KR20200015580A - 감소된 표면 푸코실화를 갖는 t 세포 및 이를 생산하고 사용하는 방법 - Google Patents

감소된 표면 푸코실화를 갖는 t 세포 및 이를 생산하고 사용하는 방법 Download PDF

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니콜 오켈리
제시카 필드
쉬라 가르다이
라이언 헤이저
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시애틀 지네틱스, 인크.
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Abstract

감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법 및 입양 세포 요법, 특히, 암 치료에서의 이의 용도가 제공된다.

Description

감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포 및 이를 생산하고 사용하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2017년 6월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/516,536호의 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 우선권 이점을 주장하는 출원으로, 이것은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함된다.
연방정부 지원된 연구 및 개발 하에서 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 진술
해당 없음
컴팩트 디스크 상에 제출된 "서열목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조
해당 없음
암 치료에는 일반적으로: 수술, 화학 요법 및 방사선 요법의 3가지 접근법이 채택되었다. 추가로, 면역 요법이 잠재적으로 단독으로 또는 기존의 암 치료에서의 임의의 접근법과 조합하여 적용될 수 있는 상대적으로 새롭고 아직은 실험적인 접근법으로 부각되었다. 암 면역 요법 내의 치료 양식 중 하나는 종양-특이적 T 세포를 사용한 입양 세포 요법이다. 입양 세포 요법을 수행하기 위해, 예를 들어, 표적 질환, 예를 들어 비-병원성 조직에 대한 표적-외 영향을 피하면서 환자에서 치료되는 암의 특정한 유형에 특이적인 T 세포를 제공하기 위한 개선된 전략이 필요하다.
일 양태에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 본 방법은 세포 배양 배지에 푸코스 유사체(fucose analog)의 존재하에 T 세포를 배양하는 것을 포함하고; 여기서 상기 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
Figure pct00001
(I) (II)
또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태를 가지고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머(anomer) 또는 상응하는 알도오스(aldose) 형태일 수 있고;
R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는
각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이고; 그리고
여기서 T 세포는 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 T 세포에 비하여 감소된 표면 푸코실화를 갖는다.
또 다른 양태에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 본 방법은 동물에 푸코스 유사체를 제공하는 단계 및 상기 동물로부터 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 얻는 단계를 포함하고; 여기서 상기 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
Figure pct00002
(I) (II)
또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태를 가지고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있고;
R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는
각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이고; 그리고
여기서 상기 동물로부터 수득된 T 세포는 상기 푸코스 유사체가 제공되지 않은 대조군 동물 내에 존재하거나 또는 그로부터 수득된 T 세포에 비하여 감소된 표면 푸코실화를 갖는다.
또 다른 양태에서, 대상체에게 입양 세포 요법을 제공하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 본 방법은 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 가지는 혼합물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 본 방법은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 가지는 혼합물을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 가지는 혼합물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 이러한 T 세포를 생산하는 임의의 방법에 따라 생산된다.
본 명세서에서 제공된 이들 및 다른 양태의 개시내용은 특정 구현예의 비-제한적인 예인, 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 보다 완전하게 이해될 수 있다.
도 1은 미접촉 BALB/c 마우스에서의 IV 이식된 A20 마우스 림프종 세포의 성장에 대한 2FF로 치료되거나 또는 치료되지 않은 KLH-A20 Id Fab 백신접종된 공여체 마우스로부터의 비장세포의 입양 전달의 생체내 효과를 입증하는 그래프를 도시한다.
도 2는 단리된 Cd3+ T 세포를 생성시키기 위해 사용된, 미접촉 BALB/c 마우스에서의 SQ 이식된 A20 마우스 림프종 세포의 성장에 대한 2FF의 생체내 효과를 입증하는 그래프를 도시한다.
도 3은 표면 LCA 염색에 의해 결정된, 20mM 2FF로 처리된 A20 종양 보유 마우스로부터 단리된 CD3+ T 세포의 감소된 표면 푸코실화를 입증하는 그래프를 도시한다.
도 4는 표면 LCA 염색에 의해 결정된, 100mM 2FF로 생체외 처리 후 인간 공여체로부터 단리된 CD3+ T 세포의 감소된 표면 푸코실화를 입증하는 그래프를 도시한다.
도 5a-5b는 2FF의 존재 또는 부재하에 성숙된 자가 인간 T 세포가 매칭된 LCL EBV 전환된 B 세포 종양을 보유하는 NSG 마우스 내로 이식된 후의 종양 진행을 입증하는 그래프를 도시한다. 도 5a는 캘리퍼(caliper) 측정을 통해 종양 진행을 입증하는 그래프를 도시하고 도 5b는 생존을 통해 종양 진행을 입증하는 그래프를 도시한다.
본 개시의 다양한 구현예들 및 양상들이 본 명세서에 도시되고 기술되었으나, 이러한 구현예들 및 양상들은 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다수의 변형, 변경 및 치환이 이제 본 발명을 벗어남이 없이 당업자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 단지 구조적 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 매뉴얼 및 논문을 제한 없이 포함하는 본 출원에서 인용된 모든 문서 또는 문서의 일부는 임의의 목적을 위해 그 전체로서 참고로 명백하게 포함된다.
본 개시내용의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업자의 기술범위 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학 및 세포 생물학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 예를 들어, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)을 참고한다.
I. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "푸코스 유사체"에 대한 언급은 하나 이상의 푸코스 유사체를 포함한다. 복수의 푸코스 유사체가 의미될 때, 복수의 푸코스 유사체의 각각은 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "단리하다", "단리하는" 또는 "단리된"은 성분(예를 들어, 화합물 또는 세포)이 자연적으로 또는 실험실 혼합물에서 수반되는 성분의 전부 또는 일부로부터 분리된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "농축하다", "농축하는" 또는 "농축된"은 성분(예를 들어, 화합물 또는 세포)을 갖는 혼합물이 공정 이전에 비교하여 성분의 농도가 증가하도록 가공된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, T 세포 및 다른 유형의 세포를 포함하는 세포의 혼합물로부터 T 세포를 농축하는 것은 세포의 혼합물이, 예를 들어 원심분리로 가공되어, 농축 전의 단위 부피당 T 세포의 농도 또는 개수, 예를 들어 105 T 세포/ml가 농축 과정 후에 105 T 세포/ml 초과가 되도록 증가된다는 것을 의미한다.
용어 "배양" 또는 "세포 배양"은 인공적인, 시험관내 환경에서 세포의 유지 및/또는 성장을 의미한다. "세포 배양 시스템"은 본 명세서에서 세포의 모집단이 성장될 수 있는 배양 조건을 지칭하기 위해 사용된다. "배양 배지"는 본 명세서에서 세포의 배양, 성장 또는 증식을 위한 영양소 용액을 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용된 "조성물"은 살아있는 또는 사멸될 수 있는 임의의 화합물(임의의 화학적 혼합물을 포함함) 및 세포를 지칭한다. 예를 들어, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 맥락에서, 본 조성물은 배양된 세포에 제공되는 푸코스 유사체를 함유할 수 있다. 또 다른 예에서, 입양 세포 요법을 제공하거나 암을 치료하는 맥락에서, 본 조성물은 예를 들어 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포인, 세포의 군을 함유할 수 있다. 임의의 맥락에서 사용되는 조성물은 하나 이상의 성분을 가질 수 있다.
용어들 "T 림프구" 또는 "T 세포"는 세포-매개 면역에서 역할을 수행하는 림프구의 유형을 지칭한다. T 세포의 유형은, 비제한적으로, 효과기 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 살해 T 세포, 메모리 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 점막-연관 불변 T 세포, 알파 베타 T 세포, 및 감마 델타 T 세포를 포함한다. 또한, T 세포는 그 위에 하나 이상의 특정 마커의 존재 또는 수준에 따라 추가로 아형(subtype)으로 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어들 "개체" 또는 "대상체"는 본 개시내용에서 인간, 포유동물 및 다른 동물을 지칭한다. 일부 경우에, 인간인 대상체는 환자일 수 있다.
질환 또는 병태와 관련하여 "치료"는 적어도 개체를 괴롭히는 병태와 연관된 증상의 개선이 달성되는 것을 의미하며, 여기서 개선은 적어도 파라미터의 규모, 예를 들어, 치료되는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 증상의 규모에서의 감소를 지칭하는 넓은 의미로 사용된다. 이와 같이, 치료는 또한 병리학적 상태 또는 적어도 이와 관련된 증상이 완전히 억제되는, 예를 들어 발생이 예방되거나, 또는 중단, 예를 들어 종결되어 숙주가 더 이상 병태, 또는 적어도 상기 병태를 특징으로 하는 증상을 앓고 있지 않는 상황을 포함한다. 따라서 치료는 하기를 포함한다: (i) 예방, 즉, 임상 증상이 전개하지 않도록 하는 것, 예를 들어, 유해한 상태로의 질환 진행을 방지하는 것을 포함하여, 임상 증상의 전개 위험을 감소하는 것; (ii) 억제, 즉, 임상 증상의 발전 또는 추가의 발전를 저지하는 것, 예를 들어 종양 부하를 감소시키기 위해, 예를 들어 활성인 질환을 경감시키는 또는 완전히 억제하는 것으로, 상기 감소는 검출가능한 암성 세포의 제거를 포함할 수 있는 것; 및/또는 (iii) 완화, 즉, 임상 증상의 퇴행을 야기하는 것.
"투여", "투여하는" 등은 시험관내 세포에 투여, 생체내 세포에 투여, 의료 전문가에 의한 대상체에게 투여일 수 있는 직접적인 투여 및/또는 본 발명의 조성물을 처방하는 행위일 수 있는 간접적인 투여 둘 모두를 지칭한다. 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 조성물을 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 유효량이 투여되며, 그 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 푸코스 유사체가 배양 배지에서 배양된 세포에 투여될 때, 푸코스 유사체(들)의 유효량은 원하는 효과, 예를 들어 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포의 생산을 생성하기에 충분한 양으로 정의된다. 임의의 투여 방법이 사용될 수 있다. 화합물 (예를 들어, 하나 이상의 푸코스 유사체)은, 예를 들어, 화합물을 세포 배양 배지에 첨가하거나 생체내 투여(예를 들어, 음식 공급(feeding))에 의해 세포에 투여될 수 있다. 대상체에게 투여는, 예를 들어 공급, 혈관내 주사, 직접적인 종양내 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
투여는 경구 투여, 좌약으로 투여, 국소 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 병변내, 척수강내, 비강내 또는 피하 투여, 또는 대상체에게 서방출 장치, 예를 들어, 미니-삼투 펌프의 이식을 의미할 수 있다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 볼, 설하, 구개, 잇몸, 비강, 질, 직장, 또는 경피)을 포함한 임의의 경로에 의한다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 세동맥내, 진피내, 피하, 복강내, 심실내, 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은, 비제한적으로, 리포좀 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함한다. "공-투여"는 본 명세서에 기재된 조성물이 하나 이상의 추가의 요법, 예를 들어 암 요법 예컨대 화학요법, 호르몬 요법, 방사선요법, 또는 면역요법의 투여와 동시에, 직전에 또는 직후에 투여됨을 의미한다. 본 발명의 화합물은 환자에게 단독으로 투여되거나 공투여될 수 있다. 공투여는 조성물을 개별적으로 또는 조합하여(하나 초과의 조성물) 동시 또는 순차적으로 투여하기 위한 것이다. 따라서, 제제는 또한 필요에 따라 (예를 들어, 대사 분해를 감소시키기 위해) 다른 활성 물질과 조합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "암"은 원발성 암 및 전이암을 포괄하는 일반적인 용어를 지칭한다. "원발성 암"은 암세포의 적어도 하나의 특징적인 특성을 획득했지만, 아직 인접한 조직을 침범하지 않았으며 일차 기원(primary origin)의 장소에 국한된 종양 내에 함께 유지된 종양 세포의 그룹을 의미한다. "전이암"은 원발성 암의 세포로부터 유래하고, 상기 원발성 암을 둘러싼 조직을 침입하여 신체를 통해 퍼지고 새로운 먼 곳에 부착되어 새로운 종양으로 자라는 종양 세포의 그룹을 의미한다. 본 발명의 원발성 및 전이암은 비제한적으로 유방의 암종, 식도암, 결장직장, 췌장, 위, (위장 기질 조직) GIST, 간세포, 간, 폐, 소세포 폐, 난소, 자궁, 자궁경부, 방광, 신장, 결장, 소장, 대장, 위암, 림프종, 전립선, 고환, 갑상선 암종, 악성 흑색종, 포도막 흑색종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 연골육종, 골육종, 교모세포종, 육종, 신경아교종, 또는 다른 뇌종양, 머리/목 다른 위장 및 생식세포 종양, 혈액성 악성종양, 백혈병, 림프종, 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프양 백혈병　 (ALL), 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 무통성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 피부암 (흑색종을 포함함), 골암, 상피성 암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 교모세포종, 신경교세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 활막 육종, 및/또는 중피종을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "암 세포"는, 예를 들어, 비정상 세포 성장, 비정상 세포 증식, 밀도 의존적 성장 억제의 상실, 정착-독립적인 성장 잠재성, 면역저하된 비-인간 동물 모델에서 종양 성장 및/또는 전개를 증진하는 능력, 및/또는 세포 전환의 임의의 적절한 지표 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있는 신생물성 세포 표현형을 나타내는 세포를 지칭한다. "암 세포"는 "종양 세포" 또는 "암성 세포"와 본 명세서에서 교체가능하게 사용될 수 있으며, 고형 종양, 반-고형 종양, 원발성 종양, 전이성 종양 등의 암 세포를 포괄한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "항종양 효과" 또는 "항암 효과"는 종양 부피에서의 감소, 종양 성장의 억제, 종양 세포 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 전이 수의 감소, 전체적인 또는 무진행 생존의 증가, 기대 수명의 증가, 또는 종양과 연관된 다양한 생리적 증상의 개선으로 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. 항종양 효과는 또한 종양의 발생의 예방, 예를 들어 백신을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, PFS로 약칭될 수 있는 용어 "무진행 생존(progression-free survival)"은 치료일로부터 개정된 악성 림프종에 대한 국제 실무 그룹 (IWG) 반응 기준에(International Working Group (IWG) Response Criteria for Malignant Lymphoma) 따른 질환 진행일 또는 임의의 원인으로 인한 사망일까지의 시간을 지칭한다.
OS로 약칭될 수 있는 용어 "전체 생존(overall survival)"은 치료 일로부터 사망일까지의 시간으로 정의된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "입양 세포 요법" 또는 "입양 세포 이식"은 요법을 필요로 하는 대상체에게 요법을 위한 세포의 제공, 예를 들어 투여 또는 이식을 지칭한다. 요법을 위한 세포는 동일한 대상체 또는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 다른 대상체로부터 유래될 수 있다. 입양 세포 요법 또는 입양 세포 이식을 위한 세포는 T 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법에 따르면, 입양 세포 요법이 대상체에게 투여될 수 있다. 입양 세포 요법에 관련된 방법 및 절차에 대한 일부 예는, 예를 들어 WO2015120096, WO2015164675, WO2016011210, WO2016040441, WO2017070395, 및 US20160158359에서 찾아 볼 수 있고, 그 개시내용은 전체적으로 명시적으로 참고로 통합된다. 입양 세포 요법은 대상체에게 T 세포, 특히 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 포함하는 세포의 혼합물을 제공할 수 있다. 원하는 생리적 반응(예를 들어, 종양 성장의 억제 또는 감소)을 생산할 수 있는, 대상체에게 투여되는 T 세포의 양이 유효량으로 정의된다. 용어들 유효량 및 유효 투약량은 상호교체적으로 사용된다. 예를 들어, 질환(예를 들어, 암)을 치료하기 위한 대상체에서 양호한 반응을 유도하기 위해, 유효량은 예를 들어 암 전이의 제어를 제공하기 위해, 암 세포 등을 제거하기 위해 장애와 관련된 증상을 감소, 제거 또는 약화시키는 양이다. T 세포를 투여하기 위한 유효량 및 스케줄은 당해 분야의 숙련가에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투약량 범위는 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향을 받는(예를 들어, 감소 또는 지연) 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 투약량은 실질적인 유해한 부작용, 예컨대 원치않는 교차-반응, 과민성 반응, 및 기타 동종의 것을 유발할 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투약량은 연령, 상태, 성별, 질환의 유형, 질환 또는 장애의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 수 있고, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 임의의 사용금지 사유가 있는 경우 개별 의사에 의해 투약량이 조정될 수 있다. 투약량은 다양할 수 있고 1일 또는 며칠 동안 매일 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 주어진 파라미터에 대해, 유효량은 치료전과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 효능은 또한 "-배" 증가 또는 감소로 표현될 수 있다. 예를 들어, 치료적으로 유효량은 대조군 또는 치료전 대해 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배, 또는 그 초과의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 요법의 목적에 의존할 것이고 공지된 기술을 사용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있을 것이다(예를 들어, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), and Pickar, Dosage Calculations (1999) 참고).
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "감소된 표면 푸코실화"는 세포, 예를 들어, T 세포 상의 표면 당단백질에 부착된 푸코스의 억제를 지칭한다. 이러한 "푸코스의 억제"는 푸코스 유사체가 표면 당단백질 상의 푸코스를 대체하는 푸코스 유사체에 의한 경쟁적 편입과 구별된다.
"대조군" 또는 "정상" 샘플, 예를 들어 대조군 세포 또는 정상 세포는 시험 샘플과 비교하기 위한 참조, 일반적으로 알려진 참조의 역할을 하는 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 시험 샘플은 변형된 T 세포, 특히 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포일 수 있다. 이러한 T 세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해, 예를 들어 푸 코스 유사체의 존재하에 T 세포를 배양하거나 푸코스 유사체가 투여된 동물로부터 T 세포를 수득하는 단계를 통해 생산될 수 있다. 이들 변형된 T 세포는 푸코스 유사체의 부재하에 배양되거나 푸코스 유사체가 투여되지 않은 동물로부터 수득된 대조군 또는 정상 T 세포와 비교하여 감소를 확인할 수 있다. 대조군 값은 또한 푸코스 유사체의 노출 또는 투여 이전의 동일한 개체, 예를 들어, 이전에-수득된 샘플로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 대상체에게 이로운 화합물(들)의 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 화합물을 제공하는 임의의 적합한 물질을 지칭한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 약제학적으로 허용되는 희석제, 약제학적으로 허용되는 첨가제 및 약제학적으로 허용되는 담체로 지칭되는 물질을 포괄할 수 있다. 용어 "담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 푸코스 유사체가 함께 투여되는 희석제, 보조제 또는 부형제를 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 액체, 예컨대 물 및 오일로, 석유, 동물, 야채 또는 합성 기원, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 광유, 참깨 오일 및 기타 동종의 것의 것들을 포함하는 것일 수 있다. 담체는 식염수, 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드 실리카, 우레아, 및 기타 동종의 것일 수 있다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 동물에게 투여될 때, 푸코스 유사체 또는 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균되어 있다. 푸코스 유사체가 정맥내로 투여될 때 물이 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한, 특히 주입가능 용액에 대한 액체 담체로 이용될 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 또한 부형제 예컨대 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 기타 동종의 것을 포함한다. 요망하는 경우, 본 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "가수분해성 에스테르기"는 생체내에서 가수분해되어 하이드록시 기를 생성할 수 있는 임의의 통상적인 에스테르를 지칭한다. 예시적인 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)H, -OC(O)C1-C10 알킬, -OC(O)C2-C10 알케닐, -OC(O)C2-C10 알키닐, -OC(O)아릴, -OC(O)헤테로사이클, -OC(O)C1-C10 알킬렌(아릴), -OC(O)C2-C10 알케닐렌(아릴), -OC(O)C2-C10 알키닐렌(아릴), -OC(O)C1-C10 알킬렌(헤테로사이클), -OC(O)C2-C10 알케닐렌(헤테로사이클), -OC(O)C2-C10 알키닐렌(헤테로사이클), -OC(O)CH2O(CH2CH2O)nCH3, 및 -OC(O)CH2CH2O(CH2CH2O)nCH3을 포함하고, 여기서 각각의 n은 0-5로부터 독립적으로 선택된 정수이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "알키닐 푸코스 퍼아세테이트(alkynyl fucose peracetate)"는 위치 R1-4 (아래, 식 I 및 II 참고)에 아세테이트 기를 갖는 임의의 또는 모든 형태의 알키닐 푸코스(5-에티닐아라비노오스)(alkynyl fucose (5-ethynylarabinose))를 지칭하여, (2S,3S,4R,5R,6S) 및 (2R,3S,4R,5R,6S) 이성질체를 포함하는 6-에티닐-테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라일 테트라아세테이트(6-ethynyl-tetrahydro-2H-pyran-2,3,4,5-tetrayl tetraacetate), 및 (2S,3S,4R,5R) 및 (2R,3S,4R,5R) 이성질체를 포함하는 5-((S)-1-하이드록시프로프-2-이닐)-테트라하이드로푸란-2,3,4-트리일 테트라아세테이트(5-((S)-1-hydroxyprop-2-ynyl)-tetrahydrofuran-2,3,4-triyl tetraacetate), 및 문맥상 달리 나타내지 않는 한 알도오스 형태를 포함한다. 용어들 "알키닐 푸코스 트리아세테이트", "알키닐 푸코스 디아세테이트" 및 "알키닐 푸코스 모노아세테이트"는 각각 알키닐 푸코스의 지시된 트리-, 디- 및 모노-아세테이트 형태를 지칭한다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "알킬"은 달리 구체화되지 않는 한 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 비치환된 포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소(및 그 안에서의 일정 범위 및 특정 개수의 탄소 원자의 모든 조합 및 하위조합)를 지칭한다. 1 내지 3개, 1 내지 8개 또는 1 내지 10개의 탄소 원자의 알킬 기가 바람직하다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 및 3,3-디메틸-2-부틸이다.
치환될 때, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로든 알킬 기는, 비제한적으로: 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함한(여기서 각각의 R'는 -H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 독립적으로 선택됨), 하나 이상의 기, 바람직하게는 1 내지 3개의 기 (및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가의 치환체)로 치환될 수 있다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어들 "알케닐" 및 "알키닐"은 2 내지 20개의 탄소 원자 (및 그 안에서의 일정 범위 및 특정 개수의 탄소 원자의 모든 조합 및 하위조합), 바람직하게는 2 내지 3개, 2 내지 4개, 2 내지 8개 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 비치환되거나 선택적으로 치환된(표시됨) 직쇄 및 분지쇄 탄소 사슬을 지칭한다. 알케닐 사슬은 사슬 내에 적어도 하나의 이중 결합을 가지고 알키닐 사슬은 사슬 내에 적어도 하나의 삼중 결합을 가진다. 알케닐 기의 예는, 비제한적으로, 에틸렌 또는 비닐, 알릴, -1　부테닐, -2 부테닐, -이소부틸레닐, -1 펜테닐, -2 펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, -2 메틸 2 부테닐, 및 -2,3 디메틸 2 부테닐을 포함한다. 알키닐 기의 예는, 비제한적으로, 아세틸렌(acetylenic), 프로파르길, 아세틸레닐, 프로피닐, -1 부티닐, -2 부티닐, -1 펜티닐, -2　펜티닐, 및 -3 메틸 1 부티닐을 포함한다.
치환될 때, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로든, 알케닐 및 알키닐기는, 비제한적으로: 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함한(여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬, -C2-C 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 독립적으로 선택됨), 하나 이상의 기, 바람직하게는 1 내지 3개의 기 (및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가의 치환체)로 치환될 수 있다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "알킬렌"은 1 내지 20개의 탄소 원자 (및 그 안에서의 일정 범위 및 특정 개수의 탄소 원자의 모든 조합 및 하위조합), 바람직하게는 1 내지 8개 또는 1 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 모체 알칸의 동일 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는 비치환된 포화된 분지쇄 또는 직쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬렌은, 비제한적으로, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥시틸렌, 노닐렌, 데칼렌, 1,4-사이클로헥실렌, 및 기타 동종의 것을 포함한다.
치환될 때, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로든, 알킬렌 기는, 비제한적으로: 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함한(여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택됨) 하나 이상의 기, 바람직하게는 1 내지 3개의 기 (및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가의 치환체)로 치환될 수 있다.
"알케닐렌"은 모체 알켄의 동일 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 2개의 1가 라디칼 중심을 가지고, 알케닐 기 (상기에 기재된 바와 같음)의 불포화된, 분지쇄 또는 직쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. "알케닐렌" 기는 비치환되거나 알케닐에 대해 상기에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다(표시됨). 일부 구현예에서, "알케닐렌" 기는 치환되지 않는다.
"알키닐렌"은 모체 알킨의 동일 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 2개의 1가 라디칼 중심을 가지고, 알키닐 기(상기에 기재된 바와 같음)의 불포화된, 분지쇄 또는 직쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. "알키닐렌" 기는 비치환되거나 알키닐 기에 대해 상기에 기재된 바와 같이 선택적으로 치환될 수 있다(표시됨). 일부 구현예에서, "알키닐렌" 기는 치환되지 않는다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "아릴"은 모체 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 1개 수소 원자의 제거에 의해 유래된 6-20개의 탄소 원자 (및 그 안에서의 일정 범위 및 특정 개수의 탄소 원자의 모든 조합 및 하위조합)의 치환된 또는 비치환된 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 일부 아릴 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 전형적인 아릴 기는, 비제한적으로, 벤젠, 치환된 벤젠, 페닐, 나프탈렌, 안트라센, 바이페닐, 및 기타 동종의 것으로부터 유래된 라디칼을 포함한다.
치환될 때, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로든, 아릴 기는, 비제한적으로: 할로겐, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO2, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함한(여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 독립적으로 선택됨), 하나 이상, 바람직하게는 1 내지 5, 또는 더욱이 1 내지 2개의 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 용어 "헤테로사이클"은 적어도 하나의 고리 원자가 N, O, P, 또는 S로부터 선택된 헤테로원자(및 그 안에서의 일정 범위 및 특정 개수의 탄소 원자 및 헤테로원자의 모든 조합 및 하위조합)인 3 내지 7개, 또는 3 내지 10개의, 고리 원자(또한 일명 고리 멤버)를 갖는 치환된 또는 비치환된 단환형(monocyclic) 고리계를 지칭한다. 헤테로사이클은 N, O, P, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개 고리 헤테로원자를 가질 수 있다. 헤테로사이클 내 하나 이상의 N, C, 또는 S 원자는 산화될 수 있다. 단환형 헤테로사이클은 바람직하게는 3 내지 7개의 고리 멤버(예를 들어, 2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)를 가진다. 헤테로원자를 포함하는 고리는 방향족 또는 비-방향족일 수 있다. 달리 지적되지 않는 한, 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서의 그것의 펜던트 기에 부착되어 안정한 구조를 초래한다.
헤테로사이클은 Paquette, "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)의, 특히 1, 3, 4, 6, 7, 및 9장에; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)의, 특히 Volumes 13, 14, 16, 19, 및 28에; 그리고 J. Am. Chem. Soc. 82:5566 (1960)에 기재되어 있다. "헤테로사이클" 기의 예는 예로써 그리고 비제한적으로 피리딜, 디하이드로피리딜, 테트라하이드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 푸코실, 아지르디닐, 아제티디닐, 옥시라닐, 옥세타닐, 및 테트라하이드로푸라닐을 포함한다.
치환될 때, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로든, 헤테로사이클 기는, 비제한적으로: -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 할로겐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함한(여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 -아릴로부터 독립적으로 선택됨), 하나 이상의 기, 바람직하게는 1 내지 2개의 기로 치환될 수 있다.
예로써 및 비제한적으로, 탄소-결합된 헤테로사이클은 하기 위치에서 결합될 수 있다: 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6; 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6; 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6; 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6; 푸란, 테트라하이드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5; 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5; 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5; 아지리딘의 위치 2 또는 3; 또는 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4. 예시적인 탄소 결합된 헤테로사이클은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴을 포함할 수 있다.
예로써 및 비제한적으로, 질소 결합된 헤테로사이클은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 또는 1H-인다졸의 위치 1; 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2; 및 모폴린의 위치 4에서 결합될 수 있다. 더욱 더 전형적으로, 질소 결합된 헤테로사이클은 1-아지리딜, 1-아제티딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴, 및 1-피페리디닐을 포함한다.
달리 지적되지 않는 한, 용어 "카보사이클"은 모든 고리 원자가 탄소 원자인 3 내지 6개의 고리 원자 (및 그 안에서의 일정 범위 및 특정 개수의 탄소 원자의 모든 조합 및 하위조합)를 갖는 치환된 또는 비치환된, 포화 또는 불포화된 비-방향족 단환형 고리계를 지칭한다.
치환될 때, 단독으로든 또는 또 다른 기의 일부로든, 카보사이클 기는, 비제한적으로: 할로겐, C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, -O-(C1-C8 알킬), -O-(C2-C8 알케닐), -O-(C2-C8 알키닐), 아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함한(여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬, -C2-C8 알케닐, -C2-C8 알키닐, 또는 아릴로부터 독립적으로 선택됨), 예를 들어, 하나 이상의 기, 바람직하게는 1 또는 2개의 기 (및 할로겐으로부터 선택된 임의의 추가의 치환체)로 치환될 수 있다.
단환형 카보사이클릭 치환체의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-에닐, 1-사이클로펜트-2-에닐, 1-사이클로펜트-3-에닐, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-에닐, 1-사이클로헥스-2-에닐, 1-사이클로헥스-3-에닐, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, -1,3-사이클로헥사디에닐, -1,4-사이클로헥사디에닐, -1,3-사이클로헵타디에닐, -1,3,5-사이클로헵타트리에닐, 및 -사이클로옥타디에닐을 포함한다.
임의의 구성성분 또는 임의의 식에서 1 초과 횟수로 임의의 변수가 발생할 때, 각 경우에서 그것의 정의는 모든 다른 경우에서의 정의와 독립적이다. 치환체 및/또는 변수의 조합은 이러한 조합이 안정한 화합물을 초래하는 경우에만 허용된다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 하이픈 (-)은 펜던트 분자에 대한 부착점을 지정한다. 따라서, 용어 "-(C1-C10 알킬렌)아릴" 또는 "-C1-C10 알킬렌(아릴)"은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 C1-C10 알킬렌 라디칼을 지칭하고, 여기서 알킬렌 라디칼은 알킬렌 라디칼의 임의의 탄소 원자에서 펜던트 분자에 부착되고 알킬렌 라디칼의 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 아릴 라디칼로 대체된다.
특정 기가 "치환된" 경우, 그 기는 치환체의 목록으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체, 바람직하게는 1 내지 5개 치환체, 더 바람직하게는 1 내지 3개 치환체, 가장 바람직하게는 1 내지 2개 치환체를 가질 수 있다. 그러나, 상기 기는 일반적으로 할로겐으로부터 선택된 임의의 수의 치환체를 가질 수 있다.
분자의 특정 위치에서 임의의 치환체 또는 변수의 정의는 그 분자의 다른 위치에서의 정의와 독립적인 것으로 의도된다. 본 발명의 화합물 상의 치환체 및 치환 패턴은 당해 분야의 숙련가에 의해 활성이고 화학적으로 안정하고, 당업계에서 공지된 기술뿐만 아니라 본 명세서에서 제시된 이들 방법에 의해 용이하게 합성될 수 있는 화합물을 제공하도록 선택될 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 동물, 그리고 보다 특히는 인간에서 사용하기 위해 일반적으로 인정되는, 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "약제학적으로 양립가능한 성분"은 푸코스 유사체가 함께 투여되는 약제학적으로 허용가능한 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 의미한다.
푸코스 유사체는 전형적으로 원하지 않는 오염물질로부터 실질적으로 순수하다. 이것은 유사체가 전형적으로 적어도 약 50%　w/w (중량/중량) 순도일 뿐만 아니라 간섭하는 단백질 및 다른 오염물질이 실질적으로 없는 것을 의미한다. 때때로 본 제제는 적어도 약 80% w/w 및, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 약 95% w/w 순도이다. 종래의 정제 기술을 사용하여, 적어도 99% w/w의 균질한 생성물이 수득될 수 있다.
II. 푸코스 유사체
본 명세서에서 다양한 구현예 중 임의의 것에서, 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
Figure pct00003
(I) (II)
또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태를 가질 수 있고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있고;
여기서 R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나,
또는
여기서 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 알키닐이다.
일부 구현예에서, R2는 -F이다.
일부 구현예에서, R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 푸코스 유사체는 식 (I) 또는 (II)를 가지며, 여기서 R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 푸코스 유사체는 식 (I) 또는 (II)를 가지며, 여기서 R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)C1-C10 알킬이다. 일부 선택된 구현예에서, 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)CH3이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R2는 -F이고, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R2는 -F이고, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 하나의 특정 구현예에서, R2는 -F이고 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R5는 -C≡CH이고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R5는 -C≡CH이고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 하나의 특정 구현예에서, R5는 -C≡CH이고 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH이다. 식 (I) 또는 (II)의 또 다른 특정 구현예에서, R5는 -C≡CH이고 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OAc이다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 하기 식:
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
또는 이들의 알도오스 형태를 가지고, 여기서 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 본 명세서에서 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스(2-deoxy-2-fluoro-L-fucose)이다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 알키닐 푸코스 퍼아세테이트이다. 알키닐 푸코스 퍼아세테이트는 알키닐 푸코스 테트라아세테이트, 알키닐 푸코스 트리아세테이트, 알키닐 푸코스 디아세테이트, 알키닐 푸코스 모노아세테이트, 또는 이들의 조합일 수 있다. 하나의 예시된 구현예에서, 푸코스 유사체는 (3S,4R,5R,6S)-6-에티닐테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라일 테트라아세테이트 또는 5-((S)-1-하이드록시프로프-2-인-1-일)테트라하이드로푸란-2,3,4-트리일 트리아세테이트이다.
임의의 다양한 구현예에서, 식 (I) 및 (II)의 푸코스 유사체의 엔도사이클릭 고리 산소는 황에 의해 대체될 수 있다.
식 I 및 II의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화물 형태가 또한 본 명세서에서 제공된다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 임의의 다양한 구현예에서, 개시된 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이 사용될 수 있다. 용매화물은 전형적으로 화합물의 생리적 활성을 크게 변화시키지 않고 따라서 약리적 등가물로서 기능할 수 있다. 용매화물의 한 유형은 수화물이다.
일부 양태에서, 푸코스 유사체는 적어도 10 mM의 농도로 제형 완충액 (예를 들어 수성 제형 완충액)에서 가용성이다. 일부 구현예에서, 푸코스 유사체는 적어도 100 mM의 농도로 제형 완충액에서 가용성이다. 일부 양태에서, 푸코스 유사체는 적어도 100 μg/ml, 적어도 1 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 약 100 mg/ml, 적어도 약 200 mg/ml, 또는 적어도 약 300 mg/ml의 농도로 제형 완충액 (예를 들어 수성 제형 완충액)에서 가용성이다.
III. 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법
일부 양태에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
II-1. 시험관내 또는 생체외 생산 방법
일부 양태에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 시험관내 또는 생체외 방법이 제공된다. 본 방법은 세포 배양 배지에서 본 명세서에 개시된 푸코스 유사체의 존재하에 T 세포를 배양하는 단계 및 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법에 의해 생산된 T 세포는 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 T 세포에 비교하여 감소된 표면 푸코실화를 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 이러한 T 세포는 치료적 목적 예컨대 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 적어도 일부 구현예에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 "치료적 T 세포"로 지칭된다.
일부 구현예에서, 본 방법에서 사용된 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
Figure pct00006
(I) (II)
또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태를 가질 수 있고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있고;
여기서 R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나,
또는
여기서 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 알키닐이다.
일부 구현예에서, R2는 -F이다.
일부 구현예에서, R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 식 (I) 또는 (II)를 가지며, 여기서 R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 식 (I) 또는 (II)를 가지며, 여기서 R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)C1-C10 알킬이다. 일부 선택된 구현예에서, 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)CH3이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R2는 -F이고, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R2는 -F이고, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 하나의 특정 구현예에서, R2는 -F이고 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R5는 -C≡CH이고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R5는 -C≡CH이고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 하나의 특정 구현예에서, R5는 -C≡CH이고 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH이다. 식 (I) 또는 (II)의 또 다른 특정 구현예에서, R5는 -C≡CH이고 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OAc이다.
일부 선택된 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 하기 식:
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
,
또는 이들의 알도오스 형태를 가지고, 여기서 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 본 명세서에서 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스이다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 알키닐 푸코스 퍼아세테이트이다. 알키닐 푸코스 퍼아세테이트는 알키닐 푸코스 테트라아세테이트, 알키닐 푸코스 트리아세테이트, 알키닐 푸코스 디아세테이트, 알키닐 푸코스 모노아세테이트, 또는 이들의 조합일 수 있다. 하나의 예시된 구현예에서, 푸코스 유사체는 (3S,4R,5R,6S)-6-에티닐테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라일 테트라아세테이트 또는 5-((S)-1-하이드록시프로프-2-인-1-일)테트라하이드로푸란-2,3,4-트리일 트리아세테이트이다.
임의의 다양한 구현예에서, 식 (I) 및 (II)의 푸코스 유사체의 엔도사이클릭 고리 산소는 황에 의해 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포 배양 배지에서 푸코스 유사체의 존재하에 T 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지에 존재하는 다른 유형의 세포, 예를 들어 적혈구가 있다. 배양되는 T 세포는 대상체(예를 들어 인간 또는 비-인간 동물)로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 배양되는 T 세포는 세포의 사전 배양된 및/또는 저장된 모집단으로부터의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 이러한 요법을 필요로 하는 대상체를 위한 입양 세포 요법에 사용될 수 있는 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산한다. T 세포 및 세포 모집단이 샘플, 예컨대 생물학적 샘플, 예를 들어, 대상체로부터 수득되거나 또는 유래된 것으로부터 단리되는 구현예에서, 상기 대상체는 세포 요법이 필요한 환자 또는 세포 요법이 투여될 환자, 즉 자가 공급원일 수 있다. 대안적으로, T 세포 및 세포 모집단은 입양 세포 요법을 필요로 하는 환자가 아닌 공여체, 즉 동종이계 공급원으로부터 단리될 수 있다. 공여체는 건강한 인간 또는 세포 요법이 필요한 환자 또는 세포 요법이 투여될 환자가 가지고 있는 것과 동일한 병태 또는 질환을 앓고 있는 또 다른 환자일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수득된 세포는 일차 세포, 예를 들어, 일차(primary) 인간 세포의 혼합물일 수 있다. 샘플은 조직, 유체, 및 대상체로부터 직접적으로 취해진 다른 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 처리 단계, 예컨대 분리, 원심분리, 세정, 인큐베이션 및/또는 배양으로부터 유래한 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접적으로 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 조직 및 장기 샘플 예컨대 비장을 포함하고, 이들로부터 유래된 가공된 샘플을 포함한다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 가슴샘, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 소화관 연관 림프양 조직, 점막 연관 림프양 조직, 비장, 다른 림프양 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도, 또는 다른 장기, 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 관점에서, 자가 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서 세포는 이종발생성 공급원, 예를 들어, 마우스, 랫트, 비-인간 영장류, 및 돼지로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라 배양되는 세포는 존재하는 세포주, 예를 들어, T 세포주로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양을 위한 세포 또는 모집단의 단리는 하나 이상의 제조 및 분리 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 원치않는 성분을 제거하고, 원하는 구성요소를 농축하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해 세정, 원심분리, 및/또는 하나 이상의 시약의 존재하에 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 특성, 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 감수성, 표면 마커 발현 프로파일, 및/또는 특정 성분에 대한 내성에 기초하여 분리된다.
혈액 세포가 대상체로부터 수집되는 일부 구현예에서, 수집분석된 혈액 세포는 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 처리 단계에 적합한 완충액 또는 배지에 배치하기 위해 세정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 세정 후 당업계에 공지된 다양한 생체적합성 완충액에서 재현탁될 수 있다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거될 수 있고 세포는 배양 배지에 재현탁될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 밀도-기반 세포 분리 방법, 예컨대 적혈구를 용해시키고 원심분리함으로써 말초 혈액으로부터 백혈구의 제조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 하나 이상의 특이적 분자, 예컨대 표면 마커, 예를 들어, 표면 단백질의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초하여 상이한 세포 유형을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리는 친화성- 또는 면역친화성-기반 분리일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서 분리는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 예를 들어 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너로 인큐베이션하고, 이어서 일반적으로 세정 단계 및 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 이들 세포로부터 결합된 항체 또는 결합 파트너를 갖는 세포의 분리에 의한 세포 및 세포 모집단의 분리를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포의 아형 중 하나 이상이 추가로 농축될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포의 아형은 T 세포 상의 하나 이상의 특정 마커, 예컨대 표면 마커의 존재 또는 수준에 의해 결정될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 마커는 T 세포의 특정 모집단 (예컨대 비-기억 세포)에서 부재이거나 상대적으로 낮은 수준으로 발현되지만, T 세포의 특정 다른 모집단(예컨대 기억 세포)에서는 존재하거나 상대적으로 더 높은 수준으로 발현되는 것들이다. 일 구현예에서, 세포(예컨대 CD8+　세포 또는 T 세포, 예를 들어, CD3+　세포)는 CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127, 및/또는 CD62L에 양성이거나 또는 높은 표면 수준을 발현하는 세포에 대해 농축되고(즉, 이들에 대해 양성으로 선택됨), 및/또는 CD45RA에 양성이거나 또는 높은 표면 수준을 발현하는 세포에 대해 감손된다(예를 들어, 이들에 대해 부정적으로 선택된다). 일부 구현예에서, 세포는 CD122, CD95, CD25, CD27, 및/또는 IL7-Ra (CD127)에 양성이거나 또는 높은 표면 수준을 발현하는 세포에 대해 농축되거나 또는 감손된다. 일부 예에서, CD8+ T 세포는 CD45RO에 대해 양성 (또는 CD45RA에 대해 음성) 및 CD62L에 대해 양성인 세포에 대해 농축된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 원하는 세포 모집단은 다중 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포가 유동성 흐름으로 운반되는 유세포분석(flow cytometry)을 통해 수집되고 농축될 수 있다(또는 감손될 수 있다). 일부 구현예에서, 일차 T 세포 모집단 또는 생산된 T 세포는 분취 척도 (FACS)-분류를 통해 수집되고 농축될 수 있다(또는 감손될 수 있다). 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출가능한 마커로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선택을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광으로 표지된 항체에 대한 결합에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 다른 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 유체 흐름에서, 예컨대 분취 척도(FACS) 및/또는 마이크로전기기계적 시스템(MEMS) 칩을 포함한, 형광-활성화된 세포 분류(FACS), 예를 들어, 유세포분석 검출 시스템(flow-cytometric detection system)과 조합에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 마커에 기반하여 동시에 양성 및 음성 선택을 가능하게 한다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 모집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 부재할 필요는 없다. 예를 들어, 일부 구현예에서, CD3+ T 세포 모집단의 일부가 상기 모집단에 대해 농축되지만, 일부 경우에, 농축된 집단에 여전히 존재할 수 있는 비-CD3+ T 세포 및/또는 비-T 세포 모집단을 포함할 수 있는, 다른 비-선택된 세포의 일부 잔존 또는 작은 백분율을 또한 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 표면 푸코실화의 감소를 갖는 T 세포는 인간 말초 T 세포를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 세포 유형의 분리 또는 농축은 배양 배지에서 세포의 모집단을 배양하는 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 샘플로부터 단리된 일차 세포의 혼합물은 T 세포를 분리 또는 농축하고 다른 유형의 세포 또는 성분들(예를 들어, 혈소판 및 적혈구)을 제거(예를 들어, 그 수를 감소)하기 위해 처리될 수 있다. 그런 다음 T 세포의 농축된 모집단이 배양으로 진행될 수 있다. 대안적으로, 다른 예에서, 샘플로부터 단리된 T 세포 및 다른 유형의 세포 또는 성분을 함유하는 세포의 혼합물은 실질적으로 T 세포를 분리하거나 농축함 없이 배양 배지에서 배양될 수 있다. 세포 모집단이 원하는 수에 도달하거나 배양 단계가 실질적으로 완료된 후, 배양 세포는 추후 사용, 예를 들어 입양 세포 요법 또는 암 치료를 위해 T 세포를 분리 또는 농축하기 위해 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 및 세포 집단을 배양하기 위한 하나 이상의 다양한 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 샘플로부터 단리되거나 존재하는 세포주로부터 수득된 세포의 모집단을 배양하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 일부 대안적인 구현예에서, 본 방법은 샘플로부터 수득되고 단리되거나 존재하는 세포주로부터 수득된 세포의 혼합물로부터 분리된 세포의 모집단을 배양하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현예 중 일부에서, 배양되는 세포의 모집단의 대부분(예를 들어, 세포의 총 모집단의 적어도 20% 이상)은 초기 세포의 모집단으로부터 분리되거나 농축된 T 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양되는 복수의 세포는 일반적으로 용기, 예컨대 동일한 유닛, 챔버, 웰, 칼럼, 튜브, 튜우빙 세트, 밸브, 바이알, 배양 접시, 백 또는 다른 배양 또는 세포 배양용 용기에서 배양될 수 있다.
배양 단계는 하기 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다: 자극 조건, 예를 들어, 모집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화, 및/또는 생존을 유도하기 위해 설계된 조건의 존재하에 인큐베이션에 의한 것을 포함하는, 배양, 배양화, 자극, 활성화, 번식.
조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 작용제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 특성을 변형하기 위해 설계된 하나 이상의 작용제가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 푸코스 유사체가 세포, 특히 T 세포의 표면 상의 푸코실화의 수준을 변형시키기 위해 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 푸코스 유사체의 존재하에 T 세포를 배양함에 의해 T 세포를 변형시키는 것을 포함한다. 푸코스 유사체는 세포 배양 배지 안으로 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 배양 배지의 약 1 ng/mL 내지 수 mg/mL의 농도로 푸코스 유사체를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 푸코스 유사체를 배양 배지의 약 1 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 150 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 250 ng/mL, 약 300 ng/mL, 약 350 ng/mL, 약 400 ng/mL, 약 450 ng/mL, 약 500 ng/mL, 약 550 ng/mL, 약 600 ng/mL, 약 650 ng/mL, 약 700 ng/mL, 약 750 ng/mL, 약 800 ng/mL, 약 약 950 ng/mL, 약 1 μg/mL, 약 10 μg/mL, 약 50 μg/mL, 약 100 μg/mL, 약 150 μg/mL, 약 200 μg/mL, 약 250 μg/mL, 약 300 μg/mL, 약 350 μg/mL, 약 400 μg/mL, 약 450 μg/mL, 약 500 μg/mL, 약 550 μg/mL, 약 600 μg/mL, 약 650 μg/mL, 약 700 μg/mL, 약 750 μg/mL, 약 800 μg/mL, 약 약 950 μg/mL, 약 1 mg/mL, 약 2 mg/mL, 약 3 mg/mL, 약 4mg/mL, 약 5mg/mL의 농도 이상, 또는 전술한 값들의 임의의 사이 값으로 함유할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지 내에서의 최종 농도 약 1 nM 내지 수 mM의 푸코스 유사체를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 푸코스 유사체를 세포 배양 배지에서의 최종 농도 약 1 nM, 약 10 nM, 약 50 nM, 약 100 nM, 약 150 nM, 약 200 nM, 약 250 nM, 약 300 nM, 약 350 nM, 약 400 nM, 약 450 nM, 약 500 nM, 약 550 nM, 약 600 nM, 약 650 nM, 약 700 nM, 약 750 nM, 약 800 nM, 약 약 950 nM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 50 μM, 약 100 μM, 약 150 μM, 약 200 μM, 약 250 μM, 약 300 μM, 약 350 μM, 약 400 μM, 약 450 μM, 약 500 μM, 약 550 μM, 약 600 μM, 약 650 μM, 약 700 μM, 약 750 μM, 약 800 μM, 약 약 950 μM, 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4mM, 약 5mM 이상의 농도, 또는 전술한 값들의 임의의 사이 값으로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 활성화된 T 세포의 모집단을 생성하기 위해 하나 이상의 T 세포 활성화 제제로 T 세포를 활성화하는 것을 포함한다. 비제한적으로, T-세포 자극 또는 공통자극 분자를 표적화하는 항체 또는 이들의 기능적 단편(예를 들어, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도의 항-CD2 항체, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 또는 이들의 기능적 단편) T 세포 사이토카인(예를 들어, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도의 임의의 단리된, 야생형, 또는 재조합 사이토카인 예컨대: 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2, (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 5 (IL-5), 인터류킨 7 (IL-7), 인터류킨 15 (IL-15), 종양 괴사 인자 α (TNF α)), 또는 임의의 다른 적합한 미토겐(예를 들어, 임의의 원하는 농도의 테트라데카노일 포르볼 아세테이트 (TPA), 파이토헤마글루티닌 (PHA), 콘카나발린 A (conA), 리포폴리사카라이드 (LPS), 미국자리공 미토겐 (PWM)) 또는 T-세포 자극 또는 공통자극 분자에 대한 천연 리간드를 임의의 원하는 농도로 포함하는 하나 이상의 적합한 T-세포 활성화 제제의 임의의 조합이 활성화된 T 세포의 모집단을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 항-CD3 항체 (또는 이들의 기능적 단편), 항-CD28 항체 (또는 이들의 기능적 단편), 또는 항-CD3과 항-CD28 항체의 조합이 T 림프구의 모집단을 자극하는 단계에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 배양의 완료 전 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21일 또는 그 초과 일 동안 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 1회 이상 계대배양될 수 있고, 즉 배양 세포의 적어도 일부는 배양이 완료되기 전에 이전의 배양 배지에서 새로운 배양 배지로 이전된다. 일부 다른 구현예에서, 세포는 배양이 완료되기 전에 1회로 배양될 수 있다. 배양 배지에 첨가된 임의의 제제는 전체 배양 기간 동안 1회 이상 세포에 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서의 방법에 유용한 배양된 T 세포의 농도는 약 1.0 - 10.0 x 106　세포/mL일 수 있다. 특정 구현예에서, 배양된 T 세포의 농도는 약 1.0 - 2.0 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 3.0 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 4.0 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 5.0 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 6.0 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 7.0 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 8.0 x 106　세포/mL, 1.0 - 9.0 x 106　세포/mL, 또는 약 1.0 - 10.0 x 106　세포/mL일 수 있다. 특정 구현예에서, 배양된 T 세포의 농도는 약 1.0 - 2.0 x 106　세포/mL일 수 있다. 특정 구현예에서, 배양된 T 세포의 농도는 약 1.0 - 1.2 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 1.4 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 1.6 x 106　세포/mL, 약 1.0 - 1.8 x 106　세포/mL, 또는 약 1.0 - 2.0 x 106　세포/mL일 수 있다. 특정 구현예에서, 림프구의 농도는 적어도 약 1.0 x 106 세포/mL, 적어도 약 1.1 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.2 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.3 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.4 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.5 x 106cells/mL, 적어도 약 1.6 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.7 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.8 x 106　세포/mL, 적어도 약 1.9 x 106　세포/mL, 적어도 약 2.0 x 106 세포/mL, 적어도 약 4.0 x 106　세포/mL, 적어도 약 6.0 x 106　세포/mL, 적어도 약 8.0 x 106　세포/mL, 또는 적어도 약 10.0 x 106　세포/mL일 수 있다.
상기에 기재된 방법에 의해 배양된 T 세포는 감소된 표면 푸코실화를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 감소된 표면 푸코실화는 정상 T 세포의 표면 상에 자연적으로 존재하는 푸코실화의 수준의 감소 또는 억제를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 상의 표면 푸코실화의 감소는 T 세포에 인공적으로 제공된 푸코스 유사체로 T 세포 표면 상에 자연적으로 존재하는 푸코스의 치환은 포함하지 않는다.
상기에 기재된 방법에 의해 배양된 T 세포는 감소된 표면 푸코실화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 배양되고 생산된 T 세포 상의 평균 표면 푸코실화는 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 T 세포, 즉 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비교할 때 적어도 약 5% 감소를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 배양되고 생산된 T 세포 상의 평균 표면 푸코실화는 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비교하여 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99%, 약 100% 감소를 가질 수 있다. T 세포 상의 표면 푸코실화의 수준은 당업계에서 이용가능한 기술, 예를 들어 유세포분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 단계는 완료될 수 있고 배양된 세포는 적어도 일부의 배양된 세포의 수집 (또는 수확) 단계로 진행될 수 있다. 배양 단계는 배양 세포의 수가 원하는 수에 도달할 때, 계획된 배양 기간이 경과한 후, 및/또는 배양 T 세포 상의 평균 표면 푸코실화가 원하는 수준에 도달하는 경우 (예를 들어, 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비하여 적어도 5% 또는 그 초과 감소) 완료될 수 있다.
배양 단계가 완료된 후, 세포는 당업계에서 이용가능한 기술에 의해 수확될 수 있다. 수확의 단계는 원심 분리, 세정, 원치 않는 세포 또는 성분의 제거, 및 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 원하는 유형의 세포의 단리와 같은 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 포함하는, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 세포의 모집단은 선택적으로 동결보존되어, 세포가 예를 들어 입양 세포 요법 또는 암 치료에서 투여, 또는 요법이나 치료를 위한 약제학적 조성물의 제형화를 위해 나중에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 희석제 용액으로 원하는 T 세포, 즉 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포의 모집단을 세정하고 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 희석제 용액은 정상 식염수, 0.9% 식염수, 플라즈마라이트 A, 5% 덱스트로스/0.45% NaCI 식염수 용액, 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, HSA는 해동 후 개선된 세포 생존력 및 세포 회복을 위해 세정되고 농축된 세포에 첨가될 수 있다. 다른 구현예에서, 세정 용액은 정상 식염수일 수 있고 세정되고 농축된 세포는 HSA (5%)로 보충될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결보존 혼합물이 생성될 수 있다. 동결보존 혼합물은 희석제 용액 중의 세포의 희석된 모집단 및 적합한 동결 보존제 용액을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 동결보존제 용액은 생산된 T 세포의 희석제 용액과 혼합된, 당 업계에서 이용가능한 임의의 적합한 동결 보존제 용액일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 또한 동결보존 혼합물을 동결시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 동결보존 혼합물은 임의의 원하는 세포 농도, 예를 들어 동결보존 혼합물 ml 당 약 106 내지 108으로 정의된 냉동 사이클을 사용하여 제어된 속도의 냉동고에 냉동된다. 본 방법은 또한 동결보존 혼합물을 증기상 액체 질소에 저장하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법에 의해 생산된 T 세포, 예를 들어 표면 푸코실화의 감소를 갖는 T 세포는 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생산된 T 세포는 요법 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법에 의해 생산된 T 세포, 예를 들어 표면 푸코실화의 감소를 갖는 T 세포는 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다.
II-2. 생체내 생산 방법
일부 양태에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 생체내 방법이 본 명세서에서 제공된다. 본 방법은 동물에 푸코스 유사체를 제공하는 단계 및 동물로부터 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 이들 방법에 의해 생산된 T 세포는 푸코스 유사체가 제공되지 않은 동물에 존재하거나 이들로부터 수득된 T 세포에 비교하여 감소된 표면 푸코실화를 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 이러한 T 세포는 치료적 목적 예컨대 입양 세포 요법 또는 암 치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 적어도 일부 구현예에서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 "치료적 T 세포"로 지칭된다.
일부 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
Figure pct00009
(I) (II)
또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태를 가질 수 있고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있고;
여기서 R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나,
또는
여기서 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 알키닐이다.
일부 구현예에서, R2는 -F이다.
일부 구현예에서, R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 식 (I) 또는 (II)를 가지고, 여기서 R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 식 (I) 또는 (II)를 가지고, 여기서 R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서, 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 R5는 -C≡CH이다.
일부 구현예에서, 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)C1-C10 알킬이다. 일부 선택된 구현예에서, 가수분해성 에스테르기는 -OC(O)CH3이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R2는 -F이고, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R2는 -F이고, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 하나의 특정 구현예에서, R2는 -F이고 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH이다.
식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R5는 -C≡CH이고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 일부 선택된 구현예에서 R5는 -C≡CH이고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된다. 식 (I) 또는 (II)의 하나의 특정 구현예에서, R5는 -C≡CH이고 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OH이다. 식 (I) 또는 (II)의 또 다른 특정 구현예에서, R5는 -C≡CH이고 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 -OAc이다.
일부 선택된 구현예에서, 본 방법에 사용된 푸코스 유사체는 하기 식:
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
,
또는 이들의 알도오스 형태를 가지고, 여기서 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 본 명세서에서 정의되고 기재된 바와 같다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스이다.
일부 선택된 구현예에서, 푸코스 유사체는 알키닐 푸코스 퍼아세테이트이다. 알키닐 푸코스 퍼아세테이트는 알키닐 푸코스 테트라아세테이트, 알키닐 푸코스 트리아세테이트, 알키닐 푸코스 디아세테이트, 알키닐 푸코스 모노아세테이트, 또는 이들의 조합일 수 있다. 하나의 예시된 구현예에서, 푸코스 유사체는 (3S,4R,5R,6S)-6-에티닐테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라일 테트라아세테이트 또는 5-((S)-1-하이드록시프로프-2-인-1-일)테트라하이드로푸란-2,3,4-트리일 트리아세테이트이다.
임의의 다양한 구현예에서, 식 (I) 및 (II)의 푸코스 유사체의 엔도시클릭 고리 산소는 황에 의해 대체될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 방법은 동물에게 푸코스 유사체를 제공하는 단계를 함유할 수 있다. 동물에게 푸코스 유사체의 제공은 다양한 방식의 투여를 통해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서 푸코스 유사체는, 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 볼, 설하, 또는 좌약 투여를 포함하는 표준 투여 기술을 사용하여 동물에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 모집단은 비경구로 투여된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 모집단은 정맥내, 복강내, 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 푸코스 유사체는 동물에게 경구로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 입양 세포 요법 또는 암 치료에서 이러한 요법 또는 치료가 필요한 대상체에 대해 사용될 수 있는 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산한다.
일부 구현예에서, T 세포를 사용한 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법 또는 암 치료는 세포가 세포 요법 또는 치료를 받는 대상체로부터, 또는 이러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고 및/또는 달리는 이들로부터 제조된 자가 이식에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 푸코스 유사체는 치료가 필요한 대상체에게, 예를 들어, 환자에게 제공 또는 투여될 수 있고, 그리고 단리 및 가공 후 얻어진 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 동일한 대상체에 대해 투여된다.
일부 구현예에서, T 세포를 사용한 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법 또는 암 치료는 세포가 세포 요법 또는 치료를 받을 예정이거나 또는 궁극적으로 받는 대상체, 예를 들어, 제1 대상체 이외의 대상체로부터 단리되고 및/또는 달리 이들로부터 제조된 동종이계 이식에 의해 수행될 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 세포는 그 다음 동일한 종의 상이한 대상체, 예를 들어, 제2 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전자적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전자적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전자적으로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 동일한 종에 속하지 않고, 예를 들어 제1 대상체는 인간이고 제2 대상체는 비-인간 동물이다. 제2 대상체로부터 수득된 T 세포는 제1 대상체의 요법 또는 치료를 위해 단리되고 가공될 수 있다.
푸코스 유사체의 유효량이 동물에게 제공될 수 있다. 유효량은 원하는 결과, 즉 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포의 생산을 생성하기에 충분한 푸코스 유사체의 양을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸코스 유사체의 유효량은 약 1 내지 약 500 mg/체중 kg의 푸코스 유사체의 범위 내일 수 있다. 푸코스 유사체가 경구로, 예를 들어 음식 또는 물과 함께 공급(feeding)을 통해 제공 또는 투여되는 일부 구현예에서, 동물에게 투여되는 푸코스 유사체의 경구 투약량은 약 1 mg/kg 내지 약 1 g/동물의 체중 kg, 더욱 전형적으로 약 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg 내지 약 1 g/동물의 체중 kg일 수 있다. 일부 양태에서, 동물에게 투여되는 투약량은 1일당 약 1g, 약 5 g, 또는 약 10 g 내지 약 150 g, 또는 1일당 약 1 g, 약 5 g, 약 10 g, 약 15 g 또는 약 20 g 내지 약 60 g이다. 일부 구현예에서, 푸코스 유사체는 푸코스 유사체가 공급된 동물에서 표면 푸코실화의 감소를 유도하기에 적합한 임의의 원하는 양으로 음식 또는 물과 함께 제공될 수 있다.
일부 구현예에서 본 명세서에서 기재된 방법에서 사용된 푸코스 유사체는 하나 이상의 추가의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께, 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 동물에게 공-투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸코스 유사체 또는 이들의 조성물은 특정 기간 동안, 예를 들어 1일 내지 며칠, 1주 내지 몇 주, 1개월 내지 몇 개월 또는 그 이상 동안, 중단이 있거나 또는 중단 없이 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸코스 유사체 또는 이들의 조성물은 매일, 매주, 격주로 또는 매월 스케줄로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 동물에게 푸코스 유사체의 제공 또는 투여는 원하는 결과가 달성될 때, 예를 들어, 동물로부터 수득된 T 세포의 평균 표면 푸코실화가 대조군 T 세포에 비하여 임의의 수의 백분율, 예를 들어 약 5% 내지 약 95% 사이로 감소될 때 완료될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 방법은 푸코스 유사체가 제공된 동물로부터 세포, 예를 들어 T 세포의 혼합물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 수득된 세포는 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 포함할 수 있다.
상기에 기재된 방법에 의해 배양된 T 세포는 감소된 표면 푸코실화를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 감소된 표면 푸코실화는 정상 T 세포의 표면 상에 자연적으로 존재하는 푸코실화의 수준의 감소 또는 억제를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 상의 표면 푸코실화의 감소는 T 세포에 인공적으로 제공된 푸코스 유사체로 T 세포 표면 상에 자연적으로 존재하는 푸코스의 치환을 포함하지는 않는다.
상기에 기재된 방법에 의해 생산된 T 세포는 감소된 표면 푸코실화를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 푸코스 유사체가 제공된 동물로부터 수득된 T 세포 상의 평균 표면 푸코실화는 푸코스 유사체가 제공되지 않은 동물에 존재하거나 이로부터 수득된 T 세포, 즉 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비교하여 적어도 약 5% 감소를 가질 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 푸코스 유사체가 제공된 동물로부터 수득된 T 세포 상의 평균 표면 푸코실화는 대조군 T 세포가 시험 또는 수득되기 전 적어도 몇 시간, 며칠, 몇 주, 몇 개월 또는 그 초과 동안 푸코스 유사체가 제공되지 않은 동물에 존재하거나 이로부터 수득된 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비교하여 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99%, 약 100% 감소를 가질 수 있다. T 세포 상의 표면 푸코실화의 수준은 당업계에서 이용가능한 기술, 예를 들어 유세포분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 및 세포 모집단은 푸코스 유사체가 제공된 동물로부터 또는 그로부터 유래된 샘플, 예컨대 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 샘플은 조직, 유체, 및 동물로부터 직접적으로 취해진 다른 샘플을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접적으로 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 조직 및 장기 샘플 예컨대 비장을 포함하고, 이들로부터 유래된 가공된 샘플을 포함한다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 가슴샘, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 소화관 연관된 림프양 조직, 점막 연관된 림프양 조직, 비장, 다른 림프양 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도, 또는 다른 장기, 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포 및 세포 모집단이 동물로부터 수득된 후, 수득된 세포의 분리, 원심분리, 세정, 인큐베이션 및/또는 배양과 같은 하나 이상의 처리 단계가 있을 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포를 함유하는 수득된 세포 모집단은 T 세포를 단리 또는 농축하고 다수의 다른 유형의 세포(예를 들어, 적혈구) 및/또는 성분(예를 들어, 혈소판)을 제거(또는 감소)하기 위해 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 수득된 세포 모집단 또는 추가로 농축된 T 세포는 나중에 사용, 예를 들어 입양 세포 요법 또는 암 치료, 또는 약제학적 조성물의 제형화에 사용하기 위하여 세포를 유지하고 및/또는 세포 수를 충분히 증가시키기 위해 당 업계에서 이용가능한 기술을 사용하여 세포 배양 배지에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물로부터 수득되거나 또는 동물로부터 단리된 후 추가로 배양된 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 추후 사용을 위해, 예를 들어 당 업계에서 이용가능하거나 본 개시의 다른 곳에 기술된 바와 같은 동결보존 기술에 의해 저장될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 생체내 생산 방법에 의해 생산된 표면 푸코실화의 감소를 갖는 T 세포는 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물로부터 수득되거나 또는 동물로부터 단리된 후 추가로 배양되어 생산된 T 세포는 이러한 요법 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물로부터 수득되거나 또는 동물로부터 단리된 후 추가로 배양되어 생산된 T 세포는 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용될 수 있는 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물은 인간이다.
본 명세서에서 기재된 생산 방법은 T 세포의 모집단을 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 모집단은 형질도입된 T 세포의 모집단을 생성하기 위해 세포 표면 수용체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 유전 물질을 세포에 전달하기 위해 바이러스 벡터로서 여러 재조합 바이러스가 사용되어 왔다. 형질도입 단계에 따라 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 비제한적으로, 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 렌티바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 벡터, 및 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한 임의의 동종성(ecotropic) 또는 양쪽성(amphotropic) 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터를 성장시키기 위한 임의의 적합한 성장 배지 및/또는 보충물은 당해 분야에서 알려진 방법에 따라 바이러스 벡터 접종물에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 표면 수용체를 인코딩하는 이종성 유전자를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 세포 표면 수용체는 표적 세포의 표면, 예를 들어 종양 세포의 표면 상에서 항원에 결합할 수 있다.
IV. 입양 세포 요법 또는 암 치료를 위한 약제학적 조성물
상기-기재된 생산 방법에 의해 생산된 감소된 표면 푸코실화를 갖는 세포 모집단 또는 T 세포는 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 원하는 T 세포 (또는 치료적 T 세포), 즉 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포 또는 이러한 T 세포를 갖는 세포의 혼합물은 치료적 또는 예방적 유효량의 원하는 T 세포 및 하나 이상의 약제학적으로 양립가능한 (허용가능한) 성분을 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 유효량의 T 세포가 대상체에게 투여하기에 적합한 부형제와 혼합된 치료적 T 세포 및 약제학적 부형제의 약제학적 조성물이 제공될 수 있다. 바람직한 양태에서, T 치료적 세포 및 그의 약제학적 조성물은 인간에게 투여하기 위해 제형화된다. 따라서, 본 개시내용은 인간에게 투여하기 위해 제형화된 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 제형화된 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 양립가능한 (허용가능한) 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물을 제조하는 데 사용되는 물질은 사용된 양에서 무독성일 수 있다. 약제학적 조성물에서 활성 성분(들)의 최적의 투약량은 다양한 인자에 의존할 것이라는 것은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 관련 인자는, 비제한적으로, 동물의 유형 (예를 들어, 인간), 투여의 방식, 사용된 조성물, 및 치료되는 질환 또는 병태의 중증도를 포함한다.
본 명세서에서의 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 액체, 예를 들어, 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀션 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 액체는 주사에 의한 전달에 유용할 수 있다. 주사 투여용 조성물 (상기에 기재된 바와 같음)에는 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충액, 안정화제 및 등장제 중 하나 이상이 또한 포함될 수 있다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 조성물이 동물(예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있게 하는 임의의 형태일 수 있다. 전형적인 투여 경로는, 비제한적으로, 경구, 비경구, 및 설하를 포함한다. 비경구 투여는 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 이들 약제학적 조성물은 요법 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 조성물의 투여시 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포가 효과적일 수 있도록 제형화될 수 있다.
V. 치료 방법
일부 양태에서, 대상체에게 입양 세포 요법을 제공하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 본 방법은 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 대상체에게 입양 세포 요법을 제공한다. 대상체에게 입양 세포 요법의 제공은 대상체에게, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포 (즉 치료적 T 세포)를 포함하는 세포의 혼합물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 이러한 요법을 필요로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에게 입양 세포 요법의 제공은 또한 본 개시의 다른 곳에 기재된 임의의 시험관내 및 생체내 방법에 따른 요법을 위한 치료적 T 세포를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 입양 세포 요법은 종양내침윤 림프구 (TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법 (eACT™), 동종이계 T 세포 이식, 비-T 세포 이식, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 입양 세포 요법은 종양 세포를 인식하고 결합할 수 있는 자가 또는 동종이계 T 세포를 선택하고, 시험관내에서 농축하고, 환자에게 투여하는 임의의 방법을 광범위하게 포함할 수 있다. TIL 면역요법은 종양 조직을 침윤할 수 있는 림프구가 단리되고, 시험관내에서 농축되고, 환자에게 투여되는 입양 T 세포 요법의 한 유형이다. TIL 세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 자가 세포 요법은 환자로부터 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 T 세포를 단리하는 단계, 시험관내에서 T 세포를 농축하는 단계, 및 동일한 환자에게 T 세포를 다시 투여하는 단계를 포함하는 입양 T 세포 요법이다. 동종이계 T 세포 이식은 생체외 팽창된 자연 발생 T 세포 또는 유전자적으로 조작된 T 세포의 이식을 포함할 수 있다. 조작된 자가 세포 요법은 환자 자신의 림프구가 단리되고, 종양 표적화 분자를 발현시키도록 유전적으로 변형되어, 시험관내에서 팽창되고, 환자에게 다시 투여되는 입양 T 세포 요법이다. 비-T 세포 이식은 비제한적으로 자연 살해 (NK) 세포와 같은 비-T 세포로의 자가 또는 동종이계 요법을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 암을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 본 방법은 그와 같은 치료가 필요한 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 또한 본 개시의 다른 곳에 기재된 임의의 시험관내 및 생체내 방법에 따른 치료를 위한 치료적 T 세포를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따른 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용된 T 세포는 대조군 T 세포에 비하여 감소된 표면 푸코실화를 갖는 치료적 T 세포이다. 일부 양태에서, 감소된 표면 푸코실화는 정상 T 세포의 표면에 자연적으로 존재하는 푸코실화 수준의 감소 또는 억제를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 상의 표면 푸코실화의 감소는 T 세포에 인공적으로 제공된 푸코스 유사체로의 T 세포 표면 상에 자연적으로 존재하는 푸코스의 치환을 포함하지 않는다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용되는 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 요법 또는 치료, 즉, 자가 요법 또는 치료를 받을 동일한 대상체, 또는 요법 또는 치료, 즉, 동종이계 요법 또는 치료를 받을 대상체와 다른 대상체로부터 유래될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따른 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용되는 T 세포는 대조군 T 세포에 비해 감소된 표면 푸코실화를 갖는 치료적 T 세포이다. 일부 구현예에서, 특히 자가 요법 또는 치료가 인간 환자에게 투여되는 경우, 동일한 환자로부터 유래된 T 세포는 본 명세서에 개시된 시험관내 또는 생체내 방법에 따라 처리되어 치료적 T 세포를 생성할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 대조군 T 세포는 (1) 정상의 건강한 인간에 존재하거나 그로부터 수득된 T 세포의 모집단, 또는 (2) 치료적 T 세포의 생산 이전에 동일한 환자에 존재하거나 그로부터 수득된 T 세포의 모집단을 지칭할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 특히 동종이계 요법 또는 치료가 인간 환자에게 투여되는 경우, 환자가 아닌 공여체로부터 유래된 T 세포는 본 명세서에 개시된 시험관내 또는 생체내 방법에 따라 처리되어 치료적 T 세포를 생성할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 대조군 T 세포는 치료적 T 세포의 생산 이전에 공여체에 존재하거나 그로부터 수득된 T 세포의 모집단을 지칭할 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 동종이계 요법 또는 치료가 인간 환자에게 투여되고 요법 또는 치료에서 사용된 치료적 T 세포가 비-인간 동물 (즉 공여체 동물)로부터 유래하는 경우, 대조군 T 세포는 (1) 정상의 건강한 비-인간 동물에 존재하거나 그로부터 수득된 T 세포의 모집단, 또는 (2) 치료적 T 세포의 생산 이전에 공여체 동물에 존재하거나 그로부터 수득된 T 세포의 모집단을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따른 입양 세포 요법 또는 암 치료에서 사용된 T 치료적 세포 상의 평균 표면 푸코실화는 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비교하여 적어도 약 5% 감소를 가질 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 푸코스 유사체가 제공된 동물로부터 수득된 T 세포 상의 평균 표면 푸코실화는 대조군 T 세포의 평균 표면 푸코실화에 비교하여 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 99%, 약 100% 감소를 가질 수 있다. T 세포 상의 표면 푸코실화의 수준은 당업계에서 이용가능한 기술, 예를 들어 유세포분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 입양 세포 요법을 제공하거나 또는 암을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법은, 비제한적으로, 유방의 암종, 식도암, 결장직장, 췌장, 위, GIST, 간세포, 간, 폐, 소세포 폐, 난소, 자궁, 자궁경부, 방광, 신장, 결장, 소장, 대장, 위암, 림프종, 전립선, 고환, 갑상선 암종, 악성 흑색종, 포도막 흑색종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 연골육종, 골육종, 교모세포종, 육종, 신경아교종, 또는 다른 뇌종양, 머리/목 다른 위장 및 생식세포 종양, 혈액성 악성종양, 백혈병, 림프종, 예를 들어, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), ALL, 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 불응성 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 무통성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 피부암 (흑색종을 포함함), 골암, 상피성 암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 교모세포종, 신경교세포종, 유잉 육종, 수모세포종, 활막 육종, 및/또는 중피종을 포함한, 임의의 질환, 병태, 및 장애를 치료하기 위한 것이다.
일부 양태에서, 입양 세포 요법을 제공하거나 또는 암을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법은 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 갖는다. 일부 구현예에서, 치료적 T 세포는 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 성분과 함께, 동물 (예를 들어, 인간)에게 투여되는 본 명세서에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 형태로 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 치료적 T 세포 또는 이들의 약제학적 조성물은, 비제한적으로, 경구, 비경구, 및 설하로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 이들 약제학적 조성은 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포가 동물에게 조성물의 투여시 효과적일 수 있도록 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료적 T 세포 또는 치료적 T 세포를 함유하는 약제학적 조성물은 암 세포의 부위에서 또는 부근에, 즉 국소 투여로 투여 (예를 들어 주사)될 수 있다. 예를 들어, 암이 장기 (예를 들어 간)에서 발견된 경우, 간에서 암 세포가 발견되는 곳 또는 암 세포에 근접한 곳(예를 들어, 암 세포의 경계로부터 수 밀리미터 내지 수 센티미터 사이)에 약제학적 조성물이 주사될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 치료적 T 세포 또는 약제학적 조성물은 치료적 T 세포가 병리적 세포가 환자의 순환계를 통해 존재하는 표적 부위(들)에 도달할 수 있도록 환자의 순환계 (예를 들어 혈관), 즉 전신 투여에 투여 (예를 들어 주사)될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 T 세포는 종양 세포 또는 암 세포와 같은 표적화되는 세포 또는 질환의 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 성분을 추가로 가질 수 있다. 따라서, 치료적 T 세포는 순환계를 통해 전달된 후에 특이성을 갖는 표적 세포에 도달하고 치료 효과를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포 또는 이들의 약제학적 조성물은, 예를 들어 질환 또는 병태를 치료하는 원하는 결과 또는 효과를 얻는 데 효과적인 양, 예컨대 약제학적 유효량으로 투여될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여의 방법은 입양 세포 요법 또는 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 치료적 T 세포 또는 이들의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서 치료적 효능은 치료된 대상체의 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 상태에 따라, 원하는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 치료가 반복된다. 일부 구현예에서, 다른 투약 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 원하는 투약량은 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물의 단일 투여, 다중 투여, 또는 연속적 투여에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포 또는 이들의 약제학적 조성물은 원하는 결과 또는 효과를 얻는 데, 예를 들어 이러한 요법 또는 치료를 필요로 하는 대상체에 대해 질환 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에 따른 치료적 T 세포 또는 이들의 약제학적 조성물의 투여에 의해 달성하기 위한 원하는 결과 또는 효과는 투여 이전에 비교하여 하기 결과 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 병변의 감소(명백한 병변에 대한 CT 스캔 또는 물리적 검사에 의해 측정될 때, 적어도 약 99%, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 5%, 예를 들어, 약 30% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 또는 약 10% 내지 약 80%의 표적 및/또는 비-표적 병변에서의 감소 (치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물의 투여 이전과 비교하여 실제(actual) 변화 % 또는 평균(median) 변화 %));
(ii) 생검, 자기 공명 영상, 또는 다른 적합한 방법에 의해 측정될 때, 적어도 약 99%, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 5%, 예를 들어, 약 30% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 또는 약 10% 내지 약 80%의 소멸 (즉, 감소) (치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물의 투여 이전과 비교하여 실제 변화 % 또는 평균 변화 %);
(iii) 적어도 약 99%, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 5%, 예를 들어, 약 30% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 또는 약 10% 내지 약 80%의 종양 크기 (예를 들어, 암 세포의 수, 종양의 크기, 또는 신체에서 암의 양)의 감소 (치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물의 투여 이전과 비교하여 실제 변화 % 또는 평균 변화 %);
(iv) 적어도 약 99%, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 5%, 예를 들어, 약 30% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 또는 약 10% 내지 약 80%의 무진행 생존 (PFS)의 증가 (치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물의 투여 이전과 비교하여 실제 변화 % 또는 평균 변화 %); 및/또는
(v) 적어도 약 99%, 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 80%, 적어도 약 70%, 적어도 약 60%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 5%, 예를 들어, 약 30% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 85%, 또는 약 10% 내지 약 80%의 전체 생존 (OS)의 증가 (기대된 전체 생존과 비교하여 실제 변화 % 또는 평균 변화 %).
일부 구현예에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포 (즉 치료적 T 세포) 또는 그것의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량, 즉 원하는 결과 또는 효과를 얻는 데 효과적인 양, 예를 들어 질환 또는 병태를 치료하는 양으로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 약제학적 유효량은 치료적 T 세포의 원하는 용량 또는 수 및/또는 다른 유형의 세포에 대한 이러한 T 세포의 원하는 비율을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 투약량은 세포의 총수 (또는 체중 kg당 수) 및 개별 모집단 또는 하위유형의 원하는 비율, 예컨대 CD3+ 대 비-CD3+ 비율에 기초한다. 일부 구현예에서, 세포의 투약량은 약제학적 조성물에 함유된 개별 세포 유형 또는 개별 모집단에서의 세포의 원하는 총수 (또는 체중 kg당 수)에 기초한다. 일부 구현예에서, 투약량은 이러한 특징, 예컨대 개별 모집단에서 총 세포의 원하는 수, 원하는 비율, 및 치료적 T 세포의 원하는 총수의 조합에 기초한다.
일부 구현예에서, 원하는 용량 또는 양은 치료적 T 세포의 원하는 수 또는 세포가 투여되는 대상체의 체중 단위당 치료적 T 세포의 원하는 수, 예를 들어, 세포/kg이다. 일부 양태에서, 원하는 용량 또는 양은 치료적 T 세포의 최소 수 또는 체중의 단위당 치료적 T 세포의 최소 수 이상이다.
특정 구현예에서, 치료적 T 세포는 약 일백 내지 약 천억 세포, 예컨대, 예를 들어, 약 수백 내지 약 수천개의 세포, 약 수천 내지 약 1백만개의 세포, 약 1백만 내지 약 5백억개의 세포(예를 들어, 약 1백개의 세포, 약 5백개의 세포, 약 1천개의 세포, 약 5천개의 세포, 약 1백만개의 세포, 약 5백만개의 세포, 약 250만 개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 2백억개의 세포, 약 3백억개의 세포, 약 4백억개의 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위), 예컨대 약 천만 내지 약 천억개의 세포 (예를 들어, 약 2천만개의 세포, 약 3천만개의 세포, 약 4천만개의 세포, 약 6천만개의 세포, 약 7천만개의 세포, 약 8천만개의 세포, 약 9천만개의 세포, 약 100억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 500억개의 세포, 약 750억개의 세포, 약 900억개의 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위), 및 일부 경우에 약 1000만개의 세포 내지 약 500억개의 세포 (예를 들어, 약 1억 2000만개의 세포, 약 2억 5000만개의 세포, 약 3억 5000만개의 세포, 약 4억 5000만개의 세포, 약 6억 5000만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 450억개의 세포) 또는 이들 범위 사이의 임의의 값의 범위로 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적 T 세포의 전술한 효과적인 용량 또는 양은 요법 또는 치료의 개별 투여 또는 전체 기간에 따를 수 있다.
일부 구현예에서, 치료적 T 세포의 용량 또는 양은 약 104　내지 약 109 세포/킬로그램 (kg) 체중, 예컨대 105　내지 106　세포/kg 체중이거나 그 사이, 예를 들어, 약 1 x 105　세포/kg, 1.5 x 105　세포/kg, 2 x 105　세포/kg, 또는 1 x 106　세포/kg 체중 사이의 범위 내일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 치료적 T 세포는 약 104　내지 약 109　T 세포/킬로그램 (kg) 체중, 예컨대 105　내지 106　T 세포/kg 체중, 예를 들어, 약 1 x 105　T 세포/kg, 1.5 x 105　T 세포/kg, 2 x 105　T 세포/kg, 또는 1 x 106　T 세포/kg 체중 사이에서, 또는 특정 범위의 오류 내에서 투여된다. 치료적 T 세포의 전술한 효과적인 용량 또는 양은 요법 또는 치료의 개별 투여 또는 전체 기간에 따를 수 있다.
일부 구현예에서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물은 원하는 효과에 따라 매일, 매주, 격주로 또는 매월 스케줄로 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물은 약 1 내지 5, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 또는 그 초과 사이클로 투여될 수 있고, 여기서 각각의 사이클은 지속기간이 1개월이다. 각각의 사이클 내의 용량은 매일 (매일 1회, 매일 2회, 또는 매일 2회 초과를 포함함), 격일로, 매주 2회, 매주, 격주, 3주 마다 또는 매월 기준으로 주어질 수 있다. 사이클은 선택적으로 휴지 기간을 포함할 수 있다. 대안적으로, 휴지 기간은 사이클 사이에 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 투여는 질환 지속 기간 동안 이루어질 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서에서 개시된 방법은 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물 및 추가의 치료제 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물 및 치료제는 추가적으로 또는, 더 바람직하게는, 상승적으로 작용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물은 하나 이상의 치료제(들)의 투여와 동시에 투여될 수 있으며, 이는 치료적 T 세포를 포함하는 것과 동일한 조성물의 일부이거나 상이한 조성물로 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물은 치료제(들)의 투여 전에 또는 후속하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서에서 기재된 방법에서 효과적인 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포 또는 그것의 약제학적 조성물의 양은 장애 또는 병태의 특성에 의존할 것이고 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투약 범위를 식별하는 것을 돕기 위해 시험관내 또는 생체내 검정이 선택적으로 이용될 수 있다. 조성물에 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장애의 심각성에 따라 달라질 것이며, 개업의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
VI. 치료 용도용 키트
일부 양태에서, 입양 세포 요법 또는 암 치료에 사용하기 위한 키트가 제공된다. 이러한 키트는 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포, 즉 치료적 T 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에서 기재된 임의의 치료적 방법에 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 포함된 지침은 대상체에서 의도된 활성, 예를 들어 질환 또는 병태, 예컨대 암의 치료를 달성하기 위해 대상체에게 약제학적 조성물의 투여에 대한 설명을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 사용에 관한 지침은 의도된 치료를 위한 투약량, 투약 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함할 수 있다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 제공된 지침은 전형적으로 표지 또는 포장 삽입물에 관한 지침서이다. 표지 또는 포장 삽입물은 약제학적 조성물이 대상체에서 질환 또는 장애의 치료, 발병 지연 및/또는 완화에 사용된다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 키트는 적합한 패키징 상태에 있다. 적합한 패키징은, 비제한적으로, 바이알, 병, 단지, 가요성 포장물, 및 기타 동종의 것을 포함한다. 흡입기, 비강 투여 장치 또는 주입 장치와 같은 특정한 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음).
VII. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정한 특이적 구현예들을 설명하며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에서 구현예는 하기 실시예 및 상세한 프로토콜에 의해 추가로 설명된다. 그러나, 실시예는 단지 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 명세서에서의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 및 공개된 특허와 특허 출원의 내용은 이로써 참고로 포함된다.
실시예 1 - 비장세포의 입양 전달을 이용한 A20 마우스 림프종 연구
면역원, KLH-A20 Id Fab는 아래와 같이 생성되었다. A20 종양 Ig 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 PCR 증폭에 의해 클로닝하고 HEK293F17 세포에서 A20 Id 생산을 위해 마우스 IgG 발현 벡터 안으로 결찰하였다(ligated). A20 Id 쥣과 항체를 단백질 A에 의해 정제하였다. 농축된 항체 (20 mM KPO4, 10 mM EDTA, pH 7.0)는 고정된 파파인 수지 (20 mM 시스테인 함유)의 4배 부피로 37℃에서 밤샘 처리하였다. 수지를 제거하고 상층액은 밤새 (4℃) 단백질 A 수지로 인큐베이션하고, 이어서 여과하여 수지-결합된 항체 Fc를 제거하였다. Fab-함유 통과액을 수집하고, 투석하고, pH 7.4의 PBS 용액에서 농축하였다. Fab 콘주게이션은 해양배양 KLH (mcKLH) 및 NHS-PEG12-말레이미드를 사용하여 달성되었다. PBS 용액 내 mcKLH, pH 8.0 (10 mg/mL)을 혼합하고 NHS-PEG12-말레이미드로 인큐베이션하였다 (125 mM 최종, 37℃, 20분). 생성물 mcKLHPEG12-말레이미드는 PD10 칼럼 (PBS 용액, pH 7.4) 상에서 완충액-교환하고 5 mg/mL로 농축하였다. A20 Id Fab (4 mg/mL)를 2 mM EDTA-함유 완충액 (30분, 37℃)에서 (트리스(2-카복시에틸)포스핀 (5 mM)으로 환원시켰다. 환원제는 PD10 칼럼 (PBS 용액, pH 7.4, 5 mM EDTA)을 통해 제거하였고, 환원된 Fab는 5 mg/mL로 농축하고, KLH-PEG12-말레이미드로 혼합하고 (3:1 몰비, Fab:KLH) 실온에서 인큐베이션하였다 (1 시간). 과잉 말레이미드 가교결합제는 N-아세틸시스테인으로 켄칭하고 PD10 칼럼 (PBS 용액, pH 7.4)에 의해 제거하였다.
비장세포의 입양 전달을 위한 공여체 마우스는 아래에 기재된 바와 같이 생산하였다. A20 세포 (ATCC)를 10% FBS, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 50 μM 2-머캅토에탄올 및 페니실린 (100U/ml)/스트렙토마이신 (100μg/ml) (PS)을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. 마우스 (BALB/c, Harlan)에 -21일째에 TiterMax 아쥬반트를 함유하는 KLH-A20 Id Fab 콘주게이트 (50μg) (1:1)를 피하로 주입하여 -7일째에 부스팅하였다. 2FF 처리 군은 -14일째부터 20 mM 2FF를 함유하는 음용수를 투여하고 반면에 미처리된 군은 담수를 투여하였다. 제2 백신접종 (0일째) 1주 후, 모든 마우스는 조사된 A20 종양 세포 (RS2000 조사기 수준 4, 17분, 마우스 i.v.당 2.5x106 세포)를 투여받았다. 14일째까지 2FF 처리는 계속되었다. 공여체 마우스의 각각의 군으로부터 수확된 비장세포 (14일째)를 미접촉(naive) 마우스에 입양으로 전달 (1회)하였다 (50x106 세포/마우스). 하나의 군은 2FF를 투여받은 공여체 마우스로부터 세포를 투여받고, 하나의 마우스 군은 2FF로 처리되지 않은 공여체 마우스로부터 세포를 투여받았다 (n = 7/군). 그런 다음 두 군 모두 이식 후 살아있는 A20 세포로 처리되었다 (2.5x106 세포). 대조군은 치료를 받지 않았다. 2FF를 투여받지 않은 공여체 마우스로부터 이식된 비장세포는 미접촉 동물에 비해 증가된 생존을 제공하였고 (27일에서 35일의 평균(median) 생존율로 증가됨), 반면에 2FF를 투여받는 공여체 마우스로부터 이식된 비장세포는 43일의 추가적인 평균 생존의 증가를 제공하였다. 이것은 2FF로 처리된 동물로부터의 세포의 입양 전달은 2FF를 투여받지 않은 동물로부터의 세포의 입양 전달보다 향상된 항종양 활성을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 2 - CD3+ T-세포의 입양 전달을 이용한 A20 마우스 림프종 연구
20 Balb/c 마우스에 A20 세포를 이식하였고 (0.2 mL의 5x10^6 세포 s.c./마우스), 하나의 마우스 군은 연구의 0일째부터 종결 일까지 2FF (음용수 내 20 mM)를 투여받은 10마리 동물로 구성하였다. A20 림프종 종양이 성장되도록 하고 20일 후에 마우스를 희생하였다. 이전에 나타난 바와 같이, 20mM의 2FF를 투여받은 마우스는 대조군에서의 동물과 비교하여 종양 진행에서 상당한 지연을 가졌다 (도 2).
2FF의 처리에 의한 CD3+ T 세포 상의 표면 푸코실화의 감소
미처리군 및 2FF 처리군으로부터의 마우스를 희생시키고 CD3 T-세포 농축을 위해 비장을 취하였다. 간략하게 비장을 2% FBS를 함유하는 RPMI에 수집하고 세포 현탁액을 2% RPMI로 세정된 70 μm 메쉬 나일론 스트레이너를 통과시켰다. 세포를 10 ml의 ACK 세포용해 완충액에 현탁시키고 이 완충액에서 5분 동안 인큐베이션하여 RBC를 제거하였다. 세포를 300xg에서 5분 동안 원심분리하고 2% FBS 및 1mM EDTA를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. T-세포는 제조사 권장사항에 따라 EasySep 마우스 T 세포 단리 키트를 사용하여 단리되었다. 간략하게는, 세포를 108 세포/mL로 재현탁시키고 여기에 50 μL/mL의 랫트 혈청을 첨가하였다. 그 후 세포를 5 mL 폴리스티렌 튜브로 이전하고 50 μL의 단리 칵테일을 샘플에 첨가하고 이어서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 신속한 구형체(rapid spheres)를 와동하고 75 μL/ml를 첨가한 후 2.5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 샘플 부피를 2.5 mL로 마무리하고 2.5분 동안 세포 단리 자석과 함께 인큐베이션하였다. 자석을 뒤집고 CD3+ T 세포를 수집하고 RPMI에서 2회 세정하고 21.2x106 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포는 유세포분석에 의해 그것의 푸코실화 상태에 대해 검사되었고 2FF 처리된 동물로부터 단리된 것은 표면 푸코실화에서 현저한 감소를 나타냈다 (도 3).
감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포의 항종양 활성
정제된 T-세포의 항종양 활성을 평가하기 위해, Balb/c 마우스의 4개 군을 A20 세포로 이식하였다 (0.2 mL의 5x106 세포 s.c./마우스). 하나의 군은 치료를 받지 않았고, 다른 3개 군은 A20 세포가 100mm3에 도달했을 때 처리하였으며 음용수에 매일 20mM 2FF, IP 주입된 대조군 종양 보유 마우스로부터 단리된 2x106 T-세포, 또는 IP 주입된 2FF 종양 보유 마우스로부터 단리된 2x106 T-세포 중 어느 하나로 처리하였다. 후속적인 종양 진행에 대해 동물을 모니터링하였다. 물에 매일 2FF 또는 종양 보유 2FF 처리된 동물로부터 단리된 CD3+ T 세포 중 어느 하나를 투여받은 동물은 미처리된 동물 또는 미처리된 종양 보유 마우스로부터 T 세포를 투여받은 동물과 비교할 때 상당히 지연된 종양 성장 및 일부 경우에 종양 퇴화를 나타냈다.
이들 데이터는 A20 림프종 모델에서 2FF 항종양 활성이 T 세포 반응을 통해 매개될뿐만 아니라, 2FF로 처리된 종양 보유 마우스로부터의 T 세포는 놀랍게도 항종양 반응을 유도하기에 충분하며, 이 반응은 전신 2FF 처리와 동등한 수준이다는 것을 나타낸다. 이들 발견은 암 환자로부터의 자가 T 세포가 생체외에서 팽창되어 환자에 재주입되거나, TCR과 함께 특이적 종양 항원 또는 CAR 작제물로 전환되는 치료적 상황에서 2FF를 사용하여 T 세포 활성을 증폭시킬 가능성을 열어준다.
실시예 3 - 생체내 항종양 효능을 위한 2FF을 이용한 인간 말초 T 세포의 생체외 팽창
T 세포를 10분 동안 (중단 없음) 1200 rpm (300 x g)에서 먼저 원심분리된 10 mL의 전혈로부터 단리하였다. 혈소판을 함유하는 최상층은 백혈구 층을 파괴함이 없이 주의하여 제거되었다. 그런 다음 RosetteSep™ 인간 T-세포 농축 칵테일 (StemCell technologies로부터의 Pan T 세포)을 나머지 혈액에 첨가하였다 (500 μL/10 mL 혈액). 이를 20분 동안 인큐베이션하고 그 다음 1 mL FBS를 10 mL PBS와 함께 첨가하였다. 50 mL 팔콘(Falcon)에 배치된 히스토파크(Histopaque) (20-25mL)에 제조된 혈액/PBS 용액을 매우 천천히 오버레이하였다. 이를 중단 없이 원심분리하였다 (25℃, 1500 rpm, 25분). 최상층을 제거하고 버피 코트 층의 T 세포를 새로운 50 mL 튜브로 제거하였다. T 세포를 PBS로 세정하고, 1 mL AKT 세포용해 완충액에 재현탁시키고 25 mL까지 채우고, 5분 동안 인큐베이션하고, PBS로 50 mL까지 채우고 그 다음 펠릿화하였다. 이 적혈구 세포용해 단계는 두 번 반복되었다.
일차 인간 T 세포 배양의 시험관내 배양을 위해, 단리된 T 세포를 T 세포 배지 (10% 소태아 혈청 (FCS), 1% 페니실린으로 보충되고, 100 μM 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스가 있는 하나와 없는 하나의, 2개의 T25 플라스크로 이동된 RPMI 배지)에 재현탁시켰다. CD3/CD28 항체 코팅된 비드 (20 μL/플라스크)를 첨가하여 T 세포를 활성화시켰다. 24시간 후 인터루킨 2 (IL2)를 첨가하였다 (100 ng/μL). 매번 세포를 신규한 IL2로 계대하고 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스를 첨가했다. 배양 10일 후, 2FF에서 배양된 팽창된 T 세포를 유세포분석에 의해 표면 푸코실화에서의 변화에 대해 평가하였다 (도 4). 2FF로 일차 인간 T 세포의 처리는 렌즈 쿨리나리스 응집소 (LCA) 표면 염색에 의해 모니터링될 때 표면 푸코실화에서 약 85% 감소를 초래하고 세포가 생체내 전이를 위해 준비가 되었음을 나타낸다.
실시예 4 - 생체외에서 2FF로 성숙 및 분화된 자가 T 세포는 항종양 활성을 부여할 수 있다
말초 혈액 단핵 세포는 히스토파크 (Sigma) 밀도 구배를 사용하여 자발적인 건강한 지원자 (Astarte Biologics)로부터 정맥 혈액의 버피 코트로부터 단리되었다. T 세포는 제조사 지침에 따라 EasySep 인간 T 세포 농축 칵테일 (STEMCELL)을 사용하여 후속으로 단리되었다. 1:8 비드:세포 비로 사용된 αCD3/αCD28 항체 코팅된 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 0일째에 T 세포를 활성화시켰다. T 세포를 RPMI 10% FCS +IL-2 (100 ng/μL, R&D Systems) +/- 100μM 2FF에서 활성화시켰다. 매번 세포를 신규한 IL-2로 계대하였고 2FF를 첨가하였다.
엡슈타인 바르 바이러스 (EBV) 형질전환된 림프아구양 세포주 (lymphoblastoid cell line, LCL)를 NSG 마우스 안으로 피하로 이식하였다. LCL 종양 부피가 300mm3에 도달될 때, 마우스에는 꼬리 정맥 주사를 통해 2FF의 존재 또는 부재하에 팽창되고 성숙된 2.0x106 자가 말초 T 세포를 투여하였다. LCL 진행에 대한 자가 T 세포의 항종양 활성은 격주로 캘리퍼 측정으로 모니터링되었다. 종양 크기가 정해지거나 1주일 이상 동안 완전히 후퇴하면 마우스를 희생시켰다.
자가 T 세포의 이식은 항-종양 활성을 초래하였으며, T 세포가 이식 전에 2FF로 성숙되었을 때 생존 (도 5b 참고)과 같이 이 활성이 유의하게 향상되었다 (도 5a 참고).

Claims (50)

  1. 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 세포 배양 배지에서 푸코스 유사체의 존재하에 T 세포를 배양하는 단계를 포함하며;
    상기 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
    Figure pct00012

    (I) (II)
    또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있으며;
    R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이며; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는
    각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이며; 그리고
    상기 T 세포는 상기 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 T 세포에 비하여 감소된 표면 푸코실화를 갖는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 단리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 푸코스 유사체는 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스(2-deoxy-2-fluoro-L-fucose)인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 푸코스 유사체는 알키닐 푸코스 퍼아세테이트(alkynyl fucose peracetate)인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 상기 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 T 세포에 비하여 표면 푸코실화의 적어도 5% 감소를 포함하는 T 세포인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지는 CD3 및 CD28 항체를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배양 배지는 인터루킨 2 (IL2)를 더 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 말초 T 세포를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산된 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 입양 세포 요법에서 사용되도록 구성된, 방법.
  15. 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
    푸코스 유사체를 동물에게 제공하는 단계; 및
    상기 동물로부터 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 수득하는 단계를 포함하며,
    상기 푸코스 유사체는 하기 식 (I) 또는 (II):
    Figure pct00013

    (I) (II)
    또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 형태로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 식 (I) 또는 (II)는 알파 또는 베타 아노머 또는 상응하는 알도오스 형태일 수 있으며;
    R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이며; 그리고 R5는 -CH3이거나, 또는
    각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH이며; 그리고
    상기 동물로부터 수득된 T 세포는 상기 푸코스 유사체가 제공되지 않은 대조군 동물에 존재하거나 또는 이로부터 수득된 T 세포에 비하여 감소된 표면 푸코실화를 갖는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, R2는 할로겐이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, R2는 -F이고; 각각의 R1, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -CH3인, 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)C1-C10 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R1, R3 및 R4는 -OH 및 -OC(O)CH3로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
  20. 제15항에 있어서, 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -OH 또는 가수분해성 에스테르기이고; 그리고 R5는 -C≡CH인, 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 푸코스 유사체는 2-데옥시-2-플루오로-L-푸코스(2-deoxy-2-fluoro-L-fucose)인, 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 푸코스 유사체는 알키닐 푸코스 퍼아세테이트(alkynyl fucose peracetate)인, 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 상기 푸코스 유사체의 부재하에 배양된 T 세포에 비하여 표면 푸코실화의 적어도 5% 감소를 포함하는 T 세포인, 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 동물의 비장으로부터 수득되는, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 푸코스 유사체는 음식 공급을 통해 동물에게 제공되는, 방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 동물로부터 수득된 T 세포로부터 T 세포를 농축하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산된 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 입양 세포 요법에서 사용되도록 구성된, 방법.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물은 인간인, 방법.
  29. 입양 세포 요법을 대상체에게 제공하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 세포 요법을 필요로 하는 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 T 세포는 정상 T 세포에 비하여 표면 푸코실화의 적어도 5% 감소를 포함하는, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 말초 T 세포를 포함하는, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 상기 대상체로부터 유래된 것인, 방법.
  35. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 상기 대상체와 상이한 동물로부터 유래된 것인, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 적혈구가 실질적으로 없는 것인, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 요법은 암을 치료하도록 구성된, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 국소적으로 (암 세포에서 또는 그 부근에서) 투여되는, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 전신적으로 (투여 경로) 투여되는, 방법.
  40. 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
    상기 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 감소된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 것인, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 T 세포는 정상 T 세포에 비하여 표면 푸코실화의 적어도 5% 감소를 포함하는, 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 말초 T 세포를 포함하는, 방법.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 상기 대상체로부터 유래된 것인, 방법.
  46. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 표면 푸코실화를 갖는 T 세포는 상기 대상체와 상이한 동물로부터 유래된 것인, 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 적혈구가 실질적으로 없는 것인, 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 요법은 암을 치료하도록 구성된, 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 국소적으로 투여되는, 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 전신적으로 투여되는, 방법.
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