KR20200026010A - 염증성 장질환 예방 또는 치료용 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트에 관한 것으로, 생체적합성 고분자의 하나인 키토산과 글리시리진을 접합시킴으로써 낮은 체내 흡수율을 개선하고, 우수한 염증 억제 효과를 확인하였다. 고분자량의 키토산과 저분자량의 키토산 올리고당 모두 글리시리진을 접합시킨 그룹에서 더 높은 세포 흡수율을 나타내고, 염증성 장질환을 유도한 마우스에서 대장 길이를 감소시키고, 미세 융모의 손상 정도를 완화시키는 것을 확인하였다.

Description

염증성 장질환 예방 또는 치료용 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트{Biocompatible polymer-Glycyrrhizin Conjugate for Prevention or Treatment of Inflammatory Bowel Diseases}
본 발명은 염증성 장질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 생체적합성 고분자-글리시리진 컨쥬게이트에 관한 것이다.
염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD)은 환경적 요인과 유전적 요인이 상호작용하여 장에서 면역반응 및 염증을 일으키는 만성 질환이다. 크게 위장관 전체에 걸쳐 나타나는 크론병(Chron's disease)과 대장에 국한적으로 나타나는 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로 나눌 수 있으며, 발병률은 궤양성 대장염이 더 높다. 정확한 질병원인은 아직까지 밝혀진 바가 없지만, 면역반응 조절 이상을 중요한 병인으로 보고 있다. 염증성 장질환은 전세계적으로 발병하는 질병이지만 식습관과 관련이 깊어 과거에는 주로 북미와 북유럽에서 호발하였다. 하지만 점차 식습관이 서구화되어 최근에는 우리나라와 일본, 중국을 포함하는 아시아 국가에서도 발병률이 증가하고 있다. 염증성 장질환은 면역 체계 이상으로 장내 미생물의 불균형이 초래되면서 장점막과 장벽이 손상된다. 이 과정에서 발생한 면역 반응에 의해 주요 염증 인자인 TNF-α가 과도하게 생성되고, 무너진 세포 장벽을 통해 염증 인자가 혈액 내로 들어가 순환하게 되며 질병을 악화시킨다. 최근에는 염증성 장질환 치료에 대한 활발한 연구를 통해 장내 염증과 관련된 TNF-α를 공격하는 다양한 생물학적 제제가 개발되었다. 하지만 이러한 항 TNF-α 제제도 환자의 1/3에서는 반응이 없고, 항체 형성으로 인한 치료 효과 감소 및 감염이나 악성 림프종과 같은 심각한 부작용이 우려되고 있다.
따라서 염증성 장질환과 같은 만성 질환을 위한 치료제로 TNF-α와 같은 주요 염증 인자의 생성은 효과적으로 억제하면서 독성 및 면역원성이 적어 장기 투여가 가능한 치료제를 개발하는 것이 필요하다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 천연물 유래의 물질을 이용해서 부작용이 없으면서 생체흡수율이 개선되고, 염증 억제 효과가 우수한 염증성 장질환의 치료, 개선 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 (a) 생체적합성 고분자 백본 및 (b) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, "글리시리진(glycyrrhizin)"은 감초의 뿌리로부터 추출된 천연물로 친수성의 글루쿠론산(glucuronic acid)과 소수성의 글리시르레틴산 (glycyrrhetinic acid)으로 이루어져 있는 양친매성 분자이다. 소수성의 글리시르레틴산은 콜레스테롤과 구조가 상당히 유사하며, 콜레스테롤과 유사한 구조를 갖는 분자들은 지용성으로 막의 지질부위를 통해 세포 안으로 빠르게 확산되는 특징을 가지고 있다. 그러나 글리시리진은 체내 반감기가 짧은 편이어서 약학 제재로 이용하기에는 효율이 떨어지는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명에서는 글리시리진을 생체적합성 고분자의 일종인 키토산과 접합시키고, 자가-조립(self-assembly)된 형태의 나노입자를 제작하였다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태의 글리시리진이다. 상기 산화된 형태의 글리시리진은 도 1에 나타낸 바와 같이, 말단의 글루쿠론산 고리의 2번 탄소 및 3번 탄소 사이의 결합이 산화에 의해 열려(opened) 알데하이드 치환기를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 알데하이드 그룹에 의해 글리시리진은 생체 적합성 고분자 백본과 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "생체적합성 고분자 백본"은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 파괴시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 갖는 고분자를 의미하고, 다수의 글리시리진과 결합을 형성할 수 있는 백본 역할을 하는 고분자를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함한다. 상술한 바와 같이 산화된 형태의 글리시리진은 알데하이드 그룹을 포함하며, 글리시리진의 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 치환기를 포함하는 생체 적합성 고분자라면 제한없이 이용 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본에 포함된 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹 또는 히드록사이드 그룹이다. 바람직하게는 아민 그룹이 포함된 생체적합성 고분자 백본을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본은 글리콜 키토산, 키토산 올리고당, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/ 아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 글리콜 키토산 또는 키토산 올리고당을 생체적합성 고분자 백본으로 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "키토산(chitosan)"은 갑각류의 껍질에서 추출한 천연 고분자로 생체적합성이 우수하고, 독성이 적어 다양한 분야에 널리 이용되고 있다. 키토산은 대장에 존재하는 미생물들에 의해 분해되므로 대장 타겟팅(colon targeting)을 위한 약물 전달에 사용되고 있다. 특히, 키토산은 생체활성 물질로서 높은 염증 억제 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며, 염증과 관련된 다양한 질병을 치료하기 위한 연구가 많이 진행되고 있다. 하지만 키토산은 분자량이 매우 커서 체내 흡수가 낮아 우수한 생리활성을 가지고 있음에도 불구하고 그 응용의 폭이 제한되고 있다. 따라서 최근에는 키토산의 저분자 형태로 흡수 및 효능이 우수한 저분자량의 키토산 올리고당(chitosan oligosaccharide)이 연구에 활용되고 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "염증성 장질환(inflammatory bowel disease)"은 장내의 과도한 면역반응에서 기인한 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환이다. 염증성 장질환 환자는 정상인에 비해 대장암 발병 가능성이 6배 이상 높기 때문에 적기 치료가 필수적이나, 아직까지 염증성 장질환을 근본적으로 치료할 수 있는 약제는 아직 개발되지 못한 실정이다.
본 발명에서, 상기 염증성 장질환은 크론병(Chrohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease) 및 장염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명자들은 천연물로부터 추출한 글리시리진과 키토산을 결합시켜 장점막을 가로질러 투과하는데 적합하다고 알려진 50 내지 150 ㎚ 크기의 나노입자를 형성하였고, 상기 나노입자가 생체 흡수율, 염증 억제 효과 및 장점막 보호 효과가 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구의 예로는 복강, 직장, 정맥, 근육, 피하 주사로 투여될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있다. 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 ㎎/㎏(체중)이다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 (a) 생체적합성 고분자 백본 및 (b) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 실질적으로 생체적합성 고분자 백본-글리시리진 컨쥬게이트를 유효성분으로 사용하므로 염증성 장질환 치료용 약학 조성물과 중복되는 내용은 명세서의 과도한 기재를 피하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하고, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.
본 발명의 식품 조성물은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등의 유효성분으로 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체중조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본-글리시리진 컨쥬게이트를 100 중량부당 0 내지 2,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 생체적합성 고분자 백본-글리시리진 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 99 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 0.002 g 내지 1000 g의 비율로 포함될 수 있다.
본 발명의 생체적합성 고분자 백본-글리시리진 컨쥬게이트는 세포 내로 잘 흡수되고, 염증 억제 효과 및 장점막 보호 효과가 우수하다는 것이 확인되었으므로 염증성 장질환 예방 또는 개선 용도의 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 키토산과 글리시리진을 접합시킴으로써 낮은 체내 흡수율을 개선시켜 효과적인 염증 억제 효과를 확인하였다. 고분자량의 키토산과 저분자량의 키토산 올리고당 모두 글리시리진을 접합시킨 그룹에서 더 높은 세포 흡수율을 나타내고, 염증성 장질환을 유도한 마우스에서 대장 길이를 감소시키고, 미세 융모의 손상 정도를 완화시키는 것을 확인하였다.
도 1은 글리콜 키토산-글리시리진(chitosan-GL) 및 키토산 올리고당-글리시리진(chitosan oligosaccharide-GL, COS-GL) 컨쥬게이트의 개략적인 합성과정을 나타낸다.
도 2는 합성된 chitosan-GL과 COS-GL을 H-NMR(nuclear magnetic resonance)로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 합성된 chitosan-GL과 COS-GL을 FT-IR 분광광도계(fourier transform infrared spectroscopy)로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 증류수에 녹인 chitosan-GL(0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎖ 농도)을 PTA(phosphotungstic acid)로 염색한 후, 투과 전자 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5는 면역세포인 RAW267.4 세포에 대한 chitosan-GL과 COS-GL의 세포 독성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 장 상피세포인 caco-2 세포에서 chitosan-GL과 COS-GL의 세포 독성 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 RAW267.4 세포에 chitosan-GL, COS-GL, 글리콜 키토산(GC), 키토산 올리고당(COS) 또는 글리시리진(GL)을 각각 처리한 후 TNF-α의 분비량 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 RAW267.4 세포에 chitosan-GL 또는 COS-GL을 각각 처리한 후 세포의 형태 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 RAW267.4 세포에 글리콜 키토산(GC), 키토산 올리고당(COS) 또는 글리시리진(GL)을 각각 처리한 후 세포의 형태 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 caco-2 세포 단일층에서 chitosan-GL과 COS-GL의 세포내 흡수 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 caco-2 세포 단일층에서 chitosan-GL과 COS-GL의 세포내 흡수율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 caco-2 세포 단일층에 LPS(lipopolysaccharides)와 chitosan-GL 또는 COS-GL을 처리한 후 TEER(transepithelial electrical resistance)을 수행한 결과를 나타낸다.
도 13은 caco-2 세포에 chitosan-GL 및 COS-GL을 각각 처리한 후, 세포내 칼슘 농도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 궤양성 대장염 동물모델에 chitosan-GL 또는 COS-GL을 7일 동안 투여한 후, 대장의 길이 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 궤양성 대장염 동물모델에 chitosan-GL 또는 COS-GL을 7일 동안 투여한 후, 장점막 조직의 손상 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 글리콜 키토산-글리시리진 및 키토산 올리고당-글리시리진 나노입자 제조
글리시리진(glycyrrhizin; 이하, GL로 기재함)을 CBS(Citrate-buffered saline) 버퍼에 용해시키고, 산화제인 과요오드산 나트륨(sodium periodate)를 첨가한 후 90분 동안 반응시켜 알데하이드 그룹(aldehyde group)을 갖는 산화된 글리시리진(oxidized glycyrrhizin)을 합성하였다. 글리콜 키토산(glycol chitosan, GC)을 CBS 버퍼에 용해시켜 산화된 글리시리진 용액에 첨가한 후 24시간 동안 반응시켜 글리콜 키토산의 아민 그룹(amine group)과 산화된 글리시리진의 알데하이드 그룹을 결합시켰다. 이 결합을 안정화시키기 위하여 시아노보로하이드라이드(cyanoborohydride)를 첨가한 후 24시간 동안 반응시켰다. 최종 반응액을 pH 9.5의 CBS 버퍼에서 48시간 동안 투석(dialysis)하고, 이후 증류수에서 72시간 동안 추가로 투석한 후 동결건조시켜 글리콜 키토산-글리시리진(glycol chitosan-glycyrrhizin; 이하, chitosan-GL로 기재함) 분말을 수득하였다. 상기 분말을 증류수에 녹이고, 37℃에서 30분 동안 소니케이션(sonication)하여 자가-조립(self-assembly)된 나노입자를 제조하였다 (도 1).
한편, 키토산 올리고당-글리시리진(chitosan oligosaccharide(COS)-glycyrrhizin; 이하, COS-GL로 기재함) 나노입자를 상기와 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 2: 키토산과 글리시리진의 결합 여부
2-1. H-NMR 분석
합성 전 물질인 글리콜 키토산, 키토산 올리고당(chitosan olygosaccharide), 글리시리진 및 산화된 글리시리진(oxidized GL)과 합성 후 물질인 chitosan-GL 및 COS-GL에 대하여 600Hz H-NMR로 각각의 스펙트라(spectra)를 측정하였다.
측정 결과, 산화 전의 글리시리진에서는 발견되지 않은 8.2 ppm과 8.4 ppm 피크값이 산화된 글리시리진에서 나타나는 것으로 보아 알데하이드 그룹이 생성된 것을 알 수 있었다. 합성 후 물질인 chitosan-GL과 COS-GL에서는 알데하이드 그룹이 반응에 이용되어 8 ppm 부근에서 피크값이 나타나지 않았으며, 글리시리진에만 특이적으로 존재하는 5.5 ppm 부근의 피크값이 나타나는 것으로 보아 COS-GL 합성이 정상적으로 이루어진 것을 확인할 수 있었다(도 2).
2-2. FT-IR 분석
합성 전 물질인 글리콜 키토산, 키토산 올리고당, 글리시리진 및 산화된 글리시리진과 합성 후 물질인 chitosan-GL 및 COS-GL에 대하여 FT-IR 분광광도계 (fourier transform infrared spectroscopy) 스펙트라를 측정하였다.
그 결과, 합성 전의 물질인 글리콜 키토산과 키토산 올리고당에 각각 존재하는 피크(각각 3358 ㎝-1 및 1587 ㎝-1, 3347 ㎝-1 및 1590 ㎝- 1)와 글리시리진에 존재하는 피크(1358 ㎝- 1)가 합성 후 물질인 chitosan-GL 및 COS-GL에 각각 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한, 산화된 글리시리진에서 알데하이드 그룹의 존재로 나타나는 피크(1615 ㎝- 1)가 chitosan-GL 및 COS-GL에서는 각각 1606 ㎝-1, 1607 ㎝-1로 나타나 쉬프트(shift)가 발생한 것을 확인할 수 있었다(도 3).
2-3. 자가-조립된 chitosan - GL 나노입자 확인
증류수(DW)에 녹인 chitosan-GL (0.01, 0.1 및 1 ㎎/㎖ 농도)에 대하여 1% PTA(phosphotungstic acid) 염색약으로 네거티브 염색(negative staining)을 수행하였다. 투과 전자 현미경으로 염색된 chitosan-GL을 확인한 결과 chitosan-GL 나노입자가 형성된 것을 알 수 있었으며, 나노입자의 크기는 이미지 J(image J)로 측정하였다(도 4).
실시예 3: chitosan - GL 및 COS- GL의 세포 독성
3-1. RAW267 .4 세포
비활성화된 면역세포인 RAW267.4 세포를 음성 대조군, LPS (lipopolysaccharide)로 활성화된 RAW267.4 세포는 양성 대조군으로 설정하였다. chitosan-GL과 COS-GL은 LPS(1 ㎍/㎖)와 함께 각각 0.01, 0.1, 0.5, 1, 1.5 및 2.5 ㎎/㎖ 농도로 배지에 녹이고, RAW267.4 세포에 처리하여 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각각의 상층액을 1.5 ㎖ 튜브에 회수하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 세포 카운팅 키트-8 용액(cell counting kit-8)을 배지 부피의 10%로 처리하여 37℃에서 3시간 동안 배양하고, 이후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, chitosan-GL과 COS-GL 모두 1 ㎎/㎖ 농도까지 RAW267.4 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다(도 5).
3-2. Caco -2 세포
장 상피세포 세포주인 caco-2 세포에 chitosan-GL과 COS-GL을 각각 0.01, 0.1, 0.5, 1, 1.5 및 2.5 ㎎/㎖ 농도로 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 새로운 배지로 교체하고, 배지 부피의 10%로 세포 카운팅 키트-8 용액을 처리하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, chitosan-GL은 1.5 ㎎/㎖ 농도부터 독성을 나타내고, COS-GL은 2.5 ㎎/㎖ 농도부터 독성을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 6).
이 결과를 통해 분자량이 낮은 COS-GL이 고분자량의 chitosan-GL보다 독성이 적은 것을 확인하였고, 이후 실험에서는 chitosan-GL 및 COS-GL 모두 독성이 나타나지 않은 최대 농도인 1 ㎎/㎖을 사용하였다.
실시예 4: chitosan - GL 및 COS- GL의 염증 억제 효과
4-1. TNF -α 분비량 측정
상기 실시예 3-1에서 회수했던 chitosan-GL 및 COS-GL 처리군의 상층액에서 주요 염증 인자인 TNF-α의 분비량을 ELISA 키트로 측정하였다. 그 결과, chitosan-GL과 COS-GL 처리군 모두 0.5 ㎎/㎖ 처리 농도에서부터 TNF-α의 분비량이 감소하기 시작하였으며, 1 ㎎/㎖ 처리 농도에서는 두 그룹 모두 TNF-α의 분비량이 70% 정도 감소하였다(도 7의 A).
또한, 세포 독성이 없는 1 ㎎/㎖ 처리 농도에서 chitosan-GL, COS-GL, GC, COS 및 GL 처리군의 TNF-α 분비량을 측정하였다. GC는 활성화된 Raw 264.7 세포의 TNF-α 분비량을 약 10% 감소시켰으나 유의성이 없었고, COS는 TNF-α의 분비량을 약 30% 정도 감소시켰다(도 7의 B). 이러한 결과는 GC 또는 COS 자체만으로 목적하는 염증 억제 효과를 얻으려면 고농도로 처리해야 한다는 것을 의미한다.
추가로 키토산과 GL의 질량비를 고려한 농도에서 chitosan-GL (1 ㎎/㎖), COS-GL (1 ㎎/㎖), GC (0.999 ㎎/㎖), COS (0.888 ㎎/㎖), GL (0.001 또는 0.112 ㎎/㎖) 처리군의 염증 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 활성화된 Raw 264.7 세포의 TNF-α 분비량과 비교하여 GC, COS 및 GL 처리군에서는 TNF-α 분비량이 전혀 감소하지 않았다. 이러한 결과는 GC와 COS의 세포내 흡수 효율이 낮기 때문일 것으로 추측되며, chitosan-GL과 COS-GL의 우수한 염증 억제 효과는 GL과의 결합을 통하여 GC와 COS의 세포내 흡수 효율이 증가한 것에 기인할 것으로 예상된다.
4-2. RAW267 .4 세포의 형태 변화 확인
RAW267.4 세포는 활성화되면 동그란 세포 형태가 방사형으로 바뀌는 특징이 있다. RAW267.4 세포에 chitosan-GL 또는 COS-GL을 다른 농도로 처리한 후 광학 현미경으로 세포의 형태 변화를 확인하였다. 형태학적 분석 결과, chitosan-GL 1 ㎎/㎖ 처리군과 COS-GL 1 ㎎/㎖ 처리군에서 방사형 세포(활성화된 세포)가 현저히 적음을 알 수 있었다(도 8).
키토산과 GL의 질량비를 고려한 농도에서 RAW267.4 세포의 형태 변화를 관찰하였다. 그 결과, 대조군(activated-Raw)과 비교하여 GL 1 ㎎/㎖ 처리군에서만 방사형 세포들이 비교적 적은 것을 알 수 있었다. 모든 농도의 GC, COS 처리군 또는 GL 0.001 및 0.112 ㎎/㎖ 처리군에서는 대조군과 비슷하게 많은 세포들이 방사형이었다(도 9).
실시예 5: chitosan - GL 및 COS- GL의 인 비트로( in vitro ) 실험
5-1. Caco -2 세포 내 흡수 정도 확인
형광 발현량의 차이를 통해 세포내 흡수 정도를 확인하기 위하여 FITC(Fluorescein isothiocyanate)의 이소티오시아네이트 그룹(isothiocyanate group)과 키토산의 아민 그룹을 반응시켜 FITC-chitosan-GL, FITC-GC, FITC-COS-GL 및 FITC-COS를 각각 합성하였다.
장 상피세포 유래 caco-2 세포에 FITC-chitosan-GL, FITC-GC, FITC-COS-GL, FITC-COS를 각각 1 ㎎/㎖ 농도로 처리하고, 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 1회 세척한 후 새로운 배지를 첨가하였다. 처리 후 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간대에서의 형광의 발현 정도를 확인하였고, 이미지 J로 정량화하였다.
그 결과, GC와 COS 모두 글리시리진과 결합된 경우에 시간에 따른 세포내 흡수율이 더 크게 증가하고, GC보다 COS의 흡수율이 더 높은 것을 알 수 있었다(도 10 및 도 11). 이를 통해 지질용해도가 높거나, 분자량이 작은 분자가 세포막의 지질 이중층을 통해 세포 내로 잘 확산되는 것을 알 수 있었다.
5-2. 손상된 caco -2 세포 단일층의 개선 여부 확인
단일층(monolayer) 형성을 위해 caco-2 세포를 37℃에서 21일 동안 배양하고, 3일마다 새로운 배지로 교체해주었다. 단일층이 충분히 형성되었는지 현미경으로 확인한 후, 볼트 옴 미터(volt ohm meter)로 저항값을 측정하여 900 Ω/㎠ 이상이 되는지 확인하였다. 세포를 아무것도 처리하지 않은 비히클(vehicle), LPS(20 ㎍/㎖) 처리군, LPS(20 ㎍/㎖)+chitosan-GL(1 ㎎/㎖) 처리군, chitosan-GL(1 ㎎/㎖) 처리군으로 나누어 실험을 진행하였다. 시간은 해당 실험 조건 처리 후 0분, 15분, 30분, 1시간, 1시간 30분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간으로 나누고, 각 처리군마다 저항값을 측정하여 TEER (transepithelial electrical resistance)을 진행하였다.
실험 결과, LPS 처리군에서는 시간이 경과할수록 저항값이 떨어지는 것을 통해 caco-2 세포의 단일층이 손상된 것을 알 수 있었고, LPS+chitosan-GL 처리군은 비히클과 유사한 저항값을 유지하는 것으로 보아 LPS로 인한 세포 손상으로부터 보호되는 것을 알 수 있었다(도 12).
5-3. caco -2 세포내 칼슘 농도 변화 확인
Chitosan-GL에 의한 caco-2 세포 단일층의 손상 보호 효과가 세포내 칼슘 농도 변화와 관련이 있는지 확인하기 위해 Rhod4 calcium assay kit(Abcam, 미국)로 실험을 진행하였다.
세포가 단일층을 형성하도록 caco-2 세포를 96 웰 플레이트에서 약 10일 동안 배양하고, 3일 간격으로 새로운 배지로 교환해주었다. 10일 후 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 후 Rhod4 스톡 용액을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. Rhod4 스톡 용액이 첨가된 상태에서 caco-2 세포에 각각 chitosan-GL 0.5 또는 1 ㎎/㎖, COS-GL 0.5 또는 1 ㎎/㎖을 처리하였다. 분광계(spectrometer)로 Ex 540 ㎚/Em 590 ㎚에서 형광 강도를 측정하고, 형광 현미경으로 이미지를 촬영하여 정량 및 정성 분석을 수행하였다.
그 결과, chitosan-GL 또는 COS-GL 처리군 모두에서 세포내 칼슘의 농도가 증가하고, 칼슘 증가량은 처리 농도에 의존하는 것을 확인할 수 있었다(도 13). 따라서, 상기 실시예 5-2에서 확인하였던 chitosan-GL의 caco-2 세포 밀착 결합(tight junction) 강화 효과는 세포내 칼슘 농도의 증가로 인한 것임을 알 수 있었다.
실시예 6: chitosan - GL 및 COS- GL의 염증성 장질환 예방 효과
6-1. 궤양성 대장염 예방 효과
염증성 장질환 중에서 대장에 국한되어 나타나는 궤양성 대장염의 질병 모델을 만들기 위해 8주령의 C57BL/6 마우스에 2.5% DSS(dextran sodium sulfate)가 포함된 음용수를 7일 동안 투여하고(대조군), 매일 몸무게 및 대변 상태를 확인하였다. 실험군은 2.5% DSS가 포함된 음용수를 투여하고, 동시에 chitosan-GL 10 ㎎/㎏/day, COS-GL 10 ㎎/㎏/day를 각각 경구 투여 및 복강 투여로 나누어 7일 동안 투여하였다. 7일 후 마우스의 대장 조직을 꺼내 길이를 측정하였다.
그 결과, 대조군과 실험군 사이에서 몸무게는 유의한 차이가 존재하지 않았지만, 궤양성 대장염이 유도되어 대장 길이가 감소한 대조군(2.5% DSS 투여군)에 비해 실험군(2.5% DSS+chitosan-GL 투여군, 2.5% DSS+COS-GL 투여군)에서는 대장 길이가 유의하게 증가한 것을 확인하였다(도 14).
6-2. 장점막 보호 효과
8주령의 C57BL/6 마우스에 각각의 조건(2.5% DSS 투여군, 2.5% DSS+chitosan-GL 경구 투여군, 2.5% DSS+COS-GL 경구 투여군, 2.5% DSS+chitosan-GL 복강 투여군 및 2.5% DSS+COS-GL 복강 투여군)으로 7일 동안 약물을 투여한 후 대장 조직을 채취하였다. 대장 조직 내에 존재하는 배설물들을 제거한 뒤, 원형으로 말아서 4% 포르말린 용액에서 3일 동안 고정시켰다. 고정된 조직을 충분히 수세하고, 파라핀 블록을 제작하였다. 조직용 섹션(section) 기기를 사용하여 각 실험군마다 조직 슬라이드를 만든 후, 헤마토실린&에오신(H&E) 염색을 수행하였다.
염색 후 광학현미경으로 조직 상태를 관찰한 결과, 2.5% DSS 투여군은 대장 조직의 미세융모가 많이 손상되어 있고, 대장 조직에 면역세포가 상당히 침투한 것을 확인하였다. 그러나 실험군에서는 상기 현상이 비교적 감소하였다. 특히, 대장 길이 감소가 가장 적었던 2.5% DSS+chitosan-GL 경구 투여군, 2.5% DSS+COS-GL 경구 투여군 및 2.5% DSS+COS-GL 복강 투여군에서는 미세융모가 상당히 온전하게 유지되고 있었으며, 면역세포의 침투 또한 거의 발견되지 않았다(도 15).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. (a) 생체적합성 고분자 백본 및 (b) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리시리진은 산화된(oxidized) 형태인 것인, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 백본은 알데하이드 그룹과 화학 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함하는 것인, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 기능기는 아민 그룹, 카복실 그룹, 티올 그룹, 또는 히드록사이드 그룹인 것인, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기능기는 아민 그룹인 것인, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자 백본은 글리콜 키토산, 키토산 올리고당, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리(N-비닐피롤리돈) 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 크론병(Chrohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease) 및 장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. (a) 생체적합성 고분자 백본 및 (b) 상기 생체적합성 고분자 백본에 결합된 글리시리진을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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