KR20200038766A

KR20200038766A - 풍도대극으로부터 분리된 감마-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 포함하는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200038766A
Application number: KR1020180118391A
Authority: KR
Inventors: 조현우; 안병관; 정호경; 우경완; 이현주; 노종현
Original assignee: 한약진흥재단
Priority date: 2018-10-04
Filing date: 2018-10-04
Publication date: 2020-04-14
Also published as: KR102147985B1

Abstract

본 발명은 풍도대극(Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus.)으로부터 분리된 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(γ-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside)를 포함하는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(γ-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside)를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 기존 항암제인 시스플라틴의 투여시 시스플라틴의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 시스플라틴에 의한 신장 세포의 사멸을 억제함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

풍도대극으로부터 분리된 감마-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 포함하는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 조성물 {Composition for preventing and treating nephrotoxicity comprising gamma-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside isolated from Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus}

본 발명은 풍도대극(Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus.)으로부터 분리된 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(γ-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside)를 포함하는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

신장은 외인성 독성 물질과 그로 인한 독성 대사체를 흡수-무독화-배설 과정을 통해 체외로 배출시킴으로써 체내의 항상성을 유지하는 데 기여하는 매우 중요한 기관이다. 따라서 신장은 항상 독성 물질에 노출되어 있으므로 약물이나 산화적 스트레스 등에 의한 독성이 발생하기 쉽다(Ichimura et al., 2008; Rached et al., 2008; Sieber et al., 2009; Ferguson et al., 2008). 신장 독성은 신약 개발과정에서 주요한 bottleneck이 되는데 비임상 독성 시험에서 실험동물의 organ toxicity의 약 20% 이상을 차지하고 있다(Kohli et al., 2000; Naughton et al., 2008; Nagai and Takano, 2010). 신장은 약한 손상 시에는 정상적으로 기능을 하기 때문에 상당한 손상을 받기 전에는 기능적인 변화를 관찰하기 어렵다. 현재의 신장 기능의 임상 독성학적 평가는 blood urea nitrogen (BUN)이나 serum creatinine(sCr)의 측정으로 이루어지고 있는 데 이러한 방법은 민감도가 낮아 신장 상피 세포의 70~80%가 손상되어야 검출이 되는 단점을 갖고 있다(Rached et al., 2008; Kirtane et al., 2005). 또한 손상된 신장 세포로부터 뇨로 방출되는 효소들(γ-glutamyl transferase(γ-GT), N-acetyl-β-Dglucosaminidase(NAG))은 뇨에서 안정하게 존재하지 못하고 빨리 분해된다(Ferguson et al., 2008; Han et al., 2008). 기존의 사용되어 온 혈액 또는 뇨 내에 존재하는 단백질을 활용하는 지표 물질들을 활용한 신장 독성 진단은 조기에 진단하기 어려우므로 보다 민감하고 정확한 신장 독성에 대한 바이오마커의 발굴이 요구되고 있다(Aicher et al., 1998,; Devarajan et al., 2008). 현재 신장독성을 확인하기 위한 여러가지 방법이 개발되고 있다. 특히 유전자의 발현 여부를 중심으로 신장독성 여부를 판단하려는 시도가 있었다.

한편, 암(cancer)은 전 세계적으로 연간 약 700만 명의 사망 원인이 되는 질병이며, 특히 우리나라에서는 지난 통계청의 『2000년 사망원인 통계연보』(2000년 사망 자료 분석 결과)에 의하면, 암으로 인한 사망은 23.5 %로 전체 사망원인 중 1위를 차지하고 있어 국가차원의 암관리 대책이 요구되고 있다. 현재 암을 치료하는 방법으로 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법들이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나가 항암제를 투여하는 화학요법(chemotherapy)이다.

항암 화학요법은 전신 치료로, 대부분 주사나 경구로 항암제를 투여하면 혈류를 따라 전신에 퍼진다. 그러므로 국소적인 효과보다는 전신에 퍼져있는 미세전이(micometastasis)에 작용하는 치료이다. 따라서 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선치료에 비해서 그 정도가 매우 심한 편이다. 정상세포와 암세포 간의 약물에 대한 감수성 차를 이용하여 항암제가 암세포에 대해 선택적으로 작용하도록 하는 것이 화학요법이나 대부분의 항암제가 정상세포와 암세포를 구별하지 못하여 용량 제한적 특성(dose-limiting toxicity)을 나타내는데 그 문제점이 있다.

대표적인 항암제인 cisplatin(cis-diammine-dichloroplatinum [Ⅱ], 시스플라틴)은 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다(Rosenberg B., Cancer, 55: pp2303-2315, 1985). 시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA의 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

그러나 치료과정 중 약물의 제한된 함량 이상에서는 청각의 상실, 신경 독성, 신장 독성과 같은 부작용이 나타나며(Mollman et al., 1998; Screnci and McKeage, 1999), 고농도의 시스플라틴의 투여 시에는 간 독성 또한 빈번하게 관찰되는 것으로 알려져 있다(Cerosimo R. J., Ann. Pharm., 27: pp438-441, 1993; Cavalli F. et al., Cancer Treat. Rep., 62: pp2125-2126, 1978; Pollera C. F. et al., J. Clin. Oncol., 5: pp318-319, 1987). 시스플라틴에 의한 이러한 부작용은 시스플라틴에 의해 생성된 활성산소종으로 인한 지질 과산화의 증가 (Matsushima H. et al., J. Lab. Clin. Med., 131: pp518-526, 1998; Koc A. et al., Mol. Cell Biochem., 278(1-2): pp79-84, 2005), 조직에 존재하는 항산화 효소 활성의 억제(Sadzuka Y. et al., Biochem. Pharmacol., 43: pp1873-1875, 1992), 글루타시온(glutathione)의 고갈(Zhang J. G. and Lindup W. E., Biochem. Pharmcol., 45: pp2215-2222, 1993) 및 세포내 칼슘 항상성의 붕괴(Zhang J.G. and Lindup W.E., Toxicology in Vitro, 10: pp205209, 1996)와 밀접한 관련이 있다.

최근 시스플라틴과 글루타시온 에스테르(glutathione ester)를 같이 투여하였을 때 시스플라틴으로 인한 신장독성이 효과적으로 억제된다는 것을 관찰하였으며(Babu E. et al., Mol. Cell Biochem., 144: pp7-11, 1995), 식이를 통해 항산화 물질을 섭취함으로써 시스플라틴으로 인한 독성을 억제하는데 많은 관심이 집중되고 있다(Appenroth D. et al., Arch. Toxicol., 71: pp677-683, 1997; Bogin E. et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 32: pp843-851, 1994; Rao M. et al., J. Biochem., 125: pp383-390, 1999).

이에 본 발명자들은 시스플라틴과 같은 항염제로 인한 신장 독성을 억제할 수 있는 새로운 물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 풍도대극으로부터 분리된 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(γ-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside)이 기존 항암제인 시스플라틴의 투여시 시스플라틴의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 시스플라틴에 의한 신장 세포의 사멸을 억제함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환을 예방할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항암제의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 항암제에 의한 신장 독성을 억제할 수 있는 신규한 물질을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 항암제로 인한 신장 독성에 관한 억제 활성을 갖는 항암보조제를 제공하는 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(γ-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside)를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서는 상기 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드가 풍도대극(Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus.)으로부터 분리된 것임을 특징으로 한다.

바람직하게, 본 발명에서는 상기 항암제가 시스플라틴인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 시스플라틴에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.

본 발명의 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 풍도대극(Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus.)로부터 추출한 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하여 기존 항암제인 시스플라틴에 의한 세포고사를 방지하여 신장 독성의 부작용을 감소시킬 수 있다.

상기 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드는 풍도대극 뿌리를 C₁ 내지 C₄의 저급알코올, 바람직하게는 메탄올에 담가 2 내지 4 시간 동안 추출하고 용출된 추출물은 감압농축하고 이들을 통상의 분획 공정을 수행하여 얻을 수 있다.

구체적으로, 풍도대극 뿌리를 메탄올에 담가 2 내지 4 시간 동안 추출하고 용출된 추출물은 감압농축하여 추출 용매를 제거한 후 건조엑기스를 조제하였으며, 건조엑기스를 H₂O에 현탁시킨 후 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올로 차례로 분획하고 각 분획을 감압 농축하여 Hx층, MC층, EA층, BuOH층, H₂O층을 수득할 수 있다. 이를 유리 칼럼 크로마토그래피를 수행하고, LC-MS 및 TLC를 이용해 스크리닝하여 수득한 소분획물을 여과 및 정제하여 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 분리할 수 있다.

상기 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드는 하기 화학식 1을 가지는 화합물이다.

상기 화학식 1의 화합물은 황색 무정형 분말로서, ¹H-NMR spectrum에서 γ-pyrone에 해당하는 3개의 ABX system proton [δ_H8.17 (1H, d, J = 0.5 Hz, H-2), 8.00 (1H, dd, J = 5.5, 0.5 Hz, H-6), 6.48 (1H, d. J = 5.5 Hz, H-5))과 galloyl 기에 1',3',4',5'-치환된 proton δ_H7.07 (2H, s, H-2'', 6'')이 관찰되었다. 추가적으로 glucose의 anomeric proton δ_H 4.81 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-1')이 확인되었으며, anomeric proton의 J 값이 8.5 Hz에 해당하여 β-결합인 것을 확인하였다. ¹³C-NMR spectrum에서 총 16개의 peak를 관찰하였고, γ-pyrone ring carbon δ_C174.6 (C-4), 156.6 (C-2), 146.4 (C-3), 145.1 (C-6), 115.6 (C-5)과 galloyl기 carbon δ_C166.7 (C-7''), 145.2 (C-3'', 5''), 138.5 (C-4''), 119.8 (C-1''), 108.7 (C-2'', 6'')과 glucose carbon δ_C101.7 (C-1'), 75.7(C-3'), 74.5 (C-5'), 73.3 (C-2'), 70.1 (C-4'), 63.1 (C-6')이 확인되었다. 위에 사항을 근거로 기존 문헌과 비교, 확인하여 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드로 구조 동정하였다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 본 발명에서는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 상기 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드는 신장 근위세뇨관 세포주인 HK-2에서 기존 항암제인 시스플라틴(시스플라틴)의 사용에 의한 세포고사를 방지함을 확인함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

상기 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드는 본 발명의 신장 독성 예방 및 치료용 약학적 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 98 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 함량이 범위내일 경우에는 기존 항암제인 시스플라틴에 의한 세포고사를 효율적으로 방지할 수 있어 신장독성의 예방과 치료효과가 우수하다.

본 발명의 약학적 조성물은 항암제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 억제 활성을 갖는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.

또한 상기 약학적 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 복숭아 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 본 발명에서는 시스플라틴에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.

상기 항암보조제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 독소루비신, 탁솔, 탐옥시펜, 캄토벨, 아드루실, 글리벡, 에토포사이드, 조메타, 온코빈 등의 기존 항암제와 병용 투여하여 항암 효능을 증진시킬 수 있으며, 동시에 항암제로 인한 신장 독성질환을 예방할 수 있다.

본 발명의 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 포함하는 약학적 조성물은 기존 항암제인 시스플라틴의 투여시 시스플라틴의 항암 효능을 증진시키면서 동시에 시스플라틴에 의한 신장 세포의 사멸을 억제함으로써 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 ¹H NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 ¹³C NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드에 의한 HK-2 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 4는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 의한 카스파아제-3 단백질 활성화를 나타낸 것이다.
도 5는 Tunel 염색을 통한 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 세포사멸(apoptosis) 저해효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI) 염색을 통한 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 세포사멸(apoptosis) 저해효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드 투여 후 H&E 염색을 통해 신장 내에 존재하는 세포와 조직의 형태를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 풍도대극으로부터 분리된 γ-피론-3- O -β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 추출 및 분리

풍도대극(Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus.) 뿌리 1.7 kg을 환류냉각장치가 설치된 추출기를 이용하여 1 kg 씩 MeOH 20 L에 담가 3시간, 총 3회 온침 추출을 진행하였다. 용출된 추출물은 다시 40℃ 이하에서 감압농축하여 추출 용매를 제거한 후 건조엑기스를 조제(수득량 240 g)하였으며, 건조엑기스를 H₂O에 현탁시킨 후 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올로 극성의 차이를 이용해 차례로 분획하고 각 분획을 감압 농축하여 Hx층 69 g, MC층 14 g, EA층 5 g, BuOH층 17 g, H₂O층 112 g을 얻었다.

유리 칼럼(Glass column, 16 cm X 60 cm)에 ODS gel(20 μm, 0.4 kg, YMC, Japan)을 충진하여 MC 분획물의 open C.C를 진행하였고, 용출용매로 H₂O-ACN의 혼합용매(7:3, 5:5, 3:7, 1:9, 0:10)를 사용하여 1 L 삼각플라스크로 20개를 받았으며, 이를 다시 LC-MS 및 TLC를 이용해 스크리닝하여 9개의 소분획물을 얻었다(PDMC 1~9). PDMC 5(270 mg)의 일부를 MeOH 5 mL에 녹여 0.45 μm 실린지 필터를 이용하여 필터링한 후, ODS 칼럼(30 mm X 250 mm, 5 μm, phenomenex, USA)가 장착된 예비 LC(Agilent, infinity 1260, USA)를 사용하여 20 μL 주입하여 35분간 8-82% ACN, 20 mL/min의 조건으로 250 nm에서 분리한 다음, LC-MS를 이용하여 그 순도를 확인하였다. 이후 분리조건을 확정하여 500 μL씩 반복 주입하여 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(TKM2098-C-1, 70 mg)을 순수 분리하였다.

γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 ¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

γ-피론-3- O -β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드
Position	δ_H	δ_C
2	8.17 (d, 0.5)	156.6
3	-	146.4
4	-	174.6
5	6.48 (d. 5.5)	115.6
6	8.00 (dd, 5.5, 0.5)	145.1
1'	4.81 (d, 8.5)	101.7
2'	3.73 (m, overlapped)	73.3
3'	3.73 (m, overlapped)	75.7
4'	3.53 (m)	70.1
5'	3.73 (m, overlapped)	74.5
6'a	4.60 (dd, 14.5, 2.5)	63.1
6'b	6.44 (dd, 11.5, 6.5)
1''	-	119.8
2'', 6''	7.07 (s)	108.7
4''	-	138.5
3'', 5''	-	145.2
7''	-	166.7

도 1은 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 ¹H NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 ¹³C NMR 분석결과를 나타낸 그래프이다.

<시험예 1> γ-피론-3-O-β- D - ( 6-갈로일)-글루코피라노사이드의 세포독성 보호효과

(1) 세포배양

실험에 사용된 HK-2 세포 (Human kidney proximal tubule cell)는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. PRMI 1640 배지 (Thermo, Waltham, MA, USA)에 10% FBS (Fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고. 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(2) MTS 분석

HK-2 세포에 대한 천연분리물질의 자체적인 세포독성과 시스플라틴에 대한 세포보호효과를 확인하기 위해 MTS 분석을 진행하였다.

세포생존율은 CellTiter 96ㄾ aqueous one solution Cell proliferation assay kit (Promega, Fitchburg, WI, USA)를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라서 측정하였다. HK-2 세포를 96 well plate에 1 X 10⁵ cells/㎖ 농도가 되도록 분주한 뒤 37℃, 5% 배양기에서 24시간 배양한 후 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 각각 10, 20, 40 그리고 80 μM 농도로 24시간 동안 처리하여 천연분리물질에 대한 자체 독성을 조사하였고 이와 같은 농도로 1시간 동안 전 처리한 뒤 20 μM 시스플라틴을 처리하고 24시간동안 배양하였다. 24시간 뒤 MTS 시약 20 ㎕를 넣고 2시간 동안 배양한 후 마이크로플레이트 리더 인피니트(microplate reader infinite)^™ 200 PRO (TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율은 정상대조군에 대한 생존율로 표시하였다.

도 3은 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드에 의한 HK-2 세포의 생존율을 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 농도별로 처리하고 20 μM 시스플라틴을 함께 처리하였을 때, 시스플라틴 단독처리군은 비처리군에 비해 세포생존율이 75.8 ± 2.0%로 감소하였으며 80 μM 처리군은 비처리군에 가깝게 회복되는 결과 (97.8 ± 1.0%)를 나타냈다. 이러한 결과는 시스플라틴 처리에 의한 세포독성도 80 μM 농도에서 차단되었다.

(3) Caspase-3 활성 분석

Caspase-3 colorimetric detection kit (Enzo, Farmingdale, NY, USA)를 이용해 실험을 진행하였다. 웨스턴 블럿 분석 방법에서 사용된 동일한 방법으로 세포를 용해하였고 총 20 ㎍의 단백질 샘플을 사용하여 제조사가 제시한 protocol에 따라 수행하였다.

카스파아제는 세포사멸(apoptosis)과 염증반응에 중요한 시토카인(IL-1β또는 IGIF: IFN-γ-inducing factor)의 후처리(processing) 및 세포증식, 이동, 분화 등 많은 생리현상에 관여하는 일군의 시스테인 단백질가수분해효소이다.

도 4는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 의한 카스파아제-3 단백질 활성화를 나타낸 것이다. 세포사멸단백질인 caspase-3 단백질 활성화를 측정해본 결과 MTS assay와 마찬가지로 80 μM 처리군 (106 ± 1.0%)은 시스플라틴 처리군 (139 ± 2.9%)에 비해 caspase-3 단백질 활성도가 감소하였다.

이러한 결과로부터 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드은 시스플라틴으로 유도된 신장독성으로부터 농도 의존적으로 세포생존율을 회복시켜 신장독성 보호 효과가 있음을 확인하였다.

< 시험예 2> γ-피론-3-O-β- D - ( 6- 갈로일 )- 글루코피라노사이드의 세포사멸(apoptosis) 저해효과

γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드가 시스플라틴에 의해 유도된 세포사 중 세포사멸(apoptosis)과 세포괴사(necrosis) 둘 중 어느 기전을 억제하는지 알아보기 위해 몇 가지 실험을 진행하였다. Tunel 염색은 DNA 단편화 (DNA fragmentation)를 형광 표지를 통해 시각화하는 방법으로 염증성 세포자멸사 (pyroptosis), 세포사멸 (apoptosis) 및 세포괴사 (necrosis)를 측정하는데 많이 이용된다.

Tunel 염색은 DeadEnd^™ fluorometric TUNEL system (Promega, Fitchburg, WI, USA)을 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라서 수행하였다. HK-2 세포를 12 well plate에서 cover slip 위에 2 X 10⁵cells/㎖ 농도가 되도록 분주한 뒤, 37℃, 5% 배양기에서 24시간 배양했다. 배양된 세포는 80 ㎕ dopaol β-D-glucoside를 1시간 동안 전 처리 한 뒤 20 μM 시스플라틴을 처리하고 24시간동안 배양하였다. 그 후 10% neutralized buffered formalin (NBF)로 4℃에서 20분 동안 고정하였고, phosphate buffered saline (PBS)로 2번 씻어주었다. 다음 0.2% triton X-100 in PBS 용액으로 5분간 투과화한 뒤 PBS로 2번 씻어주었다. 남은 액체가 없도록 모두 제거하고 equilibration buffer를 5분간 처리하였으며 100 ㎕ rTdT incubation buffer를 처리하고 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 그 후 2XSSC buffer를 처리하고, PBS로 2번 씻은 뒤 Prolong^™ gold antifade mountant with DAPI (Thermo, Waltham, MA, USA)로 마운트하여 Epi-fluorescence microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)하에 관찰하였다.

도 5는 Tunel 염색을 통한 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 세포사멸(apoptosis) 저해효과를 나타낸 결과이다. 여기에서 보듯이, 시스플라틴를 HK-2 세포에 20 μM 농도로 24시간 동안 처리하였을 때 증가하는 tunel signal이 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드을 80 μM 농도로 함께 처리하였을 때 대부분 감소되는 결과가 나타났다.

다음으로 세포사멸 및 세포괴사의 비율을 측정하기 위해 annexinV-PI 염색을 통해 flow cytometry에서 측정하였다.

구체적으로, Annxon V-FITC apoptosis detection kit (Enzo, Farmingdale, NY, USA)을 사용하였다. HK-2 세포에 약물 처리 후 유도되는 apoptosis의 비율을 구분하기 위해 제조사의 protocol에 따라 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI) 형광염료로 염색시켰으며, 각각 형광염료로 염색된 세포는 CytoFLEX (Beckman coulter, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 분석하였다.

도 6은 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI) 염색을 통한 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 세포사멸(apoptosis) 저해효과를 나타낸 결과이다. 여기에서 보듯이, HK-2 세포에 20 μM 시스플라틴을 24시간 동안 처리했을 때 세포사멸의 비율이 23.43%까지 증가하였고 80 μM γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 함께 전 처리했을 때 15.79%까지 감소되는 결과가 나타났다.

결과를 종합하였을 때 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드의 처리는 시스플라틴에 의해 유도된 HK-2 세포의 세포사멸을 억제하는 것으로 나타났다.

이는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드가 세포괴사가 아닌 세포사멸 기전을 억제하는 것으로 사료되며, 미토콘드리아 활성을 회복시키는 것으로 보아 아마도 세포사멸 초기단계부터 관여한다고 생각된다.

<시험예 3> γ-피론-3-O-β- D - ( 6-갈로일)-글루코피라노사이드이 신장독성 동물 모델에 미치는 영향

실험동물은 BALB/C mice 6주령 수컷을 샘타코 (Samtako, Osan, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 온도 20 ± 2℃, 습도 55 ± 5%, 12시간 명암조건에서 사육하였다. 실험동물은 구입 후 1주일 동안 순화한 다음, 각 군당 7 마리씩을 배치하여 실험군을 분류하였다. 정상대조군, 시스플라틴 단독 투여군, 시스플라틴 + γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드 투여군으로 군을 분리하였다. 정상대조군을 제외한 모든 군에 20 ㎎/㎏ 용량의 시스플라틴 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 3일 동안 24시간 주기로 복강투여하여 신장독성을 유발하였고, γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드 투여군에는 시스플라틴 복강투여 30분 후에 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 10 ㎎/㎏ 용량으로 복강투여하였다.

도 7은 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드 투여 후 H&E 염색을 통해 신장 내에 존재하는 세포와 조직의 형태를 확인한 결과이다. 여기에서 보듯이, 시스플라틴 단독 투여군 (CIS)은 정상대조군 (NOR)과 비교하여 세뇨관 세포의 솔가장자리 (brush border) 부분의 소실과 세뇨관손상 (tubular damege)이 관찰되었으며 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드 처리군에서 정상에 가까운 형태로 회복되었다.

Claims

γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드(γ-Pyrone-3-O-β-D-(6-galloyl)-glucopyranoside)를 유효성분으로 포함하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드가 풍도대극(Euphorbia ebracteolata var. coreana Hurus.)으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 항암제가 시스플라틴인 것을 특징으로 하는 항암제에 의해 유발되는 신장 독성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
시스플라틴에 의해 유발되는 신장 독성에 대한 억제 활성을 갖는 γ-피론-3-O-β-D-(6-갈로일)-글루코피라노사이드를 유효성분으로 포함하는 항암보조제.