KR20190131824A

KR20190131824A - 시간에 따라 공극률이 증가하는 생분해성 이식체의 제조방법

Info

Publication number: KR20190131824A
Application number: KR1020180056714A
Authority: KR
Inventors: 김현이; 신다영; 정설하
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2019-11-27
Also published as: KR102172373B1

Abstract

본 발명은 고전단혼합기를 이용하여 생분해성 고분자 용융물과 생분해성 세라믹 입자를 생분해성 고분자의 융점보다 높은 온도에서 교반하여 혼합하고, 성형하는 생분해성 이식체의 제조방법 및 이에 따라 제조된 생분해성 고분자 수지의 용융물에 수백 마이크로미터 직경의 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 생분해성 이식체를 포함하는 골재생용 임플란트에 관한 것이다.

Description

시간에 따라 공극률이 증가하는 생분해성 이식체의 제조방법{A method for preparation of biodegradable implant with increasing its porosity over time}

생체 내 삽입되는 본플레이트(bone plate)나 본스크류(bone screw)는 여러 가지 생체적합성 소재를 사용하여 제작되고 있는데, 최근에는 삽입 후 제거를 위하여 이차 수술을 하지 않아도 된다는 점에서 생분해성 재료를 이용하여 만들어진 플레이트나 스크류가 각광받고 있다. 이러한 생분해성 재료로는 고분자가 많이 사용되고 있다.

그러나, 이들 고분자 소재는 금속에 비해 현저히 낮은 탄성률 및 기계적 물성을 갖는 단점이 있다. 따라서, 원하는 기계적 물성을 구현하기 위해서는 즉, 금속 소재의 플레이트나 스크류와 동일한 하중을 견딜 수 있도록 하기 위해서는 보다 큰 크기의 플레이트와 스크류를 사용하게 되므로 시술이 어려워지고 이식받는 환자에게 부담이 될 수 있다. 한편, 상기 고분자 소재 중 우수한 기계적 물성을 토대로 가장 주목받는 물질인 폴리락트산 등의 생분해성 고분자의 경우, 고분자 자체로서는 대생물작용(bioactivity)이 활발하지 못하여 이식 후 임플란트와 뼈 사이의 접합을 느슨하게 하여 임플란트가 뼈와 분리될 수 있는 단점이 있다.

생분해성 고분자 소재의 사용에 따른 이러한 단점을 보완하기 위하여, 고분자 기재에 강화인자로서 생체활성이 우수한 금속 또는 세라믹 소재를 첨가하여 복합체로 제조하는 기술이 사용되고 있다. 상기 복합체는 강도 측면에서 물성이 향상되기는 하지만, 생체 내 이식하여 조직 재생용으로 사용하고자 하는 이들 복합체의 목적상 조합하는 물질의 종류에 따라 초기의 폭발적인 분해로 조직이 재생되기 이전에 이식체의 구조가 붕괴된다던지, 분해가 너무 더뎌 새롭게 형성되는 조직 세포를 수용할 수 있는 공간을 제공할 수 없다던지 하는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 고분자에 혼입되는 입자의 형태나 크기 역시 이의 분해 후 잔류하는 구조물에 영향을 주므로 복합체 제조시 고려해야할 사항 중 하나이다.

이에, 본 발명자들은 생분해성 고분자를 모체로 하고, 이보다 빠르게 분해되는 생체적합성 물질로 된 입자를 첨가하여 복합체를 제조함에 있어서, 상기 생체적합성 물질의 분해에 따라 재생되는 조직의 세포가 채워질 수 있는 충분한 크기의 공간을 제공하되 전체 이식체의 구조는 붕괴시키지 않는 복합체 및 이의 제조방법을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 고전단혼합기에서 융점 보다 높은 온도에서 소정의 속도로 교반하는 고분자 수지 용융물에, 상기 온도 및 교반 속도를 유지하면서 수백 마이크로미터 크기의 생분해성 세라믹 입자를 첨가하여 혼합하고, 성형함으로써 수백 마이크로미터 크기의 세라믹 입자들이 고분자 수지 내에 균일하게 분포된 복합체로 된 이식체를 제공할 수 있으며, 이는 전체 이식체의 구조가 붕괴되지 않으면서 체내 이식 후 고분자 수지 내에 삽입된 세라믹 입자들이 시간의 경과에 따라 선택적으로 분해됨으로써, 신생 조직을 구성하기 위한 세포들이 부착하여 성장, 증식 및/또는 분화하기에 충분한 공간을 제공할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 생분해성 고분자 수지의 용융물에 평균 직경 100 내지 300 μm의 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 시간에 따라 기공률이 증가하는, 생분해성 이식체의 제조방법으로서, 생분해성 고분자를 고전단혼합기에 투입하고 혼합기의 온도를 상기 생분해성 고분자의 융점보다 10℃ 내지 50℃ 더 높게 유지하면서 3 Hz 내지 10 Hz로 교반하는 제1단계; 상기 고전단혼합기에 상기 생분해성 고분자보다 분해속도가 빠른 생분해성 세라믹 입자를 포함하는 분말을 첨가하여 온도 및 속도를 유지하면서 혼합하는 제2단계; 및 상기 혼합물을 성형하는 제3단계;를 포함하는 생분해성 이식체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 생분해성 고분자 수지의 용융물에 평균 직경 100 내지 300 μm이고, 상기 생분해성 고분자보다 분해 속도가 빠른 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 시간에 따라 기공률이 증가하는 생분해성 이식체를 포함하는 골재생용 임플란트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 제1양태는 생분해성 고분자 수지의 용융물에 평균 직경 100 내지 300 μm의 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 시간에 따라 기공률이 증가하는, 생분해성 이식체의 제조방법으로서, 생분해성 고분자를 고전단혼합기(high shear mixer)에 투입하고 혼합기의 온도를 상기 생분해성 고분자의 융점보다 10℃ 내지 50℃ 더 높게 유지하면서 3 Hz 내지 10 Hz로 교반하는 제1단계; 상기 고전단혼합기에 상기 생분해성 고분자보다 분해속도가 빠른 생분해성 입자를 포함하는 분말을 첨가하여 온도 및 속도를 유지하면서 혼합하는 제2단계; 및 상기 혼합물을 성형하는 제3단계;를 포함하는 생분해성 이식체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 생분해성 고분자 이식체의 열악한 강도를 보완하고, 조직 재생을 촉진할 수 있는 이식체를 제공하기 위한 복합 소재를 발굴하기 위하여 고안된 것으로, 우수한 강도를 가지면서 체내에서 생분해될 수 있는 생체세라믹과 같은 생분해성 소재를 소정의 크기를 갖는 입자 형태로 고분자 모체에 균일하게 삽입하여 복합체로 제조함으로서 현저히 증가된 강도 및 탄성을 구현할 수 있음을 확인한 것에 기초한다. 이에 본 발명은 온도조절 가능한 고전단혼합기를 이용하여 생분해성 고분자를 용융상태로 유지하면서 소정의 크기의 생분해성 입자를 투입하고 빠르게 혼합하고 성형하는, 상기 강도 및 탄성이 향상된 생분해성 이식체의 제조방법을 최초로 개발한 것이 특징이다.

이때, 첨가되는 생분해성 세라믹 입자는 평균 직경 100 내지 300 μm의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 예컨대, 상기와 같이 제조된, 본 발명의 생분해성 이식체를 체내에 이식하는 경우, 시간의 경과에 따라 분해속도의 차이로 인해 생분해성 세라믹 입자가 고분자 모체에 비해 먼저 분해되면서 이들이 차지하던 자리에는 빈 공간 즉, 기공이 형성된다. 한편, 상기 이식체의 목적이 손상 및/또는 결실된 조직에 식립되어 이를 대체하고 바람직하게는 새로운 조직의 생성을 돕는 것임을 고려할 때, 새롭게 생성되는 조직 세포, 예컨대, 골세포가 채워질 수 있도록 충분한 공간을 제공할 수 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법은, 고전단혼합기를 이용하여 수행하는 것이 특징이다. 상기 고전단혼합기는 일반적인 혼합기에 비해 보다 빠른 속도와 전단력의 최대 효과를 높일 수 있는 노즐 형태를 이용하여 보다 높은 전단력으로 반응물을 효과적으로 혼합, 유화, 분산시킬 수 있도록 하는 기계이다. 구체적으로, 본 발명의 제조방법은 밀도가 큰 고분자 용융물 중에 상대적으로 낮은 밀도의 세라믹 입자를 균일하게 분포시키는 것인 바, 상기 고전단혼합기를 사용함으로써 점성이 높은 고분자 용융물 중에 수백 마이크로미터 크기의 큰 세라믹 입자를 고르게 분산시킬 수 있다.

상기 생분해성 고분자으로는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체 또는 폴리-ε-카프로락톤을 단독으로 사용하거나, 이들 중 둘 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 예컨대, 이들 고분자 중에서도 기계적 물성이 우수한 폴리락트산을 단독으로 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생분해성 세라믹 입자로는 인산삼칼슘(tricalcium phosphate; TCP), 인산일수소칼슘, 인산팔칼슘, 비정질인산칼슘 또는 황산칼슘으로 된 입자, 이들의 조합으로 된 입자, 또는 이들 입자의 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 제조방법은 생분해성 고분자의 융점보다 높은 온도에서 수행되는 것을 고려할 때, 최종적으로 제공하고자 하는 복합체 중에 상기 생분해성 세라믹 입자가 온전한 마이크로스피어의 형태로 유지되기 위하여, 유리전이온도가 고분자의 융점보다 높은 물질을 선택하는 것이 유리할 수 있다.

한편, 제조되는 이식체에 강도를 부여하기 위하여, 상기 생분해성 세라믹 이외에 추가로 히드록시아파타이트(hydroxyapatite; HA), 바이오글래스, 결정화 유리 아파타이트 등의 생체활성 세라믹을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생분해성 세라믹 입자는 혼합물 총량에 대해 30 내지 50 부피%로 첨가될 수 있다. 상기 생분해성 세라믹 입자 함량이 30 부피% 미만인 경우 입자 간의 연결성이 부족하여, 내부에 고립된 세라믹 입자의 분해가 저해되어, 원하는 수준까지 공극률의 계속적인 증가를 달성하기 어려우며, 50 부피% 초과인 경우, 혼합물의 물리적 성질이 떨어지므로 혼합물 자체의 안정성을 보장하기 어려울 수 있다.

본 발명의 생분해성 이식체는 체내 이식시 시간 경과에 따라 고분자 모체 내에 삽입된 생분해성 세라믹 입자가 상기 생분해성 고분자에 비해 빠른 속도로 용해되면서 기공이 형성되는 것이 특징이다. 또한 상기 이식체는 생체적합성 소재로 제조되었으므로 형성된 기공에 세포가 침투하여 이식체에 부착하여 성장, 증식 및 조직세포로 분화하면서 기공을 채울 수 있으므로 조직 재생에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 제2양태는 생분해성 고분자 수지의 용융물에 평균 직경 100 내지 300 μm이고, 상기 생분해성 고분자보다 분해 속도가 빠른 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 시간에 따라 기공률이 증가하는 생분해성 이식체를 포함하는 골재생용 임플란트를 제공한다.

본 발명의 생분해성 이식체는 강도 및 탄성이 우수하여 골재생용 임플란트로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예컨대, 본 발명의 골재생용 임플란트는 제1양태의 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 골재생용 임플란트는 이식 후 시간의 경과에 따라 고분자 골격은 유지하되 생분해성 세라믹 입자의 분해에 따라 기공이 형성되고 확장되므로 신생 조직 세포를 수용함으로써 조직 재생을 촉진할 수 있는 소재일 수 있다.

본 발명의 생분해성 이식체의 제조방법은 온도조절 가능한 고전단혼합기를 이용하여 생분해성 고분자를 용융상태로 유지하면서 소정의 크기의 생분해성 세라믹 입자를 첨가하고 고르게 혼합한 후 성형함으로서 강도 및 탄성이 향상된 생분해성 고분자를 모체로 하는 이식체를 제공할 수 있으며, 이렇게 제조된 이식체는 강도 및 탄성이 현저히 향상될 뿐만 아니라 삽입된 생분해성 세라믹 입자들이 분해되면서 형성되는 기공에 조직세포가 침투하여 증식, 분화할 수 있으므로 골재생용 임플란트로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인산삼칼슘(tricalcium phosphate; TCP) 마이크로스피어 및 폴리유산 복합체의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 TCP 마이크로스피어-폴리유산 복합체를 체내에 이식한 후 포로젠(porogen)으로 작용하는 TCP 마이크로스피어의 용해에 의한 표면 기공 형성 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 (a) TCP 마이크로스피어(TCPms) 및 (b) TCP 분말(TCPpw)의 표면 형태를 나타내는 주사전자현미경(scanning electron microscopy; SEM) 이미지와 (c) TCP 마이크로스피어 및 TCP 분말의 X-선 회절(X-ray diffraction; XRD)을 나타낸 도이다.
도 4는 (a) 원통형 시편의 제조에 사용된 핸드프레스 기구(hand press machine) 및 (b) 제조된 순수 PLA 및 PLA-40부피% TCP 복합체의 실물 사진, 및 (c) 순수 PLA, PLA-40부피% TCPms 복합체 및 PLA-40부피% TCPpw 복합체의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. Ca 및 P의 에너지분산형 X-선 분광학(energy-dispersive X-ray spectroscopy; EDS) 맵핑 이미지는 PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 삽입도에 나타내었다.
도 5는 각각 (a) 순수 PLA, (b) PLA-TCPms 및 (c) PLATCPpw 상에서의 배양 1일 후 전조골세포주(pre-osteoblast cell line, MC3T3-E1)의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. 빨간색 화살표는 세포를 지시한다.
도 6은 (a) 배양 5일 후 MTS(methoxyphenyl tetrazolium salt) 어세이 결과 및 (b) 배양 10일 후 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 나타낸 도이다(*p <0.05).
도 7은 순수 PLA 및 PLA 복합체, TCPms 및 TCPpw의 물 접촉각을 나타낸 도이다.
도 8은 순수 PLA, TCPms 및 TCPpw의 시간에 따른 분해 특성을 나타낸 도이다. (a)는 각기 다른 분해 시점에서 각 시편의 3차원 μ-CT 이미지를, (b)는 HCl에서의 가속화된 분해 30일 후 각 시편의 횡단면(cross-sectional) SEM 이미지를 나타낸다.
도 9는 생체 내 이식 16주 후 (a) 순수 PLA, (b) TCPms 및 (c) TCPpw의 횡단면 μ-CT 이미지 및 (d) μ-CT 프로그램을 이용하여 계산한 이식체 주위의 골부피를 나타낸다(*p <0.05).
도 10은 생체 내 이식 16주 후 골드너의 삼색염색(Goldner's trichrome stain)으로 염색한 (a) 순수 PLA, (b) TCPms 및 (c) TCPpw의 조직학적(histological) 이미지 및 (d) 이식 골 접촉비(bone-to-implant contact ratio)를 나타낸 도이다(I: 이식체(implant), NB: 신생골(new bone), CT: 연결조직(connective tissue)). 각 시편의 SEM 이미지를 각각 (a) 내지 (c)의 삽입도에 나타내었다(삽입도 내 스케일바=100 μm, *p<0.05).
도 11은 유사생체용액(simulated body fluid; SBF)에 침지시킨 후 시간에 따른 비교예의 마그네슘 파티클(Mg)-PLA 복합체의 분해에 의한 크기 및 형태 변화를 나타낸 도이다.
도 12는 SBF에 침지시킨 후 시간에 따른 비교예의 Mg-PLA 복합체의 분해에 의한 pH 변화를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 생분해성 세라믹 마이크로스피어 -고분자 복합체의 제조

인산삼칼슘 분말(tricalcium phosphate powder; TCPpw; Ca₃(PO₄)₂, Sigma-Aldrich, USA), 결합제(binder)로서 시약 등급(reagent-grade)의 폴리비닐부티랄(polyvinyl butyral; PVB, Butvar B-98, Sigma) 및 분산제(dispersant)로서 KD6(Hypermer KD-6, UniQema, Everberg, Belgium)의 혼합물을 이용하여 슬러리를 준비하였다. 상기 슬러리를 분무건조하여(spray-dried) TCP 마이크로스피어(TCPms)를 제조하고, 수집한 마이크로스피어를 500℃에서 10시간 동안, 이후 1350℃에서 2시간 동안 소결하여 체로 쳐 소결된 마이크로스피어로부터 50% 효율로 100 내지 250 μm 크기의 마이크로스피어를 분리하였다. 40부피%로 TCP를 함유하는 복합체를 수득하기 위하여, 고전단혼합기(high-shear mixer)를 사용하여 180℃에서 상기 분리된 TCPms를 용융상태의 PLA와 TCPms:PLA=1.63:1의 질량비(mass ratio)로 균질하게 혼합하였다. 비교예로서, 동일한 함량의 TCPpw를 함유하는 PLA-TCPpw 복합체를 제조하기 위하여, TCPpw를 동일한 비율로 용융상태의 PLA와 동일한 조건에서 혼합하였다. 원통형 주형(cylindrical mold) 및 핸드 프레스 머신(hand press machine, hydraulic unit model 3925, Carver, USA)을 사용하여 170℃에서 점성이나 완전 유동성이 아닌 복합체를 형성함으로써 원통형 시료를 제조하였다.

실험예 1: 특성분석

TCPms 및 TCPpw을 주사전자현미경(scanning electron microscopy; SEM, JSM-6360, JEOL, Japan) 및 단색성(monochromatic) Cu Kα 방사선을 이용한 X-선 회절(XRD; D8-Advance, BRUKER, Germany)로 분석하였다. 2°/min의 스캔속도로 20 내지 50° 범위의 회절각에 걸쳐 시료를 스캔하였다.

저속 톱(low-speed saw)으로 원통형 시료를 절단하여 순수 PLA 및 PLA-TCP 복합체의 단면을 획득하고, 단면의 형태를 에너지분산형 X-선 분광학(energy-dispersive X-ray spectroscopy; EDS)과 결합된 SEM으로 확인하였다.

접촉각 분석기(contact angle analyzer, Phoenix 300, Surface Electro Optics Co. Ltd, Korea)를 이용하여 표면 상에서 증류수 방울의 접촉각을 측정하여 순수 PLA 및 PLA-TCP 복합체의 표면 친수성을 확인하였다.

TCPms 및 TCPpw의 SEM 이미지 및 XRD 패턴을 도 3에 나타내었다. TCPms는 100 μm 이상의 크기를 갖는 뚜렷한 구형을 나타내었다(도 3(a)). TCPpw는 약 2 μm 크기의 불규칙한 형태를 나타내었으며, 그 형태는 TCPms와는 전혀 상이하였다(도 3(b)). XRD 특성 피크의 출현은 고전단혼합기를 이용한 마이크로스피어의 제조에 의해 TCP의 성질이 변하지 않았음을 나타내었다(도 3(c)).

원통형 시편의 제조에 사용된 핸드 프레스 머신의 사진과 결과로 제조된 순수 PLA 및 PLA 복합체 시편을 각각 도 4(a) 및 (b)에 나타내었다. 순수 PLA는 노랗고 반투명(yellowish and translucent)인 것과 달리, 2종 복합체는 모두 TCP의 혼입(incorporation)으로 불투명하였다(opaque). 나아가, PLA-TCPms 시편 내에서 구형의 마이크로스피어가 가시적으로 확인된 반면 PLA-TCPpw 시편의 표면은 균일한 흰색이었다.

순수 PLA, PLA-TCPms 복합체 및 PLA-TCPpw 복합체의 표면 형태를 도 4(c)에 나타내었다. 순수 PLA의 표면은 균일하고 연마선(grinding line)만이 나타나는 무결점의 표면이었다. 반대로, PLA-TCPms 시편의 경우 균일하게 분포된 다양한 크기를 갖는 TCPms가 PLA 매트릭스 내에서 관찰되었다. 이때, 관찰되는 뚜렷한 구형은 전단 혼합 공정이 그 구조를 왜곡하지 않았음을 나타내는 것이다. 도 4(c)에 나타난 바와 같이, Ca 및 P의 EDS 맵핑은 TCPms의 존재를 추가적으로 확인하였다. PLA-TCPpw의 표면 형태는, 균일하고 무결점이며, 몇몇 연마선이 나타나는, 순수한 PLA의 것과 상당히 상이함에도 불구하고, Ca 및 P의 EDS 맵핑으로 TCPpw의 존재를 확인하였다.

실험예 2: 시험관 내 생체적합성(in vitro biocomparibility )

전조골세포주(pre-osteoblast cell line) MC3T3-E1(ATCC, CRL-2593)을 이용하여 세포 부착, 증식 및 분화 테스트를 수행하였다. 세포 부착 테스트를 위하여, 미리 인큐베이션한(pre-incubated) 세포를 순수한 PLA, PLA-40부피% TCPms 및 PLA-40부피% TCPpw 시편의 표면에 3×10⁴ cells/mL의 세포 밀도로 분주하고, 습식 인큐베이터에서 37℃, 5% CO₂ 함유 공기 조건에서 하루 동안 배양하였다. 부착된 세포를 SEM으로 관찰하였다. 세포 증식 및 분화 테스트를 위하여, 전조골세포를 0.25×10⁴ cells/mL의 밀도로 시편의 표면에 분주하였다. 순수 PLA 및 PLA 복합체 상에서의 세포 증식을 배양 5일 후에 메톡시페닐 테트라졸리움염(methoxyphenyl tetrazolium salt; MTS) 증식 어세이를 사용하여 평가하였다. 배양 후, 시편을 Dulbecco's 인산완충염용액(phosphate-buffered saline; PBS)로 2회 세척하였다. 세척한 시편을 10% 세포 증식 어세이 키트 용액(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)과 혼합한 무우태혈청(fetal bovine serum(FBS)-absent) 배양 배지(culturing medium)에 담궜다. 2시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더(Model 550; Biorad, USA)를 사용하여 490 nm에서 용액의 흡광도를 측정하였다. 세포 분화는 알칼리포스파타아제(alkaline phosphatase; ALP) 활성 어세이를 사용하여 평가하였다. 각 시편 상에서 세포의 분화를 10일 동안 배양 후 ALP 어세이로 확인하였다. ALP 테스트를 위하여, 분주하고 1일 후에 배양 배지를 β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate, 10 mM) 및 아스코르브산(50 mg/mL)을 함유하는 새로운 배지로 교환하였다. 반응 동안 ALP 존재 하에 p-니트로페닐 포스페이트로부터 전환된 p-니트로페놀(p-nitrophenol; pNP)의 수준을 정량하여 ALP 활성을 측정하였다. pNP 수준은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405 nm 파장에서 측정하였다.

전술한 바와 같이, MC3T3-E1 세포를 사용하여 세포 부착, 증식 및 분화 테스트를 포함한 시험관 내 생체적합성 분석을 수행하였다. 순수 PLA와 PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw 복합체는, 도 5의 SEM 이미지에 나타난 부착된 세포 수에 의해 확인된 바와 같이, 배양 1일 후, 모두 우수한 세포 반응을 나타내었다.

도 5(a)에서 관찰된 바와 같이, 순수 PLA 상의 세포는 널리 퍼진(widespread) 사상위족(filopodia)을 갖는 대신에 구형이었다. 반면, TCPms 및 TCPpw의 존재는 사상위족-유사 연장(filopodia-like extensions)을 갖는 세포의 퍼짐(spreading)을 선호하였으며, 이는 생체적합성이 향상되었음을 나타내는 것이다(도 5(b) and (c)). 또한, 순수 PLA와 PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw 복합체의 MTS 및 ALP 활성 어세이를 수행하였다. 배양 5일 후, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw는, 도 6(a)에 나타난 바와 같이, 모두 순수 PLA에 비해 현저히 더 높은 세포 생존율 수준을 나타내었다.

생물활성(bioactive) TCPms 및 TCPpw의 존재는 세포의 성장 및 증식에 유리한 환경(favourable environment)을 제공하였다. 또한, 이들과의 복합체는, 배양 10일 후, 순수 PLA에 비해 현저히 더 높은 ALP 활성 수준을 나타내었다(도 6(b)). 시험관 내 세포 테스트는 생물활성 TCPms의 혼입이 순수 PLA의 생체적합성을 PLA-TCPpw와 동등 또는 보다 높은 수준으로 향상시킴을 명확히 보여주었다.

당업계에서는 매트릭스의 친수성을 개선하고 세포 부착성을 향상시키기 위하여, 상대적으로 소수성인 매트릭스 내에 친수성 소재를 도입하려는 시도가 있었다. 복합체의 친수성에 대한 이에 혼입된 TCP의 효과를 확인하기 위하여, 순수 PLA와 PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw 복합체 상에서 물 접촉각을 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

소재의 젖음성(wettability) 결정은 접촉 초기 단계에서 소재와 세포 간의 상호작용에 필수적이다. 순수 PLA의 물 접촉각은 약 80.8°이며, 이는 TCPms 및 TCPpw의 혼입시 각각 65.5 and 67.6°까지 감소되었다. 따라서, 친수성 TCP의 혼입은 순수 PLA에 비해 복합체의 친수성을 현저히 증가시켰으며, 이에 따라, 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 접촉 초기 단계 동안 세포의 부착 및 증식에 유리한 환경을 제공할 수 있었다. 나아가, 증가된 친수성은 보다 친수성인 표면을 제공함으로써 순수 PLA에 비해 상대적으로 복합체의 분해 속도를 가속화할 수 있었다.

실험예 3: 시험관 내 분해 특성 테스트

마이크로스피어들의 연결성(connectivity of the microspheres)을 확인하기 위하여 가속화된 분해(accelerated degradation) 테스트를 수행하였다. PLA는 상대적으로 낮은 pH에서도 안정하므로, 3×3×3 mm³ 크기의 시편을 37℃의 1 M HCl 용액에 담궜다. 분해 30일 후, 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 단면 표면 형태를 SEM(JSM-6360, JEOL, Japan)을 사용하여 확인하였다. 나아가 분해 거동(degradation behaviour), 기공 형성(pore generation) 및 기공 연결성(pore connectivity)을, 8.17 μm 해상도(resolution), 130 kV 전압 및 60 mA 전류에서 0.5 mm 알루미늄 필터로 마이크로-컴퓨터 단층촬영(micro-computed tomography; μ-CT, Skyscan, 1172 micro-tomography system; Skyscan, Kontich, Belgium)을 이용하여 확인하였다.

TCP의 분해는 생리활성 조건 하에서(under physiological conditions) PLA의 그것보다 더 빠르게 진행됨에도 불구하고, 복합체들의 분해 속도는 매우 느렸다. TCP는 생체 내 이식하여 24주 후에 약 55% 분해되었으며 동일한 시점에서 PLA의 분자량은 23%까지 감소하였다. 따라서, 마이크로스피어들 간의 상호 연결성을 평가하기 위하여, 생리활성 조건의 온도 즉, 체온을 모방한 37℃의 1 M HCl 용액에서 PLA-TCPms의 가속화된 분해 테스트(accelerated degradation test)를 수행하였다. 인산 칼슘-기반 물질의 용해도가 산성 환경에서 크게 향상되는 것을 고려하여 상기 테스트를 HCl에서 수행하였다. 가수분해(hydrolytic degradation)에 의해 PLA의 대규모 침식(bulk erosion)이 발생하였으며, 에스테르 가수분해를 자가촉매(autocatalyse)하는 것으로 알려진, 카르복시산 사슬 말단(carboxylic acid chain ends)의 수는 분해가 진행됨에 따라 증가하였다. 당업계에 공지된 바에 따르면, 락트산의 pKa는 3.84이므로, PLA 용액의 분해 속도는 pH 4에서 가장 낮다. pH>4에서, 락트산은 주로 해리된 형태로 나타나며, pH<4에서, 락트산은, 자가촉매를 통해 가수분해 반응을 가속화하는, 사슬 말단에 결합된 산 형태로 존재한다. 따라서, PLA는 대규모 침식을 겪음에도 불구하고, 낮은 pH에서 발생하는 빠른 사슬 절단(scission)은 PLA의 표면 침식 거동으로 설명될 수 있다. 반면, 고체 PLA의 분해 속도는 대부분 매질의 pH와는 무관하였다. 따라서, 본 발명에서는, 사용된 HCl 매질이 TCPms의 분해만을 가속화하므로, 복합체 내에서 마이크로스피어의 상호연결성을 명확히 관찰할 수 있었다. 다른 분해 기간 후 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 분해 거동을 μ-CT로 분석하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

각각 다른 시간 동안 분해시킨 시편의 3D μ-CT 이미지를 획득하였다. 세라믹과 고분자의 상이한 대비 모드로 인해 이미지 중의 PLA를 검출할 수 없었으므로, 도 8(a)에서 분해 전과 후 순수 PLA 및 PLA 복합체 시편의 형태를 빨간 색 점선으로 나타내었다. 30일까지 순수 PLA에서는 어떠한 차이도 관찰되지 않았음에도 불구하고, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw 내의 TCPms 및 TCPpw의 분해가 명확히 관찰되었다. 분해 전 마이크로스피어의 평균 크기는 약 106 μm였다. 30일의 침지(immersion) 후 PLA-TCPms 복합체의 평균 기공 크기는 약 83 μm였으며, 복합체의 분해된 부분에 대해 97.52%의 상호연결성(interconnectivity)을 나타내었다. 상기 기공 크기는, 침지 기간 동안 완전히 용해되지 않고 잔류하는 TCP로 인해, 첨가된 마이크로스피어 본래의 크기보다 더 작았다. 그러나, 형성된 기공의 크기는 여전히 세포의 내성장(ingrowth)을 허용할 수 있을 만큼 충분히 컸다. μ-CT의 분해한계(resolution limit)가 7 μm에 불과하여, PLA-TCPpw 복합체의 평균 기공 크기는 산출할 수 없었다. 그러나, 도 8(b)에 나타난 바와 같이, 30일의 분해 후 SEM 이미지에서 뚜렷한 형태적 차이가 나타났다. PLA-TCPms 시편은 TCPms의 분해에 의해 형성된 둥글고 상호연결된 기공을 포함하는 반면, PLA-TCPpw 시편은, 분말 및 이의 응집체의 크기와 일치하는, 약 2 내지 10 μm 크기의 작은 기공을 포함하였다. PLA-TCPpw 복합체의 작은 기공 크기는 유체의 흐름을 제한하며, PLA-TCPms 복합체의 보다 큰 기공과 달리, 세포의 내성장에는 적합하지 못하였다. 30일 후 분해된 TCP의 총 양은, 마이크로스피어에 의해 형성된 보다 큰 상호연결된 기공이 복합체 내부로 유체 흐름을 촉진함으로 인해, PLA-TCPpw 복합체에 비해 PLA-TCPms 복합체에서 더 많았다. 30일의 분해 후 잔류하는 PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 상대적인 질량(relative mass)은 각각 50 및 60% 정도였다. PLA-TCPms 복합체에서 상호연결된 마이크로기공의 성공적인 형성은, 다공성 스캐폴드 제조시 공간 보유자의 크기 증가가 상호결합성 및 공간 보유자의 분해 속도를 증가시키는 것과 같이, 공간 보유자(space holder)의 크기효과로 설명될 수 있다. 본 발명에 있어서, TCPms 및 TCPpw는 상이한 크기의 공간 보유자고 간주될 수 있다. 상기 2종의 PLA 복합체와 달리, 순수 PLA에 대해서는 어떠한 형태적 변화도 관찰되지 않았다. 가속화된 분해 테스트(accelerated degradation test)가 복합체 내에서 마이크로스피어의 상호연결성을 확인하는데 적합함에도 불구하고, 생체 내 조건에서 순수 PLA 및 PLA 복합체의 실제 분해 거동을 정확히 나타내지는 못한다. 따라서, 보다 긴 기간 동안 인공체액(simulated body fluid; SBF) 또는 PBS 용액에서 추가적인 시험관 내 분해 테스트를 수행하여, 생리학적 조건 하에서 복합체의 분해 거동을 관찰할 수 있었다.

실험예 4: 생체 내 골 반응 평가

골 재생에 대한 PLA-TCPms 복합체의 잠재성을 확인하기 위하여, 래빗 대퇴부 결손 모델을 이용한 생체 내 동물 실험을 수행하였다. 비교를 위하여 순수 PLA 및 PLA-TCPpw에 대해서도 실험하였다. 구체적으로, 상기 동물실험에는 건강한 뉴질랜드 백색 래빗(수컷, 10 주령, 체중 약 2.0 kg, KOSA Bio Inc., Seongnam, Korea)을 사용하였다. 모든 래빗은 0.5 mL의 2% 자일라진 염산염(xylazine HCl, Rompun, Bayer Korea, Korea), 1 mL의 틸레트아민 염산염(tiletamine HCl, Zoletil, Vicbac Laboratories, France), 및 리도카인(Yuhan Corporation, Korea)의 조합을 근육 내 주사하여 마취시켰다.

상기 생체 내 실험을 위하여, 순수 PLA, PLA-TCPms 복합체 및 PLA-TCPpw 복합체로 된 원통형의 시편(5 mm 직경, 5 mm 높이)을 사용하였다. 수동 드릴을 이용하여 관절구 간의 표시(intercondyle notch)에 미리 홀을 뚫어 놓은 후, 2개의 상이한 형태의 시편을 왼쪽과 오른쪽 대퇴부 결손 부위에 이식하였다. 상처를 봉합하고, 수술 후 항생 프로필락시스(antibiotic prophylaxis post operation)로서 젠타마이신(gentamycin, 5 mg/kg)을 실험동물에 피하주사하였다. 생체 내 동물실험은 제노스의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Genoss, GEN-IACUC, no. 1703-03)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.

이식 16주 후 래빗을 치사시켰다. 이식체를 포함한 대퇴골을 추출하고 이후 분석을 위하여 10% 완충된 포름알데하이드에 고정시켰다. 순수 PLA, PLA 복합체 및 골 조직을 연구하기 위하여, 골 조직을, 24.86 μm 해상도, 130 kV 전압 및 60 mA 전류에서, 0.5 mm 필터를 구비한 μ-CT(Skyscan, 1172 micro-tomography System; Skyscan, Kontich, Belgium)로 스캔하였다. 스캐팅 후, NRecon 소프트웨어(Skyscan, Kontich, Belgium)를 사용하여 2D 모델을 재구성하고, CTAn 프로그램(Skyscan, Kontich, Belgium)을 사용하여, 모든 평가에서 일정하게 유지되는, 이미지 분석을 위한 특정 임계치(specific threshold)로 이식체 주변위 골 부피를 결정하였다.

조직학적 평가를 위하여, 이식된 시편을 포함하는 추출된 골 조직을 중성의 10% 포름알데하이드 용액으로 고정시키고, 수지(resin, Technovit, 7200 VLC, Kulzer, Germany)에 포매시켰다. 탈석회화되지 않은(nondecalcified) 얇은 바닥면을 준비하여, 약 50 μm까지 절단 및 연마 시스템(Exakt, Germany)을 이용하여 두께를 줄였다. 조직을 골드너 삼색 염색(Goldner's trichrome stain)으로 염색하고, 파노라마 디지털 슬라이드 스캐너(Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH Ltd, Hungary) 및 SEM(JSM-6360, JEOL, Japan)을 이용하여 염색된 부분의 현미경 이미지를 얻었다. 성숙한 골 기질(mature bone matrix), 미숙한 신생 골(immature new bone) 및 석회화된 연골은 각각 녹색, 적색 및 연녹색으로 염색되었다. ImageJ 프로그램(National Institutes of Health, Maryland, USA)을 사용하여 조직학적 이미지로부터 골-이식체 접촉률(bone-to-implant contact(BIC) ratio)을 산출하였다.

래빗 대퇴부 손상 모델을 이용한 생체 내 실험으로 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 초기 단계 골 반응을 평가하였다. 이식 16주 후, 단면 형태 및 새롭게 형성된 골의 양을 μ-CT 분석으로 확인하였다. 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 중심축을 따른 축경유 단면(trans-axial sections)의 2D 이미지를 각각 도 9(a) 내지 (c)에, 계산된 이식체 주변의 신생 골의 양을 도 9(d)에 나타내었다.

2D μ-CT 이미지로부터, 이식체 주변의 신생 골의 양은 순수 PLA 시료에 비해 2종 복합체 시편에서 더 많은 것을 명확히 확인하였다. 이는 각 시편의 골 부피에 대한 정량분석에 의해서도 뒷받침되었다. 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 신생 골 부피는 각각 0.73, 5.21 및 5.98 mm³이었다. TCP의 혼입은, 실제 골과 유사한 기질을 제공함으로써, PLA의 골 반응을 현저하게 향상시켰으며, 그 결과, 시험관 내 실험에서 확인한 바와 같이, 조골세포의 성장을 자극하였다.

골드너 삼색 염색으로 염색한 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw의 조직학적 단면 이미지를 도 10(a) 내지 (c)에 각각 나타내었다. 이식체 주변에서 성공적인 신생 골(진한 녹색으로 염색된) 형성이 명확히 관찰되었다. 그러나, 연결 조직(connective tissue)은 신생 골과 이식체 간의 접촉은 차단되고 대부분 순수 PLA와 직접 접촉하고 있어, 임플란트 완화(implant loosening)를 유발할 수 있었다(도 10(a)). 반면, PLA-TCPms 복합체(도 10(b)) 및 PLA-TCPpw 복합체(도 10(c)) 모두에서, 신생 골 조직은 상대적으로 임플란트와 보다 직접적으로 접촉되었다. 생물활성 TCP 상의 혼입은 이식체 상에서 신생 골 형성을 유도하는 것으로 나타났다. PLA-TCPms 복합체 및 PLA-TCPpw 복합체에 대해 새롭게 형성된 골에서 하나의 주요한 형태적 차이가 관찰되었다. 시험관 내 분해 분석에 부합되게, 그 내부로 신생 골이 성장할 수 있는, 소정의 틈(crevices, '기공')이 PLA-TCPms 시편의 가장자리(edges)에 형성되었으며, 이에 따라 이식체와 골 사이의 골유착능(osseointegration)이 향상되었다. 신생 골이 PLA-TCPms 복합체의 기공 내부에 흡수되는(integrated) 것과는 달리, PLA-TCPpw 복합체는, 도 10(b) 및 (c)에 적색 점선 및 삽입된 SEM 이미지에 나타난 바와 같이, 어떠한 분해의 흔적(signs)도 없는 뚜렸한 경계를 나타내었다. 이는 도 10(d)에 나타난 정량적 BIC 비율 결과에 의해 입증되었다. 조직학적 이미지로부터 산출된 BIC 비율은 순수 PLA, PLA-TCPms 및 PLA-TCPpw에 대해 각각 약 16, 60 및 32%였다. PLA-TCPms의 BIC 비율은 순수 PLA 및 PLA-TCPpw 시편에 대한 수치에 비해 현저하게 더 높았으며, 이는, 조직학적 관찰과 일치하는, 기공 내에서 성장된 신생 골이 골과 이식체 사이의 접촉 길이(contact length)를 현저히 증가시켰음을 나타내는 것이다. 조직학적 이미지 및 BIC 비율 데이터는 TCPms의 혼입이 골유착능을 현저히 향상시켰음을 성공적으로 나타낸다. 나아가, 복합체 내부에서 신생 골 조직의 형성이 골과 이식체 사이의 기계적 온전성(mechanical integrity)을 향상시키는 결과를 유도함을 나타내는 것이다.

TCPms 및 TCPpw의 혼입은 PLA 복합체의 세포 반응을 성공적으로 향상시켰다. 특히, PLA-TCPms는 PLA-TCPpw과 비교하여 개선된 골유착능에 대한 발생 경로(generating pathways)의 추가적인 이점을 제공하였다. 가속화된 분해 거동이 생리학적 조건에서의 분해 거동을 정확히 모방하지 않음에도 불구하고, 이는 향상된 골유착능을 위한 TCPms로부터 기공으로의 성공적 전환에 대한 잠재성을 명확히 나타낸다. 이러한 가능성은 초기 단계의 생체 내 실험 결과에 의해서도 확인되었다. 이식체의 기공 내부에 새롭게 형성된 골은 PLA 침식이 개시된 이후에도 이식체 구조를 유지하도록 도울 수 있다. PLA-TCPms는 이의 상호 연결된 기공 형성 능력으로 인해, 대규모 침식의 위험이 여전히 존재하는 PLA-TCPpw에 비해, 보다 유용할 수 있다.

실험예 5: 통계적 분석

모든 실험은 3회 이상 수행하였으며, 실험 결과는 평균±표준 편차로 나타내었다. 각 그룹(순수 PLA, PLATCPms 및 PLA-TCPpw) 간의 차이는, 통계적으로 유의미한 차이로 간주되는, 0.05 미만의 p 값을 갖는 일원변량분석(one-way analysis of variance)을 이용하여 결정하였다(*p<0.05).

비교예 1: 생분해성 금속 마이크로스피어 -고분자 복합체의 제조

생분해성 입자로서, 세라믹의 일종인 TCP 대신에 마그네슘 파티클을 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 유사한 방법으로 25부피%로 마그네슘 입자를 함유하는, 4 mm×4 mm×6 mm 규모의 Mg-PLA 복합체를 제조하였다. 생체 내에 이식시 상기 제조된 복합체의 분해 특성을 확인하기 위하여, 유사생체용액(simulated body fluid; SBF)에 준비한 시료를 침지시킨 후 3일 및 5일 경과 후 크기 및 형태를 육안으로 관찰하고 용액의 pH도 함께 관찰하여 측정된 결과를 각각 도 11과 12에 나타내었다. 도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 복합체 내의 마그네슘이 수일 이내에 빠르게 분해되면서 그 형태를 유지하지 못할 뿐만 아니라, 마그네슘의 분해에 따라 주변의 pH를 과도하게 증가시키므로 생체 내 pH 밸런스를 유지하는데 악영향을 미칠 수 있는 것으로 확인되었다. 이는 상기 마그네슘 파티클을 함유하는 고분자 복합체는 조직 재생을 위한 이식체로 사용하기에는 부적합함을 나타내는 것이다.

PLA 기질 내로의 TCPms 혼입은, 정형외과적 응용(orthopedic applications)에 사용되는 잘 알려진 복합체인 TCPpw를 함유하는 PLA 복합체와 동등한 수준까지, 생체적합성을 향상시켰다. 향상된 골유착능을 위한 우수한 상호연결성을 갖는 기공을 형성하는 PLA-TCPms의 잠재성을 시험관 내 가속화된 분해 테스트 및 래빗 대퇴부 결손 모델을 이용한 생체 내 분석을 통해 성공적으로 확인하였다. PLA-TCPms 복합체의 우수한 생체적합성 및 향상된 골유착능으로 인해, 종래 PLA-TCP 복합체에 비해, 골 조직 재생을 위한 보다 유망한 후보군일 수 있다.

Claims

생분해성 고분자 수지의 용융물에 평균 직경 100 내지 300 μm의 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 시간에 따라 기공률이 증가하는, 생분해성 이식체의 제조방법으로서,
생분해성 고분자를 고전단혼합기에 투입하고 혼합기의 온도를 상기 생분해성 고분자의 융점보다 10℃ 내지 50℃ 더 높게 유지하면서 3 Hz 내지 10 Hz로 교반하는 제1단계;
상기 고전단혼합기에 상기 생분해성 고분자보다 분해속도가 빠른 생분해성 세라믹 입자를 포함하는 분말을 첨가하여 온도 및 속도를 유지하면서 혼합하는 제2단계; 및
상기 혼합물을 성형하는 제3단계;를 포함하는 생분해성 이식체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤 또는 이들의 조합인 것인 생분해성 이식체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 생분해성 세라믹 입자는 인산삼칼슘(tricalcium phosphate; TCP), 인산일수소칼슘, 인산팔칼슘, 비정질인산칼슘 또는 이들의 조합으로 된 것인 생분해성 이식체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 생분해성 세라믹 입자는 혼합물 총량에 대해 30 내지 50 부피%로 첨가되는 것인 생분해성 이식체의 제조방법.
제1항에 있어서,
체내 이식시 시간 경과에 따라 생분해성 세라믹 입자가 생분해성 고분자보다 빠른 속도로 용해되면서 기공이 형성되는 것인 생분해성 이식체의 제조방법.
생분해성 고분자 수지의 용융물에 평균 직경 100 내지 300 μm이고, 상기 생분해성 고분자보다 분해 속도가 빠른 생분해성 세라믹 입자들이 균일하게 삽입되어 성형된, 시간에 따라 기공률이 증가하는 생분해성 이식체를 포함하는 골재생용 임플란트.
제6항에 있어서,
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 것인 골재생용 임플란트.
제6항에 있어서,
시간에 따라 골격은 유지하되 기공이 형성되고 확장되는 것인 골재생용 임플란트.