KR20200034452A - Compositions for preventing or treating oral disease or bone disease comprising extracts of Asplenium incisum - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition, a food composition, a quasi-drug composition, and a dental composition for preventing or treating oral diseases or bone diseases, which contain an Asplenium incisum extract as an active component. Specifically, the Asplenium incisum extract of the present invention is derived from a natural product to have low toxicity, significantly inhibits the activity of Porphyromonas gingivalis, an oral disease-causing bacterium, and significantly inhibits the formation or differentiation of osteoclasts, thereby being able to be usefully used for preventing or treating oral diseases or bone diseases.

Description

꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating oral disease or bone disease comprising extracts of Asplenium incisum}Composition for preventing or treating oral disease or bone disease comprising extracts of tail fern extract as active ingredient}

본 발명은 꼬리고사리 추출물을 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 치과용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for the prevention or treatment of oral disease or bone disease, including tail fern extract, specifically, a pharmaceutical composition for preventing or treating oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient, food It relates to a composition, quasi-drug composition and dental composition.

파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor ĸB(RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-ĸB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MARK, 또는 NF-ĸB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(LEE ZH, KIM HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 파골세포의 분화와 관련된 질병의 치료에 있어서 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.In osteoclasts, RAW264.7 monocytes of mice are differentiated into multinucleated osteoclasts by a receptor activator of nuclear factor ĸB (RANK) ligand (RANKL). This differentiation process promotes the activity of mitogen-activated protein kinase (MAPK) by binding RANKL from the outside of the cell to RANK, which is a TRAP associated with osteoclast differentiation due to the transcription factor NF-ĸB entering the nucleus. It is possible by increasing the expression of (tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9 (matrix metalloproteinase-9), c-Src tyrosine kinase, etc. The multinuclear osteoclasts formed by this process are able to replace mineralized bone. It serves to absorb. In addition, when RANKL binds to RANK, it promotes the activity of TRAF6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6), thereby promoting the activity of transcription factors such as MARK, or NF-ĸB, AP-1, NFATc1 (LEE ZH, KIM) HH.Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts.Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). Therefore, blocking the signaling pathway activated by RANKL is recognized as one of the therapeutic approaches in the treatment of diseases associated with osteoclast differentiation.

파골세포는 골 내에서 조골세포와의 불균형으로 인하여 비정상적인 골조직의 파괴 및 흡수를 유발하고 이로 인하여, 뼈의 질량 및 골밀도가 감소하는 골다공증(osteoporosis), 뼈에서 석회가 탈실되는 골연화증(osteomalacia), 정상적인 골조직이 섬유성 결합조직과 미성숙한 골소주로 대체되는 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 치조골이 소실되는 치주질환(periodontal disease), 관절의 파괴 및 변형을 초래하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 이와 같이, 파골세포의 분화와 치주질환 및 골질환은 밀접한 관련성이 존재한다.Osteoblasts cause abnormal destruction and absorption of bone tissue due to imbalance with osteoblasts in the bone, and thereby, osteoporosis, which decreases bone mass and bone density, osteomalacia, where lime is lost from bone, normal Fibrous dysplasia where bone tissue is replaced by fibrous connective tissue and immature bone soju, periodontal disease in which alveolar bone is lost, and rheumatoid arthritis that causes joint destruction and deformation. It is known. As such, there is a close relationship between osteoclast differentiation and periodontal disease and bone disease.

포르피로모나스 진지발리스의 경우 리포다당류(lipopolysaccharide; LPS)나 섬모를 매개로 하여 숙주매개 염증반응에 의해 조골세포의 분화를 억제하여 골생성을 감소시키는 것으로 알려져 있으며(Wilson, 1998; Kadono 등, 1999), 상기 LPS는 세균외막에 존재하는 병원성 성분으로 염증성 사이토카인이나 에이코사노이드 합성의 잘 알려진 자극인자로서, 조골세포를 자극하여 골용해성 인자, 즉 IL-1, IL-6, PGE2, 산화질소를 분비하여 치주조직을 파괴하는 주요 구조물로 알려져 있다. 또한, LPS 자체에 의해 직접적으로 파골세포의 분화가 촉진되고 활성화되어 이는 궁극적으로 골 소실을 유도할 수 있다 (Koide 등, 2000; Taubman 등, 2005; Islam 등, 2007; Hou 등, 2013; Teramachi 등 2017). 이와 같이 치주질환 유발 균주의 조골세포 또는 파골세포의 분화에 대한 영향력을 연구한 자료가 다수 존재하며, 또한 골관절염과 치주질환을 함께 치료할 수 있는 치료제가 존재하는 등 치주질환과 골질환 사이에는 밀접한 연관성이 존재한다.Porphyromonas gingivalis is known to inhibit osteoblast differentiation by host-mediated inflammatory reactions through lipopolysaccharide (LPS) or ciliary mediation (Wilson, 1998; Kadono et al.) 1999), the LPS is a well-known stimulator of the synthesis of inflammatory cytokines or eicosanoids as a pathogenic component present in the outer membrane of the bacterium. It stimulates osteoblasts to osteolytic factors, namely IL-1, IL-6, PGE2, oxidation It is known as a major structure that destroys periodontal tissue by secreting nitrogen. In addition, the differentiation of osteoclasts is directly promoted and activated by the LPS itself, which can ultimately lead to bone loss (Koide et al., 2000; Taubman et al., 2005; Islam et al., 2007; Hou et al., 2013; Teramachi, etc.) 2017). As such, there are a number of data on the effects of periodontal disease-causing strains on the differentiation of osteoblasts or osteoclasts, and there are also therapeutic agents to treat osteoarthritis and periodontal disease. This exists.

현재 치주질환을 포함하는 구강질환을 치료하기 위해 항생제 및 생구이나린(Sangquinarine), 리스테린(Listerine), 피록사이드(Peroxide), 클로르헥시딘(Chlorhexidine) 등과 같은 항균제제가 치료제로 널리 이용되고 있다. 그러나 항생제는 우리 몸에 대한 전신적인 부작용과 함께 구강내 내성균의 출현 및 균교대증(superinfection)을 유발할 수 있기 때문에 장기적인 사용이 곤란하여 단지 치료제로만 이용될 수 있는 단점이 있다. 또한 생구이나린은 구강 내에서 세균에 대한 효과가 불분명하고 치주질환에 대한 치료 효과가 더욱 불분명할 뿐만 아니라 가격도 비싼 단점이 있고, 리스테린은 알코올이 주성분으로 약간의 정균 작용이 있으나 실제 구강 내에서는 일시적인 효과를 나타낼 뿐, 장기간 사용 시 조직에 대해 위해 작용도 나타날 수 있는 단점이 있다. 아울러, 최근 미백 효과를 위해 첨가되고 있는 피록사이드는 세균에 대한 독성이 있으나 동시에 인체 조직에도 독성을 나타내어 안전성에 문제가 있을 뿐 아니라 간혹 세균에서 피록사이드에 대한 내성균이 출현하기도 한다. 또한 클로르헥시딘은 치태 형성 억제와 더불어 치주질환 예방 및 치료제로써 현재까지 알려진 제제 중에서 가장 우수한 것으로 알려져 있으나, 조직에 대한 자극, 조직의 착색 및 변성을 유발하고, 특히 자극적인 맛이 강하고 냄새가 심한 부작용을 나타내는 문제점이 있을 뿐 아니라, 균교대증이 유발될 수 있고, 발암성이 있어 임신부의 경우 사용이 제한되는 등 치료나 특히 예방의 목적으로 장기간 사용할 수 없는 단점이 있다. 따라서 상기와 같은 부작용에 대한 우려가 없으면서 구강질환을 야기하는 균주의 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 의약품 개발이 요구되고 있는 실정이다.Currently, antibiotics and antibacterial agents such as Sangquinarine, Listerine, Peroxide, and Chlorhexidine are widely used as therapeutic agents to treat oral diseases including periodontal disease. However, since antibiotics can induce the appearance of resistant bacteria in the oral cavity and superinfection along with systemic side effects on our body, there is a drawback that long-term use is difficult and can only be used as a therapeutic agent. In addition, raw guinarine has an unclear effect on bacteria in the oral cavity and a more unclear treatment effect on periodontal disease, and also has a disadvantage in that it is expensive. It has a short-term effect, but also has the disadvantage that it may have a harmful effect on tissues when used for a long time. In addition, the recently added pyroxide for the whitening effect is toxic to bacteria, but at the same time it is toxic to human tissues, which is not only a problem in safety, but also sometimes occurs in bacteria resistant to pyroxide. In addition, chlorhexidine is known to be the best among the formulations known to date as a preventive and therapeutic agent for periodontal disease along with inhibition of plaque formation, but it causes irritation to tissues, coloring and degeneration of tissues, and has a particularly strong, irritating and odorous side effect. In addition, there is a problem that cannot be used for a long period of time for the purpose of treatment or prevention, for example, because it can cause myceliacosis and has limited carcinogenicity. Therefore, there is a need to develop a medicine capable of effectively suppressing the growth of strains causing oral diseases without concern for the side effects as described above.

현재 골다공증과 같은 파골세포에 의한 골 손상을 치료하기 위해 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 널리 이용되고 있다. 그러나 최근 비스포스포네이트 계열의 약제들을 복용하는 환자들에게서 턱뼈 괴사(osteonecrosis), 중증 심방 세동, 뼈 또는 관절의 무력화, 근골격의 통증 등 다양한 부작용이 발생하는 사례가 해마다 증가하고 있다(Br J Cancer 98:1736-1740(2008)). 따라서, 기존의 비스포스포네이트 계열의 약제들의 단점을 보완하고, 독성이 적으며 파골세포의 형성 및 분화를 효과적으로 억제할 수 있는 의약품 개발이 요구되고 있는 실정이다.Currently, bisphosphonate-based treatments are widely used to treat bone damage caused by osteoclasts such as osteoporosis. However, in recent years, patients taking bisphosphonate-based drugs have been increasing year by year with various side effects such as osteonecrosis, severe atrial fibrillation, disabling bone or joint, and musculoskeletal pain (Br J Cancer 98: 1736). -1740 (2008)). Therefore, there is a need to develop pharmaceuticals that compensate for the disadvantages of the existing bisphosphonate-based drugs, have low toxicity, and can effectively suppress osteoclast formation and differentiation.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 천연물로부터 유래하여 독성이 적으며, 구강질환 유발 균의 활성을 억제하고 파골세포의 형성 또는 분화를 억제할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력연구한 결과, 꼬리고사리 추출물이 구강질환 유발 균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 활성을 현저하게 억제하고 파골세포의 형성 또는 분화를 현저하게 억제함으로써 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.Under these backgrounds, the present inventors have found that compounds derived from natural products are less toxic, and can be used to find compounds that can inhibit the activity of oral disease-causing bacteria and inhibit osteoclast formation or differentiation. By significantly inhibiting the activity of the disease-causing bacterium Porphyromonas gingivalis and significantly inhibiting the formation or differentiation of osteoclasts, it can be used to prevent or treat oral diseases or bone diseases, The present invention has been completed.

본 발명의 하나의 목적은 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of oral diseases or bone diseases, including tail fern extract as an active ingredient.

본 발명의 다른 하나의 목적은 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a quasi-drug composition for the prevention or improvement of oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환의 예방 또는 개선용 치과용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a dental composition for preventing or improving oral disease, including tail fern extract as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of oral diseases or bone diseases, including tail fern extract as an active ingredient.

구체적으로, 본 발명의 구강질환 또는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.Specifically, the pharmaceutical composition for preventing or treating oral disease or bone disease of the present invention may include a tail fern extract or a fraction thereof.

본 발명의 용어, "꼬리고사리(Asplenium incisum)"는 꼬리고사리과에 속하는 여러해살이 풀로 짧은 뿌리줄기가 있는 소형 양치식물이다. 전초가 해독 등과 같은 다양한 효능을 갖고 있어 생즙을 약용으로 사용한다. 피부질환 원인균에 대한 항균 활성, 기관지 확장 활성 등이 보고되었다.The term "tail fern ( Asplenium incisum )" is a small fern plant with short rhizomes. Since the outpost has various effects such as detoxification, it uses raw juice for medicinal purposes. Antibacterial activity and bronchodilatory activity against skin disease causative bacteria have been reported.

꼬리고사리는 간염, 이명, 만성망간중독 치료 효과 등의 다양한 약리학적 특성을 가지고 있다고 알려져 있으나, 이의 구강질환 또는 골질환의 예방, 치료 또는 개선 효과는 아직 알려진 바 없다.The tail fern is known to have various pharmacological properties such as hepatitis, tinnitus, and chronic manganese poisoning treatment effects, but the effect of preventing, treating or improving its oral disease or bone disease is not yet known.

본 발명자들은 천연에 존재하는 천연자원들로부터 우수한 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타나는 물질에 대한 다양한 연구 수행 결과, 꼬리고사리 추출물이 구강질환 유발 균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 활성을 억제하고 파골세포의 형성 또는 분화를 억제함으로써 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 이를 통해 꼬리고사리 추출물이 구강질환 또는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 상기 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 꼬리고사리 추출물을 포함하는 조성물은 지금까지 알려진 바 없으며, 본 발명자에 의해 최초로 개발되었다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.The present inventors have conducted various studies on substances that show excellent prevention or treatment effects of oral diseases or bone diseases from natural resources existing in nature, and Porphyromonas gingivalis , a tail fern extract is an oral disease-causing bacterium. By inhibiting the activity of and inhibiting the formation or differentiation of osteoclasts, it was confirmed that it can be useful for the prevention or treatment of oral diseases or bone diseases. Through this, it was found that the tail fern extract can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating oral disease or bone disease. The composition containing the tail fern extract having the effect of preventing or treating the oral disease or bone disease has not been known so far, and can be said to be very significant in that it was first developed by the present inventor.

본 발명의 목적상 꼬리고사리는 그 종류에 제한되지 않으며, 재배한 것을 사용하거나 시중에서 구입한 것을 사용하거나 그 출처에 제한 없이 사용할 수 있다.For the purposes of the present invention, the tail fern is not limited to the type, and cultivated ones, commercially available ones, or any other source can be used.

본 발명에서 용어, "추출물"은 상기 꼬리고사리를 추출 처리한 것을 의미하는 것이고, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함할 수 있다. 또한 상기 꼬리고사리의 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관, 예를 들어 뿌리, 근경, 지상부, 줄기, 잎, 열매 등으로부터 추출될 수 있다.In the present invention, the term, "extract" means that the tail fern is extracted, but is not limited thereto, an extract obtained by an extraction process, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, adjustment thereof It may include extracts of all formulations that can be formed using the extracts themselves and the extracts, such as offerings, tablets, or mixtures thereof. In addition, the tail fern can be extracted from various organs of natural, hybrid, and varietal plants, such as roots, root roots, ground parts, stems, leaves, and fruits.

본 발명의 꼬리고사리 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 침지추출, 열수추출, 냉침추출, 환류냉각추출 또는 초음파추출 등의 방법을 이용할 수 있다.The tail fern extract of the present invention can be prepared using general extraction methods, separation and purification methods known in the art. The extraction method is not limited thereto, but a method such as immersion extraction, hot water extraction, cold immersion extraction, reflux cooling extraction or ultrasonic extraction may be used.

상기 꼬리고사리 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 추출하는 유기용매에 따라 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이가 날 수 있으므로, 적절한 유기용매를 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출할 수 있다. 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The tail fern extract may be extracted with water, an alcohol having 1 to 1 carbon atoms (C 1 ) to 4 carbon atoms (C 4 ), or a mixed solvent thereof, but is not limited thereto, and the degree of extraction of the active ingredient according to the extracted organic solvent and Since the degree of loss may vary, an appropriate organic solvent can be selected and used. Specifically, it can be extracted using water, an organic solvent, or a mixed solvent thereof. More specifically, ethanol may be used, but is not limited thereto.

또한, 상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 예로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the solvent extract may further include filtering the extract to remove floating solid particles. As an example, the particles may be filtered using cotton, nylon, or the like, an ultrafiltration method, a freezing filtration method, or a centrifugation method may be used, but is not limited thereto.

추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다.For concentration of the extract, a method such as concentrated under reduced pressure or concentrated by reverse osmosis may be used.

농축 후 건조단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조 또는 적외선건조 등이 방법을 사용할 수 있다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.After the concentration and drying step, freeze drying, vacuum drying, hot air drying, spray drying, vacuum drying, foam drying, high frequency drying, or infrared drying may be used. Optionally, a process of grinding the final dried extract may be further included.

본 발명에서 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다. The term "fraction" in the present invention means a result obtained by performing a fraction to separate a specific component or a specific component group from a mixture containing various various components.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다.The fractionation method for obtaining the fraction in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit the prevention or treatment effect of oral diseases or bone diseases, but may be performed according to methods commonly used in the art. For example, a solvent fractionation method performed by treating various solvents, an ultrafiltration fractionation method performed by passing through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, and various chromatography (separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity) Chromatography), and combinations thereof.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 증류수, 알코올 등의 극성용매; 헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 바람직하게는 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 4(C4)의 알코올을 사용할 수 있다.In the present invention, the type of fractional solvent used to obtain the fraction is not particularly limited, and any solvent known in the art may be used. Non-limiting examples of the fractional solvent include polar solvents such as water, distilled water, and alcohol; And non-polar solvents such as hexane, ethyl acetate, chloroform and dichloromethane. These may be used alone or in combination of two or more. When using an alcohol in the fractional solvent, preferably, an alcohol having 1 to 2 carbon atoms (C 1 ) to 4 (C 4 ) carbon atoms can be used.

또한, 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the extract or fraction may be prepared and used in a dry powder form after extraction, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, “구강질환”이란 구강영역에서 발생하는 여러 가지 질환을 말하며, 상기 구강영역은 앞쪽 입술부터 뒤쪽 구협에서 인두와 연결되는 입 안의 공간을 의미한다. 본 발명에서 상기 구강질환은 구강에 발생하는 질환이라면 그 병증에 관계없이 모두 포함하는 개념이며, 상기 구강질환의 비제한적인 예로는 치아 우식증, 치주질환(치주염 또는 치은염), 치통, 시린이, 구취 등을 들 수 있다.In the present invention, "oral disease" refers to various diseases that occur in the oral area, and the oral area refers to a space in the mouth that connects with the pharynx from the anterior lip to the posterior canal. In the present invention, the oral disease is a concept that includes all irrespective of the pathology if the disease occurs in the oral cavity, and non-limiting examples of the oral disease include dental caries, periodontal disease (periodontitis or gingivitis), toothache, and bad breath. And the like.

본 발명의 용어, "치주질환"은 흔히 풍치라고도 하는데, 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉜다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 구강질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 치은(gingiva)과 치조골(alveolar bone) 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다.The term "periodontal disease" of the present invention is also commonly referred to as qichi, and is divided into gingivitis and periodontitis depending on the degree of disease. Gingivitis, a form limited to soft tissues, is a relatively light and fast-recovering oral disease called gingivitis, and periodontitis is the case when such inflammation has progressed to the gingiva and alveolar bones.

치은(잇몸)과 치아 사이에는 V자 모양의 틈이 있는데, 이 치은 열구(gingival sulcus)의 치은 아래 부분을 박테리아가 공격하여 치주인대와 인접조직을 손상시키는 것이 치주질환이다. 염증이 진행되어 더 많은 조직이 손상되면서 홈이 치주낭(periodontal pocket)으로 발전하게 되며, 치주염이 심할수록 치주낭의 깊이가 깊어지게 된다. 치주낭이 깊어지면서 치주인대에 염증이 생기게 되고, 포르피로모나스 진지발리스에 의해 분비되는 리포다당류(lipopolysaccharide; LPS)에 의해 파골세포 분화가 촉진되어 치조골 소실이 일어나게 되는 것이 치주질환이다.There is a V-shaped gap between the gingiva (gingival) and the teeth. It is a periodontal disease in which bacteria attack the lower gingival portion of the gingival sulcus and damage the periodontal ligament and adjacent tissue. As inflammation progresses and more tissue is damaged, the groove develops into a periodontal pocket, and the deeper the periodontitis, the deeper the depth of the periodontal pocket. The periodontal disease is caused by inflammation of the periodontal ligament as the periodontal pocket deepens, and osteoclast differentiation is promoted by lipopolysaccharide (LPS) secreted by Porphyromonas gingivalis.

본 발명에서 용어, “구취”는 구강 및 인접기관으로부터 유래되는 냄새로 구취의 85 ~ 90%가 구강에서 유래하며, 특히, 혀의 뒷쪽에서 유래하고 있다. 구취의 주요 성분은 휘발성 황화합물인데, 휘발성 황화합물의 전체량 중 90%가 시스테인으로부터 만들어지는 황화수소(hydrogen sulfide)와 메티오닌으로부터 만들어지는 메틸머캡탄(methyl mercaptan)및 디메틸설파이드(dimethyl sulfide)이다. 이러한 성분들은 주로 혐기성 세균이 분비하는 단백질 효소에 의해서 생성되며, 혀의 뒷쪽이 가장 중요한 서식지가 된다. 이 부위는 타액에 의해 세정작용이 잘 되지 않고, 많은 작은 함몰이 있어 세균이 지속적으로 살아가는 장소가 된다. 혐기성 세균에 의한 휘발성 황화합물 생성이 구취의 원인으로 가장 중요하지만, 그 외 치아 우식증, 치주염, 구강 건조증 등과 같은 구강질환에 의해서도 발생한다. 구취를 발생시키는데 많은 종류의 혐기성 세균이 관여하며, 구취 발생 원인균의 비제한적인 예로 많은 종류와 많은 양의 효소를 분비하는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 들 수 있다.In the present invention, the term “halt breath” is an odor originating from the oral cavity and adjacent organs, and 85 to 90% of the bad breath originates from the oral cavity, particularly from the back of the tongue. The main components of bad breath are volatile sulfur compounds, with 90% of the total amount of volatile sulfur compounds being hydrogen sulfide made from cysteine, methyl mercaptan made from methionine, and dimethyl sulfide. These components are produced primarily by protein enzymes released by anaerobic bacteria, and the back of the tongue is the most important habitat. This part does not clean well by saliva, and has many small depressions, making it a place where bacteria can continue to live. The production of volatile sulfur compounds by anaerobic bacteria is the most important cause of bad breath, but it is also caused by oral diseases such as dental caries, periodontitis, and dry mouth. Many types of anaerobic bacteria are involved in the development of bad breath, and non-limiting examples of bad breath-causing bacteria include Porphyromonas gingivalis , which secretes many types and large amounts of enzymes.

본 발명에서 용어, "포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis 또는 P. gingivalis)"는 구강질환을 일으키는 몇 가지 대표적인 원인균 중 하나이다. 상기 포르피로모나스 진지발리스는 박테로이드 유연균의 일종으로 그람 음성균이고, 혐기성균이다. 상기 포르피로모나스 진지발리스는 치주질환이 발생한 구강 내에서 발생되며, 그 외에도 위장관 상부, 호흡기 및 결장에서도 발견된다. 그에 따라, 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 활성을 통해 구강질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.In the present invention, the term, " Porphyromonas gingivalis ( Porphyromonas gingivalis or P. gingivalis )" is one of several representative causative bacteria causing oral disease. The Porphyromonas ginji ballis is a type of bacterioid related bacteria and is a gram-negative bacterium and an anaerobic bacterium. The porphyromonas gingivalis occurs in the oral cavity where periodontal disease occurs, and in addition, it is also found in the upper gastrointestinal tract, respiratory tract and colon. Accordingly, oral disease can be prevented, improved or treated through antibacterial activity against Porphyromonas gingivalis.

본 발명의 일 실시예에서는 포르피로모나스 진지발리스에 본 발명의 꼬리고사리 추출물을 투여한 결과, 농도 의존적으로 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 활성을 나타냄을 확인하였으며(도 4), 본 발명의 꼬리고사리 추출물이 항균 지속 효과도 나타냄을 확인하였다(도 5). 이를 통해, 꼬리고사리 추출물이 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 활성 및 항균 지속 활성을 통한 구강질환의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다.In an embodiment of the present invention, as a result of administering the tail fern extract of the present invention to Porphyromonas ginsivalis, it was confirmed that it exhibits antimicrobial activity against Porphyromonas ginsivalis in a concentration-dependent manner (FIG. 4). It was confirmed that the tail fern extract of also exhibited an antibacterial lasting effect (FIG. 5). Through this, it was confirmed that the tail fern extract was effective in preventing or treating oral diseases through antibacterial activity and antibacterial lasting activity against Porphyromonas gingivalis.

본 발명에서 용어, "골질환"은 조골세포와 파골세포의 생성과 분화 등의 균형이 상실되어 나타나는, 골손실 또는 골밀도 감소에 의해 유도되는 모든 질환을 포함하는 것을 의미한다. 구체적으로는 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 골용해(osteolysis), 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 파제트병(Paget's disease), 골형성부전증(osteogenesis imperfect), 고칼슘혈증(hypercalcemia) 등을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 파골세포의 분화에 의한 골다공증(osteoporosis)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term, "bone disease" means to include all diseases induced by a decrease in bone loss or bone density, the balance of osteoblast and osteoclast production and differentiation is lost. Specifically, osteoporosis, osteomalacia, osteoopenia, bone atrophy, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, periodontal disease, osteolysis, May include fibrous dysplasia, Paget's disease, osteogenesis imperfect, hypercalcemia, and more specifically osteoporosis due to osteoclast differentiation. However, it is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "파골세포(osteoclast)"는 대식 세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로서 파골세포 전구 세포들은 대식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골세포로 분화되며 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성하는 것을 의미한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apoptosis)를 일으킨다.In the present invention, the term "osteoclast (osteoclast)" is a cell derived from a macrophage precursor (macrophage precursor), osteoclast progenitor cells are macrophage colony stimulating factor (M-CSF), NF-κB It refers to differentiation into osteoclasts by a receptor activating factor ligand (RANKL) and the like, to form multinucleated osteoclasts through fusion. Osteoclast cells bind to the bone through αvβ3 integrin, etc., create an acidic environment, and secrete various collagenase and protease to cause bone resorption. Osteoclasts do not proliferate as fully differentiated cells and cause apoptosis when the life span of about 2 weeks is reached.

본 발명의 일 실시예에서는 파골세포로 분화한 마우스 단핵구 세포에 본 발명의 꼬리고사리 추출물 투여한 후, 파골세포 분화 표지 인자인 TRAP(tarrate-resistant acid phosphate) 염색을 실시한 결과, 농도 의존적으로 TRAP 활성을 현저하게 저해시킴으로써, 파골세포 형성을 억제함을 확인하였다(도 6). 이를 통해, 꼬리고사리 추출물이 파골세포 형성 억제 활성을 통한 골질환, 예컨대 골다공증 또는 구강질환의 예방 또는 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, after administration of the tail fern extract of the present invention to mouse monocyte cells differentiated into osteoclasts, a result of staining the osteoclast differentiation marker factor, tarp-resistant acid phosphate (TRAP), is TRAP activity dependent on concentration. By significantly inhibiting, it was confirmed that osteoclast formation was inhibited (FIG. 6). Through this, it was confirmed that the tail fern extract was effective in preventing or treating bone diseases such as osteoporosis or oral diseases through osteoclast formation inhibitory activity.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 골질환 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term, "prevention" refers to all actions to suppress or delay the development of bone disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, "treatment" suspects bone disease by administration of the pharmaceutical composition And all actions in which the symptoms of the affected individual are improved or beneficially changed.

본 발명의 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent, which carrier may include a non-naturally occurring carrier. Specifically, carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, polycaprolactone, polylactic acid (Poly Lactic Acid), poly-L-lactic acid, Mineral oil and the like.

상기 약학 조성물은 구강질환 또는 골질환을 예방하고 치료하기 위한 통상의 방법에 따라 환제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 특히 본 발명의 약학적 조성물이 구강질환 예방 또는 치료용일 경우, 구체적으로 구강용 스프레이, 구강용 연고제 또는 구강용 바니쉬의 제형을 가질 수 있다. 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버, 로진 등을 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition is an oral dosage form such as pills, powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injections according to conventional methods for preventing and treating oral diseases or bone diseases It can be used by formulating in the form of a solution, and in particular, when the pharmaceutical composition of the present invention is for the prevention or treatment of oral diseases, specifically, it may have a formulation of an oral spray, an oral ointment, or an oral varnish. The carrier may include various types of amorphous carriers, microspheres, nanofibers, and rosin.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. In the case of formulation, it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are usually used.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in the extract and its fractions, for example, starch, calcium carbonate, It can be prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to simple excipients.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당 되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. Liquid preparations for oral administration include suspensions, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used as diluents, various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, can be included. have.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.

본 발명의 약학적 조성물에 포함된 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 100 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.The content of the tail fern extract or its fraction contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is 0.01 to 100% by weight, 0.01 to 50% by weight, more specifically 0.01 to 20% by weight based on the total weight of the final composition %.

본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.The present invention provides a method for preventing or treating oral disease or bone disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.

본 발명의 약학적 조성물은 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 이를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.Since the pharmaceutical composition of the present invention exhibits the prevention or treatment effect of oral disease or bone disease, the method of the present invention comprising the step of administering it to an individual may be usefully used for the prevention or treatment of oral disease or bone disease. have.

본 발명에서 용어, "개체"는 구강질환 또는 골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물, 예를 들어, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소, 조류, 어류 등을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term "individual" refers to all animals including humans who may or may have oral disease or bone disease, for example, monkeys, dogs, cats, rabbits, mormots, rats, mice, cows, sheep, pigs , Goat, bird, fish, etc., and specific examples may include mammals including humans, but are not limited thereto.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥 내, 피하, 피 내, 비강 내, 복강 내, 근육 내, 경피 등으로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법 및 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term "administration" means to introduce the composition to the subject in any suitable way, the route of administration can be administered through a variety of routes as long as it can reach the target tissue. Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally, intravenously, subcutaneously, intradermally, intranasally, intraperitoneally, intramuscularly, transdermally, etc., and suitable for topical treatment, including intralesional administration, if necessary. It can be administered by methods and routes. For example, it may be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine epidural or cerebrovascular injection, but is not limited thereto.

본 발명의 치료방법으로 꼬리고사리 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. As a treatment method of the present invention, the pharmaceutical composition containing the tail fern extract may be administered in a pharmaceutically effective amount.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 익상편 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.In the present invention, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention, and the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug , The patient's age, weight, health, sex, patient's sensitivity to the drug, the time of administration of the composition of the present invention used, the route of administration and the rate of excretion, the duration of treatment, the drug used in combination or coincidental with the composition of the present invention used. Factors and other factors well known in the medical field can be determined. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with a known pterygium therapeutic agent. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects.

또한, 상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 1㎎/㎏ 내지 200㎎/㎏, 구체적으로 1㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏, 더욱 구체적으로 20 내지 40㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.In addition, the dosage of the pharmaceutical composition can be determined by a person skilled in the art in consideration of the purpose of use, the degree of poisoning of the disease, the age, weight, sex, history of the patient, or the type of substance used as an active ingredient. For example, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at 1 mg / kg to 200 mg / kg per adult, specifically 1 mg / kg to 100 mg / kg, more specifically 20 to 40 mg / kg, , The frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered once a day or divided into doses several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.

또 다른 하나의 양태로서, 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.As another aspect, it provides a food composition for preventing or improving oral disease or bone disease comprising the tail fern extract as an active ingredient.

구체적으로, 본 발명의 구강질환 또는 골질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.Specifically, the food composition for preventing or improving oral disease or bone disease of the present invention may include a tail fern extract or a fraction thereof.

이때, 상기 "꼬리고사리", "추출물", "분획물", "구강질환", "골질환", 및 "예방"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "tail fern", "extract", "fraction", "oral disease", "bone disease", and "prevention" are as described above.

본 발명에서 용어, "개선"은 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 구강질환 또는 골질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.In the present invention, the term, "improvement" refers to any act of improving or benefiting the symptoms of a suspected or developing disease of an oral disease or bone disease that is prevented or treated using a composition comprising tail fern extract or a fraction thereof as an active ingredient. .

본 발명에서 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 등의 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하며, 본 발명의 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 또한 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있다.In the present invention, the term, "food" is meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages , Vitamin complexes, health functional foods, and the like, all of which are included in the ordinary sense of food, and as long as it can contain the tail fern extract or fractions thereof of the present invention, it is not limited thereto. It may also include forms such as pills, powders, granules, needles, tablets, capsules or liquids.

본 발명에서 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하다. 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어날 수 있다.In the present invention, the term, "health functional food" refers to food manufactured and processed using ingredients or ingredients having useful functionality for the human body according to Act No. 6727 on the Health Functional Food, and 'functional' is the structure of the human body And it means to obtain a useful effect in health applications such as adjusting nutrients for function or physiological action. On the other hand, health foods mean foods that have an active health maintenance or enhancement effect compared to general foods, and health supplements mean foods for the purpose of supplementing health, and in some cases, terms of health functional foods, health foods, and health supplements Can be used interchangeably. The health functional food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the art. It can be manufactured in various types of formulations, and unlike general medicines, it has the advantage of not having side effects that can occur when taking medicines for a long time using food as a raw material, and can be excellent in portability.

상기 식품 조성물 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.When preparing the food composition, it may be prepared by adding raw materials and ingredients that are conventionally added in the art, and the type is not particularly limited. For example, as a conventional food, various herbal extracts, food additives, food supplements, or natural carbohydrates may be included as additional ingredients, but are not limited thereto.

또 다른 하나의 양태로서, 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.As another aspect, a quasi-drug composition for preventing or improving oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient, is provided.

구체적으로, 본 발명의 구강질환 또는 골질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물은 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.Specifically, the quasi-drug composition for preventing or improving oral disease or bone disease of the present invention may include a tail fern extract or a fraction thereof.

이때, 상기 "꼬리고사리", "추출물", "분획물", "구강질환", "골질환", "예방" 및 "개선"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "tail fern", "extract", "fraction", "oral disease", "bone disease", "prevention" and "improvement" is as described above.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단. 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다. 또한 상기 의약외품은 피부외용제 또는 개인위생용품을 포함할 수 있다.In the present invention, the term "quasi-drug" is a fiber, rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a person or animal, has a weak effect on the human body or does not act directly on the human body, Or a non-mechanical and similar product, one of the agents used for sterilization, pesticide, and similar purposes for the prevention of infection type, and diagnoses human or animal diseases. Of items used for the purpose of treatment, alleviation, treatment, or prevention, other than devices, machines, or devices, and items used for the purpose of having a pharmacological effect on the structure and function of a person or animal, other than devices, machinery, or devices Means goods. In addition, the quasi-drug may include an external preparation for skin or a personal hygiene product.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 겔의 형태로 제조되어 사용될 수 있으며, 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정겔일 수 있다. 또한 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 구강 양치용액, 구강용 스프레이, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.The external preparation for skin is not particularly limited thereto, and specifically, it may be prepared and used in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel or gel. Without being limited thereto, specifically, soap, cosmetics, wipes, tissue, shampoo, skin cream, face cream, toothpaste, lipstick, perfume, makeup, foundation, ball touch, mascara, eye shadow, sunscreen lotion, hair care products, It may be an air freshener gel or a cleaning gel. In addition, another example of the quasi-drug composition of the present invention is a disinfecting cleaner, shower foam, oral brushing solution, oral spray, wipes, detergent soap, hand wash, humidifier filler, mask, ointment or filter filler.

본 발명의 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있으며 유효성분 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.When the tail fern extract of the present invention or a fraction thereof is used as a quasi-drug additive, the extract or fraction can be added as it is or used with other quasi-drugs or quasi-drug components, and can be suitably used according to a conventional method, and the active ingredient mixed amount is used. It may be appropriately determined according to the purpose.

또 다른 하나의 양태로서, 꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환의 예방 또는 개선용 치과용 조성물을 제공한다.As another aspect, a dental composition for preventing or improving oral diseases including tail fern extract as an active ingredient is provided.

구체적으로, 본 발명의 구강질환 예방 또는 개선용 치과용 조성물을 꼬리고사리 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.Specifically, the dental composition for preventing or improving oral disease of the present invention may include a tail fern extract or a fraction thereof.

이때, 상기 상기 "꼬리고사리", "추출물", "분획물", "구강질환", "예방" 및 "개선"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.At this time, the description of the "tail fern", "extract", "fraction", "oral disease", "prevention" and "improvement" is as described above.

본 발명에서 용어, "치과용"은 치아와 그 지지조직 및 구강 내 질병이나 손상을 예방하거나 치료하기 위한 용도를 의미할 수 있다.In the present invention, the term, "dental use" may mean a use for preventing or treating diseases and damages in the teeth and its supporting tissues and the oral cavity.

상기 치과용 조성물은 불소바니쉬에 첨가하여 항균성 불소바니쉬와 같은 치과용 제품으로 응용이 가능하며, 구강 양치용액, 치과용 지각과민처치제, 항균성 치과용 접착제, 치과용 충전재, 치과용 수복재, 치과용 근관충전재, 치과용 근관 실러(sealer), 소와열구봉쇄재, 치과용 코팅제 및 치과용 시멘트 등과 같은 치과용 재료에 응용되어 사용될 수 있다.The dental composition can be applied to dental products such as antibacterial fluorine varnish by adding it to fluorine varnish, oral brushing solution, dental crust relieving agent, antibacterial dental adhesive, dental filling material, dental restorative material, dental It can be applied to and used in dental materials such as root canal fillers, dental root canal sealers, sonar fissure sealants, dental coatings, and dental cement.

또한, 상기 치과용 조성물은 구강의 건강을 위하여 사용되는 모든 물품에 사용될 수 있다. 상기 물품의 예로는 치실, 칫솔, 치간칫솔, 전동칫솔, 혀클리너, 구강세정기, 칫솔살균기 등과 같은 구강용품, 교정기, 임플란트 등과 같은 치과용 장치, 또는 치과 진료에 사용되는 모든 치과용 도구 및 기기를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the dental composition can be used for all articles used for oral health. Examples of the article include dental products such as dental floss, toothbrush, interdental toothbrush, electric toothbrush, tongue cleaner, mouthwash, toothbrush sterilizer, dental devices such as braces, implants, or all dental tools and instruments used in dental care. However, it is not limited thereto.

구체적으로, 상기 물품을 상기 치과용 조성물에 침지시키거나, 상기 치과용 조성물을 상기 물품의 표면에 도포 또는 분무하거나, 상기 치과용 조성물로 상기 물품의 표면을 수회 세척하거나, 상기 치과용 조성물이 스며든 타올 등으로 상기 물품의 표면을 닦는 등의 방법으로 물품에 사용할 수 있으며, 상기 물품과 상기 치과용 조성물이 소정의 시간 동안 접촉할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 상기 방법을 수행하는 시간도 상기 치과용 조성물이 상기 물품의 표면과 충분히 반응할 수 있는 시간이면 제한되지 않으며, 당업자가 이를 적절하게 선택할 수 있다.Specifically, the article is immersed in the dental composition, the dental composition is applied or sprayed on the surface of the article, the surface of the article is washed several times with the dental composition, or the dental composition seeps Any towel or the like can be used for the article by a method such as wiping the surface of the article, and the method is not particularly limited as long as the article and the dental composition can be contacted for a predetermined time. In addition, the time for performing the method is not limited as long as the dental composition can react sufficiently with the surface of the article, and those skilled in the art can appropriately select it.

본 발명의 꼬리고사리 추출물은 천연물에서 유래되어 독성이 적으면서도, 구강질환 유발 균인 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 활성을 현저하게 억제하고 파골세포의 형성 또는 분화를 현저하게 억제함으로써 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The tail fern extract of the present invention is derived from a natural product and has low toxicity, but also suppresses the activity of Porphyromonas gingivalis , an oral disease-causing bacterium, and significantly suppresses the formation or differentiation of osteoclasts. Or it may be useful for the prevention or treatment of bone disease.

도 1은 꼬리고사리 추출물의 처리 농도에 따른 세포 독성(세포 생존률)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 꼬리고사리 추출물의 처리 농도에 따른 산화질소의 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다. 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, 대조군에 대비한 LPS 처리군의 유의성 #는 p < 0.001이다. LPS 처리군에 대비한 꼬리고사리 추출물 처리군의 유의성 *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다.
도 3은 꼬리고사리 추출물의 처리 농도에 따른 염증성 사이토카인, (a) IL-6 및 (b) TNF-α 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다. 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, 대조군에 대비한 LPS 처리군의 유의성 #는 p < 0.001이다. LPS 처리군에 대비한 꼬리고사리 추출물 처리군의 유의성 *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다.
도 4는 꼬리고사리 추출물의 처리 농도에 따른 포르피로모나스 진지발리스의 성장 억제 효과를 나타낸 그래프이다. 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, 대조군에 대비한 유의성 *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다.
도 5는 대조군, 불소바니쉬 처리군, 불소바니쉬+꼬리고사리 처리군에 따른 포르피로모나스 진지발리스의 성장 억제 지속 효과를 나타낸 그래프이다. 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, 대조군에 대비한 불소바니쉬 처리군의 유의성 ###는 p < 0.001이다. 불소바니쉬 처리군에 대비한 불소바니쉬+꼬리고사리 처리군의 유의성***는 p < 0.001을 나타낸다.
도 6은 꼬리고사리 추출물의 처리 농도에 따른 (a) TRAP 양성 세포 수를 나타낸 그래프, 및 (b) 분화된 파골세포의 TRAP 염색 결과를 나타낸 사진이다. 유의성 검정은 student t-test를 통하여 수행하였고, 대조군에 대비한 유의성 *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다.1 is a graph showing the cytotoxicity (cell viability) according to the treatment concentration of tail fern extract.
2 is a graph showing the effect of inhibiting the production of nitric oxide according to the treatment concentration of the tail fern extract. The significance test was performed through the student t-test, and the significance # of the LPS-treated group compared to the control group was p <0.001. The significance of the tail fern extract-treated group compared to the LPS-treated group was p <0.05, ** is p <0.01, and *** is p <0.001.
Figure 3 is a graph showing the inhibitory effect of inflammatory cytokines, (a) IL-6 and (b) TNF-α production according to the treatment concentration of the tail fern extract. The significance test was performed through the student t-test, and the significance # of the LPS-treated group compared to the control group was p <0.001. The significance of the tail fern extract-treated group compared to the LPS-treated group was p <0.05, ** is p <0.01, and *** is p <0.001.
Figure 4 is a graph showing the growth inhibitory effect of Porphyromonas gingivalis according to the treatment concentration of the tail fern extract. The significance test was performed through the student t-test, and the significance * compared to the control group was p <0.05, ** indicates p <0.01, and *** indicates p <0.001.
5 is a graph showing the sustained effect of growth inhibition of Porphyromonas gingivalis according to the control group, the fluoride varnish treatment group, and the fluoride varnish + tail fern treatment group. The significance test was conducted through the student t-test, and the significance ### of the fluoride varnish treatment group compared to the control group was p <0.001. The significance *** of the fluoride varnish + tail fern treatment group compared to the fluoride varnish treatment group was p <0.001.
Figure 6 is a photograph showing the results of TRAP staining of differentiated osteoclasts, and (a) a graph showing the number of TRAP positive cells according to the treatment concentration of the tail fern extract. The significance test was performed through the student t-test, and the significance * compared to the control group was p <0.05, ** indicates p <0.01, and *** indicates p <0.001.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention and the scope of the present invention is not limited to them.

실시예 1. 꼬리고사리 추출물의 제조Example 1. Preparation of tail fern extract

국내 식물분류학자, 재배전문가, 생약감별전문가의 협력을 통해 국내에서 자생하는 꼬리고사리를 수집하여, 전초를 건조 후 99.9% 메탄올에 넣어 45℃에서 3일 동안 추출하였다. 추출 시 15분의 소니케이션(sonication) 후, 2시간 정지과정을 10회/1일 과정을 거쳤다. 이후, 무형광 솜 필터를 이용하여 여과를 하고, 45℃에서 회전 증발기(rotary evaporator; N-1000SWD; EYELA)를 활용하여 농축을 하고, 모듈 스핀 40(module spin 40; Biotron co.)을 활용하여 24시간 동안 건조하였다. 이후, 추출물은 20 mg/tube 형태로 용매를 제거한 뒤 -4℃ 저온실에 보관하였다. 상기 과정은 한국식물추출물은행에서 수행하였고, 20 mg/tube의 시료는 세포 실험에 사용하기 위하여 DMSO로 녹여 50 mg/ml의 농도로 만들었으며, 이를 세포배양배지로 희석하여 사용하였다.Through the cooperation of domestic plant classifiers, cultivation experts, and herbalist experts, tail ferns native to Korea were collected, dried, and then put out in 99.9% methanol and extracted at 45 ° C for 3 days. After 15 minutes of sonication at the time of extraction, a 2 hour suspension was performed 10 times per day. Subsequently, it is filtered using a non-fluorescent cotton filter, concentrated using a rotary evaporator (N-1000SWD; EYELA) at 45 ° C, and 24 using a module spin 40 (Biotron co.). Dry for an hour. Thereafter, the extract was removed in the form of 20 mg / tube, and then stored in a low temperature room at -4 ° C. The above procedure was performed at the Korea Plant Extract Bank, and a sample of 20 mg / tube was dissolved in DMSO for use in cell experiments to a concentration of 50 mg / ml, which was used by diluting it with a cell culture medium.

실시예 2. 꼬리고사리 추출물의 항염 효과Example 2. Anti-inflammatory effect of tail fern extract

RAW264.7 세포를 ATCC(Rockville, MD)에서 구입하여, 10% 태아소혈청(fetal bovine serum; FBS, HyClone Logaa, UT), 스트렙토마이신(100 μg/mL), 및 페니실린(100 U/mL)이 첨가된 성장 배지(CM, DMEM)에 37℃, 5% CO2 습한 공기에서 배양하였다.RAW264.7 cells were purchased from ATCC (Rockville, MD), 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone Logaa, UT), streptomycin (100 μg / mL), and penicillin (100 U / mL) The added growth medium (CM, DMEM) was cultured in humidified air at 37 ° C and 5% CO 2 .

실시예 2-1. 세포독성 평가Example 2-1. Cytotoxicity evaluation

4×103 개의 RAW264.7 세포를 GM의 96-웰플레이트에 도말하였다. 24시간 배양 후, 세포에 리포다당류(lipopolysaccharide; LPS, 1 μg/mL) 존재 하에 1일 동안 실시예 1에서 제조한 꼬리고사리 추출물을 농도별(0, 3, 10 및 30 μg/mL)로 처리하였다. 세포 생존률(cell viability, %)은 제조사의 매뉴얼에 따라 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo, Rockville, ML, USA)를 이용하여 3회 측정하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(VERSA maxTM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 측정하였으며, 표준 곡선을 이용하여 세포 수로 전환하였다.4 × 10 3 RAW264.7 cells were plated on GM's 96-well plate. After incubation for 24 hours, the tail fern extract prepared in Example 1 was treated by concentration (0, 3, 10 and 30 μg / mL) for 1 day in the presence of lipopolysaccharide (LPS, 1 μg / mL) in cells. Did. Cell viability (%) was measured three times using Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, ML, USA) according to the manufacturer's manual. Absorbance was measured with a microplate reader (VERSA max ™ , Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and converted to cell number using a standard curve.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 꼬리고사리 추출물을 처리하는 경우, 모든 농도에서 100%에 가까운 세포 생존률을 나타내어 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 추후에 확인할 항균 효과 또는 파골세포 생성 억제 효과가 세포 상에서의 독성 효과 때문이 아니라, 꼬리고사리 추출물에 의한 항균 효과 또는 파골세포 생성 억제 효과임을 보여주는 것이다.As a result, as shown in FIG. 1, when the tail fern extract was treated, it was confirmed that the cytotoxicity was not exhibited by showing the cell viability close to 100% at all concentrations. These results show that the antimicrobial effect or osteoclast production inhibitory effect to be confirmed later is not due to the toxic effect on the cell, but the antibacterial effect or the osteoclast production inhibitory effect by the tail fern extract.

실시예 2-2. 산화질소 생성 억제 활성Example 2-2. Nitric oxide production inhibitory activity

세포는 60 mm 디쉬에 1×106 세포를 도말한 후, 2시간 동안 실시예 1에서 제조한 꼬리고사리 추출물을 농도별(0, 3, 10 및 30 μg/mL)로 처리하였다. 이후, LPS(1 μg/mL)를 첨가하였다. 24시간 배양 후, 산화질소(Nitric oxide; NO) 수준을 그리스 반응(Griess reaction)을 이용하여 분석하였다. 세포 배양 배지(100μL)를 그리스 시약과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 배양하였다. 흡광도는 540 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 모든 실험에서 블랭크(blank)로서, 새로운 배양 배지를 사용하였다. 아질산염(nitrite; NO2)은 아질산 나트륨(sodium nitrite; NaNO2)를 이용한 표준 곡선으로 측정하였다. The cells were plated with 1 × 10 6 cells in a 60 mm dish and treated with tail fern extract prepared in Example 1 for 2 hours by concentration (0, 3, 10 and 30 μg / mL). Then, LPS (1 μg / mL) was added. After incubation for 24 hours, nitrogen oxide (NO) levels were analyzed using a grease reaction. Cell culture medium (100 μL) was mixed with grease reagent and incubated for 10 minutes at room temperature. Absorbance was measured with a microplate reader at 540 nm. As a blank in all experiments, fresh culture medium was used. Nitrite (NO 2 ) was measured by a standard curve using sodium nitrite (NaNO 2 ).

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, LPS만 첨가한 경우 대조군에 비해 산화질소 수준이 현저히 증가하나, 꼬리고사리 추출물 처리 후 LPS를 첨가한 경우 LPS만 첨가한 경우 보다 산화질소 수준이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 꼬리고사리 추출물이 세포 내 염증 매개 물질인 산화질소 생성을 억제하여 항염 효과를 나타냄을 보여주는 것이다.As a result, as shown in FIG. 2, when only LPS was added, the level of nitrogen oxide was significantly increased compared to the control group, but when LPS was added after tail fern extract treatment, nitrogen oxide level was significantly reduced than when only LPS was added. Confirmed. These results show that the tail fern extract has an anti-inflammatory effect by inhibiting the production of nitric oxide, an inflammatory mediator in the cell.

실시예 2-3. 사이토카인 생성 억제 활성Example 2-3. Cytokine production inhibitory activity

세포는 60 mm 접시에 1×106 세포로 도말한 후, 2시간 동안 실시예 1에서 제조한 꼬리고사리 추출물을 농도별(0, 3, 10 및 30 μg/mL)로 처리하였다. 이후, LPS(1 μg/mL)를 첨가하였다. 세포는 24시간 동안 배양하였다. 상등액의 사이토카인 양은 제조사의 매뉴얼에 따라 IL-6 및 TNF-α를 측정하는 ELISA 키트(R&D, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.The cells were plated with 1 × 10 6 cells in a 60 mm dish, and the tail fern extract prepared in Example 1 was treated by concentration (0, 3, 10 and 30 μg / mL) for 2 hours. Then, LPS (1 μg / mL) was added. Cells were cultured for 24 hours. The amount of cytokines in the supernatant was measured using an ELISA kit (R & D, Minneapolis, MN) that measures IL-6 and TNF-α according to the manufacturer's manual.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, LPS만 첨가한 경우 대조군에 비해 IL-6 및 TNF-α 수준이 현저히 증가하나, 꼬리고사리 추출물 처리 후 LPS를 첨가한 경우 LPS만 첨가한 경우 보다 IL-6 및 TNF-α 수준이 현저히 감소하는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 꼬리고사리 추출물이 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α 생성을 억제하여 항염 효과를 나타냄을 보여주는 것이다.As a result, as shown in FIG. 3, when only LPS was added, IL-6 and TNF-α levels were significantly increased compared to the control group, but when LPS was added after tail fern extract treatment, IL-6 was more than when only LPS was added. And it was confirmed that the TNF-α level is significantly reduced. These results show that the tail fern extract has an anti-inflammatory effect by inhibiting the production of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α.

실시예 3. 꼬리고사리 추출물의 항균 효과Example 3. Antibacterial effect of tail fern extract

실시예 3-1. 꼬리고사리 추출물의 항균 활성Example 3-1. Antibacterial activity of tail fern extract

꼬리고사리 추출물의 구강 항균 활성을 평가하기 위해, 포르피로모나스 진지발리스(Prophyromonas gingivalis; P. gingivalis, ATCC33277) 균을 사용하였다. 헤민(hemin)과 메나디온(menadione)을 포함한 BHI broth를 배지로 사용하여 포르피로모나스 진지발리스 균을 활성화시키고, 37℃, CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양 후, 96-웰플레이트의 각 웰(well)에 균을 90 μL씩 넣고, 실시예 1에서 제조한 꼬리고사리 추출물 10 μL을 넣었다. 대조군은 세균만 100 μL 를 넣은 것을 사용하였으며, 각각의 웰에 BHI broth를 100 μL를 추가로 넣어 꼬리고사리 추출물의 최종 농도가 125 μg/mL, 250 μg/mL 및 500 μg/mL가 되도록 하였다. 이후, 시료를 72시간 동안 배양하였다. 흡광도는 600 nm에서 ELISA 키트(Spectra MAX250, Molecular Devices Co.)로 측정하여 균의 성장이 억제된 농도를 결정하였다.To evaluate the oral antibacterial activity of the tail fern extract, a bacterium Porphyromonas gingivalis ( P. gingivalis , ATCC33277 ) was used. BHI broth containing hemin and menadione was used as a medium to activate Porphyromonas gingivalis bacteria, incubated in a CO 2 incubator for 72 hours, and each well of a 96-well plate To the well, 90 μL of the bacteria was added, and 10 μL of the tail fern extract prepared in Example 1 was added. As a control, 100 μL of only bacteria was used, and 100 μL of BHI broth was additionally added to each well so that the final concentrations of tail fern extracts were 125 μg / mL, 250 μg / mL, and 500 μg / mL. Thereafter, the sample was cultured for 72 hours. Absorbance was measured with an ELISA kit (Spectra MAX250, Molecular Devices Co.) at 600 nm to determine the concentration at which growth of bacteria was inhibited.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 꼬리고사리 추출물을 처리하는 경우 농도 의존적으로 포르피로모나스 진지발리스의 성장을 억제하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 125 μg/ml 및 250 μg/ml의 꼬리고사리 추출물을 처리하는 경우 포르피로모나스 진지발리스의 성장이 약 20% 억제되고, 500 μg/ml의 꼬리고사리 추출물을 처리하는 경우 포르피로모나스 진지발리스의 성장이 약 40% 억제됨을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 4, when the tail fern extract was treated, it was confirmed that the growth of porphyromonas gingivalis was inhibited in a concentration-dependent manner. Specifically, when the tail fern extracts of 125 μg / ml and 250 μg / ml are treated, the growth of Porphyromonas gingivalis is inhibited by about 20%, and when the tail fern extract of 500 μg / ml is processed, Porphyrononas It was confirmed that the growth of gingivalis was inhibited by about 40%.

실시예 3-2. 꼬리고사리 추출물의 항균 지속 활성Example 3-2. Antibacterial lasting activity of tail fern extract

꼬리고사리 추출물의 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 지속 활성의 평가는 다음과 같이 수행하였다. 직경 5 mm 디스크 형태의 필름(OHP 필름)을 멸균포장지에 담아 EO 가스로 소독한 후, 표 1과 같이 시료를 준비하여, 필름 표면에 골고루 편평하게 같은 두께로, 전면적에 꽉 차도록 도포하였다. 이때, 시료 당 3개의 필름을 만들어 직경 35 mm의 페트리디쉬에 넣고, 클린벤치에서 UV를 켜 둔 상태에서 30분간 건조하였다. 시료가 도포된 필름이 있는 페트리디쉬에 멸균된 증류수 2000 μL씩을 넣은 후, 시료가 물에 용출될 수 있도록 도포된 면이 아래를 향하도록 하였다. 3일 동안 37℃, 진탕항온조(shaking water bath)에서 80 rpm으로 보관 후, 페트리디쉬에서 필름을 꺼내 한천확산법(agar diffusion test)을 이용하여 항균력을 평가하였다.Evaluation of the antimicrobial sustained activity of the tail fern extract against Porphyromonas gingivalis was performed as follows. The film (OHP film) in the form of a disk with a diameter of 5 mm was put in sterile packaging and sterilized with EO gas, and then a sample was prepared as shown in Table 1, and evenly applied to the entire surface of the film with the same thickness, evenly filling the entire surface. At this time, three films were made per sample, placed in a petri dish with a diameter of 35 mm, and dried in a clean bench for 30 minutes while UV was turned on. After adding 2000 μL of sterilized distilled water to a petri dish with a film coated with a sample, the coated surface was directed downward so that the sample could be eluted in water. After storing at 37 ° C. for 3 days at 80 rpm in a shaking water bath, the film was taken out from the petri dish and evaluated for antibacterial activity using an agar diffusion test.

시료 1
(대조군)Sample 1
(Control) 필름자체Film itself 시료 2Sample 2 불소바니쉬 KR610Fluorine varnish KR610 시료 3Sample 3 꼬리고사리 50 mg/ml(50 μL) + 불소바니쉬 KR610 (50 μL)Tail fern 50 mg / ml (50 μL) + Fluorine varnish KR610 (50 μL)

한천확산법은 다음과 같이 수행하였다. 포르피로모나스 진지발리스를 BHI broth 배지에 72시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양한 후, base agar가 깔린 한천배지 위에 접종하였다. The agar diffusion method was performed as follows. Porphyromonas gingivalis was incubated in a BHI broth medium at 37 ° C. in a CO 2 incubator for 72 hours, and then inoculated onto agar medium coated with a base agar.

Top agar가 굳고 난 후, 3일 동안 37℃, 진탕항온조에서 80 rpm으로 보관된 필름을 한천배지 위에 올려 놓았다. 이 때, 시료가 도포된 필름의 면이 아래로 향해 한천배지와 접합될 수 있도록 하였다. 이후, 72시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양 후 OHP 필름 주변에 형성된 포르피로모나스 진지발리스 억제대의 직경을 직각 방향으로 측정하여 그 평균을 억제존(inhibition zone, mm)으로 판단하였다.After the top agar was solidified, the film stored at 37 ° C. and 80 rpm in a shaking bath for 3 days was placed on an agar medium. At this time, the surface of the film coated with the sample was allowed to be bonded to the agar medium downward. Subsequently, after incubation in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 72 hours, the diameter of the Porphyromonas gingivalis inhibitor band formed around the OHP film was measured in a right angle direction to determine the average as an inhibition zone (mm).

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 불소바니쉬 처리군의 경우 대조군에 비해 현저한 항균 지속 효과를 나타내며, 불소바니쉬+꼬리고사리 처리군의 경우 불소바니쉬 처리군에 비해서 현저한 항균 지속 효과를 나타내는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the fluoride varnish treatment group showed a remarkable antimicrobial persistence effect compared to the control group, and the fluoride varnish + tail fern treatment group showed a remarkable antibacterial effect compared to the fluoride varnish treatment group. .

이상, 상기 결과를 통해 본 발명의 꼬리고사리 추출물은 구강질환을 야기하는 균주에 대하여 우수한 항균 효과 및 항균 지속 효과를 나타내므로 구강질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.As described above, it was found through the above results that the tail fern extract of the present invention exhibits excellent antimicrobial and antimicrobial effects against strains causing oral diseases, and thus can be effectively used in the treatment of oral diseases.

실시예 4. 꼬리고사리 추출물의 파골세포 분화 억제 효과Example 4. Inhibitory effect of osteoclast differentiation of tail fern extract

5주령의 수컷 ICR 마우스를 구입하여 대퇴골(fermur) 및 경골(tibia)을 취하고 항생제(100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM으로 세척하여 골수세포(bone marrow cell)를 획득하였다. 상기 골수세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/mL)를 포함하는 α-MEM에 1일 동안 배양하였다. 비부착(non-adherent) 골수세포를 페트리접시에 분주하고 M-CSF(30 ng/mL) 존재 하에 3일 동안 배양하였다. 비부착세포를 세척한 후 부착세포(adherent cell)를 골수-유래 마크로파지(bone marrow-derived macrophage; BMM)로 사용하였다. BMM 세포를 파골세포로 분화시키기 위해서, RANKL(10 ng/mL) 및 M-CSF(30 ng/mL) 존재 하에 BMM 세포(1 × 104 cells/well)를 96-웰플레이트에 도포하고, 실시예 1에서 제조한 꼬리고사리 추출물을 농도별(0, 3, 10 및 30 μg/mL)로 처리하여, 최종 농도가 125, 250 및 500 μg/ml가 되도록 하여 4일 동안 배양하였다. 음성대조군은 RANKL만을 처리한 세포를 사용하였다. 4일 동안 배양 후, 다핵성 파골세포(multinucleated osteoclast)를 3.7% 포르말린으로 10분간 고정하고 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. TRAP 용액(Sigma Aldrich, USA)을 처리하여 파골세포를 붉게 염색하였다. 이후, 파골세포의 분화 마커인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 활성도를 측정하고자, TRAP 완충용액(100 mM sodium citrate pH 5.0, 50 mM sodium tartrate, 3 mM p-nitrophenyl phosphate)을 100 μl를 넣고 37°C에서 5분간 반응시킨 후, 100 μl의 0.1 N NaOH 넣어 반응을 종결시켰다. 이후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하여, TRAP 활성도를 측정하였다.A 5 week old male ICR mouse was purchased and the femur and tibia were taken and washed with α-MEM containing antibiotics (100 units / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin) to bone marrow cells ). The bone marrow cells were cultured for 1 day in α-MEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) 10 ng / mL. Non-adherent bone marrow cells were dispensed into Petri dishes and cultured for 3 days in the presence of M-CSF (30 ng / mL). After washing non-adherent cells, adherent cells were used as bone marrow-derived macrophage (BMM). In order to differentiate BMM cells into osteoclasts, BMM cells (1 × 104 cells / well) were applied to a 96-well plate in the presence of RANKL (10 ng / mL) and M-CSF (30 ng / mL), Example The tail fern extract prepared in 1 was treated by concentration (0, 3, 10, and 30 μg / mL), and the final concentrations were 125, 250, and 500 μg / ml, and cultured for 4 days. As a negative control, cells treated with RANKL only were used. After incubation for 4 days, multinucleated osteoclasts were fixed with 3.7% formalin for 10 minutes and treated with 0.1% Triton X-100 for 10 minutes to have permeability. The osteoclasts were stained red by treatment with TRAP solution (Sigma Aldrich, USA). Thereafter, in order to measure the activity of osteoclast differentiation marker, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), 100 μl of TRAP buffer solution (100 mM sodium citrate pH 5.0, 50 mM sodium tartrate, 3 mM p-nitrophenyl phosphate) was added and 37 After reacting at ° C for 5 minutes, the reaction was terminated by adding 100 μl of 0.1 N NaOH. Thereafter, the absorbance at 405 nm was measured to measure TRAP activity.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, RANKL에 의하여 유도된 파골세포에 꼬리고사리 추출물을 처리하는 경우 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6, when the tail fern extract was treated with RANKL-derived osteoclasts, it was confirmed that the number of osteoclasts stained red was significantly reduced while suppressing TRAP activity in a concentration-dependent manner.

이상, 상기 결과를 통해 본 발명의 꼬리고사리 추출물은 우수한 파골세포를 분화 생성 억제 효과를 나타내므로 구강질환 및 골질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.As mentioned above, it was found through the above results that the tail fern extract of the present invention has an excellent osteoclast-inhibiting effect of differentiation, and thus can be effectively used in the treatment of oral diseases and bone diseases.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will appreciate that the present invention may be implemented in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In this regard, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the following claims rather than the above detailed description and equivalent concepts thereof.

Claims (11)

꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출되는 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the extract is extracted with a solvent selected from the group consisting of water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixed solvent thereof.
제1항에 있어서, 상기 구강질환은 치주질환 또는 구취인 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the oral disease is periodontal disease or bad breath.
제3항에 있어서, 상기 치주질환은 치주염, 치은염 또는 이들의 조합인 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the periodontal disease is periodontitis, gingivitis or a combination thereof.
제1항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 골용해(osteolysis), 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 파제트병(Paget's disease), 골형성부전증(osteogenesis imperfect), 고칼슘혈증(hypercalcemia)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
According to claim 1, wherein the bone disease is osteoporosis (osteoporosis), osteomalacia (osteomalacia), osteopenia (osteopenia), bone atrophy (bone atrophy), osteoarthritis (osteoarthritis), rheumatoid arthritis (periodontal disease) , Osteolysis, fibrous dysplasia, Paget's disease, osteogenesis imperfect, hypercalcemia, any one or more selected from the group consisting of, pharmaceutical composition .
제1항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증(osteoporosis)인 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the bone disease is osteoporosis.
제1항에 있어서, 상기 구강질환의 예방 또는 치료는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 활성의 억제를 통해 달성되는 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the prevention or treatment of the oral disease is achieved through the inhibition of Porphyromonas gingivalis activity.
제1항에 있어서, 상기 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 치료는 파골세포 분화의 억제를 통해 달성되는 것인, 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the prevention or treatment of the oral disease or bone disease is achieved through suppression of osteoclast differentiation.
꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
Food composition for preventing or improving oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient.
꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환 또는 골질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
A quasi-drug composition for preventing or improving oral disease or bone disease, including tail fern extract as an active ingredient.
꼬리고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강질환의 예방 또는 개선용 치과용 조성물.
Dental composition for prevention or improvement of oral diseases comprising tail fern extract as an active ingredient.
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