선암 및 폐암 세포에서 세포 사멸을 유도하므로, 암세포에서 GDF-15는 세포 사멸을 촉진하는 것으로 나타났다. GDF-15 유전자는 프로모터 영역에서 p53 반응요소(response element)를 보유하고 있기 때문에, GDF-15의 전 세포 사멸(pro-apoptotic)의 역할을 가정하는 것은 타당하다. GDF-15는 저산소증 및 염증과 같은 유해한 조건에서 섬유아세포의 죽음을 유도할 것으로 기대된다. 그러나, GDF-15는 예기치 않게 TGF-Smad 신호 전달 경로의 억제를 통해 섬유아세포 성장 및 활성화를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (도 14 내지 15). GDF-15가 TGF-β 수용체에 대한 부분 아고니스트(agonist)로서 작용할 수 있다. 일반적으로, 약한 아고니스트는 완전한 아고니스트가 없을 때 수용체를 자극할 수 있지만, 완전한 아고니스트 존재 하에서 수용체와 결합하도록 경쟁함으로써 수용체 신호 전달을 비활성화시키는 작용을 한다. IPF 폐에서 TGF-β가 풍부한 환경 고려하면, GDF-15는 섬유 형성(fibrogenesis)의 억제제로서 작용할 수 있다.

결론적으로, 사이토카인 시스타틴 C(CST3) 및 GDF-15는 정상 상피세포로부터 분비되고 폐 섬유아세포의 성장 및 활성화를 억제한다. 또한, 이들 사이토카인은 블레오마이신의 기관 내 점적을 한 쥐에서 간질 폐 섬유화를 완화시킨다. CST3과 GDF15는 손상된 폐의 섬유아세포의 과도한 증식과 활성화를 막는 진짜 조절 인자인 것으로 보인다.

본 발명의 실시예의 통계 분석은 SPSS (윈도우 버전 15.0.0) 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되었다. 두 그룹 간의 비교는 Student's t-test 또는 Mann-Whitney U test로 분석하였으며, 유의 수준은 P<0.05로 정의하였다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition comprising cystatine C for preventing or treating pulmonary fibrosis <130> 17P04019 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cystatin C(CST3) <400> 1 Ser Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala 1 5 10 15 Ser Val Glu Glu Glu Gly Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly 20 25 30 Glu Tyr Asn Lys Ala Ser Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gln 35 40 45 Val Val Arg Ala Arg Lys Gln Ile Val Ala Gly Val Asn Tyr Phe Leu 50 55 60 Asp Val Glu Leu Gly Arg Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gln Pro Asn Leu 65 70 75 80 Asp Asn Cys Pro Phe His Asp Gln Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe 85 90 95 Cys Ser Phe Gln Ile Tyr Ala Val Pro Trp Gln Gly Thr Met Thr Leu 100 105 110 Ser Lys Ser Thr Cys Gln Asp Ala 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-15 <400> 2 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA CST3#1 <400> 3 gcacaaugac cuugucgaaa uccac 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA CST3#2 <400> 4 ccuaucaccu cuuaugcaca ccucc 25 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA CST3#3 <400> 5 cgcccgcaag cagaucguag cuggg 25 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA GDF15#1 <400> 6 gcugggaaga uucgaacacc gacct 25 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA GDF15#2 <400> 7 agacuccaga uuccgagagu ugcgg 25 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA GDF15#3 <400> 8 cggauacuca cgccagaagu gcggc 25 <210> 9 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-1alpha#1 <400> 9 gcacaauagc aguugaaaca agaag 25 <210> 10 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-1alpha#2 <400> 10 agaggaucaa gacuucuuug ugctc 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SMA forward primer <400> 11 cccttgagaa gagttacgag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SMA reverse primer <400> 12 tgtaggtggt ttcatggatg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> collage 1alpha forward primer <400> 13 tacaaaacca ccaagacctc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> collage 1alpha reverse primer <400> 14 agtttacagg aagcagacag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA forward primer <400> 15 gttaattccg ataacgaacg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA reverse primer <400> 16 cacagacctg ttattgctca 20

Claims (3)

1. GDF-15(Growth Differentiation Factor-15) 단백질을 포함하는, 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 GDF-15 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 청구항 1 또는 2의 조성물을 인간 이외의 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 폐 섬유증의 치료방법.

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