KR20200002671A

KR20200002671A - 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200002671A
Application number: KR1020190077494A
Authority: KR
Inventors: 배광학; 김혜성; 홍성수; 최춘환; 정원식; 양경미; 윤이나
Original assignee: 의료법인사과나무의료재단; 재단법인 경기도경제과학진흥원
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2020-01-08
Also published as: KR102260939B1

Abstract

본 발명은 청나래고사리(Matteuccia struthiopteris) 추출물을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 구강 내 치주병, 충치 등을 유발하는 유해 세균에 대한 항균 활성을 가지는 청나래고사리를 포함한 구강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강용 조성물은, 구강 질환을 유발하는 원인균에 대한 항균 효과를 가지며, 동시에 염증성 사이토카인을 억제하여 염증을 완화하는 효과를 가진다. 상기 조성물은 천연 유래의 성분을 포함하여 부작용이 적은 장점을 가지며, 다양한 구강용 제품 및 의약품으로 활용될 수 있다.

Description

청나래고사리 추출물을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of dental disease comprising an extract of Matteuccia struthiopteris}

본 발명은 청나래고사리(Matteuccia struthiopteris) 추출물을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 구강 내 치주병, 충치 등을 유발하는 유해 세균에 대한 항균 활성을 가지는 청나래고사리를 포함한 구강용 조성물에 관한 것이다.

구강 내에서 발생되는 치주염, 치아 우식증 등의 구강질환은 다양한 구강 내 세균에 의해 유발된다. 구강 내에는 600 내지 800 종 이상의 미생물이 존재하고 있으며, 2억 마리 이상의 세균이 서식한다. 이들은 대부분 타액에 포함된 리소자임에 의해 제어되고 있으나, 구강 내 환경은 구강 질환의 원인균이 번식하기 좋은 서식처를 제공한다.

치주질환은 흔히 풍치라고도 하며, 세균의 복합적인 감염(mixed infection)에 의한 치주조직의 파괴를 동반하는 염증질환을 말하며, 치은출혈과 종창, 치주낭의 형성, 부착 치은의 상실, 치조골의 파괴 및 구취와 같은 다양한 임상적인 증상을 나타내며 치아상실 및 임플란트 실패의 주된 원인이 되고 있다.

치주질환은 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉜다 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸 뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다.

치아 우식증은 흔히 충치라고 하며, 치면세균막에 존재하는 스트렙토코쿠스 무탄스균(Streptococcus mutans)이 배설하는 산에 의하여 치아 표면의 칼슘과 인 등의 무기질이 빠져나가고 그 속의 단백질과 같은 유기질이 용해되어 결국 치아의 파괴 현상을 초래하는 증상을 말한다. 무탄스균이 분비하는 산에 의하여 pH가 낮아지면 치면의 탈회(Demineralization)가 일어나게 되는데, 이러한 현상을 치아 우식이라고 말한다. 치아 우식은 치아의 위치, 타액의 양과 점조도, 유전, 임신, 수유 등 다양한 개인적 요인과 구강 내 산성세균의 종류와 양, 활동에 의한 세균 요인, 그리고 구강 위생 상태, 음식의 종류 등 환경 요인에 의하여 진행된다.

위와 같이, 구강 질환의 예방 및 치료를 위한 다양한 조성물, 치약 등이 존재하고 있고, 항생제, 불소 화합물 등 그 효능이 알려진 다양한 성분이 사용되고 있다. 특히 구강 질환을 치료하기 위해 보조적으로 항미생물 제제를 사용할 수 있다. 일반적으로 치아 우식의 경우 치태관리를 위하여 클로로헥시딘(chlorhexidine) 0.2% 양치액을 사용하지만 치아얼룩의 부작용과 불쾌한 맛 때문에 단기요법에만 사용되고 있다. 치주질환에서는 일차적으로 치석 제거술을 시행하나 보조 요법으로 항미생물 제제 처치시에는 우식보다 더 다양한 미생물이 관여하고 있으므로 클로로헥시딘(chlorhexidine) 양치액 외에 테트라싸이클린(tetracycline), 메트로니다졸( metronidazole) 등을 사용하고 있다. 그러나 이러한 항미생물제들은 내성균의 발생, 비선택적 살균 등의 부작용을 불러올 수 있어 기존의 항미생물제를 대체할 수 있는 효과적인 물질을 찾는 것이 필요하다.

국내에서는 부작용을 줄이고 치료 효과를 개선하기 위하여 천연물을 이용한 구강 치료제가 주목을 받고 있다. 천연물을 이용한 치료제의 경우, 기존 치료제에 의한 내성이나 안전성 문제를 극복할 수 있다. 또한, 충치의 경우 구강 청결이 중요하므로, 충치균에 대한 항균력을 가지는 치약이나 구강 청결제가 충치 예방에 효과적일 것이다. 아울러, 치주 질환의 경우, 염증 반응을 수반하므로 항염 효과를 가지는 성분을 포함하여 염증 억제 효과를 가지는 것이 고려되어야 할 것이다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 구강내 질환을 유발하는 원인 세균에 대한 항균 활성을 가지면서, 부작용이 적은 천연 유래 활성 물질에 대해 연구하던 중, 청나래고사리(Matteuccia struthiopteris) 추출물이 포르피노모나스 긴기발리스 및 스트렙토코쿠스 무탄스에 대하여 항균 활성을 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-0573631호 대한민국 등록특허 제10-1592549호

따라서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하고, 부작용이 적고 안전하면서도 구강 내 세균에 대한 항균 활성을 가지는 천연물 유래의 신규 활성 성분으로서, 청나래고사리 추출물의 유용한 용도를 제공하고자 한다.

즉, 본 발명의 목적은 청나래고사리 추출물을 포함하는, 구강 질환 예방 및 치료 효과를 가지는 구강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강용 조성물을 포함하는 다양한 구강용 제품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강용 조성물을 포함하는 구강질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강용 조성물을 제공한다.

상기 구강용 조성물은, 이에 제한되지는 않으나 구취, 치아우식증, 치주염, 치은염 등의 구강 질환의 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 본 발명의 구강용 조성물은 스트렙토코쿠스(Streptococcus)속 또는 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 등, 구강 내 존재하는 세균에 대하여 항균 효과를 가지는 것을 특징으로 하며, 상기 세균은, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 상퀴니스(Streptococcus sanguinis) 및 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)로 이루어진 군으로부터 1이상 선택되는 것이다.

아울러 본 발명의 구강용 조성물은 구강 내 염증성 질환에 대한 항염 효과를 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 항염 효과에 대하여, 본 발명의 일 실시예에서는 청나래고사리 추출물을 이용하여 TNFα, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인 억제 효과를 확인하였다.

또한, 본 발명의 청나래고사리 추출물은 유효 농도가 0.01 내지 0.1% 인 것을 특징으로 한다.

다른 양태로서 본 발명은 상기 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강용 조성물을 이용한 구강용 제품 및 구강용 약학적 조성물을 포함한다. 상기 제품 및 의약품의 제형에 대하여는 특별히 제한되지 않으나, 치약, 양치액, 껌, 구강 스프레이, 구강용 젤, 구강 연고제 및 구강용 패치로 이루어진 군으로부터 1이상 선택될 수 있다.

본 발명의 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강용 조성물은, 구강 질환을 유발하는 원인균에 대한 항균 효과를 가지며, 동시에 염증성 사이토카인을 억제하여 염증을 완화하는 효과를 가진다. 상기 조성물은 천연 유래의 성분을 포함하여 부작용이 적은 장점을 가지며, 다양한 구강용 제품 및 의약품으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 청나래고사리 추출물의 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis)균에 대한 최저성장억제농도(MIC)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 청나래고사리 추출물의 스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans) 균에 대한 최저성장억제농도(MIC)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 청나래고사리 추출물의 스트렙토코쿠스 상퀴니스(S. sanguinis) 균에 대한 최저성장억제농도(MIC)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 청나래고사리 추출물의 P. gingivalis 균에 대한 생장지연효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 청나래고사리 추출물의 S. sanguinis 균에 대한 생장지연효과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 청나래고사리 추출물의 세포독성을 가지는 농도에 대해 실험한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 은 본 발명의 청나래고사리 추출물의 NO 억제 활성을 가지는 농도에 대하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 청나래고사리 추출물의 사이토카인 생성 억제능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 다양한 채집지와 부위별로 추출한 청나래고사리 추출물의 세포독성과 사이토카인 중 TNFα 생성 억제능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 다양한 채집지와 부위별로 추출한 청나래고사리 추출물의 세포독성과 사이토카인 중 IL-6 생성 억제능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 청나래고사리(Matteuccia struthiopteris) 추출물을 포함하는, 구강 내 세균에 대한 항균 활성 및 염증 완화 효과를 가지는 구강용 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 구강용 조성물의 유효 성분인 청나래고사리(Matteuccia struthiopteris)는, 양치식물문 고사리강의 여러해살이 풀로 우리나라와 일본, 중국, 시베리아, 사할린 또는 유럽에 분포하는데, 영양잎은 모여나기하고 엽병은 길이 10-20cm 정도로 단면이 편평한 삼각형이며 밑부분에는 비늘조각이 달린다. 잎은 길이 40-80cm, 폭 15-30cm 정도로 끝이 짧게 뾰족해지고 밑부분이 점차 좁아지며 밝은 녹색이다. 우편은 넓은 선형이며 예첨두로 대가 없고 우상으로 갈라진다. 열편은 긴 타원형 또는 좁은 달걀모양이며 비스듬히 벌어지고 나비 2.5-5mm 정도로 잔톱니가 있다. 실엽은 가을철에 나오고 높이 30-60cm 정도로서 엽병이 엽신보다 짧고 표면에 깊은 홈이 있다. 산림의 숲속 다소 그늘진 습기가 많은 곳에 군생한다. 주로 표고가 낮은 곳의 음습한 계곡이나 낙엽수림 하부에서 자란다. 구충작용을 한다고 알려져 있다.

상기 청나래고사리를 사용하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 건조 후 분쇄한 분말, 보다 바람직하게는 추출물의 형태로 구강용 조성물에 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "추출물"은 청나래고사리의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 상기 청나래고사리 추출물은, 상기 청나래고사리의 천연, 잡종 또는 변종 식물의 다양한 기관으로부터 추출될 수 있고, 예를 들어 청나래고사리의 종자(씨앗), 뿌리, 지상부, 줄기, 잎, 꽃, 열매의 몸통, 열매의 껍질뿐만 아니라 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.

본 발명의 상기 청나래고사리 추출물에 있어서, 상기 청나래고사리를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 냉침 추출법을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 상기 청나래고사리를 추출하는데에 사용하는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비 제한적인 예로는 물, 증류수, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, n-헥산, 염산, 초산, 포름산, 디에틸에테르 및 사이클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 용매 등을 들 수 있으며, 알코올을 용매로 사용하는 경우에는 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 청나래고사리의 추출 용매로 보다 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 조성물은 구강 질환의 예방, 또는 치료용일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법으로서, 본 발명의 목적을 위해 유익하거나 바람직한 임상적 결과를 감지 가능하거나 가능하지 않거나를 불문하고, 또한 부분적이든 전체적이든 상관없이 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 더 나빠지지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 속도감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 치료는 치료법적 치료 및 예방적인 차원의 것들 모두를 가리키며, 치료할 필요가 있는 것들은 이미 질환을 가지고 있는 상태뿐만 아니라 질환이 예방되어야 할 상태를 포함한다. 또한 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하여 구강 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 상기 구강용 조성물을 이용하여 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 상기 구강용 조성물은 약학조성물, 구강 위생용 조성물의 형태로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 구강질환은 이에 제한되지는 않으나, 구강 내 세균에 의해 발생되는 구취, 치아 우식증, 치주염, 치은염 및 구강 내 점막 궤양을 포함하는 포괄적 개념이며, 보다 바람직하게는 P. gingivalis 또는 S. mutans로 인하여 유발되는 치주염, 치은염 또는 치아 우식증일 수 있다.

즉, 본 발명의 구강 조성물은 스트렙토코쿠스(Streptococcus)속 또는 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 등, 구강 내 존재하는 세균에 대하여 항균 효과를 가지는 것을 특징으로 하며, 보다 상세하게는 스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans), 스트렙토코쿠스 상퀴니스(S. sanguinis) 및 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 세균에 대한 항균 효과가 우수하여 구강 질환의 예방 또는 치료에 효과를 가질 수 있다.

보다 바람직하게 본 발명의 구강용 조성물은 스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans) 또는 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis) 세균에 항균 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 구강용 조성물은, 청나래고사리 추출물을 유효성분으로 단독으로 포함할 수도 있으나, 이외 제형 및 사용 목적에 따라 약제학적으로 허용된 담체, 부형제, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게 상기 구강용 조성물은, 청나래고사리 추출물 이외에, 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.

또한, 본 발명의 구강용 조성물을 포함하는 약학적 조성물의 경우, 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 등을 더 포함할 수 있으며, 비경구, 경구 모두 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 비경구용이다.

비경구투여를 위한 형태로는 치약, 구강세정제, 국소 투여제(크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등) 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일 예로는, 유효성분인 청나래고사리 추출물을 포함하는 구강질환 예방 또는 치료용 조성물을 수용성 고분자를 포함하는 필름 또는 패치에 고정하여 치아 및 주변부위에 부착할 수 있도록 제형화한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 구강질환 예방 및 치료용 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 구강질환 예방 또는 치료용 조성물은 청나래고사리 추출물을, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 청나래고사리 추출물은 조성물 중 0.01 내지 0.1%의 유효 농도로 조성물 내에 포함되는 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 청나래고사리 추출물은 조성물 중 1 ㎍/mL 이상, 바람직하기로는 1 내지 100 ㎍/mL, 더욱 바람직하기로는 1 내지 10 ㎍/mL 범위로 함유되는 것이 세포독성의 최소화 및 항염증 활성의 증진 측면에서 좋다.

본 발명은 청나래고사리 추출물을 유효 성분으로 포함하는 구강용 조성물을 포함하는 구강용 제품으로서, 특히 구강 위생용 조성물로서의 용도를 제공한다. 상기 구강 위생용 제품은, 구강의 위생을 위하여 사용할 수 있는 모든 종류 및 제형을 포함한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 위생용 조성물의 예로서, 치약, 양치액, 껌, 구강 스프레이, 구강용 젤, 구강 연고제 및 구강용 패치 등을 포함한다.

상기 본 발명의 구강용 제품이 치약류인 경우, 유효성분으로 청나래고사리 추출물을 포함하는 것 외에, 연마제, 점결제, 보습제, 발포제, 감미료, 미백제 또는 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 연마제로는 수산화알루미늄, 무수규산, 규산알루미늄, 제2인산칼슘 2 수산화물 및 무수물, 제3인산칼슘, 탄산칼슘, 피로인산칼슘, 불용성 메타인산나트륨, 제3인산마그네슘, 탄산마그네슘, 황산칼슘, 폴리메타아크릴산메틸, 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다. 상기 연마제의 함량은 전체 조성물을 기준으로 통상 20 중량% 내지 90중량%일 수 있으나, 상기 함량에 의해 한정되는 것은 아니다.

상기 구강위생 조성물이 페이스트상 조성물일 경우에는 상기 점결제는 가라기닌, 각종 점증용 셀룰로오스 유도체, 잔탄검, 트라가칸트 검(tragacanth gum) 등의 검류, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴산 나트륨, 폴리아크릴산/말레인산 공중합체, 카르복시비닐 폴리머 등의 합성 고분자 유도체 등의 유기계 점결제와 실리카, 라포나이트 등의 무기계 점결제 등을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다. 상기 점결제의 함량은 전체 조성물을 기준으로 통상 0.3 중량% 내지 5 중량%일 수 있으나, 상기 함량에 의해 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 구강위생 조성물에는 그 제조시 보습제로 솔비톨, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에테르 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 구강위생 조성물에는 향료 또는 감미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 감미제는 수크로즈, 락토오즈, 말토오즈, 솔비톨, 크실리톨, 나트륨시클라메이트, 글리세린, 사카린나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐 등일 수 있고, 상기 향료는 페퍼민트, 멘톨, 아네톨, 오이게놀, 리모넨, 시트로네놀, 알파터피네올, 살리실메틸, 시네올, 리나롤, 에틸리나롤, 바닐린, 티몰, 스피아민트유, 세지유, 로즈마리유, 계피유 등일 수 있으며, 상기 감미제 또는 향료는 단독으로 또는 복합적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 구강위생 조성물에는 발포성분으로 사용되는 계면활성제나 추가 효능성분이 단독으로 또는 복합적으로 포함될 수 있으며, 상기 발포성분으로 사용되는 계면활성제는 음이온 계면활성제, 비이온 계면활성제 및 양이온 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 구체적으로는 음이온성 계면활성제인 라우릴황산나트륨, 비이온성 계면활성제인 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌의 공중합체(폴록사머), 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산에스테르 등이 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 구강위생 조성물이 치약인 경우에는, 유효성분으로 청나래고사리 추출물을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 치약 제조방법으로 제조될 수 있으며, 본 발명의 구강 위생 조성물이 양치용액인 경우에는 통상적인 용액제에 청나래고사리 추출물을 혼합하고 양치용액으로 제형화하여 제조될 수 있으며, 하루 2 내지 10회 구강을 세척함으로써 구강질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 구강위생 조성물이 구강 세척제(세정제)인 경우에는, 치약 담체, 보다 상세하게는 비독성 알콜을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 청나래고사리 추출물은 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 10 중량% 일 수 있으며, 바람직하게는 조성물 총 중량 대비 0.0005 내지 5중량% 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 조성물 총 중량 대비 0.005 내지 1중량% 일 수 있다. 상기 청나래고사리 추출물이 조성물 총 중량 대비 0.00001 중량% 미만인 경우 구강질환에 대한 효과가 미비할 수 있으며, 10 중량% 초과인 경우 세포독성이 일어나 자극적이거나, 염증이 오히려 유발될 수 있기 때문에 바람직하지 않을 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 청나래고사리 추출물의 제조

청나래고사리 전초 100g을 측량하여 70% 에탄올 1L를 이용하여 24시간 상온 냉침 추출하고, 상기 추출액을 여과한 후 감압농축기로 농축하고, 이후 동결건조하였다.

<실시예 2> 청나래고사리 추출물의 최소세균생장억제농도(MIC) 분석

본 발명의 청나래고사리 추출물의 항균력을 측정하기 위하여, in vitro에서 각 구강 세균에 대한 최소억제농도(MIC)를 측정하였다.

스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans) 또는 스트렙토코쿠스 상퀴니스(S. sanguinis)는 Brain Heart Infusion (BHI) broth에 배양하였으며, 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis)은 Tryptic soy broth(30g/l) supplemented 0.5% yeast extract, 0.05% L-cystein hydrochloride monohydrate, resazurin (final 10ug/ml), Hemin Solution (final 50 ug/ml), Vitamin K1 solution (final 10 ug/ml)에 배양하여 사용하였다. 구강 내 세균중에서 치주병 원인균인 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis), 치아우식증 원인균인 스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans), 비병원성 균주인 스트렙토코쿠스 상퀴니스(S. sanguinis)의 세균 배양액을 4℃에서 15분간 4000rpm의 속도로 원심 분리한 후, 상층액을 제거한 뒤 측정 시점의 생균 농도가 5×10⁵CFU/ml (P. gingivalis의 경우 1×10⁶CFU/ml)가 되도록 새 배양액으로 희석하였다. 희석한 배양액을 100㎕씩 96 well에 접종하였다.

추출을 통해 얻은 건조된 청나래고사리 추출물을 70% 에탄올에 용해하여 stock solution을 제조한 뒤, 최종 처리 농도가 0.1%, 0.05%, 0.025%, 0.0125%의 농도가 되도록 희석하여 균을 접종한 각 well에 100㎕씩 처리하였다.

48시간 동안 배양한 후, 세균 배양액을 분광광도계에 넣어서 660nm의 파장으로 흡광도를 측정하였다. 이때, 흡광도가 0.05 이하로 나타나는 가장 낮은 농도를 최소세균생장억제농도(MIC)로 하되, 방울(10㎕) 플래이팅 방법(drop plating method)을 동시에 진행하여 MIC를 최종 판정하였다.

그 결과, 하기 표 1에 개시된 바와 같이 각각의 균주의 최소세균생장억제농도는 P. gingivalis는 0.0063%이고, S. mutans는 0.1%이며, S. sanguinis는 0.025%인 것으로 측정되었다. 즉, 본 발명의 청나래고사리 추출물은 구강 내 세균에 대하여 모두 항균 활성을 가지는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 3).

균주명	MIC
포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)	0.0063%
스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)	0.1%
스트렙토코쿠스 상퀴니스(Streptococcus sanguinis)	0.025%

<실시예 3> 단기노출(Short-term exposure)을 통한 생장지연효과 분석

본 발명의 청나래고사리 추출물의 항균력을 측정하기 위하여, Short-term exposure 모델을 통하여 대조 시료 대비 청나래고사리 추출물의 생장지연효과를 측정하여 비교하였다. 대조시료의 경우는, NC(Negative control: 세균배양액 + 처리하는 천연물에 포함된 동일한 농도의 에탄올)를 이용하였다.

먼저, 구강 내 세균인 P. gingivalis, S. mutans, S. sanguinis의 세균 배양액을 원심분리(4000rpm, 4℃, 15분)한 후, 상층액을 제거하고, 시작 시점의 배양액 내 생균 농도 S.mutans와 S.sanguinis는 5×10⁵CFU/ml이고, P. gingivalis는 1×10⁶CFU/ml가 되도록 배양액에 추가하여 희석하였다. 생균 농도는 분광광도계(multiscan GO microplate spectrophotometer, Thermo Fisher scientific, Inc.)를 이용하여 660nm에서 흡광도를 측정한 후, 평판 배지 도말법으로 확인하였다.

각 균에 대한 최소세균생장억제농도(MIC)의 4배 내지 8배 농도의 시료와 생장억제를 보이는 농도의 클로로헥시딘 및 증류수 각각 500㎕에, 배지 500㎕ 및 세균배양액 10㎕를 혼합하여, 5분 동안 균주 별 적정 배양조건에 두었다가, 원심 분리하여 상층액을 제거한 후, 새 배양액 20ml에 분주하였다.

상기 준비된 각 균주 배양액을 적절한 조건에서 배양한 후, 48시간 동안 배양하면서 최소 5회 이상에 걸쳐 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 균주의 종류에 따라 생장지연효과에 있어 차이점이 있는 것을 확인하였다. Negative control(NC)를 균의 정상 성장 곡선으로 본다면, 약 4시간 이후에 대수증식기로 진입하여, 약 20시간 이후에는 정지기에 들어가는 것을 볼 수 있습니다. 그러나 나래고사리 시료를 단기노출시킨 뒤에 성장 곡선을 그려보면 성장이 아예 억제되는 조건인 헥사메딘과 같이 성장이 억제되는 것을 확인하였다.

일반적으로 구강용품에 기능성 성분을 섞는 농도는 0.1%-1%입니다. 이때, 균주에 대한 실제 임상적 효과가 나타나기 위해서는 MIC 농도보다 최소 10배 이상의 농도여야 합니다. 따라서 MIC가 0.05% 미만의 값으로 나온 데이터를 의미가 있으며, MIC가 0.05% 미만으로 확인된 균주인 P. gingivalis와 S.sanguinis에 대해서만 생장지연효과 실험을 진행하였다(도 4 및 도 5).

<실시예 4> 항염증 효과 확인

<4-1> 세포독성 분석

RAW 264.7 세포에 본 발명의 청나래고사리 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO₂ incubator, RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS)한 후, MTT 시약을 추가로 투여하였다.

포르마잔(formazan)이 형성된 다음 DMSO에 녹여 595nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 청나래고사리 추출물이 처리되지 않은 정상 세포와의 흡광도를 비교하여 세포 독성을 확인하였다.

그 결과, 0.01% 이상의 농도에서는 세포독성이 있는 것으로 측정되었다. 즉, 청나래고사리 추출물 0.01% 미만에서는 세포 독성이 확인되지 않았다(도 6).

다양한 채집지와 부위별로 청나래고사리 추출물(No. 37, 40, 42)을 확보하여 0.01% 농도로 처리하여 세포독성을 확인한 실험에서도 위의결과와 일관적이게 세포독성은 관찰되지 않았다(도 9, 10).

<4-2> 항염증활성 분석(NO assay)

RAW 264.7 세포에 청나래고사리 추출물을 30분 또는 180분간 처리한 후, LPS (100 또는 250 ng/mL)을 추가적으로 처리하였다. 24시간 후 상층액과 그리스(Griess) 시약을 첨가하여 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다.

구체적으로, LPS 및 청나래고사리 추출물을 처리하지 않은 군에서는 NO가 발생하지 않았다. LPS 만을 처리한 경우 NO 발생량 대비 LPS와 함께 청나래고사리 추출물을 각 농도별(0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%)로 처리한 경우 NO 발생량을 %로 비교하였다.

그 결과, 청나래고사리 추출물을 처리하지 않은 것과 대비하여, 청나래고사리 추출물을 처리한 경우, NO 발생량이 농도 의존적으로 줄어들고 있는 것을 확인하였다. 또한, NO 발생에 대한 IC50 값은 IC50 값은 청나래고사리 추출물 0.00138% 인 것으로 확인하였다(도 7).

<4-3> 사이토카인 분석(Cytokine assay)

RAW 264.7 세포에 청나래고사리 추출물을 30분간 처리한 후, LPS(250 ng/mL)을 추가적으로 처리하였다. 6시간 경과 후, 상층액을 분리하고, 이를 ELISA 시험법에 따라 사이토카인(TNFα, IL-1β, IL-6)의 생성량을 측정하였다.

구체적으로, 6시간 경과 후, 상층액을 분리하여 TNFα, IL-1β, IL-6 ELISA kit(BD Biosciences, USA)를 이용하여 제조사의 매뉴얼대로 반응시킨 뒤, 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준곡선을 이용해서 각 사이토카인의 생성량을 정량하였다.

그 결과, LPS의 자극에 의해 염증성 사이토카인의 생성량이 증가된 것을 확인하였으며, 정도의 차이는 있으나, 청나래고사리 추출물을 처리하여 이들 사이토카인의 생성량이 줄어든 것을 확인하였다. 즉, 도 8에서 보듯이, TNFα의 경우, 청나래고사리 추출물을 처리한 군에서 생성량이 줄어든 것을 확인하였으며, 특히 0.00001%의 청나래고사리 추출물을 처리하였을 경우, 저해 활성이 가장 큰 것을 확인하였다.

다양한 채집지에서 확보하고, 부위별로 추출한 추출물을 0.01%로 처치하였을 때도 TNFα의 생성은 Vehicle을 처치한 군에 비해 상당히 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

또한, IL-1β의 경우 도 8과 같이, 청나래고사리 추출물을 처리한 군에서 생성량이 줄어들었고, 0.00001%로 처리하였을 경우, 저해 활성이 가장 큰 것을 확인하였다.

다양한 채집지에서 확보하고, 부위별로 추출한 추출물을 0.01%로 처치하였을 때도 IL-1β의 생성은 Vehicle을 처치한 군에 비해 상당히 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

결과적으로, 세포독성 실험의 경우, RAW 264.7 세포인 대식세포에 세포독성을 보이지 않는 농도를 파악함과 동시에 세포가 죽어서 NO 발현이 저해된 것이나, 세포가 죽어서 사이토카인 발현에 영향을 주는 것은 아닌지 동시에 확인하고자 진행한 실험입니다.

또한 사이토카인 억제실험과 세포독성실험의 경우는 in vitro 상에서 항염 효과를 보일 수 있는 최적의 실험 조건을 설정한 후 실험한 데 반해, MIC 실험의 경우는 균들에 대해 직접적으로 작용하게 되는 농도이므로, 최적화된 추출물의 농도 범위는 P. gingivalis에 대해서는 0.0063% 이상, S.mutans에 대해서는 0.1%이상, S. sanguinis에 대해서는 0.025%이상인 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

청나래고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 구강용 조성물은 치아우식증, 치주염 및 치은염 중 하나 이상의 구강 질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 청나래고사리 추출물은 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 0.1중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 스트렙토코쿠스(Streptococcus)속 또는 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 세균에 대하여 항균 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 스트렙토코쿠스(Streptococcus)속 또는 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 세균은, 스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans), 스트렙토코쿠스 상퀴니스(S. sanguinis) 및 포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 항염 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 염증성 사이토카인인 TNFα, IL-1β에 대한 억제 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 청나래고사리 추출물은 청나래고사리 잎, 줄기, 뿌리를 포함하는 전초를 에탄올을 추출 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 하는, 구강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 청나래고사리 추출물은 유효 농도가 0.01 내지 0.1%인 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 구강용 조성물을 포함하는 구강용 제품.
제10항에 있어서, 상기 구강용 제품은 치약, 양치액, 껌, 구강 스프레이, 구강용 젤, 구강 연고제 및 구강용 패치로 이루어진 군 중에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 구강용 제품.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 구강용 조성물을 포함하는 구강 질환의 치료용 약학적 조성물.
제12항에 있어서,
상기 구강 질환의 치아우식증, 치주염 및 치은염 중 하나 이상의 구강 질환에 대한 치료 효과를 가지는 구강 질환 치료용 약학적 조성물.