KR20190143644A - Novel Ruthenium-based electron transfer mediator, preparation method thereof, redox reagent composition and biosensor comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 바이오센서용 전자전달 매개체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규 루테늄계 전자전달 매개체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 산화환원반응용 시약조성물 및 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to an electron transfer medium for a biosensor, and more particularly, to a novel ruthenium-based electron transfer medium, a method for preparing the same, and a redox reagent composition and a biosensor.
전기화학적 바이오센서는 통상적으로 환경, 생물, 의학 등의 분야에 걸쳐 다양한 분석 대상을 검출하는 장치를 말하는 것으로, 대표적으로 글루코스, 콜레스테롤, 아미노산 등의 분석물을 사람의 체액으로부터 검출하는 바이오센서가 존재한다.Electrochemical biosensors generally refer to devices for detecting various analytes, such as environment, biology, and medicine. Typically, biosensors that detect analytes such as glucose, cholesterol, and amino acids from human body fluids exist. do.
현재, 상용화된 전기화학적 바이오센서는 전기적 신호를 변환할 수 있는 전극 위에 글루코스 산화 효소를 화학적 또는 물리적 방법으로 고정시킨 구조를 가진다. 이러한 전기화학적 바이오센서는 분석물 내의 글루코스가 효소에 의해 산화되어 발생하는 전자를 전극에 전달하여 생성되는 전류를 측정함으로써 분석물 내의 글루코스 농도를 측정하는 원리에 의한 것이다.Currently, commercially available electrochemical biosensors have a structure in which glucose oxidase is immobilized on an electrode capable of converting electrical signals by chemical or physical methods. The electrochemical biosensor is based on the principle of measuring glucose concentration in an analyte by measuring an electric current generated by transferring electrons generated by the oxidation of glucose in an analyte to an electrode.
그러나, 효소 전극을 이용하는 바이오센서의 경우, 효소의 활성 중심과의 거리가 너무 멀기 때문에 기질이 산화되어 발생되는 전자를 직접적으로 전극에 전달하는 것이 용이하지 않은 문제가 발생한다. 따라서 이러한 전자전달 반응을 용이하게 수행하기 위하여 산화/환원 매개체, 즉 전자전달 매개체가 필수적으로 요구된다.However, in the case of a biosensor using an enzyme electrode, there is a problem in that it is not easy to transfer electrons generated by oxidation of a substrate directly to the electrode because the distance from the active center of the enzyme is too far. Therefore, in order to easily perform such an electron transfer reaction, an oxidation / reduction medium, that is, an electron transfer medium is essential.
종래 대표적으로 사용되는 전자전달 매개체로는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논 유도체, 오스뮴 고분자, 포타슘페리시아나이드 등이 있다. 이 중 상용화 된 바이오센서에 적용되는 대표적 전자전달매개체인 페리시아나이드는 음이온으로, Fe3 +를 중심으로 6개의 시아나이드리간드(cyanide ligands)가 8면체 구조로 결합되어 있으며, [Fe(CN)6]4-으로 쉽게 환원되며 산화/환원이 가역적이다. 이러한 특성으로 인해 페리시아나이드는 전기화학에서 대표적인 전자전달 물질로 바이오센서의 전자전달매개체로서 주로 사용되어 왔다. 그러나, 페리시아나이드는 전극 표면에 강하게 흡착되지 못하고 용액에 노출되는 경우 용액상으로 탈기가 일어나는 경향이 있으며, 이러한 경향으로 인하여 효소와 반응하기에 충분한 양의 전자전달매개체가 감소하여 글루코스 측정 감도가 저하되고 이에 따라 정확한 글루코스 측정이 어렵게 되는 문제점이 있었다(R. Wilson et al., biosens.Bioelectron. 1992, 7, 165-185).Conventionally used electron transfer mediators include ferrocene (ferrocene), ferrocene derivatives, quinone derivatives, osmium polymer, potassium ferricyanide and the like. The biosensor typically an electron transfer mediator is ferricyanide to be applied to is an anion, is coupled with 6 cyanide ligands (cyanide ligands) is octahedral structure around the Fe 3 +, [Fe (CN ) commercialization of 6 ] easily reduced to 4- with reversible oxidation / reduction. Due to these characteristics, ferricyanide has been used as an electron transfer medium of biosensors as a representative electron transfer material in electrochemistry. However, ferricyanide is not strongly adsorbed on the surface of the electrode, and when exposed to a solution, degassing occurs in solution phase. This tends to reduce the amount of electron transfer medium sufficient to react with the enzyme, thereby increasing the sensitivity of glucose measurement. There was a problem that it is lowered and thus difficult to accurately measure glucose (R. Wilson et al., Biosens. Bioelectron. 1992, 7, 165-185).
또한, 대부분의 상용화된 전기화학적 센서에 사용되는 글루코스 산화환원효소인 FAD-GOX(flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase)는 열에 안정하고 글루코스만을 산화시키는 반응선택성은 탁월하지만, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 혈액에 녹아 있는 산소와 반응하여 과산화수소를 생성하기 때문에 FAD-GOX 효소를 사용하여 만든 센서는 시료 혈액의 종류(정맥혈, 동맥혈, 또는 모세혈)에 따라서 측정값이 크게 다를 수 있다.In addition, FAD-GOX (flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase), a glucose oxidoreductase used in most commercialized electrochemical sensors, is stable to heat and excellent in reaction selectivity for oxidizing only glucose, but is shown in
[반응식 1]
채혈 혈당 센서의 개발 추이는 혈액(정맥혈, 모세혈 등)에 따라 달라지는 산소 분압(pO2) 차이에 따른 측정치 변화를 차단하기 위하여 혈액 내 글루코스와의 효소 반응에서 산소가 참여하는 GOX 대신에 효소반응에 산소가 배제된 GDH 사용으로 전환되고 있다.The development of blood glucose sensors is an enzymatic reaction instead of GOX in which oxygen participates in the enzymatic reaction with glucose in the blood to block changes in measurements due to differences in oxygen partial pressure (pO 2 ) that depend on blood (venous blood, capillary, etc.). Is shifting to the use of GDH without oxygen.
가장 보편적으로 사용되는 전자전달 매개체로는 포타슘페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]가 있으며, 가격이 저렴하고 반응성이 좋아서 FAD-GOX, PQQ-GDH 또는 FAD-GDH를 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나, 이 전자전달 매개체를 이용한 센서는 혈액에 존재하는 요산(uric acid)이나 겐티식산(gentisic acid)과 같은 방해 물질에 의한 측정오차가 발생하고, 온도와 습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 하며, 장시간 보관 후 바탕전류의 변화로 낮은 농도의 글루코스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다.The most commonly used electron transport medium is potassium ferricyanide [K 3 Fe (CN) 6 ], which is inexpensive and responsive, which is useful for both sensors using FAD-GOX, PQQ-GDH or FAD-GDH. Do. However, the sensor using the electron transfer mediator is manufactured and stored because measurement errors are caused by interfering substances such as uric acid and gentisic acid in the blood, and are easily deteriorated by temperature and humidity. Special care should be taken, and it is difficult to accurately detect low concentrations of glucose due to changes in background current after long-term storage.
헥사아민루테늄클로라이드[Ru(NH3)6Cl3]는 페리시아나이드에 비하여 산화환원 안정성이 높아 이 전자전달 매개체를 사용한 바이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성이 높은 장점을 갖지만, FAD-GDH와 사용하기에는 전자전달 반응이 용이하지 않아 상업적으로 유용한 센서로 제작하기가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들 전자전달 매개체도 센서 스트립의 정확도가 산소 분압에 영향을 받는다는 문제점이 있다.Hexaamine ruthenium chloride [Ru (NH 3 ) 6 Cl 3 ] has higher redox stability than ferricyanide. Biosensors using this electron transfer mediator are easy to manufacture and store and are stable due to small changes in background current even after long-term storage. Although it has this high advantage, it is difficult to manufacture a commercially useful sensor because the electron transfer reaction is not easy to use with FAD-GDH. In addition, these electron transport media also have a problem that the accuracy of the sensor strip is affected by the oxygen partial pressure.
따라서 산소에 의하여 영향을 받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적으며, 넓은 농도 범위의 측정이 가능하며, 대량생산에 적합한 산화환원반응용 시약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약을 제조하기 위한 기술의 개발이 요구되고 있다.Therefore, it is not influenced by oxygen, and there is little change in performance by temperature and humidity, and there is little change in performance even after long-term storage, and it is possible to measure a wide range of concentration, and is suitable for mass production redox reagent, More specifically, the development of a technology for preparing a reagent for an electrochemical biosensor is required.
본 발명의 제1 목적은 글루코스 탈수소화효소(Glucose dehydrogenase; GDH)와 반응하므로 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한, 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공하는 것이다.The first object of the present invention is to react with glucose dehydrogenase (GDH), which is not affected by oxygen partial pressure, and maintains a stable redox form for a long time, thus making it an excellent electron transfer medium for electrochemical biosensors. To provide a complex or a salt compound thereof.
본 발명의 제2 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.It is a second object of the present invention to provide a method for preparing the novel ruthenium complex or a salt compound thereof.
본 발명의 제3 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 전자전달 매개체로서 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.It is a third object of the present invention to provide a reagent composition for redox reaction comprising the novel ruthenium complex or a salt compound thereof as an electron transfer medium.
본 발명의 제4 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 전자전달 매개체로서 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.It is a fourth object of the present invention to provide an electrochemical biosensor comprising the novel ruthenium complex or a salt compound thereof as an electron transfer medium.
상기 제1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공한다.In order to achieve the first object, the present invention provides a novel ruthenium complex or a salt compound thereof represented by the following formula (1).
[화학식 1][Formula 1]
Ru(A)mXn Ru (A) m X n
(상기 화학식 1에서, A는 하기 화학식 2의 치환기이고,(In
[화학식 2][Formula 2]
R1 및 R2는 독립적으로, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 아민(-NH3), 할로겐, 카르복실산, 알코올(-OH) 및 시아나이드(-CN)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 straight or branched alkyl, C 1 -C 4 straight or branched alkoxy, amine (-NH 3 ), halogen, carboxylic acid, alcohol (-OH) and cyanide (-CN) is selected from the group consisting of
X는 할로겐 원소이고,X is a halogen element,
m은 1 또는 2이고, m is 1 or 2,
n은 2 또는 4의 정수이고, n is an integer of 2 or 4,
m과 n의 합은 6이다).the sum of m and n is 6).
또한 바람직하게는, 상기 화학식 1의 루테늄 착물은 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물일 수 있다.Also preferably, the ruthenium complex of Formula 1 may be a compound of Formula 1a or Formula 1b.
[화학식 1a][Formula 1a]
[화학식 1b][Formula 1b]
(상기 화학식 1a 및 화학식 1b에 있어서, R1, R2 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)(In Formula 1a and Formula 1b, R 1 , R 2 and X are as defined in
또한, 상기 제2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,In addition, in order to achieve the second object, the present invention, as shown in
반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시키는 단계; 및Reacting the compound of
생성물을 침전시켜 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing a novel ruthenium complex of formula (1) or a salt compound thereof comprising the step of precipitating the product to obtain a compound of formula (1a) or formula (1b).
[반응식 2]
(상기 반응식 2에서, R1, R2, X 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, 화학식 1a 및 화학식 1b는 상기 화학식 1에 포함된다.)(In
또한 바람직하게는, 상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세토니트릴 및 에틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.Also preferably, the reaction solvent may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile and ethylene glycol.
또한 바람직하게는, 상기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 3의 화합물의 반응은, 반응 용매로서 알코올 용매 또는 아세토니트릴을 사용할 경우 50~100℃에서 수행하며, 반응 용매로서 에틸렌글리콜을 사용할 경우에는 130~200℃에서 수행할 수 있다.Also preferably, the reaction of the compound of
또한 바람직하게는, 생성물의 침전시 침전 용매는 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.Also preferably, the precipitation solvent upon precipitation of the product may be selected from the group consisting of diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF) and tetrahydrofuran (THF).
또한, 상기 제3 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화환원효소, 및 전자전달 매개체로서 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 제공한다.In addition, in order to achieve the third object, the present invention provides a redox reaction reagent, and a redox reaction reagent composition comprising a ruthenium complex represented by the formula (1) or a salt compound thereof as an electron transfer medium.
또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는Also preferably, the oxidoreductase may be at least one oxidoreductase selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase; or
탈수소화효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함할 수 있다.One or more oxidoreductases selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase, flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) And pyrroloquinoline quinone (PQQ).
또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Also preferably, the oxidoreductase is glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase esterase, lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, and bilirubin oxidase It may be at least one selected from.
또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Also preferably, the oxidoreductase is flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase) may be one or more selected from the group consisting of.
또한 바람직하게는, 상기 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부 함유할 수 있다.Also preferably, the reagent composition may contain 20 to 700 parts by weight of the ruthenium complex of
또한, 상기 제4 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서를 제공한다.In addition, in order to achieve the fourth object, the present invention is prepared by coating and fixing a redox reaction reagent composition that can redox the analyte included in the liquid biological sample on a substrate having at least two electrodes One electrochemical biosensor is provided.
또한 바람직하게는, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 평면형 바이오센서일 수 있다.Also preferably, the biosensor may be a planar biosensor having a working electrode, an auxiliary electrode and a confirmation electrode provided on one plane, and coated with a redox reagent composition on the electrode.
또한 바람직하게는, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 대면형 바이오센서일 수 있다.Also preferably, the biosensor may be a large surface biosensor having a working electrode and an auxiliary electrode facing each other on different planes and coated with a redox reagent composition on the working electrode.
또한 바람직하게는, 상기 생체시료는 혈액일 수 있다.Also preferably, the biological sample may be blood.
본 발명에 따른 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물은 산화환원효소, 특히 글루코스 탈수소화효소와의 반응속도가 빨라서 혈액 내 글루코스 검출 성능이 향상되고, 혈액 내 산소 및 방해 물질의 영향을 거의 받지 않아, 글루코스 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다.The novel ruthenium complex or a salt compound thereof according to the present invention has a fast reaction rate with oxidoreductase, in particular glucose dehydrogenase, thereby improving glucose detection performance in blood and hardly affected by oxygen and interfering substances in blood. Useful in the manufacture of biosensors for detection.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 바이오센서의 분해사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 1H NMR 스펙트럼이다((a) dmo-bpy 리간드의 1H NMR, (b) 신규 루테늄 착물의 1H NMR).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 UV-vis 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 XPS 스펙트럼이다((a) 반응물과 생성물의 N 결합에너지 그래프, (b) 반응물과 생성물의 Ru 결합에너지 그래프).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 반응물(RuCl3)에 대한 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 6은 종래의 Ru(NH3)6과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 감응도를 평가하는 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 감응도를 평가하는 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 농도에 따른 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 농도에 따른 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.1 is an exploded perspective view of an electrochemical biosensor according to an embodiment of the present invention.
2 is a 1 H NMR spectrum for structural compound analysis of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention ((a) 1 H NMR of the dmo-bpy ligand, (b) 1 H NMR of the novel ruthenium complex ).
3 is a UV-vis spectrum for structural compound analysis of a novel ruthenium complex prepared according to one embodiment of the present invention.
4 is an XPS spectrum for structural compound analysis of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention ((a) N binding energy graph of reactants and products, (b) Ru binding energy graph of reactants and products) .
5 shows a cyclic voltammetry curve for the novel ruthenium complex and reactants (RuCl 3 ) prepared according to one embodiment of the present invention.
FIG. 6 shows a cyclic voltammogram curve for evaluating glucose sensitivity of a biosensor comprising Ru (NH 3 ) 6 and glucose dehydrogenase.
FIG. 7 shows a cyclic voltammetry curve for assessing glucose sensitivity of a biosensor comprising a novel ruthenium complex and a glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention.
8 shows a cyclic voltammetry curve according to glucose concentration of a biosensor comprising a novel ruthenium complex and glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention.
9 is a graph showing glucose oxidation catalyst current according to glucose concentration of a biosensor comprising a novel ruthenium complex and a glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명에 의한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.While the invention allows for various modifications and variations, specific embodiments thereof are illustrated by way of example in the drawings and will be described in detail below. However, it is not intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise forms disclosed, but rather the invention includes all modifications, equivalents, and alternatives consistent with the spirit of the invention as defined by the claims.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공한다.The present invention provides a novel ruthenium complex represented by the following formula (1) or a salt compound thereof.
[화학식 1][Formula 1]
Ru(A)mXn Ru (A) m X n
(상기 화학식 1에서, A는 하기 화학식 2의 치환기이고,(In
[화학식 2][Formula 2]
R1 및 R2는 독립적으로, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 아민(-NH3), 할로겐, 카르복실산, 알코올(-OH) 및 시아나이드(-CN)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 straight or branched alkyl, C 1 -C 4 straight or branched alkoxy, amine (-NH 3 ), halogen, carboxylic acid, alcohol (-OH) and cyanide (-CN) is selected from the group consisting of
X는 할로겐 원소이고,X is a halogen element,
m은 1 또는 2이고, m is 1 or 2,
n은 2 또는 4의 정수이고, n is an integer of 2 or 4,
m과 n의 합은 6이다.)The sum of m and n is 6)
바람직하게는, 상기 화학식 1의 루테늄 착물은 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물일 수 있다.Preferably, the ruthenium complex of
[화학식 1a][Formula 1a]
[화학식 1b][Formula 1b]
(상기 화학식 1a 및 화학식 1b에 있어서, R1, R2 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)(In Formula 1a and Formula 1b, R 1 , R 2 and X are as defined in
본 발명에 따른 루테늄 착물은 염형태일 수 있으며, 염화합물이 높은 용해도를 가지므로 더욱 바람직하다. 상기 염화합물은 Li염, Na염, K염, Rb염, Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있다.The ruthenium complex according to the invention may be in salt form and is more preferred since the salt compound has high solubility. The salt compound may be a salt compound of at least one alkali metal selected from the group consisting of Li salt, Na salt, K salt, Rb salt, Cs salt and Fr salt.
나아가, 본 발명에 따른 루테늄 착물은 이의 염화합물 뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.Furthermore, ruthenium complexes according to the invention include not only their salt compounds, but also all possible solvates, hydrates, isomers and the like that can be prepared therefrom.
또한, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,In addition, the present invention as shown in
반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시키는 단계; 및Reacting the compound of
생성물을 침전시켜 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 화학식 1의 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing a novel ruthenium complex of formula (1) or a salt compound thereof comprising the step of precipitating the product to obtain a compound of formula (1a) or formula (1b).
[반응식 2]
(상기 반응식 2에서, R1, R2, X 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, 화학식 1a 및 화학식 1b는 상기 화학식 1에 포함된다.)(In
본 발명의 제조방법에서, 상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올 용매, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the production method of the present invention, the reaction solvent may be an alcohol solvent such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile, ethylene glycol and the like, but is not limited thereto.
반응 온도는 알코올 용매 또는 아세토니트릴의 경우 50~100℃에서 수행하며, 반응 용매로서 에틸렌글리콜의 경우에는 130~200℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나는 경우에는 원하는 생성물이 형성되지 않을 수 있다.The reaction temperature is performed at 50 to 100 ° C. for an alcohol solvent or acetonitrile, and preferably at 130 to 200 ° C. for ethylene glycol as a reaction solvent. If it is outside the above range, the desired product may not be formed.
생성물의 침전시 침전 용매는 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF), 테트라하이드로퓨란 (THF) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 침전물을 여과，건조하여 루테늄 착물을 제조할 수 있으며, 생성된 루테늄 착물은 1H NMR, XRD 등의 분석법을 통하여 구조를 분석할 수 있다.Precipitation solvent in the precipitation of the product may be, but is not limited to, diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF) and the like. Thereafter, the precipitate may be filtered and dried to prepare a ruthenium complex, and the produced ruthenium complex may be analyzed by analytical methods such as 1 H NMR and XRD.
본 발명의 일실시예에 있어서, 루테늄 착물의 염형태가 용해도 증가로 인해 더욱 바람직하다. 상기 루테늄 착물의 염화합물은 염기를 사용한 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들면 루테늄 착물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고，비용해 화합물 염을 여과하고，여액을 증발，건조시켜 얻을 수 있다.In one embodiment of the invention, the salt form of the ruthenium complex is more preferred due to increased solubility. The salt compound of the ruthenium complex may be prepared using a conventional method using a base. For example, the ruthenium complex may be dissolved in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, and the compound salt may be filtered and the filtrate is filtered. Can be obtained by evaporation and drying.
본 발명의 일실시예는 글루코스 탈수소화효소(GDH)와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 루테늄 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 관한 것이다.One embodiment of the invention relates to an electron transfer mediator comprising a ruthenium complex that reacts with glucose dehydrogenase (GDH) and is free of oxygen partial pressure and maintains a long-term redox form stably.
본 발명에 따른 화학식 1의 루테늄 착물은 도 7에 나타낸 바와 같이, 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극에 있어서 글루코스가 없을 때(0 mM 검정선)에는 전류가 거의 흐르지 않으나, 글루코스를 첨가하면(30 mM 빨간선) 전류가 급격하게 증가하는 것을 보여, 글루코스, 효소, 신규 루테늄 착물, 그리고 전극간의 전자전달 반응이 원활히 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 글루코스 탈수소화효소(GDH)에 대하여 전자전달 매개체로서 유용하게 사용될 수 있다.As shown in FIG. 7, the ruthenium complex of
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 제공한다.The present invention also provides a reagent composition for redox reaction comprising the ruthenium complex represented by the formula (1) as an electron transfer medium.
본 발명에 따른 산화환원반응용 시약조성물에 있어서, 상기 산화환원반응을 위한 산화환원효소는 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원되는 것으로, 이후 환원된 효소와 전달매개체와 반응하여 대사물질을 정량하게 된다.In the reagent composition for redox reaction according to the present invention, the redox enzyme for the redox reaction is reduced by reacting with various metabolites to be measured, and then quantified metabolites by reacting with the reduced enzyme and the delivery medium. Done.
상기 전자전달 매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원반응에 의해 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자 전달 매개체는 전극으로 전자를 전달하며 산화되고, 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.The electron transfer mediator reacts with the metabolites and is reduced by a reduced enzyme and redox reaction. The reduced electron transfer mediator is oxidized by transferring electrons to the electrode, and the current is applied to the surface of the electrode to which the oxidation potential is applied. It plays a role of generating.
본 발명은 글루코스 측정 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 글루코스가 효소에 의해 산화되는 비슷한 기작을 가지는 특정 산화환원효소에 본 발명의 전자전달 매개체를 도입함으로써, 다양한 대사물질 예를 들면 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산 또는 글루타메이트와 같은 유기물 또는 무기물의 농도를 정량할 수 있다.Although the present invention describes a glucose measuring biosensor as an example, various metabolites such as cholesterol and lactate may be introduced by introducing the electron transfer mediator of the present invention into a specific oxidoreductase having a similar mechanism in which glucose is oxidized by an enzyme. The concentration of organic or inorganic substances such as creatinine, hydrogen peroxide, alcohols, amino acids or glutamate can be quantified.
따라서 본 발명은 시약조성물에 포함되는 산화환원효소의 종류를 달리함으로써 다양한 대사물질의 정량에 제한 없이 이용될 수 있다.Therefore, the present invention can be used without limitation in the quantification of various metabolites by varying the type of oxidoreductase included in the reagent composition.
본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소화효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 에스테르화효소 (esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.The oxidoreductase usable in the present invention may be one or more selected from the group consisting of various dehydrogenases, oxidases, esterases, and the like, depending on the redox or detection target material. Among the enzymes belonging to the enzyme group, an enzyme having a target substance as a substrate may be selected and used.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.More specifically, the oxidoreductase is glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterolase , Lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, bilirubin oxidase, and the like. It may be one or more.
한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질(예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자(cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.On the other hand, the oxidoreductase may include a cofactor (cofactor) that serves to store the hydrogen taken by the oxidoreductase from the target material (eg metabolites) to be measured, for example, flavin adenine dinu It may be at least one selected from the group consisting of flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), pyrroloquinoline quinone (PQQ), and the like.
예컨대, 혈중 글루코스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코스 탈수소화효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)일 수 있다.For example, in order to measure blood glucose concentration, glucose dehydrogenase (GDH) may be used as the oxidoreductase, and the glucose dehydrogenase is a flavin adenine dinucleotide-containing FAD as a cofactor. Nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, including glucose adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and / or FAD-GDH as a cofactor. .
구체적 예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH(예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH (예컨대, EC1.1.1.47 등), PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산 탈수소화효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코스 산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤 산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤 에스테르화효소 (예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트 산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산 산화효소 (예컨대, EC1.10.3.3 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올 탈수소화효소 (예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈 산화효소 (예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.In specific examples, the oxidoreductases available may include FAD-GDH (eg, EC 1.1.99.10, etc.), NAD-GDH (eg, EC1.1.1.47, etc.), PQQ-GDH (eg, EC1.1.5.2, etc.). ), Glutamic acid dehydrogenase (eg, EC 1.4.1.2, etc.), glucose oxidase (eg, EC 1.1.3.4, etc.), cholesterol oxidase (eg, EC 1.1.3.6, etc.), cholesterol esterases (eg, EC 3.1.1.13, etc.), lactate oxidase (eg, EC 1.1.3.2, etc.), ascorbic acid oxidase (eg, EC1.10.3.3, etc.), alcohol oxidase (eg, EC 1.1.3.13, etc.), alcohol dehydration Digestive enzymes (eg, EC 1.1.1.1, etc.), bilirubin oxidase (eg, EC 1.3.3.5, etc.) and the like.
본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부 함유할 수 있다. 상기 루테늄 착물의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로, 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 금속함유 착물의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.The reagent composition according to the present invention may contain 20 to 700 parts by weight, such as 60 to 700 parts by weight or 30 to 340 parts by weight, based on 100 parts by weight of oxidoreductase. The content of the ruthenium complex can be appropriately adjusted according to the activity of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase contained in the reagent composition is high, the reagent composition may exhibit the desired effect even if the content of the metal-containing complex is low. The higher the activity of the oxidoreductase, the lower the content of the metal-containing complex can be controlled.
한편, 본 발명에 따른 시약 조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.On the other hand, the reagent composition according to the present invention is a dispersant when dissolving a reagent, at least one additive selected from the group consisting of surfactants, water-soluble polymers, quaternary ammonium salts, fatty acids, thickeners, adhesives for the preparation of reagents, stabilizers for long-term storage It may further include for the role of.
상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The surfactant may serve to distribute the reagent evenly on the electrode when the reagent is dispensed, so that the reagent is dispensed with a uniform thickness. Triton X-100 (Triton X-100), sodium dodecyl sulfate (sodium dodecyl sulfate), perfluorooctane sulfonate (perfluorooctane sulfonate), sodium stearate (sodium stearate), etc. as the surfactant More than one species can be used. The reagent composition according to the present invention, in order to properly perform the role of the reagent to be evenly spread on the electrode when the reagent is dispensed to distribute the reagent to a uniform thickness, based on 100 parts by weight of the
상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 폴리아미드(polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The water-soluble polymer may serve to help stabilize and disperse the enzyme as a polymer support of the reagent composition. The water-soluble polymers include polyvinylpyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyfluorosulfonate, hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxy One or more selected from the group consisting of hydroxypropyl cellulose (HPC), carboxy methyl cellulose (CMC), cellulose acetate, polyamide, and the like may be used. Reagent composition according to the present invention, 10 to 70 parts by weight, for example, based on 100 parts by weight of the redox enzyme in order to sufficiently and appropriately play a role of helping to stabilize and disperse the oxidoreductase It may be contained in an amount of 30 to 70 parts by weight. For example, in the case of using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 70 parts by weight of a water soluble polymer based on 100 parts by weight of an oxidoreductase. Can be adjusted lower than this.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도, 예컨대, 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.The water-soluble polymer may have a weight average molecular weight of about 2,500 to 3,000,000, for example, about 5,000 to 1,000,000 in order to effectively perform the dynamics to help stabilize and dispersing the support and the enzyme.
상기 4차 암모늄염은 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 4차 암모늄염으로는 에실트리메틸 암모늄(ecyltrimethylammonium), 마이리스틸트리메틸암모늄(myristyltrimethylammonium), 세틸트리메틸 암모늄(cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리메틸 암모늄(octadecyltrimethylammonium), 테트라헥실 암모늄(tetrahexylammonium) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 적혈구용적률에 따른 측정오차를 효율적으로 감소시키기 위하여, 상기 4차 암모늄염을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 130 중량부, 예컨대 70 내지 130 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 4차 암모늄염 70 내지 130 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 4차 암모늄염의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The quaternary ammonium salt may serve to reduce the measurement error according to the amount of hematocrit. The quaternary ammonium salt is selected from the group consisting of acyltrimethyl ammonium (ecyltrimethylammonium), myristyltrimethylammonium, myristyltrimethylammonium, cetyltrimethyl ammonium (cetyltrimethylammonium), octadecyltrimethylammonium, tetrahexyl ammonium (tetrahexylammonium), and the like. More than one species can be used. The reagent composition according to the present invention may contain the quaternary ammonium salt in an amount of 20 to 130 parts by weight, such as 70 to 130 parts by weight, based on 100 parts by weight of the redox enzyme, in order to efficiently reduce the measurement error according to the red blood cell volume ratio. have. For example, in the case of using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, it may contain 70 to 130 parts by weight of the quaternary ammonium salt based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the quaternary ammonium salt The content of can be adjusted lower than this.
상기 지방산은 상술한 4차 암모늄염과 같이 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하며, 또한 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 (linear dynamic range)을 확대시키는 역할을 한다. 상기 지방산으로는 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 C6~C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용할 수 있다. 상기 지방산으로는 카프로산(caproic acid), 헵타노산(heptanic acid), 카프릴산(caprylic acid), 옥타논산(octanoic acid), 노나노산(nonanoic acid), 카프르산(capric acid), 운데카노산(undecanoic acid), 라우르산(lauric acid), 트리데카노산(tridecanoic acid), 미리스티산(myristic acid), 펜타데카노산(pentadecanoic acid), 팔미트산(palmitic acid), 헵타데카노산(heptadecanoic acid), 스테아르산(stearic acid), 노나데카노산(nonadecanoic acid), 아라키드산(arachidonic acid), 상기 지방산의 염등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 적혈구용적률에 따른 측정오차 감소 및 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 확대 효과를 적절하게 얻기 위하여, 상기 지방산을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 지방산 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 지방산의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.Like the above-mentioned quaternary ammonium salt, the fatty acid reduces the measurement error according to the amount of hematocrit and also expands the linear dynamic range of the biosensor in the high concentration region. The fatty acid may be one or more selected from the group consisting of fatty acids having a C4 to C20 carbon chain and fatty acid salts thereof, preferably fatty acids having an alkyl carbon chain consisting of C 6 to C 12 or a fatty acid salt thereof. Can be used. The fatty acid may be caproic acid (caproic acid), heptanoic acid (heptanic acid), caprylic acid (caprylic acid), octanoic acid (octanoic acid), nonanoic acid (capanoic acid), capric acid (undricano) Acid (undecanoic acid), lauric acid, tridecanoic acid, myristic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, heptadecanoic acid ( Heptadecanoic acid, stearic acid (stearic acid), nonadecanoic acid (nonadecanoic acid), arachidonic acid (arachidonic acid), one or more selected from the group consisting of salts of the fatty acids can be used. Reagent composition according to the present invention, 10 to 70 parts by weight based on 100 parts by weight of the redox enzyme, in order to properly obtain the effect of reducing the measurement error according to the red blood cell volume ratio and the linear dynamic range of the biosensor in the high concentration region, For example, in an amount of 30 to 70 parts by weight. For example, in the case of using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 70 parts by weight of fatty acid based on 100 parts by weight of the oxidoreductase. Can be adjusted low.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드(DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약이 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The thickener serves to firmly attach the reagent to the electrode. The thickener may be used at least one selected from the group consisting of natrosol, diethylaminoethyl-dextran hydrochloride (DEAE-Dextran hydrochloride). The reagent composition according to the present invention may contain the thickener in an amount of 10 to 90 parts by weight, such as 30 to 90 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, so that the reagent is firmly attached to the electrode. For example, when using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 90 parts by weight of a thickener based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the amount of the thickener is increased. Can be adjusted lower than this.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 바이오센서를 제공한다.In addition, the present invention provides a biosensor comprising a ruthenium complex represented by
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 본 발명에 따른 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biosensor is applied to the substrate having at least two or more electrodes, the redox reaction reagent composition according to the invention that can redox the analyte included in the liquid biological sample It may be a fixed electrochemical biosensor.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the biosensor is provided with a working electrode, an auxiliary electrode and a confirmation electrode on a plane, the planar electricity characterized in that the redox reaction reagent composition according to the present invention is coated on the electrode It may be a chemical biosensor.
또한, 본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the biosensor is provided such that the working electrode and the auxiliary electrode face each other on different planes, and the redox reaction reagent composition according to the present invention is coated on the working electrode. It may be a face-to-face electrochemical biosensor.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는, 대한민국 특허출원 10-2003-0036804호, 대한민국 특허출원 10-2005-0010720호, 대한민국 특허출원 10-2007-0020447호, 대한민국 특허출원 10-2007-0021086호, 대한민국 특허출원 10-2007-0025106호, 대한민국 특허출원 10-2007-0030346호, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.] 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.The planar and face type electrochemical biosensor according to the present invention, Korean Patent Application No. 10-2003-0036804, Republic of Korea Patent Application 10-2005-0010720, Republic of Korea Patent Application 10-2007-0020447, Republic of Korea Patent Application 10- 2007-0021086, Republic of Korea Patent Application 10-2007-0025106, Republic of Korea Patent Application 10-2007-0030346, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.
이하, 상기 평면형 전기화학적 바이오센서를 도 1을 참조하여 그 구성을 설명한다.Hereinafter, the configuration of the planar electrochemical biosensor will be described with reference to FIG. 1.
먼저 도 1에 나타낸 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극과 확인전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(9)를 구비한 상판(8); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며, 혈액이 모세작용으로 전극 쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(7); 하기 전극에 코팅되는 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물(6); 하기 전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(5); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극(3)과 보조전극(2)과 확인전극(4); 및 상기 작동전극과 보조전극과 확인전극이 형성되는 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.First, the planar electrochemical biosensor shown in FIG. 1 includes a
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 전자전달 매개체로서 화학식 1의 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물은 산화환원효소-루테늄 착물 간의 반응속도가 빨라져 혈액 내 글루코스 검출 성능이 현저히 향상되고, 혈액 내 산소 및 방해 물질의 영향을 거의 받지 않아, 혈액 내 글루코스 검출을 위한 전기화학적 바이오센서의 제조에 유용하다.As described above, the redox reagent composition comprising a ruthenium complex of
상기 전극은 측정 대상과 효소 간의 반응에 의하여 발생되는 전기적 신호를 검출하는 것으로, 기술분야에 있어서 통상적으로 사용되는 재료를 사용할 수 있으며, 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 전극은 작동전극 및 확인전극을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 보조전극을 더 포함할 수 있다. 상기 전극의 형성은 기술분야에 있어서 통상적으로 사용되는 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 스크린 프린팅, 에칭, 스피터링 등에 의할 수 있다.The electrode detects an electrical signal generated by the reaction between the measurement target and the enzyme, and materials commonly used in the art may be used, and carbon, gold, platinum, silver, copper, palladium, etc. may be used. It is not limited to this. The electrode may include a working electrode and a confirmation electrode, and preferably may further include an auxiliary electrode. The formation of the electrode may be by a method commonly used in the art, for example, by screen printing, etching, sputtering or the like.
상기 전자전달매개체로서 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물은 상기 바이오센서에 기술분야에서 통상적으로 사용되는 형태로 사용될 수 있으며, 예를 들어 상기 작동전극의 상부에 도포되어 효소 반응층으로 사용될 수 있다. 또한 상기 산화환원반응용 시약조성물은 상기 작동전극의 상부에 별도의 연속하는 층으로 사용될 수 있다.The redox reaction reagent composition comprising the novel ruthenium complex of
상기 산화환원효소는 바이오센서가 측정하고자 하는 대상에 따라 변경될 수 있으며, 예를 들어 측정 대상이 혈액 중 콜레스테롤, 알코올 또는 글루코스인 경우, 각각 콜레스테롤 분해효소, 알코올 분해효소 또는 글루코스 분해효소를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 일실시예에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 산화환원효소는 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소를 사용할 수 있으며, 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The oxidoreductase may be changed according to the object to be measured by the biosensor. For example, when the measurement object is cholesterol, alcohol or glucose in blood, cholesterol degrading enzyme, alcohol degrading enzyme or glucose degrading enzyme may be used, respectively. have. Therefore, in the biosensor according to an embodiment of the present invention, the oxidoreductase may be an enzyme commonly used in the art, glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, Glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase ), Alcohol dehydrogenase (alcohol dehydrogenase), one or more selected from the group consisting of bilirubin oxidase (bilirubin oxidase) may be used, but is not limited thereto.
상기 생체시료는 혈액일 수 있다.The biological sample may be blood.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실험예(example)를 제시한다. 다만, 하기의 제조예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred preparation examples and experimental examples are provided to help understanding of the present invention. However, the following Preparation Examples and Experimental Examples are only for helping the understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following Preparation Examples.
<< 제조예Production Example 1> 1> Ru(dmo-bpy)Ru (dmo-bpy) 22 ClCl 22 착물의Complex 제조 Produce
둥근바닥 플라스크에 용매로서 무수 에탄올(40 mL)에 RuCl3·xH2O(35.1 mg, 0.1692 mmol)과 4',4'-디메톡시-2',2'-바이피리딘(dmo-bpy)(73.18 mg, 0.3384 mmol)을 넣고 1.5시간 동안 가열하여 환류시켰다.In a round bottom flask, RuCl 3 .xH 2 O (35.1 mg, 0.1692 mmol) and 4 ', 4'-dimethoxy-2', 2'-bipyridine (dmo-bpy) (anhydrous ethanol (40 mL) as a solvent) 73.18 mg, 0.3384 mmol) was added thereto, and the resulting mixture was heated and refluxed for 1.5 hours.
이후, 상온으로 냉각시키고, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(500 mL) 내로 적가하여 조 생성물을 침전시켰다. 이후, 침전물을 0.45㎛ 막 필터에 통과시켜 여과를 수행하였다. 다음으로, 생성물을 산화 알루미늄과 에탄올을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 이후, 농축된 용액을 디에틸 에테르(500 mL) 내로 적가하여 재-침전시켰다. 마지막으로, 침전물을 0.45㎛ 막 필터에 통과시켜 여과를 수행한 다음, 60℃의 진공 오븐에서 1일 동안 건조시켜 갈색 분말의 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 수득하였다.After cooling to room temperature, the reaction mixture was added dropwise into diethyl ether (500 mL) to precipitate the crude product. The precipitate was then filtered through a 0.45 μm membrane filter. The product was then purified by column chromatography using aluminum oxide and ethanol, after which the concentrated solution was re-precipitated dropwise into diethyl ether (500 mL). Finally, the precipitate was filtered through a 0.45 μm membrane filter and then dried in a vacuum oven at 60 ° C. for 1 day to give a brown powdered Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex.
<분석><Analysis>
(1) (One) 1One H NMR 분광법H NMR spectroscopy
Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물이 성공적으로 합성되었는지 알아보기 위하여, 제조된 생성물을 1H NMR 분광계(Varian Ascend 500, 500 MHz)로 확인하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.In order to determine whether the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex was successfully synthesized, the prepared product was confirmed by 1 H NMR spectrometer (
도 2는 상기 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이때, (a)는 dmo-bpy 리간드의 1H NMR 스펙트럼이고, (b)는 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 1H NMR 스펙트럼이다.Figure 2 shows the 1 H NMR spectrum of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in the above preparation. At this time, (a) is a 1 H NMR spectrum of the dmo-bpy ligand, (b) is a 1 H NMR spectrum of the synthesized Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex.
도 2(a)에 나타낸 바와 같이, dmo-bpy에 대한 양성자 신호는 δ 8.6395 (d, 1H, J=5.5, 피리딘), 8.4255 (s, 1H, 피리딘), 6.9400 (d, 1H, J=5.5, 피리딘), 및 3.7400 (s, 3H, -OCH3) ppm에서 관찰되었다.As shown in FIG. 2 (a), the proton signal for dmo-bpy was δ 8.6395 (d, 1H, J = 5.5, pyridine), 8.4255 (s, 1H, pyridine), 6.9400 (d, 1H, J = 5.5 , Pyridine), and 3.7400 (s, 3H, -OCH 3 ) ppm.
그러나, 도 2(b)에 나타낸 바와 같이, 착물 형성 후에 리간드 양성자의 공명은 δ 9.302 (s, 1H, 피리딘), 7.990 (s, 1H, 피리딘), 7.113 (s, 1H, 피리딘), 및 4.273 (s, 3H, -OCH3) ppm으로 이동함으로써, 상기 dmo-bpy가 Ru 중심에 결합됨을 확인하였다.However, as shown in FIG. 2 (b), the resonance of the ligand protons after complex formation is δ 9.302 (s, 1H, pyridine), 7.990 (s, 1H, pyridine), 7.113 (s, 1H, pyridine), and 4.273 By moving to (s, 3H, -OCH 3 ) ppm, it was confirmed that the dmo-bpy is bound to the Ru center.
(2) UV-(2) UV- visvis 분광법 Spectroscopy
또한, 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 결합 형태를 알아보기 위하여, UV-vis 분광법(Model 8453, Agilent Technologies, Shanghai, China)을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.In addition, in order to determine the binding form of the synthesized Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex, UV-vis spectroscopy (Model 8453, Agilent Technologies, Shanghai, China) was performed and the results are shown in FIG.
도 3은 상기 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물(위쪽, 빨간색 실선)과, 비교를 위한 출발물질인 RuCl3(아래쪽, 검정색 실선)의 색변화 및 UV-vis 스펙트럼을 나타낸다.FIG. 3 shows the color change and UV-vis spectrum of Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex (upper, red solid line) synthesized in the above preparation, and RuCl 3 (lower, black solid line), which is a starting material for comparison. Indicates.
도 3에 나타낸 바와 같이, Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물과 RuCl3의 UV-vis 스펙트럼은 349 nm와 390 nm 흡수 피크를 나타내나, RuCl3에서는 349 nm에서 흡수 피크가 나타나지 않고 390 nm에서도 특징적인 d-d 흡수 밴드가 사라진다. 또한, 208~298 nm 범위의 자외선 영역에서의 피크들은 dmo-bpy의 전형적인 피리딘 피크들이다. 따라서, 이로부터 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물은 dmo-bpy가 Ru 중심에 결합된 형태임을 확인하였다.As shown in FIG. 3, the UV-vis spectra of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex and RuCl 3 show 349 nm and 390 nm absorption peaks, but the RuCl 3 shows no absorption peak at 349 nm and 390 nm. The characteristic dd absorption band disappears at. In addition, the peaks in the ultraviolet region ranging from 208 to 298 nm are typical pyridine peaks of dmo-bpy. Therefore, it was confirmed that the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in the preparation example was in the form of dmo-bpy bound to the Ru center.
(3) X-선 광전자 분광법((3) X-ray photoelectron spectroscopy ( XPSXPS ))
제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 배위결합을 확인하기 위하여 X-선 광전자 분광계(XPS, SPECS, Berlin, Germany)를 이용하여 XPS를 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.XPS was carried out using an X-ray photoelectron spectrometer (XPS, SPECS, Berlin, Germany) to confirm the coordination bond of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in the preparation example, and the results are shown in FIG. 4. It was.
도 4는 dmo-bpy 리간드와, 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 N 결합에너지(a) 및 Ru 결합에너지(b)를 분석한 XPS 그래프이다.FIG. 4 is an XPS graph of an N binding energy (a) and a Ru binding energy (b) of a dmo-bpy ligand and a Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in the preparation example.
도 4(a)의 XPS 분석 결과에 나타낸 바와 같이, dmo-bpy 리간드는 401.4 eV에서 피리딘의 N 1s 피크가 나타난다. 그러나, 결합 후에 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 N 결합에너지는 400.0 eV로 낮아짐을 확인하였다. As shown in the XPS analysis of FIG. 4 (a), the dmo-bpy ligand showed
또한, 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, RuCl3에 대하여 전형적인 Ru 결합에너지는 Ru(3d3 / 2)(285.15 eV) 및 Ru(3d5 / 2)(282.5 eV) 오비탈의 2개의 구별되는 피크로 나타난다. 그러나, 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물에서 Ru(3d3 /2) 결합에너지는 285.7 eV로 높아지고, Ru(3d5 /2) 피크는 세기가 감소되어 사라졌다. 이로부터 제조된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물이 배위결합을 이루고 있음을 확인하였다.Further, FIG. 4, as shown in (b), typical Ru binding energy with respect to the RuCl 3 is Ru (3d 3/2) ( 285.15 eV) and Ru (3d 5/2) ( 282.5 eV) are two distinct of the orbital Appears as a peak. However, Ru (3d 3/2) in the
(4) (4) 순환전압전류법Cyclic voltammetry (( CVCV ))
제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 전자전달 매개체로서의 특성을 확인하기 위하여, 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물과, 비교를 위한 출발물질인 RuCl3에 대하여 순환전압전류법(CV)을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.The starting material for, a Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex and, compared synthesized in Production example to confirm that a Ru (dmo-bpy) 2 properties as an electron transfer mediator of the Cl 2 complex prepared in Production Example RuCl About 3 perform cyclic voltammetry (CV) and is shown in Figure 5 the results.
도 5는 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물과 RuCl3에 대한 순환 전압 전류곡선을 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 배위결합된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물은 RuCl3에 비하여 안정한 산화 및 환원 피크를 나타내었다. 이는 상기 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물이 빠르고 가역적인 산화환원 매개체로서 작용할 수 있음을 시사한다.5 shows a cyclic voltage current curve for the synthesized Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex and RuCl 3 . As shown in FIG. 5, the coordinated Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex showed stable oxidation and reduction peaks compared to RuCl 3 . This suggests that the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex can act as a fast and reversible redox mediator.
<< 제조예Production Example 2> 본 발명에 따른 루테늄 2> ruthenium according to the present invention 착물을Complexes 이용한 바이오센서의 제조 Manufacture of biosensor using
상기 제조예 1에 따라 제조된 1.0 mg의 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 1㎖의 0.1M 인산염 완충용액(PBS)(pH 7.4)에 용해시킨 용액 1.0㎕를 스크린 프린트 탄소 전극(SPCE)의 작동전극 상부에 떨어뜨린 후 상온에서 30초 동안 건조한다. 상기 건조된 전극 위에 FAD-GDH(FAD-glucose dehydrogenase)를 증류수에 용해시킨 4.0㎎/㎖ 용액 1.0㎕를 떨어뜨린 후 상온에서 30초 동안 건조시킨다. 이 위에 1.0% 나피온(nafion) 용액 1.0㎕을 떨어뜨려 상기 루테늄 착물과 FAD-GDH의 보호층을 형성하여 바이오센서를 제작하였다. 상기 바이오센서의 전극은 작동전극, 보조전극 및 기준전극으로 구성된 스크린 프린트 전극을 사용했으며, 작동전극과 보조전극은 탄소 잉크를 사용했으며, 기준전극은 실버잉크를 사용하여 제작하였다.1.0 μl of a solution in which 1.0 mg of Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex prepared in Preparation Example 1 was dissolved in 1 mL of 0.1 M phosphate buffer (PBS) (pH 7.4) was screen printed carbon electrode (SPCE). Drop on the working electrode of) and dry at room temperature for 30 seconds. 1.0 μl of a 4.0 mg / ml solution of FAD-GDH (FAD-glucose dehydrogenase) dissolved in distilled water was dropped on the dried electrode, followed by drying at room temperature for 30 seconds. 1.0 μl of Nafion solution was dropped thereon to form a protective layer of the ruthenium complex and FAD-GDH, thereby preparing a biosensor. The electrode of the biosensor was a screen print electrode composed of a working electrode, an auxiliary electrode, and a reference electrode. The working electrode and the auxiliary electrode used carbon ink, and the reference electrode was manufactured using silver ink.
<< 비교예Comparative example 1> 종래 전자전달 매개체로 사용되는 루테늄 1> Ruthenium used as a conventional electron transfer medium 착물을Complexes 이용한 바이오센서의 제조 Manufacture of biosensor using
상기 제조예 2에서 상기 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물 대신에 종래 전자전달 매개체로 사용되는 루테늄 착물인 Ru(NH3)6을 1.0㎕를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 바이오센서를 제작하였다.Except for using the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex in Preparation Example 2, 1.0 μl of Ru (NH 3 ) 6 , which is a ruthenium complex used as a conventional electron transfer medium, is the same as in Preparation Example 2 The biosensor was manufactured by the method.
<< 실험예Experimental Example 1> 본 발명에 따른 신규 루테늄 1> novel ruthenium according to the present invention 착물Complex 또는 종래 루테늄 Or conventional ruthenium 착물을Complexes 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 산화 촉매 전류의 비교 Comparison of Oxidation Catalytic Currents of Biosensors Used as Electron Transporting Media
상기 제조예 2 및 비교예 1에 따라 제조된 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서에 글루코스 30 mM을 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 용액을 처리하여, 글루코스 산화 촉매 전류를 순환전압전류법에 의해 전위 범위 -0.8V ~ 0.8V, 주사 속도 100 mV/s에서 측정하여, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.The biosensor using the ruthenium complex prepared according to Preparation Example 2 and Comparative Example 1 as an electron transfer medium was treated with a solution in which 30 mM of glucose was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) to circulate the glucose oxidation catalyst current. It measured by the voltammetry in the potential range -0.8V-0.8V, and the scanning speed of 100 mV / s, and the result is shown in FIG. 6 and FIG.
도 6은 종래 전자전달 매개체로 사용하는 루테늄 착물인 Ru(NH3)6을 사용한 바이오센서의 순환전압전류 곡선이고, 도 7은 본 발명의 제조예 1에 따라 제조된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 순환전압전류 곡선이다.FIG. 6 is a cyclic voltammogram of a biosensor using Ru (NH 3 ) 6 , a ruthenium complex used as a conventional electron transfer medium, and FIG. 7 is a Ru (dmo-bpy) 2 prepared according to Preparation Example 1 of the present invention. The cyclic voltammetry curve of a biosensor using Cl 2 complex as an electron transfer medium.
도 6에 나타낸 바와 같이, 종래 전자전달 매개체로서 사용하는 Ru(NH3)6을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 글루코스의 유무에 대한 산화전류의 변화가 현저하게 나타나지 않았다. 구체적으로, 도 6의 Ru(NH3)6을 사용한 경우, 글루코스가 없을 때와(0 mM 검정선) 있을때(30 mM 빨간선) 전류의 증가가 일어나지 않는 것을 보아 전자전달 매개체와 효소 그리고 전극에서의 전자전달 반응이 원활하게 일어나지 않는다는 것을 볼 수 있다. As shown in FIG. 6, the electrode of Ru (NH 3 ) 6 adsorbed with glucose dehydrogenase used as a conventional electron transfer medium did not show a significant change in oxidation current with or without glucose. Specifically, in the case of using Ru (NH 3 ) 6 of FIG. 6, the increase in current in the absence of glucose (0 mM black line) and in the presence of (30 mM red line) does not occur. It can be seen that the electron transfer reaction of does not occur smoothly.
그러나, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 글루코스의 유무에 큰 반응성을 나타내었다. 구체적으로 도 7에서, 본 발명에 따른 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 사용한 경우, 글루코스가 없을 때(0 mM 검정선)에는 전류가 거의 흐르지 않으나, 글루코스를 첨가하면(30 mM 빨간선) 전류가 급격하게 증가하는 것을 보여, 글루코스, 효소, 신규 루테늄 착물, 그리고 전극간의 전자전달 반응이 원활히 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물은 글루코스 탈수소화효소(GDH)에 대하여 전자전달 매개체로서 유용하게 사용될 수 있다.However, as shown in FIG. 7, the electrode obtained by adsorbing the novel ruthenium complex according to the present invention together with glucose dehydrogenase showed great reactivity in the presence or absence of glucose. Specifically, in FIG. 7, when the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex according to the present invention is used, almost no current flows in the absence of glucose (0 mM black line), but when glucose is added (30 mM red line) As the current increases rapidly, it can be seen that the electron transfer reaction between glucose, enzymes, new ruthenium complexes, and electrodes is smoothly performed. Therefore, the novel ruthenium complex according to the present invention can be usefully used as an electron transfer medium for glucose dehydrogenase (GDH).
<< 실험예Experimental Example 2> 2> 글루코스Glucose 농도에 따른 바이오센서의 Biosensor according to concentration 글루코스Glucose 산화 촉매 전류 평가 Oxidation Catalytic Current Evaluation
상기 실시예 2에 따라 제조된 바이오센서에 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 농도 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM 및 30 mM의 글루코스 용액을 처리하여, 글루코스 산화 촉매 전류를 순환전압전류법에 의해 전위 범위 -0.8V ~ 0.8V, 주사 속도 100 mV/s에서 측정하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.A glucose sensor having a concentration of 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM and 30 mM dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) was treated in the biosensor prepared according to Example 2, thereby preparing a glucose oxidation catalyst current. The cyclic voltammetry was performed at the potential range of -0.8 V to 0.8 V and the scanning speed of 100 mV / s, and the results are shown in FIGS. 8 and 9.
도 8은 본 발명의 제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선이다.8 is a cyclic voltammogram curve according to the glucose concentration of the biosensor comprising the novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 of the present invention.
도 9는 본 발명의 제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.9 is a graph showing glucose oxidation catalyst current according to glucose concentration of a biosensor comprising a novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 of the present invention.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서는 글루코스의 농도가 1 mM에서 30 mM으로 증가함에 따라 순환전압전류 또한 증가하는 것으로 나타났으며, 이 결과에서 0.8V의 전류값들을 비교하면, 도 9에 나타낸 바와 같이, 글루코스 농도가 5 mM에서 30 mM까지 증가할수록 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 이때 선형도는 R2=0.9984로 나타났다.As shown in FIG. 8, the biosensor comprising the novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 of the present invention also showed that the circulating voltage current also increased as the concentration of glucose increased from 1 mM to 30 mM. Comparing the current values of 0.8V in the results, it was shown that as the glucose concentration increases from 5 mM to 30 mM, the glucose oxidation catalyst current increases linearly. The linearity was found to be R 2 = 0.9984.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 전자전달매개체로 포함하는 바이오센서는 글루코스 탈수소화효소를 기반으로 하므로 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 장점이 있어, 이를 적용한 산화환원 반응시약, 및 전기화학적 바이오센서는 시고 내 산소 분압에 따른 측정오차가 최소화되며, 장기간 안정적으로 사용 가능한 장점이 있다.Therefore, the biosensor comprising the novel ruthenium complex of
이상 본 발명을 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위 내에서 상기 실시예를 다양하게 변형 및 수정할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다.Although the present invention has been described above with reference to preferred embodiments, it should be understood that the present invention is not limited to the above embodiments. The present invention can be variously modified and modified within the scope of the following claims, which are all within the scope of the invention. Accordingly, the invention is limited only by the claims and the equivalents thereof.
1: 하판
2: 보조전극
3: 작동전극
4: 확인전극
5: 절연판
6: 산화환원반응 시약조성물
7: 끼움판
8: 상판
9: 통기부1: bottom plate
2: auxiliary electrode
3: working electrode
4: confirming electrode
5: insulation plate
6: redox reagent composition
7: fitting plate
8: tops
9: vent
Claims (15)
[화학식 1]
Ru(A)mXn
(상기 화학식 1에서, A는 하기 화학식 2의 치환기이고,
[화학식 2]
R1 및 R2는 독립적으로, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 아민(-NH3), 할로겐, 카르복실산, 알코올(-OH) 및 시아나이드(-CN)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
X는 할로겐 원소이고,
m은 1 또는 2이고,
n은 2 또는 4의 정수이고,
m과 n의 합은 6이다).
Ruthenium complex represented by the following formula (1) or a salt compound thereof:
[Formula 1]
Ru (A) m X n
(In Formula 1, A is a substituent of the formula (2),
[Formula 2]
R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 straight or branched alkyl, C 1 -C 4 straight or branched alkoxy, amine (-NH 3 ), halogen, carboxylic acid, alcohol (-OH) and cyanide (-CN) is selected from the group consisting of
X is a halogen element,
m is 1 or 2,
n is an integer of 2 or 4,
the sum of m and n is 6).
상기 화학식 1의 루테늄 착물은 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물인 것을 특징으로 하는, 루테늄 착물 또는 이의 염화합물.
[화학식 1a]
[화학식 1b]
(상기 화학식 1a 및 화학식 1b에 있어서, R1, R2 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)
The method of claim 1,
The ruthenium complex of Formula 1 is characterized in that the compound of Formula 1a or Formula 1b, ruthenium complex or a salt compound thereof.
[Formula 1a]
[Formula 1b]
(In Formula 1a and Formula 1b, R 1 , R 2 and X are as defined in Formula 1 above.)
반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시키는 단계; 및
생성물을 침전시켜 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1의 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법.
[반응식 2]
(상기 반응식 2에서, R1, R2, X 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, 화학식 1a 및 화학식 1b는 상기 화학식 1에 포함된다.)
As shown in Scheme 2 below,
Reacting the compound of Formula 2 with the compound of Formula 3 in a reaction solvent; And
A process for preparing a novel ruthenium complex of formula 1 or a salt compound thereof, comprising the step of precipitating the product to obtain a compound of formula 1a or 1b.
Scheme 2
(In Reaction Scheme 2, R 1 , R 2 , X and n are as defined in Formula 1, Formula 1a and Formula 1b are included in Formula 1.)
상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세토니트릴 및 에틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법.
The method of claim 3,
The reaction solvent is methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile and ethylene glycol selected from the group consisting of a novel ruthenium complex or a method for producing a salt compound thereof.
상기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 3의 화합물의 반응은, 반응 용매로서 알코올 용매 또는 아세토니트릴을 사용할 경우 50~100℃에서 수행하며, 반응 용매로서 에틸렌글리콜을 사용할 경우에는 130~200℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법.
The method of claim 3,
The reaction of the compound of Formula 2 and the compound of Formula 3 is carried out at 50 ~ 100 ℃ when using an alcohol solvent or acetonitrile as the reaction solvent, at 130 ~ 200 ℃ when using ethylene glycol as the reaction solvent Method for producing a novel ruthenium complex or a salt compound thereof.
생성물의 침전시 침전 용매는 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법.
The method of claim 3,
The precipitation solvent when the product is precipitated is selected from the group consisting of diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF) and tetrahydrofuran (THF), a method for producing a novel ruthenium complex or a salt compound thereof.
A redox reaction reagent composition comprising a redox enzyme and a ruthenium complex represented by Chemical Formula 1 of claim 1 or a salt compound thereof as an electron transfer medium.
상기 산화환원효소는 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
탈수소화효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것인, 산화환원반응용 시약조성물.
The method of claim 7, wherein
The oxidoreductase may include at least one oxidoreductase selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase; or
One or more redox enzymes selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase, flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) And, Pyrroloquinoline quinone (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) comprising one or more cofactors selected from the group consisting of, redox reaction reagent composition.
상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 산화환원반응용 시약조성물.
The method of claim 8,
The oxidoreductases include glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, lactate One or more selected from the group consisting of lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, and bilirubin oxidase Reagent composition for redox reaction, characterized in that.
상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 산화환원반응용 시약조성물.
The method of claim 8,
The oxidoreductase is composed of flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase. Reagent composition for redox reaction, characterized in that at least one selected from.
상기 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부 함유하는 것을 특징으로 하는, 산화환원반응용 시약조성물.
The method of claim 7, wherein
The reagent composition is characterized in that it contains 20 to 700 parts by weight of the ruthenium complex of Formula 1 based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, redox reagent composition.
An electrochemical biosensor prepared by coating and fixing a redox reaction reagent composition of claim 7 capable of redoxing an analyte contained in a liquid biological sample on a substrate having at least two electrodes.
상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 평면형 바이오센서인 것을 특징으로 하는 것을 전기화학적 바이오센서.
The method of claim 12,
The biosensor is an electrochemical biosensor, characterized in that the working electrode, the auxiliary electrode and the confirmation electrode is provided on one plane, the planar biosensor coated with the redox reagent composition on the electrode.
상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 대면형 바이오센서인 것을 특징으로 하는 것을 전기화학적 바이오센서.
The method of claim 12,
The biosensor is an electrochemical biosensor, characterized in that the working electrode and the auxiliary electrode is provided to face each other on a different plane, the oxidation-reduction reagent composition is coated on the working electrode.
상기 생체시료는 혈액인 전기화학적 바이오센서.The method of claim 12,
The biological sample is blood electrochemical biosensor.
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