KR20190142764A - TH1/TH17 배향성 면역 반응을 촉진시키는 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물 - Google Patents

TH1/TH17 배향성 면역 반응을 촉진시키는 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 세그먼트의 결실에 의한, 보르데텔라 종의 아데닐레이트 사이클라제로부터 유래된 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드), 특히, 보르데텔라 페르투시스의 CyaA로부터 유래된 폴리펩티드의, 면역원성 조성물에서 TH1/TH17 배향성 면역 반응의 면역조절 항원으로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 보르데텔라 종에 의한 숙주의 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 능동 면역화를 위한 무세포 면역원성 조성물에 또는 상기 상기 무세포 면역원성 조성물을 포함하는 조합 조성물에 상기 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 백신 후보물질에 관한 것이다.

Description

TH1/TH17 배향성 면역 반응을 촉진시키는 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물
본 발명은 보르데텔라 종(Bordetella sp .), 특히, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)의 아데닐레이트 사이클라제로부터 유래된 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)의 면역원성 조성물에서 TH1/TH17 배향성 면역 반응을 촉진시키는 작용제로서의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보르데텔라 종에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 무세포 후보 백신의 제조를 위한, 또는 능동 면역화를 위한 다른 활성 성분과 공동으로 상기 무세포 후보 백신을 포함하는 조합 후보 백신의 제조를 위한, 상기 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
백일해(whooping cough)(백일해(pertussis))는 박테리아 보르데텔라 페르투시스에 의해 유발되는 백신 예방 가능 질환이다. 최초의 백일해 백신은 30년대에 개발되었고, 40년대와 50년대에 선진국에서 실시되었다(1). 이는 화학적으로 사멸된 박테리아로 구성된 전세포 백신(WCV: whole cell vaccine 또는 wP)이었고, 이는 40년대 후반에 디프테리아 및 파상풍 톡소이드와 조합되었다(DTwP). 1950년대와 1960년대 사이에 산업화된 세계에서 wP 백신을 이용한 대규모 백신 접종이 진행된 이후, 백일해의 발병률 및 사망률은 현저히 감소하였다(>90%). 그러나, wP 백신은 발작, 신경 질환 및 다른 부작용을 유발하는 반응원성 성질을 보였다(2).
상기와 같은 부작용을 막기 위해, 1980년대 초반, 무세포 백일해 백신(aP)인 2세대 백일해 백신이 개발되었다. aP 백신은 보르데텔라 페르투시스로부터의 1 내지 5개의 정제된 항원, 예컨대, 백일해 독소(PT) 및 어드헤신, 예컨대, 섬유질 헤마글루티닌(FHA: filamentous hemagglutinine), 퍼탁틴(PRN) 및 섬모 응집원(AG)을 포함하였다. aP 백신은 1981년 이래로 일본에서 사용되어 왔고(3), 1991년 이래로 미국에서 부스터를 위해 권장되어 왔다(4). 그의 안전성 프로파일에 기인하여, 다수의 선진국에서는 1990년대 말 내지 2000년 초반에 전체 백신 접종 과정 동안 aP를 사용하는 것으로 전환하였다(5).
aP 백신 도입 이래, 과학 사회에서는 백일해 사례가 부활한 것이 관찰되었다(5-8). 2008년, WHO로부터의 추정에 따르면, 전세계적으로 약 1,600만 건의 백일해 사례가 발생하였고, 상기 질환으로 인해 약 195,000명의 아동이 사망한 것으로 나타났다(9).
aP 백신은 백일해의 임상적 증상에 대해서는 방어적이지만, WCV와 달리 병원체의 콜로니 형성 및 전염에 대해서는 방어적이지 못한 것으로 기술되었다(14). 이러한 관찰 결과는 상기 두 백신 유형 모두에 의해 유도되는 상이한 면역 반응에 의해 뒷받침된다. aP 백신 접종은 TH2 배향성 면역 반응을 유도하는 반면, WCV는 TH1 및 Th17 배향성 면역 반응을 유도한다(15). 이는 최근 aP 백신 접종에서의 우수한 TH1 반응의 부재 사이에서, 박테리아는 질환은 유도하지 않으면서, 백신 접종받은 동물의 폐에서 콜로니를 형성할 수 있는 바, 박테리아의 방어 및 유지 지속 기간이 더 짧다는 상관관계를 보인 개코원숭이 모델에서의 실험에 의해 입증되었다(14).
수개의 연구는 aP 유도된 면역이 wP 또는 감염 유도된 면역보다 지속 기간이 더 짧고, 그 결과로, WCV로 백신 접종받은 대상과 비교하여 aP로 백신 접종받은 대상의 감염에 대한 감수성은 증가된다고 밝혔다(10, 11). 5차 DTaP 투약 후, 백일해에 걸릴 가능성이 연간 평균 42%만큼 증가한 것으로 나타난, 미국에서 수행된 연구에 의해 예시되는 바와 같이(12), 1차 백신 접종으로 DTaP를 받고, 후속 투약을 받은 아동은 DTwP 백신을 받은 아동보다 질환에 걸리기 더 쉽다. 부스터로서 aP를 사용하였을 때에도 상기와 같이 면역력이 빠르게 감퇴되었다고 기술되었다(13). 2010년 초반 미국 및 영국에서의 백일해 발생에 기인하여 발병률이 높은 8-20세 사람으로 이루어진 큰 집단에 기초하여, (Witt et al.)은 환자들의 백일해 백신 접종 이력 동안 1회 이상 wP 투약을 받은 환자와 비교하여 오직 aP 백신만을 받은 환자의 경우, 백일해의 상대 위험도(RR)는 8.57(P < .0001)이었다고 밝혔다(14). 추가로, 1회 이상의 wP 투약을 실시하는 것이 후속 aP 투약으로부터의 지속성을 유의적으로 현저히 증가시켰다.
방어 및 지속 기간의 차이는 실제로 wP 및 aP 이후에 유도되는 상이한 면역 반응 유형으로부터 비롯된다고 볼 수 있다. 예를 들어, aP 및 wP 백신 접종은 페르투시스에 대하여 기능적으로 상이한 T 세포 반응을 유도한다. 각각 wP 또는 aP 1차 백신 접종에 의해 유도되는 Th1 또는 Th2 편향성은 고정되고, Tdap로 부스팅되는 경우에도 변함이 없거나(문헌 [Bancroft et al, 2016]), 또는 심지어는 aP 유도된 Th2 반응의 경우에는 추가로 증강되었다는 것(문헌 [Ryan et al, 2000])은 주목할 만하다. 마우스에서도 유사한 관찰 결과가 나타났다. 상기 연구에서는 상이한 유형의 애주번트를 평가하였고(문헌 [Allen et Mills, Expert Review of Vaccines, 13(10)2014]), 그 결과, 비. 페르투시스(B. pertussis) 시험감염에 대한 방어는 Th1 배향성 애주번트의 존재하에서 개선된 것으로 나타났다. 상기 시험감염에서, 백신의 주사 경로는 대개 복강내이고, 종종 피하 또는 비내이다. 11회 국제 보르데텔라 심포지엄(11th International Bordetella symposium)(April, 5th-8th, 2016 Buenos Aires, Argentina; http://bordetella2016.com.ar/en/images/Programa-Bordetella-Symposium.pdf)에서 동일 저자는 aP+ LP1569(LP1569는 Th1 면역 반응 또는 Th17 면역 반응, 또는 그 두 면역 반응 모두(TH1/TH17)를 유도하기 쉬운 애주번트로서 사용되는 TLR2 작용제이다)로 면역화되고, 동일 생성물로 부스팅된 동물의 비. 페르투시스 시험감염에 대한 방어는 기도 및 폐에서 수득된 프라임 부스트 설정에서의 결과와 함께, 그에 반해, aP+알룸에 의한 프라임 및 aP+LP1569에 의한 부스트로는 상기와 같은 방어를 부여하지 못하였다는 결과를 발표하였다. 상기 저자는 부스트 백신 중에 Th1형 애주번트가 존재하였음에도 불구하고, 면역 반응 및 그 결과에 따른 방어는 aP+알룸으로 백신 접종받고, aP+알룸으로 부스팅된 군과 같았다고 결론지었다.
숙주의 방어의 임상 효능을 위해, 특히, 시간 경과에 따라 지속된 방어를 위해서는 무세포 백일해 백신의 항원에 대하여 유도된 면역 반응의 유형이 한 가지 중요한 인자라는 것을 상기 관찰 결과로부터 이해할 수 있다. 면역 반응의 TH1 반응으로의 배향에 영향을 줄 수 있는 작용제를 찾는 것이 기대되어 왔고, 그에 따라 관심은 페르투시스 단백질 중 하나, 즉, 아데닐레이트 사이클라제의 특성으로 이어졌다.
보르데텔라 페르투시스의 아데닐레이트 사이클라제(CyaA)는, 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포(APC)를 비롯한 선천 면역 세포 상에서 발현되는 CD11b/CD18 인테그린 수용체에 대해 높은 친화도로 결합함으로써 전문 면역 세포를 표적화하는 바, 숙주의 면역계의 면역 중화를 담당하는 단백질인 독소-용혈소이다(16). 세포 내에서, CyaA는 숙주의 항박테리아 활성을 억제시킴으로써 박테리아의 콜로니 형성 및 존속을 촉진시킬 수 있다(17-20). 따라서, 면역 반응과 관련된 그의 특성을 사정하기 위해서는 무독화된 또는 비독성 CyaA가 선호되었다.
무독화된 또는 천연 CyaA를 이용한 다른 연구들에서도 상기 분자에 대한 여러 특성이 밝혀졌다. 공개된 실험의 결론 및 투여 프로토콜은 하기에 개시되어 있다.
· (MacDonald-Fyall et al.)(21)은 무독화된 CyaA의 애주번트 활성이 기술되어 있지만, 상기 애주번트 활성은 CyaA가 백신에 첨가될 때에는 백일해 독소(PT)에 대해서는 상실되는 것으로 보인다고 기술하였다.
· (Cheung et al.)(22)은 0일째 및 28일째 aP 백신 + 상이한 형태의 CyaA(프로CyaA, 무독화된 CyaA 및 천연 CyaA)로 면역화된 마우스에서 PT, FHA 및 PRN에 대한 IgG 항체 반응의 전체 수준에는 유의적인 변화가 없는 것으로 기술하였다. 무세포 백일해 백신 + 무독화된 CyaA로 백신 접종받은 상기 마우스에서의 PRN에 대한 IgG2a(TH1 반응)의 수준은 유의적으로 더욱 컸다고 기술하였다. 또한, CyaA 부재하의 동일한 DTaP와 비교하였을 때, 무독화된 CyaA의 존재하에서 인간 용량의 알루미늄의 1/8(즉, 0.0625 mg Al+++/주사)을 함유하는 DTaP 1/8을 이용한 2회의 면역화 후에 aP 특이적 IFNg 반응은 증가하였다고 밝혔다.
· (Dunne et al.)(23)은 마우스에서 WT 비. 페르투시스를 이용한 호흡기와 관련된 시험감염 모델에서 방어성인 IL-1β 매개 Th17 면역 반응을 촉진시킬 수 있는 CyaA의 능력을 기술하였다. 예컨대, 알루미늄 염과 같은 종래 백신 애주번트의 첨가 없이, 마우스에서 KLH와 함께 공동으로 주사된 CyaA는 특이적인 KLH-TH17 반응을 유도하였다고 밝혔다.
· (Dadaglio et al.)(24)은 지질다당류(LPS)와는 관계 없이, 그의 Th1 T 세포 유도 및 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 통해 비. 페르투시스에 대한 방어 반응을 유도하는 데 중요한 톨 유사 수용체(TLR) 4-신호전달 인자인 것으로 CyaA를 기술하였다;
Figure pct00001
Figure pct00002
면역원성 조성물 중 CyaA 또는 무독화된 CyaA의 사용을 포함하는, 상기 문헌에 보고된 실험은 CyaA 또는 무독화된 CyaA 단백질의 영향과 관련하여 대조되는 결과를 제공하고, 가능하게는 다수의 파라미터가 강력하고, 지속되는 방어에 유리한 면역 반응 유형의 유도에 영향을 줄 수 있기 때문에, 추가 연구가 뚜렷한 방향성을 가지고 진행되는 것을 허용하지 않는다. 따라서, 방어를 달성하기 위해서는 새로운 백신 후보물질 및 적합한 투여 설정에 관한 디자인이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 요약
숙주에게로의 그의 투여와 관련하여 백일해 백신의 항원에 대한 반응을 유도하는 데, 또는 상기 반응을 촉진시키는 데 효과적일 수 있는 CyaA 폴리펩티드를 선택하는 것 이외에도, 본 발명자들은 선행 기술에서 달성된 결과(예컨대, (Cheung et al.)에 개시된 결과)는, TH2 애주번트(알룸) 농도가 인간용 백신의 용량에서의 그의 농도와 유사한 농도인 조건하에서, 및 또한 동물이 TH2 분극성 무세포 백일해 기반 백신으로 프라이밍되는 조건하에서는 재현될 수 없다는 것을 관찰하게 되었다. 그러나, 본 발명자들은 aP를 포함하는 조합 백신과 관련된 것을 포함하여, 투여된 무세포 백일해 백신의 면역 반응의 사정에 적절한 조건을 밝혀내었고, 비독성 CyaA가 인간 숙주에서 사용되는 투여 경로에 적합한 백신 접종 설정 디자인을 위해 성공적인 면역조절제일 수 있다고 밝혔다. 그의 실험 결과로부터 본 발명자들은 예컨대, 본원에서 사용된 GTL003과 같은 비독성 CyaA는 그가 백신 후보에 포함될 때에, 전세포 백신 뿐만 아니라, 상기 비독성 CyaA 폴리펩티드를 함유하지 않는 무세포 백일해 백신에 비하여 더 우수한 항CyaA 특이적 항체 역가, IFN 감마 및 IL-17 반응을 제공한다고 최초로 밝혔다. 따라서, 비독성 CyaA 폴리펩티드를 사용하는 것이 지속되는 방어가 요구되는 면역 반응을 비롯한, 점막 및 폐에서의 보르데텔라 균주에 의한 감염에 대한 방어 반응에 유리하게 영향을 미칠 것이다.
따라서, 본 발명자들은 비독성 CyaA, 특히, 천연 CyaA 단백질의 서열의 아미노산 세그먼트의 결실의 결과로서 비독성인 CyaA 유래 폴리펩티드의 영향을 측정하였고, 이용가능한 인간 aP 백신의 투여 조건과 유사한 것으로 보이는 조건하에서 상기 비독성 CyaA 유래 폴리펩티드를 사정하였다. 수득된 결과에 기초하여, 본 발명자들은, 주로 TH2 면역 반응을 유도하는 경향이 있는, 예컨대, 수산화알루미늄과 같은 애주번트가 Tdap 백신의 인간 용량(0.39 mg Al+++/주사)으로 애주번트가 첨가된 조합 Tdap 백신과 관련하여 보르데텔라 페르투시스의 무세포 백신 항원과 연관된, 무독화된 CyaA, 특히, WO 2014/016310에서 기술된 바와 같은, 유전적으로 무독화된 재조합 CyaA 유래 폴리펩티드(및 이하 GTL003으로 명명)를 포함하는 새로운 조성물을 고안해 낼 수 있었다. 예상 밖으로, 상기 TH2 애주번트의 존재에도 불구하고, GTL003의 Tdap 백신 첨가는 마우스에서 수행된 1차 주사 이후의 주사(들) 후에 TH1/TH17 프로파일 쪽으로 진행되는 항원 특이적 사이토카인 반응 편향성을 가질 수 있게 허용하였다.
따라서, 본 발명자들은 비독성 CyaA의 예시적인 일례로서 GTL003이 TH2 유형의 알루미늄 애주번트를 함유하는 면역원성 조성물에 존재할 때, 항박테리아 감염에서 중요한 요소가 되는 것인, 이펙터 및 기억 T 림프구의 생성, 그 결과로서, TH1 IgG 이소타입 생산 및 더욱 큰 방어 점막 면역 유도에 바람직한, TH1/TH17 유형의 사이토카인 프로파일을 유도할 수 있는 이전에는 알려지지 않았던 능력을 가진다고 밝혔다. 이러한 면역 반응의 중요한 배향성 및 페르투시스의 항원에 대한 항체 수준에 미치는 가능한 추가적 효과는, 예컨대, GTL003과 같은 CyaA 유래 폴리펩티드가 더 높고, 장기간 지속되는 방어에 적합한 반응을 촉진시킬 때에는 특히 2차 및 추가 면역화를 위해 사용될 수 있는, Tdap 백신을 포함하는, 신세대 aP 백신의 개발을 가능하게 만드는 예상 밖의 결과이다.
본 발명은 조합 백신의 면역 반응의 활성 성분을 포함하는 면역원성 조성물의 제조를 위한, 비독성 CyaA, 특히, CyaA 유래 폴리펩티드의 용도로서, 여기서, 상기 비독성 CyaA, 특히, CyaA 유래 폴리펩티드는 보르데텔라, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 질환 또는 병태에 대한 방어 면역 반응의 활성 성분으로서 제공되고/거나, 조합 백신의 활성 성분들 중 적어도 하나에 대한 (바람직하게, 조합 백신의 모든 활성 성분에 대한) 예방적 방어를 위한 면역 반응을 TH1- 및/또는 TH17 배향성 면역 반응 쪽으로 일으키는 면역조정제 또는 면역조절제로서 제공되는 것인 용도에 관한 것이다.
상기 비독성 CyaA는 그의 효소적 아데닐레이트 사이클라제 활성을 상실한 단백질 또는 폴리펩티드이다. 비독성 CyaA는 본 분야에서 개시된 바 있으며, 따라서, 이는 보르데텔라의 천연 단백질의 화학적 또는 유전적 변형으로 생성될 수 있다.
특히, 이는 비세포독성 폴리펩티드이고, 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된 (CyaA 유래 폴리펩티드), CyaA 유래 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 (i) 그의 아미노산 서열이 보르데텔라 페르투시스의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 천연 CyaA의 아미노산 서열 중 227번 위치 내지 321번 위치의 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드, 또는 (ii) (i)의 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드로서, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 또는 보르데텔라 힌지이(Bordetella hinzii)의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 상기 연속 세그먼트의 CyaA 중의 결실과 매칭되는, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 천연 CyaA 서열 중의 상기 위치에 의해 정의되는 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드인 것인 CyaA 유래 폴리펩티드이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 a) 또는 b)로 구성된 군에서 선택된다:
a) 인간 숙주에서 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어에 적합한 무세포 면역원성 조성물, 또는
b) 인간 숙주에서 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어에 적합한 상기 무세포 면역원성 조성물을 포함하는 조합 면역원성 조성물,
여기서, 상기 무세포 면역원성 조성물은
- 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된, 비독성 폴리펩티드, 특히, 비세포독성 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)로서, 상기 폴리펩티드는 특정 실시양태에서 (i) 그의 아미노산 서열이 보르데텔라 페르투시스의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 천연 CyaA의 아미노산 서열 중 227번 위치 내지 321번 위치의 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드, 또는 (ii) (i)의 폴리펩티드의 변이체, 특히, 그의 아미노산 서열이 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 상기 연속 세그먼트의 CyaA 중의 227번 위치 내지 321번 위치와 매칭되는, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 천연 CyaA 서열 중의 상기 위치에 의해 정의되는 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 변이체인 폴리펩티드인 것인 비독성 폴리펩티드, 및
- 임의적으로, TH1 면역 반응의 애주번트, 또는 TH2 면역 반응의 애주번트, 또는 그 둘 모두의 조합을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 면역원성 조성물은
- 보르데텔라 균주로부터의 2개 이상의 항원으로서, 여기서, 한 항원은 (i) 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된, 비독성 폴리펩티드, 특히, 비세포독성 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)이고, 상기 폴리펩티드는 (i.1) 그의 아미노산 서열이 보르데텔라 페르투시스의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 천연 CyaA의 아미노산 서열 중 227번 위치 내지 321번 위치의 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드, 또는 (i.2) (i.1)의 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드로서, 특히, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열이 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 상기 연속 세그먼트의 CyaA 중의 227번 위치 내지 321번 위치와 매칭되는, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 천연 CyaA 서열 중의 상기 위치에 의해 정의되는 93개 이상의 아미노산 잔기로 이루어진 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드이고, 여기서, 추가 항원(들)이 (ii) 백일해 톡소이드(PT), (iii) 섬유질 헤마글루티닌(FHA), (iv) 퍼탁틴(PRN) 및 (v) 핌브리아에(Fim)로 구성된 군에서 선택되고,
여기서, 보르데텔라 균주에 대한 방어 면역 반응은 상기 항원에 대한 것으로 유도되는 것인, 2개 이상의 항원, 및
- 임의적으로, TH1 면역 반응의 애주번트, 또는 TH2 면역 반응의 애주번트, 또는 그 둘 모두의 조합을 포함하는, 인간에서 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어에 적합한 무세포 면역원성 조성물이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 조합 면역원성 조성물은 결정된 병원체에 대한 면역 방어의 유도를 위한 활성 성분으로서, (vi) 파상풍 톡소이드로 구성된 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)의 1 이상의 항원, (vii) 파상풍 톡소이드로 구성된 코리네박테리움(Corynebacterium) 복합체의 항원, 및 임의적으로 (viii) 상이한 병원체(들)의 추가 항원인 항원을 추가로 포함한다.
추가 항원은 특히 면역 반응의 반응가를 증가시키기 위해 면역원성 조성물에 추가로 포함될 수 있고, 따라서, 조합 면역원성 조성물은 결정된 병원체에 대한 면역 방어의 유도를 위한 활성 성분으로서, B형 간염 표면 항원(HB), 하나 또는 수개의 바이러스 균주의 불활성화된 폴리오바이러스(IPV), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) b형 다당류로 구성된 군에서 선택되는 항원을 추가로 포함할 수 있다.
상이한 병원체 기원의 조합 항원이 인간 숙주에게 투여되는 백신 조성물에 통상적으로 포함되고, 이는 심지어 TH2 종래 애주번트의 존재하에서도 반응을 TH1 및/또는 TH17 배향성 반응 쪽으로 일으키기 위해서는 본원에 기술된 바와 같은 CyaA 유래 폴리펩티드의 특정 특성으로부터 도움을 얻을 수 있어야 한다.
면역원성 조성물의 특정 실시양태에서, 백일해 톡소이드(PT), 섬유질 헤마글루티닌(FHA), 퍼탁틴(PRN) 및 핌브리아에(Fim)로 구성된 군에서 선택되는 보르데텔라 종의 항원은 서로 독립적으로 보르데텔라 페르투시스, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터의 것이고, 바람직하게는, 비. 페르투시스로부터의 것이고, 바람직하게는, 모두 동일한 보르데텔라 균주로부터의 것이다.
본 발명에 따른 특정 조합 면역원성 조성물은 0.5 ml의 면역원성 조성물 1회 용량이 하기의 것을 함유하는 것이다:
- 무독화된 형태의 (특히, 유전적으로 또는 화학적으로 무독화된) 보르데텔라 독소, 특히, 백일해 톡소이드: 1 내지 50 ㎍;
- 섬유질 헤마글루티닌: 1 내지 50 ㎍;
- 퍼탁틴: 1 내지 20 ㎍;
- 임의적으로, 핌브리아에: 2 내지 25 ㎍;
- 파상풍 톡소이드: 0.25 Lf 이상 내지 25 Lf 미만;
- 디프테리아 톡소이드: 0.25 Lf 이상 내지 50 Lf 미만; 및
임의적으로,
- B형 간염 표면 항원: 5 ㎍ 내지 25 ㎍
- 불활성화된 폴리오바이러스: 균주당 5 내지 45 D-항원 단위, 특히, 8 내지 40 D-항원 단위;
- 헤모필루스 인플루엔자 b형 다당류: 1 내지 20 ㎍.
이롭게는, 특정 조합 조성물은 0.5 ml의 면역원성 조성물 1회 용량이 하기의 것을 함유하는 것이다:
- 무독화된 형태로서 보르데텔라 독소, 특히, 보르데텔라 톡소이드, 특히, 백일해 톡소이드: 8 ㎍;
- 섬유질 헤마글루티닌: 8 ㎍;
- 퍼탁틴: 2.5 ㎍;
- 파상풍 톡소이드: 5 Lf;
- 디프테리아 톡소이드: 2.5 Lf.
구체적인 실시양태에서, 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물은 추가로 0.5 ml의 면역원성 조성물 1회 용량이 2.5 내지 600 ㎍의 CyaA 유래 폴리펩티드, 특히, 2.5 내지 500 ㎍, 2.5 내지 400 ㎍, 2.5 내지 300 ㎍, 2.5 내지 200 ㎍ 또는 2.5 내지 100 ㎍의 보르데텔라 페르투시스의 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하고, 바람직하게, 25 ㎍의 보르데텔라 페르투시스의 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함한다는 점을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 CyaA 유래 폴리펩티드의 면역조절제 기능을 관찰해 본 바, 면역원성 조성물의 정량적 조성은 특히 조성물의 용도에 맞게, 예컨대, 다회 용량 설정에서 추가 용량분으로서 사용될 때, 또는 프라임/부스트 백신 접종 스케줄을 위한 부스터 조성물로서 사용될 때, 그에 맞게 적합화될 수 있다.
면역원성 조성물 기능에서 CyaA 유래 폴리펩티드의 존재는, 조성물이 보르데텔라 종의 항원을 포함하는 활성 성분으로 구성된 무세포 면역원성 조성물일 때, 상기 CyaA 유래 폴리펩티드에 대한 항체를 유도하고, 면역 반응을 특히, IL-17의 생산을 포함하는 TH1/TH17 반응 쪽으로 배향시키는 것, 이 둘 모두를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 이는 백일해 뿐만 아니라, 보르데텔라 종, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 숙주의 감염과 인과 관계가 있는 각종 병태에 대한 방어, 예컨대, 숙주에 의한 또 다른 개체로의 박테리아 전파에 대한 방어 또는 감염된 숙주의 기도의 박테리아에 의한 콜로니 형성에 대한 방어에 도움이 되어야 한다.
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 TH2 반응의 애주번트를 비롯한, 여러 카테고리의 애주번트를 포함할 수 있다. 상기 애주번트는 하기 군들에서 선택될 수 있다:
· 알루미늄 염, 특히, 수산화알루미늄, 알루미늄 하이드록시포스페이트 술페이트 또는 인산알루미늄인 TH2 반응의 애주번트,
· MPL 함유 애주번트, 특히, AS15, AS01B, AS01D, 또는 AS01E(GSK 제공); CpG 함유 애주번트, 특히, AS15, QS21 함유 애주번트(GSK 제공), 특히, AS01B, D, 및 E 또는 AS15, 면역 자극 복합체(ISCOM), IC31 함유 애주번트, 키토산 함유 애주번트, 리포솜 제제 기반 애주번트, 특히, AS01B D, E 또는 AS15 또는 ISCOM, 지질 기반 에멀젼, 예컨대, MF59로 구성된 군에서 선택되는 TH1 반응의 애주번트,
· 하기의 것으로부터 선택되는 톨 유사 수용체의 리간드이거나, 또는 그를 함유하는, TH1 반응을 유도하는 애주번트:
- 톨 유사 수용체 4(TLR-4)의 리간드, 특히, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 글루코피라노실 지질 A(GLA), 또는
- 톨 유사 수용체 9(TLR-9)의 리간드, 특히, 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 및 더욱 특히, HBsAg-1018, 또는
- 톨 유사 수용체 3(TLR-3)의 리간드, 특히, 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 합성 유사체 및 더욱 특히, 폴리(I:C) 함유 조성물, 예컨대, 카복시메틸셀룰로스의 존재하의 폴리이노신-폴리시티딜산 + 폴리-L-리신 이중 가닥 RNA(폴리(ICLC)), 또는
- 톨 유사 수용체 2(TLR-2)의 리간드, 특히, 합성 지질펩티드 또는 재조합 지질단백질, 및
- 톨 유사 수용체 5(TLR-5)의 리간드, 특히, 재조합 박테리아 플라젤린.
본 발명의 면역원성 조성물의 한 측면에서, 보르데텔라의 CyaA 유래 폴리펩티드는
- 서열 번호 2에 기재된 보르데텔라 페르투시스 CyaA 단백질의 세그먼트 또는 단편으로서, 상기 단편의 서열은 서열 번호 2의 321번 위치 내지 387번 위치에 위치하는 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 마지막 잔기로 끝나는 것인 세그먼트 또는 단편, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 2 중 잔기 321 내지 마지막 잔기 또는 387 내지 마지막 잔기로 구성된 상기 세그먼트 또는 단편과 아미노산 잔기가 95% 이상 동일한 폴리펩티드 변이체에 융합된,
- 서열 번호 2에 기재된 보르데텔라 페르투시스 CyaA 단백질의 세그먼트 또는 단편으로서, 상기 세그먼트 또는 단편의 서열은 서열 번호 2의 첫 번째 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 183번 위치 내지 227번 위치에 위치하는 잔기로 끝나는 것인 세그먼트 또는 단편, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 2 중 잔기 1 내지 183 또는 1 내지 227로 구성된 상기 세그먼트 또는 단편과 아미노산 잔기가 95% 이상 동일한 폴리펩티드 변이체로 구성된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물을 포함하고, 분제, 재구성용 분제 및 액제, 액상 제제, 특히, 현탁제 또는 액제, 동결건조된 성분, 및 상기 투여 형태의 조합 중에서 선택되는 투여 형태로서 제공되는, 인간 숙주에게 투여하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 인간 숙주에게 투여하기 위한 의약 조성물의 1회 용량은 0.25 ml 내지 1 ml의 액상 제제, 특히, 재구성된 제품을 함유한다.
숙주에게 투여하는 데 다양한 투여 경로가 이용가능하며, 주사, 바람직하게는 근육내 주사를 포함한다.
본 발명은 또한
a) (i) (유전적으로 또는 화학적으로) 무독화된 형태의 백일해 독소(PT), 섬유질 헤마글루티닌(FHA), 퍼탁틴(PRN) 및 핌브리아에(Fim)로 구성된 군에서 선택되는 보르데텔라로부터의 항원들 중 1 이상 및 바람직하게, 처음 3개의 항원 또는 상기 항원 모두, (ii) (유전적으로 또는 화학적으로) 무독화된 형태의 파상풍 독소로 구성된, 클로스트리디움 테타니의 1 이상의 항원, (iii) (유전적으로 또는 화학적으로) 무독화된 형태의 디프테리아 독소로 구성된, 코리네박테리움 박테리아 복합체의 항원, 및 (iv) 본원에 개시된 실시양태 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 CyaA 유래 폴리펩티드, 및 임의적으로 (v) 결정된 병원체에 대한 면역 반응의 유도를 위한 활성 성분으로서, 하나 또는 여러 성분(들)으로서 제제화되는 상이한 병원체(들)의 추가 항원으로 구성된 군에서 선택되는 항원을 제공하는 단계, 및
b) 상기 성분(들)을, 백신을 숙주에게 투여하였을 때, 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 화합물, 예컨대, TH2 배향성 면역 반응의 애주번트(들), TH1 배향성 면역 반응의 애주번트, 또는 상기 애주번트의 조합과 혼합시키는 단계를 포함하고,
여기서, 단계 a) 및 b)는 임의적으로 단일 단계로서 수행되는 것인,
결정된 병원체, 또는 상기 병원체와 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어를 위한 활성 성분으로서, 상기 병원체의 항원, 및 추가로, 본원에서 정의된 바와 같은, 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)를 포함하는 면역원성 조성물(또한 본 개시내용의 목적을 위해 백신으로 명명됨)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
무독화된 형태의 파상풍 독소는 파상풍 톡소이드를 포함하고, 무독화된 형태의 디프테리아 독소는 디프테리아 톡소이드를 포함한다. 독소의 상기 무독화된 형태는 당업계에, 특히, 각각 파상풍 및 디프테리아에 대한 시판용 백신으로부터 공지되어 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 본 출원에 기술된 바와 같은 면역원성 조성물은 인간 숙주의 능동 면역화에서 사용하기 위한, 특히, 인간 숙주의 디프테리아, 파상풍에 대한, 페르투시스 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한, 및 임의적으로 B형 간염, 소아마비 및/또는 헤모필루스 인플루엔자 b형에 의해 유발되는 질환에 대한 방어를 위해 사용하기 위한 것이다.
면역원성 조성물이 보르데텔라 종의 항원을 함유하는 무세포 면역원성 조성물일 때, 상기 조성물은 인간 숙주의 능동 면역화에서 사용하기 위한, 특히, 인간 숙주의 페르투시스 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어를 위해 사용하기 위한 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 보르데텔라 균주에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대해 달성되는 방어는 백일해 뿐만 아니라, 보르데텔라 종, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 숙주의 감염과 인과 관계가 있는 각종 병태에 대한 방어, 예컨대, 박테리아 존속에 대한, 숙주에 의한 또 다른 개체로의 박테리아 전파에 대한 방어, 또는 감염된 숙주의 기도의 박테리아에 의한 콜로니 형성에 대한 방어일 수 있다.
본 발명은 또한 본 면역원성 조성물의 항원을 제공하는 병원체에 대한 방어, 또는 상기 병원체(들)에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어를 위한 능동 면역화를 위해 면역원성 조성물을 인간 숙주에게 투여하는 방법에 관한 것이다.
CyaA 유래 폴리펩티드를 비롯한 각종 항원의 연관으로부터 발생되는 그의 특성에 기인하여, 면역원성 조성물은 현재 이용가능한 제품으로는 이행되지 못하는 숙주의 방어의 다양한 요건에 상응하는 다양한 투여 방식으로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 면역원성 조성물 또는 의약 조성물은 제1 용량은 본원에 기술된 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하지 않는 것인, 제1 용량의 백신 조성물 이후, 특히, 제1 용량의 면역원성 조성물 이후의 투여를 위한 용량으로서 사용하기 위한 것일 수 있다. 제1 용량 이후에 투여되는 용량은 추가 프라이밍 용량이 일반적으로는 제1 용량 이후, 또는 바로 앞의 용량 후 수주 또는 6개월 미만의 시간이 경과된 시점에 투여되는 것인 다회 용량 설정의 프라이밍 용량이다. 제1 용량 이후에 투여되는 용량은 대안적으로, 또는 또한 부스팅 용량(들), 즉, 일반적으로, 다회 프라이밍 용량의 제1 용량 또는 마지막 용량 후 6개월 초과 또는 최대 수년 경과 시점에 투여되는 용량일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 용량과 상이한 제1 용량은 그의 항원 함량에서 상이하고, 특히, 비독성 CyaA 유래 폴리펩티드를 함유하지 않고, 특히, 본원에 기술된 바와 같은 CyaA 유래 폴리펩티드를 함유하지 않는다. 상기 상이한 제1 용량은 또한 항원 농도에서 상이할 수 있고, 특히, 이는 본 발명의 면역원성 조성물보다 더 높은 농도의 항원을 포함할 수 있다.
특히, 본원에 개시된 면역원성 조성물 또는 의약 조성물은 제1 용량 이후의 투여를 위한 용량으로서, 특히, (i) 다회 용량 설정의 제2 용량으로서 또는 추가 용량으로서, 또는 (ii) 파상풍, 디프테리아, 및 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태, 및 임의적으로 B형 간염, 소아마비 및 헤모필루스 인플루엔자 b형에 의해 유발되는 질환으로 구성된 군에서 선택되는 질환 중 1 이상에 대한 1가 또는 조합 백신으로 제1 백신 접종 용량 또는 1차 백신 접종을 이전에 받았던 개체에서의 부스터 용량으로서 사용하기 위한 것일 수 있다.
특정 실시양태에서, 부스터 용량은 제1 용량과, 또는 이전에 투여된 용량(들)(이전 용량)과 항원 조성에서, 및 임의적으로, 항원 농도에서 상이한데, 그 이유는 상기 제1 또는 이전 용량(들)은 본원에 기술된 바와 같은 비독성 CyaA 유래 폴리펩티드를 함유하지 않기 때문에, 특히, 어떤 형태의 (천연 또는 효소적으로 불활성 또는 무독화된 형태의) CyaA 폴리펩티드도 함유하지 않기 때문이다. 그에 반해, 상기 이전 용량은 백일해 톡소이드(PT), 섬유질 헤마글루티닌(FHA), 퍼탁틴(PRN) 및 핌브리아에(Fim) 중에서 선택되는 보르데텔라 종의 하나 이상의 항원, 특히, 백일해 톡소이드(PT), 섬유질 헤마글루티닌(FHA) 및 퍼탁틴(PRN) 항원을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 부스터 용량은, 숙주가 4세 초과인 아동, 11세 초과의 청소년, 또는 성인, 특히, 노인, 임산부 또는 임산부와 가까운 친척인 숙주(예컨대, WHO에 의해 정의된 "코쿠닝 전략법(cocooning strategy)"에서 권장됨)이고, 상기 숙주는, 1가 백일해 백신으로서, 또는 백일해에 대한 조합 백신으로서 투여되는, 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 상이한 무세포 백신으로 이미 1차 백신 접종을 받은 상태인, 프라임/부스트 백신 접종 스케줄에서 부스터 용량으로서 사용하기 위한 것으로 권고될 수 있다.
또 다른 특정 실시양태에서, 숙주는 출생시 또는 그 이후의, 특히, 18개월까지의 아동이다.
본 발명의 상세한 설명
면역원성 조성물에(또는 면역 반응을 유도하는 그의 활성 성분에) 적용되는 " 방어 "라는 표현은 능동 면역화를 위해 상기 면역원성 조성물이 투여된 숙주, 특히, 인간 숙주에서 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 조성물의 능력으로서, 여기서, 상기 면역 반응은 (i) 조성물의 항원 모두 또는 그의 일부에 특이적인 반응을 포함하고, (ii) 면역계의 사이토카인 및 항체, 특히, 중화 항체의 발현을 포함하는 것인 능력에 관한 것이고, 그를 정의하는 것이다. 그 결과, 면역 반응은 조성물의 항원을 제공하는 병원체(들)에 의한 감염에 대해, 또는 상기 병원체와 인과 관계가 있는 병태에 대해 효과적이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 방어 반응은 예방적 반응, 예컨대, 예방 백신에 의해 달성되는 반응이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 치료적 방어일 경우, 즉, 이는 감염의 병적 결과를 완화시키거나, 또는 막는다. 따라서, 유도된 면역 반응은 능동 면역화가 요구되는 병원체(들)에 의해 유발되는 질환 또는 병태의 발병 또는 발생을 막고, 특히, 병원체의 침습 단계를 막거나, 그의 다른 숙주로의 전파를 막거나, 또는 적어도 상기 질환의 임상 증상이 발생하지 못하도록 막는다. 이롭게는, 방어는 또한 숙주의 예방 백신 접종일 수 있다.
면역원성 조성물이 방어하는 적응증으로는 보르데텔라 균주, 특히, 비. 페르투시스에 의한 인간 숙주의 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대해, 또는 보르데텔라 예컨대, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 다른 균주에 대해 방어가 제공되는 적응증을 포함한다. 방어, 특히, 예방적 방어를 유도할 수 있는 능력은 조성물 중에 함유되어 있는, 보르데텔라 기원의 항원의 조합의 면역원성의 입증에, 및 상기 항원을 사용하여 유도된 반응과, 백일해에 대한 종래 무세포 백신(aP로 명명), 또는 백일해에 대한 전세포 백신(WCV로 명명)으로 유도된 반응의 비교에 기초한다. 특히, 면역 조성물에 의해 보르데텔라에 대하여, 특히, 비. 페르투시스에 대하여 유발된 면역 반응은 개체의 장기간 지속되는 방어에 바람직한 TH1 및/또는 TH17 배향성 면역 반응을 포함한다.
방어 조합의 특정 측면은 백일해에 대한 방어 이외에도, 보르데텔라의 항원에 의해 유발되는 방어는 침습성 감염의 예방, 박테리아에 의한 전파, 또는 숙주의 기도의 콜로니 형성의 예방으로 확장될 수 있다는 점이다. TH1 및/또는 TH2 배향성인 반응을 일으킬 수 있는 면역원성 조성물의 능력은 상기 강조된 바와 같이, 백일해 예방 이상의 면역 반응으로 확장시킬 수 있는 상기 조성물의 능력의 요인이 될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위해 사용되는 CyaA 유래 폴리펩티드의 특정 실시양태는 폴리펩티드의 구조와 관련하여 이후 내용에서 기술한다.
상기 언급된 바와 같이, CyaA 유래 폴리펩티드는 보르데텔라 페르투시스의 야생형 CyaA 단백질의 아미노산 서열을 나타내는 서열 번호 2의 서열과 관련하여 정의될 수 있다. 추가로, 서열 번호 2에 기재된 CyaA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1에 기재되어 있는 바와 같고, 이는 본 발명의 면역원성 조성물에서 사용되는 CyaA 유래 폴리펩티드를 발현하는 단편을 정의하기 위해 사용될 수 있다. 서열 번호 2에 기재된 CyaA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 또 다른 특정 실시양태는 서열 번호 1 서열의 변형된 버전, 예컨대, 서열 번호 2의 아미노산을 변이시키지 않는 변형에 의해 수득된 서열이다. 서열 번호 1의 특정의 변형된 버전은 서열 번호 24에 기재된 바와 같은, 이. 콜라이에서의 발현에 최적화된 서열이다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드으로부터 수득될 수 있는 본 발명의 생성된 CyaA 유래 폴리펩티드는 천연 CyaA의 2개의 세그먼트를 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 따라서, 특정 실시양태에서, 상기 CyaA 유래 폴리펩티드는 바람직하게, 보르데텔라 페르투시스로부터의, 동일한 보르데텔라 CyaA 단백질 기원의, 함께 융합되거나, 또는 재조합된, 두 단편의 발현물일 수 있다. "단편"이란, 야생형 보르데텔라 CyaA 단백질의 서열에서 발견되는 연속 아미노산 잔기의 스트레치 또는 연쇄를 의미한다. 천연 CyaA 기원의 융합된 단편의 생산 세포에서의 발현물은 그의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 발현된 아미노산 서열의 번역 후 변형이 진행될 수 있게 하는 보르데텔라의 cyaC 유전자의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 함께 공동으로 사용함으로써 수득된다.
따라서, "CyaA 유래 폴리펩티드"는 CyaA로부터 유래된 융합된 세그먼트의 발현된 아미노산 서열, 및 번역 후 변형이 진행된 것일 수 있는 상기 생성물을 포함한다. 그렇게 수득된 아미노산 서열은 원래의 CyaA 단백질, 예컨대, 서열 번호 2의 CyaA로부터의 (특히 아미노산 잔기 227 내지 321 사이의 세그먼트를 포함하거나, 또는 그로 구성된) 아미노산 잔기의 연속 세그먼트의 결실에 의해 유도된 폴리펩티드를 제공한다. 발현물은 또한 비. 페르투시스의 CyaA 유래 폴리펩티드의 변이체, 특히, 서열 번호 2의 CyaA로부터 수득된 CyaA 유래 폴리펩티드의 변이체에 관한 것이다. 따라서, 이롭게는, 본 발명을 수행하는 데 사용되는 상기 "CyaA 유래 폴리펩티드"는 그의 잔기 중 1 이상, 특히, 2개의 잔기 중 적어도 하나, 바람직하게, 비. 페르투시스, B. 힌지이(B. hinzii) 또는 B. 파라페르투시스(B. parapertussis) CyaA의 전장 서열의 860번 및 983번 위치에 위치하는 잔기에 상응하거나, 또는 B. 브론키셉티카(B. bronchiseptica) CyaA의 전장 서열의 859번 및 982번 위치에 위치하는 잔기에 상응하는 2개의 리신 잔기 중 적어도 하나의 번역 후 아실화에 의해 변형된다. 본원에서 "아실화"란, 팔미토일화, 즉, 본 발명을 위해 사용되는 CyaA 유래 폴리펩티드의 잔기(들) 상에 팔미테이트 및/또는 팔미톨리에이트 기(들)의 부가를 의미한다. 따라서, 상기 "CyaA 유래 폴리펩티드"는 잔기 중 일부, 바람직하게, 두 잔기 중 하나, 또는 비. 페르투시스, B. 힌지이 또는 B. 파라페르투시스 CyaA의 전장 서열의 860번 및 983번 위치에 위치하는 잔기에 상응하거나, 또는 B. 브론키셉티카 CyaA의 전장 서열의 859번 및 982번 위치에 위치하는 잔기에 상응하는 2개의 리신 잔기 중 하나에 팔미토일 기를 보유한다. "~에 상응하는"이란, 본 발명의 CyaA 유래 폴리펩티드에서 번역 후 변형된 잔기(들)는 그의 위치가 비. 페르투시스의 CyaA, B. 힌지이 또는 B. 파라페르투시스 CyaA의 서열(각각 서열 번호 2, 4 및 6) 중 리신 860 및 983, 및 B. 브론키셉티카 CyaA의 서열(서열 번호 8) 중 리신 859 및 982에 매칭되는 것(들)이라는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질 중의 상기 리신 잔기의 확인은 당업자에 의해, 본 발명의 단백질의 서열을 서열 번호 2, 4, 6 또는 8에 정의된 것과 같은 서열과 정렬하고, 비교함으로써 수행될 수 있다.
팔미토일화 프로세스는 당업자로부터 널리 공지되어 있고, 이는 보르데텔라 종의 cyaC 유전자, 바람직하게, 그의 천연 서열이 서열 번호 21에 기재되어 있는 것인 보르데텔라 페르투시스 CyaC 코딩 서열의 cyaC 유전자에 의해 매개된다. 이. 콜라이에서의 생산을 위해 최적화된 CyaC 코딩 서열 버전은 서열 번호 22에 기재되어 있다. 이러한(이들) 번역 후 변형(들)은 CyaA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 cyaC 유전자의 공동 발현에 의해 수득될 수 있다.
상기 제공된 CyaA 유래 폴리펩티드의 정의에 따르면, (CyaA 유래 폴리펩티드의 N 말단부에 위치하는) 제1 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 첫 번째 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 183번 위치 내지 227번 위치에 위치하는 잔기로 끝난다.
상기 제1 세그먼트 또는 단편의 크기는 183 내지 227개의 잔기 범위이고, 즉, 183개 이상의 잔기 길이이고, 227개 이하의 잔기 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 세그먼트 또는 단편의 길이는 183개 이상, 190개 이상, 200개 이상, 210개 이상, 또는 220개 이상의 잔기 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 세그먼트 또는 단편의 크기는 183개의 잔기이거나, 또는 227개의 잔기이다.
따라서, 상기 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 첫 번째 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 잔기 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226 및 227로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 끝난다.
다시 말해, 상기 제1 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 잔기 1-183, 1-184, 1-185, 1-186, 1-187, 1-188, 1-189, 1-190, 1-191, 1-192, 1-193, 1-194, 1-195, 1-196, 1-197, 1-198, 1-199, 1-200, 1-201, 1-202, 1-203, 1-204, 1-205, 1-206, 1-207, 1-208, 1-209, 1-210, 1-211, 1-212, 1-213, 1- 214, 1-215, 1-216, 1-217, 1-218, 1-219, 1-220, 1-221, 1- 222, 1-223, 1-224, 1-225, 1-226 및 1-227로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 상기 제1 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 잔기 1 내지 227, 또는 서열 번호 2의 잔기 1 내지 183을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 상기 제1 세그먼트 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드 세그먼트 또는 단편의 길이가 3 배수라고 하면, 서열 번호 1, 또는 서열 번호 24의 첫 번째 뉴클레오티드로 시작하여 서열 번호 1, 또는 서열 번호 24의 549번 위치 내지 681번 위치에 위치하는 뉴클레오티드로 끝난다. 따라서, 상기 세그먼트 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1, 또는 서열 번호 24의 잔기 1-549, 1-552, 1-555, 1-558, 1-561, 1-564, 1-567, 1-570, 1-573, 1-576, 1-579, 1-582, 1-585, 1-588, 1-591, 1-594, 1-597, 1-600, 1-603, 1-606, 1-609, 1-612, 1-615, 1-618, 1-621, 1-624, 1-627, 1-630, 1-633, 1-636, 1-639, 1- 642, 1-645, 1-648, 1-651, 1-654, 1-657, 1-660, 1-663, 1- 666, 1-669, 1-672, 1-675, 1-678 및 1-681로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
(CyaA 유래 폴리펩티드의 C 말단부) 제2 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 321번 위치 내지 387번 위치에 위치하는 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 마지막 잔기로 끝난다.
상기 제2 세그먼트 또는 단편의 크기는 1320 내지 1386개의 잔기 범위이고, 즉, 1320개 이상의 잔기 길이이고, 1386개 이하의 잔기 길이이다. 특정 실시양태에서, 상기 세그먼트 또는 단편은 1320개 이상, 1330개 이상, 1340개 이상, 1350개 이상, 1360개 이상, 1370개 이상, 또는 1380개 이상이다. 특정 실시양태에서, 상기 제2 세그먼트 또는 단편의 크기는 1320개의 잔기이거나, 또는 1386개의 잔기이다.
따라서, 상기 제2 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 잔기 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 및 387로 구성된 군으로부터 선택되는 잔기로 시작하여, 서열 번호 2의 마지막 잔기(즉, 잔기 1706)로 끝난다.
다시 말해, 상기 제2 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 잔기 321-1706, 322-1706, 323-1706, 324-1706, 325-1706, 326-1706, 327-1706, 328-1706, 329-1706, 330-1706, 331-1706, 332-1706, 333-1706, 334-1706, 335-1706, 336-1706, 337-1706, 338-1706, 339-1706, 340-1706, 341-1706, 342-1706, 343-1706, 344-1706, 345-1706, 346-1706, 347-1706, 348-1706, 349-1706, 350-1706, 351-1706, 352-1706, 353-1706, 354-1706, 355-1706, 356-1706, 357-1706, 358-1706, 359-1706, 360-1706, 361-1706, 362-1706, 363-1706, 364-1706, 365-1706, 366-1706, 367-1706, 368-1706, 369-1706, 370-1706, 371-1706, 372-1706, 373-1706, 374-1706, 375-1706, 376-1706, 377-1706, 378-1706, 379-1706, 380-1706, 381-1706, 382-1706, 383-1706, 384-1706, 385-1706, 386-1706 및 387-1706으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 상기 제2 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 잔기 321-1706, 또는 서열 번호 2의 잔기 387-1076을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, 상기 제2 세그먼트 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 폴리뉴클레오티드 세그먼트 또는 단편의 길이가 3 배수라고 하면, 서열 번호 1, 또는 서열 번호 24의 961번 위치 내지 1159번 위치에 위치하는 뉴클레오티드로 시작하여 서열 번호 1, 또는 서열 번호 24의 마지막 뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 5118)로 끝난다. 따라서, 상기 제2 세그먼트 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 69의 잔기 961-5118, 964-5118, 967-5118, 970-5118, 973-5118, 976-5118, 979-5118, 982-5118, 985-5118, 988-5118, 991-5118, 994-5118, 997-5118, 1000-5118, 1003-5118, 1006-5118, 1009-5118, 1012-5118, 1015-5118, 1018-5118, 1021-5118, 1024-5118, 1027-5118, 1030-5118, 1033-5118, 1036-5118, 1039-5118, 1042-5118, 1045-5118, 1048-5118, 1051-5118, 1054-5118, 1057-5118, 1060-5118, 1063-5118, 1066-5118, 1069-5118, 1072-5118, 1075-5118, 1078-5118, 1081-5118, 1084-5118, 1087-5118, 1090-5118, 1093-5118, 1096-5118, 1099-5118, 1102-5118, 1105-5118, 1108-5118, 1111-5118, 1114-5118, 1117-5118, 1120-5118, 1123-5118, 1126-5118, 1129-5118, 1132-5118, 1135-5118, 1138-5118, 1141-5118, 1144-5118, 1147-5118, 1150-5118, 1153-5118, 1156-5118 및 1159-5118로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 실시양태에서, CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 2의 잔기 321 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 2의 잔기 1 내지 227로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 10인, 서열 번호 10에 기재된 바와 같은 서열의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
또 다른 특정 실시양태에서, CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 2의 잔기 387 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 2의 잔기 1 내지 183으로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 12인, 서열 번호 12에 기재된 바와 같은 서열의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
다른 특정 실시양태 또한 개시된다:
- CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 19에 기재된 바와 같은 서열의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 즉, 서열은 서열 번호 2의 잔기 387 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 2의 잔기 1 내지 227로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성되고,
- CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 20에 기재된 바와 같은 서열의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 그로 구성되고, 즉, 서열은 서열 번호 2의 잔기 321 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 2의 잔기 1 내지 183으로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된다.
단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, "~에 융합된"이라는 표현은 펩티드 세그먼트 또는 단편(예컨대, 수개의 CyaA 세그먼트 또는 단편)이 함께 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 이들 상이한 펩티드 부분들의 순서는 본원에서 N 말단에서 C 말단으로, 즉, 한 부분의 마지막 C 말단 잔기가 나머지 다른 한 부분의 첫 번째 N 잔기에 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 것으로 기술된다. 폴리뉴클레오티드를 언급할 때, "~에 융합된"이라는 표현은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 부분(예컨대, 수개의 뉴클레오티드 CyaA 세그먼트 또는 단편)이 함께 포스포디에스테르 결합에 의해 공유적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 이들 상이한 뉴클레오티드 부분들의 순서는 본원에서 5'에서 3'으로, 즉, 한 부분의 마지막 3' 뉴클레오티드가 나머지 다른 한 부분의 첫 번째 5' 뉴클레오티드에 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 있는 것으로 기술된다. 뉴클레오티드 서열의 융합으로 구성된 폴리뉴클레오티드는 특히, 유지되는 세그먼트 사이에 있는, cyaA의 천연 코딩 서열 내 뉴클레오티드의 결실에 의한 것을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드로서 수득된다. CyaA 유래 폴리펩티드는 세포, 예컨대, 박테리아, 특히, 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현의 결과로서 수득될 수 있고, 폴리펩티드를 발현하는 폴리뉴클레오티드는 유전적 재조합에 의해, 또는 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 정부를 사용하여 서열의 합성에 의해 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 상기 제1 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2에 기재된 보르데텔라 페르투시스 CyaA 단백질의 결정된 세그먼트 또는 단편과 95% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드이고, 상기 세그먼트 또는 단편의 서열은 서열 번호 2의 첫 번째 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 183번 위치 내지 227번 위치에 위치하는 잔기로 끝나는 것이고/거나, 여기서, 상기 제2 세그먼트 또는 단편은 서열 번호 2의 321번 위치 내지 387번 위치에 위치하는 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 마지막 잔기로 끝나는 세그먼트 또는 단편과 95% 이상의 동일성을 가지는 변이체인 것인 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, "95% 이상의 동일성을 가지는 변이체"란, 그의 아미노산 동일성이 그의 변이 기점이 되는 폴리펩티드와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 단백질 서열을 의미한다. 동일성(%)은 상기 변이체와 상기 참조 폴리펩티드, 둘 모두의 전장 서열을 비교하여, 특히 두 서열 중 더 짧은 것 대비로 계산된다. 따라서, 하나 이상의 부가(들) 및/또는 하나 이상의 결실(들) 및/또는 하나 이상의 치환(들)에 의해 폴리펩티드의 잔기와 변이체의 잔기의 5%가 상이할 때, 변이체는 폴리펩티드와 95%의 동일성을 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 변이체는 상기 폴리펩티드와 치환, 바람직하게는 보존적 치환에 의해서만 상이하며, 따라서, 이는 그의 변이 기점이 되는 서열과 동일한 길이를 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 변이체는 상기 폴리펩티드와 1 이상의 단일 아미노산 결실, 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단일 아미노산 결실(들)에 의해, 및 치환, 바람직하게는 보존적 치환에 의해 상이하다.
본 발명은 또한 서열 번호 1의 일부분(또는 단편)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 75% 이상의 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 변이체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 첫 번째 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 뉴클레오티드 단편의 길이가 3 배수라고 하면, 서열 번호 1의 첫 번째 뉴클레오티드로 시작하여 서열 번호 1의 549번 위치 내지 681번 위치에 위치하는 뉴클레오티드로 끝나는 폴리뉴클레오티드와 75%의 동일성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 독립적으로 또는 상기 기재 내용과 조합하여, 상기 두 번째 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 뉴클레오티드 단편의 길이가 3 배수라고 하면, 서열 번호 1의 첫 번째 뉴클레오티드로 시작하여 서열 번호 1의 961번 위치 내지 1159번 위치에 위치하는 뉴클레오티드로 시작하여 서열 번호 1의 마지막 뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드 5118)로 끝나는 폴리뉴클레오티드와 75%의 동일성을 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 세그먼트 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 그의 전장 서열이 서열 번호 1과 75% 이상의 동일성을 가지는 것인 폴리뉴클레오티드 기원의 것이다. 상기 변이체의 예는 서열 번호 24이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 상기 개시된 바와 같은 서열 번호 1로부터 수득되는 폴리뉴클레오티드에, 또는 서열 번호 24의 폴리뉴클레오티드에 적용되는 유전자 코드의 축퇴성으로부터의 결과이다. 특정 실시양태에서, 따라서, 수득된 폴리뉴클레오티드 변이체는 워블(wobble) 위치에 축퇴된 염기를 가진다.
폴리뉴클레오티드를 언급할 때, "75% 이상의 동일성을 가지는 변이체"란, 그의 뉴클레오티드 동일성이 그의 변이 기점이 되는 폴리뉴클레오티드와 75% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 동일성(%)은 상기 변이체와 그의 변이 기점이 되는 폴리뉴클레오티드, 둘 모두의 전장 서열을 비교하여, 특히 두 서열 중 더 짧은 것 대비로 계산된다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레오티드 부가(들) 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드 결실(들) 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환(들)에 의해 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드와 그의 뉴클레오티드의 25%가 상이할 때, 변이체는 폴리뉴클레오티드와 75%의 동일성을 가진다. 특정 실시양태에서, 상기 변이체는 뉴클레오티드 치환에 의해서만 상이하며, 따라서, 이는 그의 변이 기점이 되는 서열과 동일한 길이를 유지한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 변이체는, 그 중 일부가 침묵 돌연변이인 것인 뉴클레오티드 치환에 의해서만 상이하며, 이로써, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체에 의해 코딩되는 단백질의 서열은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 95% 이상의 동일성을 가지거나, 또는 100%의 동일성을 가진다.
본원에서 명시된 바와 같은 뉴클레오티드 및 단백질 동일성(%)은 (Needleman) 및 (Wunsch) 알고리즘에 기반한 널리 공지된 프로그램, 예컨대, MeAlign에 의해 계산될 수 있다[18].
특정 실시양태에서, 본원에서 사용하는 데 적합한 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드는 표적 세포에 결합하고/거나, 그의 아데닐레이트 사이클라제(AC) 도메인을 표적 세포의 세포 기질로 이동시킬 수 있는 그의 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포는 CD11b 발현 세포, 즉, 그의 표면 상에 CD11b/CD18 수용체를 발현하는(CD11b+) 세포이다. 특히, 이들 세포는 과립구/호중구, 대식세포, NK 세포, T CD8+의 서브세트, B 세포의 서브세트, 수지상 세포, 예컨대, 랑게르한스 세포, 또는 골수성 수지상 세포이다.
표적 세포에 결합할 수 있는 본 발명의 변이체의 능력은 특히 EP03291486, 또는 WO02/22169 출원에 개시된 방법에 따라 검정될 수 있다. 추가로, 그의 N 말단 도메인을 세포 기질로 이동시킬 수 있는 변이체의 능력은 WO02/22169에 기술된 방법, 또는 p105 펩티드를 이용한 실시예 A에 상세히 설명된 방법을 적용하여 검정될 수 있다.
보르데텔라 페르투시스 CyaA 단백질의 전장 야생형 서열인 서열 번호 2의 단백질로부터 수득되는 CyaA 유래 폴리펩티드의 바람직한 변이체는 서열 번호 4(보르데텔라 힌지이의 CyaA 단백질), 서열 번호 6(보르데텔라 파라페르투시스의 CyaA 단백질) 및 서열 번호 8(보르데텔라 브론키셉티카의 CyaA 단백질)에 기재된 서열 번호 4(보르데텔라 힌지이의 CyaA 단백질), 서열 번호 6(보르데텔라 파라페르투시스의 CyaA 단백질) 및 서열 번호 8(보르데텔라 브론키셉티카의 CyaA 단백질)에 기재된 그의 아미노산 서열을 참조로 하여 본원에서 제공되는 다른 보르데텔라 종의 CyaA 단백질로부터 수득된다. 서열 번호 4, 6 및 8을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 3, 5 및 7에 기재되어 있거나, 또는 침묵 돌연변이에 의한 서열 번호 3, 5 및 7의 변이체이다. 따라서, 서열 번호 2의 서열을 참조로 하여 수득된 폴리펩티드의 변이체인, 본 발명을 수행하기 위한 CyaA 유래 폴리펩티드는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 아미노산 서열로부터 수득되고, 본 발명의 목적을 위해 서열 번호 2에서 정의된 세그먼트와 상기 서열의 정렬에 의해 정의되는, 본원에 개시된 바와 같이 융합된 세그먼트 또는 단편이다.
본 발명을 수행하기 위해 정의된 CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 2, 4, 6 및 8을 포함하지 않거나, 또는 그로 구성되지 않는다. 또한, 본 발명을 수행하는 데 적합한 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3, 5 및 7을 포함하지 않거나, 또는 그로 구성되지 않는다.
본 발명을 수행하는 데 적합하고, 제공된 정의에 따른 보르데텔라 페르투시스 CyaA 및 비. 페르투시스의 것과 등가인 단편의 융합으로부터 수득되고, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이 중 임의의 것의 CyaA의 아미노산 서열로부터 수득되는 그의 변이체의 두 세그먼트 또는 단편의 융합으로부터 생성되는 특정의 CyaA 유래 폴리펩티드 하기 폴리펩티드들로 구성된 군으로부터 선택된다:
서열 번호 10에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 10의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 폴리펩티드 변이체;
서열 번호 12에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 12의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 변이체,
서열 번호 19에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 19의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 변이체,
서열 번호 20에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 20의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 변이체.
CyaA 유래 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 및 제조
본 발명의 특정 실시양태에서, 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드, 바람직하게, 본원에 정의된 바와 같은 비. 페르투시스 CyaA 유래 폴리펩티드의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용되고, 상기 폴리뉴클레오티드는
(b) 각각 서열 번호 4, 6 또는 8에 기재된 바와 같은 보르데텔라 CyaA 단백질의 세그먼트 또는 단편로서, 상기 세그먼트 또는 단편의 서열은 서열 번호 4, 6 또는 8의 321번 위치 내지 387번 위치에 위치하는 잔기로 시작하여 서열 번호 4, 6 또는 8의 마지막 잔기로 끝나는 것인 세그먼트 또는 단편에 융합된,
(a) 서열 번호 4, 6 또는 8에 기재된 바와 같은 보르데텔라 CyaA 단백질의 세그먼트 또는 단편로서, 상기 세그먼트 또는 단편의 서열은 서열 번호 4, 6 또는 8의 첫 번째 잔기로 시작하여 서열 번호 4, 6 또는 8의 183번 위치 내지 227번 위치에 위치하는 잔기로 끝나는 것인 세그먼트 또는 단편을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드를 코딩한다.
서열 번호 2의 단편을 포함하는 특정 CyaA 유래 폴리펩티드에 대하여 상기 제공된 정의가 서열 번호 4 및 6의 단편을 포함하는 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드에 동일하게 적용된다.
서열 번호 8의 단편을 포함하는 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드와 관련하여, 모든 정의는 동일하게 적용되되, 단, 예외적으로, 서열 번호 8의 마지막 잔기는 잔기 1706 대신 잔기 1705이다. 그러므로, 서열 번호 8의 세그먼트 또는 단편을 포함하는 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드의 경우, 잔기 1706을 언급하는 모든 측면은 잔기 1705에 의해 대체될 수 있다. 특히, 제2 세그먼트 또는 단편의 크기는 1319 내지 1385개의 잔기 범위이고, 바람직하게는, 11319개의 잔기 또는 1385개의 잔기 길이이다. 서열 번호 8의 세그먼트 또는 단편을 포함하는 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 뉴클레오티드 5118을 언급하는 모든 정의 및 실시양태는 뉴클레오티드 5115에 의해 대체되어야 한다.
본 발명을 수행하는 데 적합한 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 특정 폴리뉴클레오티드는 하기 폴리뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된다:
1) 서열 번호 4의 잔기 321 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 4의 잔기 1 내지 227로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 13인, 서열 번호 13에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
2) 서열 번호 4의 잔기 387 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 4의 잔기 1 내지 183으로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 14인, 서열 번호 14에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
3) 서열 번호 6의 잔기 321 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 6의 잔기 1 내지 227로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 15인, 서열 번호 15에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
4) 서열 번호 6의 잔기 387 내지 1706으로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 6의 잔기 1 내지 183으로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 16인, 서열 번호 16에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
5) 서열 번호 8의 잔기 321 내지 1705로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 8의 잔기 1 내지 227로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 17인, 서열 번호 17에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
6) 서열 번호 8의 잔기 387 내지 1705로 구성된 세그먼트 또는 단편에 융합된 서열 번호 8의 잔기 1 내지 183으로 구성된 세그먼트 또는 단편으로 구성된 서열 번호 18인, 서열 번호 18에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 CyaA 유래 폴리펩티드 또는 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전장 보르데텔라 CyaA 코딩 뉴클레오티드 서열의 결실된 버전, 즉, 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 결실 단편으로 구성된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기서, 결실은, 그의 첫 번째 아미노산 잔기는 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184 내지 잔기 228에 위치하고, 그의 마지막 아미노산 잔기는 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320 내지 잔기 386에 위치하는 아미노산 세그먼트를 커버하는 천연 서열의 세그먼트를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드로서 정의될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는, 그의 첫 번째 아미노산 잔기가 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227 및 228로 구성된 군으로부터 선택되고, 그의 마지막 아미노산 잔기가 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385 또는 386로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 결실된 것인, 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 결실된 버전으로 구성된 폴리펩티드를 코딩한다.
CyaA 유래 폴리펩티드, 특히, 본원에 기술된 바와 같은 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법 또한 본 발명의 일부분이다. 본 방법은 (a) 서열 번호 2, 4, 6 또는 8에 기재된 보르데텔라 CyaA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터, 상기 서열 내 연속 뉴클레오티드 잔기의 뉴클레오티드 단편을 결실시키는 단계로서, 상기 단편의 처음 3개의 뉴클레오티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184 내지 잔기 228에 위치하는 아미노산 잔기를 코딩하고, 상기 단편의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320 내지 잔기 386에 위치하는 아미노산 잔기를 코딩하는 것인 단계, 및 (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 회수하는 단계를 포함한다.
대안적으로, CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 종래 방법을 이용하여, 원하는 CyaA 유래 폴리펩티드 서열에 따라, 및 임의적으로, 유전자 코드의 축퇴성 및/또는 발현의 최적화를 고려하여 화학적으로 합성된다.
본 발명은 또한 상기와 같이 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CyaA 유래 폴리펩티드를 사용한다. 특정 CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20에서 기재된 서열로 구성된다.
변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 비롯한, CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서, 특히, 박테리아 세포에서, 특히, 이. 콜라이에서 상기 CyaA 유래 폴리펩티드, 즉, 비. 페르투시스 CyaA 유래 폴리펩티드 또는 그의 변이체 CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 데 사용된다.
CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은
(a) 서열 번호 2, 4, 6 또는 8에 기재된 보르데텔라 CyaA를 코딩하거나, 또는 서열 번호 2와 95% 이상의 동일성을 가지는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 뉴클레오티드 세그먼트 또는 단편을 결실시키는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 세그먼트 또는 단편의 처음 3개의 뉴클레오티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184 내지 잔기 228에 위치하는 아미노산 잔기를 코딩하고, 상기 뉴클레오티드 세그먼트 또는 단편의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320 내지 잔기 386에 위치하는 아미노산 잔기를 코딩하는 것인 단계; 및
(b) CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 회수하는 단계를 포함한다.
CyaA 유래 폴리펩티드를 제조하는 방법은
(a) 서열 번호 2, 4, 6 또는 8에 기재된 보르데텔라 CyaA를 코딩하거나, 또는 서열 번호 2와 95% 이상의 동일성을 가지는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 뉴클레오티드 단편을 결실시키는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 단편의 처음 3개의 뉴클레오티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184 내지 잔기 228에 위치하는 아미노산 잔기를 코딩하고, 뉴클레오티드 단편의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320 내지 잔기 386에 위치하는 아미노산 잔기를 코딩하는 것인 단계;
(b) 세포에서, 특히, 박테리아 세포에서, 및 특히, 이. 콜라이에서 (a)에서 수득된 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
(c) 상기 발현된 CyaA 유래 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
CyaA 유래 폴리펩티드를 제조하는 방법은 상기와 같이 수득된 것 및 CyaC 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 구성물로 조합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 25의 서열을 가지는 플라스미드 pGTP-gtCyaAd93-CyaCopt를 이용하여 상기 세포에서 발현된다.
본 발명 내에서, "처음 3개의 뉴클레오티드" 또는 "마지막 3개의 뉴클레오티드"라고 언급할 때, 이들 3개의 뉴클레오티드는 유전자 코드에 따라 서열 번호 2, 4, 6 또는 8 중의 그의 위치에 확인되는 아미노산 잔기에 상응하는 코돈을 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 뉴클레오티드 결실의 크기는 바람직하게 3 배수이다. 또한, 크기가 3 배수인 것 이외에도, 폴리뉴클레오티드 뉴클레오티드 결실은 프레임 내에 있고, 즉, 결실은 리딩 프레임을 변경하지도 않고, 결실 주위(상류 및 하류)의 잔기도 변경하지 않으면서, 원하는 아미노산 잔기를 제거한다.
CyaA 유래 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물로서 폴리뉴클레오티드를 제조하는 것은 특히, WO 2014/016310에 기술되어 있고, 이는 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, CyaA 유래 폴리펩티드 및 CyaC 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드 구성물 5' 말단에서 3' 말단으로, 유리하게는, 결정된 숙주 또는 생산 세포, 예컨대, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화된 서열로 구성된 cyaA 폴리뉴클레오티드 또는 유전자, 및 유리하게는, 결정된 숙주 또는 생산 세포, 예컨대, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화된 서열로 구성된 cyaC 폴리뉴클레오티드 또는 유전자를 포함한다. 구성물 내 폴리뉴클레오티드의 상기와 같은 삽입 순서는 CyaA의 번역 후 변형된 버전의 발현 효율을 증가시키는 데 적합한 각각의 정량과 구조로 CyaA 유래 폴리펩티드 및 CyaC 단백질의 발현을 유리하게 한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 야생형 보르데텔라 CyaA 단백질에서 수행된 [그의 첫 번째 아미노 잔기는 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184 내지 잔기 228에 위치하고, 그의 마지막 아미노산 잔기는 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320 내지 잔기 386에 위치하는] 세그먼트 또는 단편의 결실을 제외하면, 본 발명을 수행하는 데 적합한 CyaA 유래 폴리펩티드는 서열 번호 2, 4, 6 또는 8과 비교하여 임의의 다른 변이 (부가, 결실, 및/또는 치환)가 이루어지지 않는다. 그의 아미노산 서열의 결과로서, CyaA 유래 단백질은 비독성, 특히, 비세포독성이고, 즉, 그의 효소적 활성인 아데닐레이트 사이클라제는 그의 첫 번째 아미노 잔기는 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 184 내지 잔기 228에 위치하고, 그의 마지막 아미노산 잔기는 각각 서열 번호 2, 4, 6 또는 8의 잔기 320 내지 잔기 386에 위치하는 세그먼트 또는 단편의 결실(따라서, 세그먼트 또는 단편의 결실은 93개 이상의 아미노 잔기로 이루어진 단편의 결실이다)의 결과로서 불활성화되어 있다. 그러므로, 특정 실시양태에서, 어떤 삽입, 결실 또는 치환도 수행되지 않은 것이다. 특히, CyaA의 잔기 188 및 189가 본 발명의 단백질에 여전히 그대로 존재할 때, 잔기 188과 189 사이에는 어떤 디펩티드(예컨대, 디펩티드 LQ 또는 GS)도 삽입되지 않는다.
본 발명의 실시양태의 추가 특징 및 특성은 하기 실시예 및 도에서 자명해질 것이다.
도 1: Tdap+/- GTL003으로 백신 접종한 이후의 사이토카인 반응: 근육내 경로
히스토그램 결과는 동물 4마리의 평균 회상 반응을 나타내는 것이다. 동물 4마리의 비장세포를 함께 풀링하고, 이중으로 배양하였다. 각 결과는 이중 웰의 평균 반응이다. 다중 비드 기반 ELISA를 사용하여 사이토카인의 수준을 분석하였고, 이중 웰 사이의 편차율(%)(CV)은 20% 미만이었다. 오차 막대는 이중 웰의 CV(%)를 나타내는 것이다.
도 1a:
Tdap로 프라이밍되고, Tdap로 또는 Tdap + GTL003으로 부스팅된 동물의 사이토카인 반응.
흰색 막대: Tdap 프라임 + Tdap 부스트
회색 막대: Tdap 프라임 + Tdap+GTL003 부스트.
도 1b:
Tdap로 프라이밍되고, WCV로 또는 Tdap + GTL003으로 부스팅된 동물의 사이토카인 반응.
흰색 막대: Tdap 프라임 + tdap+GTL003 부스트
회색 막대: Tdap 프라임 + WCV 부스트.
도 2:
Tdap+/- GTL003으로 백신 접종한 이후의 사이토카인 반응: 복강내 경로.
히스토그램 결과는 동물 4마리의 평균 회상 반응을 나타내는 것이다. 동물 4마리의 비장세포를 함께 풀링하고, 이중으로 배양하였다. 각 결과는 이중 웰의 평균 반응이다. 다중 비드 기반 ELISA를 사용하여 사이토카인의 수준을 분석하였고, 이중 웰 사이의 편차율(%)(CV)은 20% 미만이었다. 오차 막대는 이중 웰의 CV(%)를 나타내는 것이다.
도 2a:
Tdap로 프라이밍되고, Tdap로 또는 Tdap + GTL003으로 부스팅된 동물의 사이토카인 반응.
흰색 막대: Tdap 프라임 + Tdap 부스트
회색 막대: Tdap 프라임 + tdap+GTL003 부스트.
도 2b:
Tdap로 프라이밍되고, WCV로 또는 Tdap + GTL003으로 부스팅된 동물의 사이토카인 반응.
흰색 막대: Tdap 프라임 + tdap+GTL003 부스트
회색 막대: Tdap 프라임 + WCV 부스트
도 3:
Tdap 또는 Tdap+GTL00으로 면역화한 이후의 사이토카인 반응: 복강내
애주번트가 첨가된 Tdap 단독으로, 애주번트가 첨가된 Tdap+GTL003으로 백신 접종받은 동물에서 측정된 INF-g 면역 반응.
Tdap에 함유되어 있는 항원, 또는 Tdap + GTL003에 함유되어 있는 항원을 이용하여 시험관내 재자극을 수행하였다.
도 4:
Tdap 또는 Tdap+GTL00으로 면역화한 이후의 사이토카인 반응: 복강내
애주번트가 첨가된 Tdap 단독으로, 애주번트가 첨가된 Tdap+GTL003으로 백신 접종받은 동물에서 측정된 IL-17 면역 반응.
도 5:
(근육내 백신 접종으로부터의) 이소타이핑 결과
· 결과는 두 동물 각각의 2개의 풀로부터의 것이다.
· 히스토그램은 평균 GMT를 나타낸다.
· 오차 막대는 상기 역가의 95% CI를 나타낸다.
· 예상대로 풀 대 풀 간의 편차가 관찰되었다.
· IM 경로에서, 효과는 혼합된 Th1/Th2였다.
도 5a:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 백일해 독소-IgG1 항체.
도 5b:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 백일해 독소-IgG2a 항체.
도 5c:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 백일해 독소-IgG2b 항체.
도 5d: Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 백일해 독소-IgG3 항체.
도 6:
(근육내 백신 접종으로부터의) 이소타이핑 결과
· 결과는 두 동물 각각의 2개의 풀로부터의 것이다.
· 히스토그램은 평균 GMT를 나타낸다.
· 오차 막대는 상기 역가의 95% CI를 나타낸다.
· 예상대로 풀 대 풀 간의 편차가 관찰되었다.
· IM 경로에서, 효과는 혼합된 Th1/Th2였다.
도 6a:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 FHA-IgG1 항체.
도 6b:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 FHA-IgG2a 항체
도 6c:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 FHA-IgG2b 항체.
도 6d:
Tdap로 프라임 및 Tdap, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스트 이후의 FHA-IgG3 항체.
도 7:
GTL003(gtCyaad93)의 플라스미드 지도.
도 8:
플라스미드 서열(서열 번호 25).
실시예
Figure pct00003
1. 물질 및 방법
1.1. 마우스
13-23 g의 암컷/수컷 NIH 마우스를 인도 혈청 연구소(Serum Institute of India) 동물 하우스에서 근친 교배시켰다. 식수 및 사료를 무제한 제공하면서 병원체가 없는 조건하에서 마우스를 하우징하였다. 동물 및 그의 관리를 포함하는 절차는 국내 및 국제 법 및 정책을 준수하고, 지역 윤리 위원회에 의해 리뷰된 SIIL의 가이드라인을 따랐다.
1.2. 백신
Tdap 백신의 제조 및 제제화
TdaP 백신은 개별적으로 흡수되는 항원, 즉, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 섬유질 헤마글루티닌 및 퍼탁틴의 블렌드이다. 파상풍 성분은 클로스트리디움 테타니에 의해 생산된 독소의 화학적 무독화에 의해 제조된, 정제된 톡소이드이다. 파상풍 톡소이드는 발효 기술을 이용하여 반합성(육류 무함유) 배지 중에서 상기 클로스트리디움 테타니 균주의 성장에 의해 생산되는 독소로부터 제조된다. 디프테리아 톡소이드는 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae)를 사용하여 제조된다. 독소를 농축시키고, 부분적으로 정제한 후, 이어서, 무독화시킨다. 이이서, 톡소이드를 추가로 정제하여 정제된 디프테리아 톡소이드를 제조한다.
대량 무세포 백일해는 비감염성이고, 3개의 정제된 백일해 항원, 즉, 백일해 톡소이드, 섬유질 헤마글루티닌 및 퍼탁틴의 멸균 조합물로 구성된다. 발효 후, 크로마토그래피 정제에 이어서, 톡소이드의 화학적 무독화가 수행된다. 백일해 독소(PT) 및 섬유질 헤마글루티닌(FHA)은 발효 공정 동안 분비되는 세포외 단백질로서 제조되며, 상기 발효 공정에서는 퍼탁틴(69 kDa 외막 단백질)으로서 세포로부터 추출된다.
Tdap는 항원이 감염된 버전의 무세포 백일해 기반 DTaP 백신이다. 1991년 12월 17일, 최초의 무세포 백일해 백신, 즉, 레들레(lederle)에 의한 Acel-이뮨(Acel-imune)이 제4 및 제5 부스터 백신으로서 허가를 받았다. 이들 백신은 고전적 백신이다.
GTL003의 구성 및 정제
이. 콜라이에서의 발현을 위해 야생형 CyaA의 DNA 서열(CyaAwt: 진뱅크(GeneBank): CAE41066.1)을 최적화시키고, 합성하였다(GeneCust). 최적화된 DNA 서열을 gtCyaA라고 명명한다.
이어서, pTAC 유도가능 프로모터를 함유하는 pGTPc608 플라스미드(GTP Technology(프랑스 라베쥬 소재)에 의해 제공받은 플라스미드)에 gtCyaA를 삽입하였다.
효소적 제한/라이게이션에 의해 aa 227 내지 321 사이에 gtCyaA 중 93 aa 결실을 생성하였다. 수득된 아미노산 서열은 아미노산 잔기 227 내지 아미노산 잔기 321의 세그먼트가 결실된, 서열 번호 2의 서열로부터 유래된 것이다.
정제 프로토콜은 이미 EP1 576 967 B1에서 기술되었다.
1.3. 백신 제제 및 투여
3개의 백신을 사용하여 마우스를 백일해에 대해 백신 접종하였다. 모든 백신에 완충제 중 수산화알루미늄을 애주번트로서 첨가하였다. WCV에는 애주번트를 첨가하지 않았다.
Figure pct00004
본 실험에서 사용된 WCV는 마우스에 주사되는 비. 페르투시스 용량당 0.5 IU(알룸 부재)에 상응한다.
GTL003 함유 백신에서, 주사 전에 25 ㎍의 GTL003을 Tdap 백신 제제에 첨가하였다. 프라임 부스트 프로토콜에서, 0일째 및 28일째 동일한 경로, 즉, im, ip 또는 sc를 통해 2회에 걸쳐 마우스에 백신 접종하였다.
Figure pct00005
1.4. 사이토카인 반응 프로파일링
보고된 방법을 사용하여 대조군 및 처리군으로부터 비장 세포를 단리시켰다. 간략하면, 시린지 플러저를 이용하여 비장을 파쇄시켜 비장세포를 수득하였다. 생성된 비장세포를 (0.15 M NH4Cl, 10 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.3)을 이용하여 용해시켰다. 비장세포를 GTL003의 존재 및 부재하에 백일해 항원의 존재하에 RPMI 1640(2 mM L-글루타민, 10% FCS) 중 96시간 동안 4 X 106개의 세포/웰로 96시간 동안 배양하였다. 세포 상청액을 수집하고, 시판용 다중 비드 기반 면역검정법 키트를 이용하여 제조사의 설명서(Bio-Rad Laboratories: 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)에 따라 사이토카인 수준을 분석하였다.
1.5. 체액성 면역 반응 프로파일링
다중 비드 기반 면역검정법을 이용하여 항체 역가 측정 및 이소타이핑을 수행하였다. 상이한 비드 영역을 나타내는 색 코딩된 카복실화된 미소구를 루미넥스 라보라토리즈(Luminex Laboratories)로부터 입수하였다. 정제된 백일해 항원(PT 독소, 퍼탁틴 및 FHA)을 본질적으로 (van Gageldonk et al.)(25)에 의해 기술된 바와 같이 상이한 활성화된 비드에 커플링시켰다. 루미넥스 테크놀러지즈(Luminex technologies)로부터 입수한 상업적으로 이용가능한 키트를 이용하여 항원을 비드에 커플링시켰다. 키트는 EDC 및 술포-NHS 화학법에 의한 비드의 활성화에 기초한다. 산타 크루즈(Santa cruz)로부터 입수한 피코에리트린(RPE) 접합된 항마우스 전체 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 항체를 본 검정법을 위해 사용하였다. 정제된 백일해 항원은 인도 혈청 연구소(Serum Institute of India Ltd.)로부터 입수하였다. 종래 ELISA를 사용하여 GTL003에 대한 체액성 반응을 분석하였다. 간략하면, 최적화된 농도의 GTL003을 플레이트를 코팅하는 데 사용하였다. 혈청 샘플을 첨가하고, 항마우스 효소 접합된 항체를 이용하여 포획된 항체를 검출하였다. 컷 오프 OD보다 더 높은 반응을 보이는 항체의 최고 희석률로서 역가를 측정하였다.
1.6. 호흡기와 관련된 시험감염
시험 백신 및 참조 백신으로부터의 0.5 ml를 이용하여 각 군의 6마리의 마우스에 복강내로 접종하였다(문헌 [Mills et al. 1998], [Xing et al. 1999]). 21일째, 비내 시험감염을 사용하여 비. 페르투시스 현탁액(2 X 108 CFU/ml)을 각 마우스에 점적 주입하였다. 시험감염 후 7일째에 감염된 마우스를 희생시켰다. 생존가능한 계수 측정(콜로니 형성 단위 - CFU)을 위해, 각 동물의 폐를 제거 후, 균질화시키고, BG 상에 플레이팅하고, 37℃에서 5일 동안 인큐베이션시켰다.
1.7 Tdap 백신에서의 파상풍 및 디프테리아 항체 역가에 대해 GTL003이 미치는 영향에 관한 평가
본 실험은 하기 디자인에 따라 수행하였다:
Figure pct00006
수득된 결과는 하기와 같았다:
Figure pct00007
1.8 Tdap 백신과 함께 제제화되고, 부스터 백신으로서 투여되었을 때, Th1 사이토카인(IFN-감마) 수준에 대해 GTL003이 미치는 효과
Tdap 백신 및 Tdap + GTL003의 반복 투여가 IFN-감마 수준에 미치는 효과를 검정하기 위해, 하기 시험을 수행하였다:
Figure pct00008
중앙값은 동물 6마리로부터 얻은 데이터를 나타내는 것이다(2개의 비장 각각 3개의 상이한 풀에서 프로세싱된 비장). 비장세포를 aP 항원(각각 10 ㎍씩)의 혼합물로 자극시키고(400만 개의 세포/웰), 사이토카인 분석을 위해 96시간째 상청액을 수집하였다.
2. 결과
2.1. Tdap로 프라임 및 Tdap + GTL003으로 부스트 이후의 마우스 면역 반응
프라이밍된 마우스에서 유도되는 면역 반응에 대해 부스터 백신 접종에서의 GTL003이 미치는 영향을 사정하기 위해, 0일째, 동물을 알룸 애주번트가 첨가된 Tdap를 1회 주사하여 프라이밍하였고, 28일째, 상기 마우스는, 제제에 GTL003이 첨가 또는 첨가되지 않은, 알룸 애주번트가 첨가된 Tdap를 함유하는 부스트 주사를 맞았다. 또 다른 군에서, 0일째, 동물을 알룸 애주번트가 첨가된 Tdap를 1회 주사하여 프라이밍하였고, 28일째, 상기 마우스는, 알룸 부재하의 전세포 백신을 함유하는 부스트 주사를 맞았다. 하기 3개의 주사 경로를 시험하였다: 근육내(IM), 복강내(IP) 및 피하(SC).
2.1.1. 사이토카인 면역 반응: Th1 / Th17 배향성 면역 반응
수산화알루미늄 애주번트가 첨가된 Tdap 백신 접종을 받은 사람에서 wP 백신 접종에 의해 유도된 것보다 더욱 현저한 Th2 및 더 낮은 Th1 면역 반응이 발생한다. 이는 상기 면역이 TH1 및 TH17 유형의 면역 반응을 유도하는 경향이 더 큰 WCV로 백신 접종을 받은 사람에서의 면역과 비교하였을 때 더욱 빠르게 약화되기 때문인 것으로 사료된다(10, 15). (Bancroft)
IM 면역화
Tdap로 프라이밍되고, Tdap 단독으로 부스팅된 동물과 비교하여, Tdap/알룸 IM 주사에 의해 프라이밍되고, Tdap/알룸 + GTL003으로 부스팅된 동물에서 더 높은 항원 특이적 IFN-g 면역 반응 뿐만 아니라, 더 높은 항원 특이적 IL-17 면역 반응이 발생하였다. 항원 자극을 받은 비장 세포에 의해 분비되는 IL-4 또는 IL5 수준 대 IFN-g 수준 사이의 비율을 계산함으로써 상기 TH1/TH2 비의 부스터의 영향을 사정하였다.
Figure pct00009
표 3에 제시된 바와 같이, 놀랍게도, 부스터 중 GTL003 첨가는 면역 반응을 Th1 면역 반응으로 편향시켰고, 즉, GTL003을 포함하지 않는 TdaP 부스트와 비교하여 IFNg/IL-4 및 IFNg/IL-5 비를 증가시켰다. 흥미롭게도, IL-17 반응 또한 증가하였다.
이어서, 본 발명자들이 Tdap+ GTL003 부스트 대 WCV 부스트에 첨가되었을 때의 GTL003이 Th1 면역 반응에 미치는 효과를 비교해 본 결과, IFNg 면역 반응은 Tdap+GTL003으로 부스팅된 동물에서 더 높은 반면(하기 표 4), Il-17은 등가이다.
Figure pct00010
IFNg/IL-4 비 및 IFNg/IL-5 비를 검토해 본 결과, 이는 WCV 부스트와 비교하여 Tdap+GTL003 부스트에서 Th1로 더욱 편향된 반응인 것으로 나타났다.
IP 면역화 :
복강내 경로를 통해 동일한 면역화를 수행하였다. 놀랍게도, 결과는 IM 경로를 통해 진행된 것과 동일하지 않았다. Tdap 프라임/Tdap+GTL003 부스트와 비교하였을 때, Tdap 프라임/Tdap 부스트가 더욱 우수한 TH1 프로파일을 유도하였다. Tdap 부스트 중 GTL003 첨가(하기 표 5) 또는 부스트에 WCV 첨가(하기 표 6)시 반응이 TH1로 편향되는 것은 관찰되지 않는다.
Figure pct00011
마지막으로, IP 경로를 통해 진행된, WCV 부스트와 Tdap+GTL003 부스트를 비교하였을 때, WCV 부스트를 통해 약간 더 우수한 IFNg 및 IL-17 면역 반응이 이루어질 수 있었다(하기 표 6). 그럼에도 불구하고, 전반적인 반응은 Th2 편향성을 보였다.
Figure pct00012
SC 면역화 :
사이토카인 반응에 있어서 Tdap 프라임/Tdap 부스트 대 Tdap 프라임/tdap+GTL003 부스트 사이에는 어떤 유의적인 차이도 관찰되지 않았다.
2.1.1. 체액성 면역 반응
Tdap로 백신 접종받고, Tdap+GTL003 또는 WCV로 부스팅된 동물의 혈청 중에서 FHA, 및 PT에 대한 항체 반응을 측정하였다.
FHA 특이적 항체 :
Tdap+GTL003으로 부스팅된 동물은 약간 감소된 IgG1 항체 반응을 보였고, IgG2a는 거의 보이지 않았으며, IgG2b 및 IgG3 수준 증가를 나타내었는 바, 이를 통해 Ab 반응은 혼합된 Th1/Th2 프로파일이되, GTL003의 존재하에서는 Th1 IgG 이소타입 반응으로 편향되는 성향을 보인다고 말할 수 있다.
WCV로 부스팅된 동물에서는 유사한 패턴의 반응이 발생하였지만, 단, 예외적으로, IgG1 Ab 수준에는 변함이 없었지만, IgG2b ab 수준은 급격히 증가한 것으로 나타났다.
PT 특이적 항체 :
Tdap + GTL003 부스트 이후의 Th2 IgG1 이소타입 반응 감소를 측정하였다. IgG2a Ab는 동일하였고, IgG2b 및 IgG3 Ab는 감소하였다. WCV로 부스팅된 동물에서 유사한 패턴의 반응을 얻었다.
PRN 특이적 항체 :
PRN 특이적 IgG 수준은 모든 백신 조건하에 대하여 사용된 희석액에서 본 발명자들의 검정법의 검출 한계 미만이었다.
GTL003 특이적 항체 :
WCV로 진행된 경우보다 Tdap + GTL003으로 진행된 부스팅 이후에 항GTL003 IgG 역가는 유의적으로 더 높다. 이는 WCV보다는 GTL003 함유 백신 부스트가 백일해에 대하여 더욱 우수한 항CyaA 매개 방어를 제공할 것이라는 것을 시사하는 것이다.
Figure pct00013
2.2. wP 또는 TDAP 단독으로 진행된 것과 비교하여, TDAP + GTL003으로 백신 접종받은 마우스의 방어
0일째, BalbC 마우스를 복강내로 wP, Tdap 단독, 또는 GTL003의 용량을 증가시켜 가면서(10 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍ 및 100 ㎍) GTL003과 함께 Tdap로 백신 접종하였다. 하기 표 8에 제시된 바와 같이 3가지 희석액을 시험하였다. 보르데텔라 페르투시스 균주로 백신 접종한 후 21일 경과하였을 때, 동물을 시험감염시켰다. 시험감염 후 7일째, 페르투시스 콜로니 형성의 존재에 대해 폐를 분석하였다.
Figure pct00014
Tdap + GTL003 백신은 비. 페르투시스에 대하여 Tdap 단독보다는 전반적으로 더 우수한 방어, 및 WCV와는 등가이거나, 또는 그보다 우수한 방어를 유도한다. 백신 희석액 10의 경우, Tdap+ 10 ㎍ GTL003 뿐만 아니라, 25 (1028 CFU) 및 50 ㎍ (2625 CFU) GTL003도 역시, Tdap 단독 및 WCV와 비교하였을 때, 방어가 관찰되었다.
GTL003의 존재하에서의 방어 획득을 이해하기 위해 Tdap+GTL003의 단일 복강내 주사 이후의 면역 반응 분석을 수행하였다.
2.3. Tdap + GTL003을 이용한 단일 투약의 백신 접종 이후의 마우스 면역 반응
2.3.1 체액성 면역 반응
하기 표에 제시된 바와 같이, 수산화알루미늄 애주번트가 첨가된 Tdap 단독 또는 GTL003의 용량을 증가시키면서 그와의 혼합된 애주번트가 첨가된 Tdap를 이용하여 4개의 마우스 군에 백신 접종하였다.
Figure pct00015
GTL003을 함유하는 백일해 백신으로 면역화된 마우스 군에서만 오직 PT, FHA 및 PRN에 대한 항체가 약간 증가한 것이 관찰되었다.
CyaA에 대한 항체 생산을 비교하면, WCV로 백신 접종받은 동물에 비해 애주번트가 첨가된 Tdap + GTL003으로 백신 접종받은 동물의 경우, 반응이 더 높았다.흥미롭게도, WCV는 야생형 CyaA를 함유한다.
Figure pct00016
2.3.2 비장 및 대식세포에 의한 사이토카인 생산
애주번트가 첨가된 Tdap + GTL003 또는 Tdap 단독 또는 WCV로 백신 접종받은 마우스로부터의 시험관내에서의 Ap 항원으로 재자극을 받은 비장 세포에 의해 분비된 사이토카인을 시험감염되지 않은 마우스, 즉, 백신 접종 후 생 비. 페르투시스에 의한 생체내 시험감염이 이루어지지 않은 마우스에서 분석하였다.
Figure pct00017
Tdap 백신에의 25 또는 50 ㎍ 농도의 GTL003 첨가는 TH1 및 TH17 면역 반응 증가를 유도한다. 예상 밖으로, Tdap 단독으로 백신 접종받은 마우스와 비교하였을 때, GTL003은 주사가 복강내로 수행되는 동안, 자극을 받은 비장 세포에서 일산화질소(NO)에 대해 동일한 항원 특이적 효과를 유도한다. 이전 실험에서, NO는 주사 부위에 대식세포의 동원에 기인하여 예상될 수 있는 복강내 주사 이후 복강 대식세포 자극 후에 증가하는 것으로 나타났다.
백신 백신 접종받은 마우스에서 생 비. 페르투시스로 진행된 비내 시험감염 이후에 GTL003의 Tdap 백신에의 첨가가 미치는 효과에 대해서도 동일한 결론이 도출된다.
Figure pct00018
GTL003을 함유하지 않는, 애주번트가 첨가된 Tdap와 비교하여, GTL003 함유의 애주번트가 첨가된 Tdap + GTL003으로 백신 접종받은 군에서 면역 반응의 전반적으로 극적인 증가가 관찰되었다. 이러한 반응은 WCV와 등가이거나, 또는 그보다 우수하였다. IFN-g, IL17 및 일산화질소의 강력한 증가가 관찰되었다.
Tdap 항원 또는 Tdap+GTL003에 의한 자극 이후의 IFN-g 분석 결과, 모든 항원에 대한 반응은 GTL003 함유 백신으로 면역화된 군에서 증가된 것으로 나타났다.
IL-17의 경우, 측정된 사이토카인 수준은 GTL003의 존재하에서 더 높았고, 10 내지 25 ㎍의 GTL003에서 증가되었다(도 3a). 예상 밖으로, Tdap+GTL003으로 백신 접종받은 상기 동물에서의 반응 증가는 GTL003 특이적인 것이었다(도 4b).
결론:
상기의 결과들은 GTL003이 알루미늄인 Th2 애주번트를 함유하는 Tdap 백신에 포함되었을 때, 백일해 항원에 대한 Th1 면역 반응을 증강시킬 수 있는 GTL003의 능력을 최초로 제시하는 것이다.
· 상기 효과는, 문헌상의 보고에 따르면 예상되지 못했던 것으로서, GTL003이 Tdap 부스트에 존재할 때, 근육내 주사 이후에 관찰되고;
· 상기 효과는, WCV보다 우수한 사이토카인 및 체액성 반응으로 뒷받침되는, 더욱 우수한 동물 방어를 허용하면서, 단일 복강내 주사(시험감염 검정법에서 백신 접종의 표준 경로) 이후에 관찰되고; 이 또한 알루미늄의 존재하에서는 예상되지 못한 것이다.
2.4 GTL003이 Tdap 백신 중 파상풍 및 디프테리아 항체 역가에 미치는 영향 평가
GTL003은 파상풍 및 디프테리아 항체 역가에는 어떤 간섭 효과도 없다는 것을 수득된 데이터로부터 관찰하게 되었다. GTL003 처리군의 역가는 대조군 Tdap 백신에서 관찰된 역가와 유사하였다.
2.5 GTL003이 Tdap 백신과 함께 제제화되고, 부스터 백신으로서 투여되었을 때, Th1 사이토카인(IFN-감마) 수준에 미치는 효과
다회 용량으로 Tdap를 투여하면, 과도한 Th2 편향성을 일으키며, IFN-감마 수준의 유의적인 감소가 관찰되었다. 그에 반해, 부스팅 시점에 Tdap와 함께 GTL003을 투여한 것은 심지어 Tdap 투약 횟수를 증가시킨 경우에도, 처리군에서 IFN-감마 수준의 유의적인 하락을 막았다. 따라서, 이를 통해 부스터 용량의 백신으로의 GTL003의 투여가 반응을 Th1 반응으로 편향시킨다는 것을 확인할 수 있다.
참고문헌
Figure pct00019
Figure pct00020
SEQUENCE LISTING <110> GENKYOTEX Serum Institute of India Private Limited <120> Immunogenic composition comprising CyaA-derived polypeptide promoting a TH1/TH17-oriented immune response <130> B12224A-AD/SDU <140> PCT/EP2017/XXXXXX <141> 2017-12-22 <150> EP 16306822.4 <151> 2016-12-27 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5121 <212> DNA <213> Bordetella pertussis (wild type CyaA) <220> <221> CDS <222> (1)..(5121) <400> 1 atg cag caa tcg cat cag gct ggt tac gca aac gcc gcc gac cgg gag 48 Met Gln Gln Ser His Gln Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Arg Glu 1 5 10 15 tct ggc atc ccc gca gcc gta ctc gat ggc atc aag gcc gtg gcg aag 96 Ser Gly Ile Pro Ala Ala Val Leu Asp Gly Ile Lys Ala Val Ala Lys 20 25 30 gaa aaa aac gcc aca ttg atg ttc cgc ctg gtc aac ccc cat tcc acc 144 Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Val Asn Pro His Ser Thr 35 40 45 agc ctg att gcc gaa ggg gtg gcc acc aaa gga ttg ggc gtg cac gcc 192 Ser Leu Ile Ala Glu Gly Val Ala Thr Lys Gly Leu Gly Val His Ala 50 55 60 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ctcaatccca ccgacgactt cgcggcactg 60 ggcaatattg cctggctgtg gatgaactct cccatgcacc gcgactggcc ggtgcatctg 120 ctcgcacgca acacgctcgc gccgattcaa ctgggccaat acattctgct gcgatgcaat 180 gacgtgccgg ttgcatactg cagctgggcc ctaatggacg ccgacaccga actctcctat 240 gtcatggcgc cctcgtcgct gggcgggaat gcctggaact gcggcgaccg actgtggatc 300 atcgactgga tcgcgccatt ctcgcgcgac gacaatcgtg cgctgcgccg cgcgctggcc 360 gaacggcacc ccgacagcgt gggccgttcg ctgcgcgttc ggcgcggcgg cgacaccgcg 420 cgcgtcaagg agtaccgagg ccgcgcgctg gacgcggccg ccgctcgcgc gcagctggac 480 cgctaccatg ccgaactgat cgcaggactg cgcgcgagca acggcggata cgcgccgcga 540 ggccggggca ccgcctga 558 <210> 22 <211> 558 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized version of CyaC nucleotide coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(558) <400> 22 atg ctg ccg tct gca cag gcg ccg tct ctg ctg aat cca act gat gac 48 Met Leu Pro Ser Ala Gln Ala Pro Ser Leu Leu Asn Pro Thr Asp Asp 1 5 10 15 ttc gct gcg ctg ggt aac atc gcg tgg ctg tgg atg aac agc ccg atg 96 Phe Ala Ala Leu Gly Asn Ile Ala Trp Leu Trp Met Asn Ser Pro Met 20 25 30 cac cgt gac tgg ccg gtt cac ctg ctg gca cgt aac acg ctg gcg ccg 144 His Arg Asp Trp Pro Val His Leu Leu Ala Arg Asn Thr Leu Ala Pro 35 40 45 atc cag ctg ggt caa tac atc ctg ctg cgt tgt aac gac gtg cct gtg 192 Ile Gln Leu Gly Gln Tyr Ile Leu Leu Arg Cys Asn Asp Val Pro Val 50 55 60 gcg tat tgc tcc tgg gca ctg atg gat gcg gat acc gag ctg tcc tac 240 Ala Tyr Cys Ser Trp Ala Leu Met Asp Ala Asp Thr Glu Leu Ser Tyr 65 70 75 80 gtt atg gcc cca tct agc ctg ggc ggt aac gct tgg aac tgc ggc gat 288 Val Met Ala Pro Ser Ser Leu Gly Gly Asn Ala Trp Asn Cys Gly Asp 85 90 95 cgt ctg tgg atc att gat tgg att gct ccg ttt agc cgt gac gac aac 336 Arg Leu Trp Ile Ile Asp Trp Ile Ala Pro Phe Ser Arg Asp Asp Asn 100 105 110 cgt gct ctg cgt cgc gcg ctg gcc gaa cgt cat ccg gat tct gtt ggc 384 Arg Ala Leu Arg Arg Ala Leu Ala Glu Arg His Pro Asp Ser Val Gly 115 120 125 cgt tcc ctg cgc gta cgt cgc ggt ggc gac acc gct cgc gtc aaa gaa 432 Arg Ser Leu Arg Val Arg Arg Gly Gly Asp Thr Ala Arg Val Lys Glu 130 135 140 tac cgt ggt cgt gct ctg gac gca gcg gcg gcc cgc gct cag ctg gac 480 Tyr Arg Gly Arg Ala Leu Asp Ala Ala Ala Ala Arg Ala Gln Leu Asp 145 150 155 160 cgc tac cac gca gaa ctg att gcc ggt ctg cgt gca tcc aat ggc ggt 528 Arg Tyr His Ala Glu Leu Ile Ala Gly Leu Arg Ala Ser Asn Gly Gly 165 170 175 tat gct ccg cgt ggc cgt ggc acc gca taa 558 Tyr Ala Pro Arg Gly Arg Gly Thr Ala 180 185 <210> 23 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Met Leu Pro Ser Ala Gln Ala Pro Ser Leu Leu Asn Pro Thr Asp Asp 1 5 10 15 Phe Ala Ala Leu Gly Asn Ile Ala Trp Leu Trp Met Asn Ser Pro Met 20 25 30 His Arg Asp Trp Pro Val His Leu Leu Ala Arg Asn Thr Leu Ala Pro 35 40 45 Ile Gln Leu Gly Gln Tyr Ile Leu Leu Arg Cys Asn Asp Val Pro Val 50 55 60 Ala Tyr Cys Ser Trp Ala Leu Met Asp Ala Asp Thr Glu Leu Ser Tyr 65 70 75 80 Val Met Ala Pro Ser Ser Leu Gly Gly Asn Ala Trp Asn Cys Gly Asp 85 90 95 Arg Leu Trp Ile Ile Asp Trp Ile Ala Pro Phe Ser Arg Asp Asp Asn 100 105 110 Arg Ala Leu Arg Arg Ala Leu Ala Glu Arg His Pro Asp Ser Val Gly 115 120 125 Arg Ser Leu Arg Val Arg Arg Gly Gly Asp Thr Ala Arg Val Lys Glu 130 135 140 Tyr Arg Gly Arg Ala Leu Asp Ala Ala Ala Ala Arg Ala Gln Leu Asp 145 150 155 160 Arg Tyr His Ala Glu Leu Ile Ala Gly Leu Arg Ala Ser Asn Gly Gly 165 170 175 Tyr Ala Pro Arg Gly Arg Gly Thr Ala 180 185 <210> 24 <211> 5121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the wild type CyaA protein of Bordetella pertussis, optimized for E. coli expression <400> 24 atgcagcagt cccatcaggc cggttacgca aacgcagccg atcgtgaatc tggtatcccg 60 gcagcggttc tggatggtat taaggcagtt gccaaagaga agaacgctac cctgatgttc 120 cgtctggtca acccacactc tacttccctg atcgcggaag gtgtggcgac caaaggcctg 180 ggtgtgcacg ccaaaagcag cgactggggt ctgcaggcag gttatattcc ggtgaacccg 240 aatctgtcta aactgttcgg tcgtgccccg gaggtgatcg cacgtgcaga caacgatgtc 300 aactcttctc tggcgcatgg tcacaccgcg gttgatctga ccctgtccaa agaacgcctg 360 gattacctgc gtcaggcggg cctggtgacg ggcatggccg acggtgttgt agcgagcaac 420 cacgcgggtt atgaacaatt tgagtttcgc gttaaagaga cctctgacgg tcgttacgcg 480 gtgcagtacc gccgcaaagg tggcgatgac tttgaagctg tcaaagtgat cggtaacgct 540 gctggaattc cgctgaccgc ggatatcgac atgtttgcca tcatgcctca cctgtccaac 600 tttcgcgatt ccgcacgcag ctctgtgacg tctggtgatt ccgtcactga ctacctggct 660 cgtacccgtc gtgcggcctc tgaagccact ggtggtctgg atcgtgaacg cattgacctg 720 ctgtggaaaa tcgcccgtgc cggtgcgcgc tctgctgttg gtaccgaagc acgccgccaa 780 tttcgttacg acggcgatat gaacatcggt gtgatcacgg attttgaact ggaagttcgc 840 aatgccctga accgtcgtgc acacgcggtc ggcgcgcagg acgttgttca gcacggtacg 900 gagcagaata acccgttccc agaagcggac gaaaagatct ttgttgtgtc tgccaccggt 960 gaatcccaga tgctgactcg tggccagctg aaagaataca tcggccaaca gcgtggcgaa 1020 ggctacgttt tctacgagaa tcgtgcttac ggcgttgcgg gcaaatccct gttcgacgat 1080 ggtctgggcg ctgcaccggg cgttccgagc ggccgttcta aattcagccc ggacgtactg 1140 gaaactgtgc cggcttcccc gggcctgcgc cgtccgtccc tgggcgcagt cgaacgtcag 1200 gactccggct acgattccct ggatggcgtt ggctcccgct ccttctccct gggcgaggtt 1260 tctgacatgg ctgcggtgga agcggcagag ctggaaatga cccgtcaagt gctgcacgcg 1320 ggcgcacgtc aggacgatgc tgagccgggc gtgtccggtg cgtctgcaca ctggggtcaa 1380 cgtgccctgc agggtgctca agctgtcgcg gcagcgcagc gtctggtaca tgcgatcgca 1440 ctgatgaccc agttcggtcg cgcaggttct accaacactc ctcaggaagc agctagcctg 1500 tctgctgctg ttttcggtct gggcgaagcg tcttctgcgg ttgcagaaac cgtgagcggt 1560 ttcttccgtg gttctagccg ctgggcgggt ggttttggtg tagcaggtgg cgctatggcc 1620 ctgggtggcg gtatcgcggc tgctgtcggc gcaggtatga gcctgaccga cgatgctcct 1680 gcgggccaga aagccgcagc tggcgctgaa atcgcgctgc agctgactgg tggtaccgtt 1740 gaactggcta gctctatcgc gctggctctg gcagcggcac gtggcgtgac ttctggcctg 1800 caagtcgccg gtgcctctgc gggcgctgct gcgggcgctc tggcagctgc actgtccccc 1860 atggaaatct acggtctggt acagcagtct cactacgcag accagctgga taaactggcg 1920 caggagtctt ctgcatacgg ttacgaaggc gacgcactgc tggcgcagct gtatcgtgac 1980 aaaactgctg ctgaaggtgc tgtggcaggc gtttctgcgg tactgtctac cgttggcgct 2040 gcggtttcta ttgcggctgc cgcatccgtt gtaggtgcgc cggttgctgt agttacctct 2100 ctgctgactg gtgcactgaa cggtatcctg cgtggtgttc agcagcctat tatcgaaaaa 2160 ctggcgaatg attatgcccg taaaatcgac gaactgggcg gtccgcaggc ttattttgaa 2220 aaaaacctgc aggcgcgcca cgaacagctg gcaaacagcg acggcctgcg caaaatgctg 2280 gcagacctgc aagctggttg gaacgcgtct tctgtgatcg gcgtgcagac caccgaaatt 2340 agcaaatctg cgctggaact ggctgcaatt actggcaacg cggataacct gaaaagcgtt 2400 gatgtttttg tcgatcgctt cgttcagggc gagcgcgttg ctggtcagcc ggttgttctg 2460 gacgttgcgg caggcggcat cgacatcgct agccgcaagg gcgagcgtcc ggctctgact 2520 ttcattaccc cgctggcagc tccgggtgaa gaacagcgtc gccgtaccaa gactggtaaa 2580 agcgagttca ccaccttcgt ggaaatcgta ggtaaacagg accgctggcg tattcgcgac 2640 ggtgcggcgg acaccaccat cgacctggca aaagttgttt cccaactggt agatgctaac 2700 ggcgtgctga aacattctat taaactggat gtaatcggcg gtgacggcga tgacgttgta 2760 ctggcgaacg cgtctcgtat ccactatgac ggcggcgcag gtaccaacac ggtttcctac 2820 gcagcgctgg gccgccagga ttccatcact gttagcgccg atggcgaacg tttcaacgtg 2880 cgtaaacagc tgaataacgc aaacgtctat cgtgagggtg tagctaccca gaccaccgcg 2940 tacggtaagc gtaccgaaaa cgttcagtat cgtcacgtgg aactggcacg tgtgggtcag 3000 ctggtagagg tggatacgct ggaacacgtg cagcacatca tcggtggcgc cggtaacgat 3060 tccattactg gtaacgctca cgacaacttc ctggcaggtg gttctggtga tgatcgtctg 3120 gacggtggtg cgggtaacga tacgctggta ggcggcgaag gtcagaacac cgtaattggt 3180 ggtgccggtg acgacgtttt cctgcaggat ctgggcgttt ggagcaacca gctggatggc 3240 ggtgccggtg ttgacacggt taagtataac gttcaccagc cgtctgaaga gcgcctggaa 3300 cgtatgggtg acactggtat tcatgccgat ctgcagaaag gcactgttga aaaatggcct 3360 gcgctgaacc tgttctctgt ggaccatgtt aagaacattg aaaacctgca tggctctcgc 3420 ctgaacgacc gtatcgctgg tgacgaccag gataacgaac tgtggggtca tgacggcaat 3480 gataccattc gcggtcgtgg cggcgacgat attctgcgtg gcggtctggg cctggatacc 3540 ctgtatggtg aagatggtaa cgatattttc ctgcaagacg atgaaacggt atctgatgac 3600 atcgacggtg gtgcaggcct ggacaccgta gattacagcg ctatgatcca tccgggtcgt 3660 atcgtagctc cgcacgagta cggcttcggt atcgaggcgg acctgtctcg tgaatgggtt 3720 cgtaaagcgt ccgcgctggg tgtggactac tacgataacg ttcgtaacgt ggaaaacgtg 3780 atcggtacct ccatgaaaga cgtgctgatt ggcgacgcac aggccaacac tctgatgggc 3840 cagggcggtg atgacacggt tcgcggcggc gacggtgatg acctgctgtt cggtggtgac 3900 ggcaacgaca tgctgtacgg cgacgcgggc aacgacaccc tgtacggcgg tctgggtgac 3960 gacactctgg aaggtggtgc aggtaacgac tggttcggcc aaacccaggc acgcgaacac 4020 gacgtgctgc gtggtggcga cggcgtagac accgtggatt actcccaaac tggcgctcac 4080 gcgggtatcg cggccggtcg tatcggtctg ggcattctgg ccgatctggg tgccggccgt 4140 gtcgacaaac tgggtgaggc tggctctagc gcctatgata ctgtttccgg catcgaaaac 4200 gtggtaggca ctgaactggc agatcgtatc acgggtgacg cgcaagcgaa cgttctgcgt 4260 ggtgctggcg gtgcagacgt gctggcgggt ggtgaaggcg acgacgtact gctgggcggt 4320 gacggtgacg atcagctgag cggtgatgcg ggtcgtgacc gtctgtacgg tgaagcaggt 4380 gacgattggt tcttccagga cgctgctaac gctggcaacc tgctggacgg cggcgatggc 4440 cgtgacactg ttgacttcag cggtccgggt cgcggtctgg acgcaggcgc gaaaggcgtt 4500 ttcctgagcc tgggtaaggg tttcgcatct ctgatggacg aaccagaaac cagcaatgtc 4560 ctgcgtaaca tcgaaaacgc tgtcggttcc gcacgcgatg atgttctgat tggcgatgct 4620 ggtgccaatg ttctgaacgg tctggcgggt aatgatgtac tgtctggtgg cgctggtgat 4680 gatgtcctgc tgggtgatga gggcagcgat ctgctgtccg gcgatgccgg caacgacgat 4740 ctgttcggtg gccaaggtga tgatacttac ctgttcggcg ttggctatgg tcatgacacc 4800 atctatgagt ctggtggcgg ccacgatacg attcgtatta atgcaggtgc tgaccaactg 4860 tggtttgcac gtcagggtaa cgatctggaa attcgcatcc tgggtactga tgacgctctg 4920 accgtacacg actggtaccg cgatgcggat caccgcgtag aaatcatcca tgcggctaac 4980 caagctgtag accaggctgg tattgaaaaa ctggtagaag cgatggcaca gtatccggac 5040 ccaggtgcgg ctgctgcagc acctccagcg gctcgtgtgc cggataccct gatgcagagc 5100 ctggccgtca attggcgtta a 5121 <210> 25 <211> 11172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGTP-gtCyaAd93-CyaCopt <400> 25 atcgagatct gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 60 gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 120 tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat 180 aacaattata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatgcagca gtcccatcag 240 gccggttacg caaacgcagc cgatcgtgaa tctggtatcc cggcagcggt tctggatggt 300 attaaggcag ttgccaaaga gaagaacgct accctgatgt tccgtctggt caacccacac 360 tctacttccc tgatcgcgga aggtgtggcg accaaaggcc tgggtgtgca cgccaaaagc 420 agcgactggg gtctgcaggc aggttatatt ccggtgaacc cgaatctgtc taaactgttc 480 ggtcgtgccc cggaggtgat cgcacgtgca gacaacgatg tcaactcttc tctggcgcat 540 ggtcacaccg cggttgatct gaccctgtcc aaagaacgcc tggattacct gcgtcaggcg 600 ggcctggtga cgggcatggc cgacggtgtt gtagcgagca accacgcggg ttatgaacaa 660 tttgagtttc gcgttaaaga gacctctgac ggtcgttacg cggtgcagta ccgccgcaaa 720 ggtggcgatg actttgaagc tgtcaaagtg atcggtaacg ctgctggaat tccgctgacc 780 gcggatatcg acatgtttgc catcatgcct cacctgtcca actttcgcga ttccgcacgc 840 agctctgtga cgtctggtga ttccgtcact gactacctgg ctcgtacccg tcgtgcggcc 900 tctgaatccc agatgctgac tcgtggccag cttaaggaat acatcggcca acagcgtggc 960 gaaggctacg ttttctacga gaatcgtgct tacggcgttg cgggcaaatc cctgttcgac 1020 gatggtctgg gcgctgcacc gggcgttccg agcggccgtt ctaaattcag cccggacgta 1080 ctggaaactg tgccggcttc cccgggcctg cgccgtccgt ccctgggcgc agtcgaacgt 1140 caggactccg gctacgattc cctggatggc gttggctccc gctccttctc cctgggcgag 1200 gtttctgaca tggctgcggt ggaagcggca gagctggaaa tgacccgtca agtgctgcac 1260 gcgggcgcac gtcaggacga tgctgagccg ggcgtgtccg gtgcgtctgc acactggggt 1320 caacgtgccc tgcagggtgc tcaagctgtc gcggcagcgc agcgtctggt acatgcgatc 1380 gcactgatga cccagttcgg tcgcgcaggt tctaccaaca ctcctcagga agcagctagc 1440 ctgtctgctg ctgttttcgg tctgggcgaa gcgtcttctg cggttgcaga aaccgtgagc 1500 ggtttcttcc gtggttctag ccgctgggcg ggtggttttg gtgtagcagg tggcgctatg 1560 gccctgggtg gcggtatcgc ggctgctgtc ggcgcaggta tgagcctgac cgacgatgct 1620 cctgcgggcc agaaagccgc agctggcgct gaaatcgcgc tgcagctgac tggtggtacc 1680 gttgaactgg ctagctctat cgcgctggct ctggcagcgg cacgtggcgt gacttctggc 1740 ctgcaagtcg ccggtgcctc tgcgggcgct gctgcgggcg ctctggcagc tgcactgtcc 1800 cccatggaaa tctacggtct ggtacagcag tctcactacg cagaccagct ggataaactg 1860 gcgcaggagt cttctgcata cggttacgaa ggcgacgcac tgctggcgca gctgtatcgt 1920 gacaaaactg ctgctgaagg tgctgtggca ggcgtttctg cggtactgtc taccgttggc 1980 gctgcggttt ctattgcggc tgccgcatcc gttgtaggtg cgccggttgc tgtagttacc 2040 tctctgctga ctggtgcact gaacggtatc ctgcgtggtg ttcagcagcc tattatcgaa 2100 aaactggcga atgattatgc ccgtaaaatc gacgaactgg gcggtccgca ggcttatttt 2160 gaaaaaaacc tgcaggcgcg ccacgaacag ctggcaaaca gcgacggcct gcgcaaaatg 2220 ctggcagacc tgcaagctgg ttggaacgcg tcttctgtga tcggcgtgca gaccaccgaa 2280 attagcaaat ctgcgctgga actggctgca attactggca acgcggataa cctgaaaagc 2340 gttgatgttt ttgtcgatcg cttcgttcag ggcgagcgcg ttgctggtca gccggttgtt 2400 ctggacgttg cggcaggcgg catcgacatc gctagccgca agggcgagcg tccggctctg 2460 actttcatta ccccgctggc agctccgggt gaagaacagc gtcgccgtac caagactggt 2520 aaaagcgagt tcaccacctt cgtggaaatc gtaggtaaac aggaccgctg gcgtattcgc 2580 gacggtgcgg cggacaccac catcgacctg gcaaaagttg tttcccaact ggtagatgct 2640 aacggcgtgc tgaaacattc tattaaactg gatgtaatcg gcggtgacgg cgatgacgtt 2700 gtactggcga 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Claims (25)

  1. a) 인간 숙주에서 보르데텔라(Bordetella) 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어에 적합한 무세포 면역원성 조성물, 또는
    b) 인간 숙주에서 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어에 적합한 상기 무세포 면역원성 조성물을 포함하는 조합 면역원성 조성물
    의 군에서 선택되는 면역원성 조성물로서, 상기 무세포 면역원성 조성물은
    - 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된, 비독성 폴리펩티드, 특히, 비세포독성 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드), 및
    - 임의적으로, TH1 면역 반응의 애주번트, 또는 TH2 면역 반응의 애주번트, 또는 그 둘 모두의 조합
    을 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된 비세포독성 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)가 (i) 폴리펩티드로서, 그의 아미노산 서열이 보르데텔라 페르투시스의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 천연 CyaA의 아미노산 서열 중 227번 위치 내지 321번 위치의 93개 이상의 아미노산 잔기의 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드, 또는 (ii) (i)의 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드로서, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열이 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 또는 보르데텔라 힌지이(Bordetella hinzii)의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 93개 이상의 아미노산 잔기의 상기 연속 세그먼트의 CyaA 중의 227번 위치 내지 321번 위치와 매칭되는, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 천연 CyaA 서열 중의 위치에 의해 정의되는 93개 이상의 아미노산 잔기의 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드인 면역원성 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    - 보르데텔라 균주로부터의 2개 이상의 항원으로서, 한 항원은 (i) 보르데텔라 균주의 아데닐사이클라제 단백질로부터 유래된 비독성 폴리펩티드, 특히, 비세포독성 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)이고, 상기 폴리펩티드는 특히, (i.1) 폴리펩티드로서, 그의 아미노산 서열이 보르데텔라 페르투시스의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 천연 CyaA의 아미노산 서열 중 227번 위치 내지 321번 위치의 93개 이상의 아미노산 잔기의 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드, 또는 (i.2) (i.1)의 폴리펩티드의 변이체인 폴리펩티드로서, 상기 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 CyaA로부터 수득되고, 보르데텔라 페르투시스의 93개 이상의 아미노산 잔기의 상기 연속 세그먼트의 CyaA 중의 227번 위치 내지 321번 위치와 매칭되는, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이의 천연 CyaA 서열 중의 위치에 의해 정의되는 93개 이상의 아미노산 잔기의 연속 세그먼트의 결실을 함유하는 것인 폴리펩티드이고, 추가 항원(들)은 (ii) 백일해 톡소이드(PT), (iii) 섬유질 헤마글루티닌(FHA), (iv) 퍼탁틴(PRN) 및 (v) 핌브리아에(Fim)의 군에서 선택되고, 보르데텔라 균주에 대한 방어 면역 반응은 상기 항원에 대하여 유도되는 것인 2개 이상의 항원, 및
    - 임의적으로, TH1 면역 반응의 애주번트, 또는 TH2 면역 반응의 애주번트, 또는 그 둘 모두의 조합
    을 포함하는, 인간에서 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어에 적합한 무세포 면역원성 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결정된 병원체에 대한 면역 방어의 유도를 위한 활성 성분으로서, (vi) 무독화된 형태의 파상풍 독소로 구성된 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani)의 1 이상의 항원, (vii) 무독화된 형태의 디프테리아 독소로 구성된 코리네박테리움(Corynebacterium) 복합체의 항원, 및 임의적으로 (viii) 상이한 병원체(들)의 추가 항원인 추가 항원을 포함하는 조합 면역원성 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결정된 병원체에 대한 면역 방어의 유도를 위한 활성 성분으로서, B형 간염 표면 항원(HB), 하나 또는 수개의 바이러스 균주의 불활성화된 폴리오바이러스(IPV), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) b형 다당류의 군에서 선택되는 추가 항원을 포함하는 조합 면역원성 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 무독화된 형태의 보르데텔라 독소(PT), 섬유질 헤마글루티닌(FHA), 퍼탁틴(PRN) 및 핌브리아에(Fim)의 군에서 선택되는 항원이 서로 독립적으로 보르데텔라 페르투시스, 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터, 바람직하게는, 비. 페르투시스로부터의 것이고, 바람직하게는, 모두 동일한 보르데텔라 균주로부터의 것인 무세포 면역원성 조성물, 또는 조합 면역원성 조성물.
  7. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5 ml의 면역원성 조성물 1회 용량이
    무독화된 형태의 보르데텔라 독소, 특히, 백일해 톡소이드: 1 내지 50 ㎍;
    섬유질 헤마글루티닌: 1 내지 50 ㎍;
    퍼탁틴: 1 내지 20 ㎍;
    임의적으로 핌브리아에: 2 내지 25 ㎍;
    파상풍 톡소이드: 0.25 Lf 이상 25 Lf 미만;
    디프테리아 톡소이드: 0.25 Lf 이상 50 Lf 미만; 및
    임의적으로,
    B형 간염 표면 항원: 5 ㎍ 내지 25 ㎍
    불활성화된 폴리오바이러스: 균주당 5 내지 45, 특히, 8 내지 40 D-항원 단위;
    헤모필루스 인플루엔자 b형 다당류: 1 내지 20 ㎍
    을 함유하는 것인 조합 면역원성 조성물.
  8. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 0.5 ml의 면역원성 조성물 1회 용량이
    무독화된 형태의 보르데텔라 독소, 특히, 백일해 톡소이드: 8 ㎍;
    섬유질 헤마글루티닌: 8 ㎍;
    퍼탁틴: 2.5 ㎍;
    파상풍 톡소이드: 5 Lf;
    디프테리아 톡소이드: 2.5 Lf
    를 함유하는 것인 조합 면역원성 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물 1회 용량이 2.5 내지 600 ㎍, 2.5 내지 500 ㎍, 2.5 내지 400 ㎍, 2.5 내지 300 ㎍, 2.5 내지 200 ㎍ 또는 2.5 내지 100 ㎍의 보르데텔라 페르투시스의 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하고, 바람직하게, 25 ㎍의 보르데텔라 페르투시스의 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 것인 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TH2 반응의 애주번트가 알루미늄 염이고, 특히, 수산화알루미늄, 알루미늄 하이드록시포스페이트 술페이트 또는 인산알루미늄인 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TH1 반응의 애주번트가
    i. MPL 함유 애주번트, 특히, AS15, AS01B, AS01D, 또는 AS01E; CpG 함유 애주번트, 특히, AS15, QS21 함유 애주번트, 특히, AS01B, D, 및 E 또는 AS15, 면역 자극 복합체(ISCOM), IC31 함유 애주번트, 키토산 함유 애주번트, 리포솜 제제 기반 애주번트, 특히, AS01B D, E 또는 AS15 또는 ISCOM, 지질 기반 에멀젼, 예컨대, MF59의 군, 또는
    ii. - 톨 유사 수용체 4(TLR-4)의 리간드, 특히, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 글루코피라노실 지질 A(GLA), 또는
    - 톨 유사 수용체 9(TLR-9)의 리간드, 특히, 비메틸화된 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 및 더욱 특히, HBsAg-1018, 또는
    - 톨 유사 수용체 3(TLR-3)의 리간드, 특히, 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 합성 유사체 및 더욱 특히, 폴리(I:C) 함유 조성물, 예컨대, 카복시메틸셀룰로스의 존재하의 폴리이노신-폴리시티딜산 + 폴리-L-리신 이중 가닥 RNA(폴리(ICLC)), 또는
    - 톨 유사 수용체 2(TLR-2)의 리간드, 특히, 합성 지질펩티드 또는 재조합 지질단백질, 및
    - 톨 유사 수용체 5(TLR-5)의 리간드, 특히, 재조합 박테리아 플라젤린
    중에서 선택되는 톨 유사 수용체의 리간드이거나, 또는 그를 함유하는 애주번트의 군
    에서 선택되는 것인 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 보르데텔라의 CyaA 유래 폴리펩티드가
    2) 서열 번호 2에 기재된 보르데텔라 페르투시스 CyaA 단백질의 세그먼트 또는 단편으로서, 상기 세그먼트 또는 단편의 서열은 서열 번호 2의 321번 위치 내지 387번 위치에 위치하는 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 마지막 잔기로 끝나는 것인 세그먼트 또는 단편, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 2 중 잔기 321 내지 마지막 잔기 또는 387 내지 마지막 잔기로 구성된 세그먼트 또는 단편과 아미노산 잔기가 95% 이상 동일한 폴리펩티드 변이체에 융합된,
    1) 서열 번호 2에 기재된 보르데텔라 페르투시스 CyaA 단백질의 세그먼트 또는 단편으로서, 상기 세그먼트 또는 단편의 서열은 서열 번호 2의 첫 번째 잔기로 시작하여 서열 번호 2의 183번 위치 내지 227번 위치에 위치하는 잔기로 끝나는 것인 세그먼트 또는 단편, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 2 중 잔기 1 내지 183 또는 1 내지 227로 구성된 세그먼트 또는 단편과 아미노산 잔기가 95% 이상 동일한 폴리펩티드 변이체
    로 구성되는 것인 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보르데텔라의 CyaA 유래 폴리펩티드가
    1) 서열 번호 10에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 10의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 폴리펩티드 변이체;
    2) 서열 번호 12에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 12의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 변이체,
    3) 서열 번호 19에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 19의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 변이체,
    4) 서열 번호 20에 기재된 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드, 또는 보르데텔라 파라페르투시스, 보르데텔라 브론키셉티카 또는 보르데텔라 힌지이로부터 수득되고, 서열 번호 20의 아미노산 잔기 위치와 매칭되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 변이체
    로 구성되는 것인 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CyaA 유래 폴리펩티드가 서열 번호 25의 플라스미드 pGTP-gtCyaad93-CyaC-opt에 의해 전달되는 핵산 분자 gtCyaad93-CyaC-opt의 이. 콜라이(E. coli) 세포에서의 발현 생성물인 면역원성 조성물, 특히, 조합 면역원성 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 포함하고, 분제, 재구성용 분제 및 액제, 액상 제제, 특히, 현탁제 또는 액제, 동결건조된 성분, 및 상기 투여 형태의 조합 중에서 선택되는 투여 형태로서 제공되는, 인간 숙주에게 투여하기 위한 의약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 인간 숙주에게 투여하기 위한 1회 용량이 0.25 ml 내지 1 ml의 액상 제제, 특히, 재구성된 제품을 함유하는 것인 의약 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 주사에 의한 투여용으로, 특히 근육내 주사용으로 제제화된 약학적 형태로서 제공되는, 인간 숙주에게 투여하기 위한 의약 조성물.
  18. 결정된 병원체, 또는 상기 병원체와 인과 관계가 있는 병태에 대한 방어를 위한 활성 성분으로서, 상기 병원체의 항원, 및 추가로, 제1항 또는 제13항에서 정의된 바와 같은, 보르데텔라 균주의 아데닐레이트 사이클라제 단백질로부터 유래된 폴리펩티드(CyaA 유래 폴리펩티드)를 포함하는 백신을 제조하는 방법으로서,
    a) (i) 무독화된 형태의 백일해 독소(PT), 섬유질 헤마글루티닌(FHA), 퍼탁틴(PRN) 및 핌브리아에(Fim)의 군에서 선택되는 보르데텔라로부터의 항원들 중 1 이상, 및 바람직하게, 처음 3개의 항원 또는 상기 항원 모두, (ii) 무독화된 형태의 파상풍 독소로 구성된, 클로스트리디움 테타니의 1 이상의 항원, (iii) 무독화된 형태의 디프테리아 독소로 구성된, 코리네박테리움 복합체의 항원, 및 (iv) 제1항, 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 CyaA 유래 폴리펩티드, 및 임의적으로 (v) 결정된 병원체에 대한 면역 반응의 유도를 위한 활성 성분으로서, 하나 또는 여러 성분(들)으로서 제제화되는 상이한 병원체(들)의 추가 항원의 군에서 선택되는 항원을 제공하는 단계, 및
    b) 상기 성분(들)을, 백신을 숙주에게 투여하였을 때, 면역 반응을 증강시키는 하나 이상의 화합물, 예컨대, TH2 배향성 면역 반응의 애주번트(들), TH1 배향성 면역 반응의 애주번트, TH17 배향성 면역 반응의 애주번트, 또는 상기 애주번트의 조합과 혼합시키는 단계
    를 포함하고, 단계 a) 및 b)는 임의적으로 단일 단계로서 수행되는 것인 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 방어를 위한 활성 성분이 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 것과 같은 것인 제조 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 디프테리아, 파상풍 및 페르투시스 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대한, 및 임의적으로 B형 간염, 소아마비 및/또는 헤모필루스 인플루엔자 b형에 의해 유발되는 질환에 대한 인간 숙주의 능동 면역화에서 사용하기 위한 조합 면역원성 조성물, 또는 의약 조성물.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 숙주의 감염 이후 페르투시스 박테리아 존속에 대한, 또는 전파에 대한, 및/또는 보르데텔라 균주, 특히, 비. 페르투시스에 의해 감염된 인간 숙주의 기도의 콜로니 형성에 대한 인간 숙주의 능동 면역화에서 사용하기 위한 조합 면역원성 조성물, 또는 의약 조성물.
  22. 제1항 내지 제13항, 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용량 이후의 투여를 위한 용량으로서, 특히, (i) 다회 용량 설정의 제2 용량으로서 또는 추가 용량으로서, 또는 (ii) 파상풍, 디프테리아, 및 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태, 및 임의적으로 B형 간염, 소아마비 및 헤모필루스 인플루엔자 b형에 의해 유발되는 질환의 군에서 선택되는 질환 중 1 이상에 대한 1가 또는 조합 백신으로 제1 백신 접종 용량 또는 1차 백신 접종을 이전에 받았던 개체에서의 부스터 용량으로서 제19항 또는 제20항에 따라 사용하기 위한 조합 면역원성 조성물, 또는 의약 조성물.
  23. 제1항 내지 제14항, 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용량으로서 또는 추가 용량으로서, 특히, 부스터 용량으로서 투여하기 위한 용량으로서 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 것이고, 상기 제2 용량, 추가 용량, 또는 특히 부스터 용량은, 제1 용량 또는 이전 용량(들)이 제1항, 제2항, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 비독성 CyaA 유래 폴리펩티드를 함유하지 않고, 바람직하게, 어떤 CyaA 폴리펩티드 또는 CyaA 유래 폴리펩티드도 함유하지 않는다는 점에서 상기 제1 용량과, 또는 이전에 투여된 용량(들)과 상이한 것인 조합 면역원성 조성물, 또는 의약 조성물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 출생시 또는 그 이후의, 특히, 18개월까지의 아동인 조합 면역원성 조성물 또는 의약 조성물.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 숙주가 4세 초과의 아동, 11세 초과의 청소년, 또는 성인, 특히, 노인, 임산부 또는 임산부와 가까운 친척이고, 상기 숙주는, 1가 백일해 백신으로서, 또는 백일해에 대한 조합 백신으로서 투여되는, 보르데텔라 균주, 특히, 보르데텔라 페르투시스에 의한 감염과 인과 관계가 있는 병태에 대해 상이한 무세포 백신으로 이미 1차 백신 접종을 받은 상태인, 프라임/부스트 백신 접종 설정에서 부스터 용량으로서의 조합 면역원성 조성물.
KR1020197021601A 2016-12-27 2017-12-22 TH1/TH17 배향성 면역 반응을 촉진시키는 CyaA 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물 KR20190142764A (ko)

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