KR102266197B1 - Glucose dehydrogenase reactive novel ruthenium-based electron transfer mediator, preparation method thereof, redox reagent composition and biosensor comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈중 글루코스 농도를 측정하는 혈당 센서 및 바이오센서 등에서 전자전달 매개체로 사용할 수 있는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물에 관한 것으로, 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물은 글루코스 탈수소화효소와 반응성이 높아, 바이오센서의 전자전달 매개체로서 전자를 효소 및 전극 사이에서 신속하고 원활하게 교환할 수 있으므로, 글루코스 탈수소화효소를 기반으로 하는 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel ruthenium complex or a salt compound thereof that can be used as an electron transfer medium in a blood glucose sensor and a biosensor for measuring blood glucose concentration, and the novel ruthenium complex or its salt compound has high reactivity with glucose dehydrogenase. As an electron transport medium for biosensors, electrons can be exchanged quickly and smoothly between an enzyme and an electrode, so it can be usefully used for glucose dehydrogenase-based biosensors.
Description
본 발명은 바이오센서용 전자전달 매개체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 GDH 효소 감응형 신규 루테늄계 전자전달 매개체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 산화환원반응용 시약조성물 및 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to an electron transfer mediator for a biosensor, and more particularly, to a novel GDH enzyme-sensitized ruthenium-based electron transfer mediator, a method for preparing the same, a reagent composition for redox reaction comprising the same, and a biosensor.
전기화학적 바이오센서는 통상적으로 환경, 생물, 의학 등의 분야에 걸쳐 다양한 분석 대상을 검출하는 장치를 말하는 것으로, 대표적으로 글루코스, 콜레스테롤, 아미노산 등의 분석물을 사람의 체액으로부터 검출하는 바이오센서가 존재한다.The electrochemical biosensor generally refers to a device for detecting various analytes in the field of environment, biology, medicine, and the like, and there is a biosensor that detects analytes such as glucose, cholesterol, and amino acids from human body fluids. do.
현재, 상용화된 전기화학적 바이오센서는 전기적 신호를 변환할 수 있는 전극 위에 글루코스 산화 효소를 화학적 또는 물리적 방법으로 고정시킨 구조를 가진다. 이러한 전기화학적 바이오센서는 분석물 내의 글루코스가 효소에 의해 산화되어 발생하는 전자를 전극에 전달하여 생성되는 전류를 측정함으로써 분석물 내의 글루코스 농도를 측정하는 원리에 의한 것이다.Currently, a commercialized electrochemical biosensor has a structure in which a glucose oxidase is immobilized on an electrode capable of converting an electrical signal by a chemical or physical method. This electrochemical biosensor is based on the principle of measuring the concentration of glucose in the analyte by measuring the current generated by transferring electrons generated when glucose in the analyte is oxidized by an enzyme to the electrode.
그러나, 효소 전극을 이용하는 바이오센서의 경우, 효소의 활성 중심과의 거리가 너무 멀기 때문에 기질이 산화되어 발생되는 전자를 직접적으로 전극에 전달하는 것이 용이하지 않은 문제가 발생한다. 따라서 이러한 전자전달 반응을 용이하게 수행하기 위하여 산화/환원 매개체, 즉 전자전달 매개체가 필수적으로 요구된다.However, in the case of a biosensor using an enzyme electrode, since the distance from the active center of the enzyme is too far, it is not easy to directly transfer electrons generated by oxidation of the substrate to the electrode. Therefore, an oxidation/reduction mediator, that is, an electron transport mediator, is essential to facilitate this electron transport reaction.
종래 대표적으로 사용되는 전자전달 매개체로는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논 유도체, 오스뮴 고분자, 포타슘페리시아나이드 등이 있다. 이 중 상용화 된 바이오센서에 적용되는 대표적 전자전달매개체인 페리시아나이드는 음이온으로, Fe3 +를 중심으로 6개의 시아나이드리간드(cyanide ligands)가 8면체 구조로 결합되어 있으며, [Fe(CN)6]4-으로 쉽게 환원되며 산화/환원이 가역적이다. 이러한 특성으로 인해 페리시아나이드는 전기화학에서 대표적인 전자전달 물질로 바이오센서의 전자전달매개체로서 주로 사용되어 왔다. 그러나, 페리시아나이드는 전극 표면에 강하게 흡착되지 못하고 용액에 노출되는 경우 용액 상으로 탈기가 일어나는 경향이 있으며, 이러한 경향으로 인하여 효소와 반응하기에 충분한 양의 전자전달매개체가 감소하여 글루코스 측정 감도가 저하되고 이에 따라 정확한 글루코스 측정이 어렵게 되는 문제점이 있었다(R. Wilson et al., biosens.Bioelectron. 1992, 7, 165-185).Conventionally, there are ferrocene, a ferrocene derivative, a quinone derivative, an osmium polymer, potassium ferricyanide, etc. as an electron transport medium typically used in the prior art. Among them, ferricyanide, a representative electron transport medium applied to commercialized biosensors, is an anion, and six cyanide ligands are bonded in an octahedral structure centered on Fe 3 + , [Fe(CN) 6 ] It is easily reduced to 4- and oxidation/reduction is reversible. Due to these properties, ferricyanide is a representative electron transport material in electrochemistry and has been mainly used as an electron transport medium for biosensors. However, ferricyanide is not strongly adsorbed to the electrode surface, and when exposed to a solution, degassing tends to occur in the solution phase. Due to this tendency, an electron transport medium sufficient to react with the enzyme decreases, resulting in decreased glucose measurement sensitivity. There was a problem in that it is lowered and thus it is difficult to accurately measure glucose (R. Wilson et al., biosens. Bioelectron. 1992, 7, 165-185).
또한, 대부분의 상용화된 전기화학적 센서에 사용되는 글루코스 산화환원효소인 FAD-GOX(flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase)는 열에 안정하고 글루코스만을 산화시키는 반응선택성은 탁월하지만, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 혈액에 녹아 있는 산소와 반응하여 과산화수소를 생성하기 때문에 FAD-GOX 효소를 사용하여 만든 센서는 시료 혈액의 종류(정맥혈, 동맥혈, 또는 모세혈)에 따라서 측정값이 크게 다를 수 있다.In addition, FAD-GOX (flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase), a glucose oxidoreductase used in most commercially available electrochemical sensors, is stable to heat and has excellent reaction selectivity to oxidize only glucose, but as shown in
[반응식 1][Scheme 1]
채혈 혈당 센서의 개발 추이는 혈액(정맥혈, 모세혈 등)에 따라 달라지는 산소 분압(pO2) 차이에 따른 측정치 변화를 차단하기 위하여 혈액 내 글루코스와의 효소 반응에서 산소가 참여하는 GOX 대신에 효소반응에 산소가 배제된 GDH 사용으로 전환되고 있다.The development trend of blood glucose sensor is an enzymatic reaction instead of GOX in which oxygen participates in the enzymatic reaction with glucose in the blood in order to block the measurement value change due to the difference in oxygen partial pressure (pO 2 ) that varies depending on blood (venous blood, capillary blood, etc.) is being converted to the use of oxygen-free GDH.
가장 보편적으로 사용되는 전자전달 매개체로는 포타슘페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]가 있으며, 가격이 저렴하고 반응성이 좋아서 FAD-GOX, PQQ-GDH 또는 FAD-GDH를 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나, 이 전자전달 매개체를 이용한 센서는 혈액에 존재하는 요산(uric acid)이나 겐티식산(gentisic acid)과 같은 방해 물질에 의한 측정오차가 발생하고, 온도와 습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 하며, 장시간 보관 후 바탕전류의 변화로 낮은 농도의 글루코스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다.The most commonly used electron transport medium is potassium ferricyanide [K 3 Fe(CN) 6 ], which is useful for all sensors using FAD-GOX, PQQ-GDH or FAD-GDH because of its low price and high responsiveness. Do. However, the sensor using this electron transport medium is manufactured and stored because measurement errors occur due to interfering substances such as uric acid or gentisic acid present in the blood and are easily deteriorated by temperature and humidity. It is difficult to accurately detect low-concentration glucose due to changes in the background current after long-term storage.
헥사아민루테늄클로라이드[Ru(NH3)6Cl3]는 페리시아나이드에 비하여 산화환원 안정성이 높아 이 전자전달 매개체를 사용한 바이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성이 높은 장점을 갖지만, FAD-GDH와 사용하기에는 전자전달 반응이 용이하지 않아 상업적으로 유용한 센서로 제작하기가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들 전자전달 매개체도 센서 스트립의 정확도가 산소 분압에 영향을 받는다는 문제점이 있다.Hexaamine ruthenium chloride [Ru(NH 3 ) 6 Cl 3 ] has higher redox stability than ferricyanide, so biosensors using this electron transfer medium are easy to manufacture and store, and the change in background current is small even after long-term storage, so it is stable Although this has a high advantage, it has a disadvantage in that it is difficult to manufacture a commercially useful sensor because the electron transfer reaction is not easy for use with FAD-GDH. In addition, these electron transport media also have a problem that the accuracy of the sensor strip is affected by the oxygen partial pressure.
따라서 산소에 의하여 영향을 받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적으며, 넓은 농도 범위의 측정이 가능하며, 대량생산에 적합한 산화환원반응용 시약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약을 제조하기 위한 기술의 개발이 요구되고 있다.Therefore, it is not affected by oxygen, the change in performance due to temperature and humidity is small, the change in performance is small even after long-term storage, it is possible to measure a wide concentration range, and it is a reagent for redox reaction suitable for mass production, More specifically, the development of a technology for preparing a reagent for an electrochemical biosensor is required.
본 발명의 제1 목적은 글루코스 탈수소화효소(Glucose dehydrogenase; GDH)와 반응하므로 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한, 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공하는 것이다.A first object of the present invention is that since it reacts with glucose dehydrogenase (GDH), there is no effect by oxygen partial pressure, and the oxidation-reduction form is stably maintained for a long period of time, so it is excellent as an electron transfer medium for an electrochemical biosensor, novel ruthenium To provide a complex or a salt compound thereof.
본 발명의 제2 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a method for preparing the novel ruthenium complex or a salt compound thereof.
본 발명의 제3 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 전자전달 매개체로서 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.A third object of the present invention is to provide a reagent composition for a redox reaction comprising the novel ruthenium complex or a salt compound thereof as an electron transport medium.
본 발명의 제4 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 전자전달 매개체로서 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.A fourth object of the present invention is to provide an electrochemical biosensor comprising the novel ruthenium complex or a salt compound thereof as an electron transport medium.
상기 제1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공한다.In order to achieve the first object, the present invention provides a novel ruthenium complex represented by the following formula (1) or a salt compound thereof.
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, R1 내지 R3은 독립적으로 수소원자이고, X는 할로겐 원소이다)(In Formula 1, R 1 to R 3 are independently a hydrogen atom, and X is a halogen atom)
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또한 바람직하게는, 상기 신규 루테늄 착물은 최종 산화수가 산화 상태인 경우 2+이고, 환원 상태인 경우 1+이며, 물에 용해되는 것을 특징으로 한다.Also preferably, the novel ruthenium complex is characterized in that the final oxidation number is 2+ in the oxidized state and 1+ in the reduced state, and is soluble in water.
또한 바람직하게는, 상기 신규 루테늄 착물의 산화환원 전위는 0.0~0.7V일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.3~0.6V일 수 있다.Also preferably, the redox potential of the novel ruthenium complex may be 0.0 ~ 0.7V, more preferably 0.3 ~ 0.6V.
또한, 상기 제2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, a) 반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시켜 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계; b) 생성된 화학식 4의 화합물에 화학식 5의 화합물을 넣고 반응시켜 화학식 1의 화합물을 생성시키는 단계; 및 c) 생성물을 침전시켜 화학식 1의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공한다.In addition, in order to achieve the second object, the present invention, as shown in
[반응식 2][Scheme 2]
(상기 반응식 2에서, (In
R1 내지 R3 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고,R 1 to R 3 and X are as defined in
n은 0.5 내지 1이고,n is 0.5 to 1,
m은 1 내지 3이다.)m is 1 to 3.)
또한 바람직하게는, 상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세토니트릴 및 에틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.Also preferably, the reaction solvent may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile and ethylene glycol.
또한 바람직하게는, 상기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 3의 화합물의 반응은, 반응 용매로서 에틸렌글리콜을 사용할 경우에는 130~200℃에서 수행할 수 있다.Also preferably, the reaction of the compound of
또한 바람직하게는, 생성물의 침전시 침전 용매는 디메틸에테르, 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.Also preferably, the precipitation solvent for precipitation of the product may be selected from the group consisting of dimethyl ether, diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF) and tetrahydrofuran (THF).
또한, 상기 제3 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화환원효소, 및 전자전달 매개체로서 하기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 제공한다.In addition, in order to achieve the third object, the present invention provides a reagent composition for a redox reaction comprising an oxidoreductase and a ruthenium complex represented by the following
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, R1 내지 R3은 독립적으로 수소원자이고, X는 할로겐 원소이다)(In Formula 1, R 1 to R 3 are independently a hydrogen atom, and X is a halogen atom)
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또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는 탈수소화효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함할 수 있다.Also preferably, the oxidoreductase is one or more oxidoreductases selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase; or at least one oxidoreductase selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase, and flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) ), and may include one or more cofactors selected from the group consisting of pyrroloquinoline quinone (PQQ).
또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Also preferably, the oxidoreductase is glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase. esterase), lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, and bilirubin oxidase It may be one or more selected from.
또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Also preferably, the oxidoreductase is flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose). dehydrogenase) may be at least one selected from the group consisting of.
또한 바람직하게는, 상기 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부 함유할 수 있다.Also preferably, the reagent composition may contain 20 to 700 parts by weight of the ruthenium complex of Formula 1 based on 100 parts by weight of the oxidoreductase.
또한, 상기 제4 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 하기 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서를 제공한다.In addition, in order to achieve the fourth object, the present invention provides an oxidation containing a novel ruthenium complex represented by the following formula (1) capable of redox-oxidizing an analyte contained in a liquid biological sample on a substrate having at least two or more electrodes An electrochemical biosensor manufactured by applying and fixing a reagent composition for a reduction reaction is provided.
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, R1 내지 R3은 독립적으로 수소원자이고, X는 할로겐 원소이다)(In Formula 1, R 1 to R 3 are independently a hydrogen atom, and X is a halogen atom)
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또한 바람직하게는, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 평면형 바이오센서일 수 있다.Also preferably, the biosensor may be a planar biosensor in which a working electrode, an auxiliary electrode, and a confirmation electrode are provided on one plane, and a redox reagent composition is coated on the electrode.
또한 바람직하게는, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 대면형 바이오센서일 수 있다.Also preferably, the biosensor may be a face-to-face biosensor in which a working electrode and an auxiliary electrode face each other on different planes, and a redox reagent composition is coated on the working electrode.
또한 바람직하게는, 상기 생체시료는 혈액일 수 있다.Also preferably, the biological sample may be blood.
본 발명에 따른 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물은 산화환원효소, 특히 글루코스 탈수소화효소와의 반응속도가 빨라서 혈액 내 글루코스 검출 성능이 향상되고, 혈액 내 산소 및 방해 물질의 영향을 거의 받지 않아, 글루코스 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다.The novel ruthenium complex or salt compound thereof according to the present invention has a fast reaction rate with an oxidoreductase, particularly a glucose dehydrogenase, so that the blood glucose detection performance is improved, and it is hardly affected by oxygen and interfering substances in the blood. It is useful in the manufacture of biosensors for detection.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 FT-IR 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 UV-VIS 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 합성 확인을 위해 순환전압 전류법을 이용하여 측정한 결과 그래프이다.
도 4의 삽도는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소와의 반응성을 순환전압 전류법을 이용하여 측정한 결과 그래프이고, 도 4는 글루코스의 농도에 따른 상기 신규 루테늄 착물의 감응도를 나타내는 그래프이다.
도 5의 삽도는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소와의 반응성을 시간 전류 커브를 이용하여 측정한 결과 그래프이고, 도 5는 글루코스의 농도에 따른 상기 신규 루테늄 착물의 감응도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 종래의 Ru(NH3)6과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서, 또는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 감응도를 평가하는 순환전압전류 곡선이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 다양한 방해요소들과의 혼합물에서 신규 루테늄 착물의 글루코스의 선택적 감응도를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 물에서의 용해성을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 모식도이다.1 is an FT-IR spectrum for structural compound analysis of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention.
2 is a UV-VIS spectrum for structural compound analysis of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention.
3 is a graph showing the result of measurement using a cyclic voltammetry to confirm the synthesis of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention.
The inset of FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the reactivity between the novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention and glucose dehydrogenase using a cyclic voltammetry, and FIG. 4 is a graph showing the novel ruthenium complex according to the concentration of glucose. It is a graph showing the sensitivity of the ruthenium complex.
The inset of FIG. 5 is a graph of the results of measuring the reactivity between the novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention and the glucose dehydrogenase using a time current curve, and FIG. 5 is the novel ruthenium according to the concentration of glucose. It is a graph showing the sensitivity of the complex.
6 is a biosensor comprising a conventional Ru(NH 3 ) 6 and glucose dehydrogenase, or a biosensor comprising a novel ruthenium complex and glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention. It is the cyclic voltamm curve to be evaluated.
7 is a graph showing the selective sensitivity to glucose of a novel ruthenium complex in a mixture with various interfering factors according to an experimental example of the present invention.
8 shows the solubility in water of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention.
9 is a schematic diagram of a biosensor including a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명에 의한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, embodiments according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.While the present invention is susceptible to various modifications and variations, specific embodiments thereof are illustrated and shown in the drawings and will be described in detail hereinafter. However, it is not intended to limit the invention to the particular form disclosed, but rather the invention includes all modifications, equivalents and substitutions consistent with the spirit of the invention as defined by the claims.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공한다.The present invention provides a novel ruthenium complex represented by the following formula (1) or a salt compound thereof.
[화학식 1][Formula 1]
(상기 화학식 1에서, R1 내지 R3은 독립적으로 수소원자이고, X는 할로겐 원소이다)(In
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일반적으로, 전자전달매개체를 센서에 적용하기 위해서는 용매에 용해시킨 용액 상태로 사용하기 때문에 전자전달매개체는 용매 특히 물에 대한 용해도가 높은 것이 바람직한데, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 루테늄 금속에 방향족 고리가 5개가 착물로 결합함으로써, 최종 산화수가 산화 상태인 경우 2+이고 환원 상태인 경우 1+를 나타냄으로써 이온 형태를 갖는다. 따라서 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 그 자체로도 물에 용해되어 센서에 적용이 용이하다(도 8 참조).In general, in order to apply the electron transport medium to the sensor, since it is used in a solution state dissolved in a solvent, it is preferable that the electron transport medium has high solubility in a solvent, particularly water. The novel ruthenium complex of
본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 아민기를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 아민기가 루테늄 착물의 산화환원전위를 낮추어 줌으로써 선택적으로 글루코스만을 감응할 수 있도록 한다. 이때, 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물의 산화환원전위는 0.0~0.7V이다.The novel ruthenium complex of
본 발명에 따른 루테늄 착물은 염형태일 수 있다. 상기 염화합물은 Li염, Na염, K염, Rb염, Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있다.The ruthenium complex according to the present invention may be in the form of a salt. The salt compound may be a salt compound of at least one alkali metal selected from the group consisting of Li salt, Na salt, K salt, Rb salt, Cs salt and Fr salt.
나아가, 본 발명에 따른 루테늄 착물은 이의 염화합물 뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.Furthermore, the ruthenium complex according to the present invention includes all possible solvates, hydrates, isomers and the like that can be prepared therefrom, as well as salt compounds thereof.
또한, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,In addition, the present invention, as shown in
a) 반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시켜 화학식 4의 화합물을 생성시키는 단계;a) preparing a compound of
b) 생성된 화학식 4의 화합물에 화학식 5의 화합물을 넣고 반응시켜 화학식 1의 화합물을 생성시키는 단계; 및b) adding a compound of
c) 생성물을 침전시켜 화학식 1의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 1의 신규 루테늄 착물의 제조방법을 제공한다.It provides a method for preparing a novel ruthenium complex of formula (1), comprising the step of c) precipitating the product to obtain a compound of formula (1).
[반응식 2][Scheme 2]
(상기 반응식 2에서, (In
R1 내지 R3 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고,R 1 to R 3 and X are as defined in
n은 0.5 내지 1이고,n is 0.5 to 1,
m은 1 내지 3이다.)m is 1 to 3.)
본 발명의 제조방법에서, 상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올 용매, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the preparation method of the present invention, the reaction solvent may be an alcohol solvent such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile, ethylene glycol, or the like, but is not limited thereto.
반응 온도는 알코올 용매 또는 아세토니트릴의 경우 50~100℃에서 수행하며, 반응 용매로서 에틸렌글리콜의 경우에는 130~200℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나는 경우에는 원하는 생성물이 형성되지 않을 수 있다.The reaction temperature is preferably carried out at 50 to 100° C. in the case of an alcohol solvent or acetonitrile, and at 130 to 200° C. in the case of ethylene glycol as the reaction solvent. If it is outside the above range, the desired product may not be formed.
생성물의 침전시 침전 용매는 디메틸에테르, 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 침전물을 여과，건조하여 루테늄 착물을 제조할 수 있으며, 생성된 루테늄 착물은 FT-IR, UV-VIS 분광법 등의 분석법을 통하여 구조를 분석할 수 있다.When the product is precipitated, the precipitation solvent may be dimethyl ether, diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), or the like, but is not limited thereto. Thereafter, the precipitate may be filtered and dried to prepare a ruthenium complex, and the structure of the generated ruthenium complex may be analyzed through analysis methods such as FT-IR and UV-VIS spectroscopy.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 루테늄 착물의 염화합물은 염기를 사용한 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들면 루테늄 착물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고，비용해 화합물 염을 여과하고，여액을 증발，건조시켜 얻을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the salt compound of the ruthenium complex can be prepared using a conventional method using a base, for example, the ruthenium complex is dissolved in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, It can be obtained by filtering the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate.
본 발명의 일실시예는 글루코스 탈수소화효소(GDH)와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 루테늄 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 관한 것이다.One embodiment of the present invention relates to an electron transport mediator comprising a ruthenium complex that reacts with glucose dehydrogenase (GDH), is not affected by oxygen partial pressure, and maintains a stable redox form for a long period of time.
종래 전자전달 매개체로 사용되었던 루테늄 착물인 헥사아민 루테늄[Ru(NH3)6]은 도 6(a)에 나타낸 바와 같이, 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극에 있어서, 글루코스의 유무에 관계없이 전류밀도의 변화가 없으므로, 글루코스 탈수소화효소에 대하여는 반응을 나타내지 않았다. Hexaamine ruthenium [Ru(NH 3 ) 6 ], which is a ruthenium complex used as a conventional electron transport medium, is adsorbed together with glucose dehydrogenase as shown in FIG. 6(a), regardless of the presence or absence of glucose Since there was no change in current density, there was no reaction to glucose dehydrogenase.
그러나, 본 발명에 따른 화학식 1의 루테늄 착물은 도 6(b)에 나타낸 바와 같이, 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극에 있어서, 글루코스가 없을 때(0 mM)에는 전류가 거의 흐르지 않으나, 글루코스를 첨가하면(20 mM) 전류가 급격하게 증가하는 것을 보여, 글루코스, 효소, 신규 루테늄 착물, 그리고 전극간의 전자전달 반응이 원활히 이루어지는 것을 알 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 화학식 1의 루테늄 착물은 도 8에 나타낸 바와 같이, 물(증류수)에서도 잘 용해되어 원심분리기로 원심분리를 수행한 뒤에도 결정이 석출되지 않고 용해 상태로 존재함으로써 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극과 반응하는 표면적이 넓으므로 글루코스에 대한 감응도가 높았다.However, in the ruthenium complex of
또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 루테늄 착물은 도 7에 나타낸 바와 같이, 혈액 내에 아스코르브산, 요산, 도파민 등의 여러 방해물질들이 혼합된 경우에도, 글루코스에 선택적으로 반응하는 것으로 나타났다.In addition, as shown in FIG. 7 , the ruthenium complex of
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 글루코스 탈수소화효소(GDH)와 글루코스의 반응에 대하여 높은 반응 감도를 나타냄으로써 GDH 전자전달 매개체로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the novel ruthenium complex of
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a reagent composition for redox reaction comprising the ruthenium complex represented by
본 발명에 따른 산화환원반응용 시약조성물에 있어서, 상기 산화환원반응을 위한 산화환원효소는 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원되는 것으로, 이후 환원된 효소와 전달매개체와 반응하여 대사물질을 정량하게 된다.In the redox reagent composition according to the present invention, the oxidoreductase for the redox reaction is reduced by reacting with various metabolites to be measured, and then reacts with the reduced enzyme and a delivery medium to quantify the metabolite will do
상기 전자전달 매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원반응에 의해 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자 전달 매개체는 전극으로 전자를 전달하며 산화되고, 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.The electron transport mediator reacts with the metabolite and is reduced by a reduced enzyme and redox reaction, and the electron transport mediator in the reduced state thus formed transfers electrons to the electrode and is oxidized, and a current is applied on the electrode surface to which the oxidation potential is applied. plays a role in generating
본 발명은 글루코스 측정 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 글루코스가 효소에 의해 산화되는 비슷한 기작을 가지는 특정 산화환원효소에 본 발명의 전자전달 매개체를 도입함으로써, 다양한 대사물질 예를 들면 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산 또는 글루타메이트와 같은 유기물 또는 무기물의 농도를 정량할 수 있다.Although the present invention describes a glucose measuring biosensor as an example, by introducing the electron transfer mediator of the present invention to a specific oxidoreductase having a similar mechanism in which glucose is oxidized by enzymes, various metabolites such as cholesterol, lactate , the concentration of organic or inorganic substances such as creatinine, hydrogen peroxide, alcohol, amino acids or glutamate can be quantified.
따라서 본 발명은 시약조성물에 포함되는 산화환원효소의 종류를 달리함으로써 다양한 대사물질의 정량에 제한 없이 이용될 수 있다.Therefore, the present invention can be used without limitation in the quantification of various metabolites by changing the type of oxidoreductase included in the reagent composition.
본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 에스테르화효소(esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.The oxidoreductase that can be used in the present invention may be at least one selected from the group consisting of various dehydrogenases, oxidases, esterases, etc., depending on the redox or detection target material. , it is possible to select and use an enzyme having the target substance as a substrate from among the enzymes belonging to the enzyme group.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.More specifically, the oxidoreductase is glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase. , lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, bilirubin oxidase, etc. There may be more than one type.
한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질(예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자(cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.On the other hand, the oxidoreductase may include a cofactor that serves to store the hydrogen taken from the oxidoreductase from the target substance (eg, metabolite) to be measured, for example, flavin adenine dinu. It may be at least one selected from the group consisting of cleotide (flavin adenine dinucleotide, FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), and pyrroloquinoline quinone (PQQ).
예컨대, 혈중 글루코스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코스 탈수소화효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)일 수 있다.For example, when measuring blood glucose concentration, glucose dehydrogenase (GDH) may be used as the oxidoreductase, and the glucose dehydrogenase is a flavin adenine dinucleotide containing FAD as a cofactor- flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and/or nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase with FAD-GDH as a cofactor .
구체적 예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH(예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH(예컨대, EC1.1.1.47 등), PQQ-GDH(예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산 탈수소화효소(예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코스 산화효소(예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤 산화효소(예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤 에스테르화효소(예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트 산화효소(예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산 산화효소(예컨대, EC1.10.3.3 등), 알코올산화효소(예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올 탈수소화효소(예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈 산화효소(예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.In a specific example, the usable oxidoreductase is FAD-GDH (eg, EC 1.1.99.10, etc.), NAD-GDH (eg, EC1.1.1.47, etc.), PQQ-GDH (eg, EC1.1.5.2, etc.) ), glutamic acid dehydrogenase (eg EC 1.4.1.2, etc.), glucose oxidase (eg EC 1.1.3.4, etc.), cholesterol oxidase (eg EC 1.1.3.6, etc.), cholesterol esterase (eg EC 3.1.1.13, etc.), lactate oxidase (eg EC 1.1.3.2, etc.), ascorbic acid oxidase (eg EC1.10.3.3, etc.), alcohol oxidase (eg EC 1.1.3.13, etc.), alcohol dehydration It may be at least one selected from the group consisting of digestive enzymes (eg, EC 1.1.1.1, etc.), bilirubin oxidase (eg, EC 1.3.3.5, etc.).
본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부 함유할 수 있다. 상기 루테늄 착물의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로, 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 금속함유 착물의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.The reagent composition according to the present invention may contain 20 to 700 parts by weight, such as 60 to 700 parts by weight or 30 to 340 parts by weight, of the ruthenium complex of
한편, 본 발명에 따른 시약 조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.On the other hand, the reagent composition according to the present invention contains one or more additives selected from the group consisting of surfactants, water-soluble polymers, quaternary ammonium salts, fatty acids, thickeners, and the like, as a dispersant for dissolving reagents, an adhesive for preparing reagents, and stabilizers for long-term storage It may be further included for a role such as.
상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The surfactant may serve to distribute the reagent evenly on the electrode when dispensing the reagent so that the reagent is dispensed with a uniform thickness. 1 selected from the group consisting of Triton X-100, sodium dodecyl sulfate, perfluorooctane sulfonate, sodium stearate, etc. as the surfactant More than one species can be used. In the reagent composition according to the present invention, the surfactant is added to 100 parts by weight of the oxidoreductase in order to properly perform the role of dispensing the reagent evenly on the electrode and dispensing the reagent with a uniform thickness when dispensing the reagent. to 25 parts by weight, such as 10 to 25 parts by weight. For example, when an oxidoreductase having an activity of 700 U/mg is used, 10 to 25 parts by weight of a surfactant may be contained based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and when the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of the surfactant can be adjusted lower than this.
상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 폴리아미드(polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The water-soluble polymer may serve as a polymer support for the reagent composition to assist in stabilizing and dispersing the enzyme. As the water-soluble polymer, polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyfluorosulfonate (perfluoro sulfonate), hydroxyethyl cellulose (HEC), hydroxy At least one selected from the group consisting of propyl cellulose (hydroxypropyl cellulose; HPC), carboxy methyl cellulose (CMC), cellulose acetate, polyamide, and the like may be used. The reagent composition according to the present invention contains 10 to 70 parts by weight of the water-soluble polymer based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, for example, in order to sufficiently and appropriately exert the role of helping the stabilization and dispersing of the oxidoreductase. It may be contained in an amount of 30 to 70 parts by weight. For example, when an oxidoreductase having an activity of 700 U/mg is used, it may contain 30 to 70 parts by weight of a water-soluble polymer based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and when the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of the water-soluble polymer can be adjusted lower than this.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도, 예컨대, 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.The water-soluble polymer may have a weight average molecular weight of about 2,500 to 3,000,000, for example, about 5,000 to 1,000,000, in order to effectively perform a dynamic to help stabilize and disperse the support and the enzyme.
상기 4차 암모늄염은 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 4차 암모늄염으로는 에실트리메틸 암모늄(ecyltrimethylammonium), 마이리스틸트리메틸암모늄(myristyltrimethylammonium), 세틸트리메틸 암모늄(cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리메틸 암모늄(octadecyltrimethylammonium), 테트라헥실 암모늄(tetrahexylammonium) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 적혈구용적률에 따른 측정오차를 효율적으로 감소시키기 위하여, 상기 4차 암모늄염을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 130 중량부, 예컨대 70 내지 130 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 4차 암모늄염 70 내지 130 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 4차 암모늄염의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The quaternary ammonium salt may serve to reduce measurement error according to the amount of hematocrit. As the quaternary ammonium salt, 1 selected from the group consisting of ecyltrimethylammonium, myristyltrimethylammonium, cetyltrimethylammonium, octadecyltrimethylammonium, tetrahexylammonium, etc. More than one species can be used. The reagent composition according to the present invention may contain the quaternary ammonium salt in an amount of 20 to 130 parts by weight, such as 70 to 130 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, in order to effectively reduce the measurement error according to the hematocrit. have. For example, when an oxidoreductase having an activity of 700 U/mg is used, 70 to 130 parts by weight of a quaternary ammonium salt may be contained based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and when the activity of the oxidoreductase is higher than this, the quaternary ammonium salt The content of can be adjusted lower than this.
상기 지방산은 상술한 4차 암모늄염과 같이 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하며, 또한 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 (linear dynamic range)을 확대시키는 역할을 한다. 상기 지방산으로는 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 C6~C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용할 수 있다. 상기 지방산으로는 카프로산(caproic acid), 헵타노산(heptanic acid), 카프릴산(caprylic acid), 옥타논산(octanoic acid), 노나노산(nonanoic acid), 카프르산(capric acid), 운데카노산(undecanoic acid), 라우르산(lauric acid), 트리데카노산(tridecanoic acid), 미리스티산(myristic acid), 펜타데카노산(pentadecanoic acid), 팔미트산(palmitic acid), 헵타데카노산(heptadecanoic acid), 스테아르산(stearic acid), 노나데카노산(nonadecanoic acid), 아라키드산(arachidonic acid), 상기 지방산의 염등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 적혈구용적률에 따른 측정오차 감소 및 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 확대 효과를 적절하게 얻기 위하여, 상기 지방산을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 지방산 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 지방산의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The fatty acid serves to reduce a measurement error according to the amount of hematocrit like the above-described quaternary ammonium salt, and also serves to expand the linear dynamic range of the biosensor in a high concentration region. As the fatty acid, one or more selected from the group consisting of fatty acids having a C4 to C20 carbon chain and fatty acid salts thereof may be used, and preferably, a fatty acid having an alkyl carbon chain consisting of C 6 to C 12 or a fatty acid salt thereof. can be used The fatty acids include caproic acid, heptanoic acid, caprylic acid, octanoic acid, nonanoic acid, capric acid, undecano Undecanoic acid, lauric acid, tridecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, heptadecanoic acid ( heptadecanoic acid), stearic acid, nonadecanoic acid, arachidonic acid, and at least one selected from the group consisting of salts of the fatty acids may be used. The reagent composition according to the present invention contains 10 to 70 parts by weight of the fatty acid based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, in order to appropriately obtain the effect of reducing measurement error according to hematocrit and expanding the linear dynamic range of the biosensor in a high concentration region, For example, it may be contained in an amount of 30 to 70 parts by weight. For example, when using an oxidoreductase having an activity of 700 U/mg, it may contain 30 to 70 parts by weight of fatty acids based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and when the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of fatty acids is higher than this. can be adjusted low.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드(DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약이 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The thickener serves to firmly attach the reagent to the electrode. As the thickening agent, at least one selected from the group consisting of natrozole, diethylaminoethyl-dextran hydrochloride (DEAE-Dextran hydrochloride), and the like may be used. The reagent composition according to the present invention may contain the thickener in an amount of 10 to 90 parts by weight, such as 30 to 90 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, so that the reagent is firmly attached to the electrode. For example, when using an oxidoreductase having an activity of 700 U/mg, it may contain 30 to 90 parts by weight of a thickener based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and when the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of the thickener can be adjusted lower than this.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 바이오센서를 제공한다.In addition, the present invention provides a biosensor comprising the ruthenium complex represented by
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 본 발명에 따른 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biosensor is a substrate equipped with at least two or more electrodes, a reagent composition for redox reaction according to the present invention capable of redoxing an analyte contained in a liquid biological sample is applied It may be an electrochemical biosensor manufactured by fixing.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In another embodiment of the present invention, in the biosensor, a working electrode, an auxiliary electrode, and a confirmation electrode are provided on one plane, and the redox reagent composition according to the present invention is coated on the electrode. It may be a chemical biosensor.
또한, 본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.Further, in another embodiment of the present invention, the biosensor is provided such that the working electrode and the auxiliary electrode face each other on different planes, and the redox reagent composition according to the present invention is coated on the working electrode. It may be a face-to-face electrochemical biosensor.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는, 대한민국 특허출원 10-2003-0036804호, 대한민국 특허출원 10-2005-0010720호, 대한민국 특허출원 10-2007-0020447호, 대한민국 특허출원 10-2007-0021086호, 대한민국 특허출원 10-2007-0025106호, 대한민국 특허출원 10-2007-0030346호, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.] 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.The planar and face-to-face electrochemical biosensors according to the present invention are disclosed in Korean Patent Application No. 10-2003-0036804, Korean Patent Application 10-2005-0010720, Korean Patent Application 10-2007-0020447, Korean Patent Application 10- 2007-0021086, Korean Patent Application No. 10-2007-0025106, Korean Patent Application No. 10-2007-0030346, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.] can be prepared through a known method.
이하, 상기 평면형 전기화학적 바이오센서를 도 9를 참조하여 그 구성을 설명한다.Hereinafter, the configuration of the planar electrochemical biosensor will be described with reference to FIG. 9 .
먼저, 도 1에 나타낸 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극과 확인전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(9)를 구비한 상판(8); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며, 혈액이 모세작용으로 전극 쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(7); 하기 전극에 코팅되는 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물(6); 하기 전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(5); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극(3)과 보조전극(2)과 확인전극(4); 및 상기 작동전극과 보조전극과 확인전극이 형성되는 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.First, the planar electrochemical biosensor shown in FIG. 1 has a working electrode, an auxiliary electrode, and a confirmation electrode on one plane, and includes a top plate 8 having a
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 전자전달 매개체로서 화학식 1의 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물은 산화환원효소-루테늄 착물 간의 반응속도가 빨라져 혈액 내 글루코스 검출 성능이 현저히 향상되고, 혈액 내 산소 및 방해 물질의 영향을 거의 받지 않아, 혈액 내 글루코스 검출을 위한 전기화학적 바이오센서의 제조에 유용하다.As described above, the reagent composition for redox reaction comprising the ruthenium complex of
상기 전극은 측정 대상과 효소 간의 반응에 의하여 발생되는 전기적 신호를 검출하는 것으로, 기술분야에 있어서 통상적으로 사용되는 재료를 사용할 수 있으며, 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 전극은 작동전극 및 확인전극을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 보조전극을 더 포함할 수 있다. 상기 전극의 형성은 기술분야에 있어서 통상적으로 사용되는 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 스크린 프린팅, 에칭, 스피터링 등에 의할 수 있다.The electrode detects an electrical signal generated by a reaction between a measurement target and an enzyme, and materials commonly used in the technical field may be used, and carbon, gold, platinum, silver, copper, palladium, etc. may be used. The present invention is not limited thereto. The electrode may include a working electrode and a confirmation electrode, and preferably may further include an auxiliary electrode. The electrode may be formed by a method commonly used in the art, for example, screen printing, etching, sputtering, or the like.
상기 전자전달매개체로서 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물은 상기 바이오센서에 기술분야에서 통상적으로 사용되는 형태로 사용될 수 있으며, 예를 들어 상기 작동전극의 상부에 도포되어 효소 반응층으로 사용될 수 있다. 또한 상기 산화환원반응용 시약조성물은 상기 작동전극의 상부에 별도의 연속하는 층으로 사용될 수 있다.The reagent composition for redox reaction comprising the novel ruthenium complex of
상기 산화환원효소는 바이오센서가 측정하고자 하는 대상에 따라 변경될 수 있으며, 예를 들어 측정 대상이 혈액 중 콜레스테롤, 알코올 또는 글루코스인 경우, 각각 콜레스테롤 분해효소, 알코올 분해효소 또는 글루코스 분해효소를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 일실시예에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 산화환원효소는 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소를 사용할 수 있으며, 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The oxidoreductase may be changed depending on the target to be measured by the biosensor, for example, when the measurement target is cholesterol, alcohol, or glucose in blood, cholesterol degrading enzyme, alcohol degrading enzyme or glucose degrading enzyme may be used, respectively. have. Therefore, in the biosensor according to an embodiment of the present invention, the oxidoreductase may use an enzyme commonly used in the art, glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase ), alcohol dehydrogenase (alcohol dehydrogenase), bilirubin oxidase (bilirubin oxidase), etc. may be used at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
상기 생체시료는 혈액일 수 있다.The biological sample may be blood.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실험예(example)를 제시한다. 다만, 하기의 제조예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred preparation examples and experimental examples (examples) are presented to help the understanding of the present invention. However, the following preparation examples and experimental examples are only for helping understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following preparation examples.
<< 제조예manufacturing example 1> 1> Ru(dam-bpy)(ter-py)ClRu(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물의complex 제조 Produce
둥근바닥 플라스크에 용매로서 에틸렌글리콜(4 mL)에 RuCl3·xH2O(2a)(36.4 mg)를 용해시킨 제1 용액과 에틸렌글리콜(3 mL)에 4,4'-디아민-2,2'-바이피리딘(dam-bpy)(3a)(16.5 mg)을 용해시킨 제2 용액을 넣고 170℃의 오일 배쓰에서 10분 동안 교반시켜 화학식 4a의 화합물을 형성시켰다. 이후, 2,2'-6',2"-터트피리딘(5a)(82.7 mg)을 첨가하여 10분 동안 교반시켰다. A first solution of RuCl 3 ·xH 2 O ( 2a ) (36.4 mg) dissolved in ethylene glycol (4 mL) as a solvent in a round-bottom flask and 4,4′-diamine-2,2 in ethylene glycol (3 mL) A second solution in which '-bipyridine (dam-bpy) ( 3a ) (16.5 mg) was dissolved was added and stirred in an oil bath at 170° C. for 10 minutes to form a compound of Formula 4a. Then, 2,2'-6',2"-tertpyridine ( 5a ) (82.7 mg) was added and stirred for 10 minutes.
이후, 상온(25℃)으로 냉각시키고, 반응 혼합물을 디메틸 에테르(400 mL) 내로 적가하면서 280 rpm으로 30분 동안 교반시켜 조 생성물을 침전시켰다. 이러한 과정을 3회 반복하였다. 이후, 침전물을 나일론 막 필터에 통과시켜 여과를 수행한 다음, 38℃의 오븐에서 10분 동안 건조시켜 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물을 수득하였다.Then, it was cooled to room temperature (25° C.), and the reaction mixture was stirred at 280 rpm for 30 minutes while being added dropwise into dimethyl ether (400 mL) to precipitate the crude product. This process was repeated 3 times. Thereafter, the precipitate was passed through a nylon membrane filter to perform filtration, and then dried in an oven at 38° C. for 10 minutes to obtain a Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex.
<분석><Analysis>
(1) FT-IR 분광법(1) FT-IR spectroscopy
Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물이 성공적으로 합성되었는지 알아보기 위하여, 제조된 생성물, 반응물, 반응 중간체를 FT-IR 분광계(cary630, Agilent Technologies, Shanghai, China)로 측정하였다.In order to determine whether the Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex was successfully synthesized, the prepared products, reactants, and reaction intermediates were measured with an FT-IR spectrometer (cary630, Agilent Technologies, Shanghai, China).
구체적으로, 반응물인 RuCl3(2a)과 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘(3a)과 2,2':6',2"-터피리딘(5a), 반응 중간체인 Ru(dam-bpy)Cl4(4a), 및 생성물인 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl(1a)을 분말 형태로 기기에 올려 FT-IR 분석을 수행하였으며, 조건은 ATR(감쇄전반사법)을 이용하여 400cm-1~4000cm- 1 의 파수 범위에서 측정하였다.Specifically, the reactants RuCl 3 ( 2a ) and 4,4'-diamino-2,2'-bipyridine ( 3a ) and 2,2':6',2"-terpyridine ( 5a ), the reaction intermediate Ru(dam-bpy)Cl 4 ( 4a ), and the product, Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl( 1a ), were put on the instrument in powder form to perform FT-IR analysis, and the conditions were ATR (attenuation). using the overall judicial) 400cm -1 ~ 4000cm - was measured at a wave number range in Fig.
그 결과를 도 1에 나타내었다.The results are shown in FIG. 1 .
도 1은 상기 제조예 1에서 사용된 반응물, 반응 중간체 및 합성된 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다. 1 shows the FT-IR spectrum of the reactant, the reaction intermediate, and the synthesized Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex used in Preparation Example 1. FIG.
도 1에 나타낸 바와 같이, 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘은 3400cm-1에서 아민기의 N-H 단일결합 신축(Stretching) 피크, 3200cm-1과 3100cm-1에서 방향족 고리의 sp2 C-H 신축 피크가 위치에 따라 전자밀도가 달라져 Splitting이 되어 여러 피크로 나뉘어졌다.1, the 4,4'-diamino-2,2'-bipyridine has an aromatic ring in the amine group NH single bond stretching (Stretching) peak, 3200cm -1 and 3100cm -1 of at 3400cm -1 The sp 2 CH stretching peak was split into several peaks due to different electron density depending on the position.
Ru(dam-bpy)Cl4는 중심금속인 Ru와 배위결합하여 리간드의 전자밀도가 낮아져 더 낮은 파수로 이동할 것이라 예상한 대로, 전체적으로 낮은 파수로 피크가 이동한 것을 확인하였다. 다만, 원하는 단량체 합성물 뿐 아니라 생성물간의 상호작용에 의하여 복잡하고 broad한 피크로 확인되었다.As expected that Ru(dam-bpy)Cl 4 would move to a lower wavenumber due to a lowering of the electron density of the ligand by coordinating with the central metal Ru, it was confirmed that the peak shifted to a lower wavenumber overall. However, it was confirmed as a complex and broad peak by the interaction between the desired monomer composition as well as the product.
2,2':6',2"-터피리딘은 3010cm-1에서 방향족 고리의 sp2 C-H 신축진동 피크를 확인하였다.2,2':6',2"-terpyridine was confirmed at 3010cm -1 sp 2 CH stretching vibration peak of the aromatic ring.
본 발명에 따라 제조된 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl은 3301.8 cm-1, 3170.2 cm-1, 3054.6 cm-1에서 방향족 고리의 sp2 C-H 신축진동 피크를 확인하였고, 2359.4 cm-1에서 루테늄 피크를 나타냄을 확인함으로써, 루테늄과 방향족 리간드가 배위 결합을 성공적으로 형성한 것을 확인하였다.Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl prepared according to the present invention confirmed the sp 2 CH stretching vibration peak of the aromatic ring at 3301.8 cm -1 , 3170.2 cm -1 , 3054.6 cm -1 , 2359.4 cm − By confirming that the ruthenium peak in 1 was confirmed, it was confirmed that the ruthenium and the aromatic ligand successfully formed a coordination bond.
(2) UV-(2) UV- VISVIS 분광법 spectroscopy
또한, 합성된 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물의 결합 형태를 알아보기 위하여, UV-VIS 분광법(Model 8454, Agilent Technologies, Shanghai, China)을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.In addition, in order to examine the binding form of the synthesized Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex, UV-VIS spectroscopy (Model 8454, Agilent Technologies, Shanghai, China) was performed and the results are shown in FIG. 2 . It was.
도 2는 상기 제조예에서 합성된 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물과, 비교를 위한 반응물인 RuCl3와 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘과 2,2':6',2"-터피리딘, 반응 중간체인 Ru(dam-bpy)Cl4의 UV-VIS 스펙트럼을 나타낸다.2 shows the Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex synthesized in Preparation Example, and RuCl 3 and 4,4'-diamino-2,2'-bipyridine and 2, which are reactants for comparison; 2':6',2"-terpyridine, shows the UV-VIS spectrum of the reaction intermediate Ru(dam-bpy)Cl 4 .
도 2에 나타낸 바와 같이, RuCl3와 4,4'-디아미노-2,2'-바이피리딘의 200nm-300nm범위에서 확인되는 피크는 크게 전자밀도의 변화에 의해 각각 블루, 레드 Shift가 일어나 Ru(dam-bpy)Cl4 화합물의 피크가 확인되었다. 이후, 추가적인 2,2':6',2"-터피리딘과의 반응을 통해 Ru(dam-bpy)Cl4 피크는 전자밀도의 변화에 의해 다양한 Shift가 일어나 최종적으로 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 화합물의 피크는 복잡한 피크로 확인되었다. 이로부터 최종적인 화합물이 생성되었음을 확인하였다.As shown in Figure 2, the peaks identified in the 200nm-300nm range of RuCl 3 and 4,4'-diamino-2,2'-bipyridine are largely blue and red shifts caused by changes in electron density, respectively, so that Ru (dam-bpy)Cl 4 The peak of the compound was confirmed. Thereafter, through a reaction with additional 2,2':6',2"-terpyridine, the Ru(dam-bpy)Cl 4 peak undergoes various shifts due to the change in electron density and finally Ru(dam-bpy) ( The peak of the ter-py)Cl compound was confirmed as a complex peak, which confirmed that the final compound was formed.
(3) (3) 순환전압전류법Cyclic voltammetry (Cyclic (Cyclic voltammetryvoltammetry ))
Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물이 성공적으로 합성되었는지 알아보기 위하여, 제조된 생성물, 반응물, 반응 중간체를 순환전압전류법(Cyclic voltammetry)으로 측정하였다.In order to determine whether the Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex was successfully synthesized, the prepared products, reactants, and reaction intermediates were measured by cyclic voltammetry.
작업 전극(Working electrode)은 스크린 프린팅 탄소전극 (screen printed carbon electrodes, SPCEs)을 사용하였고, 상대 전극(Counter electrode)은 백금선(Platinum, wire, 0.5 mm diam, 99.99 % metals basis) (Aldrich Chem. Co.)을 사용하였다. 기준 전극(Reference electrode)은 Ag/AgCl 전극(ESA, EE009)을 사용하였다.As the working electrode, screen printed carbon electrodes (SPCEs) were used, and the counter electrode was platinum wire (Platinum, wire, 0.5 mm diam, 99.99 % metals basis) (Aldrich Chem. Co) .) was used. As a reference electrode, an Ag/AgCl electrode (ESA, EE009) was used.
구체적으로, 상기 제조예 1에서 합성된 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물과, 비교를 위한 반응물인 RuCl3와 반응 중간체인 Ru(dam-bpy)Cl4 20μl를 각각 PBS 20μl에 섞어 CH instruments(미국, 텍사스) 회사의 model 660B Electrochemical Workstation 장치 상의 스크린 프린팅 탄소전극 위에 놓고 전압의 변화에 대한 전류 밀도를 측정하였다.Specifically, 20 μl of the Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex synthesized in Preparation Example 1, RuCl 3 as a reactant for comparison, and Ru(dam-bpy)Cl 4 as a reaction intermediate, respectively, were added to 20 μl of PBS. The mixture was placed on a screen-printed carbon electrode on a model 660B Electrochemical Workstation device from CH instruments (Texas, USA), and the current density was measured with respect to the change in voltage.
측정 조건은 Scan range :-1.0V~1.2V, Scan rate : 0.1V/s, 감도 : 1.e- 4 이었다.Measurement conditions were: Scan range: -1.0V~1.2V, Scan rate: 0.1V/s, and Sensitivity: 1.e - 4 .
측정 결과를 도 3에 나타내었다.The measurement results are shown in FIG. 3 .
도 3에 나타낸 바와 같이, 최종 합성된 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 화합물이 단일피크를 보임으로써 순수한 화합물이 합성되어진 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 3 , it can be seen that a pure compound was synthesized by showing a single peak of the finally synthesized Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl compound.
<< 제조예manufacturing example 2> 본 발명에 따른 루테늄 2> Ruthenium according to the present invention 착물을complex 이용한 바이오센서의 제조 Manufacturing of biosensors using
상기 제조예 1에 따라 제조된 1.0 mg의 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물을 1㎖의 0.1M 인산염 완충용액(PBS)(pH 7.4)에 용해시킨 용액 1.0㎕를 스크린 프린트 탄소 전극(SPCE)의 작동전극 상부에 떨어뜨린 후 상온에서 30초 동안 건조한다. 상기 건조된 전극 위에 FAD-GDH(FAD-glucose dehydrogenase)를 증류수에 용해시킨 4.0㎎/㎖ 용액 1.0㎕를 떨어뜨린 후 상온에서 30초 동안 건조시킨다. 이 위에 폴리(에틸렌글리콜)디글리시딜 에테르(PEGDGE) 용액 1.0㎕을 떨어뜨려 상기 루테늄 착물과 FAD-GDH의 보호층을 형성하여 바이오센서를 제작하였다. 상기 바이오센서의 전극은 작동전극, 보조전극 및 기준전극으로 구성된 스크린 프린트 전극을 사용했으며, 작동전극과 보조전극은 탄소 잉크를 사용했으며, 기준전극은 실버잉크를 사용하여 제작하였다.1.0 μl of a solution in which 1.0 mg of Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex prepared according to Preparation Example 1 was dissolved in 1 ml of 0.1M phosphate buffer (PBS) (pH 7.4) was added to the screen-printed carbon After dropping it on the working electrode of the electrode (SPCE), it is dried at room temperature for 30 seconds. After dropping 1.0 μl of a 4.0 mg/ml solution of FAD-GDH (FAD-glucose dehydrogenase) in distilled water on the dried electrode, it was dried at room temperature for 30 seconds. A biosensor was manufactured by dropping 1.0 μl of a poly(ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDGE) solution on this to form a protective layer of the ruthenium complex and FAD-GDH. As the electrode of the biosensor, a screen print electrode composed of a working electrode, an auxiliary electrode, and a reference electrode was used, carbon ink was used for the working electrode and the auxiliary electrode, and the reference electrode was manufactured using silver ink.
<< 비교예comparative example 1> 종래 전자전달 매개체로 사용되는 루테늄 1> Ruthenium used as a conventional electron transport medium 착물을complex 이용한 바이오센서의 제조 Manufacturing of biosensors using
상기 제조예 2에서 상기 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물 대신에 종래 전자전달 매개체로 사용되는 루테늄 착물인 Ru(NH3)6을 1.0㎕를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 바이오센서를 제작하였다.In Preparation Example 2, in place of the Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex, Ru(NH 3 ) 6 , which is a ruthenium complex used as a conventional electron transport medium, was used in 1.0 μl, except that 1.0 μl was used. A biosensor was fabricated in the same manner as in 2.
<< 실험예Experimental example 1> 본 발명에 따른 신규 루테늄 1> Novel ruthenium according to the present invention 착물을complex 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 산화 촉매 전류의 측정 Measurement of oxidation catalyst current of biosensor used as electron transport medium
상기 제조예 2에서 제조된 신규 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서에 글루코스 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 mM을 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 용액을 처리하여, 글루코스 산화 촉매 전류를 순환전압전류법에 의해 전위 범위 0.2V ~ 0.8V, 주사 속도 0.01 V/s에서 측정하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.A biosensor using the novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 2 as an electron transport medium was treated with a solution in which 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 mM of glucose was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4). Thus, the glucose oxidation catalyst current was measured by cyclic voltammetry in a potential range of 0.2 V to 0.8 V and a scanning rate of 0.01 V/s, and the results are shown in FIG. 4 .
도 4는 본 발명의 제조예 2에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선(삽도) 및 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.4 is a graph showing a cyclic voltammetry curve (inset) and a glucose oxidation catalyst current according to a glucose concentration of a biosensor including a novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 2 of the present invention.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서는 글루코스의 농도가 0.1 mM에서 10 mM으로 증가함에 따라 순환전압전류 또한 증가하는 것으로 나타났으며, 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 이때 선형도는 R2=0.95317로 나타났다.As shown in FIG. 4 , the biosensor including the novel ruthenium complex of the present invention also showed an increase in cyclic voltammetry as the concentration of glucose increased from 0.1 mM to 10 mM, and the glucose oxidation catalytic current was linear. appeared to increase. At this time, the linearity was R 2 =0.95317.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 GDH 효소와 좋은 반응성을 나타냄을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the novel ruthenium complex of
또한, 상기 순환전압전류법에서 산화환원반응이 일어나는 0.6V에 대하여 글루코스의 농도에 따른 시간-전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 측정하여 도 5에 나타내었다.In addition, the time-current curve according to the concentration of glucose and the glucose oxidation catalyst current were measured for 0.6 V at which the redox reaction occurs in the cyclic voltammetry, and are shown in FIG. 5 .
도 5는 제조예 2에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 시간-전류 곡선(삽도) 및 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.5 is a graph showing a time-current curve (inset) and a glucose oxidation catalyst current according to a glucose concentration of a biosensor including a novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 2. FIG.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서는 글루코스의 농도가 0.1 mM에서 10 mM으로 증가함에 따라 전류밀도가 증가함으로써 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 이때 선형도는 R2=0.94492로 나타났다.As shown in FIG. 5 , in the biosensor including the novel ruthenium complex of the present invention, as the concentration of glucose increased from 0.1 mM to 10 mM, the current density increased, so that the glucose oxidation catalytic current was linearly increased. At this time, the linearity was R 2 =0.94492.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 GDH 효소와 좋은 반응성을 나타내므로, 이를 통해 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 전자전달매개체로 포함하는 글루코스 탈수소화효소 기반의 바이오센서 제작이 가능하다.Therefore, since the novel ruthenium complex of
상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 전자전달매개체로 포함하는 바이오센서는 글루코스 탈수소화효소를 기반으로 하므로 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 장점이 있어, 이를 적용한 산화환원 반응시약, 및 전기화학적 바이오센서는 신호 내 산소 분압에 따른 측정오차가 최소화되며, 장기간 안정적으로 사용 가능한 장점이 있다.The biosensor including the novel ruthenium complex of
<< 실험예Experimental example 2> 본 발명에 따른 신규 루테늄 2> Novel ruthenium according to the present invention 착물complex 또는 종래 루테늄 or conventional ruthenium 착물을complex 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 산화 촉매 전류의 비교 Comparison of oxidation catalyst current of biosensor used as electron transport medium
상기 제조예 2에서 제조된 신규 루테늄 착물 또는 비교예 2에서 제조된 종래 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서에 글루코스 30 mM을 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 용액을 처리하여, 글루코스 산화 촉매 전류를 순환전압전류법에 의해 전위 범위 0.2V ~ 0.8V, 주사 속도 100 mV/s에서 측정하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.The biosensor using the novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 2 or the conventional ruthenium complex prepared in Comparative Example 2 as an electron transport medium was treated with a solution in which 30 mM glucose was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4), The glucose oxidation catalyst current was measured by cyclic voltammetry in a potential range of 0.2 V to 0.8 V and a scanning rate of 100 mV/s, and the results are shown in FIG. 6 .
도 6(a)는 종래 전자전달 매개체로 사용하는 루테늄 착물인 Ru(NH3)6을 사용한 바이오센서의 순환전압전류 곡선이고, 도 6(b)는 본 발명의 제조예 1에 따라 제조된 신규 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 순환전압전류 곡선이다. 6(a) is a cyclic voltammetry curve of a biosensor using Ru(NH 3 ) 6 , which is a ruthenium complex used as a conventional electron transport medium, and FIG. 6(b) is a novel manufactured according to Preparation Example 1 of the present invention. Cyclic voltammetry curve of a biosensor using a ruthenium complex as an electron transport medium.
도 6(a)에 나타낸 바와 같이, 종래 전자전달 매개체로서 사용하는 Ru(NH3)6을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 글루코스의 유무에 대한 산화전류의 변화가 현저하게 나타나지 않았다. 구체적으로, 도 6의 Ru(NH3)6을 사용한 경우, 글루코스가 없을 때와(0 mM) 있을때(20 mM) 전류의 증가가 일어나지 않는 것을 보아 전자전달 매개체와 효소 그리고 전극에서의 전자전달 반응이 원활하게 일어나지 않는다는 것을 볼 수 있다.As shown in FIG. 6(a), the electrode in which Ru(NH 3 ) 6 used as a conventional electron transfer mediator was adsorbed together with a glucose dehydrogenase did not show a significant change in the oxidation current in the presence or absence of glucose. Specifically, in the case of using Ru(NH 3 ) 6 of FIG. 6 , it was observed that the increase in current did not occur in the absence (0 mM) and in the presence (20 mM) of glucose, so the electron transfer reaction in the electron transfer mediator, the enzyme, and the electrode It can be seen that this does not happen smoothly.
그러나, 도 6(b)에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 글루코스의 유무에 큰 반응성을 나타내었다. 구체적으로 도 6(b)에서, 본 발명에 따른 Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl 착물을 사용한 경우, 글루코스가 없을 때(0 mM)에는 전류가 거의 흐르지 않으나, 글루코스를 첨가하면(20 mM) 전류가 급격하게 증가하는 것을 보여, 글루코스, 효소, 신규 루테늄 착물, 그리고 전극간의 전자전달 반응이 원활히 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물은 글루코스 탈수소화효소(GDH)에 대하여 전자전달 매개체로서 유용하게 사용될 수 있다.However, as shown in FIG. 6(b), the electrode to which the novel ruthenium complex according to the present invention was adsorbed together with a glucose dehydrogenase exhibited great reactivity in the presence or absence of glucose. Specifically, in FIG. 6(b), when the Ru(dam-bpy)(ter-py)Cl complex according to the present invention is used, little current flows in the absence of glucose (0 mM), but when glucose is added ( 20 mM) shows a sharp increase in current, indicating that the electron transfer reaction between glucose, enzyme, novel ruthenium complex, and electrodes is smoothly performed. Therefore, the novel ruthenium complex according to the present invention can be usefully used as an electron transport mediator for glucose dehydrogenase (GDH).
<< 실험예Experimental example 3> 방해요소가 포함된 시료 내에서 3> in the sample containing the disturbing element 글루코스의of glucose 선택성 평가 Selectivity evaluation
일반적으로, 혈당 센서에서 측정하고자 하는 시료인 혈액 내에는 글루코스 이외에 방해요소로서 요산, 아스코르브산, 도파민 등이 함께 포함되어 있으므로, 바이오센서는 방해요소 가운데에서 선택적으로 글루코스만을 검출할 수 있어야 한다.In general, since uric acid, ascorbic acid, dopamine, etc. are included as interfering factors in addition to glucose in blood, which is a sample to be measured by the blood glucose sensor, the biosensor should be able to selectively detect only glucose among the interfering factors.
이에, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물이 글루코스 선택성을 나타내는지 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.Accordingly, the following experiment was performed to determine whether the novel ruthenium complex according to the present invention exhibits glucose selectivity.
상기 실시예 2에 따라 제조된 바이오센서에 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 글루코스 5 mM와 방해요소로서 요산 0.1 mM, 아스코르브산 0.1 mM 및 도파민 0.1mM을 용해시킨 용액을 처리한 후, 글루코스가 산화환원반응이 일어나는 0.6V에서 5초 동안 글루코스 산화 촉매 전류를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.The biosensor prepared according to Example 2 was treated with a solution in which 5 mM glucose and 0.1 mM uric acid, 0.1 mM ascorbic acid, and 0.1 mM dopamine were dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) as interfering factors, and then glucose The glucose oxidation catalyst current was measured for 5 seconds at 0.6 V where the redox reaction took place, and the results are shown in FIG. 7 .
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따른 다양한 방해요소들과의 혼합물에서 신규 루테늄 착물의 글루코스의 선택적 감응도를 나타내는 그래프이다.7 is a graph showing the selective sensitivity to glucose of a novel ruthenium complex in a mixture with various interfering factors according to an experimental example of the present invention.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 요산(UA), 도파민(DA), 아스코르브산(AA)에는 거의 감응하지 않았으나, 글루코스에만 높은 감응도를 나타냄으로써, 글루코스에만 선택적으로 감응하는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 7 , the electrode in which the novel ruthenium complex according to the present invention was adsorbed together with glucose dehydrogenase did not respond to uric acid (UA), dopamine (DA), and ascorbic acid (AA), but high sensitivity only to glucose By showing the, it can be seen that it is selectively sensitive only to glucose.
따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 전자전달매개체로 포함하는 바이오센서는 대표적인 방해요소들인 요산, 도파민, 아스코르브산의 영향 없이 글루코스만을 선택적으로 감응함으로써, 혈당 센서로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the biosensor comprising the novel ruthenium complex of
<< 실험예Experimental example 4> 용해도 실험 4> Solubility test
일반적으로, 전자전달매개체를 센서에 적용하기 위해서는 용매에 용해시킨 용액 상태로 사용하기 때문에 전자전달매개체는 용매 특히 물에 대한 용해도가 높은 것이 바람직하다. 이에, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물의 용해도를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.In general, in order to apply the electron transport medium to the sensor, it is preferable that the electron transport medium has high solubility in a solvent, particularly water, because it is used in a solution state dissolved in a solvent. Accordingly, the following experiment was performed to investigate the solubility of the novel ruthenium complex of
제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 물이 담긴 시험관에 넣고 뚜껑을 닫은 후, 원심분리기를 이용하여 원심분리를 수행한 후, 침전물의 여부를 관찰하여 도 8에 나타내었다.After putting the novel ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 into a test tube containing water and closing the lid, centrifugation was performed using a centrifuge, and the presence of a precipitate was observed and shown in FIG. 8 .
도 8에 나타낸 바와 같이, 원심분리 후에도 침전물이 발생하지 않음을 확인하였다. 이로부터, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 그 자체로도 물에 용해되므로 혈당 센서를 포함하는 바이오센서에 용이하게 적용될 수 있다.As shown in FIG. 8 , it was confirmed that no precipitate was generated even after centrifugation. From this, since the novel ruthenium complex of
이상 본 발명을 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위 내에서 상기 실시예를 다양하게 변형 및 수정할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다.Although the present invention has been described above with reference to the preferred embodiment, it should be understood that the present invention is not limited to the above embodiment. The present invention can variously change and modify the above embodiments within the scope of the claims described below, all of which fall within the scope of the present invention. Accordingly, the invention is limited only by the claims and their equivalents.
1: 하판
2: 보조전극
3: 작동전극
4: 확인전극
5: 절연판
6: 산화환원반응 시약조성물
7: 끼움판
8: 상판
9: 통기부1: lower plate
2: auxiliary electrode
3: working electrode
4: Confirmation electrode
5: Insulation plate
6: Redox reaction reagent composition
7: Fitting plate
8: top plate
9: Ventilation
Claims (16)
하기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 가지고, 상기 산화환원효소에 전자를 전달하기 위한 전자전달 매개체;를 포함하고,
상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH)이고,
상기 전자전달 매개체의 산화환원전위는 0.3~0.6V인 것을 특징으로 하는 산화환원반응용 시약조성물.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서, R1 내지 R3은 독립적으로 수소원자이고, X는 할로겐 원소이다)oxidoreductase; and
It has a ruthenium complex represented by the following formula (1) or a salt compound thereof, and an electron transfer mediator for transferring electrons to the oxidoreductase;
The oxidoreductase is flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH),
The redox reagent composition for the redox reaction, characterized in that the redox potential of the electron transport mediator is 0.3 ~ 0.6V.
[Formula 1]
(In Formula 1, R 1 to R 3 are independently a hydrogen atom, and X is a halogen atom)
상기 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부 함유하는 것을 특징으로 하는, 산화환원반응용 시약조성물.9. The method of claim 8,
The reagent composition for a redox reaction, characterized in that it contains 20 to 700 parts by weight of the ruthenium complex of Formula 1 based on 100 parts by weight of the oxidoreductase.
상기 산화환원반응용 시약조성물은 산화환원효소 및 전자전달 매개체로서 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 하기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하고,
상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH)이고,
상기 전자전달 매개체의 산화환원전위는 0.3~0.6V인 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.
[화학식 1]
(상기 화학식 1에서, R1 내지 R3은 독립적으로 수소원자이고, X는 할로겐 원소이다)It is manufactured by applying and fixing a reagent composition for redox reaction on a substrate equipped with at least two or more electrodes,
The reagent composition for the redox reaction comprises a ruthenium complex represented by the following formula (1) or a salt compound thereof that can redox an analyte contained in a liquid biological sample as an oxidoreductase and an electron transfer mediator,
The oxidoreductase is flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH),
The electrochemical biosensor, characterized in that the redox potential of the electron transport medium is 0.3 ~ 0.6V.
[Formula 1]
(In Formula 1, R 1 to R 3 are independently a hydrogen atom, and X is a halogen atom)
상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 상기 기판상에 구비되고, 상기 작동전극 위에 상기 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 평면형 바이오센서인 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서.14. The method of claim 13,
The biosensor is an electrochemical biosensor, wherein a working electrode, an auxiliary electrode, and a confirmation electrode are provided on the substrate, and the redox reagent composition is coated on the working electrode.
상기 생체시료는 혈액인 전기화학적 바이오센서.14. The method of claim 13,
The biological sample is an electrochemical biosensor that is blood.
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