KR102085709B1 - Redox reagent composition and biosensor comprising novel ruthenium-based electron transfer mediator - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈중 글루코스 농도를 측정하는 혈당 센서 및 바이오센서 등에서 전자전달 매개체로 사용할 수 있는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물에 관한 것으로, 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물은 글루코스 탈수소화효소와 반응성이 높아, 바이오센서의 전자전달 매개체로서 전자를 효소 및 전극 사이에서 신속하고 원활하게 교환할 수 있으므로, 글루코스 탈수소화효소를 기반으로 하는 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel ruthenium complex or a salt compound thereof that can be used as an electron transport medium in blood glucose sensors and biosensors for measuring blood glucose concentration, wherein the new ruthenium complex or salt compound thereof has high reactivity with glucose dehydrogenase , As an electron transport medium of the biosensor, electrons can be quickly and smoothly exchanged between the enzyme and the electrode, and thus can be usefully used for a biosensor based on glucose dehydrogenase.

Description

신규 루테늄계 전자전달 매개체를 포함하는 산화환원반응용 시약조성물 및 바이오센서{Redox reagent composition and biosensor comprising novel ruthenium-based electron transfer mediator}Redox reagent composition and biosensor comprising novel ruthenium-based electron transfer mediator}

본 발명은 바이오센서용 전자전달 매개체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규 루테늄계 전자전달 매개체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 산화환원반응용 시약조성물 및 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to an electron transport medium for a biosensor, and more particularly to a novel ruthenium-based electron transport medium, a method for manufacturing the same, a reagent composition for a redox reaction and a biosensor comprising the same.

전기화학적 바이오센서는 통상적으로 환경, 생물, 의학 등의 분야에 걸쳐 다양한 분석 대상을 검출하는 장치를 말하는 것으로, 대표적으로 글루코스, 콜레스테롤, 아미노산 등의 분석물을 사람의 체액으로부터 검출하는 바이오센서가 존재한다.The electrochemical biosensor is a device that detects various analysis targets across fields such as environment, biology, and medicine, and typically there is a biosensor that detects analytes such as glucose, cholesterol, and amino acids from human body fluids. do.

현재, 상용화된 전기화학적 바이오센서는 전기적 신호를 변환할 수 있는 전극 위에 글루코스 산화 효소를 화학적 또는 물리적 방법으로 고정시킨 구조를 가진다. 이러한 전기화학적 바이오센서는 분석물 내의 글루코스가 효소에 의해 산화되어 발생하는 전자를 전극에 전달하여 생성되는 전류를 측정함으로써 분석물 내의 글루코스 농도를 측정하는 원리에 의한 것이다.Currently, commercialized electrochemical biosensors have a structure in which glucose oxidase is immobilized on an electrode capable of converting electrical signals by chemical or physical methods. The electrochemical biosensor is based on the principle of measuring the concentration of glucose in the analyte by measuring the current generated by transferring electrons generated by oxidation of glucose in the analyte by an enzyme to the electrode.

그러나, 효소 전극을 이용하는 바이오센서의 경우, 효소의 활성 중심과의 거리가 너무 멀기 때문에 기질이 산화되어 발생되는 전자를 직접적으로 전극에 전달하는 것이 용이하지 않은 문제가 발생한다. 따라서 이러한 전자전달 반응을 용이하게 수행하기 위하여 산화/환원 매개체, 즉 전자전달 매개체가 필수적으로 요구된다.However, in the case of a biosensor using an enzyme electrode, since the distance from the active center of the enzyme is too far, a problem arises in that it is not easy to directly transfer electrons generated by oxidation of the substrate to the electrode. Therefore, an oxidation / reduction mediator, that is, an electron transfer mediator, is required in order to facilitate the electron transfer reaction.

종래 대표적으로 사용되는 전자전달 매개체로는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논 유도체, 오스뮴 고분자, 포타슘페리시아나이드 등이 있다. 이 중 상용화 된 바이오센서에 적용되는 대표적 전자전달매개체인 페리시아나이드는 음이온으로, Fe3 +를 중심으로 6개의 시아나이드리간드(cyanide ligands)가 8면체 구조로 결합되어 있으며, [Fe(CN)6]4-으로 쉽게 환원되며 산화/환원이 가역적이다. 이러한 특성으로 인해 페리시아나이드는 전기화학에서 대표적인 전자전달 물질로 바이오센서의 전자전달매개체로서 주로 사용되어 왔다. 그러나, 페리시아나이드는 전극 표면에 강하게 흡착되지 못하고 용액에 노출되는 경우 용액상으로 탈기가 일어나는 경향이 있으며, 이러한 경향으로 인하여 효소와 반응하기에 충분한 양의 전자전달매개체가 감소하여 글루코스 측정 감도가 저하되고 이에 따라 정확한 글루코스 측정이 어렵게 되는 문제점이 있었다(R. Wilson et al., biosens.Bioelectron. 1992, 7, 165-185).Examples of electron transfer mediators conventionally used include ferrocene, ferrocene derivatives, quinone derivatives, osmium polymers, and potassium ferricyanide. The biosensor typically an electron transfer mediator is ferricyanide to be applied to is an anion, is coupled with 6 cyanide ligands (cyanide ligands) is octahedral structure around the Fe 3 +, [Fe (CN ) commercialization of 6 ] It is easily reduced to 4- , and oxidation / reduction is reversible. Due to these properties, ferricyanide has been mainly used as an electron transport medium for biosensors as a representative electron transport material in electrochemistry. However, ferricyanide is not strongly adsorbed on the electrode surface, and when exposed to a solution, degassing tends to occur in the solution phase. Due to this tendency, a sufficient amount of an electron transport medium is reduced to react with an enzyme, thereby reducing glucose measurement sensitivity. There was a problem in that it was degraded and thus it was difficult to accurately measure glucose (R. Wilson et al., Biosens. Bioelectron. 1992, 7, 165-185).

또한, 대부분의 상용화된 전기화학적 센서에 사용되는 글루코스 산화환원효소인 FAD-GOX(flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase)는 열에 안정하고 글루코스만을 산화시키는 반응선택성은 탁월하지만, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 혈액에 녹아 있는 산소와 반응하여 과산화수소를 생성하기 때문에 FAD-GOX 효소를 사용하여 만든 센서는 시료 혈액의 종류(정맥혈, 동맥혈, 또는 모세혈)에 따라서 측정값이 크게 다를 수 있다.In addition, FAD-GOX (flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase), a glucose oxidase used in most commercially available electrochemical sensors, is heat-stable and has excellent reaction selectivity to oxidize glucose, but as shown in Reaction Scheme 1 below, Because it reacts with oxygen dissolved in the blood to generate hydrogen peroxide, the sensor made using the FAD-GOX enzyme can have a large difference in measurement value depending on the type of sample blood (intravenous blood, arterial blood, or capillary blood).

[반응식 1][Scheme 1]

Figure 112018061017592-pat00001
Figure 112018061017592-pat00001

채혈 혈당 센서의 개발 추이는 혈액(정맥혈, 모세혈 등)에 따라 달라지는 산소 분압(pO2) 차이에 따른 측정치 변화를 차단하기 위하여 혈액 내 글루코스와의 효소 반응에서 산소가 참여하는 GOX 대신에 효소반응에 산소가 배제된 GDH 사용으로 전환되고 있다.The development trend of the blood glucose sensor is an enzymatic reaction instead of GOX in which oxygen is involved in the enzymatic reaction with glucose in the blood in order to block the change in the measurement according to the difference in the oxygen partial pressure (pO 2 ) that varies depending on the blood (vein blood, capillary blood, etc.) Is being converted to the use of GDH, which is free of oxygen.

가장 보편적으로 사용되는 전자전달 매개체로는 포타슘페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]가 있으며, 가격이 저렴하고 반응성이 좋아서 FAD-GOX, PQQ-GDH 또는 FAD-GDH를 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나, 이 전자전달 매개체를 이용한 센서는 혈액에 존재하는 요산(uric acid)이나 겐티식산(gentisic acid)과 같은 방해 물질에 의한 측정오차가 발생하고, 온도와 습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 하며, 장시간 보관 후 바탕전류의 변화로 낮은 농도의 글루코스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다.The most commonly used electron transport medium is potassium ferricyanide [K 3 Fe (CN) 6 ], which is inexpensive and has good reactivity, making it useful for sensors using FAD-GOX, PQQ-GDH or FAD-GDH. Do. However, the sensor using this electron transport medium is produced and stored because measurement errors occur due to interfering substances such as uric acid or gentisic acid present in the blood, and it is easy to deteriorate due to temperature and humidity. Special attention should be paid to, and it is difficult to accurately detect low concentration of glucose due to a change in background current after long-term storage.

헥사아민루테늄클로라이드[Ru(NH3)6Cl3]는 페리시아나이드에 비하여 산화환원 안정성이 높아 이 전자전달 매개체를 사용한 바이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성이 높은 장점을 갖지만, FAD-GDH와 사용하기에는 전자전달 반응이 용이하지 않아 상업적으로 유용한 센서로 제작하기가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들 전자전달 매개체도 센서 스트립의 정확도가 산소 분압에 영향을 받는다는 문제점이 있다.Hexaamine ruthenium chloride [Ru (NH 3 ) 6 Cl 3 ] has higher oxidation-reduction stability than ferricyanide, so biosensors using this electron transport medium are easy to manufacture and store, and have little change in background current even after long-term storage for stability. Although it has this high advantage, it has a disadvantage in that it is difficult to manufacture it as a commercially useful sensor because the electron transfer reaction is not easy to use with FAD-GDH. In addition, these electron transport mediators also have a problem that the accuracy of the sensor strip is affected by the oxygen partial pressure.

따라서 산소에 의하여 영향을 받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적으며, 넓은 농도 범위의 측정이 가능하며, 대량생산에 적합한 산화환원반응용 시약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약을 제조하기 위한 기술의 개발이 요구되고 있다.Therefore, it is not affected by oxygen, has little change in performance due to temperature and humidity, has little change in performance even after long-term storage, can measure a wide range of concentrations, and is suitable for mass-production redox reaction reagents, More specifically, there is a need to develop a technique for preparing a reagent for an electrochemical biosensor.

1. 대한민국 등록특허공보 제10-0874630호1. Republic of Korea Registered Patent Publication No. 10-0874630 2. 대한민국 등록특허공보 제10-0854389호2. Republic of Korea Registered Patent Publication No. 10-0854389

본 발명의 제1 목적은 글루코스 탈수소화효소(Glucose dehydrogenase; GDH)와 반응하므로 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한, 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공하는 것이다.The first object of the present invention is glucose novel dehydrogenase (Glucose dehydrogenase; GDH), so there is no influence due to the partial pressure of oxygen, and the long-term redox form is stably maintained, excellent as an electron transport medium for electrochemical biosensors, new ruthenium It is to provide a complex or a salt compound thereof.

본 발명의 제2 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.A second object of the present invention is to provide a method for preparing the novel ruthenium complex or salt compound thereof.

본 발명의 제3 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 전자전달 매개체로서 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.A third object of the present invention is to provide a reagent composition for redox reaction comprising the novel ruthenium complex or a salt compound thereof as an electron transport medium.

본 발명의 제4 목적은 상기 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 전자전달 매개체로서 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.A fourth object of the present invention is to provide an electrochemical biosensor comprising the novel ruthenium complex or salt compound thereof as an electron transport medium.

상기 제1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공한다.In order to achieve the first object, the present invention provides a new ruthenium complex represented by Formula 1 below or a salt compound thereof.

[화학식 1][Formula 1]

Ru(A)mXn Ru (A) m X n

(상기 화학식 1에서, A는 하기 화학식 2의 치환기이고,(In Formula 1, A is a substituent of Formula 2,

[화학식 2][Formula 2]

Figure 112018061017592-pat00002
Figure 112018061017592-pat00002

R1 및 R2는 독립적으로, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 아민(-NH3), 할로겐, 카르복실산, 알코올(-OH) 및 시아나이드(-CN)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 straight or branched chain alkyl, C 1 -C 4 straight or branched alkoxy, amine (-NH 3 ), halogen, carboxylic acid, alcohol (-OH) and cyanide. (-CN) is selected from the group consisting of,

X는 할로겐 원소이고,X is a halogen element,

m은 1 또는 2이고, m is 1 or 2,

n은 2 또는 4의 정수이다).n is an integer of 2 or 4).

삭제delete

또한 바람직하게는, 상기 화학식 1의 루테늄 착물은 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물일 수 있다.Also preferably, the ruthenium complex of Formula 1 may be a compound of Formula 1a or Formula 1b.

[화학식 1a][Formula 1a]

Figure 112018061017592-pat00003
Figure 112018061017592-pat00003

[화학식 1b][Formula 1b]

Figure 112018061017592-pat00004
Figure 112018061017592-pat00004

(상기 화학식 1a 및 화학식 1b에 있어서, R1, R2 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)(In Formula 1a and Formula 1b, R 1 , R 2 and X are as defined in Formula 1.)

또한, 상기 제2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,In addition, in order to achieve the second object, the present invention, as shown in Scheme 2,

반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시키는 단계; 및Adding a compound of Formula 2 and a compound of Formula 3 to the reaction solvent and reacting; And

생성물을 침전시켜 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공한다.A method for preparing a new ruthenium complex of Formula 1 or a salt compound thereof is provided, which comprises the step of precipitating the product to obtain a compound of Formula 1a or Formula 1b.

[반응식 2][Scheme 2]

Figure 112018061017592-pat00005
Figure 112018061017592-pat00005

(상기 반응식 2에서, R1, R2, X 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, 화학식 1a 및 화학식 1b는 상기 화학식 1에 포함된다.)(In Reaction Scheme 2, R 1 , R 2 , X and n are as defined in Chemical Formula 1, and Chemical Formulas 1a and 1b are included in Chemical Formula 1.)

또한 바람직하게는, 상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세토니트릴 및 에틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.Also preferably, the reaction solvent may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile and ethylene glycol.

또한 바람직하게는, 상기 화학식 2의 화합물과 상기 화학식 3의 화합물의 반응은, 반응 용매로서 알코올 용매 또는 아세토니트릴을 사용할 경우 50~100℃에서 수행하며, 반응 용매로서 에틸렌글리콜을 사용할 경우에는 130~200℃에서 수행할 수 있다.Also, preferably, the reaction of the compound of Formula 2 and the compound of Formula 3 is performed at 50 to 100 ° C when using an alcohol solvent or acetonitrile as a reaction solvent, and 130 to when using ethylene glycol as a reaction solvent. It can be carried out at 200 ℃.

또한 바람직하게는, 생성물의 침전시 침전 용매는 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF) 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.Also preferably, the precipitation solvent upon precipitation of the product may be selected from the group consisting of diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF) and tetrahydrofuran (THF).

또한, 상기 제3 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화환원효소, 및 전자전달 매개체로서 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 제공한다.In addition, to achieve the third object, the present invention provides a reagent composition for an oxidation-reduction reaction comprising a redox enzyme and a ruthenium complex represented by Chemical Formula 1 as an electron transport medium or a salt compound thereof.

또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 탈수소화효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는Also preferably, the oxidoreductase is at least one oxidoreductase selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterase; or

탈수소화효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함할 수 있다.One or more oxidoreductases selected from the group consisting of dehydrogenase, oxidase, and esterification enzyme, and flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) , And pyrroloquinoline quinone (PQQ).

또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.In addition, preferably, the redox enzymes include glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, and cholesterol esterolase. Group consisting of esterase, lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, and bilirubin oxidase It may be one or more selected from.

또한 바람직하게는, 상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Also preferably, the redox enzyme is flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose) dehydrogenase).

또한 바람직하게는, 상기 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부 함유할 수 있다.Also preferably, the reagent composition may contain 20 to 700 parts by weight of the ruthenium complex of Formula 1 based on 100 parts by weight of the redox enzyme.

또한, 상기 제4 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서를 제공한다.In addition, in order to achieve the fourth object, the present invention is prepared by applying and fixing a reagent composition for an oxidation-reduction reaction capable of redoxing an analyte contained in a liquid biological sample on a substrate equipped with at least two electrodes. An electrochemical biosensor is provided.

또한 바람직하게는, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 평면형 바이오센서일 수 있다.In addition, preferably, the biosensor may be a planar biosensor having a working electrode, an auxiliary electrode, and an identification electrode on one plane, and coated with a redox reagent composition on the electrode.

또한 바람직하게는, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 대면형 바이오센서일 수 있다.In addition, preferably, the biosensor may be a face-to-face biosensor having a working electrode and an auxiliary electrode facing each other on a different plane, and coated with a redox reagent composition on the working electrode.

또한 바람직하게는, 상기 생체시료는 혈액일 수 있다.Also preferably, the biological sample may be blood.

본 발명에 따른 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물은 산화환원효소, 특히 글루코스 탈수소화효소와의 반응속도가 빨라서 혈액 내 글루코스 검출 성능이 향상되고, 혈액 내 산소 및 방해 물질의 영향을 거의 받지 않아, 글루코스 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다.The novel ruthenium complex or salt compound thereof according to the present invention has a fast reaction rate with an oxidoreductase, particularly glucose dehydrogenase, thereby improving glucose detection performance in the blood, and is hardly affected by oxygen and interfering substances in the blood. It is useful for the production of biosensors for detection.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학적 바이오센서의 분해사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 1H NMR 스펙트럼이다((a) dmo-bpy 리간드의 1H NMR, (b) 신규 루테늄 착물의 1H NMR).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 UV-vis 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물의 구조 화합물 분석을 위한 XPS 스펙트럼이다((a) 반응물과 생성물의 N 결합에너지 그래프, (b) 반응물과 생성물의 Ru 결합에너지 그래프).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 반응물(RuCl3)에 대한 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 6은 종래의 Ru(NH3)6과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 감응도를 평가하는 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 감응도를 평가하는 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 농도에 따른 순환전압전류 곡선을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신규 루테늄 착물과 글루코스 탈수소화효소를 포함하는 바이오센서의 글루코스 농도에 따른 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.1 is an exploded perspective view of an electrochemical biosensor according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a 1 H NMR spectrum for the structural compound analysis of a new ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention ((a) 1 H NMR of the dmo-bpy ligand, (b) 1 H NMR of the new ruthenium complex ).
3 is a UV-vis spectrum for the structural compound analysis of a new ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention.
4 is an XPS spectrum for analyzing a structural compound of a novel ruthenium complex prepared according to an embodiment of the present invention ((a) N binding energy graph of reactant and product, (b) Ru binding energy graph of reactant and product) .
5 shows a cyclic current curve for a new ruthenium complex and a reactant (RuCl 3 ) prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 shows a cyclic voltage current curve for evaluating the glucose sensitivity of a conventional biosensor containing Ru (NH 3 ) 6 and glucose dehydrogenase.
7 shows a circulating voltage current curve for evaluating glucose sensitivity of a biosensor comprising a new ruthenium complex and glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention.
8 shows a circulating voltage current curve according to the glucose concentration of a biosensor comprising a new ruthenium complex and glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention.
9 is a graph showing the glucose oxidation catalyst current according to the glucose concentration of a biosensor comprising a new ruthenium complex and glucose dehydrogenase prepared according to an embodiment of the present invention.

이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명에 의한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명이 여러 가지 수정 및 변형을 허용하면서도, 그 특정 실시예들이 도면들로 예시되어 나타내어지며, 이하에서 상세히 설명될 것이다. 그러나 본 발명을 개시된 특별한 형태로 한정하려는 의도는 아니며, 오히려 본 발명은 청구항들에 의해 정의된 본 발명의 사상과 합치되는 모든 수정, 균등 및 대용을 포함한다.While the invention allows for various modifications and variations, specific embodiments thereof are illustrated and illustrated in the drawings, which will be described in detail below. However, it is not intended to limit the invention to the specific forms disclosed, but rather the invention includes all modifications, equivalents, and substitutes consistent with the spirit of the invention as defined by the claims.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 제공한다.The present invention provides a new ruthenium complex represented by Formula 1 below or a salt compound thereof.

[화학식 1][Formula 1]

Ru(A)mXn Ru (A) m X n

(상기 화학식 1에서, A는 하기 화학식 2의 치환기이고,(In Formula 1, A is a substituent of Formula 2,

[화학식 2][Formula 2]

Figure 112018061017592-pat00006
Figure 112018061017592-pat00006

R1 및 R2는 독립적으로, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 아민(-NH3), 할로겐, 카르복실산, 알코올(-OH) 및 시아나이드(-CN)으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 straight or branched chain alkyl, C 1 -C 4 straight or branched alkoxy, amine (-NH 3 ), halogen, carboxylic acid, alcohol (-OH) and cyanide. (-CN) is selected from the group consisting of,

X는 할로겐 원소이고,X is a halogen element,

m은 1 또는 2이고, m is 1 or 2,

n은 2 또는 4의 정수이다.)n is an integer of 2 or 4.)

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바람직하게는, 상기 화학식 1의 루테늄 착물은 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물일 수 있다.Preferably, the ruthenium complex of Formula 1 may be a compound of Formula 1a or Formula 1b.

[화학식 1a][Formula 1a]

Figure 112018061017592-pat00007
Figure 112018061017592-pat00007

[화학식 1b][Formula 1b]

Figure 112018061017592-pat00008
Figure 112018061017592-pat00008

(상기 화학식 1a 및 화학식 1b에 있어서, R1, R2 및 X는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)(In Formula 1a and Formula 1b, R 1 , R 2 and X are as defined in Formula 1.)

본 발명에 따른 루테늄 착물은 염형태일 수 있으며, 염화합물이 높은 용해도를 가지므로 더욱 바람직하다. 상기 염화합물은 Li염, Na염, K염, Rb염, Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있다.The ruthenium complex according to the present invention may be in the form of a salt, and is more preferable because the salt compound has a high solubility. The salt compound may be a salt compound of at least one alkali metal selected from the group consisting of Li salt, Na salt, K salt, Rb salt, Cs salt and Fr salt.

나아가, 본 발명에 따른 루테늄 착물은 이의 염화합물 뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체 등을 모두 포함한다.Furthermore, the ruthenium complex according to the present invention includes not only salt compounds thereof, but also possible solvates, hydrates, isomers and the like that can be prepared therefrom.

또한, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,In addition, the present invention, as shown in Scheme 2 below,

반응 용매에 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 넣고 반응시키는 단계; 및Adding a compound of Formula 2 and a compound of Formula 3 to the reaction solvent and reacting; And

생성물을 침전시켜 화학식 1a 또는 화학식 1b의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는 화학식 1의 신규 루테늄 착물 또는 이의 염화합물의 제조방법을 제공한다.A method for preparing a new ruthenium complex of Formula 1 or a salt compound thereof is provided, which comprises the step of precipitating the product to obtain a compound of Formula 1a or Formula 1b.

[반응식 2][Scheme 2]

Figure 112018061017592-pat00009
Figure 112018061017592-pat00009

(상기 반응식 2에서, R1, R2, X 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, 화학식 1a 및 화학식 1b는 상기 화학식 1에 포함된다.)(In Reaction Scheme 2, R 1 , R 2 , X and n are as defined in Chemical Formula 1, and Chemical Formulas 1a and 1b are included in Chemical Formula 1.)

본 발명의 제조방법에서, 상기 반응 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올 용매, 아세토니트릴, 에틸렌글리콜 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the production method of the present invention, the reaction solvent may be an alcohol solvent such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetonitrile, ethylene glycol, etc., but is not limited thereto.

반응 온도는 알코올 용매 또는 아세토니트릴의 경우 50~100℃에서 수행하며, 반응 용매로서 에틸렌글리콜의 경우에는 130~200℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나는 경우에는 원하는 생성물이 형성되지 않을 수 있다.The reaction temperature is performed at 50 to 100 ° C in the case of an alcohol solvent or acetonitrile, and preferably at 130 to 200 ° C in the case of ethylene glycol as the reaction solvent. If it is outside the above range, the desired product may not be formed.

생성물의 침전시 침전 용매는 디에틸에테르, 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF), 테트라하이드로퓨란 (THF) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 침전물을 여과，건조하여 루테늄 착물을 제조할 수 있으며, 생성된 루테늄 착물은 1H NMR, XRD 등의 분석법을 통하여 구조를 분석할 수 있다.When the product is precipitated, diethyl ether, acetone, dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), etc. may be used as the precipitation solvent, but is not limited thereto. Thereafter, the precipitate can be filtered and dried to prepare a ruthenium complex, and the resulting ruthenium complex can be analyzed for structure through 1 H NMR, XRD, or other analytical methods.

본 발명의 일실시예에 있어서, 루테늄 착물의 염형태가 용해도 증가로 인해 더욱 바람직하다. 상기 루테늄 착물의 염화합물은 염기를 사용한 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들면 루테늄 착물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고，비용해 화합물 염을 여과하고，여액을 증발，건조시켜 얻을 수 있다.In one embodiment of the present invention, the salt form of the ruthenium complex is more preferred due to the increased solubility. The salt compound of the ruthenium complex can be prepared using a conventional method using a base, for example, the ruthenium complex is dissolved in an excess of an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, the insoluble compound salt is filtered, and the filtrate is filtered. Can be obtained by evaporation and drying.

본 발명의 일실시예는 글루코스 탈수소화효소(GDH)와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 루테늄 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 관한 것이다.One embodiment of the present invention relates to an electron transport medium comprising a ruthenium complex that reacts with glucose dehydrogenase (GDH), has no influence due to partial pressure of oxygen, and maintains a stable redox form for a long time.

본 발명에 따른 화학식 1의 루테늄 착물은 도 7에 나타낸 바와 같이, 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극에 있어서 글루코스가 없을 때(0 mM 검정선)에는 전류가 거의 흐르지 않으나, 글루코스를 첨가하면(30 mM 빨간선) 전류가 급격하게 증가하는 것을 보여, 글루코스, 효소, 신규 루테늄 착물, 그리고 전극간의 전자전달 반응이 원활히 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물은 글루코스 탈수소화효소(GDH)에 대하여 전자전달 매개체로서 유용하게 사용될 수 있다.As shown in Fig. 7, the ruthenium complex of formula 1 according to the present invention hardly flows current when there is no glucose in the electrode adsorbed with glucose dehydrogenase (0 mM assay line), but when glucose is added ( 30 mM red line) It can be seen that the current rapidly increases, and the electron transfer reaction between the glucose, the enzyme, the new ruthenium complex, and the electrode is smoothly performed. Therefore, the novel ruthenium complex of formula 1 according to the present invention can be usefully used as an electron transport medium for glucose dehydrogenase (GDH).

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 포함하는 산화환원반응용 시약조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a reagent composition for an oxidation-reduction reaction comprising a ruthenium complex represented by Chemical Formula 1 as an electron transport medium.

본 발명에 따른 산화환원반응용 시약조성물에 있어서, 상기 산화환원반응을 위한 산화환원효소는 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원되는 것으로, 이후 환원된 효소와 전달매개체와 반응하여 대사물질을 정량하게 된다.In the reagent composition for an oxidation-reduction reaction according to the present invention, the oxidation-reduction enzyme for the oxidation-reduction reaction is reduced by reacting with various metabolites to be measured, and then quantifying metabolites by reacting with the reduced enzyme and the delivery medium. Is done.

상기 전자전달 매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원반응에 의해 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자 전달 매개체는 전극으로 전자를 전달하며 산화되고, 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.The electron transport medium is reacted with a metabolite to be reduced by a reduced enzyme and an oxidation-reduction reaction, and the electron transport medium in the reduced state is oxidized while transferring electrons to an electrode, and an electric current is applied to the electrode surface to which an oxidation potential is applied. It plays a role of generating.

본 발명은 글루코스 측정 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 글루코스가 효소에 의해 산화되는 비슷한 기작을 가지는 특정 산화환원효소에 본 발명의 전자전달 매개체를 도입함으로써, 다양한 대사물질 예를 들면 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산 또는 글루타메이트와 같은 유기물 또는 무기물의 농도를 정량할 수 있다.Although the present invention describes the glucose measurement biosensor as an example, various metabolites such as cholesterol and lactate are introduced by introducing the electron transfer medium of the present invention into a specific oxidoreductase having a similar mechanism by which glucose is oxidized by an enzyme. , Creatinine, hydrogen peroxide, alcohol, amino acids, or concentrations of organic or inorganic substances such as glutamate.

따라서 본 발명은 시약조성물에 포함되는 산화환원효소의 종류를 달리함으로써 다양한 대사물질의 정량에 제한 없이 이용될 수 있다.Therefore, the present invention can be used without limitation to the quantification of various metabolites by varying the type of oxidoreductase contained in the reagent composition.

본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소화효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 에스테르화효소 (esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.The redox enzyme usable in the present invention may be one or more selected from the group consisting of various dehydrogenase, oxidase, esterase, etc., depending on the redox or detection target substance , Among the enzymes belonging to the enzyme group, an enzyme having the target substance as a substrate may be selected and used.

보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.More specifically, the redox enzymes are glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, and cholesterol esterase. , Lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, bilirubin oxidase, etc. It may be one or more.

한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질(예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자(cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논(Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Meanwhile, the oxidoreductase may include a cofactor that serves to store hydrogen taken from the oxidoreductase from the target substance (eg, metabolites) to be measured. For example, flavin adenine dine It may be one or more selected from the group consisting of nucleotides (flavin adenine dinucleotide, FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), pyrroloquinoline quinone (PQQ), and the like.

예컨대, 혈중 글루코스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코스 탈수소화효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-글루코스 탈수소화효소(nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)일 수 있다.For example, when measuring the concentration of glucose in the blood, glucose dehydrogenase (GDH) may be used as the redox enzyme, and the glucose dehydrogenase is flavin adenine dinucleotide-containing FAD as a cofactor. It can be a nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), and / or nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase containing FAD-GDH as a cofactor. .

구체적 예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH(예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH (예컨대, EC1.1.1.47 등), PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산 탈수소화효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코스 산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤 산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤 에스테르화효소 (예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트 산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산 산화효소 (예컨대, EC1.10.3.3 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올 탈수소화효소 (예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈 산화효소 (예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.In a specific example, the available redox enzymes are FAD-GDH (eg, EC 1.1.99.10, etc.), NAD-GDH (eg, EC1.1.1.47, etc.), PQQ-GDH (eg, EC1.1.5.2, etc.) ), Glutamic acid dehydrogenase (eg, EC 1.4.1.2, etc.), glucose oxidase (eg, EC 1.1.3.4, etc.), cholesterol oxidase (eg, EC 1.1.3.6, etc.), cholesterol esterase (eg, EC 3.1.1.13, etc.), lactate oxidase (e.g. EC 1.1.3.2, etc.), ascorbic acid oxidase (e.g., EC1.10.3.3, etc.), alcohol oxidase (e.g. EC 1.1.3.13, etc.), alcohol dehydration It may be one or more selected from the group consisting of digestive enzymes (eg, EC 1.1.1.1, etc.), bilirubin oxidase (eg, EC 1.3.3.5, etc.).

본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부 함유할 수 있다. 상기 루테늄 착물의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로, 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 금속함유 착물의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.The reagent composition according to the present invention may contain 20 to 700 parts by weight, such as 60 to 700 parts by weight or 30 to 340 parts by weight of the ruthenium complex of Formula 1 based on 100 parts by weight of the redox enzyme. The content of the ruthenium complex can be appropriately adjusted according to the activity of the oxidoreductase, and when the activity of the oxidoreductase contained in the reagent composition is high, the reagent composition can exert the desired effect even when the content of the metal-containing complex is low. The higher the activity of the oxidoreductase, the more the content of the metal-containing complex can be controlled.

한편, 본 발명에 따른 시약 조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.On the other hand, the reagent composition according to the present invention is a surfactant, a water-soluble polymer, a quaternary ammonium salt, a fatty acid, a thickener, a dispersant when dissolving reagents, a tackifier when preparing reagents, and a long-term storage stabilizer It may further include for the role of the back.

상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.When the reagent is dispensed, the surfactant may serve to distribute the reagent evenly over the electrode so that the reagent is dispensed with a uniform thickness. The surfactant is selected from the group consisting of Triton X-100, Sodium dodecyl sulfate, perfluorooctane sulfonate, sodium stearate, etc. 1 More than one species can be used. The reagent composition according to the present invention, when the reagent is dispensed so that the reagent spreads evenly over the electrode to properly perform the role of dispensing the reagent to a uniform thickness, the surfactant is based on 100 parts by weight of redox enzyme 3 To 25 parts by weight, for example, 10 to 25 parts by weight. For example, when using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, the surfactant may contain 10 to 25 parts by weight based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of the surfactant Can be adjusted lower than this.

상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 폴리아미드(polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The water-soluble polymer may serve to help stabilize and disperse the enzyme as a polymer support of the reagent composition. The water-soluble polymers include polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), perfluoro sulfonate, hydroxyethyl cellulose (HEC), and hydroxy One or more selected from the group consisting of hydroxypropyl cellulose (HPC), carboxy methyl cellulose (CMC), cellulose acetate, and polyamide may be used. The reagent composition according to the present invention, in order to sufficiently and appropriately exert a role of helping stabilization and dispersing of oxidoreductase, 10 to 70 parts by weight of the water-soluble polymer based on 100 parts by weight of oxidoreductase, such as 30 to 70 parts by weight. For example, when using a redox enzyme having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 70 parts by weight of the water-soluble polymer based on 100 parts by weight of the redox enzyme, and if the activity of the redox enzyme is higher than this, the content of the water-soluble polymer Can be adjusted lower than this.

상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도, 예컨대, 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.The water-soluble polymer may have a weight average molecular weight of about 2,500 to 3,000,000, for example, about 5,000 to 1,000,000 in order to effectively perform dynamics that help stabilize and disperse the support and the enzyme.

상기 4차 암모늄염은 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 4차 암모늄염으로는 에실트리메틸 암모늄(ecyltrimethylammonium), 마이리스틸트리메틸암모늄(myristyltrimethylammonium), 세틸트리메틸 암모늄(cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리메틸 암모늄(octadecyltrimethylammonium), 테트라헥실 암모늄(tetrahexylammonium) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 적혈구용적률에 따른 측정오차를 효율적으로 감소시키기 위하여, 상기 4차 암모늄염을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 130 중량부, 예컨대 70 내지 130 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 4차 암모늄염 70 내지 130 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 4차 암모늄염의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The quaternary ammonium salt may serve to reduce the measurement error according to the amount of hematocrit. The quaternary ammonium salt is 1 selected from the group consisting of ethyltrimethylammonium, myristyltrimethylammonium, cetyltrimethylammonium, octadecyltrimethylammonium, tetrahexylammonium, and the like. More than one species can be used. The reagent composition according to the present invention may contain the quaternary ammonium salt in an amount of 20 to 130 parts by weight, such as 70 to 130 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidase-reducing enzyme, in order to effectively reduce the measurement error according to the erythrocyte volume fraction. have. For example, when using a redox enzyme having an activity of 700 U / mg, it may contain 70 to 130 parts by weight of a quaternary ammonium salt based on 100 parts by weight of the redox enzyme, and when the activity of the redox enzyme is higher than this, the quaternary ammonium salt The content of can be adjusted lower than this.

상기 지방산은 상술한 4차 암모늄염과 같이 적혈구용적률(hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하며, 또한 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 (linear dynamic range)을 확대시키는 역할을 한다. 상기 지방산으로는 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 C6~C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용할 수 있다. 상기 지방산으로는 카프로산(caproic acid), 헵타노산(heptanic acid), 카프릴산(caprylic acid), 옥타논산(octanoic acid), 노나노산(nonanoic acid), 카프르산(capric acid), 운데카노산(undecanoic acid), 라우르산(lauric acid), 트리데카노산(tridecanoic acid), 미리스티산(myristic acid), 펜타데카노산(pentadecanoic acid), 팔미트산(palmitic acid), 헵타데카노산(heptadecanoic acid), 스테아르산(stearic acid), 노나데카노산(nonadecanoic acid), 아라키드산(arachidonic acid), 상기 지방산의 염등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 적혈구용적률에 따른 측정오차 감소 및 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 확대 효과를 적절하게 얻기 위하여, 상기 지방산을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 지방산 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 지방산의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The fatty acid serves to reduce the measurement error according to the amount of hematocrit like the quaternary ammonium salt described above, and also serves to expand the linear dynamic range of the biosensor in the high concentration region. As the fatty acid, one or more selected from the group consisting of fatty acids having a C4 to C20 carbon chain and fatty acid salts thereof may be used, preferably fatty acids having an alkyl carbon chain composed of C 6 to C 12 or fatty acid salts thereof Can be used. The fatty acids include caproic acid, heptanic acid, caprylic acid, octanoic acid, nonanoic acid, capric acid, and undecano. Undecanoic acid, lauric acid, tridecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, heptadecanoic acid ( One or more selected from the group consisting of heptadecanoic acid, stearic acid, nonadecanoic acid, arachidonic acid, and salts of the fatty acids may be used. The reagent composition according to the present invention, in order to properly reduce the measurement error according to the red blood cell volume ratio and to obtain a linear dynamic region enlargement effect of the biosensor in a high concentration region, 10 to 70 parts by weight based on 100 parts by weight of the redox enzyme, For example, it may contain 30 to 70 parts by weight. For example, when using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 70 parts by weight of a fatty acid based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of the fatty acid is higher than this. It can be adjusted low.

상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드(DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약이 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.The thickener serves to firmly attach the reagent to the electrode. As the thickener, one or more selected from the group consisting of natrosol, diethylaminoethyl-dextran hydrochloride, and the like can be used. The reagent composition according to the present invention may contain the thickener in an amount of 10 to 90 parts by weight, such as 30 to 90 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, so that the reagent is firmly attached to the electrode. For example, when using a redox enzyme having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 90 parts by weight of a thickener based on 100 parts by weight of the redox enzyme, and if the activity of the redox enzyme is higher than this, the content of the thickener Can be adjusted lower than this.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 바이오센서를 제공한다.In addition, the present invention provides a biosensor comprising a ruthenium complex represented by Chemical Formula 1 or a salt compound thereof.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 본 발명에 따른 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the biosensor is coated with a reagent composition for an oxidation-reduction reaction according to the present invention capable of redoxing an analyte contained in a liquid biological sample on a substrate having at least two electrodes. It may be an electrochemical biosensor produced by fixing.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the biosensor is provided with a working electrode, an auxiliary electrode and an identification electrode on one plane, and a planar electricity characterized in that a redox reagent composition according to the present invention is coated on the electrode. It can be a chemical biosensor.

또한, 본 발명의 또다른 실시예에 있어서, 상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서일 수 있다.In addition, in another embodiment of the present invention, the biosensor is provided so that the working electrode and the auxiliary electrode face on different planes, and characterized in that the redox reagent composition according to the present invention is coated on the working electrode. It may be a face-to-face electrochemical biosensor.

본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는, 대한민국 특허출원 10-2003-0036804호, 대한민국 특허출원 10-2005-0010720호, 대한민국 특허출원 10-2007-0020447호, 대한민국 특허출원 10-2007-0021086호, 대한민국 특허출원 10-2007-0025106호, 대한민국 특허출원 10-2007-0030346호, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.] 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.The planar and face-to-face electrochemical biosensors according to the present invention, Korean Patent Application No. 10-2003-0036804, Korean Patent Application No. 10-2005-0010720, Korean Patent Application No. 10-2007-0020447, Korean Patent Application No. 10- 2007-0021086, Korean patent application 10-2007-0025106, Korean patent application 10-2007-0030346, [E. K. Bauman et al., Analytical Chemistry, vol 37, p 1378, 1965; K. B. Oldham in "Microelectrodes: Theory and Applications," Kluwer Academic Publishers, 1991.].

이하, 상기 평면형 전기화학적 바이오센서를 도 1을 참조하여 그 구성을 설명한다.Hereinafter, the configuration of the planar electrochemical biosensor will be described with reference to FIG. 1.

먼저 도 1에 나타낸 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극과 확인전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(9)를 구비한 상판(8); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며, 혈액이 모세작용으로 전극 쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(7); 하기 전극에 코팅되는 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물(6); 하기 전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(5); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극(3)과 보조전극(2)과 확인전극(4); 및 상기 작동전극과 보조전극과 확인전극이 형성되는 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.First, the planar electrochemical biosensor shown in FIG. 1 is provided with a working electrode, an auxiliary electrode, and a confirmation electrode on one plane, a top plate 8 having a venting portion 9 for allowing blood to permeate into the sensor; Adhesive coated on both sides serves to bond the upper plate and the lower plate, and a fitting plate 7 for allowing blood to permeate toward the electrode by capillary action; Redox reagent composition according to the present invention is coated on the following electrode (6); An insulating plate 5 provided with a passage for defining an area of the following electrode; A working electrode 3, an auxiliary electrode 2 and a confirmation electrode 4 printed on the lower plate; And a lower plate 1 on which the working electrode, the auxiliary electrode, and the confirmation electrode are formed sequentially stacked.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 전자전달 매개체로서 화학식 1의 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물은 산화환원효소-루테늄 착물 간의 반응속도가 빨라져 혈액 내 글루코스 검출 성능이 현저히 향상되고, 혈액 내 산소 및 방해 물질의 영향을 거의 받지 않아, 혈액 내 글루코스 검출을 위한 전기화학적 바이오센서의 제조에 유용하다.As described above, the reagent composition for an oxidation-reduction reaction comprising a ruthenium complex of Formula 1 or a salt compound thereof as an electron transport medium according to the present invention has a faster reaction rate between an oxidoreductase-ruthenium complex, thereby significantly improving glucose detection performance in blood It improves and is hardly affected by oxygen and interfering substances in the blood, which is useful for the production of electrochemical biosensors for the detection of glucose in the blood.

상기 전극은 측정 대상과 효소 간의 반응에 의하여 발생되는 전기적 신호를 검출하는 것으로, 기술분야에 있어서 통상적으로 사용되는 재료를 사용할 수 있으며, 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 전극은 작동전극 및 확인전극을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 보조전극을 더 포함할 수 있다. 상기 전극의 형성은 기술분야에 있어서 통상적으로 사용되는 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 스크린 프린팅, 에칭, 스피터링 등에 의할 수 있다.The electrode detects an electrical signal generated by a reaction between a measurement target and an enzyme, and materials commonly used in the art may be used, and carbon, gold, platinum, silver, copper, and palladium may be used. It is not limited to this. The electrode may include a working electrode and a confirmation electrode, and preferably may further include an auxiliary electrode. The electrode may be formed by a method commonly used in the art, for example, by screen printing, etching, sputtering, or the like.

상기 전자전달매개체로서 상기 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 포함하는 산화환원반응용 시약조성물은 상기 바이오센서에 기술분야에서 통상적으로 사용되는 형태로 사용될 수 있으며, 예를 들어 상기 작동전극의 상부에 도포되어 효소 반응층으로 사용될 수 있다. 또한 상기 산화환원반응용 시약조성물은 상기 작동전극의 상부에 별도의 연속하는 층으로 사용될 수 있다.A reagent composition for an oxidation-reduction reaction including the new ruthenium complex of Chemical Formula 1 as the electron transport medium may be used in a form commonly used in the biosensor, for example, it is applied on top of the working electrode It can be used as an enzyme reaction layer. In addition, the reagent composition for the redox reaction may be used as a separate continuous layer on top of the working electrode.

상기 산화환원효소는 바이오센서가 측정하고자 하는 대상에 따라 변경될 수 있으며, 예를 들어 측정 대상이 혈액 중 콜레스테롤, 알코올 또는 글루코스인 경우, 각각 콜레스테롤 분해효소, 알코올 분해효소 또는 글루코스 분해효소를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 일실시예에 따른 바이오센서에 있어서, 상기 산화환원효소는 당업계에서 통상적으로 사용되는 효소를 사용할 수 있으며, 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산 탈수소화효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스 산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트 산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The oxidoreductase may be changed depending on the object to be measured by the biosensor. For example, when the measurement target is cholesterol, alcohol or glucose in the blood, cholesterol degrading enzyme, alcohol degrading enzyme or glucose degrading enzyme can be used, respectively. have. Therefore, in the biosensor according to an embodiment of the present invention, the oxidoreductase may use an enzyme commonly used in the art, glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, Glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase ), Alcohol dehydrogenase (alcohol dehydrogenase), bilirubin oxidase (bilirubin oxidase), or the like may be used, one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

상기 생체시료는 혈액일 수 있다.The biological sample may be blood.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실험예(example)를 제시한다. 다만, 하기의 제조예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred manufacturing examples and experimental examples are provided to help understanding of the present invention. However, the following preparation examples and experimental examples are only for understanding the present invention, and the present invention is not limited by the following preparation examples.

<< 제조예Manufacturing example 1>  1> Ru(dmo-bpy)Ru (dmo-bpy) 22 ClCl 22 착물의Complex 제조 Produce

Figure 112018061017592-pat00010
Figure 112018061017592-pat00010

둥근바닥 플라스크에 용매로서 무수 에탄올(40 mL)에 RuCl3·xH2O(35.1 mg, 0.1692 mmol)과 4',4'-디메톡시-2',2'-바이피리딘(dmo-bpy)(73.18 mg, 0.3384 mmol)을 넣고 1.5시간 동안 가열하여 환류시켰다.RuCl 3 xH 2 O (35.1 mg, 0.1692 mmol) and 4 ', 4'-dimethoxy-2', 2'-bipyridine (dmo-bpy) in absolute ethanol (40 mL) as a solvent in a round-bottom flask ( 73.18 mg, 0.3384 mmol) was added and heated to reflux for 1.5 hours.

이후, 상온으로 냉각시키고, 반응 혼합물을 디에틸 에테르(500 mL) 내로 적가하여 조 생성물을 침전시켰다. 이후, 침전물을 0.45㎛ 막 필터에 통과시켜 여과를 수행하였다. 다음으로, 생성물을 산화 알루미늄과 에탄올을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 이후, 농축된 용액을 디에틸 에테르(500 mL) 내로 적가하여 재-침전시켰다. 마지막으로, 침전물을 0.45㎛ 막 필터에 통과시켜 여과를 수행한 다음, 60℃의 진공 오븐에서 1일 동안 건조시켜 갈색 분말의 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 수득하였다.Then, it was cooled to room temperature, and the reaction mixture was added dropwise into diethyl ether (500 mL) to precipitate the crude product. Then, filtration was performed by passing the precipitate through a 0.45 μm membrane filter. Next, the product was purified by column chromatography using aluminum oxide and ethanol, and then, the concentrated solution was added dropwise into diethyl ether (500 mL) to re-precipitate. Finally, filtration was performed by passing the precipitate through a 0.45 μm membrane filter, and then dried in a vacuum oven at 60 ° C. for 1 day to obtain a brown powder of Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex.

<분석><Analysis>

(1) (One) 1One H NMR 분광법H NMR spectroscopy

Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물이 성공적으로 합성되었는지 알아보기 위하여, 제조된 생성물을 1H NMR 분광계(Varian Ascend 500, 500 MHz)로 확인하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.To determine whether the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex was successfully synthesized, the prepared product was confirmed by a 1 H NMR spectrometer (Varian Ascend 500, 500 MHz), and the results are shown in FIG. 2.

도 2는 상기 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이때, (a)는 dmo-bpy 리간드의 1H NMR 스펙트럼이고, (b)는 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 1H NMR 스펙트럼이다.Figure 2 shows the 1 H NMR spectrum of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in the above Preparation Example. At this time, (a) is a 1 H NMR spectrum of the dmo-bpy ligand, (b) is a 1 H NMR spectrum of the synthesized Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex.

도 2(a)에 나타낸 바와 같이, dmo-bpy에 대한 양성자 신호는 δ 8.6395 (d, 1H, J=5.5, 피리딘), 8.4255 (s, 1H, 피리딘), 6.9400 (d, 1H, J=5.5, 피리딘), 및 3.7400 (s, 3H, -OCH3) ppm에서 관찰되었다.As shown in Fig. 2 (a), the proton signal for dmo-bpy is δ 8.6395 (d, 1H, J = 5.5, pyridine), 8.4255 (s, 1H, pyridine), 6.9400 (d, 1H, J = 5.5 , Pyridine), and 3.7400 (s, 3H, -OCH 3 ) ppm.

그러나, 도 2(b)에 나타낸 바와 같이, 착물 형성 후에 리간드 양성자의 공명은 δ 9.302 (s, 1H, 피리딘), 7.990 (s, 1H, 피리딘), 7.113 (s, 1H, 피리딘), 및 4.273 (s, 3H, -OCH3) ppm으로 이동함으로써, 상기 dmo-bpy가 Ru 중심에 결합됨을 확인하였다.However, as shown in Figure 2 (b), the resonance of the ligand proton after complex formation was δ 9.302 (s, 1H, pyridine), 7.990 (s, 1H, pyridine), 7.113 (s, 1H, pyridine), and 4.273 By moving to (s, 3H, -OCH 3 ) ppm, it was confirmed that the dmo-bpy was bound to the Ru center.

(2) UV-(2) UV- visvis 분광법 Spectroscopy

또한, 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 결합 형태를 알아보기 위하여, UV-vis 분광법(Model 8453, Agilent Technologies, Shanghai, China)을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.In addition, in order to examine the binding form of the synthesized Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex, UV-vis spectroscopy (Model 8453, Agilent Technologies, Shanghai, China) was performed, and the results are shown in FIG. 3.

도 3은 상기 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물(위쪽, 빨간색 실선)과, 비교를 위한 출발물질인 RuCl3(아래쪽, 검정색 실선)의 색변화 및 UV-vis 스펙트럼을 나타낸다.Figure 3 shows the color change and UV-vis spectrum of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex (top, red solid line) synthesized in the preparation example, and the starting material for comparison, RuCl 3 (bottom, black solid line). Shows.

도 3에 나타낸 바와 같이, Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물과 RuCl3의 UV-vis 스펙트럼은 349 nm와 390 nm 흡수 피크를 나타내나, RuCl3에서는 349 nm에서 흡수 피크가 나타나지 않고 390 nm에서도 특징적인 d-d 흡수 밴드가 사라진다. 또한, 208~298 nm 범위의 자외선 영역에서의 피크들은 dmo-bpy의 전형적인 피리딘 피크들이다. 따라서, 이로부터 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물은 dmo-bpy가 Ru 중심에 결합된 형태임을 확인하였다.As shown in FIG. 3, the UV-vis spectrum of Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex and RuCl 3 shows absorption peaks at 349 nm and 390 nm, but absorption peak at 349 nm does not appear at Ru49 3 and 390 nm. Even the characteristic dd absorption band disappears. In addition, peaks in the ultraviolet region in the range of 208-298 nm are typical pyridine peaks of dmo-bpy. Accordingly, the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in the preparation example was confirmed that dmo-bpy is a form bound to the Ru center.

(3) X-선 광전자 분광법((3) X-ray photoelectron spectroscopy ( XPSXPS ))

제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 배위결합을 확인하기 위하여 X-선 광전자 분광계(XPS, SPECS, Berlin, Germany)를 이용하여 XPS를 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.To confirm the coordination bond of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in Preparation Example, XPS was performed using an X-ray photoelectron spectrometer (XPS, SPECS, Berlin, Germany) to show the results in FIG. 4. Did.

도 4는 dmo-bpy 리간드와, 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 N 결합에너지(a) 및 Ru 결합에너지(b)를 분석한 XPS 그래프이다.FIG. 4 is an XPS graph of analyzing N binding energy (a) and Ru binding energy (b) of a dmo-bpy ligand and a Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex synthesized in Preparation Example.

도 4(a)의 XPS 분석 결과에 나타낸 바와 같이, dmo-bpy 리간드는 401.4 eV에서 피리딘의 N 1s 피크가 나타난다. 그러나, 결합 후에 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 N 결합에너지는 400.0 eV로 낮아짐을 확인하였다. As shown in the XPS analysis result of FIG. 4 (a), the dmo-bpy ligand exhibits an N 1s peak of pyridine at 401.4 eV. However, it was confirmed that the N binding energy of the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex after binding was lowered to 400.0 eV.

또한, 도 4(b)에 나타낸 바와 같이, RuCl3에 대하여 전형적인 Ru 결합에너지는 Ru(3d3 / 2)(285.15 eV) 및 Ru(3d5 / 2)(282.5 eV) 오비탈의 2개의 구별되는 피크로 나타난다. 그러나, 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물에서 Ru(3d3 /2) 결합에너지는 285.7 eV로 높아지고, Ru(3d5 /2) 피크는 세기가 감소되어 사라졌다. 이로부터 제조된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물이 배위결합을 이루고 있음을 확인하였다.Further, FIG. 4, as shown in (b), typical Ru binding energy with respect to the RuCl 3 is Ru (3d 3/2) ( 285.15 eV) and Ru (3d 5/2) ( 282.5 eV) are two distinct of the orbital It appears as a peak. However, Ru (3d 3/2) in the synthesis Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex binding energy increased to 285.7 eV, Ru (3d 5/ 2) peak disappeared intensity is decreased. It was confirmed that the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex prepared therefrom formed a coordination bond.

(4) (4) 순환전압전류법Circulating voltage current method (( CVCV ))

제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물의 전자전달 매개체로서의 특성을 확인하기 위하여, 제조예에서 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물과, 비교를 위한 출발물질인 RuCl3에 대하여 순환전압전류법(CV)을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.The starting material for, a Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex and, compared synthesized in Production example to confirm that a Ru (dmo-bpy) 2 properties as an electron transfer mediator of the Cl 2 complex prepared in Production Example RuCl Cyclic voltage current method (CV) was performed on 3 , and the results are shown in FIG. 5.

도 5는 합성된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물과 RuCl3에 대한 순환 전압 전류곡선을 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 배위결합된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물은 RuCl3에 비하여 안정한 산화 및 환원 피크를 나타내었다. 이는 상기 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물이 빠르고 가역적인 산화환원 매개체로서 작용할 수 있음을 시사한다.5 shows a cyclic voltage current curve for the synthesized Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex and RuCl 3 . As shown in FIG. 5, the coordinated Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex showed a stable oxidation and reduction peak compared to RuCl 3 . This suggests that the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex can act as a fast and reversible redox mediator.

<< 제조예Manufacturing example 2> 본 발명에 따른 루테늄  2> Ruthenium according to the present invention 착물을Complex 이용한 바이오센서의 제조 Production of used biosensors

상기 제조예 1에 따라 제조된 1.0 mg의 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 1㎖의 0.1M 인산염 완충용액(PBS)(pH 7.4)에 용해시킨 용액 1.0㎕를 스크린 프린트 탄소 전극(SPCE)의 작동전극 상부에 떨어뜨린 후 상온에서 30초 동안 건조한다. 상기 건조된 전극 위에 FAD-GDH(FAD-glucose dehydrogenase)를 증류수에 용해시킨 4.0㎎/㎖ 용액 1.0㎕를 떨어뜨린 후 상온에서 30초 동안 건조시킨다. 이 위에 1.0% 나피온(nafion) 용액 1.0㎕을 떨어뜨려 상기 루테늄 착물과 FAD-GDH의 보호층을 형성하여 바이오센서를 제작하였다. 상기 바이오센서의 전극은 작동전극, 보조전극 및 기준전극으로 구성된 스크린 프린트 전극을 사용했으며, 작동전극과 보조전극은 탄소 잉크를 사용했으며, 기준전극은 실버잉크를 사용하여 제작하였다.A 1.0 µl solution of 1.0 mg of Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex prepared according to Preparation Example 1 in 1 ml of 0.1M phosphate buffer solution (PBS) (pH 7.4) was screen printed carbon electrode (SPCE). ) And then dried at room temperature for 30 seconds. On the dried electrode, 1.0 µl of a 4.0 mg / ml solution of FAD-GDH (FAD-glucose dehydrogenase) dissolved in distilled water was dropped, and then dried at room temperature for 30 seconds. On this, 1.0 μl of a 1.0% nafion solution was dropped to form a protective layer of the ruthenium complex and FAD-GDH to prepare a biosensor. The electrode of the biosensor used a screen print electrode composed of a working electrode, an auxiliary electrode and a reference electrode, a carbon ink was used for the working electrode and the auxiliary electrode, and the reference electrode was manufactured using silver ink.

<< 비교예Comparative example 1> 종래 전자전달 매개체로 사용되는 루테늄  1> Ruthenium used as a conventional electron transport medium 착물을Complex 이용한 바이오센서의 제조 Production of used biosensors

상기 제조예 2에서 상기 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물 대신에 종래 전자전달 매개체로 사용되는 루테늄 착물인 Ru(NH3)6을 1.0㎕를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 바이오센서를 제작하였다.In Preparation Example 2, the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex was used in the same manner as in Preparation Example 2, except that 1.0 μl of Ru (NH 3 ) 6 , a ruthenium complex used as a conventional electron transport medium, was used. The biosensor was prepared by the method.

<< 실험예Experimental example 1> 본 발명에 따른 신규 루테늄  1> New ruthenium according to the present invention 착물Complex 또는 종래 루테늄  Or conventional ruthenium 착물을Complex 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 산화 촉매 전류의 비교 Comparison of oxidation catalyst current of biosensors used as electron transfer mediators

상기 제조예 2 및 비교예 1에 따라 제조된 루테늄 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서에 글루코스 30 mM을 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 용액을 처리하여, 글루코스 산화 촉매 전류를 순환전압전류법에 의해 전위 범위 -0.8V ~ 0.8V, 주사 속도 100 mV/s에서 측정하여, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.The biosensor using the ruthenium complex prepared according to Preparation Example 2 and Comparative Example 1 as an electron transport medium was treated with a solution in which 30 mM glucose was dissolved in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) to circulate the glucose oxidation catalyst current. The voltage was measured in a potential range of -0.8 V to 0.8 V and a scanning speed of 100 mV / s by the current method, and the results are shown in FIGS. 6 and 7.

도 6은 종래 전자전달 매개체로 사용하는 루테늄 착물인 Ru(NH3)6을 사용한 바이오센서의 순환전압전류 곡선이고, 도 7은 본 발명의 제조예 1에 따라 제조된 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 전자전달 매개체로 사용한 바이오센서의 순환전압전류 곡선이다.FIG. 6 is a cyclic voltage current curve of a biosensor using Ru (NH 3 ) 6 which is a ruthenium complex used as a conventional electron transfer medium, and FIG. 7 is a Ru (dmo-bpy) 2 prepared according to Preparation Example 1 of the present invention It is a circulating voltage current curve of a biosensor using Cl 2 complex as an electron transport medium.

도 6에 나타낸 바와 같이, 종래 전자전달 매개체로서 사용하는 Ru(NH3)6을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 글루코스의 유무에 대한 산화전류의 변화가 현저하게 나타나지 않았다. 구체적으로, 도 6의 Ru(NH3)6을 사용한 경우, 글루코스가 없을 때와(0 mM 검정선) 있을때(30 mM 빨간선) 전류의 증가가 일어나지 않는 것을 보아 전자전달 매개체와 효소 그리고 전극에서의 전자전달 반응이 원활하게 일어나지 않는다는 것을 볼 수 있다. As shown in FIG. 6, the electrode adsorbed with Ru (NH 3 ) 6 used as a conventional electron transport medium together with glucose dehydrogenase did not significantly change the oxidation current with or without glucose. Specifically, in the case of using Ru (NH 3 ) 6 in FIG. 6, the increase in current does not occur in the absence of glucose (0 mM black line) and in the presence of (30 mM red line) electron transport mediators, enzymes, and electrodes. It can be seen that the electron transfer reaction of does not occur smoothly.

그러나, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물을 글루코스 탈수소화효소와 함께 흡착시킨 전극은 글루코스의 유무에 큰 반응성을 나타내었다. 구체적으로 도 7에서, 본 발명에 따른 Ru(dmo-bpy)2Cl2 착물을 사용한 경우, 글루코스가 없을 때(0 mM 검정선)에는 전류가 거의 흐르지 않으나, 글루코스를 첨가하면(30 mM 빨간선) 전류가 급격하게 증가하는 것을 보여, 글루코스, 효소, 신규 루테늄 착물, 그리고 전극간의 전자전달 반응이 원활히 이루어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규 루테늄 착물은 글루코스 탈수소화효소(GDH)에 대하여 전자전달 매개체로서 유용하게 사용될 수 있다.However, as shown in FIG. 7, the electrode adsorbed with the new ruthenium complex according to the present invention together with glucose dehydrogenase showed great reactivity to the presence or absence of glucose. Specifically, in FIG. 7, when the Ru (dmo-bpy) 2 Cl 2 complex according to the present invention is used, little current flows when there is no glucose (0 mM assay line), but when glucose is added (30 mM red line) ) It can be seen that the electron transfer reaction between the glucose, the enzyme, the new ruthenium complex, and the electrode is smoothly performed. Therefore, the novel ruthenium complex according to the present invention can be usefully used as an electron transport medium for glucose dehydrogenase (GDH).

<< 실험예Experimental example 2>  2> 글루코스Glucose 농도에 따른 바이오센서의  Biosensor according to concentration 글루코스Glucose 산화 촉매 전류 평가 Oxidation catalyst current evaluation

상기 실시예 2에 따라 제조된 바이오센서에 0.1 M 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해시킨 농도 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM 및 30 mM의 글루코스 용액을 처리하여, 글루코스 산화 촉매 전류를 순환전압전류법에 의해 전위 범위 -0.8V ~ 0.8V, 주사 속도 100 mV/s에서 측정하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.A glucose sensor having a concentration of 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, and 30 mM dissolved in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) was treated with the biosensor prepared according to Example 2 to measure the glucose oxidation catalyst current. 8 and 9 are measured in a potential range of -0.8 V to 0.8 V and a scanning speed of 100 mV / s by the cyclic voltammetry method.

도 8은 본 발명의 제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선이다.8 is a cyclic voltage current curve according to the concentration of glucose of the biosensor comprising the new ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 of the present invention.

도 9는 본 발명의 제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.9 is a graph showing the glucose oxidation catalyst current according to the concentration of glucose of the biosensor including the new ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 of the present invention.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조예 1에서 제조된 신규 루테늄 착물을 포함하는 바이오센서는 글루코스의 농도가 1 mM에서 30 mM으로 증가함에 따라 순환전압전류 또한 증가하는 것으로 나타났으며, 이 결과에서 0.8V의 전류값들을 비교하면, 도 9에 나타낸 바와 같이, 글루코스 농도가 5 mM에서 30 mM까지 증가할수록 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 이때 선형도는 R2=0.9984로 나타났다.As shown in Figure 8, the biosensor containing the new ruthenium complex prepared in Preparation Example 1 of the present invention was found to increase the circulating voltage current as the concentration of glucose increases from 1 mM to 30 mM, When comparing the current values of 0.8V in the results, as shown in FIG. 9, the glucose oxidation catalyst current increased linearly as the glucose concentration increased from 5 mM to 30 mM. At this time, the linearity was R 2 = 0.9984.

따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 신규 루테늄 착물을 전자전달매개체로 포함하는 바이오센서는 글루코스 탈수소화효소를 기반으로 하므로 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 장점이 있어, 이를 적용한 산화환원 반응시약, 및 전기화학적 바이오센서는 시고 내 산소 분압에 따른 측정오차가 최소화되며, 장기간 안정적으로 사용 가능한 장점이 있다.Therefore, the biosensor containing the new ruthenium complex of formula 1 according to the present invention as an electron transport medium is based on glucose dehydrogenase, so there is no influence due to oxygen partial pressure, and there is an advantage that the redox form is stably maintained for a long time. , The redox reaction reagent to which it is applied, and the electrochemical biosensor have the advantage that the measurement error due to the partial pressure of oxygen in the plaster is minimized and can be used stably for a long time.

이상 본 발명을 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위 내에서 상기 실시예를 다양하게 변형 및 수정할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다.Although the present invention has been described above with reference to preferred embodiments, it should be understood that the present invention is not limited to the above embodiments. The present invention can be variously modified and modified in the above-described embodiments within the scope of the following claims, all of which belong to the scope of the present invention. Therefore, the present invention is limited only by the claims and their equivalents.

1: 하판
2: 보조전극
3: 작동전극
4: 확인전극
5: 절연판
6: 산화환원반응 시약조성물
7: 끼움판
8: 상판
9: 통기부1: Bottom
2: auxiliary electrode
3: Working electrode
4: Confirmation electrode
5: Insulation board
6: Redox reagent composition
7: sandwich plate
8: Tops
9: Aeration

Claims (15)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 산화환원효소, 및
전자전달 매개체로서 하기 화학식 1b로 표시되는 루테늄 착물 또는 이의 염화합물을 포함하고,
[화학식 1b]
Figure 112019126895577-pat00024

(상기 화학식 1b에 있어서,
R1 및 R2는 독립적으로 C1-C4 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고,
X는 할로겐 원소이다.)
상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소화효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH)인 것을 특징으로 하는 산화환원반응용 시약조성물.
Redox enzymes, and
A ruthenium complex represented by the following formula 1b as an electron transport medium or a salt compound thereof,
[Formula 1b]
Figure 112019126895577-pat00024

(In the formula 1b,
R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 straight or branched alkoxy,
X is a halogen element.)
The redox enzyme is a flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), characterized in that the reagent composition for redox reaction.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제7항에 있어서,
상기 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 화학식 1b의 루테늄 착물을 20 내지 700 중량부 함유하는 것을 특징으로 하는, 산화환원반응용 시약조성물.
The method of claim 7,
The reagent composition is characterized in that it contains 20 to 700 parts by weight of a ruthenium complex of formula 1b based on 100 parts by weight of redox enzyme, a reagent composition for redox reaction.
적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 제7항의 산화환원반응용 시약조성물을 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서.
An electrochemical biosensor produced by applying and fixing a reagent composition for oxidation-reduction reaction according to claim 7 that can redox analytes contained in a liquid biological sample on a substrate equipped with at least two electrodes.
제12항에 있어서,
상기 바이오센서는 작동전극, 보조전극 및 확인전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 평면형 바이오센서인 것을 특징으로 하는, 전기화학적 바이오센서.
The method of claim 12,
The biosensor is an electrochemical biosensor, characterized in that a working electrode, an auxiliary electrode and a confirmation electrode are provided on one plane, and a redox reagent composition is coated on the electrode.
제12항에 있어서,
상기 바이오센서는 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 산화환원반응 시약조성물이 코팅된 대면형 바이오센서인 것을 특징으로 하는, 전기화학적 바이오센서.
The method of claim 12,
The biosensor is an electrochemical biosensor, characterized in that the working electrode and the auxiliary electrode are provided to face on different planes, and the redox reagent composition is coated on the working electrode.
제12항에 있어서,
상기 생체시료는 혈액인 전기화학적 바이오센서.The method of claim 12,
The biosample is an electrochemical biosensor that is blood.
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