KR20200025197A

KR20200025197A - 인삼 추출물을 포함하는 암전이 억제용 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20200025197A
Application number: KR1020180102179A
Authority: KR
Inventors: 함정엽; 김태정; 박영태; 최필주; 정봉철; 최선준; 송봉근; 김진철
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2020-03-10
Also published as: KR102190909B1

Abstract

진세노사이드 Rk1 및 Rg5 중 하나 이상을 유효 성분으로서 포함하는 암의 전이를 억제하기 위한 조성물, 및 그의 용도를 제공한다.

Description

인삼 추출물을 포함하는 암전이 억제용 조성물 및 그의 용도{Composition for inhibiting metastasis of cancer comprising extract of ginseng and use thereof}

진세노사이드 Rk1 및 Rg5 중 하나 이상을 유효 성분으로서 포함하는 암의 전이를 억제하기 위한 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

암(cancer)이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생하는 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 악성종양이라고도 한다. 일반적으로 암은 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에서 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전하여 최종적으로 사망에 이루게 된다.

암전이 과정은 암세포의 이동, 침윤, 혈관 내 이동, 전이 가능한 장기에 흡착 및 성장으로 구성된다. 특히 이러한 암전이 과정에서 암세포의 이동과 침윤이 일어나기 위해서는 우선적으로 암세포는 상피 간엽세포 전환(Epithelial to Mesenchymal Transition: EMT)이라는 현상을 겪게 된다. EMT 현상은 저산소 상황, 약물 저항성 획득, 다양한 사이토카인의 자극 등에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다. 그 중 전환성장인자(Transforming growth factor-β1: TGF-β1), 상피성장인자(Epidermal growth factor: EGF), 및 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor: FGF) 및 간세포성장인자(hepatocyte growth factor: HGF)가 대표적인 암 전이 유도 사이토카인으로 알려져 있다.

암은 국내에서 사망 원인 통계를 작성하기 시작한 1983년 이후 한 해도 빠지지 않고 사망 원인 1위를 기록하고 있다. 특히 암 중에서 폐암으로 사망하는 환자는 2014년 기준 가장 발생 빈도가 높으며, 그 다음으로 간암, 위암, 대장암 및 췌장암에 이른다.

현재 암을 치료하는 방법으로는 초기에 발견되는 암일 경우 수술, 항암제, 방사선 치료 등이 이용되고 있으나 사망의 주된 원인은 암세포의 전이에 의해 유발된다. 따라서 암세포의 이동이나 침윤을 억제하는 기전의 규명이나 효과적인 치료 약물 개발이 많은 연구자들의 주된 표적이 되고 있다. 이에 암 치료를 위한 새로운 접근방법으로 독성이 비교적 낮은 천연물로부터 부작용이 적고 암 종의 전이를 억제하거나 감소시키는 효능이 뛰어난 발암 억제제 및 암 치료제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다.

인삼(Panax ginseng)은 식물 분류학상 파낙스(Panax)속 오가피과(Araliaceae)에 속하는 다년생 식물로서, 인삼과 유사한 효능을 갖는 파낙스속 식물로는 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼(Panax pseudoginseng), 베트남삼(Panax vietnamensis) 등이 있다. 이러한 파낙스속 식물에는 다른 식물과는 달리 담마란(dammarane) 골격에 1-4개의 당이 결합되어 있는 담마란계 사포닌을 공통으로 함유하고 있다. 특히 인삼에 함량이 높은 사포닌은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg1, Re 등이며, 이러한 사포닌 성분들은 다양한 약효를 나타내는데 그 구조에 따라 약효의 종류와 강도가 매우 다르다.

[화학식 Ⅰ]

파낙스속 식물의 담마란계 사포닌은 프로토파낙사디올 (protopanaxadiol: PPD) 또는 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol: PPT)을 모핵으로 가지며, 화학식 Ⅰ과 같이 표시될 수 있다. 화학식 Ⅰ 중 R₁, R₂, 및 R₃에 따라 담마란계 사포닌은 다음과 같이 분류될 수 있다.

그룹	진세노사이드	R₁	R₂	R₃
프로토파낙사디올	Ra1	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(pyr)-Xyl
	Ra2	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(fur)-Xyl
	Ra3	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara-Xyl
	Rb1	-Glc-Glc	-H	-Glc-Glc
	Rb2	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(pyr)
	Rb3	-Glc-Glc	-H	-Glc-Xyl
	Rc	-Glc-Glc	-H	-Glc-Ara(fur)
	Rd	-Glc-Glc	-H	-Glc
	Rg3(20-S,R)	-Glc-Glc	-H	-H
	Rh2(20-S,R)	-Glc	-H	-H
	Rs1	-Glc-Glc-Ac	-H	-Glc-Ara(pyr)
	Rs2	-Glc-Glc-Ac	-H	-Glc-Ara(fur)
	Rs3	-Glc-Glc-Ac	-H	-H
	malonyl-Rb1	-Glc-Glc-malonyl	-H	-Glc-Glc
	malonyl-Rb1	-Glc-Glc-malonyl	-H	-Glc-Ara(fur)
	malonyl-Rb1	-Glc-Glc-malonyl	-H	-Glc
	pseudoginsenoside F2	-Glc	-H	-Glc
	notoginsenoside Fe	-Glc	-H	-Glc-Ara(fur)
프로토파낙사트리올	Re	-H	-OGlc-Rha	-Glc
	Rf	-H	-OGlc-Glc	-H
	Rg1	-H	-OGlc	-Glc
	Rg2(20-S,R)	-H	-OGlc-Rha	-H
	Rh1(20-S,R)	-H	-OGlc	-H
	notoginsenoside R1	-H	-OGlc-Xyl	-Glc
	notoginsenoside R2	-H	-OGlc-Xyl	-H
	pseudoginsenoside F1	-H	-OH	-Glc
	pseudoginsenoside F8	-Glc-Glc-Ac	-OH	-Glc-Glc
	pseudoginsenoside F3	-H	-OH	-Glc-Ara(pyr)
	Rh4	-H	-OGlc	-methyl

Rg5와 Rk1은 각각 화학식 Ⅱ 및 화학식 Ⅲ으로 표시될 수 있는 화합물로서, 화학식 중 R₁은 -Glc-Glc이고, R₂는 -H이다.

[화학식 Ⅱ]

[화학식 Ⅲ]

프로토파낙사디올계 진세노사이드인 Rb1과 Rb2는 20번 위치에서 -Glc-Glc 또는 -Glc-Ara(pyr)의 이탈에 의하여 20(S)-Rg3 또는 20(R)-Rg3가 생성될 수 있다. 또한, 20(S)-Rg3 또는 20(R)-Rg3는 20번 위치에서 H₂O의 이탈에 의하여 Rg5 및 Rk1이 생성될 수 있다. 진세노사이드 Rg5는 항산화효과, 뇌기능 및 인지기능 개선효과, 혈관 이완효과, 혈소판 응집억제 효과, 피부염 및 건선 개선 효과, 및 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 진세노사이드 Rk1은 혈관이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 뇌기능 및 인지기능 개선효과가 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 종래 기술에 의하더라도, 암 전이를 억제하는 대안적 조성물에 대한 욕가 있다.

일 양상은 진세노사이드 Rk1 및 Rg5 중 하나 이상을 유효 성분으로서 포함하는 암의 전이를 억제하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

상기 조성물은 진세노사이드 Rg3을 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 파낙스속 식물 또는 그 추출물을 마이크로웨이브 조사하여 얻어진 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90 % 이상 함유된 파낙스속 식물 추출물을 포함할 수 있다. 상기 추출물은 예를 들면, 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 98% 내지 100%, 또는 100%인 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로웨이브 조사 가공된 추출물은 진세노사이드 (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율이 현저히 높으며, 예를 들면, (Rg5+Rk1)/(Rg3)가 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상일 수 있다.

상기 조성물은 Rk1 및 Rg5를 조성물 중량에 대하여 15 내지 40 중량% 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 Rk1 및 Rg5는 개체에서 폐암 세포의 사멸을 유도하는 농도 미만으로 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 Rk1 및 Rg5는 40 mg/kg의 50 % 미만, 40 % 미만, 30 % 미만, 20 % 미만, 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만, 또는 0.1 % 미만의 양으로 투여하기 위한 것일 수 있다.

상기 마이크로웨이브 조사 가공된 추출물은 단순 열처리 가공물에 비해 진세노사이드 Rg3+Rg5+Rk1, 특히 Rg5 및 Rk1의 함량이 높으므로 증강된 진세노사이드 Rg3+Rg5+Rk1, 특히 Rg5 및 Rk1의 약효를 가질 수 있다. 상기 추출물은 파낙스속 식물 추출물을 마이크로웨이브 조사시키거나 파낙스속 식물을 마이크로웨이브 조사시킨 다음 추출 용매로 추출하여 얻어질 수 있다. 상기 추출물은 파낙스속 식물 추출물을 마이크로웨이브 조사시키거나 파낙스속 식물을 마이크로웨이브 조사시킨 다음 추출 용매로 추출하여 얻어진 조 추출물을 물에 녹인 수용액을 DIAION HP20 칼럼에 흘려주어 결합시킨 후, 물 및 20-50 v/v%의 저 농도의 에탄올로 용출한 후, 60-100 v/v% 에탄올로 용출하여 얻어진 Rg5 및 Rk1을 포함하는 분획물일 수 있다.

진세노사이드 Rg3는 신경보호 작용, 혈소판 응집 억제, 항산화 효과, 항염증 작용, 신장 보호작용, 및 항피로 효과를 가지고 있다고 알려져 있다. 진세노사이드 Rg5는 항산화효과, 뇌기능 및 인지기능 개선효과, 혈관 이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 피부염 및 건선 개선 효과, 및 항염증 효과를 가지고 있다. 진세노사이드 Rk1은 혈관 이완 효과, 혈소판 응집억제 효과, 및 뇌기능 및 인지기능 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 마이크로웨이브 가공 처리된 파낙스속 식물 또는 그의 추출물은 Rg3, Rg5, Rk1 함량이 증가된 것으로서, 발명자들은 마이크로웨이브 조사 가공물을 폐암 세포주에 처리하여 세포 이동 및 침윤 저해 등을 통해 암 전이 억제 효과를 입증하였다.

상기 마이크로웨이브 조사는 파낙스속 식물 또는 파낙스속 식물 추출물에 마이크로웨이브를 조사하여 가열하는 열적 반응(thermal reaction)을 의미한다. 마이크로웨이브는 1 m 내지 1 mm의 파장을 갖는 라디오파, 또는 300MHz 내지 300GHz의 주파수를 갖는 라디오일 수 있다. 마이크로웨이브 조사 시간, 온도, 및 압력 등의 조건은 반응물의 양이나 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 마이크로웨이브 조사는 150℃ 내지 190℃, 예를 들면, 160℃ 내지 190℃, 170℃ 내지 190℃, 180℃ 내지 190℃, 150℃ 내지 180℃, 150℃ 내지 170℃, 150℃ 내지 160℃, 170℃ 내지 180℃, 또는 160℃ 내지 170℃에서 수행될 수 있다. 또한, 마이크로웨이브 조사는 30 내지 90 분, 30 내지 80 분, 30 내지 70 분, 30 내지 60 분, 30 내지 50 분, 30 내지 40 분, 40 내지 90 분, 50 내지 90 분, 60 내지 90 분, 70 내지 90 분, 80 내지 90, 50 내지 80 분, 60 내지 80 분, 70 내지 80 분, 또는 50 내지 70 분 동안 수행할 수 있다. 마이크로웨이브 조사는 가압 하에서, 예를 들면, 1 내지 100 기압, 2 내지 100 기압, 5 내지 100 기압, 7 내지 100 기압, 10 내지 100 기압, 15 내지 100 기압, 1 내지 80 기압, 2 내지 80 기압, 5 내지 80 기압, 7 내지 80 기압, 10 내지 80 기압, 15 내지 80 기압, 1 내지 50 기압, 2 내지 50 기압, 5 내지 50 기압, 7 내지 50 기압, 10 내지 50 기압, 15 내지 50 기압, 1 내지 30 기압, 2 내지 30 기압, 5 내지 30 기압, 7 내지 30 기압, 10 내지 30 기압, 또는 15 내지 30 기압의 압력 하에서 수행되는 것일 수 있다.

마이크로웨이브 조사는 중성 용액, 예를 들면, 수성 용액 중에서 조사되는 것일 수 있다. 마이크로웨이브의 출력은 특별히 한정되는 것은 아니며, 반응물의 양에 따라 적절히 증감될 수 있고 예를 들어 50 내지 1000W, 예를 들면, 100 내지 700W의 마이크로웨이브가 사용될 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사 조건은 특별히 한정되는 것은 아니며, 마이크로웨이브 조사에 의해 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90% 이상 함유되도록 하는 임의의 반응 조건을 포함할 수 있다. 또한, (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율이 2 이상, 3이상, 4이상 또는 5 이상이 되도록 할 수 있는 임의의 반응을 포함할 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사의 생성물은 그대로 사용될 수도 있으나, 건조물 또는 동결 건조물로서 함유될 수도 있다. 일 구체예에서, 마이크로웨이브 조사는 파낙스 속 식물 또는 파낙스 속 식물 추출물을 포함하는 수성 용액에 대하여, 30분90 분 동안 150 내지 190 ℃에서 가압 하에서 예를 들면 1 내지 100 기압, 2 내지 100 기압, 5 내지 100 기압, 7 내지 100 기압, 10 내지 100 기압, 15 내지 100 기압, 1 내지 80 기압, 2 내지 80 기압, 5 내지 80 기압, 7 내지 80 기압, 10 내지 80 기압, 15 내지 80 기압, 1 내지 50 기압, 2 내지 50 기압, 5 내지 50 기압, 7 내지 50 기압, 10 내지 50 기압, 15 내지 50기압, 1 내지 30 기압, 2 내지 30 기압, 5 내지 30 기압, 7 내지 30 기압, 10 내지 30 기압, 또는 15 내지 30기압에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 파낙스속 식물은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Re, Rg1, Rc, 및 Rd 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 파낙스속 식물로는 인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼(Panax pseudoginseng), 베트남삼(Panax vietnamensis), 이들의 배양근, 열처리 또는 효소처리 가공물, 또는 이들의 조합이 이용될 수 있다. 상기 열처리 가공물은 홍삼, 흑삼을 포함한다. 바람직하게는 인삼이 사용될 수 있다.

상기 마이크로웨이브 조사의 반응물에 해당하는 파낙스속 식물 추출물은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, 및 Rd 중 하나 이상을 포함하는 임의의 파낙스속 식물의 추출물일 수 있다. 또한, Re, 및/또는 Rg1을 더 포함하는 것일 수 있다. 파낙스속 식물 추출물은 조추출물일 수도 있으며 추가적인 용매 분획이나 크로마토그래피에 의해 정제된 정제물일 수도 있다. 예를 들어 파낙스속 식물의 물, C1-C6 알콜, 또는 이들의 혼합물의 조추출물; 그 조추출물의 n-헥산, 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 이들의 혼합물의 용매 분획물; 또는 그 용매 분획물의 정제물일 수 있다. 상기 물, C1-C6 알콜, 또는 이들의 혼합물의 조추출물은 예를 들면, 메탄올 또는 에탄올의 조추출물일 수 있다. 추출 시 용매를 식물 분량의 약 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것, 예를 들면, 약 10 배 첨가하여 추출하는 것 일 수 있다. 상기 용매를 가한 후 가열 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등의 통상의 방법으로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출이 이용될 수 있다. 추출시 용매의 온도는 약 50 내지 200 ℃, 예를 들면, 120 ℃일 수 있다. 또한, 추출시간은 약 2 내지 4 시간, 예를 들면 약 3 시간일 수 있다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5 회, 예를 들면 3 회 반복 추출하는 것 일 수 있다. 이러한 방법에 의하여 얻어진 조추출물을 상기 파낙스속 식물 추출물로서 사용할 수도 있으나, 상기 조추출물을 추가적으로 유기용매로 추출한 용매 분획물이 이용될 수도 있다.

상기 유기용매 분획물은 상기 조추출물을 메틸렌클로리드, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 또는 이들의 혼합물 등으로 추출한 분획물일 수 있다. 상기 유기 용매 분획물을 더욱 정제한 정제물을 상기 파낙스속 식물 추출물로서 사용할 수도 있으며, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피에 의해 진세노사이드 Rb1, Rb2, Re, Rg1, Rc, 및 Rd 중 하나 이상을 더욱 정제할 수 있다. 상기한 마이크로웨이브 조사 가공물은 얻어진 추출물 중 진세노시사이드 총 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 함유된 것일 수 있다. 상기 진세노사이드 총 중량은 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5 또는 Re, Rg1, Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량일 수 있다. 상기한 마이크로웨이브 조사 가공물은 용매에 의하여 추출된 것으로서, 분획되지 않은 상태의 것일 수 있다.

상기 조성물은 상기 추출물 또는 분획물을 조성물 중량에 대하여 15 내지 40 중량% 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 암은 폐암, 흑색종(melanoma), 간암, 경부암(cervial cancer), 결장암, 췌장암, 위암, 또는 유방암일 수 있다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 약학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다.

다른 양상은 치료적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

상기 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있다.

용어 "치료적으로 유효한 양"은 개체에서 암의 전이를 억제하는데 효과적인 양일 수 있다. 상기 투여는 개체의 체중 kg 당 일당 0.01 mg 내지 10 g, 0.01 mg 내지 5 g, 0.1 mg 내지 10 g, 1.0 mg 내지 10 g, 10 mg 내지 10 g, 100 mg 내지 10 g, 또는 50 mg 내지 1000mg의 양으로 투여하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 포유동물은 사람이 아닌 것일 수 있다. 포유동물은 소, 개, 고양이, 돼지, 또는 양일 수 있다.

도 1은 인삼 추출물 및 분획물 제조와 진세노사이드 분리 과정을 그린 도면이다.
도 2는 인삼 추출물을 HPLC 분석한 크로마토그램이다.
도 3은 KMxG를 HPLC 분석한 크로마토그램이다.
도 4는 KMxG-GF를 HPLC 분석한 크로마토그램이다.
도 5는 진세노사이드 Rk1을 HPLC 분석한 크로마토그램이다.
도 6은 진세노사이드 Rg5를 HPLC 분석한 크로마토그램이다.
도 7a 내지 7f는 폐암 세포에 대하여 인삼 추출물, KMxG, KMxG-GF, 진세노사이드 Rk1 및 Rg5의 세포 생존능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 인삼추출물, KMxG, KMxG-GF, 진세노사이드 Rk1 및 Rg5가 TGF-β1에 의한 폐암 세포의 상피-간엽성 세포 전환을 억제하는 효과를 보여주는 현미경 사진이다.
도 9a 내지 9d는 인삼 추출물, KMxG, KMxG-GF, 진세노사이드 Rk1 및 Rg5가 단백질 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.
도 10은 TGF-β1에 의한 암세포 이동에 진세노사이드 Rk1과 Rg5의 영향을 보여주는 현미경 사진이다.
도 11은 TGF-β1에 의한 암세포의 침윤 현상에 대한 진세노사이드 Rk1과 Rg5 의 영향을 보여주는 현미경 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인삼 가공 추출물 및 그 분획물과 진세노사이드 분리

본 실시예에서 사용된 인삼은 금산 인삼 도매센터에서 건조된 인삼을 구매하여 사용하였다. 도 1은 인삼 추출물 및 그 분획물의 제조 과정을 그린 도면이다. 구체적 추출과정은 다음과 같다.

1. 인삼 추출물 제조

세절된 건조 인삼 1000 g을 50 % 에탄올 20 L에 넣고 80 ℃에서 3 시간 환류 추출하는 것을 2회 반복하였다. 용액을 거름종이로 여과하여 얻어진 여과액(filtrate)을 감압 증류하여 인삼 추출물 260 g을 수득하였다.

도 2는 인삼 추출물을 HPLC 분석한 크로마토그램이다. 도 2 내지 도 6에서, HPLC 분석은 Nexera X2(Shimadzu, 일본) 기기를 사용하였으며 Phenomenex 사 컬럼 Luna Omega C18, 입자 크기 1.6 μm, 컬럼 크기 150 x 2.1 mm을 사용하여 용리액 물 중 초기 10 %부터 100 % 아세토니트릴의 구배를 70 분 동안 유속 0.5 mL/min으로 흘려주는 조건에서 수행된 것이다.

2. 마이크로웨이브를 이용한 가공 인삼 추출물( KMxG )의 제조

1절에서 얻어진 50 % 에탄올 추출물에 마이크로웨이브를 조사하였다. 구체적으로, 인삼 건조 추출물 20 g을 미국 CEM 사에서 제조된 마이크로웨이브 조사기 (CEM, 미국)의 80 mL 용기에 40 mL 50 % 에탄올 추출물을 넣고 밀봉한 상태에서 약 150 ℃로 200 W에서 60 분 동안 마이크로웨이브를 조사한 후 동결건조하여 마이크로웨이브 조사된 가공물을 수득하였다. 마이크로웨이브 조사 시 최대 압력은 6.8 기압이었고, 얻어진 마이크로웨이브 가공 인삼 추출물을 증발건조하여 19.2 g을 수득하였다(이하 'KMxG'라 한다.).

도 3은 KMxG를 HPLC 분석한 크로마토그램이다.

3. 유효 진세노사이드 분획물 분리 ( KMxG - GF )

2절에서 얻어진 가공 인삼 추출물을 비극성 흡착 수지인 DIAION^TM HP-20 수지 (Samchun Chemicals)를 이용하여 진세노사이드 분획물을 분리하였다. DIAION^TM HP-20 수지는 스트린 및 디비닐 벤젠(DVB)의 공중합체의 고 다공성 타입 합성 흡착제이다. 가공 인삼 추출물 10 g에 5배 용적의 물을 가하여 충분히 희석시킨 후, 물로 평형화된 HP-20 수지가 충진된 칼럼을 통과시켜 사포닌 성분을 흡착시켰다. 상기 수지 용적의 약 5배의 증류수를 칼럼을 통하여 흘려 얻어진 수용성 성분을 모아 동결 건조하여 HP-20 수지 비흡착 수용성 성분 4.21 g을 수득하였다. 수용성 성분이 제거되고 HP-20 수지 흡착성분, 예를 들면, 소수성 사포닌계 성분과 항산화 성분, 및 기타 소수성 성분이 흡착되어 있는 수지에 상기 수지의 5 내지 10 배 부피의 20 내지 50 v/v% 에탄올을 상기 칼럼에 통과시켜 용출시키고, 건조하여 유효 성분을 제외한 소수성 성분 분획 2.96 g을 얻었다. 다음으로 상기 수지 용적의 5 내지 10 배 부피의 60 내지 100 v/v% 에탄올을 상기 칼럼에 통과시켜 용출시키고, 건조하여 유효 진세노사이드 함량이 강화된 분획물 KMxG-GF를 2.23 g을 얻었다.

도 4는 KMxG-GF를 HPLC 분석한 크로마토그램이다.

4. 진세노사이드 Rk1 및 Rg5 의 분리

3절에서 얻은 유효 진세노사이드 분획물에서 진세노사이드 Rk1 및 Rg5를 분리하였다.

구체적으로는, 상기 분획물 중 1 g을 역상 분취 HPLC (Phenomenex 사 Luna C18(2) 컬럼, 입자 크기 10 μm, 컬럼 크기 250 x 21.20 mm)에서 용리액으로서 물 중 초기 50 %부터 70 % 아세토니트릴의 구배를 60~90 분 동안 유속 8 mL/min으로 흘려주면서 용리시켰다. 그 결과, 얻어진 크로마토그램에서 UV 203 nm에서 나타나는 피크 2개를 확인하였다. 이들 중 피크 1~3에 해당되는 분획을 역상 준-분취 HPLC (Phenomenex사 Gemini 6 Phenyl 컬럼, 입자 크기 5 μm, 컬럼 크기 250x10 mm)에서 용리액으로서 물 중 초기 60 %부터 100 % 메탄올의 구배를 60~90 분 동안 유속 4 mL/min으로 흘려주면서 용출시켰다. 그 결과, 얻어진 크로마토그램에서 진세노사이드 Rk1 131 mg, 및 진세노사이드 Rg5 142 mg이 확인되었다.

상기 화합물은 핵자기공명분광기(nuclear magnetic resonance spectrometer, NMR) 및 질량 분광광도계(mass spectroscopy)를 사용하여 구조를 확인하였다. 상기 화합물을 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR (Bruker AVACE III 400 MHz spectrometer, Bruker, 독일)을 측정하여 구조를 확인하였다. 분리한 화합물의 화학 구조식 및 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 데이터는 다음과 같다.

[화학식 Ⅳ]

[화학식 Ⅴ]

화학식 IV 화합물: 진세노사이드 Rk1

화학식 V 화합물: 진세노사이드 Rg5

도 5는 진세노사이드 Rk1을 HPLC 분석한 크로마토그램이다.

도 6은 진세노사이드 Rg5를 HPLC 분석한 크로마토그램이다.

실시예 2: 인삼추출물, KMxG , KMxG - GF 분획물 및 단일성분의 폐암 전이 억제 효과 평가

1. 세포 생존능측정 (Cell viability)

폐암 세포 A549를 인산염완충액식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)로 세척하고 0.5 % 트립신으로 처리한 후 깨끗한 배지로 세척한다. 5 x 10³세포(0.1 mL) 를 96-웰 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 분주하고 24 시간 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양기 조건은 온도 37 ℃, 공기 95 %/이산화탄소 5 % 이다. 인삼추출물, KMxG, KMxG-GF, 진세노사이드 Rk1 및 Rg5를 깨끗한 배지에 지정 농도로 희석하여 제조한다. 각 웰에 있는 배지를 흡입 제거한 후 지정 농도로 제조된 배지를 100 ㎕씩 분주하고 24 및 48 시간 동안 배양하였다. EZ-Cytox(Daeil Lab Service, 한국) 10 ㎕를 각 웰에 첨가해 준 후 다시 2 시간 동안 배양기에서 배양 후 플레이트 리더(plate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 측정하였다. 상기 지정된 농도는 상기 인삼추출물 및 KMxG는 각각 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, 400 μg/mL 및 500 μg/mL, KMxG-GF는 100 μg/mL, 120 μg/mL, 140 μg/mL, 160 μg/mL 및 180 μg/mL, 진세노사이드 Rk1은 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM 및 100 μM, 진세노사이드 Rg5는 100 μM, 150 μM, 200 μM 및 250 μM, 300 μM 농도이다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

구분	농도(μg/mL)	세포 생존율(%)
인삼 추출물	0	100
	100	103.11
	200	95.14
	300	58.18
	400	42.16
	500	24.36
KMxG	0	100
	100	96.84
	200	89.24
	300	82.76
	400	21.84
	500	6.37
	0	100
	100	96.06
	120	93.04
	140	89.73
	160	86.02
	180	87.19
KMxG-GF	0	100
	100	71.14
	120	73.52
	140	70.27
	160	44.33
	180	19.40
진세노사이드 Rk1	0	100
	20	114.21
	40	98.52
	60	89.58
	80	80.86
	100	64.02
진세노사이드 Rg5	0	100
	100	107.49
	150	95.33
	200	91.77
	250	87.58
	300	72.41

표 2는 폐암 세포 A549 세포에 대한 인삼추출물, KMxG, KMxG-GF, Rk1 및 Rg5의 세포 생존능 시험결과를 나타낸다. 또한, 도 7a 내지 7f는 폐암 세포에 대하여 인삼 추출물, KMxG, KMxG-GF, Rk1 및 Rg5의 세포 생존능을 나타낸 그래프이다.

시험 물질이 폐암 세포 사멸 효과와는 별개로 폐암 전이 억제 효과를 가지고 있는지 확인하기 위하여 세포 사멸에 영향을 주지 않는 농도 범위를 확인하였다. 세포 사멸 정도를 측정한 결과 70 % 이상 세포가 생존한 농도는 인삼추출물 250 μg/mL, KMxG 300 μg/mL, KMxG-GF 140 μg/mL, Rk1 50 μM, 및 Rg5 250 μM이었다. 따라서, 이 농도 이하의 농도를 세포 생존에 영향을 끼치지 않는 것으로 결정하였다.

2. 세포 형태 및 웨스턴 블롯 (Cell Morphology & Western blot)

폐암세포 A549를 PBS로 세척하고, 0.5 % 트립신으로 처리한 후, 깨끗한 배지로 세척하였다. 1.5x10⁵세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 2 mL 씩 분주한 후 24 시간 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 인삼추출물, KMxG, KMxG-GF, Rk1, 및 Rg5를 형질 전환 성장 인자 (Transforming growth factor beta: TGF-β) 5 ng/mL가 포함된 배지를 이용하여 지정 농도로 제조하였다. 인삼추출물은 200 μg/mL 및 250 μg/mL, KMxG는 280 μg/mL 및 300 μg/mL, KMxG-GF는 100 μg/mL 및 140 μg/mL, Rk1은 45 μM 및 50 μM, Rg5는 200 μM 및 250 μM 농도이다. 각 웰에 있는 배지를 흡입 ㅈ제거한 후 지정 농도로 희석 제조한 배지를 1.5 mL 씩 분주하였다.

48 시간 동안 배양하고 현미경 카메라를 통해 세포의 사진을 찍은 후에 PBS로 세포를 세척한 다음 세포 스크레이퍼(cell scraper)를 이용해서 세포를 걷어내었다. 걷어낸 세포는 10,000 rpm, 1 분 동안 원심분리기에 돌려서 펠렛을 얻었다. 방사면역침전분석완충액 (RIPA, Radio-immunoprecipitation assay buffer)을 이용하여 세포를 용해시키고 10 분 뒤 10,000 rpm, 20 분 동안 원심분리기에 돌린 후 상등액만을 새로운 튜브로 옮긴 후 얼음에 보관하였다.

각 세포 파쇄물(lysate)에 대한 단백질 농도를 결정하기 위해 Bradford assay를 이용하는데, 쿠마시블루 염색약을 처리한 후 595 nm 파장의 빛을 이용하여 단백질을 정량하였다. 분자량 마커와 함께 동등한 양의 단백질을 SDS-PAGE 겔의 웰에 넣고 80 volt, 10분, 120 volt, 90 분 정도 전기영동하였다. 전기영동이 끝나면 메탄올로 활성화시킨 PVDF 겔에서 멤브레인으로 이동시키는 트랜스퍼를 95 volt, 1시간 30 분 동안 수행하였다. 트랜스퍼가 끝난 후 멤브레인을 꺼내어 5 % 탈지유에 잠시 차단한 후 새로운 탈지유에 원하는 항체를 희석시켜 멤브레인과 함께 밀봉하고 4 ℃에서 12 시간 동안 보관하였다. 트리스완충식염수 (Tris Buffered Saline with Tween 20; TBST)로 멤브레인을 10 분 간격으로 3번 씻어내고 HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 새로운 탈지유에 희석시켜 멤브레인과 1 시간 반응시켰다. 다시 TBST를 이용해 10 분 간격으로 3번 씻어주고 멤브레인을 화학발광솔루션 (Enhanced chemiluminescence; ECL)과 1 분 동안 반응시키고 제거한 다음 Fusion solo를 이용하여 웨스턴 밴드(western band)를 이미지화시켰다.

도 8은 폐암 세포에서 인삼추출물, KMxG, KMxG-GF, Rk1 및 Rg5가 TGF-β에 의한 폐암 세포의 상피-간엽성 세포 전환 (Epithelial to Mesenchymal Transition; 이하 'EMT'라 한다.)을 억제하는 효과를 보여주는 현미경 사진이다. 폐암 세포는 상피세포의 특징인 동그란 형태를 취하지만 TGF-β을 처리하면 길쭉한 모양의 간엽성 세포로 형태가 변환된다. 이러한 EMT는 암세포의 전이 과정에서 필수적인 현상으로 알려져 있다. 인삼 추출물은 TGF-β에 의한 EMT를 억제하지 못했지만 KMxG, Rk1 및 Rg5를 처리했을 때 상피 세포가 간엽성 세포로 변환되는 것을 억제하였다.

도 9a 내지 9d는 인삼 추출물, KMxG, KMxG-GF, Rk1 및 Rg5가 단백질 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다. EMT의 대표적인 현상은 상피세포의 세포-세포 결합 단백질인 E-cadherin의 발현이 감소하고 간엽성 세포의 대표 마커인 vimentin의 발현이 증가한다. 인삼 추출물은 TGF-β에 의한 E-cadherin의 발현 감소 및 vimentin의 발현 증가 현상을 억제하지 못했으나 KMxG, KMxG-GF, Rk1 및 Rg5는 처리 농도에 비례하여 TGF-β에 의한 E-cadherin의 발현 감소와 vimentin의 발현 증가 현상을 억제하였다.

3. 이동 분석(Migration assay): 상처-치유 분석

폐암세포 A549를 PBS로 세척하고, 0.5 % 트립신으로 처리한 후, 깨끗한 배지로 세척하였다. 4 x 10⁵세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 2 mL 씩 분주한 후 24 시간 정도 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 진세노사이드 Rk1 및 Rg5를 TGF-β가 5 ng/mL 농도로 포함된 배지를 이용하여 지정 농도로 제조하였다. Rk1은 45 μM 및 50 μM, Rg5는 200 μM 및 250 μM 농도이다. 각 웰에 80-90 % 이상 세포가 존재하였을 때 웰에 새로운 피펫 팁으로 웰 중앙을 같은 간격 거리를 두어 긁어냈다. 그 다음 양 옆으로 한번 씩 더 긁어낸 후 PBS로 2-3번 씻어주고 지정 농도로 제조한 Rk1 및 Rg5를 1.5 mL 씩 넣고 24, 및 48 시간 동안 세포의 이동을 관찰하였다.

구분	농도(μg/mL)	이동 억제율 (%)
진세노사이드 Rk1	45	58
진세노사이드 Rk1	50	66
진세노사이드 Rg5	200	71
진세노사이드 Rg5	250	81

도 10은 TGF-β에 의한 암세포의 이동에 Rk1과 Rg5의 영향을 보여주는 현미경 사진이다. 암세포의 EMT 현상은 암 전이 과정 중 암세포의 이동과 매우 밀접한 관계를 가진다. 즉, 암세포가 EMT 현상을 겪은 후 세포-세포의 결합이 약해지며 암세포는 적절한 침윤지를 찾기 위해 이동한다. 그러므로 임의로 암세포가 자라는 곳에 상처를 내서 세포가 없는 빈 공간을 만들어내면 EMT를 겪게 되는 암세포는 그 부분으로 이동하게 된다. 결과적으로 TGF-β를 처리했을 때 시간이 지날수록 세포의 이동으로 인해 빈 공간이 줄어드는 현상을 보이나 Rk1 및 Rg5 처리하였을 경우 세포의 이동을 억제하여 빈 공간이 줄어들지 않는 것이 확인되었다.

4. 침윤 분석(Invasion assay)

폐암세포 A549를 PBS로 세척하고 0.5 % 트립신으로 처리한 후, 깨끗한 배지로 세척하였다. 1.5 x 10⁵세포를 6-웰 플레이트에 2 mL 씩 분주한 후 24 시간 정도 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 진세노사이드 Rk1 및 Rg5 를 TGF-β가 5 ng/mL 농도로 포함된 배지를 이용하여 지정 농도로 제조하였다. Rk1은 45 μM 및 50 μM, Rg5는 200 μM 및 250 μM 농도이다. 각 웰에 있는 배지를 흡인 제거한 후 지정 농도로 희석 제조한 배지를 1.5 mL 씩 분주하고 48 시간 동안 배양하였다. 후드 안에서 침윤(Invasion) 챔버를 상온에서 10 분 정도 방치하고 챔버 위에 혈청이 들어가지 않은 배지를 300 ㎕ 분주 후 상온에서 1 시간 동안 방치하였다. 48 시간 동안 배양한 세포를 PBS로 세척하고 0.5 % 트립신으로 세포를 떼어낸 후 0.9 x 10⁶ 세포 (1 mL)를 동일한 양으로 계수하였다.

물질과 5 ng/mL TGF-β를 처리한 후, 챔버 위에 있던 배지를 제거한 후 세포가 들어있는 배지로 교체하였다. 챔버 밑은 혈청이 들어간 배지를 500 ㎕ 분주하고 48 시간 동안 배양기로 배양시켰다. 안쪽 웰의 배지와 세포를 제거하고 새로운 웰에 옮겨 400 ㎕ 염색시약으로 10 분 염색한 후 증류수에 세척하고 건조시켰다. 이때 현미경을 통해 염색된 정도를 관찰할 수 있었으며, 사진을 찍었다. 추출 용액을 각 새로운 웰에 넣고 염색시약을 10 분 동안 용해시킨 다음 96-웰 플레이트에 50 ㎕ 씩 3개의 웰 씩 분주하고 560 nm에서 OD 값을 측정하였다.

구분	농도(μg/mL)	침윤 억제율 (%)
진세노사이드 Rk1	45	85
진세노사이드 Rk1	50	158
진세노사이드 Rg5	200	140
진세노사이드 Rg5	250	143

도 11은 TGF-β에 의한 암세포의 침윤 현상에 대한 진세노사이드 Rk1과 Rg5 의 영향을 보여주는 현미경 사진이다. 암세포의 EMT 현상은 암 전이 과정 중 암세포의 침윤도 매우 밀접한 관계를 가진다. 암세포는 EMT 현상을 겪은 후 적절한 침윤 가능한 곳을 찾아서 이동하게 되며 결과적으로 침윤 과정을 겪게 된다. 침윤 과정은 암세포에서 생성한 기질 메탈로프로테나제(Matrix metalloproteinase: MMP)에 의해 장기 조직의 기저면을 녹임으로써 진행된다. 이때 암세포에서 생성하는 다양한 MMP는 TGF-β에 의한 EMT 현상에 의해 발현되는 단백질이다. 그러므로 TGF-β를 처리했을 때 암세포는 침윤 현상으로 인해 인공 세포외 기질을 침윤하는 현상을 보이지만 Rk1 및 Rg5 처리하였을 경우 침윤 정도가 줄어든 것이 확인되었다.

앞서 언급했듯이 암전이 과정에서 가장 중요한 현상은 암세포의 EMT 현상을 통한 이동 및 침윤 현상이다. 이에 TGF-β에 의한 암세포의 이동과 침윤 증가 현상이 Rk1과 Rg5에 의해 억제됨을 이동 분석(migration assay)과 침윤 분석(invasion assay)를 통해 증명했다. 그 결과를 표 3, 4를 통해 각 진세노사이드의 암전이 억제율을 이동과 침윤 억제율로 표현했다. 이동 억제율은 각각의 세포 생존 가능 농도에서 진세노사이드 Rg5가 Rk1에 비해 약간 높은 효과를 나타냈고, 침윤 억제율은 Rk1과 Rg5가 비슷한 침윤 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다. 하지만 농도 대비 하여서는 Rk1이 Rg5에 비해 그 효율이 좋은 것으로 판단된다.

결과적으로, 두 진세노사이드 모두 세포의 생존 가능 농도에서 암 전이를 억제하는 효과는 확실히 관찰할 수 있었으며, 농도 대비 암전이 억제 효율성을 재고했을 때 진세노사이드 Rk1이 Rg5에 비해 암전이 억제 효과가 더 좋았다.

Claims

진세노사이드 Rk1 및 Rg5 중 하나 이상을 유효 성분으로서 포함하는 암의 전이를 억제하기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 진세노사이드 Rg3을 더 포함하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 파낙스속 식물 또는 그 추출물을 마이크로웨이브 조사하여 얻어진 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3, Rk1 및 Rg5의 중량에 대하여 Rg3, Rk1 및 Rg5가 90 % 이상 함유된 파낙스속 식물 추출물을 포함하는 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 파낙스속 식물 추출물은 진세노사이드 (Rg5 + Rk1)/(Rg3)의 비율이 2 이상인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 파낙스속 식물 추출물은 Rg5 및 Rk1를 포함하는 분획물인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 암은 폐암인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, Rk1 및 Rg5는 조성물 중량에 대하여 15 내지 40 중량%인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 Rk1 및 Rg5는 개체에서 폐암 세포의 사멸을 유도하는 농도 미만으로 투여하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 8 중 하나를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암의 전이를 억제하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물인 것인 방법.