KR20200029892A

KR20200029892A - 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 탄저균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주

Info

Publication number: KR20200029892A
Application number: KR1020180108475A
Authority: KR
Inventors: 이기은; 전정훈; 유재연; 황이랑; 조병기; 지미정; 홍설혜
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장); 주식회사 한국애보트진단
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-03-19
Also published as: KR102092465B1

Abstract

본 발명은 탄저균 아포의 표면 항원 중 하나인 BclA 단백질 특이적인 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1(기탁번호 KCLRF-BP-00429), 및 이를 이용한 탄저균 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 탄저균에 대하여 우수한 민감도를 나타내고 다른 병원체 및 방해물질에 대하여 교차반응을 나타내지 않는다.

Description

신속 면역크로마토그래피법을 이용한 탄저균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주 {Anthrax diagnostic detection kit using rapid immunochromatography, its specific antibody and antibody-producing cell lines}

본 발명은 탄저균 표면항원 중 하나인 BclA(Bacillus Collagen-Like protein of Anthracis)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1(기탁번호 KCLRF-BP-00429) 및 상기 항체를 포함하고 민감도와 특이도가 개선된 탄저균 탐지용 면역 크로마토그래피 키트에 관한 것이다.

탄저균(Bacillus anthracis)은 탄저를 유발하는 그람양성 간균으로 자연계에서는 주로 아포(spore) 또는 연결되어 있는 영양 세포(vegetative cell)의 형태로 존재한다. 탄저균의 영양 세포는 편모가 없고 운동성이 없으며, 생장 조건에 적합하지 않은 환경에 노출되면 아포를 생산한다. 아포는 공기 중에서는 24시간, 흙 속에서는 100년까지도 살 수 있으며 가열, 일광, 소독제 등에도 강한 저항성을 나타낸다.

탄저균은 자연계에서는 아포 형태로 존재하지만 인체에 침입하면 증식 형태로 바뀌는 특성이 있으며 탄저 독소(방어항원, 치사요소 및 부종요소)가 발병에 관여한다. 탄저는 크게 호흡기 탄저, 피부 탄저 및 위장관 탄저로 구분되며, 이중에서 호흡기 감염에 의한 탄저가 가장 치명적이다. 호흡기 탄저에 의한 초기 증상은 발열, 호흡곤란, 기침, 두통, 구토, 오한, 복통, 흉통 등으로 감기와 비슷하나 감염 후 며칠 뒤에는 그 증상이 심각한 호흡곤란과 쇼크로 진행되어 치명적이게 된다. 피부 탄저의 경우 약 20%, 위장관 탄저의 경우는 25%에서 60% 정도가 사망하게 되며, 호흡기 탄저의 경우는 더욱 치명적이다.

호흡기 탄저의 경우, 아포 형태의 탄저균이 호흡기를 통해 폐로 감염되고, 감염 후 폐의 대식세포 내에서 발아(germination)한다. 이후 림프절로 이동하여 증식하고 혈액 내로 유입하게 되면 지속적으로 탄저균이 증식하고 독소를 생산해 치명적인 증상을 유발하게 된다(Maynard등 Nature Biotechnology 2002 20:597-601).

최근 탄저균은 생물 테러에 사용될 가능성이 높아 미국 질병통제센터(Centers for disease control and prevention; CDC)에서 카테고리 A(Category A) 병원성 미생물로 분류하였다.

탄저균은 pXO1 플라스미드를 통해 탄저독소를 생산하는데, 이 탄저독소는 방어항원(protective antigen: PA, 83 kDa), 치사요소(lethal factor: LF, 90 kDa), 부종요소(edema factor: EF, 89 kDa) 세 종류의 독소 단백질로 구성된다. 4개의 폴딩 도메인(folding domain)으로 구성된 방어항원은 도메인 4를 통해 세포표면에 존재하는 탄저독소 수용체(anthrax toxinreceptor: ATR)에 결합한 후 세포표면에 존재하는 퓨린 유사 프로테아제(furin-like protease)에 의해 도메인 1의 N 말단(N-terminal) 20 kDa 이 잘려나가면서 PA63의 형태로 활성화된다. 활성화된 PA63은 7량체화(heptamerization)되어 [PA63]7의 형태가 되고 치사요소 또는 부종요소와 결합할 수 있는 부위가 생성된다. 방어항원과 치사요소가 결합할 경우 치사독소(lethal toxin: LeTx)라고 하며, 방어항원과 부종요소가 결합할 경우 부종독소(edema toxin: EdTx)라고 한다.

방어항원과 결합한 치사요소 또는 부종요소는 방어항원과 결합한 복합체 상태로 세포내부로 엔도사이토시스(endocytosis)되며, 리소좀과 융합되어 낮은 pH상태에서 방어항원의 구조적 변화로 인해 세포질 내로 방출된다. 아연 의존적 메탈로프로테아제(Zinc-dependent metalloprotease)로 방출된 치사요소는 미토젠 활성화된 단백질 키나제-키나제(Mitogen activated protein―kinase-kinases)를 잘라 세포내 신호전달을 중단시켜 대식세포의 용해를 일으킨다. 부종요소는 칼슘/칼모듈린 의존적 아데닐레이트 싸이클라제(calcium/calmodulin-dependent adenylate cyclase)로 세포내의 cAMP 농도를 증가시켜 부종과 국부적인 염증반응을 유도하나 일반적으로 치명적이지 않다.

현재 탄저균의 치료를 위해서는 페니실린, 독시사이클린, 플루로퀴놀론류(fluroquinolones) 등 몇 종의 항생제가 사용되고 있다. 그러나 항생제 내성 균주에 의한 탄저는 치료할 수 없고, 특히 생화학테러나 생화학전의 경우 항생제 내성을 가진 균주를 사용할 가능성이 높기 때문에 이러한 경우에는 사용될 수 없다. 또한 항생제는 독소의 작용을 억제할 수 없어 감염 후 초기에 투여되지 않으면 사망의 가능성이 매우 높다. 그러나 탄저의 초기 증상이 일반적인 감기의 증상과 비슷해 초기 진단 및 치료가 어렵다.

탄저의 예방을 위해서는 현재 방어항원이 주성분인 백신이 미국과 영국에서 개발되어 사용 중이지만 그 안전성이 완전히 검증되지 않은 상태로 실제 사용은 군인이나 탄저균에 노출될 가능성이 매우 높은 일부 사람에게만 허용되고 있다. 또한 백신은 일반적으로 충분한 면역력을 획득하기 위해 최소 수개월의 기간이 필요해 생화학 테러 등의 위급상황에는 사용이 사실상 불가능하다.

따라서 생물테러 의심상황 발생 시 현장에서 신속 탐지할 수 있는 기술의 개발은 테러상황 유무를 신속하게 판단하고 대응정책 결정을 위해 매우 중요하다. 이를 위하여 본 발명자는 탄저균 현장 검출을 위한 면역크로마토그래피 기술 기반 신속 탐지 키트를 개발하고자 하였다.

본 발명의 목적은 생물테러 의심상황 등에서 신속한 대응을 위해, 탄저균 현장 검출을 위한 탄저균 탐지 키트를 제공하는 것이다. 이를 위하여 본 발명은 탄저 포자의 외피 표면 항원 중 하나인 BclA 단백질 특이적 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 신규한 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1(기탁번호 KCLRF-BP-00429), 및 이를 이용한 탄저균 탐지용 면역 크로마토그래피 키트를 제공한다.

본 발명은 탄저균 포자외막 단백질 BclA를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체를 제공한다. 상기 단백질 BclA는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.

상기 단일클론 항체는 기탁번호 KCLRF-BP-00429로 기탁된 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1에 의하여 생성되고, 탄저균 포자외막 단백질 BclA를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 기탁번호 KCLRF-BP-00429로 기탁된 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명은 (i) 단백질 BclA의 염기서열(서열번호 1)을 도입하여 플라스미드(plasmid)를 합성한 후 대장균(XL1-Blue)에 형질전환하여 항원을 발현시키는 단계; (ii) 상기 항원을 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계; (iii) 상기 비장에서 수득한 B 림프구와 미엘로마(Myeloma) 세포를 융합하는 단계; 및 (iv) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 세포주에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체를 포함하는 탄저균 탐지 키트에 관한 것이다. 상기 키트에서 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅될 수 있다.

상기 키트는 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 기존의 탄저균 탐지키트에 사용되는 항체와 비교하여 민감도 및 특이도가 월등하게 우수한 항체를 제공함으로써 보다 신속하고 정확하게 탄저균을 탐지 및 검출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체를 이용한 탐지키트는 종래의 제품과 비교하여 월등하게 우수한 민감도를 가지며, 타 병원체 및 독소 등에 대한 교차반응이 없어 매우 우수한 특이도를 갖는다.

도 1은 기존 상용화된 탐지키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 본 발명의 신규 항체를 적용한 탐지키트의 감도를 비교평가한 결과이다.
도 2는 특이도 평가를 위하여 균체 및 독소 9종에 대한 교차반응 유무를 비교 평가한 결과이다.
도 3은 탐지키트가 방해물질에 대한 영향을 받는지 여부를 시험한 결과이다.
도 4는 탐지키트의 재현성을 평가하기 위해 각 항목별 20회의 감도 및 특이도 시험을 실시한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 모든 용어는 달리 정의되지 않는 이상 본 발명의 관련 분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.　 또한 본 명세서에는 바람직한 방법 또는 시료 등이 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.　

본 발명에서 용어, "항체(antibody)"란 항원과 특이적으로 결합하는 단백질이며, 본 발명의 목적상 탄저균의 표면 항원 중 하나인 BclA 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체이다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 조제물을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 “벡터”는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하고, 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명은 기탁번호 KCLRF-BP-00429의 하이브리도마 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1에 의해 생산되는, 탄저균 포자외막 단백질 BclA에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 관한 것이다.

기탁번호 KCLRF-BP-00429의 하이브리도마 세포주에서 생산되는 항체는 기존의 탄저균 검출키트에 사용된 항체보다 항원에 대한 친화도가 높은 신규한 항체이다. 항원에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주는 표준 기술에 따라 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마 세포주가 생산하는 단일클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기한 항체를 포함하는 탄저균 탐지키트에 관한 것이다. 상기의 항체를 포함하는 키트를 이용하여 생물테러 의심상황에서 탄저균의 현장 검출을 신속하게 할 수 있다.

이러한 탐지키트에는 본 발명의 단일클론 항체 뿐만 아니라 당해 분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구 및 시약은 적합한 담체(carrier), 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제 및 안정화제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

적합한 담체(carrier)로는, 가용성 담체, 예를 들어 당해 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리 에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip)에 의해 제조될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체 형성을 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있도록 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

검출 라벨로 이용가능한 효소는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포 프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트, 데카복실라제, β-라타마제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

형광물은 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

리간드는 바이오틴 유도체 등을 포함하고, 발광물은 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라제 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

미소입자는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트에서, 상기 단일클론 항체는 통상의 탐지키트의 재료로 사용되는 멤브레인에 코팅된 것일 수 있으며, 멤브레인은 나이트로셀룰로스, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체를 사용할 수 있다.

본 발명자는, 멤브레인 종류별(제조사별, pore size 별) 및 검사선용 항체 농도별 시험을 실시하여 감도 및 특이도가 높은 멤브레인 및 항체 농도를 선별하였다. 그 결과 본 발명의 키트는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 검사선과 대조선 위치 부위에 항원 특이적 단일클론 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다.

본 발명은 검체 패드 시험을 통해 소, 마우스 혈청과 같은 동물 혈청 처리를 통해 비특이 반응을 제거하며 BSA, Casein등과 같은 안정제 등으로 전처리하여 선별 조건에 최적화된 패드 조성을 선별하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] - 탄저 BclA 재조합 항원의 준비

항체 개발을 위한 면역원 조사 및 준비를 위해 [유전자변형생물체의 국가 간 이동 등에 관한 법률]에 의거하여 탄저(승인번호 제15-RDM-012호)는 유전자변형 생물체 실험 및 개발 국가승인 심사를 통해 승인 받았으며, 모든 실험과정은 신고된 생물안전 연구시설에서 생물안전 운영지침을 준수하여 실시하였다.

탄저균(Bacillus anthracis)의 아포 구성 단백질인 BclA의 유전자가 도입된 재조합 항원발현 벡터들을 제조하고자 해당 유전자합성을 진행하였다. 합성된 유전자는 BclA 전장으로 클로닝 작업을 위해 5’, 3’에 각각 BamHI과 SalI restriction enzyme site를 추가하여 복제가 가능한 플라스미드 형태로 합성하였다. 합성된 유전자는 XL1-Blue에 형질 전환하여 다량 확보한 후, 제한효소로 처리하여 대장균 발현벡터에 접합시켰다. 이렇게 얻은 재조합 항원 발현벡터는 XL1-Blue에 형질 전환시킴으로써 상기 항원을 발현시키는 대장균을 얻었다. 단백질 발현에 사용되는 시작코돈 및 종결코돈은 벡터 내에 존재하는 것으로 대체하였다. BclA는 1332bp의 염기서열로 이루어져 있고 그 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

[실시예 2] - 탄저 BclA 재조합 항원 생산 및 정제

클로닝이 확인된 형질전환체는 LB배지에서 37℃, 220rpm으로 배양하였으며, OD600에서 흡광도 값이 0.5일 때, IPTG(Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside)로 induction하였다. 정제를 위해 배양액에서 상층액을 제외한 펠렛은 sonication하여 파쇄하였다. 원심 후, 불용성 단백질을 6M 구아니딘(guanidine)으로 용해시켜 Ni-affinity 정제를 진행하였으며 약 48.8kDa에 해당하는 단일밴드의 단백질 분획을 모아서 20mM carbonate buffer (pH9.6)로 투석하여 면역원으로 사용하였다.

[실시예 3] - 단일클론 항체 제조

1.면역 및 세포 융합

단일클론 항체 제조를 위해 재조합 항원을 Freund's adjuvant로 emulsion을 만든 후 마우스에 면역하였다. 마우스 면역량은 150~450㎍/dose의 농도로 1~2주 간격으로 4~8회 복강면역을 진행하였고, 세포 융합 1~3일 전에 항원을 미정맥으로 접종하였다.

세포 융합 하루 전에 미정맥으로 전채혈을 실시하여 단일클론 항체의 ELISA 검사시 사용하였다. 세포 융합에 사용할 비장은 무균조건 하에서 채취하여 폴리에틸렌글리콜(PEG 1500 시약)을 이용하여, 미엘로마(myeloma) 세포와의 세포 융합을 유도한 후 HAT 배지 및 HT 배지에서 세포 배양하였다.

2. 스크리닝, 복수생산 및 항체 정제

96well에 배양된 융합 세포는 ELISA에 의한 1차 및 2차 스크리닝을 통하여 교차반응이 없는 양성 클론을 선별하였다. 그 결과 얻어진 세포주를 2018.04.17자로 한국세포주은행에 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00429). 이들 세포주를 마우스 복강 접종하여 복수 생산을 하였다. 복강 접종 10~20일 후 복강 내 복수가 생산되면 마우스 당 약 2~4㎖의 복수를 채취하였다. 채취한 복수는 원심분리로 혈구 및 피브린 등을 제거하고 이를 정제에 사용하였다. 마우스 복수 정제는 Protein G chromatography gel을 이용하여 protein G에 특이적인 항체인 마우스 IgG를 정제하였다. 마우스 IgM은 특이적인 gel affinity chromatography 방법을 사용하지 않고, 투석 및 DEAE gel 정제 방법으로 IgM을 정제하여 제제화에 사용하였다. 정제된 단일클론 항체 후보군은 골드(gold)를 이용한 스크리닝으로 선별하였다.

[실시예 4] - 탄저균 탐지키트의 제조

나이트로셀룰로스 멤브레인의 검사선과 대조선 위치에 선별된 항원 특이적 항체 및 대조선용 항체를 각각 코팅하였다. 선별된 항체를 접합한 금접합체를 패드에 분주하여 건조한 후 절단하여 골드패드를 제조하였다. 라미네이터를 이용하여 플라스틱 카드에 멤브레인, 골드패드, 검체패드, 흡습패드를 부착하여 키트를 제조하였다.

[시험예 1] - 감도(검출한계) 시험

탄저균의 검출 한계를 시험하기 위하여, 탄저균의 농도를 희석하면서 감도 평가를 실시하였다. 기존 상용화된 SD 탐지키트(제품명: 생물테러 병원체 및 독소 다중 탐지키트 9, 제조사: 주식회사 에스디)와 실시예 4에서 제조된 탐지키트의 감도 비교평가를 실시하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 총 10회 반복 시험한 결과 검출한계가 1.5x10⁵ cfu/ml로 측정되어, 기존 제품(2.5x10⁶cfu/ml) 대비 감도가 16배 개선되었음을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] - 특이도 시험 1

특이도 평가를 위하여 페스트, 리신, 브루셀라 등 균주 및 독소 9종에 대한 교차 반응(cross reactivity)을 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.

	항목	농도	탄저균 검출키트 반응
1	검체 희석액	N/A	음성
2	페스트	1X10⁸cfu/ml	음성
3	리신	10uf/ml	음성
4	보툴리늄 독소A	200ng/ml	음성
5	야토균	1X10⁸cfu/ml	음성
6	콜레라균 O139	1X10⁸cfu/ml	음성
7	콜레라균 O1	1X10⁸cfu/ml	음성
8	유비저균	1X10⁸cfu/ml	음성
9	브루셀라균	1X10⁸cfu/ml	음성
10	SEB	100ug/ml	음성

상기 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 다른 검체와의 교차 반응이 발생하지 않음을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] - 특이도 시험 2

상기 시험예 2의 9종의 균주 및 독소 이외의 다른 균주 및 독소와의 교차반응 여부를 확인하기 위해 하기 표 2에 개시된 27종의 균주(>1x10⁸ cfu/ml) 또는 독소물질(>100ng/ml)과의 교차반응 시험을 실시하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 교차반응 시험 균주 및 물질 27종에 대하여 교차반응이 나타나지 않음을 확인하였다.

[시험예 4] - 방해물질 시험

소혈청, 사람 혈청, 설탕, 밀가루, 집먼지 등과 같은 탐지키트의 성능에 영향을 미칠 수 있는 예상 저해(방해)물질을 선정하여 특이도 테스트를 진행하여, 방해물질의 영향 유무를 확인하였다.

상기 실험결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

항목	검출결과
항목	방해물질	2.5X10⁶ cfu/ml	3x10⁵ cfu/ml
소 혈청(NCS 1%)	음성	양성	양성
사람 혈청(NHS 5배 희석)	음성	양성	양성
소 알부민 (BSA 1%)	음성	양성	양성
설탕 (Sucrose 10%)	음성	양성	양성
애기분 (Skim milk 10%)	음성	양성	양성
베이킹파우더(포화부유액)	음성	양성	양성
밀가루(포화부유액)	음성	양성	양성
세제(포화부유액)	음성	양성	양성
집먼지(포화부유액)	음성	양성	양성
토양(포화부유액)	음성	양성	양성

상기 표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 10종의 방해물질로부터 방해 작용을 받지 않음을 확인하였다(도3).

[시험예 5] - 재현성 시험

실시예 4에서 제조된 탐지키트가 재현성이 있는지 확인하기 위해 총 20회의 감도 및 특이도 시험을 진행하였다. 감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성검체로 하여 실험하였다.

상기 실험결과를 도 4에 나타내었으며, 모두 재현성이 있는 것으로 확인되었다.

[시험예 6] - 가속 안정성 시험

실시예 4에서 제조된 탐지키트의 유효기간 설정을 위해, 스트립을 55℃, 7주간 보관한 후 1주차 간격으로 꺼내 실온 보관한 스트립과의 감도 및 특이도 비교시험을 실시하였다.

감도 시험을 위해서는 양성 검출 한계 농도에서, 특이도 시험을 위해서는 검체희석액을 음성 검체로 하여 실험을 진행하였다. 실험결과 7주간의 가속 안정성 시험 이후에도 감도와 특이도 모두 이상 없음을 확인하였다.

기탁기관명 : 한국세포주연구재단

수탁번호 : KCLRFBP00429

수탁일자 : 20180417

<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention Standard Diagnostics, Inc. <120> Anthrax diagnostic detection kit using rapid immunochromatography, its specific antibody and antibody-producing cell lines <130> P180023 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BclA protein of Bacillus anthracis <400> 1 Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Gly Ala Ala Thr Cys Ala 35 40 45 Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr 50 55 60 Thr Thr Gly Ala Cys Cys Cys Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Thr 65 70 75 80 Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly 85 90 95 Cys Cys Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Thr Thr Ala 100 105 110 Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys 115 120 125 Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr 130 135 140 Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly 145 150 155 160 Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys 165 170 175 Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly 180 185 190 Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys 195 200 205 Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly 210 215 220 Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys 225 230 235 240 Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala 245 250 255 Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys 260 265 270 Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Cys 275 280 285 Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly 290 295 300 Gly Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys 305 310 315 320 Gly Gly Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Thr 325 330 335 Ala Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys 340 345 350 Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly 355 360 365 Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala 370 375 380 Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Thr Ala 385 390 395 400 Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala 405 410 415 Thr Ala Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr 420 425 430 Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly 435 440 445 Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys 450 455 460 Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys 465 470 475 480 Ala Cys Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys 485 490 495 Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly 500 505 510 Thr Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Gly 515 520 525 Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala 530 535 540 Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys 545 550 555 560 Thr Ala Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr 565 570 575 Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly 580 585 590 Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys 595 600 605 Cys Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys 610 615 620 Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys 625 630 635 640 Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly 645 650 655 Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys 660 665 670 Gly Gly Cys Gly Ala Thr Ala Cys Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala 675 680 685 Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys 690 695 700 Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr 705 710 715 720 Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly 725 730 735 Gly Thr Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys 740 745 750 Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Thr 755 760 765 Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys Cys 770 775 780 Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Gly 785 790 795 800 Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys 805 810 815 Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Ala 820 825 830 Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys 835 840 845 Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly 850 855 860 Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly 865 870 875 880 Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Ala Ala Cys 885 890 895 Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys 900 905 910 Ala Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys 915 920 925 Cys Gly Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr 930 935 940 Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr 945 950 955 960 Gly Cys Thr Thr Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Gly 965 970 975 Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr 980 985 990 Gly Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Cys Cys Gly 995 1000 1005 Gly Thr Cys Cys Cys Gly Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly 1010 1015 1020 Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Gly 1025 1030 1035 1040 Thr Ala Cys Cys Gly Cys Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys Ala Ala 1045 1050 1055 Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Thr 1060 1065 1070 Thr Thr Gly Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys 1075 1080 1085 Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr Thr 1090 1095 1100 Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala 1105 1110 1115 1120 Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr 1125 1130 1135 Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys 1140 1145 1150 Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly 1155 1160 1165 Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Cys 1170 1175 1180 Cys Gly Gly Thr Ala Gly Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys 1185 1190 1195 1200 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 1205 1210 1215 Thr Thr Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr 1220 1225 1230 Thr Ala Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Gly 1235 1240 1245 Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Gly 1250 1255 1260 Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly 1265 1270 1275 1280 Thr Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly 1285 1290 1295 Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly 1300 1305 1310 Cys Ala Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Ala 1315 1320 1325 Ala Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Cys Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys 1330 1335 1340

Claims

탄저균 포자외막 단백질 BclA를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제1항에 있어서, 상기 단백질 BclA가 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
기탁번호 KCLRF-BP-00429로 기탁된 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1에 의하여 생성되고, 탄저균 포자외막 단백질 BclA를 특이적으로 인지하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
기탁번호 KCLRF-BP-00429로 기탁된 세포주 SDV1 BclA 1e 47-1.
제4항에 있어서, 하기 단계로 생산되는 것을 특징으로 하는 세포주:
(i) 단백질 BclA의 염기서열(서열번호 1)을 도입하여 플라스미드(plasmid)를 합성한 후 대장균에 형질전환하여 항원을 발현시키는 단계;
(ii) 상기 항원을 마우스에게 주입하여 면역을 진행한 후 마우스의 비장을 획득하는 단계;
(iii) 상기 비장에서 수득한 B 림프구와 미엘로마(Myeloma) 세포를 융합하는 단계; 및
(iv) 상기에서 수득된 세포를 선별하는 단계.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단일클론 항체를 포함하는 탄저균 탐지키트.
제6항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 나이트로셀룰로스 멤브레인에 코팅된 것을 특징으로 하는 탄저균 탐지키트.
제6항에 있어서, 검체패드 및 흡습패드 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 탄저균 탐지키트.