KR20200040144A - 활성성분의 안정화된 지속 방출을 위한 금속산화물 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 활성성분을 안정적이고 지속적으로 전달하기 위한 금속산화물 복합체 및 그를 포함하는 화장료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 내부에 다중 공극 또는 다층구조가 형성되는 금속산화물 또는 금속수산화물;및 상기 공극 또는 상기 다층구조 사이에 삽입되는 활성성분;을 포함함으로써, 높은 흡착률을 가지며 활성성분의 단계적 방출에 의한 시간차 방출 제어가 가능하여 개선된 전달 효율을 나타낼 수 있는 금속산화물 복합체 및 그를 포함하는 화장료용 조성물에 관한 것이다.

Description

활성성분의 안정화된 지속 방출을 위한 금속산화물 복합체{METAL OXIDE COMPLEX FOR STABILIZED AND EXTENDED RELEASE FORMATION OF ACTIVE MATERIAL}

본 발명은 활성성분을 안정적이고 지속적으로 전달하기 위한 금속산화물 복합체 및 그를 포함하는 화장료용 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 최외각에 존재하며, 표피, 진피 및 피하조직으로 구성된다. 진피는 섬유성과 기질 성분으로 구성되고, 진피의 대부분을 차지하는 콜라겐(collagen)은 피부에 강도와 장력을 주고 피부를 보호하는 역할을 한다. 이러한 콜라겐은 인체가 노화됨에 따라 결합조직의 기질 내 섬유성분을 합성 및 분비하는 섬유아세포(fibroblast)의 작용과 세포수 감소로 인해 합성량이 줄어들게 되고, 이에 따라 피부세포 내 수분이 손실되고 각질층 구조가 변화하게 된다.

사람의 피부는 노화가 진행됨에 따라 내적 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고 세포의 기능과 활성이 저하되게 되며, 이에 따라 생체에 필요한 단백질들의 생합성이 줄어들어 피부조직의 탄력이 저하되고 주름이 발생하게 되는데, 이를 내인성 노화라 한다. 또한, 이러한 내인성 노화 이외에도, 직사광선에 대한 장시간의 노출, 화상, 찰과상 등과 같은 외적 요인에 의하여도 기미, 주근깨, 검버섯 등의 다양한 피부병변이 발생하게 된다.

건강하고 탄력있는 피부를 유지하기 위하여 여러 가지 물질들이 피부노화의 저감 또는 치료를 위하여 사용되고 있는데, 이러한 물질로는 대표적으로 비타민C(L-아스코르브산) 및 비타민A(레티놀)과 같은 비타민류, 인돌-3-아세트산(indole-3 acetic acid) 및 코직산(kojic acid)과 같은 화합물, 항산화 기능을 갖는 플라보노이드계 천연 추출물, AHA(a-hydroxyacid)류의 항산화 물질, 글루코사민 및 콘드로이친황산(Condroitin sulfates)과 같은 천연 보습성 물질, EGF, FGF등의 성장인자, 또는 기타 피부 활력 증진 성분들이 있으며, 이들을 이용한 다양한 제제의 화장품류가 널리 이용되어 왔다. 이 중에서도 특히 비타민C, 에이코사펜타에노산(EPA) 및 인돌-3-아세트산은 피부와 관련된 모든 산업분야, 예컨대 화장품, 피부외용제용 의약외품 및 의약품 분야에서 많은 장점을 가지고 있다.

비타민C는 L-아스코르브산(C₆H₈O₆)으로서, 물질의 항산화 특성 및 다양한 신진 대사에서의 역할이 중요해 인체에 필수불가결한 물질이다. 그러나 식물이나 기타 동물과는 달리 영장류인 인간의 경우 비타민C의 체내합성이 불가능하기 때문에 반드시 음식물을 통한 섭취가 필요하다. 비타민C는 이렇게 체내 여러 신진대사 및 촉매로의 역할뿐만 아니라 사람의 피부에 있어서는 과색소 침착(pigmentation) 방지 또는 피부 수분 조절에 매우 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 특히 색소침착의 원인이 되는 멜라닌(melanin) 색소의 환원을 통한 탈색반응 또는 멜라닌 색소 침착에 관여하는 효소인 티로시나아제의 활동 억제를 통한 색소 침착의 방지와 같이 피부 미백에 매우 효과적인 물질로 알려져 있다. 그러나, 이러한 우수한 생리화학적 효과에도 불구하고 비타민C는 산소, 광, 습기, 온도 등 외부환경에 극히 불안정하여 쉽게 분해, 파괴되는 단점을 가지고 있다.

에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid; EPA)은 일명 오메가-3로도 불리며, DHA 및 DPA와 함께 음식물을 통해 섭취해야만 하는 불포화지방산의 일종이다. EPA는 인체 기능에 꼭 필요한 영양소일 뿐만 아니라 혈중콜레스테롤 저하와 뇌기능을 촉진시키는 작용과 함께, 류머티스성 관절염, 심장 질환, 동맥경화증, 폐 질환의 예방과 치료에도 좋다는 연구결과가 보고되었다. 또한 EPA에서 유도된 TXA3와 PGI3은 육지 동물의 혈소판에 들어있는 TXA2의 생성을 저해하여 결과적으로는 이에 의한 혈소판 응집 억제작용을 한다고 알려져 있다. 현재 EPA를 함유한 식품은 건강보조식품으로 많이 식용되고 있으며, EPA 제제는 혈소판 응집에 의한 혈전증 예방약으로 시판되고 있다.

인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid, C₁₀H₉NO₂)은 알로에 또는 고등식물에 포함되어 있는 식물 성장호르몬으로서, 인체에서는 상처가 있는 부분으로 진피내의 섬유아세포(fibroblast)의 이동을 촉진시키고, 증식활동과 더불어 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 및 콜라겐이나 다른 섬유상 물질들의 구성 성분인 프로테오글리칸(proteoglycan)을 형성시키는 독특한 작용을 갖는 물질로 알려져 있다. 피부 치료 효과 면에서, 인돌-3-아세트산은 섬유아세포를 노화에 의해 피부 조직 결핍이 발생한 부분으로 이동시켜, 정상적인 세포증식활동을 촉진함으로써 결핍된 피부 조직을 충진시켜주는 역할을 포함하고 있어 피부조직을 재생시켜주는 기능을 갖는다. 또한, 피부에 상처가 나는 경우 상처가 빨리 치유될 수 있는 기능을 발휘하는 것으로도 알려져 있다. 따라서 인돌-3-아세트산은 화장품 베이스에 첨가함으로써 효과적으로 피부를 보호하고 관리할 수 있는 유용한 성분으로 활용되고 있다. 그러나 이러한 탁월한 기능성에도 불구하고 열, 빛, 온도 또는 산소 등의 외부환경 하에서는 비타민류와 마찬가지로 매우 불안정하여 변색 또는 변취가 발생하게 되므로 제품에 첨가물로 적용하는데 많은 제약이 있었다.

전술한 바와 같이, 이러한 비타민 C, EPA 및 인돌-3-아세트산과 같은 유용한 활성물질은 쉽게 산화되어 안정성이 낮으며, 또한, 피부에서 확산(simple diffusion mechanism)에 의한 흡수가 이루어지므로 피부흡수가 단시간에 이루어질 수 없어, 피부에서의 흡수율을 높이기 매우 어려운 문제가 있었다. 이에 따라, 상기 활성물질들을 안정화시키면서 피부에 대한 자극 또는 독성을 경감시킬 수 있는 효과를 얻기 위한 많은 연구가 수행되어 왔다.

화장료 조성물에 있어서, 금속산화물은 피그먼트(pigment)로 사용되고 있으며, TiO의 경우 무기계 자외선 차단제로 널리 사용되고 있다. 이러한 금속산화물류는 비표면적을 증대시키기 위한 나노화에 관한 연구는 활발하게 이루어졌으나, 흡입독성 및 경피 흡수 독성에 대한 문제가 여전히 잔존하고 있다. 또한, 금속산화물류는 산화촉매로서의 특성으로 인하여, 화장료 조성물에 주요 성분으로 많이 포함되는 항산화물질과는 동시 사용하기 어렵다는 문제점을 가지고 있어 그 제품화 또는 사용에 여전히 제한점이 있었다.

금속 산화물의 경우 그 고유의 독성 이슈때문에 인체 적용에 여러가지 제약이 있는 것으로 알려져 있다. 금속 산화물의 경우 특히 나노 사이즈로 가공되었을 경우 흡입 독성뿐만 아니라 세포 독성이 상당히 높아진다는 것은 이미 주지의 사실이며, 이에 약물전달 분야 또는 화장품 분야에서도 그 사용에 제약이 있는 것이 사실이다. 이의 독성을 저감할 수 있는 방법으로는 입자의 크기를 크게 하거나 그 형태를 제어하는 다양한 기술이 알려져 있으나 물질적인 특징인 cell viability에 미치는 영향을 극복하는 것은 요원한 상태이다. 이를 극복하기 위한 다른 방법으로 산화 촉매에 해당하 ZnO와 대표적인 항산화물질에 해당하는 Vitamin C(ascorbic acid)의 혼합물에 대한 독성에 대한 연구는 많이 알려져 있다.([Toxic effects of zinc oxide nanoparticles combined with vitamin C and casein phosphopeptides on gastric epithelium cells and the intestinal absorption of mice , RSC Adv., 2018, 8, 26078 ] [ A combined toxicity study of zinc oxide nanoparticles and vitamin C in food additives, Nanoscale, 2014, 6, 15333] 문헌 등). 상기의 문헌들에 알려져 있는 바로는 300 ppm의ascorbic acid와15ppm의Zinc Oxide의 혼합물로 높은 세포 독성을 나타냄을 확인할 수 있다. 다양한 분야에서 금속 산화물과 항산화 물질의 조합을 통해 금속 산화물 자체의 독성을 해결하기 위한 많은 연구가 진행되고 있으나 그 실질적인 성과는 아직 요원한 상태이다.

또한, 금속산화물류는 높은 표면전하를 띄고, 수소결합에 용이한 높은 전하량을 갖는 산소원자를 함유하고 있어, 공극을 함유하는 금속 산화물에 있어 높은 함수율을 극복하는 것이 매우 어려운 공정으로 알려져 있다. 이에 따라 일반적으로는 500℃이상의 고온에서 건조하여 조성물(composite)상에서 물을 제거하게 되거나, 또는 200℃ 이상의 온도에서 중진공(2X10^-3 mm bar)의 조건에서 건조하는 것이 알려져 있다. 하지만 이러한 극한의 조건의 경우 높은 공정비용 포함할 뿐만 아니라 유기계 물질의 분해의 원인이 되기 때문에 고체간의 혼합만이 가능한 문제점이 있다.

금속 산화물의 경우 수분을 함유하는 경우 높은 촉매효율을 나타내기 때문에 항산화 물질과의 하이브리드(hybrid-composite)의 형성이 어렵다는 치명적인 문제점을 가지고 있다. 즉, 항산화 물질의 산화를 촉진시킬 수밖에 없는 치명적인 한계점이 있으며, 이에 보조적인 역할을 할 수 있는 수분의 제거는 본 기술 분야에 있어 매우 중요한 기술이라 할 수 있다.

KR 101537063 B1

본 발명은 활성성분의 변성을 저감시켜 그를 안정적으로 공급할 수 있는 활성성분-금속산화물의 복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 활성성분을 안정적으로 지속 방출할 수 있는 활성성분-금속산화물의 복합체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 금속 성분 특유의 독성이, 활성성분에 의하여 저감될 수 있는 활성성분-금속산화물의 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 금속염의 수용액을 염기성 물질로 공침시켜 층간에 이온이 삽입된 층상 금속염의 침전을 형성하는 단계; 및 상기 층간의 이온을 활성성분으로 이온 교환하여 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는, 금속산화물 복합체가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 내부에 다중 공극 또는 다층구조가 형성되는 금속산화물 또는 금속수산화물; 및 상기 공극 또는 상기 다층구조 사이에 삽입되는 활성성분;을 포함하고, 상기 활성성분은 상기 금속산화물 또는 금속수산화물로부터 1시간에 20 내지 40%이 용출되고, 12시간에 40 내지 60%이 용출되는 용출율로 지속 방출되는, 금속산화물 복합체가 제공될 수 있다.

또한, 상기 활성성분은 복합체 총 100wt%에 대하여 15 내지 65wt%로 포함될 수 있다.

또한, 상기 금속산화물 복합체는 하기 화학식 1 내지 6 중 적어도 하나로 표현되는 화합물을 포함할 수 있다.

[화학식 1]

[(MO)_x(A)_z]·mH₂O

(상기 화학식 1에서, M은 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 및 Zn²⁺으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,

x는 1 이상 20 미만이고,

z는 0 초과 100 이하이고,

A는 활성성분이다.)

[화학식 2]

[(MO)_1-x(M`O)_x(A)_z]

(상기 화학식 2에서, M은 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 및 Zn²⁺으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,

M'는 Al³⁺, Cr³⁺, Fe³⁺, Ga³⁺, In³⁺, V³⁺ 및 Ti³⁺로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,

x는 0.01 내지 0.5이고,

z는 0 초과 100 이하이고,

A는 활성성분이다.)

[화학식 3]

[M²⁺ _(1-x)N³⁺ _x(OH)₂]A_x·yH₂O

(상기 화학식 3에서, M²⁺는 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 또는 Zn²⁺이고,

N³⁺은 Al³⁺, Cr³⁺, Fe³⁺, Ga³⁺, In³⁺, V³⁺ 또는 Ti³⁺이고,

A는 (-) 전하를 띠는 활성성분이고,

x는 0.01 내지 0.5의 수이고,

y는 0 초과 100 이하의 수이다).

[화학식 4]

[M²⁺(OH)_x']A_(2-x')·yH₂O

(상기 화학식 4에서,

M²⁺는 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 또는 Zn²⁺이고,

A는 (-) 전하를 띠는 활성성분이고,

x'는 1 초과 2 미만의 수이고;

y는 0 초과 100 이하의 수이다).

[화학식 5]

[Zn₅(OH)₈A₂] ㆍ nH₂O

(상기 화학식 5에서, n은 0 초과 100 이하의 수이다).

[화학식 6]

Zn₃(OH)₄A₂ㆍnH₂O

(상기 화학식 6에서, n은 0 초과 100 이하의 수이다).

또한, 상기 금속산화물 또는 금속수산화물은 아연이온을 포함할 수 있다.

또한, 상기 활성성분은 산성 또는 음이온성 유기계일 수 있다.

또한, 상기 활성성분은 비타민 C 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.

또한, 상기 금속수산화물은 2 내지 5개의 층이 형성된 층상형 금속수산화물일 수 있다.

또한, X선 회절 패턴이 5.96±1°, 8.5±1°, 10.36±1°, 13.36±1°의 회절각 2θ에서의 피크를 포함할 수 있다.

또한, 입경이 0.5 내지 200㎛일 수 있다.

또한, 상기 금속산화물 또는 금속수산화물과 상기 활성성분의 전구체를 알코올 및 물의 혼합용매로 공침 반응시켜 제조될 수 있다.

또한, 상기 금속산화물 또는 금속수산화물과, 상기 활성성분을 1:0.05 내지 2의 몰비로 반응시켜 제조될 수 있다.

또한, 상기 공침 반응을 위한 반응 용액의 pH가 6 내지 8이고, 온도가 18 내지 25℃일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 금속산화물 복합체를 포함하는, 화장료 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 금속산화물 복합체는 높은 비표면적을 가지며, 입자간 응집(agglomeration)을 통해 음이온성 물질을 안정적으로 흡착시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면에 따른 금속산화물 복합체는 변성된 수산화물 구조체를 통하여 그 내부에 과량의 활성성분을 안정적으로 담지할 수 있다. 이를 통하여, 활성성분의 변성을 저감시키며 효과를 온존한채로 그를 전달하기 위한 중간체 물질로 사용되기 유용하다.

또한, 본 발명의 일 측면에 따른 금속산화물 복합체는 비정형 응집을 통하여 그 내부에 다양한 크기의 공극이 형성되거나 또는 다층구조로 형성되므로, 높은 흡착률을 가지며 활성성분의 단계적 방출에 의한 시간차 방출 제어가 가능하여 개선된 전달 효율을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면에 따른 금속산화물 복합체는 활성성분의 방출을 서방화시켜, 활성성분의 투여 또는 피복횟수를 감소시켜 사용자의 편의성을 향상시킬 수 있으며, 금속산화물로 인한 부작용을 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면에 따른 금속산화물 복합체는 효율적인 제조공정을 통하여 제조되므로, 우수한 생산성을 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 복합체의 형성 과정을 도시화한 모식도,
도 2는 아연 이온에 대한 검량곡선 그래프,
도 3 내지 5은 본 발명의 복합체의 XRD 회절구조를 확인한 것,
도 6은 본 발명의 복합체의 활성성분 용출 특성을 확인한 것,
도 7 및 8은 용출된 활성성분을 NMR을 통하여 확인한 것,
도 9는 본 발명의 복합체의 활성성분 안정성이 증대된 것을 확인한 것,
도 10은 본 발명의 복합체의 SEM 이미지,
도 11은 본 발명의 복합체의 SEM 이미지 및 EDX 분석결과,
도 12는 본 발명의 복합체의 입도분포를 확인한 것,
도 13은 본 발명의 복합체의 입형을 확인한 것,
도 14는 본 발명의 복합체의 경피흡수율을 확인한 것,
도 15는 본 발명의 복합체의 ROS감소율을 확인한 것,
도 16은 본 발명의 복합체의 독성테스트 결과를 확인한 것.

본 발명은 내부에 다중 공극 또는 다층구조가 형성되는 금속산화물 또는 금속수산화물; 및 상기 공극 또는 상기 다층구조 사이에 삽입되는 활성성분;을 포함하고, 상기 활성성분은 상기 금속산화물 또는 금속수산화물로부터 지속 방출되는, 금속산화물 복합체 및 그를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 금속산화물 복합체가 제공된다. 상기 금속산화물 복합체는 금속산화물 및 활성성분을 포함한다. 상기 금속산화물은 금속산화물 또는 금속수산화물일 수 있다.

상기 금속산화물 또는 금속수산화물은 일반적으로 형성되는 금속산화물의 구조에서 내부가 변성된 것일 수 있다. 상세하게는, 내부에 다중 공극 또는 다층구조가 형성된 것일 수 있다. 상기 다중 공극은 서로 다른 크기를 갖는 공극들이 형성된 것을 의미한다. 상기 금속산화물은 일반적으로 형성되는 촘촘한 결정 구조의 금속산화물의 구조와 달리, 내부에 공극이 형성된 것으로, 상기 공극은 서로 다른 크기를 갖도록 형성될 수 있다. 상세하게는, 상기 공극은 적어도 두 개의 다른 공극 크기를 갖도록 형성될 수 있다. 또한, 상기 금속수산화물은 내부에 적어도 두 개 이상의 층이 형성되며, 층간 거리가 서로 상이하도록 형성될 수 있다. 상세하게는, 상기 층은 2 내지 5개가 형성될 수 있으며, 형성되는 층이 3개 이상인 경우에는 적어도 두 개의 다른 층간 거리를 갖도록 형성될 수 있다.

상기 금속산화물 또는 금속수산화물은, 입자들 사이의 응집(agglomeration)을 비정형으로 유도하여 전술한 바와 같이 다수의 공극이 형성되거나 또는 다층형의 내부구조로 형성될 수 있으며, 이러한 구조 및 입자간 응집을 통하여, 음이온에 대하여 안정적이고 높은 흡착률을 나타낼 수 있다. 또한, 비표면적을 증대시키기 위하여 나노사이즈의 금속산화물을 이용하는 종래기술에 비하여, 내부구조가 조절되어 높은 비표면적을 가지면서도 피부 흡수는 어려워 현저히 낮은 독성을 나타낼 수 있으며, 이를 통하여 활성물질의 효율적인 전달이 가능한, 인체에 대한 안전성이 향상된 서브미크론(submicron) 사이즈의 하이브리드 복합체를 형성할 수 있다. 이에 따라, 상기 금속산화물 또는 금속수산화물은, 종래 물질과 동일 또는 유사한 화학식으로 표현되더라도, 내부구조가 변경됨에 따라, 종래물질과는 상이한 결정 구조를 가질 수 있다.

상기 금속수산화물은 층상형 금속수산화물일 수 있다. 상기 층상형 금속수산화물은 약염기성 또는 중성의 무기화합물로써, 수산화기가 존재하고 표면의 전하가 양전하를 띄므로 강한 친수성을 나타낸다. 층상형 금속수산화물은 입자상의 내부 결정 구조가 층상형이며 특이한 층간 반응성을 나타낼 뿐만 아니라 음이온 교환능(anion exchange capacity)이 있는데, 이는 층상형 금속 수산화물에서 그 원인은 다르나 공통적으로 수산화물층이 양전하를 띠고 있어 이를 보상하기 위해 층간 음이온이 존재하며 이 층간 음이온은 다른 음이온종으로 치환될 수 있기 때문인 것으로 판단된다. 따라서, 층상형 금속 수산화물에는 층간삽입 가능한 크기의 (-) 전하를 띠는 생리활성물질이 층간 삽입될 수 있으며, 상기 생리활성물질은 층상형 금속 수산화물의 층간에 도입되어 안정화될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 층상형 금속 수산화물은 금속 이중층 수산화염(Layered double hydroxide;LDH) 및 아연 염기성염(ZBS: Zinc Basic Salt) 으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

종래의 LDH(Layer Double Hydroxide)계 단일 층상의 물질의 경우, 층과 음이온 간의 상호작용은 단순한 이온적 상호작용(ionic interaction)에 의한 결합이기 때문에 수분산시에 쉽게 그 결합이 깨어지고 이로 인하여 내부의 물질을 빠르게 방출하는 단점을 가지고 있었다. 상세하게는, 고체상에서 또는 수화 에너지가 낮은 용매에 분산시에는 높은 안정성을 유지할 수 있지만, 실제 인체에 적용할 수 있는 버퍼(buffer) 또는 수용액상에서는 내부의 물질을 빠르게 방출하는 한계점을 가질 수 있으며, 이 방출 패턴이 단순확산 메커니즘(simple diffusion mechanism)에 의해 조절되기 때문에 그 방출 속도를 제어할 수 없는 한계점이 있었다. 그러나, 본 발명의 다중 공극 내지 다층구조의 금속산화물 또는 금속수산화물의 경우 내부에 삽입된 여러 종류의 공극 내지는 층상을 갖는 ZnO 또는 ZBS계 hybrid 물질의 음이온계 물질과 무기계 입자간의 상호작용(interaction)의 강도의 차이로 그 차별성을 설명할 수 있다. 작은 공간 내지는 좁은 층간에 촘촘(compact)하게 인터칼레이션(intercalation)된 물질과 중간층, 그리고 가장 넓은 공극 내지는 층상에 삽입된 음이온계 물질의 경우 방출 속도에 있어 차이가 생길 수 있다.

상기 금속산화물 또는 금속수산화물은 2가 금속 양이온을 포함할 수 있다. 상기 2가 금속 양이온으로는, 예를 들면, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 철 이온으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기 활성성분은 사람의 피부 등에 작용하여 효과를 나타낼 수 있는 성분으로, 상기 금속산화물 또는 금속수산화물의 내부에 담지될 수 있다. 상기 활성성분은 생리활성물질일 수 있다. 상기 활성성분은 산성 또는 음이온성 유기계 물질일 수 있다. 상기 활성성분은 상기 금속산화물의 공극 또는 상기 층상형 금속 수산화물의 층간에 삽입 가능한 크기를 가질 수 있다. 상기 활성성분은 상기 금속산화물 또는 금속수산화물의 내부에 담지되어, 안정성 및 경피 투과율이 향상될 수 있다. 상기 활성성분으로는, 예를 들면 비타민류, EPA, 인돌-3-아세트산 및 피부질환 치료용 약물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 비타민류는 비타민 C 또는 이의 화장품학적으로 허용가능한 염일 수 있다.

상기 활성성분은, 본 발명의 금속산화물 복합체 총 100wt%에 대하여 15 내지 65wt%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 활성성분의 함량이 15wt% 미만이면 활성성분의 전달 효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 상기 활성성분의 함량이 65wt% 초과이면 상기 금속산화물 또는 금속수산화물 내부에 담지되지 못하는 활성성분이 발생하여 활성성분의 변성이 발생하는 문제가 발생할 수 있고, 수율 및 흡착률이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 금속산화물 복합체는 전술한 바와 같이 금속산화물 또는 금속수산화물계 물질의 내부구조(polymorphism)를 변경함으로써 내부에 다양한 크기의 공극이 유도되거나 또는 다양한 층간거리의 다층형 구조가 유도될 수 있으며, 이 사이에 정전기적 인력을 이용한 활성성분을 삽입하여 재조립(refabrication)이 수행될 수 있다. 이를 통하여, 무기물인 금속산화물과 유기물인 활성성분이 결합된 유-무기 복합 조성물(organic-inorganic hybrid composite)로 제공될 수 있다. 본 발명의 금속산화물 복합체는, 활성성분을 담지하게 되는 금속산화물 또는 금속수산화물의 내부에 다양한 크기의 공극이 형성되거나 또는 다양한 층간거리의 다층구조가 형성됨으로써, 단일 공극 또는 균일화된 층간거리를 갖는 경우보다 활성성분의 조절방출이 용이하도록 할 수 있으며, 이를 통하여 활성성분의 우수한 지속적 전달 효율을 나타낼 수 있다. 본 발명의 금속산화물 복합체에 있어서, 상기 활성성분은 상기 금속산화물 또는 금속수산화물로부터 1시간에 20 내지 40%이 용출되고, 12시간에 40 내지 60%이 용출되는 용출율로 지속 방출될 수 있다. 이는 피부 도포 후 활성성분을 지속적으로 방출한다는 것을 의미하며, 따라서, 도포 횟수를 저감시키면서 활성성분의 효능은 달성하는 방출패턴을 달성할 수 있는 것을 의미한다. 상기 용출율은 하기 실험방법에 따라 상기 복합물 내에 포함된 전체 활성성분 함량 총 100wt%을 기준으로 산정된 것으로, 하기 수학식 1에 따라 시간경과에 따른 누적 용출율을 구하여 계산될 수 있다.

상기 수학식 1에서, 투입된 실시예에 포함된 총 ascorbic acid 총량은, 테스트 시료(실시예)에 함유된 ascorbic acid를 분석법에 기술된 HPLC분석법을 이용하여 총 고체상의 실시예 1에 함유된 ascorbic acid를 산출한 이후 이를 이용하여 산출하였다. 예를 들면, 42% ascorbic acid 함량을 갖는 테스트 시료를 1.0g 사용하는 경우 0.42g의 ascorbic acid를 total ascorbic acid로 설정하였다.

용액중 ascorbic acid의 량은 용액중 방출된 ascorbic acid를 측정하여 계산하였다. Releasing medium용액 1ml를 취하여 syringe filter(Millipore, 0.2um, Nylon)로 필터후 HPLC를 이용하여 releasing medium 내 용출된 ascorbic acid의 량으로 사용하였다.

무기계 물질, 일 예로, 단일 층상구조를 형성하는 층상형 이중층 금속수산화물의 경우 유기계 음이온의 방출 속도가 매우 빠르다는 단점을 가지고 있다. 이는 방출 메커니즘이 단순 이온교환에 의해 이루어 지기 때문에 생리적 컨디션(physiological condition) 및 생체 시스템에서 강력한 음이온에 해당하는 인산을 함유하는 releasing medium에서는 0.5 시간 내에 대부분의 음이온이 인산이온으로 교환이 일어나기 때문이다. 하지만 topical application의 경우 초기 방출량이 높을지라도 SC layer의 skin barrier를 투과할 수 있는 유효물질의 량은 한계가 있기 때문에 초기의 높은 방출량은 효능(efficacy) 측면에 있어 의미가 없어지는 문제점을 가지고 있다. 반면, 본 발명의 상기 복합체에 포함된 활성성분은, 그 구조체인 상기 금속산화물 또는 금속수산화물로부터 1시간에 20 내지 40%이 용출되고, 12시간에 40 내지 60%이 용출되는 용출율로 지속 방출될 수 있으며, 이에 따라 피부장벽(skin barrier)을 통과할 수 있는 활성성분을 지속적으로 방출할 수 있어, 지속적으로 활성유효성분을 공급할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 금속산화물 복합체는 하기 화학식 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로 표현되는 화합물을 포함할 수 있다. 상세하게는, 하기 화학식 1 또는 2로 표현되는 금속산화물 복합체 또는, 하기 화학식 3 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로 표현되는 층상형 금속수산화물 복합체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 화학식 5 또는 6으로 표현되는 ZBS(Zinc Basic Salt) 복합체를 포함할 수 있다.

(상기 화학식 1에서, M은 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 및 Zn²⁺으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,

x는 1 이상 20 미만이고,

z는 0 초과 100 이하이고,

A는 활성성분이다.)

(상기 화학식 2에서, M은 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 및 Zn²⁺으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,

M'는 Al³⁺, Cr³⁺, Fe³⁺, Ga³⁺, In³⁺, V³⁺ 및 Ti³⁺로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,

x는 0.01 내지 0.5이고,

z는 0 초과 100 이하이고,

A는 활성성분이다.)

(상기 화학식 3에서, M²⁺는 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 또는 Zn²⁺이고,

N³⁺은 Al³⁺, Cr³⁺, Fe³⁺, Ga³⁺, In³⁺, V³⁺ 또는 Ti³⁺이고,

A는 (-) 전하를 띠는 활성성분 이고,

x는 0.01 내지 0.5의 수이고;

y는 0 초과 100 이하의 수이다).

(상기 화학식 4에서,

M²⁺는 Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺ 또는 Zn²⁺이고,

A는 (-) 전하를 띠는 활성성분 이고,

x'는 1 초과 2 미만의 수이고;

y는 0 초과 100 이하의 수이다).

바람직하게는, 상기 화학식 3에서, M²⁺는 Mg²⁺이고, N³⁺은 Al³⁺인 것이 좋다.

바람직하게는, 상기 화학식 4에서, M²⁺가 Zn²⁺인 것이 좋다. 상기 화학식 4에서, M²⁺가 Zn²⁺인 경우, 본 발명의 금속산화물 복합체는 하기 화학식 5 또는 6으로 표현될 수 있다.

(상기 화학식 5에서, n은 0 초과 100 이하의 수이다).

(상기 화학식 6에서, n은 0 초과 100 이하의 수이다).

상기 화학식 3 내지 6에 있어서, 활성성분은 층상형 금속수산화물의 층간에 삽입 가능한 크기를 가지면서 (-)전하를 띠는 한, 그 종류는 제한되지 않는다.

상기 화학식 3 내지 6으로 표시되는, 층상형 금속수산화물 복합체는, 활성성분이 삽입되지 아니한 것도 포함한다. 예를 들면, 상기 복합체에 있어서 활성성분은 내부 삽입되지 않고 표면에 결합된 것일 수도 있다.

본 발명의 금속산화물 복합체는 X선 회절 패턴이 5.96±1°, 8.5±1°, 10.36±1°, 13.36±1°의 회절각 2θ에서의 피크를 포함할 수 있다. 또한, 0.5 내지 200㎛, 바람직하게는 1 내지 100㎛의 입경을 가질 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 금속산화물 복합체는 상기 금속산화물 및 상기 활성성분의 전구체를 알코올 및 물의 혼합용매로 공침 반응시켜 제조될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이 때 금속산화물은 내부 구조가 변경된 상기 금속산화물 또는 금속수산화물을 포함하는 의미이며, 이하에서는 상기 금속산화물 또는 금속수산화물을 통칭하여 '금속산화물'로 기재하여 설명하기로 한다. 본 발명의 금속산화물 복합체는 먼저 금속산화물 전구체를 준비하는 단계; 활성성분을 알코올 및 물의 혼합용매에 용해시켜 활성성분 용액을 준비하는 단계; 상기 금속산화물 전구체 및 활성성분 용액을 침전반응시키는 단계를 포함하는 제조방법을 통하여 제조될 수 있다. 본 발명의 금속산화물 복합체의 제조에 있어서, 혼합용매로 알코올 및 물을 이용한 침전법을 이용함으로써, 별도의 공정단계를 더 필요로 하지 않고 활성성분을 금속산화물 구조체 내부로 도입할 수 있으며, 이를 통하여 활성성분을 안정화시킬 수 있다. 전술한 바와 같이 활성성분의 도입을 위한 별도의 공정단계를 더 필요로 하지 않으므로 전체 제조방법에서의 제조시간을 현저히 단축시킬 수 있다. 상세하게는, 활성성분-금속산화물 복합체를 제조하기 위한 종래 공정 방법의 경우 10 내지 12시간이 소요되었으나, 전술한 바와 같이 알코올 및 물의 혼합용매를 이용한 공침법으로는 3시간 내지 5시간으로 그 제조를 위하여 소요되는 시간이 현저히 단축될 수 있다. 또한, 종래기술 대비, 제조되는 복합체의 내부에 담지되는 활성성분이 상기 화학식 1 내지 3 중 적어도 하나의 시성식 기준 5 내지 60wt% 추가 첨가되는 효과를 나타낼 수 있다. 상기 알코올은 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 혼합용매에 있어서, 알코올 및 물의 중량비는 1:9 내지 9:1일 수 있다. 바람직하게는, 알코올 및 물의 중량비는 1:0.6 내지 1.2일 수 있다.

금속산화물, 층상형 금속수산화물 또는 점토질계 물질의 경우 metal-oxygen 결합을 가지고 있는 것을 그 일반적 특징으로 하는데, 이 경우 금속에 배위된 산소원자를 통해 물분자와 강한 수소 결합을 하는 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 그 표면의 성질은 친수성이며, 함수율이 매우 높은 특징을 갖는다. 금속산화물의 경우 고온 소성을 통해 얻어지기 때문에 함수율이 낮은 상태로 얻어지지만, 이를 수분하게 되면 금속산화물 자체의 내부 구조를 형성하고 있는 M(metal)-O(oxygen)간의 결합이 일부 깨어지면서 공극이 형성되며, 이 공극 사이에 물분자가 삽입되면서 스웰링(swelling)되는 특징을 가지고 있다. 따라서, 물을 일부 용매로 사용하는 경우에는 얻어진 고체상의 물질을 효율적으로 건조하는 것이 매우 중요하다. 이는 아스코르브산(Ascorbic acid)과 같이 친수성이면서 물에 의해 분해(degradation)가 유도되는 물질을 활성성분으로 이용하게 되는 경우 특히 중요한 공정이다. 또한, 금속산화물 또는 금속수산화물을 사용하는 경우 산화 촉매 역할을 할 수 있으며, 가수분해의 경우 물분자가 반드시 필요한 분해 과정이기 때문에 수득된 입자상의 물질 내에서 물을 효율적으로 제거하는 것이 매우 중요하다. 생체 적용물질의 경우 가능하면 class III~IV의 용제를 사용해야 하는데, 본 발명에서는 이를 위해서 에탄올과 물의 혼합 용매를 반응 용매로 사용하여 금속산화물 입자내로의 물분자의 침투 정도를 조절하였으며, 친수성 물질인 유기산을 활성물질로 이용하는 경우 흡착 후 반응 용매속으로 재분산되는 것을 막아야 하기 때문에, 다양한 비율 조합을 통해 가장 적합한 비율을 설정하여 본 발명을 완성하였다.

또한, 본 발명의 금속산화물 복합체의 제조시 알코올이 포함된 혼합용매를 이용함으로써, 세척시 사용되는 UF(Ultra filteration) 필터의 막힘을 방지할 수 있고, 제조공정중 활성성분의 산화 또는 갈변과 같은 변성을 방지할 수 있으며, 스프레이 드라이어를 이용한 건조시에 물을 용매로 사용하는 공정에 비하여 건조시간이 단축되고 60 내지 70℃의 낮은 건조온도에서 건조가 가능하여, 활성물질의 변성을 저감시키기 위한 최적화된 환경을 구성할 수 있다.

본 발명의 금속산화물 복합체에 있어서, 상기 금속산화물의 내부구조는 알코올 및 물을 포함하는 용매를 이용하여 유도될 수 있다. 물 및 에탄올을 포함하는 용매 상에서 금속산화물의 내부 구조 변경이 유도된 후에, 활성 성분을 흡착시키고 재조립(refabrication)이 수행되어 활성성분이 내부에 담지된 금속산화물 복합체로 제조될 수 있다. 이 때 상기 금속산화물 및 상기 활성성분은 1:0.05 내지 2의 몰비로 반응시킬 수 있다. 상기 몰비는 제조되는 금속산화물 복합체 총 100wt%에 있어서 활성성분이 15 내지 65wt%로 포함되도록 제조하기 위한 값으로, 상기 금속산화물의 함량이 상기 범위에 기재된 함량범위 미만이면 무기물인 ZnO과 같은 화합물의 특징인 높은 밀도와 단단한 표면(hard surface)을 유지하게 되어, 이로 인해 상대적으로 높은 구조적인 안정성을 나타내게 되므로 내부에 함유된 유기물의 조절 방출이 이루어 지기 어려운 문제가 발생할 수 있고, 상기 금속산화물의 함량이 상기 범위에 기재된 함량범위 초과이면 무기입자의 공극 또는 층상구조에 흡착되는 것 이외에도 입자상 표면에 과량의 활성성분이 흡착되게 되고, 표면에 흡착된 과량의 활성성분은 산화촉매역할을 하는 ZnO과 같은 금속산화물에 의하여 산화가 촉진되어, 공기중의 수분과 빛에 의해 빠르게 산화되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 공침 반응에 있어서, 반응을 위한 반응 용액의 pH는 6 내지 8이고 반응 용액의 온도는 18 내지 25℃일 수 있다. 전술한 반응조건으로 공침 반응을 수행하는 경우에 본 발명의 유-무기 하이브리드 복합체가 높은 효율로 제조될 수 있다.

상기 금속산화물 복합체 중 금속수산화물에 활성성분이 층간 삽입된 복합체의 비제한적인 제조방법의 일 구현예를 상세하게 설명한다. 본 제조방법은 금속염의 수용액을 염기성 물질로 공침시켜 층간에 이온이 삽입된 층상 금속염의 침전을 형성하는 단계와, 상기 층간의 이온을 활성성분으로 이온 교환하여 복합체를 형성시키는 단계를 포함한다.

상기 복합체의 제조과정에서 출발물질로 사용되는 금속염은, ZnCl₂, Zn(NO₃)₃, Zn(CH₃COO)₂, MgCl₂, AlCl₃, CaCl₂, Mg(NO₃)₂, Al(NO₃)₃ 또는 이들의 수화물을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 공침에 사용되는 용매는 물, C 1 내지 4의 알코올 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 에탄올이 선택되는 것이 좋다. 공침법에서 사용되는 금속 이온의 농도는, 0.01 몰 내지 5 몰로, 활성성분은 금속 성분의 전체 몰 수를 기준으로 그의 0.1 내지 10배인 몰비로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

필요에 따라, 침전 반응시 염기를 가하여 침전을 유도할 수 있다. 상기 염기로는, 예를 들면 알칼리금속 수산화염 또는 아민류가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 반응시 반응용액의 pH는 4 내지 11, 바람직하게는 6 내지 8이고, 반응온도는 0℃ 내지 20℃, 바람직하게는 0℃내지 5℃일 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응조건하에서의 반응시간은 30분 이상인 것이 좋다. 또한, 상기 반응 중에는 질소 또는 불활성 기체를 연속적으로 투입하고 차광하여 반응시키는 것이 좋다.

본 발명의 금속산화물 복합체의 형성을 시간적 순서에 따라 도시화하여 도 1

에 나타냈다. 도 1을 보면, 입자상의 금속산화물 또는 금속수화물의 내부 구조 변경을 통해 서로 다른 공극을 갖는 다공극 구조 또는 층상 구조체를 형성시키고, 상기 금속산화물 또는 금속수화물과는 반대 전하를 띄는 음이온성 활성물질을 그에 흡착시킬 수 있으며, 재응집시켜 본 발명에 따른 금속산화물 복합체의 최종 구조체를 얻을 수 있다. 이때, 입자상의 물질은 다양한 내부구조를 갖는 구조체 역할을 할 수 있으며, 내부에 생성된 다양한 크기의 공극 또는 층상의 구조에 따라 흡착된 물질-입자상 구조체 사이의 상호작용이 달라질 수 있다. 또한, 금속산화물 또는 금속수화물의 내부구조가 변경되고, 음이온성 물질이 그에 흡착됨에 따라 표면전하의 변화가 발생하게 되는데, 이로 인하여 재응집시키는 것이 용이해지므로, 입자상의 물질을 수득할 수 있으며, 이때의 조건에 따라 다양한 사이즈 및 입형의 조절이 가능해질 수 있다.

또한, 이렇게 수득된 입자상의 물질에 함유되게 되는 활성물질의 경우 단일상의 흡착 형태 내지는 삽입형태보다 그 조절 방출이 용이하며, 장기간 지속 방출이 가능하다. 이는 내부구조가 변경되며 생성된 공극 내지는 층상구조와의 크기에 따른 입체상의 장애와 물분자 내지는 이온교환물질의 침투에 영향을 받는 결과인 것으로 판단된다.

또한, 이렇게 수득된 입자상의 물질은 기존의 단일계 금속 산화물에 비해 세포독성이 현저히 낮아지는 특징을 가지고 있어, 생체에 대한 친화성이 높아, 생체에 적용하기 매우 유리한 특장점을 갖는다.

본 발명에 따른 상기 금속산화물 복합체는 피부에 도포되는 물질로 제조될 수 있다. 예를 들면, 화장료 또는 피부 외용제로 제조될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 또는 피부 외용제는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 수분로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 수분크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저 등의 제형으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

<금속산화물 복합체의 제조>

[제조예 1] ZnO 및 아스코르브산을 5:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

반응기에 ZnO (6g, 73.73 mmol)를 2N HCl 74ml를 질소 환경하에서 서서히 첨가하고 분산시켜 현탁액을 제조하였다. 염산용액이 완전히 투입되고 나서 반응액의 pH는 0.5 내지 1.5를 유지하면서 현탁액이 맑은 용액으로 변할 때까지 반응시켰다. 다른 반응용기에 아스코르브산(Ascorbic acid, 5.2g, 29.49mM)을 에탄올 수용액(에탄올:물=1:1) 50ml에 완전히 용해시킨 후 반응기에 첨가하고, 0.5시간 동안 600rpm의 교반 속도로 교반시켰다. 이 플라스크에 액체펌프를 이용하여 3.2N의 NaOH 용액을 40ml 1ml/min의 속도로 첨가하여 용액의 최종 pH를 6.8이 되도록 적정하여 현탁액을 제조하였다. 이 pH를 유지하면서 300rpm의 속도로 3시간 동안 20℃의 온도를 유지하며 빛을 차단한 상태에서 에이징(aging)을 수행하였다. 에이징 단계의 종결 시점은 용액 중 잔류 아스코르브산이 100ppm 이하인 시점으로 설정하였다. 이후 상기 혼합액을 Amicon stirred cell과 76mm RC membrane(MWCO=50,000 Da)를 이용하여, 50% 에탄올 수용액을 이용하여 5회 desalting작업을 수행하였으며, 최종적으로는 고순도 에탄올을 이용하여 용매 치환 및 농축작업을 수행하였다. 이후, Pall life science 상에 pressure filter set과 N₂ gas 그리고 45mm membrane(PVDF, 02um)을 이용하여 pressure filter 및 N₂ gas를 이용하여 예비 건조를 수행하였다. 수득된 슬러리 상태의 복합체 혼합물을 진공건조 또는 동결 건조를 통해 최종의 입자상의 물질을 수득하였다(yield=78.4%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₉Zn₅, [(ZnO)₅(Asc)₂]·2H₂O이고, 이론상 계산된 원소분석 값(Calculated elemental analysis)는 C, 18.17; H, 2.29; O, 38.33; Zn, 41.21이고, 분석 결과값(Found)은 이론상 계산된 값과 일치하였다. 복합체 총 100%(wt%)에 있어서, ZnO 함량은 51.18%, 아스코르브산 함량은 44.29%이고 함수량 4.53%이었다.

[제조예 2] ZnO 및 아스코르브산을 1:1 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (12.99g, 73.73mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₉O₈Zn, [ZnO(Asc)₂]·H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 26.25; H, 3.30; O, 46.63; Zn, 23.82이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 29.55%, 아스코르브산 함량은 63.92%이고 함수량 6.53%이었다.

[제조예 3] ZnO 및 아스코르브산을 3:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (8.66g, 49.15mM)), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₇Zn₃, [(ZnO)₂(Asc)₃]이고, 계산된 원소분석 값은 C, 22.86; H, 2.88; O, 43.15; Zn, 31.11이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 38.61%, 아스코르브산 함량은 55.69%이고 함수량 5.69%이었다.

[제조예 4] ZnO 및 아스코르브산을 2:1 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (6.49g, 36.87mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₉O₉Zn₂, [(ZnO)₂(Asc)]·H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 20.25; H, 2.55; O, 40.46; Zn, 36.74이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 45.62%, 아스코르브산 함량은 49.34%이고 함수량 5.04%이었다.

[제조예 5] ZnO 및 아스코르브산을 6:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (4.33g, 24.58mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₉O₁₀Zn₃, [(ZnO)₃(Asc)]·H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 16.48; H, 2.07; O, 36.59; Zn, 44.86이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 55.72%, 아스코르브산 함량은 40.18%이고 함수량 4.11%이었다.

[제조예 6] ZnO 및 아스코르브산을 8:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (3.25g, 18.43mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₁₁O₁₂Zn₄, [(ZnO)₄(Asc)]·2H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 13.43; H, 2.07; O, 35.78; Zn, 48.73이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 60.55%, 아스코르브산 함량은 32.75%이고 함수량 6.69%이었다.

[제조예 7] ZnO 및 아스코르브산을 12:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (2.16g, 12.29mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₁₁O₁₄Zn₆, [(ZnO)₆(Asc)]·2H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 10.30; H, 1.59; O, 32.03; Zn, 56.09이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 69.89%, 아스코르브산 함량은 25.16% 이고 함수량 5.14%이었다.

[제조예 8] ZnO 및 아스코르브산을 16:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (1.62g, 9.22mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₁₁O₁₆Zn₈, [(ZnO)₈(Asc)]·2H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 8.36; H, 1.29; O, 29.69; Zn, 60.66이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 75.58%, 아스코르브산 함량은 20.70% 이고 함수량 4.17%이었다.

[제조예 9] ZnO 및 아스코르브산을 22:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (1.18g, 6.70mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₆H₁₁O₁₉Zn₁₁, [(ZnO)₁₁(Asc)]·2H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 6.51; H, 1.00; O, 27.48; Zn, 65.01이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 81.06%, 아스코르브산 함량은 16.14% 이고 함수량 4.17%이었다.

[제조예 10] Zn(NO₃)₂·6H₂O 및 아스코르브산을 5:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

증류수에 30ml Zn(NO₃)₂·6H₂O(2.97g, 10 mmol)을 60 wt% (에탄올 수용액)가 되게 100ml 3-neck flask에 (Zinc solution)에 투입하고, 불활성기체와 진공을 이용하여 degassing 하며 완전 용해시킨다. 한편, 4M NaOH 용액을 2-neck flask(RF-2)에 넣은 후 불활성 기체와 진공을 이용하여 degassing 작업을 수행한다. 그 후, 3-neck reaction flask(RF-1)에 ascorbic acid(0.70g, 4mmol)를 70 wt%(에탄올 수용액) 60ml를 완전히 녹인다. 이때, 불활성 기체를 bubbling 하여, 용액내 잔류 O₂ gas 및 CO₂ gas를 추가로 제거 한 후 water bath를 이용하여 상온으로 냉각한다.

상기 질산아연 수용액을 ascorbic acid가 녹아 있는 반응기에 서서히 투입한 후, NaOH 수용액을 pH 6.4 내지 7.0 사이가 될 때까지 서서히 투입하고, 5 내지 7 시간 동안 pH를 유지하며 저온 결정화를 진행하였다. 상기 혼합액을 Amicon stirred cell과 76mm RC membrane(MWCO=50,000 Da)를 이용하여, 50% 에탄올 수용액을 이용하여 5회 desalting작업을 수행하였으며, 최종적으로는 고순도 에탄올을 이용하여 용매 치환 및 농축작업을 수행하였다. 이후, Pall life science 상에 pressure filter set과 N₂ gas 그리고 45mm membrane(PVDF, 02um)을 이용하여 pressure filter 및 N₂ gas를 이용하여 예비 건조를 수행하였다. 수득된 슬러리 상태의 복합체 혼합물을 진공건조 또는 동결 건조를 통해 최종의 입자상의 물질을 수득하였다. 아스코르브산 함량은 41.35% 이었다.

본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₉Zn₅, [(ZnO)₅(Asc)₂]·2H₂O 이고, 계산된 원소분석 값은 C, 18.17; H, 2.29; O, 38.33; Zn, 41.21이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다.

[제조예 11] ZnSO₄-7H₂O 및 아스코르브산을 5:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnSO₄-7H₂O(2.87g, 10mmol), ascorbic acid(0.7g, 4mmol) 및 NaOH 수용액을 이용하여 상기 제조예 10과 같은 방법으로 최종 분말상의 조성물을 수득하였다. 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₉Zn₅, [(ZnO)₅(Asc)₂]·2H₂O 이고, 계산된 원소분석 값은 C, 18.17; H, 2.29; O, 38.33; Zn, 41.21이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. 아스코르브산 함량은 41.35% 이었다.

[제조예 12] ZnCl₂ 및 아스코르브산을 5:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnCl₂(1.36g, 10mmol), ascorbic acid(0.7g, 4mmol) 및 NaOH 수용액을 이용하여 상기 제조예 10과 같은 방법으로 최종 분말상의 조성물을 수득하였다. 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₉Zn₅ , [(ZnO)₅(Asc)₂]·2H₂O 이고, 계산된 원소분석 값은 C, 18.17; H, 2.29; O, 38.33; Zn, 41.21이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. 아스코르브산 함량은 41.35% 이었다.

[제조예 13] Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 및 아스코르브산을 5:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

Zn(CH₃COO)₂·2H₂O(2.19g, 10mmol), ascorbic acid(0.7g, 4mmol) 및 NaOH 수용액을 이용하여 상기 제조예 10과 같은 방법으로 최종 분말상의 조성물을 수득하였다. 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₉Zn₅, [(ZnO)₅(Asc)₂]·2H₂O 이고, 계산된 원소분석 값은 C, 18.17; H, 2.29; O, 38.33; Zn, 41.21이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. 아스코르브산 함량은 41.35% 이었다.

[제조예 14] Zn(NO₃)·6H₂O, Al(NO₃)·9H₂O 및 아스코르브산을 2:1:1 몰비로 반응시킨 복합체 제조

Zn(NO₃)·6H₂O(2.30g, 8mmol), Al(NO₃)·9H₂O(1.5g, 4mmol), ascorbic acid(0.7g, 4mmol) 및 NaOH 수용액을 이용하여 상기 제조예 10과 같은 방법으로 최종 분말상의 조성물을 수득하였다. 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₁₉ZnAl₅, [(ZnO)₅(Asc)₂]·2H₂O 이고, 계산된 원소분석 값은 C, 18.17; H, 2.29; O, 38.33; Zn, 41.21이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. 아스코르브산 함량은 37.30% 이었다.

[제조예 15] ZnO 및 아스코르브산을 38:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (0.68g, 3.88mM), 그리고 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)을 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=28.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₈O₃₃Zn₁₉, [(ZnO)₁₉(Asc)]·2H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 7.46; H, 0.94; O, 27.32; Zn, 64.28이고, 분석 결과값은 이론상 값과 일치하였다. ZnO 함량(wt%)은 87.94%, 아스코르브산 함량은 10.01%이고 함수량 2.05%이었다.

[제조예 16] ZnO 및 아스코르브산을 1:2 몰비로 반응시킨 복합체 제조

ZnO (6g, 73.73mM), 2N HCl 74ml(2eq), 아스코르브산 (25.98g, 147.46mM), 3.2N NaOH (ethanol 50% 용액)를 이용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 제조하였으며, 연노란색의 최종 물질을 수득하였다(yield=48.9%, ZnO basis). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 C₁₂H₁₆O₁₄Zn, [ZnO(Asc)₂]·H₂O이고, 계산된 원소분석 값은 C, 32.06; H, 3.59; O, 49.82; Zn, 14.54이고, 분석 결과값은 C, 33.29; H, 3.4; O, 49.19; Zn, 15.05 이었다. ZnO 함량(wt%)은 17.33%, 아스코르브산 함량은 75.00%이고 함수량 7.67%이었다.

[제조예 17] 비타브리드 C의 제조

Zn(NO₃)₂ㆍH₂O 6g과 비타민C 1.42g을 카보네이트 이온(CO₃ ^2-)이 제거된 3차 증류수에 용해시킨 다음, 0.2M NaOH를 사용하여 pH를 6~7 정도로 적정한 후 12시간 반응을 진행하여 비타민C-아연 염기성 염 침전물을 얻었다. 상기 적정된 용액을 원심분리기로 상등액을 분리하고 세척하는 과정을 5회 반복 실시를 통해서 미반응 염과 비타민C를 제거하여 2.9g(수율65%, 비타민C함량 42%)을 수득하였다(XRD peak 2 theta = 7 ). 본 제조예에서 수득된 최종 물질의 화학식은 [Zn₅(OH)₈(Asc)₂]·2H₂O 이었다.

<제조된 복합체의 기기분석>

HPLC 분석을 이용하여 제조된 복합체의 함량분석을 수행하였다. Agilent 1260 HPLC systems( with DAD detector and Q-pump) 기기를 사용하고, 컬럼은 Poroshell 120, C18 (4.6mmX 150mm, 3.5um, Agilent technologies, USA)을 사용하였으며, 이동상은 water:ACN=2:8 (0.1% trifluoroacetic acid) 조건으로 하여, 파장 240nm, 유속 0.65 ml/min, 인젝션 볼륨 10㎕ 으로 수행하였다.

[샘플 전처리]

각 샘플 40mg을 정밀하게 취하여 TFA가 0.1% 혼합된 이동상 90g에 섞은 후, 볼텍스 믹서를 이용하여 5분간 혼합한 후, 10분간 초음파 처리 한후 최종의 전체 혼합 용액의 무게를 100g이 되도록 이동상 용매를 추가하여 분석물질의 농도가 40mg/100g (400ppm) 되도록 정밀히 첨가하였다. 이후, 용액을 syringe filter(Millipore, nylon, pore size 0.2㎛)를 이용하여 필터하고 오토 샘플러에 장착하였다. 이때, 시료의 온도는 4℃를 유지하며, 차광하여 ascorbic acid의 추가 산화를 방지하였다.

[아연의 정량분석]

Perkin elmer ICP-MS (NexION 300) 기기를 이용하여 수행하였다. 희석용매로 0.2% 질산을 사용하였다. 아연 이온에 대한 검량선 작성을 위해, Perkin elmer사로부터 구매한 혼합 표준용액을 이용하여 희석하여 측정하였으며, regression equation: Y = 17.8194 + 146.871로 계산 되었다. 이때, R² 값은 0.999996으로 높은 신뢰도의 정량곡선을 얻었다. 아연 이온에 대한 검량곡선 그래프(1ppm ~ 0.5ppm)은 도 2에 나타냈다.

[제조예 시료의 전처리]

제조된 각 제조예의 시료 50mg을 정밀하게 칭량하여 0.2% 질산용액을 첨가하여 최종 용액의 무게를 50.0g으로 맞춘 후 볼텍싱하여 혼합하고, 10분간 초음파 처리한 후 원심분리기를 이용하여 12,000rpm으로 5분 원심분리한 후 상층액을 syringe filter(Millipore, 0.2um, nylon)하여 새로운 tube로 옮긴 후 적절히 희석하여 ICP-MS에 주입하였다. 1차 제조 농도는 50mg/50g wt./wt.(1,000ppm, 시료농도)로 하고, 인젝션 시에는 1/10(100ppm), 1/100(10ppm)배 희석 하여 주입하였다.

[금속산화물 함량 계산]

금속 산화물의 함량은 상기의 정량곡선과 산화물에 해당하는 이온의 ICP-MS 분석 결과를 이용하여, 식약처의 금속 산화물 계산법을 이용하여 계산하였다. 예를 들어, ZnO 함량은 분석된 Zn 이온의 농도에 O원자의 무게를 더하여 총량을 계산하였으며, 그 계산식을 아래 수학식 2에 표시하였다.

<제조된 유-무기 하이브리드 복합체에서의 활성물질의 안정성 확인>

먼저 X-선 회절분석법을 이용하여 확인하였다. 혼성물질의 결정상 분석은 분말 X-선 회절분석기(Philips PW 1380)의 Cu-Ka radiation(λ = 1.54184 A)를 이용하여 분석하였으며, 분석할 시료는 슬라이드 글래스 위에 얇게 펴서 도포한 필름 형태의 샘플을 이용하였다. 분석대상은 상기 제조예들 및 ZBS(Zinc Basic Carbonate : Zn₅(OH)₈(Asc)₂)를 대상으로 하고, 그 결과를 도 3 내지 도 5에 나타냈다. 상세하게는, 상기 ZBS, 상기 제조예 1 및 제조예 17을 대상으로 한 결과는 도 3에 나타내고, 제조예 3 및 제조예 10 내지 12를 대상으로 한 결과는 도 4 및 5에 도시하였다.

NO₃ ^2-나 CO₃ ^2- Cl^-등 단일 음이온이 층간에 삽입된 경우, 층간에 삽입된 음이온의 크기에 따라 7~8 Å인 d003 값을 갖는다. 또한, bulky 음이온인 ascorbic acid의 경우도 LDH 계열의 물질을 포함하여 단일한 층간거리를 갖는다. 반면에, 도 1 내지 3을 보면, 본 발명의 바람직한 실시예의 제조예에 해당되는 상기 제조예 1~12의 경우 2개이상에서 3개의 peak 값을 갖는 것으로 나타났다. 이를 통하여, 2개 이상의 서로 다른 공극의 크기를 갖는 물질이 동시에 형성됨을 확인할 수 있다. 비타민C 이온이 함침된 ascorbic acid-ZnO, 또는 ascorbic acid-ZBS의 혼성 물질의 1차 혼성물질의 d003 값이 ~14 Å 정도로 알려져 있으며, 층간에 비타민C 분자가 단일층으로 배열되어 있음을 의미하지만, 본 발명의 제조예의 경우 2개 이상의 공극 내지는 층상 구조를 이루는 것을 도 1 내지 3을 통해 확인할 수 있다. 이는 ascorbic acid와 같이 금속이온과 여러 개의 결함 모드를 갖을 수 있는 donor atom 들이 금속 산화물 또는 금속 수산화물층의 잉여 양이온과 정전기적 인력에 의하여 안정화되는 경우 여러 개의 결합 모드가 있음을 나타내는 결과이다.

상기와 같은 여러 개의 공극을 갖는 ZnO 경우 입자상의 ZnO의 내부 구조 변성을 유도할 수 있는 물질의 사용에 따라 발생할 수 있다. 이때 사용할 수 있는 물질의 경우 유기산 또는 무기산이 사용될 수 있으며, 그 반응시간 및 반응조건에 따라서 그 정도를 변화시킬 수 있음을 도면의 XRD 회절 pattern을 이용해서 확인하였다. 제조예 1의 회절 패턴을 얻기 위해 발명자들은 다양한 농도의 염산을 이용하여 ZnO의 내부구조 변형을 유도하였으며, 이는 염산 이외에도 질산, 황산, 그리고 변성 내부 공극에 삽입될 수 있은 산성계 음이온 물질로도 공극 형성이 가능함을 확인할 수 있었다.

<제조된 유-무기 하이브리드 복합체의 분말상 물질에서의 탈수효과>

본 발명의 반응 조건상 발생할 수 있는 부산물은 NaCl, ZnCl₂, sodium ascorbate 등 물에 대한 용해도가 높은 물질이며, 이를 제거하는 step인 desalting 작업을 수행하였다. Desalting 작업은 물을 사용하여 진행하는 것이 원칙이지만 본 발명에서는 슬러리상의 물질의 함수율을 낮추기 위해서 물/에탄올 혼합 용매를 이용하여 desalting 작업을 수행하였으며, desalting 과정 중 유출되는 ascorbic acid의 량을 최소화시킬 수 있는, 그리고 방출되는 아연이온의 량을 최소화할 수 있는 용매 조합을 설정하였다.

그리고 desalting 후 최종적으로는 100% ethanol을 이용한 washing 작업을 통해 입자상의 물질의 표면의 물을 ethanol로 교환함으로써 건조가 용이한 분말상의 제조방법을 완성하였다. 이후 진공 건조, 분무건조, 동결 건조 등의 방법으로 잔류 용매를 제거할 경우 본 발명의 제조예와 같이 낮은 함수율의 분말상의 유-무기 복합체를 수득할 수 있었다. 각각 사용 용매 조건에서의 일정 건조 조건(건조 방법; 진공건조, 건조온도; 40℃, 진공도; 10mmbar, 건조 시간; 12시간)에서의 건조 효율에 대한 내용을 하기 표 1에 정리하였다. 하기 표 1에서, 각각의 값은 워싱 후 함수율을 분석한 결과(wt%)이며, *로 표시된 것은 불순물 NaCl이 검출된 것을 의미한다.

	에탄올:물 (80:20)	에탄올:물 60:40	에탄올:물 50:50	에탄올:물 40:60	에탄올:물 20:80	에탄올:물 0:100
제조예1	3.2*	4.2	3.5	6.4	6.4	8.4
제조예3	3.5*	4.1	4.3	6.3	7.4	8.4
제조예5	3.4*	3.8	4.2	6.6	8.4	9.4
제조예7	3.1*	3.5	4.6	5.8	7.4	8.4
제조예9	3.8*	3.2	5.3	6.6	8.4	9.4
제조예16	3.2*	6.1	4.9	6.3	7.4	8.4
제조예10	3.9*	4.3	3.6	7.1	8.4	9.4

상기 표 1을 보면, 에탄올 60~40%(wt%) 용액의 경우 3 내지 7%로 큰 차이가 없는 함수율을 나타내고, washing 용액에서 ethanol의 농도가 높은 경우(80%)에는 불순물인 NaCl이 다량 검출됨을 확인할 수 있다. 이는 에탄올 함량이 높을 경우 NaCl 자체가 침전물을 형성함으로써 잔류하는 것이 원인으로 확인되었다. 물의 함량이 높은 경우에는 같은 조건에서 진공 건조 후에도 8.4 이상으로, 에탄올 50%에 비하여 대략 2배정도 함수량이 높은 것을 확인할 수 있었다.

<활성성분의 용출패턴 확인>

제조예 1 및 비교예의 NaCl 수용액 내에서의 시간에 따른 용출패턴의 변화를 확인하여 도 6에 나타냈다. 비교예로는 종래 LDH 내에 아스코르브산을 담지하도록 제조한 복합체인 제조예 17을 이용하였다.

Hanson 사의 Elite-8 모델을 사용하여 실험을 수행하였다. vessel 온도는 digital temperature prove를 이용하여 자동 측정 하였다.

실험방법은, 대한약전(제9개정)에 따른 패들(paddle)방법을 사용하였다. PBS buffer (pH 6.8)의 용출액 900ml에서, 32℃ ± 0.5℃, 50rpm 으로 용출 시험하였을 때, 10시간 이후에 상기 속방층 및 서방층에서 방출된 총 활성성분 용출율이 상기 복합물 내 포함된 전체 활성성분 함량 100중량%을 기준으로 산정되었다. 이때, 용출된 활성물질의 량은 HPLC를 이용하여 측정하였다. 이때 사용한 시료의 량은 ascorbic acid를 기준으로 450mg을 기준으로 산정하여 비교 하였다.

도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 층간에 삽입되어 있는 활성성분인 비타민C는 NaCl 수용액에서 Cl 음이온과 비타민C 음이온간의 이온교환반응에 의해 제어된 형태로 방출됨을 볼 수 있다. 본 발명에 따른 유-무기 혼성 복합체인 제조예 1은 비교예에 비하여 제어된 방출 속도로 아스코르브산을 방출함을 확인할 수 있으며, 초기 보다는 후기의 방출 속도가 현저히 낮아짐을 확인할 수 있다. 이것은 내부구조가 변성된 금속산화물 또는 금속수산화물 내부로 삽입된 음이온성 물질과 양이온성의 무기계 물질의 결합력의 차이에 의해 발생하는 현상으로 해석할 수 있다.

<용출된 활성성분의 특성 확인>

제조예 1의 물질을 D₂O에 분산시킨 후 UV spectroscopy(Perkin elmer lamda 35)와 1H, 13C-NMR(nuclear magnetic resonance, Varian 500MN)을 이용하여 방출된 음이온, 본 실험에서는 아스코르브산에 대하여 측정하였으며 측정결과를 도 7 및 8에 나타냈다.

UV spectroscopy의 경우 같은 내부에 삽입된 ascorbic acid의 량을 HPLC로 정량 분석하여 같은 ascorbic acid 농도를 기준으로 표준물질의 농도와 분석 물질의 농도를 맞추어 측정하였다. 분석 결과 층간에서 용출된 ascorbic acid와 표준 물질인 ascorbic acid 의 흡수 패턴 및 최대 흡광도가 정확히 일치함을 볼 수 있다. 이것은 층간에 삽입되어 있는 비타민C가 특별한 화학적인 변화 없이 안정하게 보관되어 있다는 것을 의미하며, 내부 구조 변경에 의해 생성된 공극내에 포집된 경우이든, ZBS와 같은 무기캡슐에 의해 층상에 삽입되어 있는 경우이든 화학적 변화 없이 안정한 상태로 보관됨을 확인할 수 있다. 또한 비타민C의 삽입-용출은 비타민C 입장에서는 위상반응(topotactic reaction)을 통해 진행됨을 의미하는 것이며, 이는 공극 내지는 층상 구조와의 단순 electrostatic interaction에 의해 이루어짐을 의미한다.

핵자기 공명 분광 실험(NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy)는 varian 사의 500MHz의 multi probe model을 이용하여 측정하였으며, 제조예의 방법으로 제조된 시험 물질을 D₂O에 분산시켜 측정하였다. 이때 표준물질로는 TMS(trimethylsilane)을 사용하여 chemical shift를 보정하여 사용하였다.

합성된 제조예 1에 대하여 ¹H, ¹³C-NMR spectroscopy를 측정한 결과, UV spectrum으로는 확인할 수 없었던 유-무기 혼성체에서 방출되는 물질의 경우 산염기 반응에 따른 단순 방출이 아닌 무기물을 이루는 일부 물질의 구조적인 변형에 의해 금속 이온과 같이 방출됨을 확인할 수 있다. Ascorbic acid의 경우 ¹H, ¹³C-NMR 의 chemical sfift가 Zinc ascorbate와 매우 유사함을 확인함으로써, 층간 또는 공극내 삽입된 음이온성 물질의 방출시 inorganic backbone을 형성하는 무기물질의 이온과 같이 방출됨을 확인하였다. 이를 통하여, 본 제조예의 물질이 단순한 유효성분의 전달뿐만 아니라 체내 필수 무기물의 공급원으로써도 역할을 수 있는 가능성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

<활성물질의 안정성 확인>

제조예 1에 대하여, 수상(water)환경, 오일상(silicone oil)환경 및 분말(powder) 자체의 안정성을 실온(25℃) 및 42℃의 두가지 온도 조건에서 8주간에 걸쳐 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 도시하였다.

25℃와 42℃의 안정성 시험은 각각 습도 75%에서 차광상태에서 밀폐용기에 보관하는 조건을 기준으로 측정하였으며, 가속안정성 조건과 일반 안정성 시험조건하에 안정성 시험 챔버를 이용하여 실험하였으며, 분석은 상기의 HPLC 분석 조건을 이용하여 분산매에 함유되어 있는 ascorbic acid의 량을 측정하여 분석하였다. 이때, 0 time에 분석된 농도를 100%로 환산하여 시간에 따라 감소된 량을 계산하여 표시하였다.

매질	온도 (℃)	기간(주)
		0	4	8
수상	25	25.0(100%)	25.0(100%)	24.9(99.6%)
	42	25.0(100%)	24.9(99.6%)	24.2(98.0%)
오일상	25	25.0(100%)	25.0(100%)	24.9(99.6%)
	42	25.0(100%)	25.0(100%)	24.8(99.2%)
분말	25	25.0(100%)	25.0(100%)	25.0(100%)
	42	25.0(100%)	25.0(100%)	24.8(99.2%)

상기 표 2를 보면, 무기캡슐을 이용하여 비타민 C를 안정화시키는 경우에는 8주 후에도 98% 이상 비타민 역가가 보존되는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 비타민 C 분자가 본 발명의 복합체의 금속산화물 층간에서 정전기적 인력에 의하여 안정화되어 있으므로, 외부환경으로부터 비타민 C의 변성을 효과적으로 방지할 수 있는 것을 의미한다.

캡슐화시키는 경우의 아스코르브산의 안정성 향상 정도를 비교하기 위하여, 본 발명에 따른 실시예에 해당되는 제조예 1, 비교예, 순수 비타민 C 및 비타민 유도체에 대하여 상대적 안정성을 평가하였다. 순수 비타민C로는 Roche(Switzerland)사의 L-아스코르브산(L-ascorbic acid) 및 Roche(Switzerland)사의 아스코빌 팔미테이트(Ascorbyl palmitate)를 사용하였으며, 비교예로는 무기물에 의해 캡슐화된 비타민C로서 Nikko VC-PMG(Japan)사의 마그네슘-아스코빌 팔미테이트(Mg-Ascorbyl phosphate)을 사용하였고, 2중 코팅 물질로서 비타브리드-C를 사용하였다. 경과기간에 따른 비타민 잔량을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9에서, 실시예로 표기된 샘플은 상기 제조예 1을 의미한다.

도 9를 보면, 본 발명에 따른 실시예의 제조예에 해당되는 제조예 1이 다른 비타민C 유도체 및 안정화기술에 비해 현저히 안정성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 불안정한 비타민C를 안정화하는데 있어서 단일 층상 구조 내지는 단일 공극을 갖는 단순한 방출 메커니즘을 갖는 물질보다는 다단계 방출 시스템을 갖는 본 발명의 복합체가 우수한 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

<전자현미경을 이용한 복합체의 관찰>

본 발명에 따른 실시예의 제조예에 해당되는 제조예 1에 대하여 SEM을 이용하여 그 형태를 확인하였다. FE-SEM 관찰하기 위해서 10 kV의 가속 전압에서 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM, JMS-6701F, JEOL)을 사용하였고, 원소 조성을 확인하기 위해서 에너지 분산 X-선 분광법(EDX, JED-2300 Energy Dispersive X-ray Analyzer, JEOL)을 사용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 10에 나타냈다.

도 7을 보면, 본 발명의 혼성물질의 경우 100 nm 이하 사이즈의 미세입자들이 응집되어 sub-micro의 크기를 갖는 입자를 형성함을 확인할 수 있고, 입자의 형태는 구형에 미세 공극을 가지고 있음을 확인할 수 있다.

제조예 1 및 10에 대하여 SEM을 이용하여 형태를 확인하는 동시에 EDX 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 11에 나타냈다. 도 11의 (A)는 제조예 1의 결과이고, (B)는 제조예 10의 결과이다.

<복합체의 입도 및 입형 분석>

본 발명의 유-무기 하이브리드 복합체의 입도 및 입형을 분석하기 위하여, Malvern사의 Morphologi G3장비를 이용하여 분말상의 제조예 1의 입도 및 입형을 확인하였다. 단순한 입자의 크기의 측정의 경우 입자의 물리적 특징(분말의 흐름도 및 핸들링), 화학적 특징(표면적에 따른 수분산 특성 및 용해도)등에 대한 기초 정보를 얻을 수 없는 단순한 크기 분포에 대한 분포도에 대한 정보만을 획득할 수 밖에 없는 반면, 입형 분석이 동시에 진행될 경우 표면적 계산 및 약물방출 특성등을 예측할 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 이는 공기중에 입자상의 물질을 분산시킨 후 고속 카메라를 이용하여 각각의 입자를 추적하여 고배율 현미경으로 측정하는 방식으로 크기별 입형을 측정할 수 있으며, 평균적인 입자의 크기를 측정하는 기존의 장비와는 달리 TEM 또는 SEM과 같이 특정 크기의 입자의 개수에 의존하는 방식이다. 실시예 1에 대하여 측정을 수행한 결과를 도 12에 나타냈다.

도 12를 참조하면, 입도 분포는 1 내지 100um의 크기를 갖는 입자들이 분포됨을 확인할 수 있다.

제조예 1 및 10에 대한 입도의 % 분포를 측정한 결과는 도 13에 나타내었다. 도 13의 (A)는 제조예 1의 입형 분석 결과이고, (B)는 제조예 10의 입형 분석 결과이다.

도 13을 보면, 입형 분석 결과 전체적인 입자의 모양은 구형에 가까운 모양으로 확인되었으며, 제조예 1의 입도 및 입형이 제조예 10보다 고른 분포를 나타냄을 확인할 수 있었다.

<경피흡수 모델을 이용한 복합체의 피부 흡수율 확인>

경피 흡수 실험은 OECD guide line(OECD (2004). Test Guideline 428: Skin absorption: in vitro Method. OECD, Paris)에 따라 인공 피부와 프란츠 셀(Frentz cell) 법을 이용하여 실험을 수행하였고 그 결과를 도 14에 나타냈다. 도 14에서, 비교예로는 제조예 17을 이용하였다.

피부투과장치는 공여칸(donor chamber)과 수용칸(receptor chamber)으로 구성되어 있고 이 사이에 인공피부를 고정한다. 동일한 시험에 사용하는 각 셀은 4 cm² 범위 내에서 동일한 표면적을 갖는 셀을 사용하였다. 인공피부는 각질층(stratum corneum)이 위로 위치하도록 하여 피부투과장치에 고정하였다. 피부투과장치는 피부를 잘 밀착시켜야 하고, 피부 하단의 수용 액을 균질하게 혼합시킬 수 있어야 하며, 수용 액의 채취가 용이하고, 장치와 내용물의 온도 조절이 용이해야 한다. 피부투과장치는 borosilcate 재질을 사용하였으며, heat block을 이용하여 온도 조절을 하였으며, receptor chamber는 차광하여 사용하였다. 공여칸은 실험의 특성상 닫아서 사용하였다.

수용액(Receptor fluid)은 피부조직과 친화성이 있는 pH=7.4 buffer 용액을 이용하였다. 시험물질을 평가하는 경우의 수용 액은 분석 과정 및 분석 농도를 고려하여 HPLC 분석법을 이용하여 분석하였다.

정적 확산장치에서 수용액의 양은 일반적으로 10 mL를 이용하였으며, 용액은 지속적으로 균질하게 혼합하기 위하여 온도가 조절되는 multi-position 자력교반기를 이용하여 50rpm으로 교반 하였으며, 동적 확산 장치에서 수용칸의 수용 액 양은 일반적으로 2.5 mL로 설정하였다. 수용액의 유속은 공여칸의 양이 3 mL(3회 교환/hr)일 때 9 mL/hr이거나 공여칸의 양이 150-300 μL(5-10회 교환/hr)일 때 1.5 mL/hr로 설정하여 실험하였다.

<MTT assay 법을 이용한 세포독성 확인 시험>

실험에 사용된 세포는 마우스 대식세포(mouse macrophage RAW 264.7 cell line)로서 한국 세포주 은행(KCLB,Korea)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 10% FBS (Fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM배지를 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

시험물질의 세포에 대한 독성 측정을 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Raw 264.7 cell 1x10⁴ cell/ml를 96 well plate에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 Lipopolysaccharide(LPS, 1μg/mL)와 농도별 시험물질(0, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 다시 배양하였다. Well 당 50 μg/ml MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 2시간 동안 반응시킨 후, 상충액을 제거하고, DMSO 100μl를 처리하였다. Microplate reader을 이용하여 570nm 에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

세포 내 ROS(reactive oxygen species) 수준은 OxiSelect^TM Intracellular ROS Assay Kit(Cell Biolabs, Inc.)를 사용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell 을 DMEM 배지를 이용 하여 1x10⁴ cell/ml로 조절한 후 96 well plate에 분주하고 37℃, 5% CO² incubator에서 24시간 동안 전배양 하였다. 시험물질을 각각의 농도로 처리한 후 4시간 동안 전배양 하였다. 그 후 1 μg/ml의 LPS 50 μl를 처리한 후 20시간 동안 추가 배양하였다. 배양 마지막 30분 동안 10μM DCFH-DA를 배양액에 첨가하여 반응시킨 후 PBS (pH 7.4)로 DCFH-DA를 3회 씻어낸 후 fluorescence microplate reader을 이용하여 excitation 485nm, emission 530nm에서 형광을 측정하였다. 정량적 평가를 위하여 DCF Standard를 10, 20, 40 μM로 처리하여 비교하였다. 모든 시험은 3회 이상 반복 실시하여 그 평균값으로 비교하였다.

시험물질의 세포 독성을 파악하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과, 비교예에 해당되는 시험물질인 제조예 15 내지 17, L-ascrobic acid, 실시예에 해당되는 시험물질인 제조예 1 및 10을 각각 0, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000μg/ml 농도로 처리하였다. 그 결과 모든 시험 물질에서 80% 이상의 세포 생존률을 나타내는 농도로 0, 1.9, 3.8, 7.5, 15 μg/ml을 선정하였다.

세포생존율 확인 실험에서 선정된 농도 (0, 1.9, 3.8, 7.5, 15 μg/ml) 로 시험물질의 Raw 264.7 cell에서 LPS로 유발된 세포 내 ROS 제거능력을 확인함으로써 시험물질의 항산화 효능을 확인하고자 하였다. 정량적 평가를 위하여 측정 kit내의 DCF Standard를 10, 20,40μM로 처리하여 비교하였다. 그 결과 상관계수(r2)가 0.99이상으로 매우 양호한 직선성을 나타내었다.

유발군 대비 시험물질 처리군의 세포 내 ROS 감소율을 확인한 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서, 제조예 1 및 10은 실시예에 해당되고, 제조예 15 내지 17은 비교예에 해당된다.

도 15에 각 시험물질의 ROS inhibition capacity를 무처리 군을 100%(효과 없음)을 기준으로 환산하여 나타내었다. 양성 대조군으로 사용된 L-Ascorbic acid는 순수 Vitamin C로 함량은 100%이며, 비교예의 물질은 분석결과를 바탕으로 계산하여 환산하였다. 그 결과 L-Ascorbic acid와 비교하여 제조예 1의 물질이 산화적 손상 억제율이 전체적 농도 영역대에서 대략 5% 이상, 최대 8.4% 더 크게 나타났다. 제조예 15의 경우 전체적이 용량에 따른 유의미한 결과가 나타나지 않았으며, 제조예 16의 경우에는 용량에 따른 의존적 억제효과를 나타내기는 하였으나 그 억제효과가 낮은 결과를 얻었다. 이는 Ascorbic acid가 소량 함유된 제조예 2의 경우 유효성분의 방출이 용이하지 않은 이유로 판단되며, 과량 첨가된 제조예 16의 경우 ZnO의 표면에 흡착된 ascorbic acid의 산화에 의한 영향으로 판단된다. 제조예 17은 단일상 내지는 단일 층상구조고를 갖는 물질로써, 항산화력을 나타내기는 하지만 대조군인 ascorbic acid에 비해 그 효과가 떨어짐을 확인할 수 있다. 반면 본 발명의 제조예 1과 10의 경우 대조군인 ascorbic acid에 대비 뛰어난 ROS inhibition effect를 갖는 것을 확인할 수 있다.

<금속산화물의 독성 저감 효과 확인>

금속산화물의 독성 저감 효과를 확인하기 위한 실험에 사용된 세포는 마우스 대식세포(mouse macrophage RAW 264.7 cell line)로서 한국 세포주 은행(KCLB,Korea)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위해 10% FBS (Fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM배지를 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

시험물질은 다음과 같이 준비하여 사용하였다. 실험에 사용된 시료 중 Vitamin C는 USP grade의 표준물질을 사용하였으며, 대조군에 해당하는 ZnO 및 VitC의 혼합물의 경우 medical grade Zinc Oxide(sigma)와 USP grade ascorbic acid를 차광상태에서 혼합 후 몰타르를 이용하여 갈아서 균일하게 조제된 파우더로 사용하였으며, 그 혼합 비율은 상기 제조예 1과 유사한 비율인 ZnO:ascorbic acid = 55:45로 혼합하여 사용하였다. 제조예 17을 비교제조예로, 제조예 1을 실시예로 본 실험에 사용하였다. 제조예 17 및 제조예 1의 경우 실험법에 따라 제조된 고체상의 물질을 세포실험 전에 몰타르를 이용하여 균일하게 갈아서 실험에 사용하였다.

시험물질의 세포에 대한 독성 측정을 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. Raw 264.7 cell 1x10⁴ cell/ml를 96 well plate에 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 Lipopolysaccharide(LPS, 1μg/mL)와 농도별 시험물질(0, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 다시 배양하였다. Well 당 50 μg/ml MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 2시간 동안 반응시킨 후, 상충액을 제거하고, DMSO 100μl를 처리하였다. Microplate reader을 이용하여 570nm 에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

시험 물질의 cell viability를 파악하기 위하여 MTT assay는 다음과 같이 수행하였다. 시험 물질인 ZnO 및 VitC의 혼합물(ZnO와 ascorbic acid의 혼합물), 제조예 1 및 17의 물질을 각각 0, 7.8, 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1000μg/ml 농도로 처리하였다. 이 때, 양성 대조군으로 Vitamin C (100 ppm)를 사용하여 그 값을 양성 대조군 값으로 사용하였으며, 그 실험 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에 있어서, ZnO 및 VitC의 혼합물은 ZnO+VitC로 표시하였다. 제조예 1은 실시예에 해당되고, 제조예 17 및 ZnO+VitC은 비교예에 해당된다.

도 16을 보면, Vitamin C(ascorbic acid)는 무처리군인 대조군에 비해 세포활성도가 높아진 반면 나머지 실험군의 경우 처리 농도에 비례하여 세포 활성도가 낮아지는 결과를 얻었다. 특히 ZnO+VitC의 경우 세포 독성이 나타나는 농도가 10 ppm 으로 상대적으로 독성이 높게 나타남을 확인하였으며, 이는 공지된 문헌상(RSC Adv., 2018, 8, 26078-26088)에 알려진 금속산화물의 독성 값과 유사한 결과를 얻었다. 제조예-17의 경우, ZnO+VitC 시료에 비하여 1.5~2배 정도 낮아진 결과를 수득하였다. 본 발명의 바람직한 실시예에 속하는 제조예-1의 경우 cell viability를 80% 이상 유지하는 농도가 300ppm 이상의 값을 얻었다. 상기 제조예-1의 결과를 보면, 이는 단순한 혼합물에 가까운 ZnO+VitC의 경우보다 30배 가까운 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않는 결과를 의미한다. 이에 따라, 금속산화물의 독성이 저감된 복합체에 관한 본 발명을 완성하였다.

상기 제시된 데이터의 결과는 항산화물질이 금속산화물 고유의 독성을 제어하는데 매우 유리한 조건을 제시함을 나타내며, 이때 항산화물질의 조절 방출이 매우 중요한 역할을 함을 나타낸다. 상세하게는, 항산화물질의 빠른 방출은 초기 금속산화물의 초기 독성을 제어하는데 도움을 줄 수 있으나 용액 중에서 없어지거나 대사되지 않는 금소계 물질의 특징상 장시장, 예를 들면, 12시간 이상 시간이 지난 뒤에는 금속 산화물의 독성을 제어하는데 도움을 주지 못함을 나타내는 실험 결과이다.

Claims (1)

1. 금속염의 수용액을 염기성 물질로 공침시켜 층간에 이온이 삽입된 층상 금속염의 침전을 형성하는 단계; 및
   상기 층간의 이온을 활성성분으로 이온 교환하여 복합체를 형성시키는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는, 금속산화물 복합체.

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